Маренич Наталья Сергеевна КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В КОМПЛЕКСНОЙ
advertisement
На правах рукописи Маренич Наталья Сергеевна КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ДЕСТРУКТИВНЫХ ПОРАЖЕНИЙ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ЗОНЫ У ДЕТЕЙ. 14.00.09 – педиатрия АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2007 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Мухина Юлия Григорьевна доктор медицинских наук, профессор заслуженный деятель науки РФ Конь Игорь Яковлевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Цветкова Любовь Никифоровна доктор медицинских наук, профессор Римарчук Галина Владимировна Ведущее учреждение: детской хирургии Московский научно-исследовательский институт педиатрии и Защита состоится «14» мая 2007 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.02 при Российском государственном университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. Автореферат диссертации разослан «21» февраля 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Н.П.Котлукова Актуальность проблемы Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки и эрозивные поражения гастродуоденальной зоны у детей представляют серьезную проблему клинической медицины и общества в связи с высоким уровнем распространенности и омоложением патологии. В настоящее время наблюдается утяжеление ее течения с частыми рецидивами, нивелирование сезонности обострений, появление атипичных и бессимптомных форм (Баранов А.А., Щербаков П.Л., 2000, 2002). Это обуславливает необходимость дальнейшего детального изучения патогенеза повреждения слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта с целью коррекции имеющихся нарушений. Открытие Helicobacter pylori (H.pylori) изменило традиционные представления о механизмах формирования хронического гастрита и язвенной болезни и явилось основанием для пересмотра представлений об этиологии и патогенезе заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки, как у взрослых, так и у детей (Баранов А.А., Климанская Е.В., Римарчук Г.В. 2002; Бельмер С.В., 1997; Ивашкин В.Т., 2001; Корсунский А.А., 1999). Современные схемы противохеликобактерной терапии позволяют достичь быстрого клинического эффекта, но не всегда приводят к длительной ремиссии. Этот факт объясняет активный интерес к изучению влияния отдельных нутриентов на метаболические процессы в организме и патогенетические механизмы болезней. Значительное внимание при этом уделяется влиянию жирового компонента рациона питания, в частности, полиненасыщенным жирным кислотам (ПНЖК) семейства -3, прежде всего эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислотам, оказывающим иммуномодулирующее, противовоспалительное, антиатерогенное действие (Титов В.Н., 1999; Кожевникова Е.Н., 2006, Calder P.C.,2005, Cleland L.G., 1992, James M.J., 2000) Использование препаратов, обогащенных ПНЖК, нашло широкое применение при лечении воспалительных заболеваний 2 кишечника и атопических дерматитов у детей (Хавкин А.И., Пампура А.Н., 2004, James M.J., 1997, Sicherer S. H., 2003) Однако, данные литературы отечественных и зарубежных авторов, посвященные влиянию пищеварительного ω-3 тракта, ПНЖК крайне на воспалительные ограничены, содержат процессы единичные исследования. Важным патогенетическим механизмом воспалительного процесса в гастродуоденальной зоне является дисбаланс между агрессивными и защитными механизмами слизистой оболочки. В литературе имеются указания на влияние ПНЖК семейства -3 на процессы, протекающие в слизистой оболочке ЖКТ. При обострении язвенной болезни и эрозивных поражениях гастродуоденальной зоны отмечается блокада циклооксигеназного липооксигеназного лейкотриенов 5-го пути пути, превращения что класса, приводит ПНЖК к обладающих и активации увеличенному менее синтезу выраженными провоспалительными свойствами (Curtis G.H., 1992; Caughey G.E., 1996; Wallace J.L., 1996). Широкий спектр действия ПНЖК семейства -3 определен тем, что жирные кислоты, поглощенные клетками, используются в синтезе простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов, эстерифицируются в фосфолипиды, вытесняя линолевую и арахидоновую жирные кислоты. Исходя из изложенного представляется важным разработка подходов к оптимизации жирового компонента питания с использованием -3 ПНЖК растительного происхождения у детей с эрозивно-язвенными поражениями гастродуоденальной зоны на основании клинико-морфологических изменений. Цель исследования Обосновать целесообразность использования полиненасыщенных жирных кислот семейства -3 в комплексной терапии деструктивных поражений гастродуоденальной зоны у детей с учетом клиникоморфологических характеристик 3 Задачи исследования Выявить клинико-эндоскопические особенности деструктивных поражений гастродуоденальной зоны у детей. Разработать оценку морфологических критериев деструктивных поражений гастродуоденальной зоны, иммунологических нарушений, включая пищевую аллергию. Провести оценку клинико-морфологических особенностей воспалительных изменений в слизистой оболочке желудка и 12п к-ки на фоне повышения содержания в пищевом рационе -3 ПНЖК. Определить оптимальную дозировку используемых для коррекции пищевого рациона продуктов и препаратов, содержащих -3 ПНЖК. Оценить клинико-морфологические характеристики протективных механизмов слизистой оболочки у детей с деструктивными поражениями гастродуоденальной зоны на фоне проводимой терапии. Изучить клинико-морфологические особенности репаративных и регенераторных процессов, а также сочетания воспалительных и аллергических изменений слизистой оболочки у детей с деструктивными поражениями гастродуоденальной зоны. Научная новизна На основании комплексного клинико-морфологического исследования верхних отделов ЖКТ впервые были охарактеризованы особенности воспалительных изменений, особенности протективных свойств слизистой оболочки у детей с деструктивными поражениями гастродуоденальной зоны; изучены характеристики репарационных и регенераторных процессов слизистой оболочки гастродуоденальной у зоны детей на растительного происхождения. с фоне деструктивными приема ПНЖК поражениями семейства ω-3 4 Практическая значимость Использование льняного масла в дозировке 2.7-3.0 г. или 10-15 мл в день является эффективным компонентом комплексной терапии и приводит к улучшению клинико-морфологических характеристик слизистой оболочки у детей с деструктивными поражениями гастродуоденальной зоны. Количественная оценка эозинофильной и тучно-клеточной инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки желудка и 12ти перстной кишки может служить важным морфологическим критерием для выявления аллергического компонента воспаления у детей с деструктивными поражениями гастродуоденальной зоны. Обнаружение экспрессии CD15 клетками покровно-ямочного эпителия слизистой оболочки антрального отдела желудка после эрадикационной терапии Н.pylori позволяет выделить группу высокого риска повторного инфицирования Н.pylori. Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конгрессе "Детская гастроэнтерология: настоящее и будущее", (2002 г., Москва); на 9-й конференции "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей", (Санкт-Петербург, 2002); на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии (2003 г., Москва); на третьем Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (2004г., Москва); на Всероссийском совещании «Детская гастроэнтерология – настоящее и будущее» (2005г., Томск); на ХIII Конгрессе детских гастроэнтерологов России (Москва, 2006г). Публикации По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ. Внедрение в практику 5 Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры детских болезней №2 ГОУ ВПО РГМУ РОСЗДРАВА, в клиническую практику 2-го терапевтического отделения ДГКБ №13 им. Н.Ф.Филатова и ОКДЦ ДГБ №21 г. Москвы. Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 57 отечественных и 85 зарубежных источников. Материалы диссертации изложены на 108 страницах компьютерного текста, содержат 11 таблиц, 4 диаграммы, 3 схемы и 8 морфологических фотографий. Содержание работы Объем и методы исследования. В ходе исследования под нашим наблюдением находилось 82 ребенка с язвенной болезнью 12ти перстной кишки, желудка и эрозивными гастродуоденитами. Возраст детей составил от 6 до 16 лет, из них мальчиков - 52, девочек – 30 человек (табл.1). Таблица 1. Распределение больных по возрасту и полу. Возраст Нозологические формы Пол Всего 6-7 лет 8-11 лет 12-16 лет Мальчики Девочки детей Эрозивный гастродуоденит 3 14 20 26 16 42 Язвенная болезнь желудка - 1 1 - 2 2 Язвенная болезнь 12ти перстной кишки 1 9 28 26 12 38 Итого: 4 24 49 52 30 82 6 Каждый ребенок обследован трехкратно: до лечения, через 2 недели и через три месяца после начала лечения. Диагноз верифицирован эндоскопическим и морфологическим методами. Всем детям во время эзофагогастродуоденоскопии проводилось взятие двух биопсий слизистой оболочки фундального, антрального отделов желудка и луковицы ДПК на всех этапах обследования. Одновременно определялась степень обсемененности слизистой оболочки желудка бактериями H.pylori c помощью “мазка-отпечатка” и уреазным Де-нол тестом (табл.2). Таблица 2. Объем проведенных исследований Методы Количество исследований Клинический анализ крови общепринятый 82 Биохимический анализ крови общепринятый 82 общепринятый Кратчайшая эндоскопия детскими панэндоскопами фирмы “Olympus” и “Fudjinon” 82 Вид исследования Общий анализ мочи ЭГДС (3х кратно) Ультразвуковое исследование органов брюшной полости УЗ-сканер “Aloka” Гистологическое исследование Гистологический, гистохимический, срезов биоптатов (3х кратно) ИГХ, морфометрический Исследование крови пищевые аллергены Быстрый уреазный тест на 246 82 278 Иммуноферментный анализ 12 “Де-нол” тест 76 Находившиеся под нашим наблюдением дети были разделены на 2 группы в зависимости от схемы терапии. Основную группу составили 52 ребенка (33 мальчика и 19 девочек), получавших наряду с базовой терапией, препарат -3 ПНЖК, льняное масло, в количестве 2.7-3.0 г или 10-15 мл в сутки соответственно возрасту. 30 детей (19 мальчиков и 11 девочек), страдающих язвенной болезнью луковицы ДПК и эрозивными поражениями слизистой оболочки желудка и ДПК, в схему терапии которых не было включено льняное масло, составили группу сравнения. 7 Использовалось 100% натуральное пищевое льняное масло, выпускаемое во флаконах по 250 мл, а также препарат льняного масла, выпускаемый в капсулах, «Линовид», содержащий 100 капсул по 0.3г. Состав и содержание ПНЖК в препаратах были следующими: – α-линоленовая кислота 60%; – линолевая кислота 17%; – олеиновая кислота 15%; – стеариновая, пальмитиновая и миристиновая кислоты в общей сложности составили не более 8%. Предлагаемая дозировка учитывала рекомендации Института Питания РАМН, институтов и комиссий по лекарствам и продуктам питания Великобритании и США. Методы исследования. Клиническое наблюдение за детьми проводилось во 2-м терапевтическом отделении Детской городской клинической больницы №13 им. Н.Ф. Филатова и Детской городской больницы №21 города Москвы. Диагноз устанавливался в соответствии с критериями МКБ-10, анализом клинико-анамнестических данных детей и результатам дополнительных методов исследования (общий анализ мочи, крови, копрологическое исследование, биохимический анализ крови, ультразвуковое сканирование брюшной полости, эзофагогастродуоденоскопия). Специальные методы исследования. Морфологическое исследование проводилось на кафедре патологической анатомии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ доцентом, д.м.н. А.С. Тертычным (заведующий кафедрой проф., д.м.н. А.Г. Талалаев). Обработка материала осуществлялась с использованием следующих методов исследования: гистологический, гистохимический, иммуногистохимический (ИГХ), полуколичественный, морфометрический, компьютерный анализ изображения и статистическая обработка полученных 8 данных. Для гистологического исследования биопсийный материал фиксировали в 10% забуференном нейтральном формалине и заливали в парафин. Срезы толщиной 6-8 мкм подвергали дальнейшей обработке в зависимости от выбранного метода исследования. Использовались стандартные гистологические и гистохимические методы исследования (окраска гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизон, ШИКреакция и окраска альциановым синим). При исследовании биопсийного материала дополнительно использовали селективные окраски для выявления хеликобактера (окраска по Гимзе, акридиновым оранжевым, иммуногистохимическая -реакция). Подсчет межэпителиальных лимфоцитов проводили на 100 эпителиальных клеток в правильно ориентированных биоптатах. Для лучшего выявления и более точного подсчета межэпителиальных лимфоцитов использовали иммуногистохимическую реакцию с антителами к CD45RO(pan-T) и CD3. Подсчет эозинофильных лейкоцитов и тучных клеток проводили как минимум на 10 полях зрения при большом увеличении микроскопа (х400). Нормальными значениями содержания эозинофильных лейкоцитов и тучных клеток считалась цифра 15-20 клеток в поле зрения при большом увеличении микроскопа. При иммуногистохимическом исследовании с моноклональным антителом c-kit (CD117) верхняя граница поднималась до 25-30, поскольку эта высокочувствительная методика выявляла тучные клетки даже в случае их дегрануляции. Набор моноклональных антител, используемых при иммуногистохимическом исследовании, представлен в таблице 3. Таблица 3. Характеристика использованных моноклональных антител для иммуногистохимического исследования. Антитело Ki67 Клональность Разведени ; код е MIB-1 1:50 Фирма Novocastra 9 Smooth muscle actin (SMA) 1A4 1:50 Novocastra S-100 Polyclonal 1:50 Novocastra PCNA 19A2 1:50 Novocastra CD117 (c-kit) 78E 1:50 DAKO CD3 PS1 1:50 Novocastra CD15 80H5 1:30 Novocastra CD20 L26 1:100 Novocastra CD45RO UCHL-1 1:100 Novocastra CD68 PG-M1 1:100 Novocastra Chromogranin A LK2H10 1:50 Novocastra Neurone-specific enolase Polyclonal 1:50 Novocastra (NSE) Ki67 и PCNA – моноклональные антитела, позволяющее выявить клетки, находящиеся в состоянии пролиферации на различных стадиях клеточного цикла, за исключением стадии покоя. S-100 – реагирует с белком S-100, находящимся в клетках нейронального и гистиоцитарного происхождения. CD117 (c-kit) позволяет выявить в тканях тучные клетки. CD3 и CD45RO – специфические Т-клеточные маркеры. CD20 – специфический В-клеточный маркер. CD15 – маркер гранулоцитов. CD68 – маркер макрофагов-гистиоцитов. Chromogranin A и Neurone-specific enolase (NSE) – моноклональные нейроэндокринных антитела, гранул и реагирующие позволяющие с компонентами выявлять клетки нейроэндокринного происхождения. При ИГХ исследовании была использована непрямая иммунопероксидазная реакция. После депарафинизации и дегидратации в абсолютном спирте срезы были подвергнуты пероксидазо- антипероксидазному (peroxidase-anti-peroxidase (PAP)) методу обработки. Статистический математических анализ подходов, данных разработанных выполнялся для с помощью малой выборки. Достоверность различия результатов оценивалась по критерию Стьюдента. Результаты исследований обработаны на персональном компьютере IBM PC с помощью пакета программ “Microsoft Office 97” и “Microsoft Office 2000”. Результаты работы. 10 Среди детей, находившихся под нашим наблюдением, эрозивным гастритом/дуоденитом страдали 42 ребенка, язвенной болезнью желудка - 2, язвенной болезнью ДПК-38 (диаграмма 1). У 12 детей эрозивно-язвенные поражения слизистой оболочки гастродуоденальной зоны отмечались впервые. Длительность заболевания у наблюдаемых детей в обеих группах варьировала от 6 мес. до 6 лет с рецидивами от 1 до 3 раз в год. С возрастом увеличивается частота и тяжесть течения заболеваний, сопровождающихся деструктивными поражениями гастродуоденальной зоны, что было отмечено и другими авторами. Среди детей, страдающих язвенной болезнью ДПК, преобладали дети препубертатного и пубертатного периодов, однако, заболеваемость и активность воспалительных изменений у мальчиков и девочек отличались. Увеличение частоты заболеваемости в два раза у девочек было отмечено в возрасте 12-13 лет, в то время как у мальчиков – в возрасте 14-15 лет. Эти факты указывают на связь развития данного заболевания с половым созреванием ребенка и отражают более агрессивное течение язвенной болезни у девочек в препубертатном и раннем пубертатном, а у мальчиков – в пубертатном периоде (Цветкова Л.Н., 1993, 2002). Диаграмма 1. Структура эрозивно-язвенных поражений в группах 2 ЯБЖ 26 ЯБДПК 24 ЭГД Основная группа 11 14 ЯБДПК ЭГД 16 Группа сравнения Инфицированность H.pylori одинаково часто выявлялась как в основной группе (82,6%), так и в группе сравнения (83%), что соответствует литературным данным о распространенности H.pylori при деструктивных поражениях верхних отделов ЖКТ (Баранов А.А., 2002; Корсунский А.А., 1999; Ивашкин В.Т., 2001). Важную роль гастродуоденальной зоны в развитии играют деструктивных аллергические изменений факторы. Признаки воздействия на организм аллергенов определяются на поверхности слизистой оболочки различных отделов ЖКТ до появления общесоматических и кожных проявлений аллергии (Matysiak-Budnik T., 1999; Matysiak-Budnik T., 2002). В основной группе у 16 детей (30,7%) был выявлен отягощенный аллергологический анамнез, из них 4 страдали язвенной болезнью желудка и 12ти перстной кишки. Для верификации диагноза, определения характера, степени выраженности распространенности патологического процесса проводилась 3х кратная эзофагогастродуоденофиброскопия (ЭГДС). Таблица 4. Эндоскопическая характеристика деструктивных поражений гастродуоденальной зоны. Диагноз ЭГД Общее число детей (n=42) ЯБЖ Общее число детей (n=2) ЯБДК Общее число детей (n=38) 12 Распространенность поражения слизистой оболочки желудка: - антральный гастрит - пангастрит - эрозивный гастрит Распространенность поражения слизистой оболочки ДПК: - бульбит - дуоденит Глубина и характер поражения: - эрозии - единичные язвы - множественные язвы Нарушения моторики - гастро-эзофагеальный рефлюкс (рефлюкс-эзофагит) - дуодено-гастральный рефлюкс При Основна я группа (n=26) Группа сравнен ия (n=16) 20 4 12 15 3 5 8 18 7 9 Основна я группа (n=2) Группа сравнен ия (n=0) Основная группа (n=24) Группа сравне ния (n=14) 2 12 12 2 10 4 1 2 1 7 17 3 11 2 5 7 17 4 2 12 17 7 9 5 42 3 9 2 8 морфологическом исследовании 1 до лечения изменения в слизистой оболочке тела желудка относились к проявлениям хронического поверхностного гастрита. В антральном отделе преобладал диффузный характер поражения (т.н. хронический диффузный гастрит), с морфологическими признаками активности и фолликулярной гиперплазии лимфоидной ткани, которые коррелировали со степенью обсемененности H.pylori. Изменения соответствовали в слизистой хроническому оболочке 12ти поверхностному перстной кишки дуодениту. Все перечисленные выше изменения были в равной степени и с одинаковой частотой представлены, как в основной группе, так и в группе сравнения. Через 2 недели на фоне проводимой терапии в основной группе полная эрадикация отмечалась в 90.4% (47 из 52 больных), а в группе сравнения в 83.3% (25 из 30 больных). Сохранение минимальной степени активности воспаления отмечалось в случаях присутствия в биоптатах одиночных бактерий Н.pylori. В большинстве биоптатов слизистой оболочки антрального отдела желудка сохранялся диффузный характер распределения лимфо-плазмоцитарного инфильтрата. У 9 больных отмечалось сохранение 13 повышенного содержания эозинофильных лейкоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки, у 5 из этих пациентов сохранялось одновременное повышение количества тучных клеток. Наиболее существенные отличия в группах были получены при гистохимическом исследовании (диаграмма 2). Сохранение позитивного окрашивания шеечного отдела желез на кислые муцины, свидетельствуещее о тяжести поражения, отмечалось в основной группе в 13.5% (7 детей), а в группе сравнения в 40% (12 детей), р<0.01. При этом в обеих группах при иммуногистохимическом исследовании отмечалось сохранение высокой пролиферативной активности эпителия. Диаграмма 2. Гистохимическая характеристика содержания муцинов в покровно-ямочном эпителии слизистой оболочки антрального отдела желудка после 2 недельной терапии. 60 50 Отсутствие выявления кислых муцинов Сохранение кислых муцинов 40 30 20 10 0 1 2 1 – основная группа 2 – группа сравнения Через 3 месяца от начала лечения слабо выраженные воспалительные изменения в слизистой оболочке антрального отдела желудка без признаков активности сохранялись у 25% детей основной группы в 25% (13 детей), и в 47% группы сравнения (14 детей), р<0,05 (диаграмма 3). 14 Диаграмма 3. Динамика воспалительных изменений слизистой оболочки желудка на фоне применения ω-3 ПНЖК после 3х мес. терапии. 60 50 Отсутствие воспалительных изменений Сохранение морфологических признаков гастрита 40 30 20 10 0 1 2 1 – основная группа 2 –группа сравнения Лимфоидные фолликулы были уменьшены в размерах и содержали в центральных отделах гомогенные эозинофильные массы, что свидетельствовало о развитии инволютивных изменений на месте центров размножения. В группе сравнения в собственной пластинке слизистой оболочки в 13,3% (4 детей) отмечалось очаговое избыточное разрастание коллагеновых волокон, выявляемых при окраске по Ван Гизон и незначительное повышение числа межэпителиальных лимфоцитов. Эти изменения выявлены у детей с первоначально диагностированным выраженным диффузным и мультифокальным атрофическим гастритом. Подобных изменений в основной группе обнаружено не было. Известно, что повышение содержания межэпителиальных лимфоцитов свидетельствует об антигенной нагрузке при инфицированности Н.pylori. В основной группе содержание межэпителиальных лимфоцитов варьировало от 9 до 26 на 100 эпителиальных клеток и в среднем составило 17,94±2,06, а в группе сравнения содержание межэпителиальных лимфоцитов варьировало от 11 до 28 на 100 эпителиальных клеток и в среднем составило 22,74±4,09 (р<0,005). После 3х мес. терапии в биоптатах слизистой оболочки 12ти 15 перстной кишки выявлена статистически значимая разница в снижении количества межэпителиальных лимфоцитов в основной группе, которая составила 3,985±1,194 и в группе сравнения (диаграммы 4, 5, 6) - 0,18±0,87 (Р = 0,0035). 40 35 30 25 20 15 Содержание МЭЛ в основной группе до лечения Содержание МЭЛ в основной группе после лечения 10 5 0 Диаграмма 4. Содержание межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) в слизистой оболочке 12ти перстной кишки в основной группе. 40 35 30 25 20 15 Содержание МЭЛ в группе сравнения до лечения Содержание МЭЛ в группе сравнения после лечения 10 5 0 Диаграмма 5. Содержание межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) в слизистой оболочке 12ти перстной кишки в группе сравнения. 16 # Содержание МЭЛ после лечения 35 y = 0,7091x + 6,4875 30 основная группа 25 группа сравнения Линейный (основная г р у п п а ) 20 Линейный (группа с р а в н е н и я ) y = 0.3126x + 11.085 15 10 10 15 20 25 30 35 40 # Содержание МЭЛ до лечения Диаграмма 6. Содержание и линейные графики распределения межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) в слизистой оболочке 12ти перстной кишки в обеих группах. При гистохимическом исследовании кислые муцины переставали выявляться в основной группе, однако сохранялись в 6 случаях группы сравнения. ШИК-реакция в покровно-ямочном эпителии носила интенсивный характер и была равномерно представлена на всем протяжении, что свидетельствовало о латентном течении воспаления и ответной защитной реакции на повреждение слизистой оболочки. Результаты иммуногистохимического исследования показали, что Вклеточные (CD20-позитивные) инфильтраты были представлены очаговыми скоплениями и являлись преобладающими клеточными элементами в составе лимфоидных фолликулов. После лечения отмечалось уменьшение количества В-клеток в лимфоидных фолликулах и сохранение отдельных клеток в базальных отделах Преобладающими собственной клеточными пластинки элементами, слизистой оболочки. сохраняющимися после проведенного лечения, явились Т-клетки (CD45RO-позитивные). CD68- 17 позитивные макрофаги были представлены одиночными клеточными элементами. Экспрессия антигена LewisX (CD15) покровно-ямочным эпителием слизистой оболочки желудка играет важную роль в механизме адгезии H.pylori к эпителиальным клеткам, поэтому уровень экспрессии антигена LewisX может влиять на процесс колонизации H.pylori слизистой оболочки желудка, в особенности у детей с хроническими гастродуоденитами. Результаты иммуногистохимического исследования с моноклональным антителом к CD15 показали, что в биоптатах слизистой оболочки тела желудка, взятых до лечения, отмечалось слабо позитивное окрашивание наружной цитоплазматической мембраны одиночных клеток покровного эпителия и интенсивное окрашивание цитоплазмы желез. В антральном отделе желудка наблюдался высокий уровень экспрессии CD15 клетками покровно-ямочного и железистого эпителия. После проведенного лечения и достижения эрадикации не обнаруживалось экспрессии CD15 клетками покровного эпителия тела желудка, а в слизистой оболочке антрального отдела желудка отмечалось снижение степени интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток у большинства больных основной группы. У 9 больных группы сравнения сохранялся высокий уровень экспрессии CD15 клетками покровно-ямочного эпителия. Экспрессия CD15 в цитоплазме железистого эпителия не претерпевала значительных изменений в ходе лечения. Нами не было отмечено значительного изменения в количестве нейроэндокринных клеток, выявляемых с помощью моноклональных антител Chromogranin A и NSE, после проведенной антисекреторной терапии. Позитивно окрашенные клетки выявлялись в базальных отделах желез и крипт, и их количество составляло 3-4 на железу/крипту. Ни в одном из исследованных случаев последовательного нами распределения не было обнаружено нейроэндокринных формирования ими узловатых или аденоматозных структур. линейного клеток и 18 До последнего времени недостаточное внимание в педиатрической гастроэнтерологии уделялось коррекции протективных механизмов, те или иные нарушения которых отмечаются у подавляющего большинства больных с Н. pylori–ассоциированной патологией. Гастродуоденальный защитный слизистый барьер может быть условно разделен на преэпителиальный, эпителиальный и субэпителиальный компоненты. Для его поддержания и, соответственно, предупреждения повреждения слизистой оболочки необходимо участие цитокинов, факторов роста, кислых и основных переносчиков, адгезинов, состояние тока крови и микроциркуляторного русла. Наиболее существенные отличия в основной группе и группе сравнения были получены при проведении гистохимического исследования. Как отмечалось выше, после двухнедельного приема препаратов льняного масла сохранялось позитивное окрашивание шеечного отдела желез на кислые муцины. Поскольку тяжесть патологического процесса в слизистой оболочке желудка в значительной мере определяется состоянием муцина, то терапия, включающая ПНЖК и направленная на позитивные изменения структуры слизистого слоя, представляется патогенетически обоснованной. Полученные нами данные согласуются с данными литературы, указывающими на то, что содержание фосфолипидов в слизистом барьере желудка и соотношение в них жирных кислот непосредственно зависят от успешной эрадикации Н.pylori и снижения уровня эйкозаноидов, одновременно сами эпителиальные клетки могут экспрессировать ферменты, участвующие в выработке медиаторов воспаления (Orihara T., 2001). Через 3 месяца от начала лечения слабо выраженные воспалительные изменения без признаков активности сохранялись в слизистой оболочке антрального отдела желудка в основной группе у 13 больных (25%) и у 14 - в группе сравнения (46.7%) (р<0.05). Наши данные согласуются с представлениями о том, что ведущим механизмом реализации действия ω-3 ПНЖК, является переключение 19 метаболизма жирных кислот с арахидонового на эйкозапентаеновый путь. Известно влияние, оказываемое Н.рylori на процессы метаболизма жирных кислот. По данным литературы экспрессия Ki-67 и ЦОГ-2 была значительно выше у детей, инфицированных Н.рylori (Kim K.M., 2004). При этом экспрессия ЦОГ-2 коррелировала с характером воспаления в слизистой оболочке и уровнем экспрессии Ki-67. Экспрессия ЦОГ-2 наблюдалась в моноцитах и миофибробластах собственной пластинки слизистой оболочки. Полученное в результате использования ПНЖК статистически значимое снижение степени выраженности воспалительной инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки и, соответственно, повреждающего действия, оказываемого выделяемыми клетками воспаления медиаторами цитокинами, предупреждает развитие коллагенизации и собственной пластинки слизистой оболочки и предупреждает развитие атрофии. Этими данными можно объяснить обнаружение в собственной пластинке слизистой оболочки 4 больных контрольной группы (13,3%) очагового избыточного разрастания коллагеновых волокон, выявляемых при окраске по Ван Гизон. Таблица 5. Сравнительная оценка морфологических показателей при использовании в терапии льняного масла. Морфологическая характеристика Гистологические показатели Воспаление Гистохимические показатели Снижение содержания кислых муцинов Иммуногистохимичес кие показатели Содержание МЭЛ * - p< 0,05 ** - p< 0,01 Стандартная схема терапии Стандартная схема терапии с добавлением льняного масла ↓↓ ↓↓↓* ↓ ↓↓** ↓ ↓↓*** 20 *** - p< 0,005 Только в небольшом проценте наблюдений – у 3 больных (5,8%) в биоптатах слизистой оболочки антрального отдела желудка были обнаружены отдельные бокаловидные клетки, которые располагались в ямках в непосредственной близости с крупными лимфоидными фолликулами. Данные изменения являются начальными проявлениями кишечной метаплазии и свидетельствуют о переходе морфологических изменений в группу мультифокального атрофического гастрита, который во взрослом возрасте уже непосредственно предшествует развитию тяжелых атрофических форм хронического гастрита и является фоном для развития опухолевых поражений. Атрофические формы гастритов и кишечная метаплазия крайне редко диагностируются у детей. По данным литературы атрофия и кишечная метаплазия у детей с H.pylori могут иметь связь с повышением количества Влимфоцитов и апоптотическими изменениями покровного эпителия. Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что у детей с деструктивными поражениями гастродуоденальной зоны развитие кишечной метаплазии не требует для своего развития предшествующих атрофических изменений слизистой оболочки и может происходить независимо от процессов атрофии. Появление секреции кислых муцинов в эпителии шеечных отделов желез, по-видимому, непосредственно предшествует появлению в эпителии бокаловидных клеток. Эти изменения всегда происходят на фоне расширения регенерационной зоны желез и локализуются в непосредственной близости с крупными лимфоидными фолликулами, что подтверждает высказанное Guarner J. предположение о влиянии, оказываемом В-клетками на процессы атрофии и метаплазии. В последнее время в литературе появляется все больше публикаций, посвященных роли пищевой аллергии в формировании воспалительных изменений верхних отделов ЖКТ. В нашем исследовании при использовании 21 критериев, предложенных Dimmik J. и Minnea F. в собственной пластинке слизистой оболочки 16 детей отмечалось повышение содержания эозинофильных лейкоцитов, количество которых достигало 10-15 в поле зрения при большом увеличении микроскопа. У 15 из этих больных происходило одновременное повышение количества тучных клеток, которые выявлялись благодаря своему характерному метахроматическому окрашиванию цитоплазмы при окраске по методу Гимза. У 9 пациентов после проведенной эрадикации H.pylori отмечалось сохранение повышенного содержания эозинофильных лейкоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки, и у 5 из них сохранялось одновременное повышение количества тучных клеток. В нашем исследовании при повышении содержания эозинофильных лейкоцитов в большинстве случаев происходило одновременное повышение количества тучных клеток, что согласуется с данными литературы. Следует особо подчеркнуть, что обнаруженная в нашем исследовании морфологическая картина не соответствует «строгим» критериям и картине классического эозинофильного гастрита. В нашем исследовании были разработаны критерии количественной оценки аллергического компонента воспаления слизистой оболочки ЖКТ. 15-20 эозинофильных лейкоцитов и тучных клеток в поле зрения при большом увеличении микроскопа могут указывать на вероятность аллергического воспаления и требуют иммунологического обследования на наличие пищевой аллергии, в особенности у детей, у которых сохраняется клиническая симптоматика после успешно проведенной эрадикационной терапии. Сохранение высокой экспрессии CD15 клетками покровно-ямочного эпителия слизистой оболочки антрального отдела желудка после эрадикации свидетельствует о наличии благоприятных условий и высокой вероятности реинфицирования H.pylori. 22 Полученные обосновать результаты значение ω-3 данного ПНЖК в исследования восстановлении позволили нам структурных и функциональных характеристик слизистой оболочки при деструктивных поражениях гастродуоденальной зоны. Выводы 1. Обогащение пищевого рациона ω-3 ПНЖК, источником которых служит льняное масло, в ближайшие сроки от начала лечения влияет на морфофункциональные характеристики покровно-ямочного эпителия, а в отдаленные сроки – на изменения, происходящие в собственной пластинке слизистой оболочки. Достоверный положительный эффект достигается при назначении льняного масла в суточной дозировке 2.7-3.0 г или 10-15 мл в день (в пересчете на содержание α-линоленовой кислоты не менее 1.62 – 1.8г). 2. Использование в терапии ПНЖК приводит к уменьшению секреции кислых муцинов и предупреждает функциональную перестройку клеток покровно-ямочного эпителия, уменьшает вероятность развития кишечной метаплазии. 3. Использование ПНЖК статистически достоверно предупреждает развитие коллагенизации собственной пластинки слизистой оболочки и развитие атрофии. 4. При назначении ПНЖК происходит достоверное снижение количества межэпителиальных лимфоцитов в слизистой оболочке ДПК у детей с H.pylori-ассоциированными деструктивными поражениями гастродуоденальной зоны. 5. Выявление аллергического компонента воспаления требует поиска и исключения возможных аллергенов, что позволяет добиться существенного улучшения результатов лечения у детей с деструктивными поражениями гастродуоденальной зоны. 23 6. Сохранение высокой степени экспрессии CD15 клетками покровноямочного эпителия слизистой оболочки антрального отдела желудка после эрадикационной терапии, свидетельствует о сохраняющихся условиях для адгезии и высокой вероятности реинфицирования H.pylori. Практические рекомендации 1. Льняное масло в дозировке 2.7-3.0 г. или 10-15 мл в день можно рекомендовать в качестве эффективного компонента лечебного питания в дополнение к морфологических основной терапии результатов лечения для улучшения детей с клинико- деструктивными поражениями слизистой оболочки гастродуоденальной зоны. 2. Оценка и подсчет эозинофильной и тучно-клеточной инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки желудка и ДПК является важным морфологическим критерием для выявления аллергического компонента воспаления у детей с деструктивными поражениями гастродуоденальной зоны. 3. Обнаружение экспрессии CD15 клетками покровно-ямочного эпителия слизистой оболочки антрального отдела желудка после эрадикации позволяет выделить группу высокого риска повторного инфицирования Н.pylori. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Конь И.Я., Мухина Ю.Г., Маренич Н.С., Тертычный А.С. Использование полиненасыщенных жирных кислот в комплексной терапии Helicobacter pylori-ассоциированных гастродуоденитов и язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. // Материалы конгресса 24 "Детская гастроэнтерология: настоящее и будущее", 12 - 14 февраля 2002 г., Москва. - С. 139-140 2. Конь И.Я., Мухина Ю.Г., Маренич Н.С., Гаврикова Д.В., Тертычный А.С. Использование льняного масла в комплексной терапии Helicobacter pylori-ассоциированных гастродуоденитов и язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у детей. // Детская гастроэнтерология 2002: Сб. мат-лов 9-й конференции "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей" - Санкт-Петербург, 15-17 мая 2002. - С. 270-271. 3. Тертычный А.С., Маренич Н.С. Клинико-морфологические признаки пищевой аллергии при хроническом хеликобактерном гастрите у детей.// Тезисы II Всероссийского конгресса по детской аллергологии – М.: Медпрактика-М, 10 – 11 декабря 2003 года, Москва. – С. 194-95. 4. Тертычный А.С., Коновалов Д.М., Маренич Н.С. Иммуногистохимическая оценка результатов лечения хронических гастродуоденитов у детей.// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2004. - Том XIV - № 5 (Приложение № 23. Материалы Десятой Российской Гастроэнтерологической Недели, 25 - 28 октября 2004г., Москва). - С. 117. 5. Тертычный А.С., Коновалов Д.М., Маренич Н.С. Применение иммуногистохимического метода исследования в диагностике хронических гастродуоденитов у детей. // Материалы третьего Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии, 26-28 октября 2004г., Москва. – М.: Медпрактика. – М., 2004. - С. 80-81. 6. Талалаев А.Г., Тертычный А.С., Коновалов Д.М., Маренич Н.С., Жаров А.Р., Бардина Т.А. Новые подходы в морфологической диагностике хронических гастродуоденитов у детей. // Вестник РГМУ. – 2005. - № 1 (40) – С. 49–53. 7. Талалаев А.Г., Тертычный А.С., Коновалов Д.М., Маренич Н.С. Влияние Helicobacter pylori на экспрессию антигена LewisX (CD15) 25 эпителиальными клетками слизистой оболочки желудка при НРассоциированных хронических гастродуоденитах у детей.// Бюллетень сибирской медицины. – 2005. – Том 4. (Приложение 2. Материалы Всероссийского совещания «Детская гастроэнтерология – настоящее и будущее»). – С. 112-113. 8. Маренич Н.С., Мухина Ю.Г., Тертычный А.С., Коновалов Д.М., Талалаев А.Г. Эффективность оптимизации лечебного питания с учетом клинико-морфологических критериев диагностики у детей с деструктивными поражениями слизистой оболочки гастродуоденальной зоны. // Материалы ХIII Конгресса детских гастроэнтерологов России (Всероссийское совещание "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей"). – Москва, 21-23 марта 2006г. – Под общей редакцией акад. РАМН В.А. Таболина. – М.: Изд. Медпрактика-М, 2006. – С. 218-219.
