Разработка методов выявления фальсификации мясной

Разработка методов выявления
фальсификации мясной продукции:
идентификация сырьевого состава и
количественное определение
растительных компонентов
Владимир Кимович Мазо, О. В. Анисимова, С. Н. Зорин.
(НИИ Питания РАМН, г.Москва)
Методы определения сырьевого состава мясной продукции
Основные
методы
Объект исследования
Гистологические
мясо в тушах и крупных кусках
(по анатомическим особенностям осевого и
периферического скелета, форме и цвету
мышечной ткани, количеству и
распределению жировой ткани и
лимфатичских узлов)
Физико-химические мясное сырье
(определение температуры плавления,
вспышки, коэффициента рефракции жира)
Метод
электрофореза
(вертикальный,
капиллярный,
встречный)
мясное сырье и готовые мясные
продукты
Энзимологические
мясное сырье и готовые мясные
продукты (установление видовых
различий в ферментных спектрах
различных видов животных)
Группа
различные биологические объекты,
иммунологических в том числе мясное сырье и готовые
методов
мясные продукты
(РА, РП, РИД и ИФА)
Методы,
мясное сырье и готовые мясные
основанные на
продукты,
определении ДНК
в том числе прошедшие термическую
(ПЦР, ПЦР - ELISA)
обработку. Выявление
фальсифицирующих примесей
Преимущества
Недостатки метода
достаточно точное определение не применимы к частично измельченным или
видовой принадлежности
полностью переработанным мясным изделиям
ориентировочные результаты по отсутствие стабильных результатов по
установлению видовой
показателям
принадлежности мяса, могут
использоваться как
вспомогательные методы
качественная оценка
(количественный анализ
возможен после увеличения
чувствительности метода и
ликвидации факторов,
ухудшающих качество анализа)
установление видовой
принадлежности нативного
мясного сырья
невозможно выявить различия между
близкородственными видами животных
нельзя использовать для продуктов
прошедших термическую обработку, и
количественного анализа компонентов
мясопродуктов
повышенная специфичность по не пригодны для исследования мяса
близкородственных видов животных и
сравнению с физикомясных продуктов обработанных при t выше
химическими методами
48° С., а также изделий с содержанием
подложного мяса менее 10-20 % от общей
массы.
быстрый и достоверный метод, поиск и выбор специфичных праймеров
позволяет получить результаты
высокой степени точности
Цель исследования:
• разработка непрямого иммуноферментного
метода количественного определения белка сои в
мясной продукции;
• апробация методов идентификации ДНК
животного происхождения.
Задачи:
1. Разработка метода количественного определения изолята
соевого белка в мясных продуктах;
2. Апробация тест-систем SureFood® Animal-ID CONGEN
Biotechnologie GmbH, Германия, предназначенного для
идентификации видоспецифичной ДНК различных видов
животных.
3. Проведение исследований пищевой продукции,
представленной на внутреннем рынке Российской Федерации
для видовой идентификации мясной продукции.
4. Подготовка проекта методических указаний:
– «ИДЕНТИФИКАЦИЯ СЫРЬЕВОГО СОСТАВА МЯСНОЙ
ПРОДУКЦИИ»,
– «ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЛЯТА СОЕВОГО БЕЛКА В
СОСТАВЕ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ».
I
Разработка метода количественного
определения изолята соевого
белка в мясных продуктах
Схема метода
твердофазного непрямого
ИФА
Калибровочная кривая для стандарта ИБС
Концентрация стандартного раствора ИБС,
соответствующая 50 % связывания вторичных антител
(СИБС 50 %), рассчитывается методом линейной интерполяции :
С ИБС 50% = 10 Lg (ИБС, 50%) ,
Lg (ИБС, 50%) = Lg С1ст + (50 – J1ст) * (Lg С2ст – Lg С1ст) / (J2ст – J1ст) , где
Lg С1ст – десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИБС,
соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50%
вторичных антител;
Lg С2ст – десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИБС,
соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50%
вторичных антител;
J 1ст – % связывания вторичных антител, соответствующий Lg С1ст;
J 2ст – % связывания вторичных антител, соответствующий Lg С2ст .
Содержание ИБС в анализируемом образце
колбасного изделия (в %) рассчитывается по
формуле:
% ИБС = 100 * С ИБС 50% / С П 50%
С ИБС 50% – концентрация стандартного раствора
ИБС, соответствующая 50% связывания вторичных
антител
С П 50% – концентрация раствора колбасного изделия,
соответствующая 50% связывания вторичных антител
Рас тв окривая
р анали
р у емо го образца
Калибровочная
длязи
стандартного
оконсервов
бр азца
3,50
3,00
Lg (мкг /мл)
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
0,0
20,0
40,0
60,0
% связы вания (J)
80,0
100,0
Метрологические показатели
Основные метрологические показатели методики количественного
определения ИБС методом непрямого ИФА в колбасных изделиях
Метрологическая характеристика
(р = 0,95)
Диапазон концентраций ИБС, г/100г
0,2 – 1,0
1,0-10
Предел повторяемости (rm), г/100г
0,1
0,6
Предел воспроизводимости (Rm), г/100г
0,2
0,9
Предел точности (∆), г/100г
0,1
0,5
Основные метрологические показатели методики количественного
определения ИБС методом непрямого ИФА в мясных консервах
Метрологическая характеристика
(р = 0,95)
Диапазон концентраций ИБС, г/100г
0,2 – 1,0
1,0-10
Предел повторяемости (rm), г/100г
0,1
0,6
Предел воспроизводимости (Rm),
г/100г
0,2
0,6
Предел точности ( ∆), г/100г
0,1
0,3
Количественное определение ИБС в составе
мясной продукции:
п/п
Вид пищевой
продукции
Результаты
исследования
Количество
образцов
1
Колбасные изделия (ГОСТ)
20
6
2
Колбасные изделия (ТУ)
следовые количества
(менее 0,1 % ИБС)
от 0,1 % до 2,4 % ИБС
3
Мясные консервы
от 0,2 % до 1,2 % ИБС
МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОЛЯТА
СОЕВОГО БЕЛКА В МЯСНОЙ
ПРОДУКЦИИ
НИИ ПИТАНИЯ РАМН
ГНУ ВНИИ МЯСНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
ИМ. В.М. ГОРБАТОВА РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ
ООО «КОМПАНИЯ СТАЙЛАБ»
1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ИЗОЛЯТА СОЕВОГО БЕЛКА В КОЛБАСНЫХ
ИЗДЕЛИЯХ
2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ИЗОЛЯТА СОЕВОГО БЕЛКА В МЯСНЫХ
КОНСЕРВАХ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
____________________________________
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ
ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЛЯТА СОЕВОГО БЕЛКА В СОСТАВЕ
МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
Методические указания
МУК 4.1. -10
Издание официальное
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека
Москва
2010
II
Идентификация сырьевого состава
мясной продукции методом
SureFood® Animal-ID
Схема метода
ПЦР-ИФА
для идентификации ДНК
животного и
растительного
происхождения
Результаты проведенных исследований с помощью
набора SureFood® Animal-ID
п/п
1
Мясное сырье
Домашняя птица
Количество образцов
7
2
Дикая птица
4
3
Крупная дичь
4
3
Мелкий рогатый скот
1
4
Кошка
1
5
Собака
1
п/п Вид пищевой продукции Количество образцов
1
2
3
Мясные изделия, колбасы,
сосиски
Майонезы
Болгарская брынза из
овечьего молока и козьего
молока
Цель исследования
Положительный контроль и контроль на
отсутствие ложноположительных
результатов
Контроль на отсутствие
ложноположительных результатов
Контроль на отсутствие
ложноположительных результатов
Контроль на отсутствие
ложноположительных результатов
Контроль на отсутствие
ложноположительных результатов
Контроль на отсутствие
ложноположительных результатов
Выявленные несоответствия
8
Не выявлено
4
2
Не выявлено
Выявлено нерегламентированное
содержание ДНК КРС
МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ
СЫРЬЕВОГО СОСТАВА МЯСНОЙ
ПРОДУКЦИИ:
1. НИИ ПИТАНИЯ РАМН, ООО «КОМПАНИЯ
СТАЙЛАБ»
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ДНК
ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПОМОЩЬЮ
НАБОРА SUREFOOD® ANIMAL-ID
(говядины, свинины, баранины, козлятины, оленины,
курицы, индейки, гуся, утки, индоутки)
ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
____________________________________
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ
ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ИДЕНТИФИКАЦИЯ СЫРЬЕВОГО СОСТАВА МЯСНОЙ ПРОДУКЦИИ
Методические указания
МУК 4.1. -10
Издание официальное
2. ГНУ ВНИИ МЯСНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
ИМ. В.М. ГОРБАТОВА РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК С ПОМОЩЬЮ НАБОРОВ
SPECIES IDENT RT
(крупного рогатого скота, свинины, баранины, козы,
курицы)
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека
Москва
2010
III
Модификации методики определения
видоспецифичной ДНК
От теории к практике:
от базы данных ДНК
до разработки
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
видоспецифичной
методики
12S rRNA,
16S rRNA,
D-loop, cytochrome b, tRNA
наличие
перекрестной
реакции
Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST)
Nucleotide
blast
отсутствие перекрестной реакции
Primer-BLAST
Синтез видоспецифичной пары праймеров (ЗАО «Синтол»)
Составление корректного температурно-временного режима
проведения ПЦР, оптимизация состава реакционной смеси.
ПЦР
Детекция результатов методом горизонтального
электрофореза
Разработаны ПЦР-тест-системы для видовой
идентификации ДНК:
• Bos taurus taurus (бык/корова)
• Suidae (свинья)
• Equus (лошадь)
• Capra aegagrus hircus (коза)
• Ovis (овца)
• Félis silvéstris cátus (кошка)
• Canis lupus familiaris (собака)
• Muridae/Rattus (мышь/крыса)
Идентификация ДНК некоторых видов животных в мясном сырье
1 2 3 4 5
6 7 8
326 b.p.
1 2 3
1 – маркер м.м. 100 b.p.;
2 – контроль «+» (capra aegagrus hircus);
3 – контроль «+» (capra aegagrus hircus);
4 – контроль «–»;
5 – bos taurus;
6 – suidae;
7 – gallus gallus;
8 – ovis;
Capra aegagrus hircus
1 2 3 4 5
398 b.p.
4 5 6 7
97 b.p.
1 – маркер м.м. 100 b.p.;
2 – контроль «+» (bos taurus);
3 – контроль «–»;
4 – gallus gallus;
5 – suidae;
6 – сapra aegagrus hircus;
7 – ovis;
Bos taurus
6 7
1 2 3
1 – маркер м.м. 100 b.p.;
2 – контроль «+» (suidae);
3 – контроль «–»;
4 – gallus gallus;
5 – bos taurus;
6 – сapra aegagrus hircus;
7 – ovis;
Suidae
4 5 6 7
172 b.p.
Ovis
1 2 3
4 5 6 7
153 b.p.
Equus
1 – маркер м.м. 100 b.p.;
2 – контроль «+» (equus);
3 – контроль «–»;
4 – suidae;
5 – bos taurus;
6 – сapra aegagrus hircus;
7 – ovis;
1 – маркер м.м. 100 b.p.;
2 – контроль «+» (ovis);
3 – контроль «–»;
4 – gallus gallus;
5 – bos taurus;
6 – suidae;
7 – сapra aegagrus hircus;
Идентификация ДНК кошки, собаки, мыши/крысы в составе одно- и
многокомпонентных продуктов
1 2 3
4 5
6 7
322 b.p.
1 2 3 4 5 6
1 – маркер м.м. 100 b.p.;
2 – контроль«+»(canis lupus familiaris);
3 – контроль «–»;
4 – bos taurus;
5 – suidae;
6 – ovis;
7 – félis silvéstris cátus;
Canis lupus familiaris
Muridae/Rattus
274 b.p.
1 – маркер м.м. 100 b.p.;
2 – контроль «+» (félis silvéstris cátus);
3 – контроль «–»;
4 – bos taurus;
5 – suidae;
6 – ovis;
7 – canis lupus familiaris;
Félis silvéstris cátus
1 2 3 4 5 6 7 8
96 b.p.
7
1 – маркер м.м. 100 b.p.;
2 – контроль «+» (muridae);
3 – контроль «+» (rattus);
4 – контроль «–»;
5 – bos taurus;
6 – suidae;
7 – ovis;
8 – félis silvéstris cátus;
Исследование мясной продукции на наличие ДНК
кошки, собаки, мыши/крысы
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 – маркер м.м. 100 b.p.;
2 – контроль«+» (Félis silvéstris cátus, canis
lupus familiaris, muridae/rattus);
3 – чебурек ул.Новопетровская;
4 – чебурек, вокзал м.Белорусская;
5 – чебурек, вокзал г. Сергиев Посад;
6 – беляш, м.Петровско-Разумовская;
7 – колбаса «Докторская», Клинский;
8 – колбаса «Докторская», Сетунь;
9 – колбаса «Докторская», Войковский м/к;
10 – колбаса «Докторская», Микоян;
11 – колбаса «Докторская», Ремит;
12 – колбаса «Докторская», Велком;
13 – колбаса «Фаворит»;
14 – колбаса «Молочная»;
15 – колбаса «Южная»;
16 – колбаса «Сырокопченая №1»;
17 – карбонат «Царицыно»;
18 – сосиски «Молочные»;
19 – сервелат «Гурман»;
20 – контроль «–».
Идентификация ДНК рыбы
в одно- и многокомпонентных продуктах
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
224 b.p.
1 – «Семга с овощами» детское питание;
2 – «Форель с картофелем и зеленью» детское питание;
3 – «Треска с рисом и овощами» детское питание;
4 – кальмар;
5 – форель;
6 – маркер м. м. 100 b.p.;
7 – судак;
8 – семга;
9 – «Kalanmarksaöljy Fiskleverolja» рыбий жир из печени трески;
10 – ОКВ
11 – ХО
Идентификация ДНК рыбы в пищевых продуктах
1
2
3
4
5
6
7
8
9
224 b.p.
224 b.p.
рыба
290 b.p.
свинья
183 b.p.
домашняя птица
1 – бланк;
2 – семга;
3 – горбуша;
4 – маркер м.м. 100 b.p.;
5 – пикша;
6 – свинья;
7 – курица;
8 – маркер м.м. 100 b.p.;
9 – смесь: семга + свинья + курица.
Идентификация ДНК семги и форели радужной
1
2
3
4
5
6
7
8
500 b.p.
518 b.p.
форель
532 b.p.
семга
1 – контроль «–» (треска);
2 – маркер м.м. 100 b.p.;
3 – форель радужная;
4 – семга;
5 – семга;
6 – контроль «+» (семга);
7 – контроль «+» (форель радужная);
8 – контроль «–» (вода).
518 b.p.
форель
Заключение
• В результате проведенных исследований разработан
количественный метод непрямого (конкурентного)
иммуноферментного определения содержания ИБС в
мясной продукции. Метод апробирован в исследованиях
по определению содержания ИБС в колбасных изделиях и
консервах отечественного производства.
• Установлено, что разработанный метод позволяет
определять содержание ИБС (с концентрацией от 0,2% в
образце) с погрешностью измерений
15%, что
соответствует
обычным
значениям
для
иммуноферментного анализа, проводимого непрямым
(конкурентным) методом.
• Методом ПЦР-ИФА проведены исследования 32
образцов мясной пищевой продукции. В двух образцах
болгарской брынзы из козьего и овечьего молока,
производства ООО «Албена», Болгария, выявлено
нерегламентированное содержание ДНК КРС. В
остальных образцах несоответствия определяемой
ДНК животного происхождения выявлено не было.
Разработаны Методические Указания:
1 - 4.1. «ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЛЯТА СОЕВОГО БЕЛКА
В СОСТАВЕ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ»
2 - 4.1. «ИДЕНТИФИКАЦИЯ СЫРЬЕВОГО СОСТАВА
МЯСНОЙ ПРОДУКЦИИ».
Документы прошли рецензирование и направлены для
утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека.
СПАСИБО
ЗА ВНИМАНИЕ!