методические указания - Белорусская медицинская академия
реклама
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Министра здравоохранения Республики Беларусь ____________ Р.А. Часнойть “_30__” ___01________ 2009 г. Регистрационный номер № 193-1208 МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АЛЬФА-ТОКОФЕРОЛА И РЕТИНОЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (инструкция по применению) Учреждение-разработчик: ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования » Авторы: кандидат медицинских наук, доцент И.В. Тарасюк, Т.М. Юрага, С.И. Станкевич, кандидат медицинский наук, доцент О.Н. Почепень, О.М. Чередник Минск - 2008 Показания к применению Указанная методика может широко применяться в медицине (в кардиологии, онкологии, урологии, эндокринологии, гастроэнтерологии, педиатрии, гинекологии, дерматовенерологии, неврологии, психиатрии, пульмонологии и др.). Метод позволяет осуществлять лабораторную диагностику при лечении различных заболеваний (атеросклероз, инфаркт миокарда, ишемические поражения органов, сахарный диабет, острый панкреатит, обширные ожоги, травмы, расстройства иммунной системы и т.д.). Противопоказания для применения Не выявлены. Перечень необходимого оборудования, реагентов, вспомогательных устройств: 1. встряхиватель «VORTEX Genius 3», 2000 колеб/мин, «IKA» (Германия); 2. спекрофлюориметр «Hitaci» (Япония); 3. центрифуга ОПН-3 (РФ); 4. стеклянные пробирки с притертыми пробками; 5. пипетки полуавтоматические одноканальные со наконечниками, переменным объемом 200-1000 мкл, 1-5 мл; 6. этиловый спирт 96 %; 7. гексан; 8. вода бидистиллированная; 9. стандарты: 9.1. альфа – токоферолацетат; 9.2. ретинолацетат. 2 сменными Описание технологии использования метода с указанием этапов: 1. Подготовка исследуемого материала 1.1. В пробирки вносят по 200 мкл сыворотки крови. 1.2. В стандартные пробы вносят 200 мкл рабочего стандартного раствора α-токоферолацетата для определения витамина Е и ретинолацетата – для определения витамина А. 2. Ход определения 2.1. Добавить к исследуемому образцу 1 мл бидистилированной воды. 2.2. Встряхивать пробы в течение 30 с. 2.3. Добавить в каждую пробу 1 мл этилового спирта 2.4. Встряхивать пробы в течение 30 с. 2.5. Добавить к образцу 5 мл гексана. 2.6. Энергично встряхивать не менее 20 мин. 2.7. Инкубировать в темноте 15 мин или центрифугировать 10 мин при 1500 об/мин. 3. Идентификация результатов 3.1. Провести измерение флюоресценции на спектрофлюориметре, настроенном на волну возбуждения 295 нм и волну испускания 320 нм для α-токоферола, а для ретинола – соответственно при длине волны возбуждения 335 нм и длине волны испускания 460 нм. 3.2. Ширину щели установить 8/8. 3.3. Концентрацию витаминов определить по формуле: Собр. = (Фоб-Фк) / Фст*Сст где Фобр, Фк, и Фст. - интенсивность флюоресценции образца сыворотки, контрольного образца и стандарта; Сст. - концентрация вещества в рабочем стандартном растворе. 3 Перечень возможных осложнений и ошибок при выполнении и пути их устранения. Контроль качества метода. Техника безопасности. 1. Нарушение технологии выполнения анализа. 2. Использование реагентов с истекшим сроком годности. 3. Неточное пипетирование реагентов. 4. Неправильный забор и хранение образцов биоматериала. Пути устранения: 1. Соблюдение последовательности операций и аккуратное выполнение анализа является обязательным. Наличие в лаборатории пула контрольных сывороток – уверенность в надежности получаемого результата. 2. Использование реагентов с истекшим сроком годности запрещено. 3. Все необходимые растворы для проведения анализа должны готовиться непосредственно перед работой. 4. На всех этапах проведения исследования должен работать один и тот же сотрудник. Все пробы исследовать в дублях. Когда дозируемый объем раствора минимальный из допустимого диапазона, то при работе используется легко вспенивающаяся жидкость или раствор с большой вязкостью и необходимо применять обратный способ пипетирования. 4. Применение пластиковых пробирок при взятии образцов биоматериала позволяет избежать контактной активации протеолитических систем. Исследуемые образцы сыворотки (плазмы) могут храниться при температуре 2-8 °С в течение 24 ч. При плановых исследованиях возможно накопление проб и хранение в замороженном виде при температуре -20 °С до использования. 4 Контроль качества проводимых лабораторных исследований осуществляется методами исследования параллельных проб, повторных проб и смешанных проб. Все пробы исследуют в дублях, поэтому интенсивность флюоресценции образца и стандарта рассчитывают по средним значениям флюоресценций параллельных проб. Разница между пробами при измерении концентрации витамина Е не должна превышать 15,4% для сыворотки и 4,1% для стандартов, при измерении концентрации витамина А - соответственно 13,3 и 5,6%. Эти значения получены при расчете Хsх из 50 параллельных проб сыворотки и стандартных растворов. Если разница превышает указанные границы, данные нельзя считать достоверными, и пробы должна исследоваться повторно. Необходимое качество и стандартизация определения не достигаются использованием лишь стандартных растворов, так как они менее чувствительны к разным методическим отклонениям, нежели сыворотка. Поэтому одновременно со стандартами необходимо исследовать контрольные сыворотки, которые можно изготовить путем сбора остатков образцов сывороток в один пул с последующей обработкой и расфасовкой в нужных количествах. Возможность хранения образцов сыворотки в замороженном виде не более 3 месяцев позволяет использовать такие слитые сыворотки одного приготовления в течение продолжительного времени. При выполнении исследований необходимо соблюдать меры безопасности согласно действующих приказов Министерства здравоохранения Республики Беларусь, инструкций по охране труда для КДЛ и инструкций по эксплуатации медицинских измерительных приборов, разработанных и утвержденных в учреждениях. 5 Хронометраж метода № пп 1 Время, мин каждое единичное последующее Содержание работ Подготовка реактивов к проведению анализа 2 Внесение контрольных, исследуемых образцов в пробирки 5 1 1 0,5 1 0,5 0,5 0,5 1 0,5 0,5 0,5 3 Внесение бидистиллированной воды 4 Встряхивание ручное 5 Внесение этилового спирта 6 Встряхивание ручное 7 Внесение гексана 1 0,5 8 Встряхивание на вибровстряхивателе 20 20 9 Инкубация 15 15 10 Измерение образцов 8 2 11 Расчет концентрации 2 2 Всего 55 43 6 Обоснование целесообразности практического использования Витамины представляют собой группу органических веществ различной химической структуры, синтезирующихся, как правило, в растениях и входящих в состав тканей животных обычно в малых количествах. Физиологическое значение витаминов заключается в их активном участии в поддержании нормальной деятельности живого организма. Для этого необходимо, чтобы нужное количество витаминов поступало с пищей или из органов, в которых осуществляется синтез витаминов. Если развивается они поступают витаминная в незначительном недостаточность. количестве, Неферментативными ингибиторами свободнорадикального окисления являются природные антиоксиданты - альфа-токоферол, ретинол тироксин, фосфолипиды, холестерол, аскорбиновая кислота. Наиболее активным и распространенным является альфа-токоферол, содержащийся в плазме и плазматических клеточных мембранах. Витамин Е (токоферол) – жирорастворимый витамин - антиоксидант. В силу данных свойств токоферол включается в клеточную мембрану для удаления свободных радикалов, которые могли бы ослабить самую основную защитную линию клетки. Витамин Е регулирует обмен белков и липидов. При недостаточности этого витамина развивается мышечная атрофия, охватывающая как скелетные, так и гладкие мышцы, а также миокард. Витамин Е тормозит перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот (образование липоперекисей), причиной этого является его антиоксидантная способность. Токоферол необходим и для восстановления других жирорастворимых редокс-витаминов: в частности, витамина А и коэнзима Q. Витамин Е и селен взаимодействуют с эндогенными соединениями, оказывая антиоксидантную защиту 7 организма, а витамин С способен восстанавливать редокс-активность этой системы. Будучи одним из основных антиоксидантов, витамин А – бесценный союзник в борьбе с сердечно-сосудистыми и другими дегенеративными заболеваниями. Он необходим для здоровой репродуктивной функции, нормального роста, баланса сахара в крови и защиты от инфекций. Ретинол обладает способностью акцептировать свободные радикалы. Поскольку организм обладает способностью накапливать витамин А, его бесконтрольный прием иногда приводит к тому, что он начинает оказывать токсическое действие. Однако, если организму нужен витамин А, он сам может производить его из бета-каротина. Поэтому можно легко обойтись без последствий, связанных с токсичностью ретинола, если организм будет получать бета-каротин. В комплексе витамины А и С являются факторами антиоксидантной защиты, уменьшение антиокислительной их содержания защиты организма приводит и к ослаблению накоплению продуктов перекисного окисления липидов. Образовавшиеся в избытке продукты перекисного окисления, губительно действуюя на живую клетку человека. Негативное действие свободных радикалов проявляется в ускорении старения организма, провоцировании воспалительных процессов в мышечных, соединительных функционировании различных и других систем тканях, организма: неправильном циркуляционной, нервной (включая клетки мозга) и иммунной систем. В следствие чего развиваются такие болези, как рак, атеросклероз, астма, артроз, варикозное расширение вен, болезни печени, почек, гипертензия, нарушение памяти, сахарный диабет и др. До настоящего времени вышеуказанный метод (Р.Ч. Черняускене, 1984) использовался для выполнения научных исследований в области 8 онкологии, кадиологии, урологии, эндокринологии, акушерстве и гинекологии, офтальмологии. С возрастанием роли данных показателей для диагностики, оценки течения патологических процессов в плане эффективности лечения, а также состояния антиоксидантной защиты организма и необходимости проведения профилактических мероприятий возникла потребность его в утверждении в установленном порядке и широком внедрении в практику работы клинико-диагностических лабораторий организаций здравоохранения, прежде всего, амбулаторно-поликлинического звена. Литература 1. Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф., Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике. – Элиста: АПП Джангар, 1999, 214 с. 2. Лифшиц В.М., Сидельникова В.И. Биохимические анализы в клинике медицинское информационное агентство. – М.: Медицинское информационное агентство, 2001, 303 с. 3. Рудакова-Шипина Н.К., Матюхова Н.П. - Лаб. дело, 1982, №1, с. 19. 4. Черняускене Р.Ч., Варшкявичене З.З., Грибаускас П.С. Лаб. дело, 1984, №6, с. 362. 5. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы патохимии – СПб: ЭЛБИ-СПб, 2000, 688 с. 6. H. Volker, G. Levin, K-J. Winzer, I. Porov. Antioxidative Homeostasis in Patiens with Mamma-Tumors. Phys/ Chem/ Biol & Med, 1995, 2, p. 57-60. 7. Herbert J Kayden, Thomas Wisniewski. Вiological activity vitamins E. Am. J. of Clinical Nutrition, July 2000, Vol. 72, № 1, p. 201-202. 9 УТВЕРЖДАЮ Проректор по научной работе БелМАПО д-р мед. наук, профессор Ю.М. Гаин «___» _______________ 2008 г. Отчет о клиническом испытании метода определения витаминов альфа-токофрола и ретинола в сыворотке крови Многие авторы считают нормальным уровнем витамина Е в сыворотке крови 11,6-46,4 мкмоль/л, а у детей эти величины значительно ниже, чем у взрослых 1,2,4,5,6. Тестом на обеспеченность витамином Е служит показатель перекисной резистентности эритроцитов: при гемолизе свыше 10% - содержание витамина Е менее 3 мг/л. Недостаточность витамина Е возникает при отсутствии в рационе растительных жиров, хроническом панкреатите, резекции желудка, у недоношенных детей и вызывает усиление перекисного окисления липидов. Все перечисленное ведет к нарушению репаративного синтеза и повышению проницаемости клеточных мембран, развитию мембранной патологии 7. Гипервитаминоз у человека не встречается, только у маленьких детей от высоких доз может возникнуть резкое обезвоживание. Увеличение концентрации витамина Е наблюдается у людей старческого и пожилого возраста за счет повышения уровня липидов в крови. Нормальное содержание витамина А в сыворотке крови считается 1,05-2,27 мкмоль/л 1,2,4,5,6. Гипервитаминозный токсикоз наблюдается при концентрации выше 5,25 мкмоль/л 3. Избыточное содержание витамина А Сопровождается вызывает хроническую увеличением печени, 10 и острую селезенки, интоксикацию. повышением внутричерепного давления, болями в костях. Недостаточность витамина А возникает при дефиците ретинола или каротина в пище, нарушениях их всасывания и вызывает метаплазию эпителия различных органов, замедление восстановления зрительного пурпура, что проявляется повышенной восприимчивостью к бронхо-легочным заболеваниям, инфекциям мочевыводящих путей, слизистой оболочки глаз, сухости эпителия (ксерофтальмия при 0,35 мкмоль/л). Скрытый гиповитаминоз появляется при 0,7 мкмоль/л. Основные результаты и их обсуждение Исследования проводились на базе Центральной научно- исследовательской лаборатории БелМАПО. Биологический материал для исследования поступал из учреждений здравоохранения г. Минска: 2-я и ГКБ, 3–я Республиканский Городской ожоговый кожно-венерологический центр (палата интенсивной диспансер, терапии), Минский областной родильный дом, а также г. Гомеля (Гомельская областная клиническая больница) и Гомельской области (Наровлянская центральная районная больница). Уровень витаминов в плазме крови был изучен у 240 женщин и мужчин в возрасте от 15 до 75 лет без признаков ишемической болезни сердца, острых воспалительных и инфекционных заболеваний, а также у новорожденных и детей подросткового возраста. В результате исследований получены следующие данные: содержание витамина Е в среднем составило - 24,40,97мкмоль/л с колебаниями в пределах 5÷47,2 мкмоль/л, а витамина А - 2,230,5 мкмоль/л с колебаниями 0,78÷4,5 мкмоль/л. У обследуемых нами лиц ни в одном случае концентрация витамина А не выходила за указанные пределы нормы. Известно, что концентрация витамина Е в сыворотке крови зависит от содержания в ней липидов 1. Поэтому статус витамина Е оценивался 11 относительно липидов. Результаты исследования показали, что у обследуемых нами лиц концентрация холестерина, триацилглицеринов, общих липидов, общих фосфолипидов была в пределах нормы. В ходе проведенных исследований были получены данные, свидетельствующие о колебаниях содержания витаминов Е и А в зависимости от пола и возраста (таблица 1). Таблица 1. Содержание витамина Е и А (мкмоль/л) в сыворотке крови в зависимости от пола и возраста (XSx). Возраст обследуемых, годы Новорожденные Подростки Кол-во обследуемых, n 11 25 15-35 35-55 55-75 В целом 15-75 15 30 45 90 15-35 35-55 55-75 В целом 15-75 50 50 50 150 Витамин Е, мкмоль/л 9,570,98 11,90,48 Мужчины 25,40,50 14,461,09 24,041,31 24,40,97 Женщины 17,91,48 24,041,31 27,81,13 23,21,3 Витамин А, мкмоль/л 2,520,38 2,640,41 2,320,99 2,90,39 1,490,12 2,230,5 2,40,33 2,410,1 2,610,12 2,470,18 Выполнена оценка обеспеченности у 502 жителей Беларуси витаминами А и Е, обладающими антиокислительными свойствами: 96 – дети в возрасте 9-12 лет; 197 – женщины в возрасте 19-32 лет; 18 – мужчины в возрасте 19-32 лет; 191 - пациенты зрелого возраста (58-76 лет). Контрольную группу составили 13 женщин в возрасте 19-32 лет и 18 мужчин такого же возраста. У всех наблюдаемых в период исследования 12 отсутствовали клинические проявления острой инфекционной патологии. В анамнезе лиц пожилого возраста имели место хронические воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия. Витаминный баланс у большинства обследованных можно охарактеризовать как состояние дефицита по эндогенному содержанию витаминов антиоксидантного действия. В первую очередь, это касается детей и молодых людей как контрольной, так и основной групп. Так, средние показатели содержания витамина А ниже нормы и колеблются от 0,49 мкмоль/л до 0,88 мкмоль/л. Для витамина Е их величина составляет 2,9÷5,85 мкмоль/л. Доля пациентов с низкими значениями этих показателей по витамину А составляет 65,3-95,3%, по витамину Е – 92,9-100%. Причем практически у половины обследованных выявлена наиболее тяжелая, 3-я степень дефицита обоих витаминов, особенно витамина Е. Аналогичная картина выявлена у лиц зрелого возраста, однако степень дефицита антиоксидантных витаминов выражена меньше. Так, например, среднее значение содержания витамина А в данной группе (1,5 мкмоль/л) ближе к нижней границе нормы (1,05-2,27 мкмоль/л). Наиболее тяжелая 3-я степень выраженности дефицита витамина А наблюдалась только у 5 из 201 пациентов, что составило 6,9 %. Средний уровень витамина Е в этой группе – 6,86 мкмоль/л. Полученные данные позволили сделать вывод, что имеют место постоянные круглогодичные дефициты эссенциальных микронутриентов антиоксидантного действия в рационах питания всех категорий жителей республики. При всем многообразии вариантов витаминодефицитных состояний наиболее проблемной является обеспеченность витамином Е, 13 стабильный дефицит которого характерен не менее, чем для половины населения. На базе Республиканского ожогового центра проведено исследование состояние антиоксидантной способности организма у 23 пациентов с тяжелой термической травмой на фоне приема “Реамберина”. Реамберин инфузионный препарат IV поколения для интенсивной терапии и реаниации, вводится взрослым до 800 мл/сутки только внутрикапельно. В зависимости от степени тяжести заболевания курс ведения препарата 711 дней. Назначение “Реамберина” обусловлено его фармокологическими и метаболическими эффектами: антигипоксическим и антиоксидантным действием, оказывает положительный эффект на аэробные биохимические процессы в клетке, восстанавливает уменьшая продукцию энергетический потенциал свободных радикалов, клеток, активирует ферментативные процессы цикла Кребса и способствует утилизации жирных кислот и глюкозы клетками, нормализует кислотно-щелочной баланс и газовый состав крови. Тяжелая термическая гиперметаболизмом, травма, вызванным как правило, повреждением сопровождается и ограничением биодоступности субстратов для окисления (углеводов, жиров, белков), в следствие чего тяжелый субстратный дисэргоз сопровождается нарушением доставки и потребления кислорода. В свою очередь избыточное выделение активных форм кислорода (АФК) и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) при обширных ожогах приводит к разнообразным патологическим явлениям и нарушает функцию жизненно важных органов. Процесс генерации большого количества АФК и ПОЛ происходит особенно сильно при условии отсрочки начала лечения либо на фоне затянувшегося периода шока. Это связано с нарушением микроциркуляции и усилением анаэробных 14 процессов. В случае проведения своевременной, адекватной инфузионной терапии процессы активации ПОЛ купируются. Токсическое действие АФК может быть снижено и посредством применения препаратов, обладающих антиаксидантной активностью. Обследуемые были разделены на 2 группы (1-ая – на фоне традиционной терапии назначался “Реамберин”, – 2-ая лечение проводилось по традиционной схеме). “Реамберин” назначался на 5 сутки и вводился ежедневно по 400 мл внутривенно в течение 7 дней на фоне базисной инфузионно-трансфузионной терапии (перинатальное питание проводилось по показаниям). Выявлены отличия в течении тяжелой термической травмы у больных, получавших “Реамберин”, в виде уменьшения частоты септических осложнений, в более легком неврологическом статусе, а также в длительности нахождения в отделении интенсивной терапии и реанимации, летальности. При оценке влияния лечения, включавшего перекисного окисления “Реамберин”, липидов - на активность первичные показателей (диенкетоны и диенконьюгаты - Д233, Д278) и вторичные (малоновый диальдегид МДА) продукты перекисного окисления липидов - выявлены определенные закономерности. Так на 5 сутки от начала заболевания у пациентов обеих групп имел место оксидантный стресс, проявлявшийся значительным усилением образования продуктов перекисного окисления липидов. Через сутки после назначения “Реамберина” у больных 1-й группы отмечалось достоверное (р<0,05) снижение Д233 и Д278. К 7 суткам эта тенденция сохранялась, хотя липидная пероксидация оставалась повышенной по сравнению с нормой, однако клиническая картина у больных этой группы была благоприятной. У больных 2-й группы к 7 суткам повышались показатели Д233 (2,68±0,04 усл.ед.), МДА (8,11±0,01 мкмоль/л) по сравнению с нормой (1,165±0,062 усл.ед.; 15 6,25±0,077 мкмоль/л). Такая динамика коррелировала с ухудшением клинического состояния и развитием пневмонии (в 100% случаев). Выявленные изменения доказывают необходимость проведения лабораторной оценки антиоксидантного статуса (прежде всего, содержания жирорастворимых витаминов Е и А в плазме или сыворотке крови) и мониторинга его коррекции в клинико-диагностических лабораториях с использованием предлагаемого метода. Медико-социальная и экономическая эффективность метода Данный метод флюориметрическое позволяет определение провести концентрации одновременное жирорастворимых витаминов А и Е в сыворотке (плазме) крови для оценки оксидантного статуса организма. Стабильность и воспроизводимость применяемого метода, достигнутые и обеспечиваемые постоянным контролем качества анализов, делают метод приемлемым для проведения исследований у различных контингентов пациентов в динамике. Предложенный метод несложен в выполнении и доступен для использования в клинико-лабораторной практике, позволяет дать оценку состояния антиоксидантной защиты организма. Экономическая эффективность предложенного метода представлена в таблице 2. Область применения и уровень внедрения. Данный метод рекомендуется для внедрения в практику клинико-диагностических и научных лабораторий учреждений системы здравоохранения Республики Беларусь. Авторы: Тарасюк И.В. Почепень О.Н. Юрага Т.М. Чередник О.М. Станкевич С.И. 16 Министерства Таблица 2. Экономическая эффективность метода определения содержания витаминов альфа-токоферола и ретинола в сыворотке крови. Метод Параметры Предлагаемый метод (флюориметрический) высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Стоимость реагентов для проведения исследований, 3 7 18 000 62 000 100 344 у.е. Стоимость оборудования, у.е. Сопоставление стоимости исследования с учетом всех затрат, в % Затраты рабочего времени, мин фельдшер-лаборант единичное 55 каждое последующее 43 врача / лаборанта единичное 120 каждое последующее 50 17
