На правах рукописи НАЗАРОЧКИНА Оксана Васильевна КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ ОСТРОЙ ФАЗЫ И ИНТЕРЛЕЙКИНА-10 ПРИ ВИРУСНЫХ МЕНИНГИТАХ У ДЕТЕЙ 14.00. 09 – педиатрия 14.00.10. – инфекционные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград - 2006 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия Росздрава» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Харченко Геннадий Андреевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич доктор медицинских наук, профессор Петров Владимир Александрович Ведущая организация: ГОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия» Защита состоится «20» декабря 2006 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета К 208.008.01. при Волгоградском государственном медицинском университете (400131 г. Волгоград, площадь Павших борцов, 1) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета Автореферат разослан «___» _________ 200 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент М.С. Селихова 2 Список сокращений БОФ – белки острой фазы ИЛ – интерлейкин ИФА – иммуноферментный анализ ИФН - интерферон ЛЗН – лихорадка Западного Нила ЛФ – лактоферрин ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота СМЖ – спинномозговая жидкость Тh – Т лимфоцит-хелпер ФР – ферритин ЦНС – центральная нервная система Ig – иммуноглобулин 3 Введение Актуальность проблемы. В структуре общей патологии нервной системы удельный вес инфекций составляет 40%. При этом менингиты и менингоэнцефалиты являются наиболее частыми клиническими формами нейроинфекционных заболеваний, 75% заболевших – дети (Н.П.Куприна с соавт.,1999; Н.М.Батерашвили с соавт.,2000; Ю.В.Лобзин с соавт.,2001; В.Ф.Учайкин,2003). Актуальность проблемы определяется часто тяжелым и осложненным течением заболевания, высоким показателем летальности при некоторых нозологических формах, расширением спектра этиопатогенов, вызывающих менингиты и менингоэнцефалиты (Г.Г.Онищенко,2000; Ю.Я.Венгеров с соавт.,2003; В.А.Петров,2002; Д.К.Львов с соавт.,2004; В.В.Малеев, 2004). Известно, что на долю вирусных менингитов приходится 60% всех инфекционных заболеваний нервной системы, более половины из них – это менингиты энтеровирусной этиологии (Т.Р.Харрисон,1994; Н.В.Скрипченко с соавт.,2000). С 1999 года в Российской Федерации ежегодно в летне-осенний период регистрируется сезонное увеличение заболеваемости тяжело протекающими менингитами и менингоэнцефалитами «арбовирусной» этиологии, прежде всего – лихорадкой Западного Нила (ЛЗН) (С.В.Андросова с соавт.,2001; В.И.Журавлев с соавт.,2001; C.Huang et al.,2002; P.Caitlin et al.,2003). На основании клинических данных и исследования ликвора не всегда можно установить этиологическую причину заболевания, оценить тяжесть патологического процесса, что, в свою очередь, может привести к назначению неадекватной терапии (В.В.Пилипенко с соавт.,2001; А.Е.Платонов с соавт.,2001; Е.Н.Родионова с соавт.,2002). Изменения качественного и количественного состава ликвора при вирусных менингитах являются важными диагностическими критериями, однако, часто они лишь умеренно отклонены от нормы и не отражают тяжесть патологического процесса (В.Н.Тимченко с соавт., 2002; З.Л.Хохлова с соавт.,2005). Существенным обстоятельством, затрудняющим диагностику вирусного менингита, является выявление нейтрофильного или смешанного плеоцитоза и увеличенных показателей белка в ранние сроки заболевания, что характерно как для вирусных, так и для бактериальных менингитов (Н.П.Куприна, 1999; B.Cunha et al., 2004). Рост концентрации белков острой фазы (БОФ) циркулирующей крови представляет собой маркер острого воспаления при бактериальных и серозных менингитах (В.Ю.Шанин,1998; Е.В.Пахалкова,2003; S.Tacahashi et al.,1999; Y.Kim et al.,2004). 4 Железосодержащие БОФ - ферритин (ФР) и лактоферрин (ЛФ) оказывают бактерицидное и бактериостатическое действие, являются компонентами протеолитических каскадных реакций, их концентрация существенно изменяется при воспалительно-деструктивных процессах (П.Г.Назаров,2001). Уровень ЛФ в крови увеличен при гнойных менингитах (Г.М.Алешина с соавт.,2000; Т.В.Попонникова с соавт.,2003; О.И.Лыкова с соавт., 2003). Есть сообщения об увеличении уровня ФР в крови и ликворе при менингитах и менингоэнцефалитах «арбовирусной» этиологии (F.Reisenhammer et al.,1997). При вирусных менингитах динамика концентрации железосодержащих БОФ представляется менее изученной. Способность интерлейкинов (ИЛ) регулировать специфические иммунные процессы резко повысила значимость изучения их концентрации в диагностике болезней и определении активности воспалительного процесса (Р.М.Хаитов, 2000; А.С.Симбирцев, 2004; В.В.Иванова с соавт.,2005). Они отражают индивидуальную первичную реакцию на вирусный агент, позволяя оценить характер течения процесса и прогнозировать исход заболевания при многих вирусных инфекциях (Д.В.Стефани,1996; Б.В.Пинегин с соавт., 2000; И.А.Васильева с соавт.,2003). Это важно при объективной оценке эффективности терапии, особенно в случаях применения противовирусных средств, обладающих иммуномодулирующей и иммунокоррегирующей активностью. Особенно актуальной проблемой является изучение эндогенных медиаторов, блокирующих процесс воспаления. К ним относят ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13. Каждый из этих факторов блокирует продукцию или функцию некоторых провоспалительных медиаторов, и только ИЛ-10 действует как универсальный ингибитор синтеза всех цитокинов (Т.В.Вашурина с соавт.,2000; A.Marchant et al.,2004). Концентрация ИЛ-10 меняется и зависит от возбудителя заболевания (С.А.Кетлинский с соавт.,1995; А.А.Останин с соавт.,2002; А.В.Жахов с соавт.,2003; B.Derk et al.,1995). Иммунные комплексы при вирусных инфекциях, оказывают влияние на лимфоциты, при этом избыток ИЛ-10 ведет к снижению противоинфекционной защиты и формированию затяжного или хронического течения инфекции (И.В.Бабоченко с соавт.,2002; В.А.Козлов,2003; Л.С. Приймеги с соавт.,2003; В.Ю.Талаев с соавт.,2004). В литературе недостаточно данных об изучении показателей уровня ИЛ-10 в крови и его изменения при вирусных менингитах у детей. Не разработаны эффективные подходы к оценке степени тяжести состояния и прогноза заболевания на основании динамики 5 БОФ. Вопрос ранней дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных менингитов остается до конца нерешенным. Не разработана схема этиотропной терапии «арбовирусных» и энтеровирусных менингитов с использованием индуктора интерферонов на основе контроля уровня ИЛ-10. Таким образом, изучение показателей БОФ – ФР и ЛФ, а так же цитокина ИЛ-10 в крови при вирусных поражениях центральной нервной системы (ЦНС) является актуальной проблемой. Цель исследования. Совершенствование диагностики и лечения вирусных менингитов у детей на основании изучения их распространенности в Астраханской области, использования показателей концентрации ферритина, лактоферрина, интерлейкина-10 и применения индуктора интерферона «Циклоферон». Задачи исследования: 1. Установить распространенность и этиологическую структуру вирусных менингитов у детей в Астраханской области путем раннего выявления возбудителя заболевания методами полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа. 2. Изучить динамику концентрации противовоспалительного интерлейкина-10 в сыворотке крови у больных вирусными менингитами, выявить ее диагностическое и прогностическое значение в зависимости от тяжести течения менингита. 3. Выявить клинико-диагностическое значение определения концентрации ферритина и лактоферрина сыворотки крови у детей с вирусными менингитами. 4. Оценить эффективность иммуномодулирующего препарата «Циклоферон» и его влияние на уровень интерлейкина-10 в терапии вирусных менингитов у детей. Научная новизна: Впервые изучена этиологическая структура вирусных менингитов в Астраханской области с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Установлена циркуляция наиболее часто встречающихся вирусов. Наибольшее эпидемическое значение имеют возбудитель ЛЗН, а среди энтеровирусов – серотипы ECHO 20, 21, 30. Впервые проведена сравнительная оценка значения методов ПЦР и ИФА для раннего выявления возбудителя ЛЗН с учетом распространенности заболевания. Предложен новый способ объективной оценки тяжести состояния и периода заболевания при вирусных менингитах у детей на 6 основании изучения динамики концентрации ИЛ-10. Изучена динамика концентрации ферритина и лактоферрина в сыворотке крови детей при вирусных поражениях ЦНС. Впервые для дифференциальной диагностики вирусного и менингококкового менингита у детей в ранние сроки заболевания предложено использовать величину концентрации ИЛ-10 в сыворотке крови. Впервые в качестве критерия эффективности использования препарата «Циклоферон» (индуктора эндогенного интерферона) в терапии вирусных менингитов у детей предложено использовать динамику концентрации интерлейкина-10 в сыворотке крови. Практическая значимость. В результате исследования установлено, что энтеровирусы и вирус ЛЗН являются определяющими этиологическими факторами в структуре вирусных менингитов у детей в Астраханской области. Определены доминирующие серотипы. Проведен периодический анализ распространенности вирусных и менингококковых менингитов в Астраханской области в период с 1998 по 2004 годы. Предложена оптимальная схема выявления возбудителя ЛЗН в ранние сроки заболевания: в 1-5 сутки от момента начала заболевания, возможно, его выявление методами ПЦР или ИФА (выявление антигена вируса ЛЗН). Позднее 10 суток от начала заболевания, этиологическая верификация ЛЗН возможна лишь с помощью выявления антител к вирусу. Установлена зависимость между концентрацией ИЛ-10 в сыворотке крови в первые дни заболевания и степенью тяжести менингита у детей. Предложено использовать концентрацию ИЛ-10 в сыворотке крови для дифференциальной диагностики вирусных и менингококковых менингитов у детей, а так же для прогнозирования тяжести течения заболевания. Показатели концентрации железосодержащих БОФ как неспецифические факторы активности воспаления при арбовирусных и энтеровирусных менингитах у детей, могут применяться как дополнительные критерии оценки степени тяжести заболевания. Подтверждена эффективность применения индуктора интерферона Циклоферон при вирусных менингитах у детей, и предложены иммунологические критерии оценки его действия. Основные положения, выносимые на защиту: Этиологическая структура вирусных менингитов на территории Астраханской области представлена преимущественно вирусом ЛЗН и энтеровирусами. Среди энтеровирусов заболеваемость 7 менингитами определяют серотипы: ЕСНО-20, ЕСНО-21 и ЕСНО30. Этиологическая верификация возбудителя ЛЗН возможна на 1-5 сутки заболевания методами ПЦР или ИФА (на вирусные антигены), а с 10 дня – выявлением антител к вирусу ЛЗН методом ИФА. Уровень ИЛ-10 в сыворотке крови детей с вирусными менингитами является объективным критерием степени тяжести в ранние сроки заболевания. Длительно сохраняющаяся высокая концентрация ИЛ-10 характеризует тяжелое и затяжное течение инфекции. Определение концентрации ИЛ-10 в ранние сроки заболевания улучшает дифференциальную диагностику вирусных и менингококковых менингитов у детей. Изменения концентрации железосодержащих белков сыворотки крови детей с вирусными менингитами в динамике характеризует тяжесть заболевания. Высокая концентрации ФР и ЛФ прямо коррелирует с продолжительностью менингеального синдрома и длительностью лихорадки. Применение индуктора интерферона Циклоферон в лечении вирусных менингитов у детей, является рациональным, эффективным и патогенетически обоснованным методом лечения. Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в работу детских отделений Областной инфекционной клинической больницы г. Астрахани. Материалы диссертации используются при подготовке педиатров-инфекционистов, интернов, клинических ординаторов, а так же включены в лекционный курс и семинарские занятия для студентов 5-6 курсов на кафедре детских инфекционных болезней АГМА. Апробация работы: результаты исследования доложены на I-IY ежегодных конгрессах педиатров-инфекционистов, Москва, 2002,2003,2004,2005; Всероссийской конференции «Современные проблемы профилактической педиатрии», Москва, 2003; Всероссийском конгрессе врачей-инфекционистов, Москва, 2003; конференции «Клинико-патогенетические аспекты и лечение арбовирусных и геморрагических лихорадок», Волгоград, 2003; научно-практической конференции и школе-семинаре для молодых ученых, Астрахань-Москва, 2004; конференции молодых ученых и студентов Южного федерального округа, Краснодар, 2004; 8 конференции «Губерния в 21 веке: взгляд молодого поколения», Астрахань, 2003; научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии Юга России, Ростов-на-Дону, 2005; заседаниях Астраханского научного общества врачейинфекционистов и эпидемиологов, 2003,2004,2005; научных сессиях сотрудников и врачей Астраханской области, 2002,2003,2004,2005,2006; По теме диссертации опубликовано 23 научные работы, подана заявка на Патент РФ «Способ оценки степени тяжести менингококковых и вирусных менингитов у детей» № 2005139465/ 15 (043996) приоритет от 16.12.2005 г. Структура и объем диссертации: диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы содержащего 276 источников (155 отечественных и 121 иностранных авторов). Текст иллюстрирован 20 таблицами и 9 рисунками. Содержание работы Общая характеристика обследованных больных. На первом этапе исследования нами были проанализированы истории болезни 1199 детей в возрасте до 14 лет, госпитализированных в ОИКБ с диагнозом: «Менингит». Среди них, по данным обследования (изменения в СМЖ, полученные после люмбальной пункции), признаки менингита были обнаружены у 873 больных (578 случаев вирусных менингитов и 295 менингококковых менингитов). У 326 больных выставлен диагноз «нейротоксикоз» различной этиологии. На этом этапе проведена оценка распространенности и этиологической структуры менингитов. На втором этапе исследования для исследования клинических и иммунологических показателей сформирована группа из 185 больных в возрасте от 3 до 14 лет, у которых менингит был подтвержден различными клиническими и лабораторными методами исследования (152 больных вирусными менингитами и 33 больных менингококковым менингитом). После уточнения этиологии заболевания, больные распределены следующим образом: энтеровирусная инфекция, менингит - 75 больных; лихорадка Западного Нила, менингит - 54 больных; 9 лихорадка Тагина, менингит – 3 больных; вирусный менингит невыясненной этиологии – 20 больных; менингококковая инфекция, менингит – 33 больных. Минимальное количество наблюдений в выборке определяли по формуле И.С.Случанко (1974). Диагноз выставлялся на основании комплекса клинико-лабораторных, инструментальных исследований и анамнестических данных. Этиологический диагноз подтвержден выделением вирусных РНК из крови и ликвора методом ПЦР (ликвор исследовался в первые сутки поступления в стационар). Диагноз дополнен серологическим исследованием (ИФА с использованием парных сывороток для определения антигенов и антител). Диагностически значимым считалось обнаружение титра Ig М в разведении 1:800. Лабораторные и инструментальные исследования в неосложненных случаях проводились дважды (1-3 и 7-10 сутки пребывания в стационаре), при тяжелом и затяжном течении трижды: при поступлении, через 7-10 дней лечения и на 17-20 сутки. У 20 больных серозными менингитами, включенными в группу исследования, этиологию заболевания установить не удалось. Диагноз менингококковой инфекции подтверждался бактериологически (посев ликвора), бактериоскопически и серологически (ИФА с обнаружением титра Ig М). По возрасту, больные распределялись следующим образом: до 3 лет детей не было, от 3 до 7 лет - 67 человек, от 7 до 14 лет – 118 человек (дети школьного возраста), что отражает общую закономерность возрастного распределения при данных инфекциях. Мальчиков было 104, девочек 81. Дети поступали в стационар на 1-3 день от начала заболевания. Большая часть больных (128 человек 69%) поступили на лечение в первые сутки от начала заболевания. Дети, поступившие позднее 3 дня заболевания, больные с сопутствующей патологией были исключены из выборки, в которой проводилось исследование биохимических и иммунологических показателей. Для проведения сравнительного анализа эффективности ранней этиологической диагностики ЛЗН методами ПЦР (РНК вируса), выявление антигенов возбудителя ЛЗН (ИФА) и выявления антител к вирусу (ИФА) у больных вирусными менингитами при поступлении в стационар изучены 34 пробы крови и ликвора больных с диагнозом ЛЗН, поступивших в первый день заболевания. Изучение эффективности препарата «Циклоферон» проводили в дизайне рандомизированного контролируемого исследования. Рандомизацию проводили методом конвертов. Оценку эффективности 10 препарата «Циклоферон» проводили у 39 детей в возрасте от 7 до 14 лет госпитализированных по поводу вирусного менингита. По возрасту, больные распределились следующим образом: от 7 до 10 лет – 43 человека (из них 30 – в группе, получавшей Циклоферон, 13 детей – в контрольной группе). Детей от 11 до 14 лет – 27 человек (в том числе 9 – в исследуемой группе, 18 – в контрольной). Основная группа (39 человек) - получали Циклоферон в возрастных дозировках 1 раз в день перед едой по рекомендуемой производителем схеме (1,2,4,6,11,14 день). Пациенты группы сравнения (31 человек) получали общепринятую симптоматическую, патогенетически направленную (базисную) терапию, назначаемую и больным основной группы. Оценивали влияние препарата «Циклоферон» на особенности течения заболевания (продолжительность и выраженность симптомов, температурную реакцию), влияние препарата на продукцию ИЛ-10 в сыворотке крови. Методы исследования. Биохимические исследования выполнены автором в лаборатории кафедры биохимии АГМА (зав. – доцент Д.М.Никулина) при непосредственном участии заведующего лабораторией П.А.Иванова и врача И.В.Яровой. Этиологическая расшифровка менингитов (ПЦР) проведена в ЦНИИ эпидемиологии (г. Москва) д.б.н. А.Е.Платоновым и к.м.н. В.И.Журавлевым, которым выражаем глубокую признательность. Исследование показателей ФР, ЛФ и ИЛ-10 в сыворотке крови проводили в динамике заболевания: при поступлении (1-3 сутки) и после курса лечения в периоде ранней реконвалесценции (7-10 сутки), при затяжном течение заболевания на 17-20 сутки. Сыворотка замораживалась и хранилась при температуре –20°С до момента исследования. Аналогичным образом поступали с ликвором после проведения диагностической люмбальной пункции. Метод определения ЛФ. Для определения ЛФ использовалась коммерческая тест-система «Лактоферрин-стрип»- ЗАО «Вектор-Бест» г. Новосибирск. Чувствительность тест-системы 4 нг/мл. Контрольный показатель у детей - 650±58 нг/мл. Метод определения ФР. Для определения ФР использовалась коммерческая тест-система («Ferritin-ИФА-тест», «Orgentec», Австрия. Чувствительность тест-системы 5 нг/мл. Контрольный показатель у детей - 25,1±5,2 нг/мл. Метод определения ИЛ-10. Для определения ИЛ-10 использовалась коммерческая тест-система для твердофазного ИФА 11 «Human ИЛ-10 Biosours», Бельгия. Чувствительность тест-системы 1 пкг/мл. Контрольный показатель у детей - 0-1 пкг/мл. Сыворотки крови больных исследовали на наличие маркеров (антигенов и антител) вирусов в различных вариантах ИФА с коммерческими диагностическими тест-системами, выпускаемыми в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН (г. Москва). Статистическая обработка данных и периодический анализ. Анализ распространенности «арбовирусной» и энтеровирусной инфекции проведен с использованием уравнения регрессии Фурье для описания сложных колебательных процессов (Н.А.Плохинский, 1970). Для медицинской практики важно выявление не только средних, но и «крайних» (минимальных и максимальных) значений распространенности, а также периода их колебаний (рисунок 1). y ( x ) a b sin( 360 360 x) c cos( x) r r Рисунок 1. Уравнение регрессии Фурье Алгоритм анализа Фурье в виде компьютерной программы на базе стандартного пакета MS Excel XP составлен под руководством заведующего курсом медицинской статистики Астраханской государственной медицинской академии доцента А.Б.Федоренко. Анализ количественных данных проведен с помощью прикладного пакета программ <Анализ данных> MS Excel XP (описательная статистика; двухвыборочный F-тест для дисперсии удовлетворял условию F>Fкрит при p<0,05; двусторонний t-тест для средних значений признака - достоверными считали различия при условии t>Tкрит при p<0,05; регрессионный анализ, r2 - значение коэффициента корреляции – ±(0-0,3) – слабая (положительная или отрицательная) корреляционная связь), ±(0,4-0,6) – средняя (положительная или отрицательная) корреляционная связь, ±(0,7-1,0) – сильная (положительная или отрицательная) корреляционная связь. Результаты исследования На территории Астраханской области с 1999 по 2004 годы заболеваемость «арбовирусными» менингитами была обусловлена возбудителем ЛЗН (68,9% среди всех «арбовирусных» инфекций). Вирусы Инкоо, Синдбис, Тагина, Батаи и некоторые новые вирусы, 12 находящиеся на идентификации, в настоящее время являются этиологическими факторами спорадической заболеваемости. Среди энтеровирусов заболеваемость менингитами определяют штаммы вирусов ЕСНО-20,21,30. Вирусы Коксаки-А серотипы 1-11, 14, 16-18, 22, 24, Коксаки-В серотипы 1-6, 9. Ядра природных очагов «арбовирусов» расположены, преимущественно в дельтовых районах - Камызякский, Володарский, Икрянинский и Лиманский районы и в городе Астрахани. Резкое утяжеление и изменение клинической картины болезни, по сравнению с более ранним описанием заболевания, указывает на возможность изменений в геноме вируса ЛЗН и появления его новых модификаций, обладающих повышенной вирулентностью и выраженной нейротропностью (Д.К.Львов и соавт 2004). Распространенность верифицированных случаев менингита была представлена следующим образом: энтеровирусные менингиты 17%, «арбовирусные» менингиты (ЛЗН) 11,2%, паротитные менингиты 0,16%, менингококковые 24,6%. Структура вирусных менингитов у детей в Астраханской области (рисунок 2). Заболеваемость арбовирусными менингитами имеет выраженную летне-осеннюю сезонность с появлением первых случаев заболевания в июне, пиком заболеваемости, приходящимся на август-сентябрь и единичными случаями в октябре-ноябре. Заболеваемость энтеровирусными менингитами выше в летний период (июль-август). энтеровирусные Батаи неклассифицированные ЛЗН Инкоо паротитные Тагина Синдбис неподтвержденные 176 2 18 9 10 204 6 18 135 Рисунок 2. Структура вирусных менингитов (всего - 578 больных) По данным периодического анализа, всплеск заболеваемости менингитами, скорее всего, определялся ростом числа больных 13 «арбовирусными» инфекциями. Период колебаний заболеваемости «арбовирусной» инфекцией составляет 2-2,5 года. Несмотря на снижение количества заболевших в последние 2 года после всплеска 2002 года, по-прежнему, существует тенденция к росту количества больных данными инфекциями в ближайшие 2-3 года. Заболеваемость энтеровирусными менингитами на фоне выраженной сезонной зависимости (пик приходится на июль-август) представляется более стабильной, чем «арбовирусными» менингитами, с периодом колебаний около 2-3 лет. Применяя периодический анализ, можно предположить рост числа больных в ближайшие 2-3 года. При сопоставлении графиков заболеваемости вирусными менингитами, складывается впечатление о периодической смене доминирующей роли «арбовирусов» и энтеровирусов. Наблюдая всплеск заболеваемости вирусными менингитами в 2002 году, и связывая его с «арбовирусами», отмечен постепенный рост числа случаев энтеровирусных менингитов, которые, скорее всего, будут определять заболеваемость в ближайшие годы. Периоды снижения распространенности отдельных форм вирусных менингитов могут быть связаны с развитием постинфекционного иммунитета вследствие так называемой «немой иммунизации», возникающей в результате частых контактов с возбудителями, обладающими низкой патогенностью. Наиболее сложным периодом для выявления вируса ЛЗН являются 5-10 сутки заболевания, поскольку резко снижается чувствительность как ПЦР, так и ИФА для выявления антигенов возбудителя. Очевидно, что для диагностики (ЛЗН) наиболее целесообразно использовать ПЦР не позднее 3-5 суток (чувствительность 80%) от начала заболевания для детекции РНК и ИФА для выявления антигенов – не позднее 1-3 суток (в данные сроки чувствительность ПЦР и ИФА приближается к 100%). Для диагностики на поздних сроках заболевания эффективны методы, основанные на выявлении специфических антител. У больных с тяжелым течением менингита к 1-3 суткам заболевания нами отмечено повышение концентрации ФР до 50,99 – 60,31 нг/мл с последующим ростом к 7-10 суткам заболевания до 52,21 – 92,21 нг/мл. У больных с легким течением вирусного менингита к 13 суткам заболевания происходит увеличение концентрации ФР до 33 – 47,2 нг/мл и возрастает к периоду ранней реконвалесценции до 36,9 – 45,1 нг/мл. При средней тяжести вирусного менингита концентрация ФР к 1-3 суткам заболевания составляет 36,63 – 66,83 нг/мл, а к периоду ранней реконвалесценции – 29,94 – 47,66 нг/мл (таблица 1). 14 Рост концентрации ФР к периоду ранней реконвалесценции соответствует продолжительному сохранению менингеальных симптомов и затяжной санации ликвора. 15 Таблица 1 Концентрация ФР в сыворотке крови больных вирусными менингитами в зависимости от тяжести течения заболевания Степень тяжести Дни заболевани я Легкая Средняя Тяжелая 1-3 7-10 1-3 7-10 Значение показателя (152 больных) 40,1 ± 7,1 41 ± 4,1 51,7 ± 15,1 38,8 ± 8,86 1-3 M±m(нг/мл) 55,63 ± 4,68 Затяжное течение 7-10 1-3 7-10 72,21 ± 20,0 65,33 ± 8,19 74,39 ± 30,7 r2 -0,19 0,94 0,17 0,12 *-двухвыборочный F-тест для дисперсии удовлетворяет условию F>Fкрит при p<0,05, двусторонний t-тест для средних значений удовлетворяет условию t>Tкрит при p<0,05. Снижение концентрации ЛФ к периоду ранней реконвалесценции у больных вирусными менингитами тяжелого течения происходит от 799,2 нг/мл до 360,8 нг/мл, в группе больных вирусными менингитами легкого течения - от 310,28 до 153,84 нг/мл (р>0,05), и при средней тяжести заболевания - от 492 до 316 нг/мл (р<0,05) (таблица 2). Наибольший рост концентрации ЛФ отмечен у больных с длительной температурной реакцией, затяжной санацией ликвора, продолжительными менингеальными симптомами. Таблица 2 Концентрация ЛФ в сыворотке крови больных вирусными менингитами в зависимости от тяжести течения заболевания Степень тяжести Дни заболевания Значение показателя (152 больных) Легкая 1-3 7-10 310,2 ± 74,1 153,8 ± 41,1 Средняя 1-3 7-10 Тяжелая 1-3 M±m (нг/мл) 492,1 316,4 799,2 ± ± ± 118* 52,46* 143,01 Затяжное 7-10 1-3 7-10 360,8 ± 48,87 905,541 ± 219,86 814,40 ± 418,36 r2 -0,16 -0,32 -0,09 -0,25 *-двухвыборочный F-тест для дисперсии удовлетворяет условию F>Fкрит при p<0,05, двусторонний t-тест для средних значений: t>Tкрит при p<0,05 При вирусных менингитах достоверная корреляционная связь получена между колебаниями показателей лейкоцитов в ликворе и 16 концентрацией ФР (r2=0,14, p=0,04) в группе тяжелых больных. Учитывая достоверность значений концентрации ФР и ЛФ только у больных с повышенным содержанием белка ликвора (ФР), трехзначным и смешанным цитозом (ФР и ЛФ), следует отметить, что данные показатели могут свидетельствовать о деструктивных изменениях в ЦНС, сопровождающихся снижением концентрации ФР крови. Однако, значительных изменений концентрации железосодержащих белков у больных с лимфоцитарным цитозом и затяжной санацией ликвора, характеризующих вирусный процесс, не обнаружено. Отсутствие статистически значимых колебаний концентрации железосодержащих БОФ у больных разных групп имеет место, повидимому, из-за различий их исходных индивидуальных показателей (по результатам F-теста для дисперсии), а повышение ФР в периоде ранней реконвалесценции отражает еще и большую потребность организма в этом микроэлементе в процессе репарации. Снижение концентрации ЛФ у больных вирусными менингитами не может быть следствием лейкопении - у большинства больных были нормальные значения лейкоцитов, и лишь к периоду ранней реконвалесценции – лейкопения. Отсюда следует, что при вирусном менингите может иметь место нарушение синтеза ЛФ в нейтрофилах, а увеличение концентрации ЛФ к периоду реконвалесценции связано с восстановлением способности нейтрофилов к синтезу ЛФ. Усиление продукции ИЛ-10 может свидетельствовать о дифференцировке Th-0 в направлении Th-2 фенотипа на фоне затяжной вирусной инфекции. В наших исследованиях данное предположение подтвердилось: у больных с затяжным течением заболевания отмечалось стойкое увеличение концентрации ИЛ-10 в динамике. При тяжелом течении менингита, концентрация ИЛ-10 на 1-3 сутки составляет 4,24 – 4,58 пкг/мл, возрастая на 7-10 сутки свыше 4,94 – 5,56 пкг/мл; при затяжном течении вирусного менингита концентрация в 1-3 сутки составила 4,48 – 5,08 пкг/мл с увеличением к 7-10 суткам до 6,15- 6,99 пкг/мл; при легком и среднетяжелом течении вирусных менингитов концентрация ИЛ-10 на 1-3 сутки составляет 3,61 – 3,89 пкг/мл, а на 7-10 сутки - не более 4,25 – 4,81 пкг/мл (таблица 3). На основе полученных данных о динамике концентрации ИЛ-10, нами разработан способ ранней оценки тяжести течения менингитов у детей. Чувствительность – 87%, диагностическая точность 82%. Отрицательные значения этого теста имеют меньшее значение. 17 Таблица 3 Концентрация ИЛ-10 в сыворотке крови больных вирусными менингитами в зависимости от тяжести течения заболевания Степень тяжести Дни заболевания Легкая 1-3 7-10 Средняя 1-3 7-10 Тяжелая 1-3 7-10 Затяжное 1-3 7-10 M±m (пг/мл) Значение 3,21± 3,5± 3,75 ± 4,53 ± 4,41± 5,25 ± 4,78± 6,57± показателя 0,12* 0,11* 0,14* 0,29* 0,17* 0,31* 8,19* 0,42* (152 больных) r2 0,69 0,24 0,61 0,72 *-двухвыборочный F-тест для дисперсии удовлетворяет условию – F>Fкрит при p<0,05, двусторонний t-тест для средних значений удовлетворяет условию – t>Tкрит при p<0,05; r2- значение коэффициента корреляции Пирсона. Установлено, что в остром периоде заболевания у детей с менигококковыми менингитами уровень ИЛ-10 в 2,5-3 раза превышает тот же показатель у больных с вирусными менингитами. При этом в динамике к периоду ранней реконвалесценции при менингококковой инфекции отмечается резкое снижение сывороточной концентрации ИЛ-10 (при среднетяжелом течении концентрация ИЛ-10 на 1-3 сутки составляет 7,21- 7,75 пкг/мл, снижается на 7-10 сутки до 3,76-4,5 пкг/мл). Данный показатель может быть использован в качестве дополнительного критерия для дифференциальной диагностики вирусных и менингококковых менингитов в раннем периоде заболевания. Высокие показатели эффективности данного теста делают возможным использование его в клинике: чувствительность – 85,7%, специфичность – 100%, точность – 88,8%. При лечении больных с вирусными поражениями ЦНС использовался индуктор эндогенного ИФН, препарат «Циклоферон»: у больных вирусными менингитами пероральное введение препарата способствовало достоверному сокращению длительности лихорадки, симптомов интоксикации, менингеального синдрома по сравнению с контрольной группой детей. Отмечено положительное влияние препарата на динамику температурной реакции: до начала лечения ее структура у детей в сравниваемых группах была практически одинакова с преобладанием случаев заболеваний с повышением температуры более 38°С, а на следующий день после начала применения препарата число случаев менингита с длительной лихорадкой достоверно сократилось. Максимальное количество случаев снижения температуры на фоне приема Циклоферона наблюдалось на 3-й день от начала его 18 приёма. Если в контрольной группе повышенная температура тела сохранялась к 3 дню заболевания в 48,4% случаев, то на фоне приема препарата - лишь в 10,1%. Однако существенных сдвигов в динамике гематологических показателей не наблюдалось. Действие Циклоферона связано с уменьшением концентрации интерлейкинов-супрессоров, способствующих аутоантителообразованию, и увеличением цитокинов Th-1 с иммуностимулирующей активностью – ИФН. Концентрация ИЛ-10 снижалась в группе больных, получавших препарат с 4,26±0,23 до 3,55±0,46 пкг/мл, а в контрольной группе – увеличивалась с 4,17±0,19 пкг/мл до 4,66±0,23 пкг/мл. Достоверные различия концентрации ИЛ10 и ФР на фоне лечения Циклофероном подтверждают полученный положительный эффект (таблица 4). Таблица 4 Динамика уровня ИЛ-10, ФР и ЛФ в сыворотке крови детей, получавших Циклоферон Сроки и Циклоферон n=39 Контроль n=31 группы 1-3 сутки 7-10 сутки 1-3 сутки 7-10 сутки наблюдений ИЛ-10 4,17±0,19 4,66±0,23 4,26±0,23* 3,55±0,46* (пкг/мл) ФР (нг/мл) 45,53±4,68 74,39±30,7 45,57±6,46* 35,49±4,39* ЛФ ( нг/мл) 477,03±68,42 333,8±57,65 492±118,41 316,41±52,46 * - различия показателей основной и контрольной групп достоверны при р<0,05. Использованный нами комплексный подход к изучению распространенности различных вирусных менингитов, позволил определить доминирующие этиологические формы заболевания и их временные закономерности, приблизиться к краткосрочному прогнозированию заболеваемости. Количественная оценка эффективности диагностических тестов, основанная на тщательном отборе больных в исследуемой группе с учетом распространенности патологии определила диагностическое значение концентрации железосодержащих БОФ и ИЛ-10 при вирусных менингитах у детей: ИЛ-10 – ранняя (1-3 сутки) оценка степени тяжести заболевания и возможность применения в ранней дифференциальной диагностике вирусных менингитов, критерий эффективности этиотропной терапии (7-10 сутки); ферритин – оценка выраженности системного воспалительного ответа (рост показателя к периоду ранней реконвалесценции при тяжелых формах заболевания – 7-10 сутки); лактоферрин – оценка выраженности системного 19 воспалительного ответа (снижение показателя к периоду ранней реконвалесценции – 7-10 сутки). Каждый вариант иммунного ответа сопряжен с особенностями течения заболевания, что свидетельствует о неразрывной связи иммунопатогенеза и клиники инфекции. В перспективе диагностика особенностей иммунного ответа с учетом индивидуальных механизмов, может быть использована для своевременного прогноза развития осложнений и исходов заболеваний. Это открывает возможности для назначения обоснованной иммунотерапии. Выводы: Определение этиологической структуры вирусных менингитов позволило выявить энтеровирусную природу заболевания у 35,2% больных, арбовирусную - у 33,8%, паротитную - у 0,34%. Распространенность менингитов энтеровирусной этиологии у детей в Астраханской области - 17% (преобладают серотипы ЕСНО-20, ЕСНО-21, ЕСНО-30). Распространенность арбовирусных менингитов - 11,2% (преобладает вирус лихорадки Западного Нила – 68,9%). 2. Выявление РНК или антигенов вируса лихорадки Западного Нила в крови больных на 1-3 день заболевания возможно при помощи ПЦР или ИФА с чувствительностью около 100%. На 3-5 день заболевания метод ПЦР обладает чувствительностью 80%, а ИФА - 50%. Позднее 5 дня заболевания использование данных методов неэффективно. 3. Концентрация интерлейкина-10 в крови у детей определяет тяжесть течения и продолжительность вирусного менингита: рост показателя к 7-10 суткам соответствует тяжелому и длительному течению заболевания с затяжной санацией ликвора. 4. Разработанный способ ранней оценки тяжести течения вирусного менингита у детей на основании динамики концентрации интерлейкина-10 наиболее эффективен в течение первых 10 суток заболевания: чувствительность – 87%, диагностическая точность 82%. 5. Определено значение исследований ферритина и лактоферрина в диагностике вирусных менингитов. Рост концентрации ферритина на 54,9% (от 799,2±143,01 нг/мл до 360,8±48,87 нг/мл, p<0,05) и снижение концентрации лактоферрина на 31,7% (от 55,63±4,68 нг/мл до 72,21±20,0 нг/мл, p>0,05) к периоду ранней реконвалесценции характеризует тяжесть воспалительного ответа и соответствует тяжелому течению заболевания с санацией ликвора более 20 дней и 1. 20 6. лихорадочному периоду более 5 дней. Включение Циклоферона в комплексное лечение детей больных вирусным менингитом способствует уменьшению выраженности и длительности симптомов интоксикации, менингеального синдрома, сокращает сроки пребывания в стационаре на 3-5 дней. Положительный эффект лечения Циклофероном подтверждается снижением концентрации ИЛ-10 на 17% (от 4,26±0,23 до 3,55±0,46 пкг/мл, p<0,05). Практические рекомендации: 1. 2. 3. 4. Выявление наиболее значимых штаммов «арбовирусов» и энтеровирусов позволяет проводить эпидемиологическое районирование территории с выделением зон наиболее высокого риска заражения вирусными менингитами. Применение генетических и ИФА методов исследования значительно улучшает раннюю диагностику лихорадки Западного Нила. Оптимальными сроками исследования крови с целью выявления РНК и антигенов вируса являются 1-5 сутки заболевания. Рекомендуется определение ИЛ-10 в крови в раннем периоде заболевания, для оценки тяжести и прогнозирования течения вирусных менингитов у детей (чувствительность 87%, точность 82%). Рекомендовано включение препарата «Циклоферон» в комплексную терапию вирусных менингитов у детей. 21 Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Лихорадка Западного Нила в Астраханской области/ Сб. трудов АГМА – Астрахань – 2001. (соавт. Г.А.Харченко) Клинико-эпидемиологические аспекты арбовирусных инфекций в Астраханской области/ Сб.: Первый конгресс педиатров-инфекционистов России – Москва – 2002–С.203. (соавт.: Г.А.Харченко, В.И.Журавлев, Ю.В.Оганесян, О.Г.Харченко) Клинические особенности вирусных менингитов у детей/ Сб.: Первый конгресс педиатров-инфекционистов России – Москва – 2002–с. 204. (соавт. Г.А.Харченко) Экологические и клинико-эпидемиологические аспекты арбовирусных инфекций в Астраханской области/Сб. трудов АГМА – Астрахань – 2002 – С.362 (соавт.: Г.А.Харченко, В.И.Журавлев, О.Г.Харченко) Вирусные менингиты у детей// Вопросы современной педиатрии –2003 – т.2(1)-С. 387 (соавт.: Г.А.Харченко, Л.Н.Степанченко) Эффективность применения амиксина и виферона для лечения лихорадки Западного Нила у детей/ Сб.: Второй конгресс педиатров-инфекционистов России – Москва – 2003 – С.203 (соавт. Г.А.Харченко) Экологические аспекты природно-очаговых инфекций в Астраханской области/ Там же, с.202 (соавт.: Г.А.Харченко, Ю.В.Оганесян, О.Г.Харченко) Лихорадка Западного Нила у детей в Астраханской области/ Сб. трудов 1 Поволжской конференции «Клинико-патогенетические аспекты и лечение арбовирусных и геморрагических лихорадок» - Волгоград – 2003 (соавт. Г.А.Харченко) Арбовирусная инфекция у детей в Астраханской области/ Сб. трудов ежегодной научно-практической конференции молодых ученых Астраханской области – Астрахань – 2003 (соавт. О.Г.Харченко) Арбовирусная инфекция в Астраханской области/ Сб.: «Губерния в XXI веке – взгляд молодого поколения» - Астрахань – 2003 (соавт. О.Г.Харченко) Новые природно-очаговые инфекции Юга России/ Сб.: «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» - СПб – 2004 (соавт. О.Г.Харченко) Вирусные поражения центральной нервной системы у детей в Астраханской области/ Сб. трудов конференции молодых ученых и студентов Южного Федерального округа – Краснодар – 2004 (соавт. О.Г.Харченко) Генодиагностика вирусных менингитов/ Сб. научных трудов АГМА – Астрахань – 2004 – С. 98 (соавт. Г.А.Харченко) Характеристика природных очагов арбовирусных инфекций в Астраханской области/ Сб. научных трудов АГМА – Астрахань – 2004 –с. 96 (соавт. Г.А.Харченко) 22 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. Генодиагностика вирусных менингитов/ Сб.: Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины Астрахань-Москва – 2004 – С.214. (соавт. Г.А.Харченко) Роль арбовирусов в инфекционной патологии детей Астраханской области/ Сб.: Третий конгресс педиатров-инфекционистов России – Москва – 2004. – С .250 (соавт. Г.А.Харченко) Природные очаги арбовирусов на территории Астраханской области/ Сб.: Третий конгресс педиатров-инфекционистов России – Москва – 2004. – С.250 (соавт. Г.А.Харченко) Вирусные поражения ЦНС и новые природно-очаговые инфекции Юга России/ Сб.: Третий конгресс педиатров-инфекционистов России – Москва – 2004. – С. 249 (соавт. Г.А.Харченко) Энтеровирусная инфекция у детей в Астраханской области/ Сб.: Актуальные вопросы инфекционной патологии Юга России - Ростов-наДону – Краснодар – 2005. – С.124 (соавт.: Г.А.Харченко, Ю.В.Оганесян, И.Ф.Плискевич, О.Г.Харченко) Тактика ведения больных с серозными менингитами/ Сб.: Актуальные вопросы инфекционной патологии Юга России - Ростов-на-Дону – Краснодар – 2005. – с. 125-127 (соавт. Г.А.Харченко, Ю.В.Оганесян, Л.С.Чанпалова, Л.И.Родина) Изучение лактоферрина и ферритина в крови при вирусных менингитах у детей/ Сб.: Четвертый конгресс педиатров-инфекционистов России – Москва – 2005 – С.184. (соавт.: Г.А.Харченко, П.А.Иванов, Н.А.Захарова) Изучение ИЛ-10 при вирусных менингитах у детей/ Сб.: Четвертый конгресс педиатров-инфекционистов России – Москва – 2005 –с. 185 (соавт.: Г.А.Харченко, П.А.Иванов, И.Ф.Плискевич, С.М.Колодяжная). Способ оценки степени тяжести менингококкковых и вирусных менингитов у детей / Заявка на получение Патента РФ № 2005139465/ 15(043996) приоритет от 16.12.2005 г. (соавт.: П.А.Иванов, Г.А.Харченко). 23