На правах рукописи Клименко Виктория Евгеньевна
реклама
На правах рукописи Клименко Виктория Евгеньевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАПИЛЛЯРОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ЧЕРЕПНОМОЗГОВОЙ ТРАВМЕ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология 14.01.20 – анестезиология и реаниматология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Владивосток 2011 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Мотавкин Павел Александрович доктор медицинских наук, профессор Шуматов Валентин Борисович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Черток Виктор Михайлович ГОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России доктор медицинских наук, профессор Шевченко Владимир Петрович ФГУ «Новосибирский научно- исследовательский институт травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития России Ведущая организация: ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита диссертации состоится « 03 » июня 2011 г. на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2. Автореферат разослан «_____» _______________2011 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор 2 Г.В. Рева ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема тяжелой черепно-мозговой травмы привлекает внимание исследователей в течение многих лет. Гигантские масштабы современного травматизма сделали ее не только медицинской, но и острой социальной (Бабаян Е.Б., Зельман В.Л., Полушин Ю.С., 2005). Это обусловлено массовостью ее распространения среди лиц молодого и младшего среднего возраста, высокой летальностью и инвалидизацией пострадавших (Коновалов А.Н. и соавт., 2002). В процессе развития травматической болезни головного мозга, в области его поражения возникает сложный комплекс анатомических и патофизиологических процессов как со стороны ткани мозга, так и сосудистой системы, что ведет к нарушениям его функций (Шевцов В.И., 2003, Armin, S.S., 2006; Dorsch, N.W., 1993). Эти нарушения провоцируются не только прямым (первичным) травматическим воздействием, но и вторичными факторами, среди которых важную роль играют ишемические осложнения, обусловленные влиянием вазоактивных веществ (Стороженко И.Н, Вахницкая В.В., 2001, Крылов В.В., 2005; Ромодановский П.О., 1994). Нарушение микроциркуляции и, как следствие, гипоксия головного мозга, возникают при дискоординации физиологического цикла (сокращение – расслабление) гладкой мускулатуры микрососудов, которое происходит при нарушении баланса между констрикторными и вазодилататорными факторами, секретируемыми эндотелием сосудов (Рябов Г.А., 1988, 1994; Ананин В.Ф., 1996; Георгиева С.А., Бабиченко Н.Е., Пучиньян Д.М., 1993). Важнейшими патогенетическими звеньями травматического повреждения головного мозга являются эндотелиальная дисфункция и нарушение целостности гематоэнцефалического барьера. Учитывая важную биорегуляторную роль оксида азота (NO) в организме, нарушения, возникающие в нитроксидергической системе представляют собой ключевое звено в патогенезе эндотелиальной дисфункции и, как следствие, нарушения микроциркуляции (Гомазков О.А., 1998; Денисов Е.Н., 2008). 3 Одним из важнейших трансмиттеров, участвующих в регуляции местного сосудистого тонуса, выступает оксид азота, но в момент травмы он может оказывать токсическое действие и на ткань мозга, усиливая ее повреждение (Семченко В.В., 2002, Голиков П.П., 2003). В настоящее время одним из маркеров нейронального повреждения является белок S-100, выброс которого в кровеносное русло связывают лишь с нарушением целостности ГЭБ (Marchi N., Rasmussen P., 2003). Однако роль его в прогнозировании тяжести черепномозговой травмы и определении степени повреждения мозговой ткани до конца не ясна. Несмотря на многочисленность проведенных исследований, следует признать, что в связи со сложностью происходящих в ЦНС процессов, большим многообразием патофизиологических, биохимических и морфофункциональных изменений, работа по изучению патогенеза черепно-мозговой травмы и роли нитроксидергической системы в этом процессе далека от полного клинического завершения. Цель исследования: Выявить закономерности морфофункциональных преобразований капилляров головного мозга в остром периоде черепно-мозговой травмы. 1. 2. 3. 4. Задачи исследования: Изучить качественные и количественные показатели, характеризующие капилляры коры головного мозга в остром периоде черепно-мозговой травмы у экспериментальных животных. Исследовать нитроксидпозитивные капилляры головного мозга в динамике развития черепно-мозговой травмы у крыс. Определить количественное содержания конечных метаболитов оксида азота в плазме крови у животных и человека в остром периоде черепно-мозговой травмы. Изучить динамику маркера нейронального повреждения (белка S100) при черепно-мозговой травме с целью оценки состояния ГЭБ и степени тяжести травмы. 4 Научная новизна. Впервые получены данные о качественной и количественной перестройке микроциркуляторного русла коры головного мозга в остром периоде тяжелой черепно-мозговой травмы. Установлено, что реакция микроциркуляторного русла в значительной степени зависит от активности NO в стенке капилляра. Это косвенно подтверждается уровнем его стабильных метаболитов в крови. Показана зависимость количественного содержания маркера нейронального повреждения (белка S-100) в крови человека с черепномозговой травмой от сроков острого периода, характера повреждения головного мозга, прогноза течения заболевания. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные материалы о структурно-функциональной организации и компенсаторных возможностях капиллярного русла головного мозга при ЧМТ являются частью фундаментальных исследований в области нейробиологии, которые служат теоретической базой для изучения патогенеза ЧМТ. Сведения о динамике нитрита и белка S-100 представляют интерес для специалистов экспериментальной и практической медицины в диагностике степени повреждения головного мозга при ЧМТ. На основании полученных результатов лабораторных и клинических исследований могут быть разработаны рекомендации для практического здравоохранения (врачей анестезиологов-реаниматологов, нейрохирургов) по совершенствованию диагностики травматического повреждения головного мозга путем дифференцированного подхода к оценке степени и характера его повреждения. Положения, выносимые на защиту: 1. В процессе развития травматической болезни головного мозга происходят качественные и количественные изменения морфометрических показателей капилляров коры, выраженность которых зависит от времени, прошедшего после нанесения травмы. 2. При травматической болезни головного мозга, наряду с локальными процессами (нарушение образования NOS в эндотелии), происходит также повышение экспрессии оксида азота в кровоток. 5 3. При отрицательной динамике течения тяжелой черепно-мозговой травмы, происходит массивный выброс в кровеносное русло белка S – 100, что свидетельствует о продолжающемся патологическом процессе в головном мозге и возникновении вторичных реперфузионных повреждений. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VIII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2007), На IX Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 50-летию ГОУ ВПО ВГМУ Росздрава (Владивосток, 2008), на V Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 2008), на X Тихоокеанской научнопрактической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2009). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5 глав собственных данных, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 7 таблицами. Список литературы содержит 244 литературных источника, из них 169 принадлежат отечественным и 75 зарубежным авторам. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования. Для решения поставленных задач в настоящей работе использован комплекс морфологических, гистохимических, фотометрических экспериментальных и статистических методов исследования. При проведении экспериментов на лабораторных животных руководствовались приказом № 755, Министерства здравоохранения 6 СССР от 12 августа 1977 года “О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных”, и стандарта отрасли «Правила проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации» ОСТ 42 5П 99 (утв. Минздравом РФ 29.02. 1998 г.). Животные содержались в виварии в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 6.04.1993. Кормление осуществлялось в соответствии с нормами, утвержденными МЗ СССР от 10.03.1996 г., №163. Все исследования проводили согласно разрешению этического комитета протокол № 1 от 04.10.2010 г. Экспериментальная часть работы выполнена на половозрелых белых крысах линии Вистар, массой 180-300 г (n =54). Животные были разделены на контрольную и экспериментальную группы. Эти группы были разделены на 4 подгруппы в зависимости от метода идентификации микроциркуляторного русла. У первой подгруппы мозг исследовался на NADPH-диафоразу по методу Hope, Vinsent (1989), который позволяет судить не только о гистохимической локализации нейрональной NO-синтазы (NOS), но и об активности этого фермента в клетках. У второй подгруппы микроциркуляция исследовалась методом заливки тушью сосудистой системы. Инъекцию сосудистокапиллярной сети мозга осуществляли смесью тушь-желатин. Также срезы мозга окрашивались гематоксилин-эозином и по методу Ниссля. Объектом исследования служила кора больших полушарий головного мозга лабораторных животных. Использована модель нанесения дозированной тяжелой ЧМТ по методике Соколовой Т.Ф. (1986г.), обеспечивающей получение у разных животных одинаковой по степени тяжести ЧМТ. Все исследования проводились в динамике: без патологии, через 24, 72 часа и 7 суток после травмы. У каждого животного сравнивали участки мозга в зоне поражения (в зоне так называемой пенумбры) и аналогичные участки в интактном полушарии. Оценивался диаметр капилляров (мкм), объемная плотность 7 микроциркуляторного русла (мм), площадь обменной поверхности (мм2) и активность фермента (NADPH-диафоразы). В эти же сроки проводился забор крови у экспериментальных животных для исследования метаболитов NO. Клиническое исследование проводилось на базе отделения реанимации и интенсивной терапии МУЗ ГКБ № 2 г. Владивостока. В работе представлены результаты обследования 30 пациентов в возрасте 18 – 60 лет с острой изолированной тяжелой черепно-мозговой травмой. Исключение больных из дальнейшего исследования проводили в следующих случаях: - сочетание черепно-мозговой травмы с тяжёлым повреждением опорно-двигательного аппарата; - указание в анамнезе и выявленная при обследовании грубая сопутствующая соматическая или неврологическая патология; - из исследования также исключались беременные женщины и дети младше 18 лет. В основную группу вошли пациенты, у которых за время пребывания в отделении реанимации производился 3-кратный забор крови в первые 12 часов, через 24 часа и на 7 сутки с момента травмы. Эта группа была разделена на две подгруппы по исходу травмы: в первую вошли 14 человек с благоприятным исходом (выжившие), во вторую - 16 пациентов с неблагоприятным исходом. Иммуноферментный анализ уровня белка S100 в плазме крови проводился с применением системы Eleksys S-100. Анализ ELECSYS S100 – это сэндвич–метод, основанный на иммуноферментном анализе, предназначенный для использования на автоматических анализаторах и способный выявлять В-субъединицу S100 в сыворотке крови. Оценку состояния нитроксидергической системы у человека и экспериментальных животных проводили путем определения ближайшего стабильного метаболита оксида азота(II) – нитрита в плазме крови по методу Грисса на спектрофотометре при длине волны 546 нм. В качестве стандарта использовался нитрит натрия. 8 Полученные в результате исследования данные обрабатывали методом вариационной статистики с определением средней арифметической, стандартной ошибки средней арифметической, критерия достоверности. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Значения доверительного интервала, p < 0,05, считалось статистически достоверным. Результаты исследований и их обсуждение На МРТ-томограммах головного мозга подопытных животных выявились следующие изменения: средний размер очага повреждения после нанесения травмы составил в среднем 5,3 мм куб., был локализован в правой теменно-височной области и распространялся на кору, а в ряде случаев и на нижележащие структуры. Зона травмы в первые часы была представлена очагом размозжения (занимающим 2/3 от всего объема повреждения) с небольшим контуром перифокального отека (так называемая пенумбра). Изменение объема пенумбры у крыс на МРТ отражает степень выраженности вторичного повреждения головного мозга. Спустя 24 часа происходило нарастание отека, и соотношение их менялось: зона пенумбры составила 2/3 от объема повреждения и превысила размеры гематомы в 2 раза. Объем гематомы имел тенденцию к снижению, начиная с 24 часов. Это соответствует принятой на сегодняшний день концепции о том, что нарастание отека происходит к концу первых суток после получения травмы с пиком на 3 сутки. Макроскопически травматический очаг размозжения определялся в правой теменно-височной области, имел неправильную форму, с размерами 1,00,50,5 см. Ушиб головного мозга тяжелой степени характеризовался разрушением ткани мозга с разрывом мягких мозговых оболочек. Первичный очаг травматического некроза захватывал кору и субкортикальную зону. В ткани мозга наблюдалось скопление свернувшейся крови буровато-красного цвета, с разрушенным 9 веществом мозга (детрит), желтовато-красного цвета. Вокруг была видна тонкая полоска диффузного геморрагического пропитывания. Окружающая мозговая ткань белесоватого цвета. Целостность мягкой мозговой оболочки над описанным участком была нарушена. Локализация очага совпадала с локализацией, описанной по МРтомограммам. Морфологические исследования при окраске гематоксилинэозином и методом Ниссля показали, что у экспериментальных животных наблюдались обширные ушибы, представленные бесструктурными массами, с геморрагическим инфарцированием, захватывающие кору теменно-височной области большого мозга справа. В большинстве случаев ушиб мозга был представлен компактным очагом, имбибированным кровью. Нередко встречающиеся внутримозговые кровоизлияния были больших размеров по объему повреждения и площади распространения – до 6,0 мм куб. Кровоизлияние было представлено скоплением в ткани мозга гемолизированных и частично сохранившихся эритроцитов. На периферии его видны макрофаги, нагруженные бурым пигментом – гемосидерином. В мозговом веществе перифокальной зоны отмечались отек, гиперемия мелких сосудов коры и подкоркового белого вещества: прекапилляров и капилляров, формирующих сети, перикакапиллярный отек. В нервных клетках наблюдались выраженные деструктивнодистрофические изменения: хроматолиз и гибель нейронов, появление ишемических нейронов, признаками первичного аксонального раздражения (транснейрональные изменения). В сером веществе появлялись очаги ганглиозноклеточных запустений, в белом веществе - деструктивные изменения в нервных волокнах и нервных пучках. К 7 суткам происходило очищение очагов первичного травматического некроза, гиперплазия микроглиоцитов, размножение фагоцитов, появление новообразованных сосудов. 10 Описанные выше морфологические изменения были наиболее выраженными в непосредственной близости от очага ушиба, т.е. в перифокальной зоне, и постепенно ослабевали по мере удаления от него Экспериментальные изучения капилляров больших полушарий позволило установить, что микроциркуляторное русло головного мозга в остром периоде черепно-мозговой травмы претерпевает выраженные качественные и количественные изменения, затрагивающие как травмированное, так и интактное полушарие. Проведенные нами исследования не выявили достоверных различий в диаметре, плотности капилляров и в площади обменной поверхности обоих полушарий у интактных животных. Однако диаметр капилляров при заливке тушью был достоверно меньше, чем при окраске на NADPH-диафоразу (табл.1). По всей вероятности такая разница в диаметре капилляров при различных методах их идентификации обусловлена тем, что тушь заполняет только просвет капилляра, а NО-синтаза, вырабатываемая в эндотелиоцитах, визуализируется в стенке, и верифицирует его наружный диаметр. Здесь следует отметить, что при инъекции сосудистого русла мозга тушью капилляры коры головного мозга, выявляются с большей полнотой (в 3 раза больше), чем гистохимическим методом на NADPH-диафоразу. Объяснение кроется в том, что синтез эндотелий-зависимого релаксирующего фактора оксида азота сосредоточен в резистивных сосудах, и по мере уменьшения диаметра микрососудов, количество фермента постепенно уменьшается. Не исключено также, что гистохимический метод позволяет выявлять лишь функционально активные капилляры, эндотелий которых в момент фиксации секретирует NO. Этим можно объяснить более низкую плотность при гистохимическом методе. В первые сутки после травмы в поврежденном полушарии головного мозга происходит выраженная редукция микроциркуляторного русла. Выявляется неравномерное “обеднение” сосудистого рисунка. Образование мало- и бессосудистых зон при 11 наливке тушь-желатином сосудистого русла, является одним из основных ранних признаков тяжелого травматического повреждения головного мозга. Размеры и форма очагов гипоперфузии значительно варьируют, характерно их ассиметричное расположение. При наливке сосудистого русла тушью выяснено, что к концу первых суток реакцией на повреждение является значительное достоверное сужение капилляров как на стороне травмы (на 36%), так и на интактной стороне (на 28%) и уменьшение относительной плотности капилляров на травмированной стороне на 38% от исходного. В тоже время на симметричном участке в интактном полушарии наблюдался значительный рост плотности капилляров - на 35% от исходных величин. Площадь обменной поверхности капилляров сократилась в 2,5 раза на стороне травмы. При окраске на NADPH-диафоразу на интактной и на травмированной стороне диаметр достоверно не отличался от исходного, но имел тенденцию к сужению диаметра на стороне травмы. Кроме того, в поврежденном полушарии стенка капилляра была неравномерной, имела выраженные углубления и выпячивания. Такие изменения, возможно, связаны либо с неоднородным распределением фермента, либо с отеком и деформацией эндотелиоцитов, описанных в литературе. Плотность NADPH-диафораза-позитивных капилляров достоверно возрастала как на стороне травмы (на 21%), так и на противоположной стороне (на 12%). Несмотря на уменьшение их диаметра, происходило возрастание площади обменной поверхности с обеих сторон по сравнению с нормой (на 29% в интактном и на 25% в травмированном). Активность NADPH-диафоразы в стенке капилляров коры к концу первых суток течения травматического процесса значительно возрастала практически в 2 раза от исходной величины (табл.1). Через 72 часа сохранялась тенденция к сужению диаметра нитроксидергических капилляров от исходных величин, как на стороне травмы (на 14%), так и на интактной стороне (на 11%). Отмечалось достоверное повышение плотности капилляров с положительной 12 реакцией на NADPH-диафоразу в травмированном полушарии (в 1,7 раз), и на противоположной стороне (в 2,1 раза). К концу 3 суток, по мере прогрессирования патологического процесса, наступает незначительный спад активности NO-cинтазы, что выражается в снижении активности NADPH-диафоразы в травмированном полушарии на 12 % (табл.1). При инъекции тушью в обоих полушариях визуализировалось множество узких капилляров, диаметр которых достоверно отличался от исходных величин в 1,5 раза. На третьи сутки отмечались увеличение плотности капилляров и площади обменной поверхности на стороне травмы в 2 раза по сравнению с предыдущим этапом исследования. При этом величины достоверно не отличались друг от друга в обоих полушариях. Снижение плотности капилляров маркированных тушью в травмированном полушарии возможно связано с феноменом "no reflow", когда реперфузия после травмы на нормальном уровне АД не может восстановить кровоток: после полного или почти полного прекращения кровообращения в очаге повреждения замедляется циркуляция крови в неповрежденных сосудах (в зоне так называемой пенумбры), расположенных около очага. Учитывая выявленное к концу первых суток сужение просвета капилляра (как при инъекционном методе, так и при гистохимическом), можно предположить, что происходит «закрытие» капилляра из-за отека структурных образований его стенки (набуханием клеток эндотелия) и окружающих капилляр тканей мозга и формированием эндотелиальной дисфункции [Иванов В.С. с соавт., 1993]. В сравнении с предыдущим этапом исследования к 7 суткам происходило достоверное увеличение диаметра NADPH-диафоразапозитивных капилляров как на травмированной, так и на интактной стороне. При этом диаметр капилляров на стороне травмы восстанавливался до исходных величин, а в контралатеральном полушарии диаметр капилляров превышал контрольные значения пока зателя на 14%. Достоверно снижалась плотность нитроксидергических 13 Таблица 1 Морфологические показатели капилляров в коре больших полушарий головного мозга крысы при черепно-мозговой травме. 14 Исследуемый Метод показатель идентиф икации Исследуемое полушарие Контрольная группа Диаметр капилляров, мкм NO интактное травма интактное травма 6,10±0,19 6,04±0,16 5,33±0,1 5,35±0,12 6,45±0,32 5,85±0,35 3,8±0,21* 3,44±0,32* 5,45±0,25*/** 5,2±0,1*/** 3,99±0,16* 4±0,17* 6,44±0,06*/** 6,04±0,04** 6,1±0,14*/** 5,87±0,12** Плотность капилляров, в 1 мм3, мм NO тушь интактное травма интактное травма 210±5 218±6 610±28 620±32 239±17* 260±16* 852±48* 378±21* 348±13*/** 310±7*/** 768±35* 788±29*/** 255±16*/** 268±13*/** 450±28*/** 560±53** Площадь NO обменной поверхности, тушь мм2 интактное травма интактное травма 4022±124 4134±127 10209±569 10215±543 4840±452* 4775±454* 10166±647 4083±286* 5955±338*/** 5061±474* 9621±376** 9897±438*/** 5156±331*/** 5082±104* 8619±477*/** 10321±748** тушь Период ЧМТ 1 сутки 3 сутки 7 сутки Активность 6,73±0,54 9,82±0,24* 8,63±0,67*/** 7,45±0,42** NO фермента, ЕОП Достоверность: * - различия значимы по сравнению с контрольной группой (р < 0,05) ** - с предыдущими сутками (р < 0,05) капилляров, которая составила на травмированной стороне 114%, а на интактной - 109% от исходных величин. Менее выражено изменялась площадь обменной поверхности, оставаясь, тем не менее, на 30% выше, чем у интактных животных с обеих сторон. На 7 сутки течения патологического процесса происходит значительное уменьшение активности фермента до 7,45±0,42 ЕОП в клетках эндотелия капилляров, что соответствует нормальным значениям. При инъекционном методе также имело место достоверное расширение просвета капилляров, как на стороне травмы, так и на интактной стороне в сравнении и с предыдущим этапом исследования и с исходными данными. Тенденция к нормализации величины диаметра капилляров в обоих полушариях при различных методах их идентификации может свидетельствовать о включении компенсаторных механизмов, способствующих уменьшению отека и деформации эндотелия. При этом плотность русла в травмированном полушарии была достоверно больше, чем в интактном (разница с нормой составила 26% и 1% соответственно). Аналогичные изменения коснулись площади обмена (табл.1). При исследовании уровня оксида азота в крови отмечалась сходная динамика NO в плазме крови, как в эксперименте, так и в клиническом течении ЧМТ. Сразу после травмы наблюдалось увеличение уровня оксида азота в крови. Средние величины NO были самыми высокими в первые часы и за 7-дневный контрольный период возвращались к нормальным. Отмечалось резкое падение количества NO в крови к концу первых суток. К 3 суткам уровень NO в крови находился уже в пределах нормальных величин. Через 7 суток течения травматической болезни головного мозга значения NO в крови экспериментальных животных и человека не выходили за пределы референсных значений (рис. 1, 2). Мы наблюдали, что в течении травматической болезни существует 2 временных промежутка, когда происходит выброс NО: в первые часы 15 после травмы и на 3 сутки. Это согласуется с результатами ряда исследователей [Ziaja M., Pyka J., Machowska A.at al, 2007]. Рис. 1. Уровень NO в сыворотке крови пациентов с ТЧМТ. Рис. 2. Уровень NO в сыворотке крови экспериментальных животных. Начальный непосредственный пик NO в крови после травмы происходит, вероятно, из-за деятельности эндотелиальной NO-синтазы и нейрональной NO-синтазы как физиологическая реакция на травму. Вполне вероятно, что очень быстрое снижение NO к концу 1 суток происходит через его преобразования в другие продукты реакции, такие как пероксинитрит, которые далее неблагоприятно влияют на поврежденную ткань. Возможно также, что снижение NO к концу 1 16 суток связано со снижением мозгового кровотока и, как следствие, наблюдается уменьшение диаметра капилляров, снижение плотности капиллярной сети поврежденном полушарии к концу первых суток. Второй пик NO на 3 сутки, по-видимому, происходит в результате активации NO-синтазного пути образования оксида азота, и прежде всего прежде всего деятельностью iNOS, поскольку увеличение уровня нитрита почти в 2 раза выходящее за пределы нормальных значений вряд ли возможно в результате активации нейрональной и эндотелиальной NO-синтаз [Bayir H., Kagan V.E., 2005]. Уровень метаболитов NO в крови, повышенный при ЧМТ, согласуется с уровнем NO в поврежденной ткани мозга. Таким образом нарушение продукции оксида азота эндотелием сосудов головного мозга можно рассматривать как проявление эндотелиальной дисфункции, усугубляющейся при отрицательной динамике течения тяжелой черепно-мозговой травмы. Изменения проницаемости гематоэнцефалического барьера могут возникать уже с первых минут травмы. Первичное повышение проницаемости капилляров головного мозга происходит в результате повреждения клеточных мембран эндотелия, повреждения соединений между эндотелиальными клетками. Возникновение неадекватной проницаемости барьера способствует проникновению нейроспецифических белков в кровь. Поскольку эндотелиальная дисфункция и нарушение целостности ГЭБ являются важнейшими патогенетическими звеньями травматического повреждения головного мозга, нарушения в нитроксидергической системе являются ключевым звеном в патогенезе эндотелиальной дисфункции. В свою очередь экспрессия белка S-100 в кровеносное русло происходит лишь при нарушении целостности ГЭБ. При исследовании уровня белка S-100 в крови пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой были получены следующие 17 результаты. В первые часы после травмы отмечалась достоверная разница между уровнями белка S-100 в группах выживших и умерших пациентов. Уровень белка в группе умерших пациентов в этот временной промежуток был в 3,3 раза выше, чем в группе выживших (рис. 3). У всех выживших пациентов имело место достоверное снижение уровня белка S – 100 к 24 часам в среднем на 75% с последующим более плавным снижением вплоть до нормализации к 7 суткам. В группе умерших пациентов к концу первых суток снижение носило недостоверный характер. На 7 сутки уровень S-100 был в группе пациентов с летальным исходом в 3,2 раза выше нормы. S100, мкг/л 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 2,79 0,83 1е сутки до 12 часов Умершие пациенты Выжившие пациенты 0,84 0,32 0,09 0,21 24 часа 7 сутки Рис. 3. Динамика белка S 100 в зависимости от исхода травматического повреждения головного мозга. Это объясняется тем, что при отрицательной динамике течения тяжелой черепно-мозговой травмы, нарушение ГЭБ наблюдается в течение длительного времени, следовательно, поступление S-100 в кровь может быть более продолжительным. В таких случаях уровень белка S – 100 снижается незначительно, остается неизменным или же может повышался. Такое волнообразное изменение уровня белка свидетельствует о продолжающемся патологическом процессе в головном мозге и возникновении вторичных реперфузионных повреждений. А в случае благоприятного исхода ЧМТ, тенденция к значительному достоверному снижению уровня белка S – 100 наглядно прослеживается уже на 2 сутки болезни. 18 Поскольку всем пациентам КТ головного мозга проводилось на 2е сутки и при необходимости на более поздних сроках, характер повреждения головного мозга был известен (табл. 2). Таблица 2 Уровень белка S-100 в зависимости от вида травматического повреждения головного мозга (по данным КТ) Вид повреждения Уровень белка S-100, мкг/л Контрольная группа Эпидуральная гематома ДАП Внутримозговая гематома Контузионные очаги 0,00 - 0,10 1 сутки (до 12 ч) 24 часа 7 сутки 0,42± 0,15* 0,24±0,1** 0,09±0,06* 0,68±0,02* 0,32±0,03* 0,17±0,06*/* 6,85±2,12* 0,77±0,41* 0,28±0,01 7,96±2,56* 0,41±0,2 0,21±0,02 * - различия значимы по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). В случае диагностирования у пациентов эпидуральной гематомы, уровень маркера при поступлении был в 4,5 раз больше нормы, который к концу первых суток снижался недостоверно, но уже к 7 суткам происходил достоверный регресс показателя до нормальных цифр. При диффузном аксональном повреждении, исходный уровень маркера был достоверно выше, чем в случае с эпидуральной гематомой в 7 раз по сравнению с нормальными значениями, но на 7 сутки нормализации показателя не наблюдалось и составляла 2 нормы). Такая длительная экспрессия маркера в циркуляторное русло обусловлена продолжающимся патологическим процессом. В группе пациентов со сдавлением головного мозга внутримозговыми гематомами различной локализации уже в первые часы после поступления наблюдались более высокие цифры белка, чем в предыдущих группах, в среднем в 70 раз по сравнению с нормальными величинами. К 7 суткам, они значительно уменьшались, оставаясь повышенными в 3 раза от нормы. Такая же 19 динамика получена при обследовании пациентов с множественными контузионными очагами различной локализации. Анализируя полученные данные, обращает на себя внимание различие в исходных уровнях белка S-100 в зависимости от характера повреждения. Быстрая нормализация показателя и отсутствие значимых подъемов в последующие сутки объясняется тем, что после хирургического устранения причины, которое проводилось в первые 2 суток с момента травмы, не происходило выраженного разрушения ткани мозга, что клинически выражалось в восстановлении сознания до оглушения в среднем на 9 сутки и благоприятном исходе. При массивном повреждении ткани мозга возникает более выраженное и продолжительное нарушение ГЭБ, которое проявляется нарушением физиологических механизмов регуляции микроциркуляции, и нарушением образования NO в стенке капилляров. Это приводит к неадекватной проницаемости барьера, что способствует проникновению нейроспецифических белков в кровь. Таким образом, мы получили данные, подтверждающие возникновение эндотелиальной дисфункции при ТЧМТ, что выражается в нарушении нарушении целостности ГЭБ. Дискоординация эндотелийзависимых механизмов регуляции тонуса сосудов сопровождаются нарушением продукции NO в стенке сосуда. Микроскопически наблюдаются выраженные качественные и количественные изменения микроциркуляторного русла головного мозга в остром периоде черепномозговой травмы. Обнаруженный в ранние сроки ЧМТ выброс в кровеносное русло маркера повреждения головного мозга подтверждает нарушение целостности ГЭБ. 20 ВЫВОДЫ 1. При тяжелой черепно-мозговой травме у экспериментальных животных возникает выраженное расстройство кровообращения в зоне первичного и вторичного повреждения коры головного мозга, которое выражается в отеке стенок микрососудов, уменьшении их просвета, изменении плотности сосудистого русла. 2. Реакция капиллярного русла коры больших полушарий в острый период травмы начинается с уменьшения диаметра капилляров и их плотности, а также площади обменной поверхности. 3. В формировании ответной реакции капилляров коры головного мозга на травму вовлекается капиллярная сеть и интактного полушария, что проявляется в нарастании показателя плотности капилляров при снижении их диаметра, при этом площадь обмена остается на прежнем уровне. 4. Течение травматической болезни головного мозга сопровождается увеличением активности NO-синтазы в стенке капилляра, которая возрастает на 46% в течение первых суток. 5. При тяжелой черепно-мозговой травме, существует 2 временных промежутка, в течение которых происходит выброс NО в кровеносное русло: в первые часы и на 3 сутки после травмы, когда уровень метаболитов NO в крови повышается в 1,5 раза по сравнению с нормальными величинами. 6. При тяжелой черепно-мозговой травме происходит массивный выброс в кровеносное русло маркера повреждения головного мозга (белка S-100), что доказывает нарушение целостности ГЭБ. На основании результатов мониторинга содержания белка S-100 возможен ранний прогноз течения и исхода травмы. 7. Содержание белка S100 в плазме крови пациентов с тяжелой черепномозговой травмой зависит от характера и тяжести повреждения головного мозга. При благоприятном течении, начиная с конца 1 суток болезни отмечается постепенное снижение количества белка. 21 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Характеристика нитроксидергических капилляров в экспериментальной модели черепно-мозговой травмы у крыс / Полещук А.В., Дроздов К.А., Тарасенко В.Е. и др. // Материалы VIII-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины».Владивосток, 2007. - С. 30. 2. Реакция микроциркуляторного русла в экспериментальной модели черепно-мозговой травмы у крыс / Тарасенко В.Е, Полещук А.В., Молдованов М.А. и др. // Вестник интенсивной терапии. – 2008. - N5 (приложение). – С. 36. 3. Церебропотекторная терапия у больных с изолированной тяжелой черепно-мозговой травмой / Тарасенко В.Е., Полещук А.В., Молдованов М.А. и др. // Вестник интенсивной терапии. – 2008. - N5 (приложение). – С. 27. 4. Анализ экстенивных, интенсивных показателей и сроков нахождения в стационаре пациентов с изолированной ТЧМТ по данным МУЗ ГКБ №2 г. Владивостока / Патлай И. В., Молдованов М.А., Тарасенко В.Е., Полещук А.В. // Материалы IX-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 50-летию ГОУ ВПО «ВГМУ» Росздрава «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины». – Владивосток, 2008. – С. 222 223. 5. Молдованов М.А., Тарасенко В.Е., Полещук А.В. Анализ экстенивных, интенсивных показателей и сроков нахождения в стационаре пациентов с изолированной ТЧМТ по данным МУЗ ГКБ №2 г. Владивостока // Материалы V Дальневосточного регионального конгресса с международным участием «Человек и лекарство». – Владивосток, 2008. – С. 101. 22 6. Молдованов М.А., Тарасенко В.Е., Полещук А. В. Анализ экстенивных, интенсивных показателей и сроков нахождения в стационаре пациентов с изолированной ТЧМТ по данным МУЗ ГКБ №2 г. Владивостока // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2008. - №4. – С. 89. 7. Молдованов М.А., Тарасенко В.Е., Полещук А. В. Диагностика и мониторинг нейронального повреждения у пациентов с изолированной тяжелой черепно-мозговой травмой // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2008. - №4. – С. 70-72. 8. Клименко В.Е., Молдованов М.А., Полещук А.В. Реакция нитроксидергических капилляров головного мозга при черепномозговой травме в эксперименте // Материалы X-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины». - Владивосток, 2009. - С. 186. 9. Клименко В.Е., Молдованов М.А., Полещук А.В. Реакция микроциркуляторного русла головного мозга при черепно-мозговой травме в эксперименте // Материалы X-й Тихоокеанской научнопрактической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины». – Владивосток, 2009. - С. 187188. 10. Диагностика и мониторинг нейронального повреждения при тяжелой черепно-мозговой травме / Молдованов М.А., Клименко В.Е., Полещук А.В. и др. // Общая реаниматология. – 2010. - №1. – С.17-21. 11. Состояние капилляров микроциркуляторного русла головного мозга в остром периоде экспериментальной черепно-мозговой травмы / Клименко В.Е., Молдованов М.А., Полещук А.В. и др. // Общая реаниматология. – 2010. - №2. – С. 10-14. 12. Исследование динамики повреждения мозга крыс при черепномозговой травме методом магнитно-резонансной томографии / Дроздов К.А., Полещук А.В., Клименко В.Е., Молдованов М.А. // Тихоокеанский 23 медицинский журнал. – 2011. - №1. – С. 94-96. 24 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АД – артериальное давление ЧМТ - черепно-мозговая травма ВЧД – внутричерепное давление NADPH-диафораза – ГЭБ – гематоэнцефалический никотинамидадениндинуклеотид барьер фосфат-диафораза ГМК – гаммаоксимасляная NO - оксид азота кислота NOS - нитрооксидсинтаза КТ – компьютерная томография iNOS - индуцибельная NOS МРТ – магнитно-резонансная eNOS - эндотелиальная NOS томография nNOS – нейрональная NOS ТЧМТ – тяжелая черепноGCS - Glasgow-Coma-Scale мозговая травма (шкала ком Глазго)+ Клименко Виктория Евгеньевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАПИЛЛЯРОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЕ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Подписано в печать 14.04.2011 Формат 60×90 1/16. Усл. п.л. 1,0. Уч. изд. л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ 112 Отпечатано на участке оперативной полиграфии типографии ООО «Рея» г. Владивосток, ул. Адм. Юмашева, 12б 25
