Биохимия-часть2 - Астраханский Государственный

АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра органической, биологической и
физколлоидной химии
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Методические указания по выполнению лабораторных работ для студентов
специальности 020803.65 “Биоэкология”,
240902.65 “Пищевая биотехнология”, 110901.65 “Водные биоресурсы и
аквакультура”, 080401.65 “Товароведение и экспертиза товаров",
260100.62 “Технология продуктов питания”.
Часть II
АСТРАХАНЬ 2010 г.
Методические указания содержат введение, описание
техники
безопасности и противопожарных мер при работе в лаборатории органической
химии, описание лабораторных работ по органической химии (часть 2).
Составители: к.х.н., доц. кафедры органической химии
Алевтина Ивановна, ведущий инженер Васильева Елена Андреевна.
Фоменко
Методические указания рассмотрены и утверждены на заседании
кафедры органической химии (протокол № 9 от 25 октября 2010 г.)
Рецензент: д.т.н., профессор Долганова Наталья Вадимовна
2
Содержание
1.
Лабораторная работа № 1……….........................................……….....4
2.
Лабораторная работа № 2……………………………………………..8
3.
Лабораторная работа № 3……………………………………………..12
4.
Лабораторная работа № 4……………………………………………..21
3
Тем а :
"СВОЙСТВА Ф ЕРМ ЕН ТО В ".
При выполнении данной работы вам понадобятся р еа к т и вы, являющиеся в той или иной степени токсичными - это СuSO4, раствор
Фелинга II, а также раствор Люголя (р-р J 2 в H 2 O с добавлением КJ).
СuSO4 и раствор Фелинга не летучи, из раствора Люголя J 2 может
улетать. Все реактивы, в особенности раствор Люголя, не следует без
надобности держать открытыми!
После работы с ними следует тщательно мыть руки.
Лабораторная работа № 1.
"ОБЩИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ"
Опыт №1: Влияние температуры на скорост ь реакции,
ускоряемой ферментом.
Скорость реакций, идущих в присутствии неорганических
катализаторов, возрастает с повышением температуры.
Так, крахмал быстро гидролизуется в присутствии соляной и
разбавленной серной кислоты только при кипячении.
Наиболее благоприятной температурой для действия боль шинства
ферментов, находящихся в организме человека, является температура
35-40ºС.
При
повышении
температуры
фермент
начина ет
денатурировать.
Понижение температуры ниже оптимума является причиной
понижения реакционной способности молекул. В этом можно
убедиться, исследуя действие амилазы слюны на крахмал при 0 º, 37º,
100ºС.
Оборудование и реактивы:
1. Штатив с пробирками.
2. Воронка.
3. Стаканчик на 30 мл.
4 . В о д я на я баня.
5. Чаша со льдом.
6. Крахмал – 0,1% раствор.
7. Р-р Л юго л я.
8. Амилаза слюны - готовится каждым студентом.
Ход работы: В стаканчик собирают слюну и разбавляют ее в пять раз
дистиллированной водой. Если в растворе будут загрязнения, то
фильтруют его через несколько слоев марли.
4
В три пробирки вносят по 10 капель разбавленной слюны и
помещают их:
1- в кипящую баню
2- в баню при 37-40ºС
3- в баню со льдом
Через 5-7 минут во все три пробирки добавляют по 10 ка пель
крахмала, тщательно перемешивают содержимое каждой про бирки и
ставят в те же условия. Замечают время. Через пять минут пробирки
вынимают из бань. Пробирку вынутую из кипя щей бани, охлаждают под
краном. Добавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора Люголя и
отмечают результат.
Таблица №1.
субстрат
катализатор
КРАХМАЛ
0º
37º
100º
амилаза
Как далеко прошел гидролиз в каждой пробирке? Сделайте вывод.
Гидролиз крахмала протекает по схеме:
крахмал
с J2 синее
окрашивание
растворимый крахмал
фиолетовое
окрашивание
мальтоза
светло желтое орашивание
(не изменяет окраски J 2)
декстрины
красное
красно бурое
бурое окрашивание
,D глюкоза
Каждый продукт реакции дает разное окрашивание с раствором Люголя.
Опыт №2: Специфичность действия амилазы и сахаразы.
Для изучения специфичности действия амилазы и сахаразы можно
воспользоваться тем, что при гидролизе субстратов (крахмал, сахароза), на
которых мы будем исследовать ферменты, образуются соединения, обладающие
редуцирующими свойствами, т.е. дающие положительную реакцию Троммера.
Фелинга, Толленса и др., в то время как исходные субстраты - крахмал, сахароза
5
- этих реакций не дают, т.к. в их молекуле нет свободных гликозидных
гидроксилов (карбонильной группы).
H
O
H
H
H
HO
H
H
OH
H
O HO
H
O
H
H
+ H2O
OH
O
H
O
CH2OH
CH2OH
C
H
HO
H
H
H
HO
H
H
OH
H
O
OH
CH2OH
H
HO
H
H
OH
H
OH
OH
CH2OH
α-D-глюкоза (при полном гидролизе)
C
CH2OH
+ H2O
H
O
OH
HO
H
H
OH
H
O
OH
O
C
CH2OH
H
O
H
n
крахмал
H
OH
C
C
C
H
HO
H
H
OH
OH
H
O
OH
CH2OH
HO
+ HO
CH2OH
CH2OH
сахароза
α,D-глюкоза
Оборудование и реактивы:
1. Штатив с пробирками
2. Водяная баня
3. Сахароза 0,1% р-р свежеприготовленный
4. Крахмал 0,1% р-р свежеприготовленный
5. Сахараза
6. Амилаза
7. Реактив Фелинга I и II.
Можно использовать раствор амилазы, оставшийся от опыта №1.
6
H
H
H
O
OH
CH2OH
β,D-фруктоза
СПЕЦИФИЧНОСТЬ АМИЛАЗЫ.
Ход работы: Вносят в одну пробирку 10 капель раствора крахмала, во вторую
10 капель раствора сахарозы. В обе пробирки добавляют по 5 капель амилазы
слюны и помещают пробирки в водяную баню при t =37-40ºС.
Через 10 минут пробирки вынимают, охлаждают, добавляют по 5-6
капель реактива Фелинга (3 капли раствора Фелинга I и 3 капли раствора
Фелинга II).
Нагревают пробирки в пламени горелки. Отмечают результаты.
СПЕЦИФИЧНОСТЬ САХАРАЗЫ.
Ход работы: В одну пробирку вносят 10 капель раствора крахмала, в другую
10 капель раствора сахарозы. Затем в обе пробирки добавляют по 5 капель
сахаразы. Помещают пробирки в баню при 37-40°С на 10 минут. Затем
вынимают их из бани, охлаждают и проводят реакцию Фелинга, так, как
описано выше.
Результаты вносят таблицу № 2 (полученная окраска).
Таблица №2.
РЕАКЦИЯ ФЕЛИНГА
субстрат
КРАХМАЛ
САХАРОЗА
фермент
АМИЛАЗА
САХАРАЗА
Сделайте выводы.
Опыт №3. Влияние активатора и ингибитора на активность амилазы
слюны.
Ход работы: В три пробирки наливают:
в первую - 10 капель Н2О;
во вторую - 8 капель H2О +2 капли 1% р-ра NаС1;
в третью - 8 капель Н2О +2 капли 1% р-ра СuSO4.
В каждую пробирку приливают по 10 капель слюны, разведенной 1:5,
перемешивают, добавляют по 5 капель 0,5% р-ра крахмала, вновь
перемешивают и оставляют при комнатной температуре.
7
Через 1-2 минуты в три пробирки с водой, подкрашенной каплей
раствора йода, отливают по 2-3 капли содержимого каждой опытной пробирки.
Какую окраску приобретает содержимое каждой из пробирок? Если
разницы в окрасках содержимого пробирок нет (все синие), опыт повторяют,
увеличивая время выдержки.
Аналогично пробу берут через 1-2 минуты после взятия первой пробы.
Результаты работы фиксируют в таблице №3.
Таблица №3.
№
фермент
субстрат
Время
действия
фермента
(в мин.)
Окраска
жидкости
после
добавления J 2 в присутствии
NаС1
1
амилаза
крахмал
1-2
2
амилаза
крахмал
2-4
Н2О
СuSO4
Сделайте вывод.
Лабораторная работа № 2.
"КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА НЕКОТОРЫЕ ФЕРМЕНТЫ"
Качественно ферменты можно обнаружить по их действию на те или
иные субстраты.
Опыт №1. Определение пепсина.
Общие понятия.
Пепсин и химозин вырабатываются стенками желудка и катализируют
реакцию гидролиза белка до пептонов. Оба фермента действуют в сильнокислой среде (рН=1,4 – 2,5). Активатором этих ферментов является соляная
кислота.
Реактивы: пепсин 1% р-р.
Исследуемое вещество: молоко (белок молока).
Ход работы: В две пробирки наливают по 2 мл молока, затем и первую
пробирку добавляют 5 капель пепсина, во вторую пробирку 5 капель
предварительно прокипяченного и охлажденного пепсина. Обе пробирки
помещают в баню при 37°. Через несколько минут сравниваем содержимое
пробирок.
Что наблюдаете? Сделайте вывод.
8
Опыт № 2. Реакции на тирозиназу.
Общие понятия.
Фермент тирозиназа относится к фенолооксидазам. Этот фермент
катализирует окисление тирозина и других производных фенолов газообразным
кислородом воздуха с образованием красного пигмента галохрома, который
затем превращается в темный пигмент, родственный меланинам.
Схематично катализируемый процесс можно изобразить следующим образом:
CH 2
CH
COOH
O2
HO
CH2 CH
HO
H
NH 2
O
CH2
N
O2
NH2
HO
O
COOH
CH
O2
COOH
меланин
черный пигмент
или
коричневый пигмент
красный пигмент
Источником фермента могут быть растительные и животные ткани,
например, сырой картофель, мышечная ткань, кровь и т.д.
Особенно много тирозина находится ближе к поверхности клубня.
Ход работы: 1 г сырого картофеля измельчают в ступке с 3 мл дистиллированной воды и быстро фильтруют через марлю.
Фильтрат содержит тирозиназу. Полученную вытяжку делят на две
части. Одну часть кипятят. Затем в обе пробирки добавляют по 5-10 капель
0,1% раствора тирозина и помещают их в штатив при комнатной температуре.
Пробирки периодически встряхивают, чтобы усилить соприкосновение
раствора с кислородом воздуха. Наблюдают изменения, происходящие в
пробирках.
Сделайте вывод.
Опыт № 3. Реакция на сукцинатдегидрогеназу.
Реактивы: 1) янтарная кислота (нейтрализованная)
2) метиленовая синь
Исследуемое вещество: мышечная ткань.
9
Ход работы: 0,3 г. хорошо измельченной мышечной ткани растирают в ступке с
двенадцатикратным количеством дистиллированной воды и отфильтровывают
через марлю, не отжимая. Экстракцию мышечной ткани повторяют еще раза
два. После последней экстракции мышечную кашицу заливают водой и
используют полученный раствор с кашицей.
В две пробирки помещают по 3-4 мл р-ра мышечной кашицы. В первую
пробирку прибавляют около 0,5 мл нейтрализованного раствора янтарной
кислоты. Затем в обе пробирки добавляют по 1 капле метиленовой сини,
встряхивают и ставят на водяную баню при 37°С. Через некоторое время
наблюдают обесцвечивание раствора в одной из пробирок. В какой?
Фермент
сукцикатдегидрогеназа
относится
к
анаэробным
дегидрогеназам, классу оксидоредуктаз. Т.е. они участвуют в переносе водорода
от окисляемого субстрата - янтарной кислоты - на какой-то промежуточный
субстрат, в опыте таким промежуточным субстратом является метиленовая
синь. Это фермент, коферментом которого является НАД, содержащий в
качестве активного центра витамин РР. Схематично происходящие в пробирке
процессы можно изобразить следующим образом:
O
HO
O
C
CH2
C
CH2
HO
+
CH
COOH
CH
COOH
Mc
Янтарная кислота
H
+
Mc
H
фумаровая кислота
Опыт № 4. Определение каталазы.
Общие понятия.
В процессе тканевого дыхания в организме образуется не только Н2О,
но и Н2О2, которая является токсичным веществом и для ее устранения
организм располагает ферментом, разрушающим перекись водорода на воду и
кислород. Это фермент каталаза. Ее много содержится в крови, печени, молоке
и в растительных продуктах.
Реактивы: Н 2 О 2 – 3% раствор
Исследуемое вещество: кровь, печень, мышца и т . д .
Ход определения: В пробирку наливаем 1 мл 3% р-ра Н 2 О 2 и
добавляем немного растертой печени, мышцу или немного крови.
Что наблюдаете? Сравнение реакции.
10
Опыт № 5 . Обнаружение пероксидазы.
Общие понятия.
Пероксидаза, фермент, который содержится во многих рас тительных и животных продуктах. Содержится она в доброкачест венных тузлуках. Этот фермент катализирует реакции окисления
некоторых фенолов и аминов перекисью водорода или органичес кими
перекисями.
Реактивы:
1)
р-р
бензидина
в
спирте
(свежеприготовленный)
2 ) Н 2 О 2 – 3% раствор.
Исслед. в-во: тузлук, мышца рыбы, мясо и т . д .
-
1%
Ход работы: Приготавливают 4 пробирки, так, как указано в
таблице №4 ( пр. 1 , 2 , 3 , 4 ) .
Таблица №4
№
Количество вещества каплями
Результат
проб бензидин тузлук
(окраска)
кипяч.
H2O
H2O2
тузлук
1
10
10
2
2
10
10
2
3
10
10
2
4
10
10
Что наблюдаете? Дайте объяснение.
H2N
NH2
O
HN
H2O2
NH
Бесцветное
синее
Бензидин неокрашенное соединение. При окислении он прев ращается в пара-дииминдихинон (п-дииминдихинон) синего цвета.
11
Лабораторная работа № 3.
КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ВИТАМИНЫ
ЖИРОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ
ВИТАМИН А (Ретинол)
Витамин А - циклический высокомолекулярный спирт.
H3C
CH3
CH
CH3
CH
C
CH3
CH
CH
CH C
CH
CH2OH
CH3
Предшественниками витамина А являются каратиноиды, которые
превращаются в витамин А в печени и слизистой оболоч ке тонких кивок
при участии каротиназы.
Признаками авитаминоза витамина А яв ляются заболевания
роговицы глаз (ксерофтальмия), повышенная утомляемость, за держка
роста.
Реакция витамина А с серной кислотой
(реакция Друммонда)
Ход работы: Одну каплю рыбьего жира растворяют в 4-5 каплях
хлороформа и прибавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты.
Появляется голубое окрашивание, быстро переходящее в буро -красное.
В основе приведенной реакции лежит способность серной кислоты
отнимать от витамина А воду с образованием цветных продуктов
реакции.
Реакция с сульфатом железа (II)
Ход работы: К 1-2 каплям рыбьего жира или 0,05%-ного раствора
витамина А в хлороформе добавляют 5-10 капель ледяной уксусной
кислоты, насыщенной сульфатом железа
(II) и 1-2 капли
концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окраши вание,
постепенно переходящее в розово-красное. Каротины дают при этой
реакции зеленоватое окрашивание.
12
ВИТАМИН D (Кальциферрол)
Витамины группы D являются веществами стероидной природы.
Наибольшее
практическое
значение
имеют
витамины
D2
(эргокальциферол) и D 3 (холекальциферол).
CH3
CH2
HO
CH
CH
CH
CH3
CH3
CH
CH
CH3
CH3
CH3
CH
CH2
CH3
CH2 CH2 CH2
CH
CH3
HO
D2
D3
Недостаток витамина D приводит к нарушению обмена со лей
кальция и фосфора, что вызывает у детей заболевание – рахит, у
взрослых - явление остеопороза (хрупкость) и остео маляции
(размягчение костей).
Бромхлороформная проба на витамин D
Рыбий жир, содержащий витамин D, при добавлении раствора
брома в хлороформе окрашивается в зеленовато-голубой цвет.
Ход работы: В сухую пробирку налить 0,5 мл рыбьего жира и 1 мл
раствора брома в хлороформе (1:60). Наблюдают изменение окраски.
Анилиновая проба на витамин D
При нагревании рыбьего жира,
содержащего кальциферол, со
смесью анилина и концентрированной НС1 раствор приобретает
красную окраску.
Ход работы: В сухую пробирку наливают 1 мл рыбьего жира и 1
мл смеси анилина с концентрированной соляной кислотой ( 15:1),
перемешивают, осторожно нагревают при постоянном поме шивании до
кипения и кипятят 0,5 мин.
При наличии витамина
D желтая
эмульсия делается сначала зеленой, а затем красной. Через 1 -2 мин
эмульсия делится на два слоя, из которых ниж ний окрашен в
интенсивный красный цвет.
13
ВИТАМИН E (Токоферол)
К группе витаминов Е относятся несколько соединений, имеющих
в своей структуре бензольный и пирановый циклы. Наибольшей
витаминной активностью обладает токоферол, у которого бензольное
кольцо является полностью замещенным.
CH3
CH3
CH3
(CH2)3 CH (CH2)3
O
CH3
CH
(CH2)3
CH
CH3
CH3
HO
CH3
α-токоферол
Витамин Е – фактор размножения. При недостатке витамина Е у
животных развивается бесплодие.
Реакция с концентрированной азотной
кислотой
Ход работы: В сухую пробирку берут 4-5 капель 0,1% спиртового
раствора токоферола, прибавляют 10 капель концентрированной
азотной кислоты и содержимое пробирки встряхивают.
Пробирку помещают в водяную баню, нагретую до 70°С.
Образуется эмульсия, которая постепенно расслаивается: верхний
масляный
слой
приобретает
красную
окраску.
Окрашива ние
обусловлено окислением токоферола до токоферилхи нона, окрашенного
в красный или желтовато-красный цвет.
Реакция с хлоридом железа (III)
Ход работы: В сухую пробирку берут 4-5 капель 0,1% -ного
спиртового раствора токоферола, прибавляют 0,5 мл хлорида железа
(III) и тщательно перемешивают содержимое пробирки.
Раствор окрашивается при нагревании в красный цвет в результате
окисления токоферола хлоридом железа (III) в токоферилхинон:
CH3
CH3
O
HO
CH3
H 3C
O
+
FeCl3
+
CH3 + FeCl2 + HCl
H2O
O
H 3C
R
CH3
CH3
где R – радикал изогексадекана.
14
R
ВИТАМИН К (Антигеморрагический)
Витамины
нафтохинона:
группы
К
являются производными 2-метил-1,4O
CH3
O
Витамины группы К принимают участие в образовании
соединений
–
факторов
свертывания
крови
(протромбина,
тромботропина, проконвертина), синтез которых осуществляется в
печени.
Искуственно синтезированные аналоги витамина К (вика сол,
метинон, фтиокол и др.) обладают высокой биологической активностью.
Реакция со щелочным раствором цистеина
Ход работы: В пробирку наливают 1 мл 0,1%-ного спиртового
раствора викасола (или 0,2%-ного спиртового раствора метинона).
Затем прибавляют 2 капли 0,025%-ного раствора цистеина и 2 капли
10%-ного раствора гидроксида натрия. Появляется жел тое окрашивание.
Реакция с анилином
Ход работы: К 2 мл 0,2%-ного раствора метинона добавляют 1
мл анилина, перемешивают. Смесь окрашивается в красный цвет:
O
2
O
CH3
+
CH3
H2N
NH
O
метинон
OH
O
анилин
CH3
+
OH
2 -метил-3-фенил
восстановленный
амино-1,4-нафтохинон
метинон
15
ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ
ВИТАМИН В1 (Тиамин)
В состав молекулы тиамина входят два гетероцикла
пиримидиновый и тиазольный, связанные метиленовой группой.
–
В тканях организма животных тиамин превращается в
пирофосфорный эфир - тиаминпирофосфат, являющийся коферментом
фермента углеродного обмена - карбоксилазы. Недостаток витамина В1
приводит к накоплению пировиноградной кислоты в тканях, что связано
с возникновением заболевания - полиневрит.
Диазореакция на витамин В1
Раствор тиамина при добавлении к нем у диазореактива и
щелочи окрашивается в розовато-оранжевый или красный цвет.
Подобную реакцию с диазореактивом дают вещества, имеющие в своей
структуре
фенольные,
имидазольные,
пиррольные,
тиазо ловые
группировки (адреналин, тиамин, карнозин, желчные пигменты,
гистамин и др.). Поэтому препараты для определения тиамина должны
быть очищены от белков и других веществ, дающих такую же реакцию.
Ход работы: К 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты
добавляют 1 мл 5%-ного раствора азотнокислого натрия. К
полученному диазореактиву добавляют 1,5-2 мл насыщенного раствора
соды и по стенке 1 мл 0,1%-ного раствора тиамина. На границе раздела
появляется розово-оранжевое кольцо, через 2-3 минуты становится
более интенсивным.
Реакция окисления тиамина в тиохром
Ход работы: К 1 мл 0,1%-ного раствора тиамина добавляют
5-10 капель 5%-ного раствора гексоциано-(III)-феррата калия и 2 мл
30%-ного гидроксида натрия, содержимое тщательно перемешивают.
При нагревании жидкость окрашивается в желтый цвет вследствие
превращения тиамина в тиохром.
16
ВИТАМИН В2
Рибофлавин по химической природе - диметилзамещенное
производное изоаллоксазина, связанного в положении 9 с остатком
пятиатомного спирта рибитола.
Витамин В 2 входит в состав небелковой группы окислительновосстановительных ферментов (флавиновых), участвующих в переносе
водорода.
Восстановление рибофлавина
Рибофлавин обратимо окисляется- восстанавливается, отдавая или
присоединяя водород к атомам азота изоаллоксазиновой группировки в
1-ом и 10-ом положениях. При его восстановлении образуется
бесцветное, соединение лейкофлавин – восстановленная форма
рибофлавина. Окисленная форма – рибофлавин – желтого цвета.
Добавление к раствору рибофлавина концентрированной со ляной
кислоты и металлического цинка приводит к восстановле нию
рибофлавина.
CH2(CHOH) 3CH2OH
H 3C
H3C
N
N
N
N
H
HOCH2(CHOH) 3H2C
O
H 3C
+ 2 HCl +
H
N
O
+
Zn
H3C
O
N
N
N
H
ZnCl 2
H
O
Рибофлавин
Лейкофлав ин
Ход работы: В пробирку налить 1,5 мл 0,025%-ного раствора
рибофлавина и 1 мл концентрированной НС1, а затем опустить кусочек
металлического цинка. Наблюдается бурное выделение пу зырьков
водорода и постепенное окрашивание раствора в розо вый цвет, затем
происходит обесцвечивание жидкости. Если жидкость остается красной,
то необходимо добавить еще кусочек металлического цинка.
Реакция рибофлавина с азотнокислым серебром
Нейтральные или слабокислые растворы рибофлавина (рН=6,57,2), реагируя с азотнокислым серебром, дают соединение, окрашенное
в розовый и красный цвет,
(образуется промежуточ ный продукт
восстановления рибофлавина - родофлавин).
Ход работы: К 1 мл раствора рибофлавина добавляют 0,5 мл
раствора азотнокислого серебра. Появляется розов ое или красное окрашивание (интенсивность окраски зависит от концентрации рибоф лавина
в растворе).
17
ВИТАМИН В 6
Известны три вещества, обладающие свойствами витамина В 6 :
пиридоксол, пиридоксаль и пиридоксамин. Все они являют ся
производными пиридина.
CH2OH
HO
H 3C
CH2OH
N
C
CH2NH2
HO
H 3C
CH2OH
HO
H 3C
N
O
H
CH2OH
N
Фосфорилированные производные пиридоксина (фосфопиридоксаль и фосфопиридоксамин) в виде коферментов участвуют в
реакциях переаминирования и декарбоксилирования аминокисло т.
Отсутствие в пище витамина В 6 приводит к заболеванию кожи дерматит.
Реакция витамина В 6 с хлорным железом
Ход работы: К 2,5 мл 5%-ного раствора пиридоксола прибавить
0,5
мл 5%-ного раствора
хлорного
железа
и
встряхнуть,
жидкость окрашивается в красный цвет вследствие образования
комплексного соединения типа фенолята железа.
18
ВИТАМИН С
Аскорбиновая кислота по химической природе - окисленное
производное шестиатомного спирта сорбита. Диенольная группа
обуславливает способность витамина С легко под вергаться окислению с
одновременным восстановлением других соединений. При окислении
аскорбиновая
кислота
дает
дегидроаскорбиновую
кислоту,
сохраняющую витаминную ценность.
O
O
C
C
HO
C
HO
C
O
H C
HO
C
2H
+ 2H
O
C
O
C
H C
HO
H
O
C
H
CH2OH
CH2OH
Дегидроаскорбиновая кислота - неустойчивое соединение и при
восстановлении снова переходит в аскорбиновую кислоту. Благодаря
этой способности витамин С принимает активное участие в
окислительно-восстановительных процессах в организме, являясь
активатором или ингибитором ряда ферментных систем.
Отсутствие в пище витамина С вызывает заболевание,
известное под названием цинги или скорбута.
Качественные реакции на витамин С основаны на его
способности легко вступать в окислительно -восстановительные
реакции, и восстанавливать,
напр имер, метиленовую
синь, 2,6дихлорфенолиндофенол,
гексоциано -(III) феррат
калия, нитрат
серебра и др.
Взаимодействие с метиленовой синью.
Ход работы: К 1 мл сока капусты в пробирке прибавляют 1
мл 0,01%-ного раствора метиленовой сини, перемешивают и закры вают
пробкой для предохранения от соприкосновения с кислоро дом воздуха.
Пробирку помещают в термостат при 37 -40 ◦ С. Через некоторое время
жидкость в пробирке обесцвечивается за счет восстановления
метиленовой сини в бесцветную лейкоформу и образования
дегидроаскорбиновой кислоты. Если затем бесцветный раствор
19
метиленовой сини энергично встряхнуть, не препятствуя поступлению
воздуха в пробирку, то раствор вновь приобретает синий цвет.
Реакция с гексациано-(III) ферратом калия
Аскорбиновая кислота, окисляясь, восстанавливает гексациано(III) феррат калия К 3 [Fе(CN) 6 ] до гексациано-(II) феррата калия
К 4 [Fе(CN) 6 ], который с ионом железа в степени окисления +3 образует
в кислой среде гексациано-(II)феррат железа (берлинскую лазурь
Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 ):
O
O
C
C
HO
HO
C
C
O
+ 2 K3[Fe(CN)6] + 2 KOH
C
C
O
C
O
+ 2 K4[Fe(CN)6] + 2 H2O
H C
H C
HO
O
H
HO
CH2OH
C
H
CH2OH
Ход работы: К 1 мл сока капусты прибавляют 2 капли раствора
гидроксида калия, 2 капли раствора гексациано-(III) феррата калия и
энергично встряхивают содержимое пробирки. Затем в пробирку
добавляют 6-8 капель 10%-ного раствора соляной кислоты и 1 -2 капли
раствора хлорида железа (III), выпадает синий ( или зеленовато-синий)
осадок берлинской лазури.
3 K4[Fe(CN)6] + 4 FeCl3
Fe4[Fe(CN)6]3 + 12 KCl
Лабораторная работа № 4.
20
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Принцип метода:
Метод основан на титровании пробы в кислой среде
раствором краски Тильманса (2,6 – дихлорфенолиндофенолят натрия) без предварительного
осаждения белков.
Ход работы:
I.
Определение витамина С в картофеле, капусте, моркови,
луке, лимоне и др.
Взвесить 1г исследуемого продукта. Навеску поместить в
фарфоровую ступку и растереть, постепенно приливая 15 мл
воды. Профильтровать и произвести исследования следующим
образом:
1.
В коническую колбу наливают 3 мл фильтрата, 10 мл H 2 O, 23 капли 10% HCl и титруют 0,001N раствором краски
Тильманса
до
слабо-розового
окрашивания,
удерживающегося не менее 0,5 мин.
2.
В коническую колбу наливают 3 мл фильтрата, 10 мл H 2 O.
Колбу закрывают обратным холодильником и кипятят 10
мин. Охлаждают содержимое колбочки, добавляют 2 -3 капли
10% HCl и титруют как указано выше.
3.
В коническую колбу наливают 3 мл фильтрата, 10 мл H 2 O, 1
мл 2% HCl и кипятят 10 мин. Охлаждают содержимое
колбочки и титруют раствором краски Тильманса.
4.
В коническую колбу наливают 3 мл фильтрата, 10 мл H 2 O, 1
мл 2% NaOH и кипятят 10 мин. Охлаждают содержимое
колбочки и титруют раствором краски Тильманса.
5.
Контрольная проба. К 13 мл H 2 O добавляют 2-3 капли 10%
HCl и титруют раствором краски Тильманса до появления
устойчивого бледно-розового окрашивания.
Расчет витамина С ведут по формуле:
21
а- количество краски Тильманса, пошедшее на титрование рабочей
пробы.
б- количество краски Тильманса, пошедшее на титрование контрольной
пробы.
II.
1.
2.
Определение витамина С в томатном, виноградном, яблочном и
др. соке.
Томатный сок предварительно разводят 10 раз водой и
фильтруют. Исследование проводят следующим образом:
В коническую колбу наливают 10 мл фильтрата и титруют
0,001N раствором краски Тильманса до слабо-розового
окрашивания.
В коническую колбу наливают 10 мл фильтрата1 мл 2% HCl,
закрывают обратным холодильником и кипятят 10 мин.
Охлаждают содержимое колбочки и титруют раствором
краски Тильманса.
Расчет витамина С ведут по формуле:
Сделайте выводы.
22
23