На правах рукописи Карпова Наталья Игоревна

На правах рукописи
Карпова Наталья Игоревна
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЙ ВРОЖДЕННОГО
И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА, СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА И
МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ПРИ РЕСПИРАТОРНОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ЧАСТО БОЛЕЮЩИХ ДЕТЕЙ
14.03.03. – Патологическая физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой
степени кандидата медицинских наук
Чита – 2011
Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская
академия» Минздравсоцразвития России.
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
профессор
Малежик Лидия Павловна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор
Бишарова Галина Ивановна
кандидат медицинских наук
Ведущая организация:
Фефелова Елена Викторовна
ГБОУ ВПО «Алтайский государственный
медицинский университет»
Минздравсоцразвития России.
Защита
состоится
диссертационного
декабря
22
совета
Д
2011
208.118.01
года
при
в
ГБОУ
9.00
на
ВПО
заседании
«Читинская
государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России по
адресу: 672090, г. Чита, ул. Горького, 39 а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Читинская
государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.
Автореферат разослан «_____» ______________2011г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
д.м.н., профессор
И.Н. Гаймоленко
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. К группе часто длительно болеющих относят
детей с повторными респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ),
возникающими более 5-6 эпизодов в год (Беляков В.И. и др. 2001; Шерстобоев
Е.Ю. и др. 2002; Самсыгина Г.А., Коваль Г.С. 2008; Аминова А.И. и др. 2009).
Такие дети характеризуются повышенной восприимчивостью к инфекционным
агентам. Ряд авторов (Железникова Г.Ф. 1995; Самсыгина Г.И., 2005, 2010;
Ярцев М.Н. и др., 2006, Харламова Ф.С. и др., 2009) считает, что причиной
тому является функциональная незрелость иммунной системы.
Патогенетические
нарушения
в
системе
иммунитета
могут
формироваться в любом звене иммунного ответа. Нас интересовало состояние
первого звена – рецепторов, воспринимающих действие патогена. К таким
рецепторам
относятся
иммунокомпетентных
Toll
–
клетках
рецепторы,
и
присутствующие
эпителиоцитах,
на
всех
контактирующих
с
инфекционными агентами.
Структурные изменения в Toll-рецепторах возможны при полиморфизме
генов, кодирующих эти рецепторы. В случае генетических аномалий
осуществляется
неполноценный
контакт
рецептора
с
патогеном,
ограничивается внутриклеточная сигнализация и синтез медиаторов воспаления
(Симбирцев А.С., Громов А.Ю., 2005).
В настоящее время известно 10 разновидностей Toll-рецепторов у людей.
Нас заинтересовал Toll-4, лигандом для которого является липополисахарид
бактерий и ДНК вирусов и Toll-6, реагирующий на ЛПС грамотрицательных
бактерий.
Основываясь
на
инициирующей
роли
Toll-рецепторов
противоинфекционной защите, мы попытались связать их
в
генетические
дефекты с уровнем врожденного и приобретенного иммунитета у часто
болеющих детей, а также состоянием системы гемостаза и степенью адгезивной
3
активности форменных элементов крови, определяющей реологические
свойства крови и микроциркуляцию.
Цель исследования: изучить состояние систем иммунитета, гемостаза,
коагрегации
форменных
элементов
крови
при
респираторно-вирусных
инфекциях у часто болеющих детей, и выявить роль генетических аномалий
Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов в их функционировании.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Выявить частоту встречаемости генетических дефектов Toll-4(Asp299Gly) и
Toll-6(Ser249Pro) рецепторов среди здоровых и часто болеющих детей.
2. Исследовать уровень врожденного и адаптивного иммунитета при ОРВИ у
часто болеющих детей и оценить роль полиморфизма Toll-4(Asp299Gly) и Toll6 (Ser249Pro) рецепторов в функциональной активности элементов иммунной
защиты.
3. Изучить состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза и коагуляционного
потенциала при респираторно-вирусной инфекции, и выяснить влияние
полиморфизма генов Toll-4(Asp299Gly)
и Toll-6(Ser249Pro)
рецепторов на
функции тромбоцитов и уровень гемостаза у обследуемых детей.
4. Определить адгезивные свойства лимфоцитов, эритроцитов и тромбоцитов
при ОРВИ у часто болеющих детей и влияние полиморфизма генов Toll4(Asp299Gly)
и
Toll-6(Ser249Pro)
рецепторов на образование клеточных
ассоциаций.
Научная новизна. Установлено, что одной из причин дисфункции в
системе иммунитета у детей часто болеющих ОРВИ является генетический
дефект в Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторах, воспринимающих
действие патогена. Среди таких детей 55,6% являются носителями мутаций в
Toll-4 и 75% в Toll-6 рецепторах.
Предрасположены к частым заболеваниям ОРВИ дети-носители аллели G
гена Toll-4(Asp299Gly) рецептора и аллели P гена Toll-6(Ser249Pro) рецептора.
Выявлено, что генетические дефекты в Toll-4(Asp299Gly) и
(Ser249Pro)
Toll-6
рецепторах обусловливают снижение противоинфекционной
4
защиты за счет несостоятельности врожденного иммунитета, ограничения
синтеза иммуноглобулинов (sIgA, IgA, IgM, IgG
и его подклассов),
уменьшения количества провоспалительных цитокинов (IL-1β, ФНО-α, IL-8) и
увеличения иммуносупрессирующих факторов – IL-10 и IL-1RA.
Обнаружено, что гиперкоагуляция, развивающаяся при ОРВИ у часто
болеющих детей более выражена при наличии аномалий в Toll-рецепторах.
Агрегационная функция тромбоцитов изменяется в зависимости от состояния
Toll-рецепторов. При мутациях в Toll-4(Asp299Gly) рецепторах индукторы
агрегации (адреналин, АДФ, коллаген) усиливают агрегационную активность
тромбоцитов; при аномалиях в Toll-6(Ser249Pro) рецепторах – уменьшают.
У
детей
часто
болеющих
индуцированы
адгезивные
увеличением
числа
ОРВИ
свойства
при
очередном
форменных
элементов
лимфоцитарно-тромбоцитарных,
заболевании
крови
с
эритроцитарно-
тромбоцитарных и эритроцитарно-лейкоцитарных коагрегатов в крови. При
генетических дефектах в Toll-4 и Toll-6 рецепторах клеточные ассоциации
выражены значительнее, чем у больных детей, не отягощенных мутациями в
сигнальных рецепторах.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные
данные о состоянии систем врожденного и адаптивного иммунитета, гемостаза
и адгезивных свойств форменных элементов крови у часто болеющих детей с
полиморфными вариантами генов Toll-4 и Toll-6 рецепторов, позволят
расширить представление о патогенетических особенностях течения ОРВИ при
различной врожденной предрасположенности к респираторным заболеваниям.
Проведенный анализ частоты встречаемости полиморфных вариантов
генов Toll-4 и Toll-6 рецепторов и выявление генетических маркеров ОРВИ
позволит создать группу диспансерного наблюдения с индивидуальной
профилактикой и лечением ОРВИ.
Внедрение в практику. Теоретические положения, раскрываемые в
диссертации внедрены в учебный процесс кафедры патологической физиологии
и кафедры детских инфекций ГБОУ ВПО Читинская государственная
5
медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития
РФ.
Апробация
диссертации.
Основные
положения
и
результаты
исследования доложены на: I Международной научно-практической интернетконференции «Состояние здоровья: медицинские и психологические аспекты»
(Чита-Славянск,
2009), II Международной научно-практической интернет-
конференции «Состояние здоровья: медицинские и психологические аспекты»
(Чита-Славянск, 2011), Всероссийской научно-практической конференции
посвященной 55-летию Читинской государственной медицинской академии
(Чита,
2008),
VII
международной
конференции:
гемореология
и
микроциркуляция (Ярославль, 2009), Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Итоги эпидемии гриппа А (H1N1)»
(Чита, 2010), Научно-практической конференции с международным участием
«Медицина - новое в теории и практике» (Шарджа, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных
работ, из которых 2 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и
изданиях, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Основные положения, выносимые на защиту
1.
Среди детей с частыми заболеваниями ОРВИ выявлены генетические
дефекты в Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторах, регулирующих
врожденный и адаптивный иммунитет. В 55,6% случаев отмечены мутации в
генах кодирующих Toll-4 рецепторы и в 75% – в генах Toll-6 рецепторов.
Подобные дефекты встречаются и среди здоровых детей, эпизодически
болеющих респираторными инфекциями. Из них 17,1% являются носителями
генетических дефектов в Toll-4 рецепторах и 65% в Toll-6 рецепторах.
2.
Выявленные аномалии в Toll-4 и Toll-6 рецепторах сказываются на
несостоятельности врожденного и адаптивного иммунитета. Иммунодефицит у
детей с частыми эпизодами ОРВИ проявляется низкой фагоцитарной
активностью, снижением концентрации провоспалительных цитокинов (IL-1β,
6
IL-8, ФНО-α) и повышенным содержанием иммуносупрессирующих факторов
IL-10 и IL-1RA.
Респираторно-вирусная инфекция у часто болеющих детей увеличивает
синтез IgG, IgM и уменьшает содержание sIgA и IgA. Наличие генетических
дефектов в Toll-рецепторах сопряжено с уменьшением синтеза отмеченных
иммуноглобулинов по сравнению с группой больных детей, не являющихся
носителями генетических мутаций.
3.
У детей в острый период при респираторных инфекциях в крови
развивается гиперкоагуляция, степень которой увеличивается при генетических
изменениях в Toll-4 и Toll-6 рецепторах за счет большей концентрации
фибриногена, РФМК и ингибиции фибринолиза. Агрегационная функция
тромбоцитов зависит от состояния Toll-рецепторов. При генетических дефектах
в Toll-4(Asp299Gly) рецепторах индукторы агрегации (адреналин, АДФ,
коллаген) увеличивают агрегационные свойства тромбоцитов. При аномалиях
в Toll-6(Ser249Pro) рецепторах – уменьшают.
4.
При ОРВИ у часто болеющих детей в крови индуцированы адгезивные
свойства форменных элементов крови с увеличением числа лимфоцитарнотромбоцитарных,
эритроцитарно-тромбоцитарных
и
лейкоцитарно-
эритроцитарных коагрегатов. При замене аллелей в генах Toll-4 и Toll-6
рецепторах клеточные ассоциации выражены значительнее, чем у больных
детей без генетических аномалий.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138
страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы,
описания
материалов
и
методов
исследования,
главы
собственных
исследований, обсуждения полученных данных, выводов, практических
рекомендаций, содержит 24 таблицы, иллюстрирована 7 рисунками. Указатель
литературы включает 243 источника, из которых 156 отечественных и 87
зарубежных.
7
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы,
предъявляемые
Хельсинской
Декларацией
Всемирной
Медицинской
Ассоциации (World Medikal Association Declaraition of Helsinki 1964, 2000 ред.).
Клиническое и лабораторное обследование проведено у 100 детей обоего
пола в возрасте от 2 до 3 лет, поступивших в детскую инфекционную больницу
г. Чита. Дети включались в группу часто болеющих детей на основании
критериев, предложенных В.Ю. Альбицким и А.А. Барановым (1986г.).
Критерии включения: частота эпизодов ОРВИ более 6 раз в году.
Наличие ОРВИ на момент обследования.
Критерии
бронхолегочной
исключения:
системы,
наличие
соматическая
хронических
патология
заболеваний
различных
органов,
аллергические заболевания.
Из числа обследуемых у 49 % был диагностирован грипп, у 26 % –
парагрипп, у
5% – аденовирусная инфекция, у 4 % – респираторно-
синцитиальный вирус. У 16 % этиология ОРВИ не определена.
Контрольную группу составили 35 детей с редкими эпизодами ОРВИ,
сопоставимыми по возрасту и полу с группой часто болеющих.
На генетический полиморфизм Toll-4 и Toll-6 рецепторов обследовано 76
здоровых детей и 100 часто болеющих ОРВИ.
Методы исследования
Молекулярно-генетическое исследование для выявления генетических
мутаций проводилось методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами (НПФ
«Литех», Россия, Москва). Выделение ДНК осуществлялось при помощи
наборов «ДНК-экспресс кровь» (НПФ «Литех», Россия, Москва). Детекция
продуктов амплификации проводилась электрофоретическим способом в 3 %
агарозном геле.
8
Определение фагоцитарной активности нейтрофилов. Базальную (без
продигиозана) и стимулированную (продигиозаном) фагоцитарную активность
нейтрофилов исследовали по их способности поглощать частицы латекса
(Меньшиков В.В., 1987).
Исследование
системы
комплемента.
Компоненты
комплемента
определяли методом твердофазного ИФА с применением набора реагентов
ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург).
Измерение уровня цитокинов (lL-1ß, IL-4, TNFα, IL-10, IL-8, IL-1RA) и
иммуноглобулинов (IgA, sIgA, IgM, IgG и его подклассов) проводили методом
твердофазного ИФА с использованием реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (г.
Новосибирск).
Оценку
агрегационной
функции
тромбоцитов
осуществляли
турбодиметрическим методом по G. Born (1962). Для исследования спонтанной,
АДФ, адреналин и коллаген индуцированной агрегации использовали
соответствующие реактивы ООО «Технология-стандарт» (г. Барнаул).
Исследование
системы
гемостаза
(АЧТВ,
МНО,
концентрацию
фибриногена и фибринмономерных комплексов – РФМК, эуглобулиновый
фибринолиз,
экспрессию
тканевого
фактора)
проводили
методами,
изложенными в современных руководствах (Баркаган З.С., Момот А.П.).
Лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию (ЛТА и ЛТИ) определяли
методом, предложенным Ю.А. Витковским (1999).
Исследование лейкоцитарно-эритроцитарных (ЛЭА) и эритроцитарнотромбоцитарных агрегатов (ТЭА) осуществляли камерным методом в мазках
крови.
Статистическая
обработка
материала:
полученные
данные
обработаны методом вариационной статистики для связанных и не связанных
между собой наблюдений с помощью пакетов программ Microsoft Excel 2007,
STATISTICA 6,0 (StatSoft Inc., США), с определением значимости различий
при достигнутом уровне значимости
p<0,05. Перед началом анализа
вариационные ряды тестировались на нормальность с использованием критерия
9
Шапиро-Уилка
W.
При
нормальном
распределении
использовались
параметрические методы статистики – критерий Стьюдента (t-тест). Изучаемые
показатели представлены в виде средних величин со стандартным отклонением
(M±SD). При ненормальном распределении признака применялся критерий
Манна
–
Уитни
(U-тест).
Для
сравнения
качественных
показателей
использовался критерий 2 (Пирсона). Для оценки ассоциаций рассчитывали
относительный риск OR по формуле OR=ad/bc. Где а – число лиц с наличием
анализируемого маркера среди больных, b – его отсутствие; с и d – число лиц
соответственно с наличием
и отсутствием маркера в контрольной группе.
Величина OR=1 указывает на отсутствие ассоциации, OR>1 – имеет место при
положительной ассоциации (фактор риска) и OR<1 – отрицательная ассоциация
аллеля с генотипом, расцениваемый как фактор устойчивости (Зайцев В.М.,
2006).
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Распространенность полиморфных вариантов генов Toll-4 (Asp299Gly)
и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов среди здоровых детей и часто
болеющих ОРВИ, проживающих в г. Чите
Молекулярно-генетические исследования показали, что среди здоровых
детей 82,9 % являются носителями нормальной гомозиготы (Аsp/Asp) в гене
Toll-4 (Asp299Gly) рецептора, 9,3 % – обладают гетерозиготным вариантом
(Asp/Gly), в 7,8 % – обнаружена полная замена аллелей (Gly/Gly). Таким
образом, здоровые дети проживающие в г. Чите, в 17,1 % являются носителями
генных мутаций в Toll-4 рецепторе. Среди детей, часто болеющих ОРВИ, 44,4
% обладают нормальной аллелью в гене Toll-4 рецептора (генотип Asp/Asp), 20
% имеют гетерозиготный вариант гена (генотип Asp/Gly) и 35,6 % обладают
мутантной аллелью (генотип Gly/Gly). В общей сложности у этой группы детей
генетические дефекты в Toll-4 рецепторе встречаются в 55,6 %.
10
Таблица 1
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера
Asp299Gly гена Toll-4 рецептора у детей с острой вирусной инфекцией
в сравнении с контрольной группой
Генетический маркер
Аллель А
Контрольная
группа (n=76)
0,875
Аллель G
Больные
ОРВИ (n=90)
0,423
P
OR
p<0,05
0,5
0,125
0,577
p<0,05
4,6
Генотип Asp/Asp
63(82,9 %)
40(44,4 %)
p<0,05
0,5
Генотип Asp/Gly
7(9,3 %)
18(20 %)
p<0,05
2,1
Генотип Gly/Gly
6(7,8 %)
32(35,6 %)
p<0,05
5,6
Примечание: χ2 – тест, p – значимость различий между показателями
больных и здоровых детей
Расчет отношения шансов (OR) выявил положительную ассоциацию
аллеля G и генотипа Gly/Gly при респираторной инфекции, что указывает, на
повышенный риск развития данной патологии у детей, имеющих полиморфизм
(Asp299Gly) в гене Toll-4 рецептора (табл. 1). Среди ЧБД процент мутаций в
гене (Ser249Pro) Toll-6 рецептора увеличен до 75 %. Мутантных гомозигот 25
% (Pro/Pro), что в 1,5 раза больше, чем у здоровых (табл. 2).
Таблица 2
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера
Ser249Pro гена Toll-6 рецептора у детей с респираторно-вирусной
патологией в сравнении с группой контроля
Генетический
Контрольная Больные
p
OR
маркер
группа
ОРВИ
(n=100)
(n=100)
Аллель S
0,655
0,375
p<0,05
0,8
Аллель P
0,345
0,625
p<0,05
1,4
Генотип Ser/Ser
35(35 %)
25(25 %)
p<0,05
0,7
Генотип Ser/Pro
48(48 %)
50(50 %)
p>0,05
1,2
Генотип Pro/Pro
17(17 %)
25(25 %)
p<0,05
1,5
Примечание: χ2 – тест, p – значимость различий между показателями
больных и здоровых детей.
11
Расчет отношения шансов (OR) выявил положительную ассоциацию
аллеля P с генотипом Pro/Pro. Это дает основание предполагать, что мутантная
аллель Р маркирует повышенный риск высокой восприимчивости детей к
ОРВИ. Кроме того, среди больных детей выявлены 4 носителя сочетанных
мутантных аллелей генов Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов.
2. Состояние врожденного и адаптивного иммунитета при ОРВИ у
часто болеющих детей, имеющих полиморфизм генов Toll-4
(Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов
Основную роль в противовирусной защите играют элементы врожденного
иммунитета. У часто болеющих детей в период ОРВИ снижена фагоцитарная
активность (фагоцитарный индекс и фагоцитарное число) по сравнению с
показателями здоровых детей. После стимуляции продигиозаном в условиях in
vitro фагоцитарная активность крови больных детей несколько увеличивается,
до 34,4±3,9 %, но фагоциты реагируют в 2 раза слабее, чем аналогичные клетки
здоровых детей - 61±4,2 %. Это говорит о дефиците резервных возможностей
фагоцитов у часто болеющих детей.
Фагоциты детей, носителей генетических дефектов Toll-4 рецепторов
реагируют на стимуляцию продигиозаном очень слабо, особенно при
гетерозиготном варианте (Asp/Gly) – 29,4±3,1 %, при контроле 61±4,2 %.
Фагоцитарный индекс и фагоцитарное число при этом значительно ниже, чем у
больных с нормальным генотипом (Asp/Asp).
Особенно ярко выражен фагоцитарный дефект при генетических
мутациях в Toll-6 рецепторах. Фагоцитарный индекс и поглотительная
активность у мутантных генотипов Ser/Pro – 26,1±2,1 % и Pro/Pro – 30±3,2 %
ниже, чем у нормального генотипа Ser/Ser – 44,3±4,2 %.
Фагоциты
гетерозиготного варианта Ser/Pro и гомозиготного Pro/Pro практически не
отвечают на стимуляцию.
12
Следовательно, при полиморфизме генов сигнальных рецепторов Toll-4 и
Toll-6 снижается способность к распознаванию соответствующего лиганда, что
ограничивает активацию фагоцитов после встречи с патогеном.
Врожденный иммунитет обеспечивается не только фагоцитозом, но и
системой комплемента, которая обладает выраженной цитотоксичностью по
отношению к патогену. Наши исследования показали, что система комплемента
у больных ОРВИ активирована
с увеличением концентрации С5а и С1-
ингибитора.
У детей, имеющих полиморфные варианты генов Toll-4 и Toll-6
рецепторов содержание анафилотоксина С5а и С1-ингибитора значительно
выше, чем в крови больных, не имеющих генетических изменений в Tollрецепторах. Для Toll-4 рецепторов концентрация С5а с генотипом Asp/Gly –
58,6 нг/мл, Gly/Gly – 50,5 нг/мл, С1 ингибитора у полиморфных Gly/Gly –
1021,7 нг/мл. Для Toll-6 рецепторов концентрация С5а у носителей генотипа
Ser/Pro – 30,4 нг/мл, Pro/Pro – 60,5 нг/мл; С1 ингибитора Pro/Pro – 947,5 нг/мл.
В контроле содержание С5а – 12,2 нг/мл, С1 ингибитора – 346,6 нг/мл.
Чрезмерная индукция анафилотоксина С5а у больных с полиморфными
вариантами генов Toll – рецепторов может играть неблагоприятную роль в
течении ОРВИ, так как С5а вызывает массивный отек слизистых, который
определяет клинические особенности местных проявлений инфекции.
Функциональная несостоятельность сигнальных Toll-рецепторов при
полиморфизме в кодирующих их генах отражается на внутриклеточных
реакциях и продукции медиаторов воспаления. Нас интересовал уровень
цитокиновых реакций при респираторно-вирусных инфекциях и особенно их
продукция при наличии полиморфных
вариантов в рецепторах
Toll-4
(Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro).
Наши исследования показали, что в общей группе часто болеющих детей,
включающих
все
генотипы,
при
ОРВИ
повышалась
концентрация
провоспалительных цитокинов (IL-1β, ФНО-α) и хемокина IL-8.
13
Рис. 1. Концентрация цитокинов IL-1β, IL-8 у больных ОРВИ-носителей
полиморфного варианта генаToll-6 (Ser249Pro) рецепторов (U-тест)
*– значимость различий от нормальных гомозигот Ser/Ser.
Это естественная реакция, направленная на борьбу с вирусами.
Содержание противовоспалительного цитокина IL-4 не изменяется в первые
дни заболевания, но увеличивается концентрация IL-10 и ИЛ-1RA (антагониста
рецепторов к IL-1β). Эти цитокины оказывают иммуносупрессорный эффект.
Усиленная
их
ингибированию
экспрессия
в
Th1-клеточного
первые
дни
пути
заболевания
иммунитета,
способствует
свойственного
противовирусной защите.
При генетических аномалиях в Toll-4 рецепторах мы не отметили четкой
разницы в концентрации цитокинов между генотипами. Замена аллелей
отразилась лишь на синтезе IL-1RA. Его содержание у детей с генотипом
Gly/Gly выше, чем при других полиморфных вариантах.
При генетических дефектах в Toll-6 рецепторах у больных ОРВИ
уменьшался синтез IL-1β, ФНО-α, IL-8, и увеличивался IL-1RA по сравнению с
группой детей без аномальных нарушений в сигнальных рецепторах (рис.1).
Такая реакция иммунокомпетентных клеток в первые дни заболевания
неблагоприятно сказывается на организации противоинфекционной защиты, и
местное воспаление слизистой может приобрести затяжной характер с
возможными бактериальными осложнениями.
14
Цитокины, выделенные в месте локального воспаления при ОРВИ
регулируют синтез иммуноглобулинов.
Рис. 2. Концентрация sIgА, IgM в крови у больных ОРВИ-носителей
полиморфных вариантов гена Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов (U-тест)
*– значимость различий от нормальных гомозигот Ser/Ser.
Полиморфизм генов, кодирующих Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro)
рецепторы ограничивает синтез всех иммуноглобулинов (IgA, sIgA, IgM, IgG),
поэтому их продукция у больных с аномальными аллелями оказалась ниже,
чем у аналогичных больных без генетических мутаций (рис. 2). Следовательно,
генетические ограничения выработки антител являются одной из возможных
причин несостоятельности противоинфекционной защиты у ЧБД.
3. Состояние гемостаза и влияние полиморфизма генов (Asp299Gly)
Toll-4 и (Ser249Pro) Toll-6 рецепторов на его уровень у детей при
частых ОРВИ
Несмотря на то, что основная нагрузка при вирусной защите падает на
систему иммунитета, гемостатические реакции обязательно сопровождают
иммунное реагирование (Кузник Б.И., Васильев В.Н., Цыбиков Н.Н., 1989;
Витковский Ю.А., 1997; Кузник Б.И., 2010).
В
наших
исследованиях
показано,
что
агрегационная
функция
тромбоцитов зависит от наличия полиморфизма генов, кодирующих Toll4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторы.
15
При мутациях в гене Toll-4 рецептора, индукция АДФ, адреналином и
коллагеном
увеличивает
способность
тромбоцитов
к
агрегации.
При
генетических дефектах Toll-6 рецепторов индукция теми же агонистами
уменьшает агрегационные свойства стимулированных тромбоцитов.
Мы полагаем, что различные эффекты индуцированной агрегации
связаны с количеством экспрессированных рецепторов для используемых
индукторов и состоянием белков трансмембранной передачи сигнала.
Возможно, при генетических дефектах в Toll-6 рецепторах срабатывает система
ингибиции внутриклеточной сигнализации.
Изменение в функциональной активности тромбоцитов сопряжено с
реакциями коагуляционного гемостаза. У детей больных ОРВИ развивается
гиперкоагуляция, которая выражается в укорочении времени рекальцификации,
увеличении
концентрации
фибриногена
и
числа
фибрин-мономерных
комплексов (РФМК).
На фоне ускоренного образования фибрина угнетён фибринолиз.
При
генетических дефектах в Toll-рецепторах степень гиперкоагуляции более
выражена в трех показателях: концентрации фибриногена, числе фибринмономерных комплексов и скорости фибринолиза.
4.
Особенности адгезивных свойств клеток крови у детей, больных
ОРВИ при полиморфизме генов (Asp299Gly) Toll-4 и (Ser249Pro) Toll-6
рецепторов
Гиперкоагуляция, имеющаяся в крови детей при ОРВИ нарушает белковый
состав крови, который отражается на адгезивных свойствах форменных
элементов.
Нас интересовали три варианта розеток при ОРВИ: лимфоцитарнотромбоцитарные,
лейкоцитарно-эритроцитарные,
тромбоцитарно-
эритроцитарные коагрегаты.
Проведенные исследования показали, что при ОРВИ увеличивается
лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия почти в два раза, что свидетельствует о
16
напряженности клеточного иммунитета (Витковский Ю.А., и др. 2005-2010;
Кузник Б.И., 2005-2010). Тромбоциты образуют клеточные кооперации не
только с лимфоцитами, но и эритроцитами (ТЭА). У здоровых детей такие
ассоциации составляют 5,0±0,4 %, у больных ОРВИ-32,1±2,8 % из 200
тромбоцитов, присоединивших к себе эритроциты.
Адгезивности подвержены эритроциты с пониженной резистентностью и
деформированной мембраной. С ними ассоциируют наряду с тромбоцитами и
лейкоциты, образуя лейкоцитарно-эритроцитарные коагрегаты (ЛЭА). У детей,
страдающих ОРВИ, отмечено увеличение ЛЭА в 5 раз (24,9±2,9 %) по
сравнению со здоровыми (5,3±0,6 %).
Лейкоцитарно-эритроцитарные
нейтрофилами
и
моноцитами.
агрегаты
представлены
Преобладают
коагрегаты,
в
основном
образованные
нейтрофилами (88,6±2,5 %), реже моноцитами (12,4±2,2 %).
Эритроциты,
подвержены
ассоциированные
экзоцитарному
лизису,
с
тромбоцитами
что
обусловлено
и
лейкоцитами,
цитотоксичными
свойствами контактных клеток. При этом у эритроцитов выделяются
прокоагулянтные факторы, поддерживающие гиперкоагуляцию. Экзоцитарный
лизис приводит к уменьшению числа эритроцитов у больных.
Генетические дефекты в Toll-4 и Toll-6 не отражаются на степени
тромбоцитарно-эритроцитарных ассоциаций. Однако количество образованных
эритроцитарно-лейкоцитарных розеток (ЛЭА) увеличивается при мутациях в
генах (Asp299Gly) Toll-4 и (Ser249Pro) Toll-6 рецепторов (табл.3).
Патогенетическое
значение
образованных
коагрегатов
форменными
элементами крови связано с нарушением микроциркуляции и увеличением
прокоагулянтного потенциала крови.
17
Таблица 3
Содержание ауторозеток у пациентов носителей полиморфных аллелей
Ser249Pro в гене Toll-6 и Asp299Gly в гене Toll-4 (медиана, 25-75 перцентили)
299Asp
(n=40)
ТЭА
37,1
(%)
[34,5-42,3]
Asp299Gly
Asp299Gly
(n=18)
30,3
[20,8-31]
299Gly
(n=32)
33,8
[29,5-40]
249Ser
(n=25)
33,5
[23,3-45]
Ser249Pro
Ser249Pro
(n=50)
32,3
249Pro
(n=25)
22,8
[31-40]
[11-32]
p*<0,05
ЛЭ
А
p*<0,05
17,5
23,5
26,3
21,5
27
29,8
[11,8-18,8]
[17,5-25,8]
[17,8-33,5]
[20,5-42,3]
[24,5-42,3]
[22,5-42,3]
p*<0,05
p*<0,05
p*<0,05
p*<0,05
(%)
Примечание: U-тест, P*–значимость различий по сравнению с группой
носителей гомозиготного Asp/Asp генотипа для гена Toll-4 и Ser/Ser генотипа
для гена Toll-6.
Таким образом, одной из причин высокой восприимчивости к ОРВИ
является наследственная предрасположенность, обусловленная мутациями в
генах Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов. Генетические дефекты
в
сигнальных
рецепторах
снижают
функциональную
активность
иммунокомпетентных клеток, что определяет низкую противоинфекционную
защиту.
ВЫВОДЫ
1.
Одним из патогенетических механизмов нарушений в системе
иммунитета, гемостаза и адгезивных свойств форменных элементов крови у
детей, часто болеющих ОРВИ, являются генетические дефекты в Toll-4
(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторах. Среди таких детей 55,6 %
являются носителями мутации в Toll-4 рецепторах
рецепторов.
и 75 % в генах Toll-6
Маркерами высокой восприимчивости детей к респираторно-
вирусным инфекциям являются аллель G гена Toll-4(Asp299Gly) рецептора и
аллель P гена Toll-6(Ser249Pro) рецептора.
18
2.
У
часто
болеющих
детей
снижена
фагоцитарная
активность.
Индуцирована система комплемента с увеличением уровня анафилатоксина
С5а и С1-ингибитора. У больных, носителей мутаций в генах Toll-4 и Toll-6
рецепторов, несостоятельность врожденного иммунитета выражена более
значительно.
3.
При ОРВИ в первые дни заболевания увеличена концентрация
провоспалительных
цитокинов
IL-1ß,
ФНОα,
хемокина
IL-8
и
противовоспалительных цитокинов IL10 и IL-1RA. При аномалии в рецепторах
Toll-4 и Toll-6 синтез отмеченных цитокинов уменьшался
у носителей
гетерозиготных вариантов Asp/Gly в гене Toll-4 рецептора, а при мутациях в
гене Toll-6 снижался у гетерозигот Ser/Pro и гомозигот Pro/Pro.
4.
В крови детей часто болеющих ОРВИ увеличено содержание IgM, IgG и
его подклассов, уменьшена концентрация IgA и sIgA. При генетических
мутациях в Toll-4 и Toll-6 рецепторах синтез отмеченных иммуноглобулинов
снижен, по сравнению с группой детей, не имеющих генетических дефектов в
рассматриваемых рецепторах.
5.
При ОРВИ, в первые дни заболевания спонтанная агрегация тромбоцитов
не отличается от контроля. При индукции АДФ, адреналином и коллагеном
агрегационная
активность
тромбоцитов
больных
детей
увеличивается
независимо от наличия или отсутствия генетических дефектов Toll-4 и Toll-6
рецепторов. Однако, аномальные аллели гена Toll-6 рецептора (Ser249Pro)
ограничивают индуцированную активность.
6.
В
остром
периоде
у
часто
болеющих
детей
развивается
гиперкоагуляция, которая сопровождается укорочением АЧТВ, увеличением
концентрации фибриногена и фибрин-мономерных комплексов (РФМК),
ингибицией фибринолиза. У больных с мутациями в генах Toll-4 и Toll-6
рецепторов отмеченные изменения выражены в большей степени.
7.
У детей при ОРВИ усилена лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия
(ЛТА), увеличен лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс (ЛТИ), повышено
число
лейкоцитарно-эритроцитарных
и
тромбоцитарно-эритроцитарных
19
ассоциаций. При наличии полиморфных генотипов Gly/Gly Toll-4 рецептора и
Pro/Pro Toll-6 рецептора число лейкоцитарно-эритроцитарных коагрегатов
увеличено в большей степени, чем у больных, не имеющих дефектов в
соответствующих генах.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Проведенный анализ частоты встречаемости полиморфных вариантов
генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов и выявление
генетических маркеров ОРВИ позволит создать группу диспансерного
наблюдения с индивидуальной профилактикой и лечением ОРВИ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1. Карпова Н.И. Врожденный и адаптивный иммунитет при острой
респираторной вирусной патологии у часто болеющих детей [Электронный
ресурс] / Н.И. Карпова // Забайкальский медицинский вестник. – 2011. №2. – С. 66 - 69. - Режим доступа: http: //www.medacadem.chita.ru/zmv (10
октября 2011г.).
2. Кузник Б.И. Состояние системы гемостаза и взаимодействие
форменных
элементов
крови
у
детей,
часто
болеющих
острыми
респираторными вирусными инфекциями / Б.И. Кузник, Л.П. Малежик,
Н.И. Карпова // Кубанский научный медицинский вестник. – 2010. - №8. –
С. 110 - 115.
3. Карпова Н.И. Фагоцитарная активность, особенности гемостаза у детей
часто болеющих ОРВИ / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик // Актуальные проблемы
клинической и экспериментальной медицины : тезисы докладов Всероссийской
научно-практической конференции, посвященной 55-летию ЧГМА. – Чита,
2008. – С. 183.
4. Карпова Н.И. Состояние гемостаза, неспецифической резистентности и
ауторозеткообразования
у
детей
с
рецидивирующими
обструктивными
20
ларингитами / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик, Н.А. Мироманова // Медицинские
аспекты
состояния
здоровья
:
материалы
I
Международной
научно-
практической интернет конференции «Состояние здоровья: медицинские и
психолого-педагогические аспекты». – Чита - Славянск, 2009. - С.139 - 140.
5.
Карпова
Н.И.
Гемореологические
нарушения
у
детей
со
стенозирующими ларинготрахеитами вирусной этиологии / Н.И. Карпова, Л.П.
Малежик //
Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-
сосудистой хирургии : материалы четвертой Всероссийской конференции (с
международным участием) – Москва, 2009. – С.196.
6. Карпова Н.И. Некоторые патогенетические аспекты респираторных
инфекций у часто болеющих детей / Н.И. Карпова и др. //
Материалы I
Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – Москва,
2009. – С. 91 - 92.
7. Карпова Н.И. Эндогенное ауторозеткообразование и лимфоцитарнотромбоцитарная адгезия у детей часто болеющих острыми респираторными
вирусными инфекциями / Н.И. Карпова, Н.А. Мироманова, Н.В. Епифанцева //
Современные аспекты инфекционной патологии : тезисы докладов научнопрактической конференции студентов и молодых ученых (с международным
участием). - Астрахань, 2009. - С. 50.
8.
Карпова
Н.И.
Свертывание
крови,
врожденный
иммунитет
и
ауторозеткообразование у детей, часто болеющих острыми респираторными
вирусными инфекциями / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик // Тромбоз, гемостаз и
реология. – 2005. - №3. - С. 43 - 48.
9. Карпова Н.И. Некоторые патогенетические особенности нарушения
микроциркуляции у детей с респираторно-вирусными инфекциями / Н.И.
Карпова, Л.П. Малежик, Б.И. Кузник // Забайкальский медицинский вестник. –
2010. - №4. – С. 24 - 29.
10. Карпова Н.И. Роль гемостаза и межклеточных агрегаций у детей с
острой респираторной вирусной инфекцией / Н.И. Карпова // Системное
21
кровообращение, микроциркуляция и гемореология : тезисы докладов. –
Ярославль, 2011. – С. 64.
11. Карпова Н.И. Иммунный статус у детей, часто болеющих острой
респираторной вирусной инфекцией / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик, Е.Е.
Гергесова // Медицинские аспекты состояния здоровья : материалы I
Международной научно-практической интернет конференции «Состояние
здоровья: медицинские и психолого-педагогические аспекты». - Чита-Славянск,
2011г. - С. 22 - 23.
12. Solpov A. Lymphocyte-platelet adhesion in A H1N1 infected patients / A.
Solpov, E. Gergesova, N. Strambovskaya, N. Karpova et al. // Abstracts from the
XXXIII World Congress of the International Society of Hematology. – Jerusalem. –
2010. – P. 79.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ЛТА – лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия
ЛТИ – лимфоцитарно -тромбоцитарный индекс
ЛЭА – лейкоцитарно-эритроцитарная адгезия
ОРВИ – острая респираторная вирусная инфекция
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ТЭА – тромбоцитарно-эритроцитарная адгезия
ЧБД – часто болеющие дети
ФИ – фагоцитарный индекс
ФЧ – фагоцитарное число
ЭДТА – этилендиаминтетраацетат
PRR – патоген распознающие рецепторы
22