ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова"
Реклама
![](http://s1.studylib.ru/store/data/003656144_1-da3cea35147eaec8a4a998b86631f467-768x994.png "ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова"")
ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Титов Борис Васильевич ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, БЕЛКОВЫЕ ПРОДУКТЫ КОТОРЫХ ИГРАЮТ РОЛЬ В РАЗВИТИИ ВОСПАЛЕНИЯ, ПРИ ИШЕМИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ 03.01.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор биологических наук профессор О.О. Фаворова МОСКВА 2014 1 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5 ВВЕДЕНИЕ 8 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Ишемический инсульт как комплексное полигенное заболевание 1.1. Этиопатогенез ишемического инсульта и факторы риска 14 1.2. Значение генетических факторов для развития ИИ 22 1.2.1. Моногенные формы ИИ 22 1.2.2. Полигенные мультифакториальные формы ИИ 24 1.2.3.Экспериментальные модели для изучения генетики ИИ 25 1.3. Поиск генов, определяющих предрасположенность к полигенным формам ИИ 26 1.3.1. Гены системы липидного метаболизма 29 1.3.2. Ген eNOS системы продукции оксида азота 32 1.3.3. Гены ренин-ангиотензин-альдостероновой системы 34 1.3.4. Ген метилентетрагидрофолатредуктазы 34 1.3.5. Гены системы свертывания крови 35 1.3.6. Гены, кодирующие компоненты системы воспаления 36 1.3.7. Полный геномный поиск и мета-анализ 42 1.4. Выбор генов-кандидатов и их полиморфных участков для настоящего исследования 44 1.4.1. Ген CTLA4, его белковый продукт и полиморфизм 44 1.4.2. Ген PDE4D, его белковый продукт и полиморфизм 46 1.4.3. Ген IL4, его белковый продукт и полиморфизм 47 1.4.4. Ген TNF, его белковый продукт и полиморфизм 48 1.4.5. Ген LTA, его белковый продукт и полиморфизм 50 1.4.6. Ген IL6, его белковый продукт и полиморфизм 51 1.4.7. Ген IFNG, его белковый продукт и полиморфизм 53 1.4.8. Ген TGFB1, его белковый продукт и полиморфизм 54 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 58 2 2.1. Объект исследования 58 2.2. Использованные реактивы 58 2.3. Выделение геномной ДНК из периферической крови 59 2.4. Геномное типирование 60 2.4.1. Геномное типирование полиморфного участка 49A>G гена CTLA4 61 2.4.2. Геномное типирование полиморфных участков 41G>A и 87C>T гена PDE4D 62 2.4.3. Геномное типирование полиморфного участка −590C>T гена IL4 63 2.4.4. Геномное типирование полиморфного участка −308A>G гена TNF 64 2.4.5. Геномное типирование полиморфного участка 252А>G гена LTA 66 2.4.6. Геномное типирование полиморфного участка −174G>C гена IL6 67 2.4.7. Геномное типирование полиморфного участка 874A>T гена IFNG 68 2.4.8. Геномное типирование полиморфного участка −509С>Т гена TGFB1 70 2.4.9. Геномное типирование полиморфного участка 869T>C гена TGFB1 71 2.4.10. Геномное типирование полиморфного участка 915G>C гена TGFB1 72 2.5. Статистический анализ 73 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 75 3.1. Анализ ассоциации полиморфных участков исследуемых генов с развитием ИИ 76 3.1.1. Полиморфные участки 49A>G гена CTLA4, −590C>T гена IL4, −308A>G гена TNF, 252 A>G гена LTA 76 3.1.2. Полиморфный участок −174G>C гена интерлейкина 6 (IL6) 78 3.1.3. Полиморфные участки SNP41G>A и SNP87C>T гена фосфодиэстеразы 4D (PDE4D) 83 3.1.4. Полиморфные участки −509С>Т, 869T>C и 915G>C гена трансформирующего фактора роста β1 (TGFβ1) 87 3.1.5. Полиморфный участок 874A>T гена интерферона гамма (IFNG) 92 3.2 Анализ ассоциации полиморфизма –174G>C гена IL6 с уровнями фибриногена и показателями тромбоцитарного гемостаза в плазме крови 3 96 3.3. Анализ ассоциации сочетаний аллелей и генотипов полиморфных участков генов CTLA4, PDE4D, IL4, TNF, LTA, IL6, IFNG, TGFB1 с использованием алгоритма APSampler 97 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 110 ВЫВОДЫ 112 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 114 4 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АГ – артериальная гипертензия АД – артериальное давление АПК – антигенпрезентирующие клетки ГКГ – главный комплекс гистосовместимости ГЭБ – гематоэнцефалический барьер ДИ – доверительный интервал ИБС – ишемическая болезнь сердца ИИ – ишемический инсульт ИМ – инфаркт миокарда ЛПНП – липопротеины низкой плотности МА – мерцательная аритмия МРТ – магнитно-резонансная томография ОШ – отношение шансов ПДРФ – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов п.н. – пара нуклеотидов ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЦР-SSP – ПЦР с использованием набора аллелеспецифических праймеров РААС – ренин-ангиотензин-альдостероновая система мм.рт.ст. – миллиметр ртутного столба ср. возраст – средний возраст ФФК – фосфофруктокиназа ХС – холестерин цАМФ – циклический аденозинмонофосфат цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат ЦНС – центральная нервная система ЭДТА – этилендиаминтетраацетат ЭКГ – электрокардиография ACE –ангиотензин-превращающий фермент 5 ACE – ген, кодирующий ангиотензин-превращающий фермент apoE – аполипопротеин Е APOE – ген, кодирующий аполипопротеин Е CADASIL – церебральная аутосомно-доминантная артериопатия с субкортикальными инфарктами и лейкоэнцефалопатией CTLA4 – антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) dH2O – дистилированная H2O DMSO – диметилсульфоксид EM – максимизация математического ожидания (expectation maximization) eNOS – ген, кодирующий эндотелиальную синтазу NO FGA –альфа-фибриноген FGA – ген, кодирующий альфа-фибриноген FGB – бета-фибриноген FGB – ген, кодирующий бета-фибриноген GWAS – полногеномный поиск ассоциаций (genome-wide association study) IFNγ – интерферон гамма IFNG – ген, кодирующий интерферон гамма IL-4 – интерлейкин 4 IL4 – ген, кодирующий интерлейкин 4 IL-6 – интерлейкин 6 IL6 – ген, кодирующий интерлейкин 6 LPL – липопротеинлипаза LPL – ген, кодирующий липопротеинлипазу LTA – лимфотоксин альфа LTA – ген, кодирующий лимфотоксин альфа MTHFR – ген, кодирующий метилентетрагидрофолатредуктазу PDE4D – фосфофдиэстераза 4D PDE4D – ген, кодирующий фосфофдиэстеразу 4D QTL – локус количественных признаков (quantitative trait locus) 6 SD – стандартное отклонение (standard deviation) SDS – додецилсульфат натрия SHRSP – склонные к возникновению инсульта спонтанно-гипертензивные крысы (spontaneously hypertensive stroke-prone rats) SNP – однонуклеотидный полиморфизм (single nucleotide polymorphism) TGFB1 – ген трансформирующего фактора роста бета 1 TNF – фактор некроза опухоли альфа TNF – ген фактора некроза опухоли альфа 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. В России, как и во всем мире, острые нарушения мозгового кровообращения являются одной из важнейших медико-социальных проблем, что обусловлено их высокой долей (65-75%) в структуре заболеваемости, а также в инвалидизации и смертности населения [15]. В Российской Федерации частота инсультов составляет, по разным данным, 350-400 случаев на 100 тыс. населения [15]. Заболевание может возникнуть в любом возрасте, но наибольшая заболеваемость наблюдается у лиц в возрасте между 50 и 70 годами [15]. Инвалидизация после перенесенного инсульта занимает первое место среди всех причин первичной инвалидности. Социально-экономическая значимость этого заболевания связана еще и с тем, что среди заболевших инсультом 1/3 – люди трудоспособного возраста, а к труду возвращается не более 20% больных. Более того, увеличение частоты инсульта наблюдается за счет возрастания числа больных в работоспособном возрасте – до 64 лет [16, 28]. Сосудистые заболевания мозга занимают второе место в структуре причин общей смертности, ненамного уступая заболеваниям сердца и онкологическим заболеваниям [33, 78]. В острой стадии инсульта смертность составляет около 35%, увеличиваясь еще на 15% к концу первого года [35]. Особого беспокойства не может не вызывать тот факт, что показатели смертности от инсульта в России за последние годы повысились на 18%, достигнув 280 человек на 100 тыс. населения, хотя в других странах идет прогрессивное снижение этой цифры. В зависимости от патоморфологических особенностей, выделяют ишемический инсульт (ИИ), или инфаркт мозга, являющийся следствием резкого ограничения притока крови к головному мозгу, геморрагический инсульт, характеризующийся кровоизлиянием в ткань мозга, подоболочечные пространства или в желудочки, а также смешанные инсульты, при которых сочетаются очаги ишемии и геморрагии. На долю ИИ в нашей стране, как и в большинстве стран мира, приходится около 80% всех случаев инсульта [17]. 8 Настоящая работа посвящена исследованию генетической предрасположенности к ИИ. Известно, что гибель нервной ткани и формирование инфаркта при ИИ являются результатом каскада патобиохимических и патофизиологических процессов [16, 19]. Патогенез мозговой ишемии включает большое количество факторов, таких как гипоксия, реперфузионные повреждения, а также воспалительные реакции, которые, в свою очередь, имея динамический характер, сопровождаются вовлечением различных механизмов на разных стадиях ишемического каскада и играют неоднозначную роль [18]. Большую роль в развитии ИИ играют внешние факторы, такие, например, как гиподинамия, прием алкоголя и стресс. В развитии мозговой ишемии доказана также важная роль генетических факторов, таких как носительство определенных аллелей генов, кодирующих компоненты различных физиологических систем, в том числе связанных с воспалительным ответом, и влияющих на уровень белковых продуктов. Таким образом, ИИ в большинстве случаев представляет собой комплексное (мультифакториальное) полигенное заболевание и возникает в результате действия генетических факторов в сочетании с воздействиями внешней среды. Среди механизмов повреждения ткани мозга важную роль играют, как уже упоминалось выше, реакции воспаления. Известно, что одними из важнейших факторов воспаления являются цитокины. Было показано, что дисбаланс цитокинов и повреждающего локальная фактора воспалительная (травму, реакция ишемию, в ответ кровоизлияние) на действие приводит к повреждению нейронов, гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и нарушениям микроциркуляции. Исследования выявили дисбаланс цитокинового статуса, влияние иммунобиохимических процессов на тяжесть и клинический исход ИИ, а также неоднозначную роль при ИИ некоторых медиаторов воспаления [41, 52, 217]. Поэтому представляет интерес исследование факторов, приводящих к дисбалансу цитокинов и усилению воспалительной реакции при ИИ. 9 Поскольку уровень цитокинов и их функциональная активность во многом определяется генетическими факторами, в настоящей работе мы исследовали ассоциацию с ИИ полиморфизма генов, кодирующих цитокины IL6, TGFB1, IL4, TNF, IFNG и LTA. В работу были включены также гены, кодирующие антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов и фосфодиэстеразу 4D, – белки, для которых показана роль в развитии воспаления. Выявление связи между полиморфизмом того или иного конкретного гена с развитием ИИ может способствовать пониманию биологической природы заболевания и открыть новые возможности для его профилактики и лечения. Воспаление при ИИ развивается также вследствие усиления свертывающей способности крови [262,384]. Описано влияние цитокинов на синтез фибриногена, уровень которого является одной из важных составляющих развития артериального тромбоза и повышенного риска ИИ [141]. Известно, что связывание IL-6 со своим рецептором активирует транскрипционный фактор STAT3, который передает сигнал с рецептора IL-6 в ядро, где связывается с респонсивными элементами промоторных областей всех трех генов, кодирующих субъединицы фибриногена человека [115, 384]. Исходя из сказанного, представляло несомненный интерес оценить влияние полиморфизма гена IL6 на уровень фибриногена и агрегационную активность тромбоцитов в плазме крови. Степень разработанности темы. За последние годы было проведено немало исследований, посвященных поиску ассоциации различных полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ИИ для различных этносов. В частности, такие исследования были проведены для населения России. Для русских исследовали ассоциации полиморфизма генов ренин-ангиотензин- альдостероновой системы (РААС), системы гемостаза, липидного метаболизма и системы продукции оксида азота, с развитием ИИ [1, 9, 10, 30, 31, 38, 39]. Для якутской популяции были проведены исследования полиморфизма генов систем гемостаза, РААС, продукции оксида озота и липидного метаболизма, а также системы метаболизма гомоцистеина [25, 30, 294]. Эти исследования показали важность этнической гомогенности исследуемых групп больных и здоровых. Тем 10 не менее, вопрос о генетической предрасположенности к этому заболеванию далек от своего решения. Во многом это, вероятно, связано с тем, что при выявлении генов-кандидатов, влияющих на развитие ИИ, необходимо учитывать совместный вклад большого числа генов. Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является комплексный анализ возможной ассоциации носительства аллелей и генотипов однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) генов-кандидатов системы воспаления, а также их сочетаний, с развитием ИИ. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1. Провести геномное типирование выбранных на основе анализа литературы полиморфных участков генов-кандидатов (CTLA4, IL6, TGFB1, IL4, TNF, IFNG, LTA и PDE4D) для русских индивидов, перенесших ИИ, а также для индивидов без ИИ в анамнезе, совпадающих с больными по этнической принадлежности, полу и возрасту. 2. Провести анализ ассоциации аллелей и генотипов исследованных генов с развитием ИИ методом «случай-контроль» с использованием «стандартного» статистического анализа на основе точного критерия Фишера. 3. Оценить уровни фибриногена и показателей тромбоцитарного гемостаза в плазме крови в зависимости от носительства вариантов гена IL6. 4. Провести анализ ассоциации носительства сочетаний аллелей/генотипов («генетических ансамблей») исследованных генов с развитием ИИ с использованием программного обеспечения (ПО) APSampler. 5. Оценить гендерные и возрастные особенности ассоциации генетических маркеров с предрасположенностью к ИИ. Научная новизна работы. Впервые у этнических русских проведен комплексный анализ, с учетом пола и возраста рассматриваемых индивидов, связи носительства аллелей, генотипов и сочетаний аллелей и генотипов полиморфных участков генов CTLA4, IL6, TGFB1, IL4, TNF, IFNG, LTA и PDE4D с развитием ИИ. Впервые показана ассоциация с развитием ИИ носительства 11 аллелей/генотипов трех полиморфных участков поодиночке: −174G>C гена IL6, −509С>Т гена TGFB1 и 87C>T гена PDE4D. Показано, что ассоциации ИИ с аллелями/генотипами каждого из этих участков, выявленные при сравнении общих групп больных и контролей, наблюдаются при стратификации на две подгруппы по полу или по возрасту по крайней мере в одной из подгрупп, т.е. сохраняются на подвыборках общей выборки. Аллели или генотипы генов IL6, PDE4D и TGFB1 входят в состав ассоциированных с ИИ сочетаний, объединяясь как друг с другом, так и с аллелями других исследованных генов, из которых для IFNG и TNF тоже наблюдается воспроизведение результатов на подвыборках. Теоретическая и практическая значимость работы. Исследования последних лет показали, что данные о связи между полиморфизмом отдельного гена и развитием полигенного заболевания способствуют пониманию биологической природы последнего. Обнаруженные в работе ассоциации аллелей и генотипов генов IL6, PDE4D и TGFB1 и развитием ИИ, с высокой долей вероятности свидетельствуют об участии кодируемых ими медиаторов воспаления в формировании патогенетических событий на различных стадиях, предшествующих ишемии. Наблюдаемый кумулятивный эффект носительства вариантов этих и некоторых других генов системы воспаления отражает полигенную природу ИИ и позволяет предполагать аддитивность вклада рассмотренных генов в предрасположенность к этому заболеванию . Выявленные в работе одиночные аллели и генотипы, а также сочетания аллелей и генотипов, могут служить маркерами для оценки индивидуального риска развития ИИ у этнических русских. Обнаружение подобных маркеров может послужить основой в поиске новых мишеней для превентивной терапии, компенсирующей генетически обусловленные неблагоприятные особенности функционирования системы воспаления для тех лиц, у которых выявлена наследственная предрасположенность к ИИ. Методология и методы исследования. Работа основана на сравнении частот аллелей и генотипов 11 полиморфных вариантов 8 генов-кандидатов в норме и при ИИ. Для анализа вариантов генома использовали различные 12 современные методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в реальном времени. Для выявления значимой связи с ИИ носительства сочетаний аллелей и/или генотипов применяли оригинальное программное обеспечение APSampler (http://code.google.com/p/apsampler/), использующее метод МонтеКарло Марковскими цепями и Байесовскую непараметрическую статистику Положения, выносимые на защиту: 1. Наиболее значимый вклад в развитие ИИ у этнических русских вносят аллели или генотипы генов IL6, PDE4D и TGFB1. 2. Ассоциированные с ИИ сочетания представляют собой составные генетические маркеры ИИ как полигенного заболевания, в которых аллели генов IL6, PDE4D и TGFB1 присутствуют попарно и/или совместно с аллелями других исследованных генов, а именно генов IFNG, CTLA4, IL4 и TNF, носительство которых в одиночку не было значимо ассоциировано с ИИ. 3. Распределение в составе сочетаний аллелей/генотипов, выявленное в общей группе, в целом сохраняется при разделении выборок больных ИИ и контрольной группы на мужчин и женщин, тогда как между подгруппами с ранним (не старше 60 лет) и более поздним ИИ наблюдаются существенные различия. 3. Анализ ассоциации носительства аллелей и генотипов полиморфного участка – 174G>C гена IL6 с уровнями фибриногена и показателями тромбоцитарного гемостаза в плазме крови показал, что выявленный вклад гена IL6 в развитие ИИ, по-видимому, не определяется влиянием его полиморфизма на синтез фибриногена. Достоверность результатов. Результаты получены современными биохимическими и молекулярно-генетическими методами. Основные выводы работы и выносимые на защиту положения являются обоснованными и полностью соответствуют полученным результатам. Достоверность выводов подтверждается корректной статистической 13 обработкой данных. 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Ишемический инсульт как комплексное полигенное заболевание ИИ 1.1. Этиопатогенез ишемического инсульта и факторы риска относится к острым нарушениям мозгового кровообращения, характеризуется стойкими менингеальными, общемозговыми и очаговыми симптомами или их сочетанием вследствие прекращения или значительного уменьшения кровоснабжения участка мозга – локальной ишемии. Определенная последовательность молекулярно-биохимических изменений в веществе мозга, вызываемая острой фокальной ишемией мозга, способна привести к тканевым нарушениям, в результате которых происходит гибель клеток (инфаркт мозга). Изменения в мозге могут носить обратимый или необратимый характер. Степень обратимости тканевых изменений на каждом этапе патологического процесса определяется уровнем снижения мозгового кровотока и его продолжительностью в сочетании с факторами, определяющими чувствительность мозга к гипоксическому повреждению. Термином «ядро инфаркта» обозначают зону необратимого повреждения, термином «ишемическая полутень» (пенумбра) — зону ишемического поражения обратимого характера. Продолжительность существования пенумбры — важнейший фактор, так как со временем обратимые изменения принимают необратимый характер [112]. К ИИ могут приводить различные патофизиологические механизмы, но наиболее часто его причиной становятся атеросклероз крупных сосудов (дуга аорты, магистральные артерии головы, мозговые артерии), расслоение (диссекция) сонной и реже позвоночной артерий, закупорка мозговых сосудов тромбом или эмболом, образующимися в сердце и попадающими в сосуды мозга с током крови при различных заболеваниях (ревматизм, эндокардиты, ишемическая болезнь сердца и др.). В последние десятилетия было проведено большое количество исследований, показавших, что в большинстве случаев ИИ представляет собой мультифакториальное (комплексное) заболевание, т.е. развивается в результате 14 многочисленных взаимодействий между генетическими факторами и факторами окружающей среды. Факторы риска, ассоциированные с повышенной частотой развития ишемического инсульта, можно разделить на модифицируемые и немодифицируемые. К модифицируемым факторам риска ИИ относятся: 1.Артериальная гипертензия. Артериальная гипертензия является ведущим модифицируемым фактором риска развития ИИ. По сравнению с лицами, имеющими артериальное давление (АД) ниже 140/90 мм рт. ст., у больных с АД свыше 160/95 мм рт. ст. риск развития инсульта возрастает в 4 раза, а при АД более 200/115 мм рт. ст. – в 10 раз. Увеличение систолического АД на 10 мм рт. ст. приводит к увеличению риска развития ИИ в 1.9 раз у мужчин и в 1.7 раз у женщин [43, 381]. Следует отметить, что наблюдаются этнические различия в распространении АГ. Среди населения, проживающего на севере Европы и в странах Северной Америки, наблюдается более высокая распространенность АГ по сравнению с населением стран бассейна Средиземного моря и Японии. Выделяют возникновения несколько ИИ, основных среди механизмов которых следует влияния отметить АГ на риск усугубление атеротромботического поражения артерий крупного калибра, дестабилизацию атеросклеротических гипертонической (формирование бляшек и возникновение микроангиопатии, аневризм). эмболов, истончение Перечисленные нарушения формирование сосудистой часто стенки развиваются параллельно. Кроме того, важной проблемой является влияние повышенного АД на морфофункциональное состояние головного мозга. Важно отметить, что опасность развития цереброваскулярных нарушений может зависеть не только от уровня АД, но и от продолжительности течения АГ. Длительное наличие АГ запускает основные механизмы развития хронического патологического (нейродегенеративного) процесса в ткани головного мозга: хроническое воспаление, изменение проницаемости ГЭБ и аутоиммунизацию 15 организма собственными нейроспецифическими белками с последующим вторичным аутоиммунным повреждением головного мозга, оксидантный стресс и апоптоз [188]. Одним из наиболее эффективных путей снижения риска развития инсульта является контроль АГ. Исследования показывают, что адекватное систематическое лечение АГ приводит к снижению частоты заболеваемости и смертности от инсульта на 36 – 40% [188, 310]. 2. Атеросклероз. Среди модифицируемых факторов риска ИИ важная роль принадлежит атеросклерозу [26, 53. 216, 226].Установлено, что 70% всех случаев ИИ связаны с атеросклерозом. Начальным событием в атерогенезе является эндотелиальная дисфункция. В результате потери эндотелием однородности и упорядоченности эндотелиальные клетки секретируют в интиму набор цитокинов (IL-6, IL-1, TNF), которые активируют макрофаги интимы. Активированные макрофаги в свою очередь секретируют цитокины, приводящие к дальнейшей активации эндотелия, что вызывает усиление проницаемости сосудистой стенки для атерогенных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) [318].Накапливаясь в стенке сосуда, ЛПНП окисляются и фагоцитируются макрофагами, в результате чего образуются так называемые пенистые клетки [153]. Окисленные ЛПНП приводят к повышению синтеза молекул адгезии на эндотелии и способствуют трансмиграции моноцитов в атероматозные участки сосудистой стенки [318]. Помимо широкого спектра цитокинов, активированные макрофаги вырабатывают факторы роста, прокоагулянтные субстанции, большое количество разнообразных биологически активных липидов, а также фосфолипазу А2, которая активирует ферменты циклооксигеназу и липоксигеназу, тем самым способствуя выработке простагландина Е2 и лейкотриенов, обладающих мощным провоспалительным действием [362]. При развитии атеросклеротической бляшки в стенке сосуда характерно накопление холестерина (холестерол, ХС), связанного с липопротеинами низкой и очень низкой плотности [158, 352 366]. Однако на данный момент связь 16 повышенного уровня ХС с развитием инсульта остается не до конца выясненной. Была обнаружена корреляция между высоким уровнем ХС в сыворотке и смертностью от ИИ у мужчин [43], однако в других исследованиях отмечалась лишь тенденция к повышению риска развития ИИ при гиперхолестерин- и гипертриглицеридемии [81, 224]. Тем не менее, установлено, что гиперлипидемия отрицательно влияет на все звенья центральной и периферической гемодинамики, а также на микроциркуляцию и транскапиллярный обмен, а, следовательно, усугубляет течение атеросклероза [35, 328]. Дополнительным фактором, повышающим риск развития ИИ при атеросклеротическом поражении сосудов, является нарушение в системе свертывания крови. Показано, что одновременное наличие атеросклеротических повреждений, особенно при повреждения капсулы атеросклеротической бляшки, и нарушения в системе свертывания (гиперфибриногенемия, гомоцистинурия и повышенный уровень антиактиватора плазминогена 1) синергически влияют на риск возникновения ИИ [240]. 3. Сахарный диабет. Одним из самых значимых факторов риска инсульта является сахарный диабет, который может увеличивать риск развития инсульта в 2-3 раза независимо от других факторов риска [297, 393]. Показано, что сахарный диабет оказывает различное влияние на риск развития инсульта у мужчин и женщин. У женщин, страдающих сахарным диабетом, риск инсульта в 2 раза выше, чем у мужчин с сахарным диабетом. У этих женщин также наблюдается более высокий риск смерти от инсульта, чем у женщин, не страдающих диабетом [373]. В развитии цереброваскулярных нарушений при диабете главную роль играет патология магистральных артерий головы: сонных и позвоночных артерий. У лиц, страдающих диабетом, стенки сонных артерий утолщены вследствие развития атеросклероза. Показано, что инсулинорезистентность ассоциирована c выраженным атеросклерозом сонных артерий, причем независимо от уровня глюкозы и инсулина в крови [329, 395]. 17 Диабет оказывает прямое влияние на развитие атеросклероза сосудов как крупного, так и мелкого калибра. У женщин, страдающих диабетом, было показано значительное увеличение риска инсульта вследствие окклюзии крупных сосудов [307]. Диффузные изменения стенок мелких сосудов, склероз или гиалиноз стенок, значительно суживающие просвет сосудов, способствуют развитию лакунарного инсульта, а изменения в системах липидного обмена и гемостаза, сопровождающие диабет, могут приводить к атеротромботическим инсультам. Влияние этих процессов наблюдается в равной степени у мужчин и женщин [144, 200, 307, 370]. 4. Мерцательная аритмия. Мерцательная аритмия (МА) является наиболее частой причиной кардиогенной мозговой эмболии, приводящей к развитию ИИ. МА повышает риск возникновения инсульта в 3.6 раза, причем риск эмболии особенно высок в первые месяцы после начала постоянной МА [362]. Около 25% ИИ при мерцательной аритмии имеют атеротромботическую природу и сочетаются с атеросклерозом сосудов головного мозга или дуги аорты [23]. Наличие МА приводит к расширению полости левого предсердия, нарушению его сократительной функции, а отсутствие полноценной систолы предсердий и пассивное опорожнение ушка левого предсердия за счет сокращения прилежащей стенки левого желудочка приводят к замедлению кровотока в ушке левого предсердия, что способствует тромбообразованию. Основной причиной тромбообразования при МА считается активация каскадов коагуляции вследствие стагнации крови в левом предсердии с образованием красных тромбов. Факторами, ассоциированными с повышенным риском тромбоэмболии при неклапанной МА, считают возраст, левопредсердный тромб, дилатацию левого предсердия, увеличение левого желудочка, предшествующий ИМ, высокое АД. Присутствие одного из клинических факторов риска эмболии с каждым годом увеличивает риск инсульта у пациента до 7%, а наличие двух и более – до 17.6% [3, 5]. 18 5. Курение. Известно, что курение, наряду с другими факторами риска, играет существенную роль в развитии ИИ. При курении наблюдается уменьшение просвета, а также ослабление стенки сосудов головного мозга. Кроме того, у курильщиков часто наблюдается повышение АД и развитие атеросклероза сосудов головного мозга. Среди механизмов, посредством которых курение оказывает влияние на развитие атеросклеротического процесса, особое значение имеют: повреждение эндотелия сосудов, инфильтрация его липидами, усиление клеточной пролиферации, выделение катехоламинов и вазопрессина [50, 67, 296]. Эти процессы приводят к нарушению кровоснабжения головного мозга, что способствует развитию его функциональных нарушений. Наблюдается зависимость степени риска инсульта от интенсивности и длительности курения: отмечено двукратное увеличение риска развития инсульта у заядлых курильщиков (более 40 сигарет в день) по сравнению с мало курящими индивидами (менее 10 сигарет) [73]. У курильщиков в целом даже при наличии в анаменезе сниженного АД отмечается более раннее развитие ИИ по сравнению с некурящими индивидами. При этом на риск развития ИИ оказывает влияние как активное, так и пассивное курение [102, 168]. Следует отметить, что бόльшую роль в развитии ИИ у курильщиков играет не кардиоэмболия, а окклюзия мелких и атеросклеротические поражения крупных сосудов. Выдвинута гипотеза, что у курильщиков медленное прогрессирующее снижение кровоснабжения и, как следствие, недостаток кислорода в тканях по причине атеросклероза могут «приучить» мозг к ишемии и снизить ущерб в случае резкой ишемии, вызванной внезапным тромбозом сосуда [61, 351]. Поэтому при курении окклюзия мелких сосудов может снижать риск кардиоэмболических инсультов и в то же время являться прогностическим маркером тяжести течения ИИ [391]. Таким образом, наличие таких признаков метаболического синдрома как нарушения углеводного и липидного обмена, АГ и уменьшение просвета сосуда являются основным патогенетическим условием возникновения локальной 19 ишемии мозга, с последующим необратимым повреждением нервной ткани по механизмам некроза и апоптоза. Среди немодифицируемых факторов риска основную роль играют: 1. Возраст. В 60% случаев инсульт развивается у лиц в возрасте старше 60 лет. По данным ряда исследований, частота новых случаев инсульта увеличивается более чем в два раза в каждой следующей возрастной группе населения, отличающейся всего на 10 лет [27, 35, 194]. Следует отметить, что в последние годы происходит «омоложение» мозгового инсульта: так, наблюдается значительное увеличение распространенности инсульта в возрасте от 40 до 60 лет, причем в разных климато-географических регионах [35] Почти повсеместно выявляется тенденция к увеличению числа лиц с инсультом и преходящими нарушениями мозгового кровообращения в возрасте до 45 лет, как у мужчин, так и у женщин [21, 374]. По данным [21, 374], cреди пациентов с диагнозом ИИ 20% составляют люди в возрасте 41-50 лет и 12-14% − люди моложе 40 лет. 2. Пол В большинстве возрастных групп инсульт чаще развивается у мужчин, чем у женщин [22, 27, 310, 367]. При этом инсульты у женщин развиваются в среднем на 10-20 лет позднее, чем у мужчин [13]. Однако суммарное число женщин, умерших от инсульта, оказывается бόльшим [35]. 3. Этническая принадлежность. Риск развития инсульта зависит от этнической принадлежности. Действительно, частота инсульта различна у разных рас и в разных этнических группах [79, 327]. Среди европеоидов зарегистрированый уровень заболеваемости инсультом в Испании ниже, чем в Германии и Норвегии [48, 49]. Известно, что представители монголоидной расы, особенно китайцы и японцы, более подвержены инсульту, чем представители европеоидной расы, а у индивидов негроидной расы смертность от инсульта вдвое выше, чем у европеоидов [79,199, 279]. В исследовании, проведенном на популяции американских индейцев, было 20 показано, что у них риск инсульта в возрасте после 66.5 лет значительно выше, чем у чернокожих и белых американцев в той же возрастной группе [411]. 4. Семейный анамнез Наличие инсульта в анамнезе у кого-либо из родителей увеличивает риск его развития у потомков. Если пациент в возрасте до 65 лет имел в истории болезни инсульт, риск инсульта у его потомства увеличивается в 2.79 раза (95% ДИ, 1.68- 4.66, р<0.001). Если же пациент в возрасте до 65 лет имел в истории болезни ИИ, то риск ИИ у потомства увеличивается в 3 раза (95% ДИ 1.69-5.88, р<0.001) [337]. Эти данные однозначно свидетельствуют о наличии наследственной предрасположенности к ИИ и значении генетических факторов. Влияние генетических факторов на риск развития ИИ подтверждается с помощью генеалогического, близнецового и популяционного методов. Наиболее объективным и чувствительным является близнецовый метод, при котором проводят сравнение конкордантности моно- и дизиготных близнецов или сравнение конкордантности выросших вместе или порознь монозиготных близнецов. В результате близнецовых исследований показано, что инсульт у обоих (или более) монозиготных близнецов встречается чаще по сравнению с дизиготными близнецами [131]. Анализ литературных источников, посвященных факторам риска ИИ, свидетельствует, что некоторые исследователи рассматривают совокупный вклад в развитие заболевания всего комплекса факторов, в то время как другие исследователи указывают на независимое действие некоторых из них. Тем не менее, между многими факторами риска ИИ существует взаимное влияние, поэтому их сочетание приводит к более значительному увеличению вероятности заболевания, чем простое арифметическое сложение их отдельных вероятностей [29]. Поэтому при анализе предрасположенности к ИИ очень важно учитывать именно сочетанное действие различных факторов риска, включая генетические, географические и этнические. 21 1.2. Значение генетических факторов для развития ИИ В последние десятилетия было проведено большое количество исследований, посвященных молекулярно-генетическому анализу факторов риска ИИ в различных популяциях [24, 25, 31, 71, 149, 252, 266]. В ходе исследований было выявлено, что генетическая природа ИИ может быть различной. Выделяют моногенные и полигенные формы ИИ. Наиболее ярко роль генетики в развитии ИИ проявляется при моногенных формах заболевания. Хотя в совокупности на их долю приходится менее 1% от всех случаев ИИ, необходимо четко дифференцировать их от полигенных форм заболевания. Это важно как для своевременной профилактики, адекватного лечения и максимально эффективной реабилитации пациента, так и для правильной оценки риска развития повторного инсульта и дальнейшего прогноза [134, 162, 305, 369]. Этническая принадлежность играет важную роль при проведении генетических исследований, поскольку установлено, что в разных популяциях может различаться представленность того или иного аллеля (в том числе мутации), связанного с развитием заболевания. Таким образом, для проведения подобных исследований очень важен выбор этнически гомогенных популяций. 1.2.1. Моногенные формы ИИ Моногенные нарушения, обуславливающие ИИ, наследуются по классическому менделевскому типу как рецессивные, аутосомно-доминантные или сцепленные с X-хромосомой признаки (таблица 1). Большинство из представленных в таблице 1 наследственных моногенных заболеваний могут служить частью системного поражения; для некоторых из них инсульт является лишь одним из клинических проявлений, как, например, при болезни Фабри, серповидноклеточной анемии, гомоцистинурии, митохондриальном синдроме MELAS. В других случаях инсульт может являться основным проявлением моногенных заболеваний, таких как CADASIL (церебральная аутосомнодоминантная артериопатия с субкортикальными инфарктами и лейкоэнцефалопатией), болезнь Мойя-Мойя и др. Характерными особенностями моногенных форм инсульта являются низкая частота встречаемости. 22 Таблица Error! Reference source not found.. Моногенные заболевания, приводящие к инсульту (по данным [110, 252, 309]) Заболевание Семейные кардиомиопатии Семейные дислипидемии Тип наследования Вовлеченный ген не установлен (возможно, Различные сцеплен с Х-хромосомой) аутосомно-доминантный или аутосомно- рецессивный Различные CADASIL аутосомно-доминантный NOTCH3 CARASIL аутосомно-рецессивный HTRA1 Болезнь Фабри сцепленный с X-хромосомой GAL Синдром Марфана аутосомно-доминантный FBN1 аутосомно-доминантный COL3A1 аутосомно-доминантный TREX1 аутосомно-рецессивный ABCC6 аутосомно-рецессивный MTHFR Синдром Элерса-Данлоса, тип IV Аутосомно-доминантная васкулопатия сетчатки Эластическая псевдоксантома Гомоцистинурия MTTL1 MELAS по материнской линии в митохондриальной ДНК Серповидно-клеточная анемия аутосомно-рецессивный HBB Данные таблицы 1 показывают, насколько широк спектр мутаций и заболеваний, которые могут приводить к сходным проявлениям, в частности, к развитию инсульта. Моногенные заболевания, приводящие к инсульту, как правило, проявляются у лиц молодого возраста и в основном в форме лакунарного 23 (микроциркуляторного) и атеротромботического, поражающего сосуды крупного калибра, инсультов. Диагностика моногенных форм ИИ наиболее актуальна у лиц молодого и среднего возраста без признаков атеросклероза и артериальной гипертензии, особенно при наличии указаний на развитие ИИ у родственников молодого возраста. 1.2.2. Полигенные формы ИИ Наиболее значимыми и распространенными на популяционном уровне являются полигенные формы ИИ, которые не подчиняются законам Менделя, как это имеет место при моногенных формах, и имеют сложный характер наследования [82]. Влияние каждого патофизиологический вовлеченного процесс может локуса на обуславливать конкретный незначительный относительный риск и вносить небольшой вклад в развитие заболевания. Варианты аллелей могут оказывать влияние на чувствительность к другим факторам риска, формирование предрасположенности индивида к конкретным подтипам ИИ, а также воздействовать на опосредующие факторы или оказывать непосредственный эффект на риск развития ИИ [130, 287]. Различные гены могут оказывать влияние на эффекты друг друга или взаимодействовать с провоцирующими развитие заболевания внешними факторами, приводя на популяционном уровне к различной пенетрантности конкретного аллеля [162]. Исходя из этого, в случае такого полигенного заболевания, как инсульт, выявление генетических детерминант является сложной задачей. В силу этих причин некоторые исследователи изучают генетическую предрасположенность не к самому ИИ как окончательному проявлению заболевания, а к его возможным промежуточным стадиям, таким, например, как утолщение стенок каротидных артерий и гипертинтенсивные очаги в белом веществе головного мозга, которые могут предшествовать развитию заболевания [135, 319]. К промежуточным стадиям ИИ некоторые авторы относят также артериальную гипертензию и атеросклероз магистральных артерий, ранее 24 упомянутые нами как модифицируемые факторы риска заболевания [128, 129, 131]. Такой подход имеет ряд преимуществ: во-первых, подобные состояния представляют собой промежуточные стадии в патогенезе ИИ и поэтому могут быть обусловлены полимрфизмом меньшего количества генов; во-вторых, эти состояния легко поддаются выявлению и точной оценке; в-третьих, являясь количественными признаками, они позволяют применять более мощные способы статистического анализа. Кроме того, при исследовании методом "случайконтроль" акцент на промежуточных фенотипах позволяет в значительной степени избежать недостатков при формировании контрольной группы, связанных с включением в нее недостаточно обследованных индивидов. Действительно, включение в контрольную группу индивидов по принципу отсутствия проявлений нарушений мозгового кровообращения в анамнезе не гарантирует, что у этих лиц они не появятся в короткие сроки после включения в исследование [110]. 1.2.3. Экспериментальные модели для изучения генетики ИИ Так как ИИ представляет собой сложное комплексное полигенное заболевание, возникает ряд серьезных трудностей для идентификации генов, определяющих риск его развития. Генетические исследования на животных моделях ИИ позволяют контролировать влияние факторов внешней среды на объект. Наиболее широко используются в качестве модели ИИ склонные к возникновению инсульта спонтанно-гипертензивные крысы (spontaneously hypertensive stroke-prone rats, SHRSP). Данная модель была разработана в 1974 г. в Японии Okamoto et al. [406] и показала сходство патогенетических механизмов развития инсульта у SHRSP и человека. В результате полногеномного поиска, проведённого на F2-гибридах SHRSP и инсульт-резистентных спонтанногипертензивных крыс (SHRSR), выявили так называемые локусы количественных признаков (quantitative trait locus, QTL), связанные с количественными показателями фенотипических признаков, использующихся для оценки риска 25 возникновения инсульта, например, с уровнем артериального давления. Установлено, что QTL на 1-ой хромосоме локализован вблизи гена, кодирующего адреномедуллин, а на 5-ой – рядом с генами предсердного и мозгового натрийуретических факторов (ANP и BNP, соответственно). В дальнейших работах вклад полиморфных участков гена ANP в риск развития инсульта был подтвержден у F2-гибридов, для других указанных генов подобных данных получено не было [323]. В исследованиях на F2-гибридах SHRSP и нормотензивных крысах линии Wistar-Kyoto [184, 191] были идентифицированы QTL на 4-ой и 5-ой хромосомах. Главной проблемой подобного моделирования заболеваний человека на животных остается соотнесение выявленных у животных локусов с соответствующими участками генома человека. Успех был достигнут только в соотнесении QTL на 5-ой хромосоме крысы с областью хромосомы человека 1p35-36. В этой области расположены гены, кодирующие ANP и метилентетрагидрофолатредуктазу (MTHFR). Безусловно, эти исследования помогли в понимании механизма развития ИИ, а также в определении генов-кандидатов для генетических исследований у людей. 1.3. Поиск генов, определяющих предрасположенность к полигенным формам ИИ До начала 2000-х годов для идентификации генов, определяющих предрасположенность к инсульту как комплексному заболеванию, использовали два основных подхода: метод «ген-кандидат» (функциональное картирование) и полный геномный поиск (позиционное картирование, сканирование), основанный на анализе сцепления с анонимными генетическими маркерами с известной хромосомной локализацией, распределенными по геному. При наиболее распространенном подходе «ген-кандидат» предположение о возможном участии гена выдвигается исходя из участия его белкового продукта в этиопатогенезе заболевания (путь от фенотипа к гену). Далее проводится анализ его ассоциации (реже – сцепления) с заболеванием. Об ассоциации судят исходя 26 из сравнения частот аллелей гена или генетического маркера в группах больных и здоровых индивидов из одной популяции. При обнаружении статистически значимых различий данный генетический маркер считается ассоциированным с болезнью. Однако, исследователи не должны упускать из рассмотрения возможность, что наряду с прямой связью между исследованным локусом и наследственной патологией в основе ассоциации может лежать неравновесие по сцеплению между маркерным локусом и локусом болезни, если эти локусы расположены достаточно близко друг от друга [134]. При полном геномном поиске, основанном на анализе сцепления с анонимными генетическими вовлеченных в развитие маркерами, заболевания, после проводят локализации в них областей, поиск генов, ассоциированных с заболеванием (путь от генома к гену). Анализ сцепления проводится в семьях с несколькими пораженными членами и основан на наблюдении, что тот или иной полиморфный вариант (аллель или гаплотип) участка ДНК, связанного с заболеванием, встречается у пораженных заболеванием членов семьи с более высокой вероятностью, чем случайная. В отличие от ассоциации, сцепление прямо доказывает роль гена (маркера) в предрасположенности к заболеванию, однако этот метод является менее чувствительным. Выявляемые в результате анализа сцепления вовлеченные участки достаточно протяженны и могут включать сотни различных генов, а сила сцепления может быть недостаточной в случае, когда генетические варианты оказывают незначительный эффект или когда они часто встречаются в популяции. Данный анализ эффективен для моногенных нарушений, приводящих к инсульту и наследующихся по классическому менделевскому типу (например, в случае CADASIL). Что касается выявления участков, вовлеченных в формирование предрасположенности к полигенному инсульту, то, в дополнение к приведенным выше недостаткам, часто не представляется возможным проводить семейные исследования с привлечением родственников и трудно составлять выборки семей с несколькими пораженными индивидами [265, 397]. Другие проблемы при использовании данного подхода связаны с обусловленной различиями в 27 этиологии и патогенезе клинической гетерогенностью (гетерогенность фенотипов) заболевания, а также с генетической гетерогенностью, когда один и тот же фенотип заболевания может возникать в результате мутаций в различных генах. В результате полногеномного поиска, основанного на анализе сцепления, было обнаружено два локуса, участвующих в формировании восприимчивости к инсульту, один из них, картированный на хромосоме 5q12 у человека, называется STRK1. Дальнейший анализ выявил ассоциацию полиморфных участков этого локуса с инсультом, причем наибольший вклад вносили аллели и гаплотипы полиморфных участков в гене, кодирующем фосфодиэстеразу 4D (PDE4D) [70, 149, 350]. Предполагается, что PDE4D играет важную роль в патогенезе инсульта за счет участия в воспалении, формировании физиологического ответа на повреждение сосудов и ангиогенезе. Другой обнаруженный локус расположен на хромосоме 13q12-13. В этом участке находится ген ALOX5AP, который кодирует белок, активирующий 5липоксигеназу (ALOX5AP). Этот фермент участвует в лейкотриеновом пути и может быть вовлечен в развитие инсульта за счет активации воспалительных процессов и/или через увеличение проницаемости сосудов и ускорения развития атеросклероза [166]. Известно, что экспрессия участников данного пути, таких как ALOX5AP и его мишени – 5-липоксигеназы (ALOX5), увеличивается в атеросклеротических бляшках на различных стадиях их развития [166]. В то же время, данные об ассоциации полиморфизмов гена ALOX5AP с риском развития острого инсульта противоречивы. В исследовании Helgadottir et al. [166, 239] были выявлены полиморфные варианты гена ALOX5AP, которые ассоциированы с повышенным риском развития инсульта. В другом исследовании на выборке из Центральной Европы также была обнаружена ассоциация гена ALOX5AP с ИИ [239]. Однако, в двух последующих исследованиях, проведенных в США на популяции европейского происхождения, не удалось подтвердить эти данные [264, 410]. Исследование на русской популяции также не выявило достоверных 28 ассоциаций между однонуклеотидными полиморфизмами в гене ALOX5AP и острым инсультом [9]. Подход «ген-кандидат» имеет бóльшую статистическую мощность в сравнении с анализом сцепления, так как наследование выявляемых аллелей рассматривается на уровне популяции, и нет необходимости составлять большие семейные выборки. Однако, он требует предварительного целевого выбора анализируемых генов-кандидатов, а также дополнительных доказательств того, что наблюдаемые различия частот аллелей между больными и здоровыми индивидами не являются случайными, а действительно обусловлены ассоциацией с заболеванием. При данном подходе проводится анализ распределения у больных и здоровых таких полиморфных вариантов генома, как однонуклеотидные замены (single nucleotide polymorphisms, или SNP), инсерционно-делеционные мутации, вариации числа копий отдельных участков генома (размером от 1 000 п.н. и более) (copy number variation, CNV), тандемные повторы различной длины (минии микросателлиты). Крайне важен правильный выбор функционально значимого полиморфного участка исследуемого гена, что в большинстве случаев представляет определенные сложности. Гены, принимающие участие в развитии ИИ, можно разделить на основе их функциональной связи с патофизиологией ИИ и отнести к пяти основным группам по названию систем, компоненты которых данные гены кодируют. Это гены системы липидного и гомоцистеинового метаболизма, гемостаза, продукции оксида азота, ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) и воспаления. 1.3.1. Гены системы липидного метаболизма Большое значение в этиологии ИИ могут играть гены системы липидного метаболизма, поскольку патологические изменения в регуляции липидного профиля плазмы крови являются ключевым моментом в развитии атеросклероза и таким образом лежат в основе большинства случаев инсульта. В качестве одних из главных генов-кандидатов рассматривают гены Аполипопротеин Е (АроЕ) представляет собой гликопротеид, играющий существенную роль в процессах активации некоторых липолитических ферментов 29 (липазы печени, липазы липопротеинов и лецитин-холестерин ацилтрансферазы) и в регуляции распределения и транспорта холестерина от глиальных клеток мозга до нейронов. Выявлен двадцать один полиморфный участок в гене APOE, в том числе мультиаллельный локус в 4-ом экзоне (полиморфизм эпсилон-apoE), который определяется сочетанием двух однонуклеотидных замен в положениях 3937T>C и 4075C>T внутри четвертого экзона гена [85]. Аллели эпсилонполиморфизма называются эпсилон-2 (2), эпсилон-3 (3) и эпсилон-4 (4) и кодируют три изоформы белка АроЕ (Е2, Е3 и Е4). Данные изоформы различаются аминокислотными остатками в положениях Cys112Arg и Arg158Cys, находящимися в участке связывания apoE с соответствующими рецепторами. Аллель ε3 кодирует нормальную изоформу белка, для которой в европейской популяции не было выявлено ассоциации с повышенным риском развития сердечно-сосудистых заболеваний. Частота аллеля ε3 в Европейской популяции составляет 70-80% [292]. Наличие в геноме человека аллель АPOЕ ε2 связан со сниженными уровнями холестерина, триглицеридов и бета-липополипротеинов в сыворотке крови [104, 246], что может приводить к снижению атеросклеротических изменений и возникновения ИИ. риска развития Действительно, в популяции европеоидов показано протективное действие аллеля ε2 при формировании предрасположенности к ИИ, однако, у представителей монголоидной популяции, по данным [125 , 208], он ассоциирован с ИИ. Носительство аллеля ε4 ассоциировано с повышенным уровнем триглицеридов и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) [87, 345]. Однако, в европейской популяции вовлеченность данного аллеля в предрасположенность к ИИ остается спорной. Несмотря на наблюдавшуюся ассоциацию аллеля ε4 с повышенным уровнем холестерина, ЛПНП и риском сердечно-сосудистых заболеваний и ИИ [63, 66, 353], в результате последующих исследований не было выявлено явной связи между аллелем и инсультом, хотяи была показана роль повышенной концентрации холестерина в плазме как фактора риска инсульта [346]. Более того, выявлена ассоциация между уровнем ApoE и смертностью в 30 пожилом возрасте от сердечно-сосудистых заболеваний независимо от генотипа индивида и уровня липидов в плазме [271, 380]. В то же время, исследования в китайской популяции продемонстрировали потенциальную ассоциацию полимрфизма APOE ε2/ε3/ε4 с риском ИИ и артериальной гипертензией [74]. Среди работ, посвященных поиску связи гена АРОЕ с риском развития ИИ, представляют интерес исследования двух полиморфных областей этого гена: участков биаллельного полиморфизма –491А>Т и –472T>С в промоторной области, влияющих на уровень продукции белка. Согласно исследованию [294], у больных ИИ мужчин-якутов была выявлена достоверно меньшая частота аллеля АРОЕ*–427С и генотипа АРОЕ*–427Т/С, оказывающих протективное действие, и достоверно большая частота аллеля АРОЕ*–427Т и генотипа АРОЕ*–427Т/Т, предрасполагающих к развитию ИИ. Для атеротромботического типа инсульта сохранялись все перечисленные выше ассоциации, а также была выявлена ассоциация с риском развития ИИ полиморфного участка –491А>Т, что может свидетельствовать о генетических различиях между атеротромботической и другими формами инфаркта мозга [294]. У русских больных ИИ в возрастной группе до 60 лет аллель АРОЕ*–427Т также оказался ассоциированным с риском развития заболевания [31]. Другим ключевым ферментом метаболизма липидов является липопротеинлипаза (LPL). Она играет важную роль в формировании липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), гидролизе триглицеридов плазмы до диглицеридов и участвует во взаимодействии липопротеинов с клеточными рецепторами [273]. В гене LPL выявлено несколько полиморфных участков, причем аллели некоторых из них критичны для ферментативной активности. Полиморфизм 495T>G располагается в восьмом интроне гена LPL и ассоциирован с повышением концентрации триглицеридов, участвующих в процессе атерогенеза и повышающих риск развития инсульта. При исследовании якутской популяции у женщин была выявлена позитивная ассоциация аллеля LPL*495G полиморфизма 495T>G и негативная ассоциация аллеля LPL*495T с риском развития инсульта [294]. 31 Наибольшее значение придается однонуклеотидному полиморфизму 1595С>G, который расположен в 9-ом экзоне LPL. В случае аллеля LPL*1595G происходит замена кодона 447Ser на стоп-кодон, вследствие чего LPL становится короче на две С-концевые аминокислоты: серин и глицин. При укороченном LPL увеличивается уровень липопротеинов высокой плотности, что может привести к ослаблению процессов атерогенеза. Была показана негативная ассоциация аллеля LPL*1595G данного полиморфного участка с ИИ [278, 343, 401, 415]. 1.3.2. Ген eNOS системы продукции оксида азота Исследования системы продукции оксида азота (NO) свидетельствуют о важной роли эндотелиальной синтазы NO, кодируемой геном eNOS (или NOS), в развитии повышенной чувствительности мозга к ишемии и в формировании очага повреждения при развитии инсульта. Оксид азота оказывает влияние на тонус, целостность, рост и тромбогенные свойства кровеносных сосудов, играет важную роль в развитии артериальной гипертензии. В результате снижения мозгового кровотока и дефицита кислорода в митохондриях снижается скорость аэробного окисления, что приводит к снижению соотношения АТФ/АДФ+АМФ и активации фосфофруктокиназы (ФФК) и как следствие к активации анаэробного гликолитического пути. Гликолиз в анаэробных условиях ведёт к образованию молочной кислоты (лактата). Усиленное освобождение лактата при гипоксии, в условиях недостаточного кровообращения, приводит к метаболическому лактатацидозу и дефициту АТФ; а дефицит энергии в свою очередь – к нарушению калийнатриевого градиента. В результате клетки утрачивают ионы калия, а вне клеток возникает его избыток. Важнейшим из прямых последствий повреждения калийнатриевого насоса является проникновение в клетку избытка натрия, стимулирующего гипергидратацию и церебральный отек. Затем происходит выброс глутамата с развитием глутаматной "эксайтотоксичности". Возбуждение глутаматных NMDA-рецепторов активирует Са2+-каналы, что приводит к усилению поступления внеклеточного кальция в клетку и высвобождению внутриклеточного кальция из депо, что активизирует различные ферментные 32 системы. Образующиеся при этом продукты перекисного окисления липидов тормозят активность натрий/калиевой аминотрансферазной ферментной системы, усугубляя изменения энергозависимого ионного транспорта, а также ингибируют фермент глутаминсинтетазу в астроглии, нарушая метаболизм глутамата и способствуя его накоплению в синаптической щели. Все эти процессы приводят к быстрому входу ионов кальция и натрия в нейрон, что усугубляет все реакции глутамат-кальциевого каскада, а также обусловливает активацию NO-синтазы и тем самым к избыточной продукции радикала NO-. В результате создаются условия для образования пероксинитрита (ONOO-), что стимулирует генерацию гидроксил-радикалов и способствует нитрированию тирозиновых остатков белков, а также инактивирует фермент супероксиддисмутазу и вызывает углубление свободнорадикального окисления, приводящего к гибели клетки. Кроме того, пероксинитрит способен тормозить тирозинкиназу, входящую в активный центр нейротрофических факторов, увеличивая степень недостаточности трофического обеспечения мозга [20, 32, 42, 103, 231]. Таким образом, в условиях церебральной ишемии перевозбуждение глутаматных рецепторов и избыточная продукция NO приводят к усилению процессов свободнорадикального окисления, вызывающих гибель клетки [190, 407]. Среди всех полиморфизмов гена eNOS наиболее детально исследован минисателлитный полиморфизм eNOS 4a/4b. В китайской популяции аллель 4а рассматривается как независимый фактор риска развития атеросклероза и заболеваний, сопровождающихся нарушениями выработки NO, в том числе ИИ [176, 342]. Однако, в другом исследовании показана протективная роль аллеля 4a при развитии лакунарного инсульта в турецкой популяции [161, 407]. В китайской популяции была выявлена также достоверная ассоциация с ИИ биаллельных полиморфизмов −922A>G и −786T>C в промоторной области гена. Генотип eNOS*–786C/C и аллель eNOS*–922G чаще встречались у больных ИИ по сравнению с контрольной группой [100]. Вероятно, эти полиморфизмы оказывают влияние на уровень транскрипции гена, вызывая снижение активности NO и 33 развитие гипертензии и/или вазомоторных реакций, что способствует атерогенезу и увеличивает риск инсульта [178]. 1.3.3. Гены ренин-ангиотензин-альдостероновой системы Нарушения в ренин-ангиотензин-альдостероновой системе (РААС) служат одной из главных причин развития инсульта и других сердечно-сосудистых заболеваний. Среди генов, кодирующих компоненты РААС, особое внимание привлекает ген ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) и полиморфный маркер, расположенный в его 16-ом интроне, который характеризуется наличием или отсутствием (инсерция/делеция) фрагмента ДНК длиной 287 п.н. [105]. В результате проведенных исследований была выявлена позитивная связь делеции в данном участке с предрасположенностью к ИИ в европейских и азиатских популяциях [30, 330, 365, 377]. Также показаны ассоциации с инсультом полиморфизма генов AGT (кодирует ангиотензин) [34, 146, 322, 413] и REN (ренин)[138]. 1.3.4. Ген метилентетрагидрофолатредуктазы Изменения в метаболизме гомоцистеина приводят к нарушению функции эндотелия, агрегации тромбоцитов и как следствие к раннему развитию атеросклеротических поражений сосудов. Подобные изменения вызывает замена 677С>Т в гене MTHFR, которая приводит к замене валина на аланин в сайте связывания фолата метилентетрагидрофолатредуктазы, участвующей в превращении гомоцистеина в метионин, и к уменьшению ее ферментативной активности. гомоцистеина Генотип в MTHFR*677Т/Т плазме [139]. связан Согласно с повышенным исследованиям уровнем последних лет, ассоциацию с ИИ полиморфизма 667С>Т гена MTHFR выявляли в популяциях китайцев [143, 414], японцев [403], турок [332], индусов [75]. В работах японских и китайских исследователей была отмечена более высокая частота инсульта у женщин-носительниц аллеля MTHFR*667Т в период менопаузы; это может быть связано с тем, что недостаток эстрогенов снижает устойчивость организма к повышению уровня гомоцистеина и является предрасполагающим фактором к развитию ССЗ [64, 398]. В популяциях европейских стран cтатистически значимая 34 позитивная ассоциация аллеля MTHFR*667Т с ИИ была описана у поляков [145], итальянцев [298] и голландцев [241]. 1.3.5. Гены системы свертывания крови Нарушения регуляции свертывающих и противосвертывающих систем крови, а также неспособность компенсировать эти нарушения часто приводят к возникновению инсульта и целого ряда других сердечно-сосудистых заболеваний. Увеличение концентрации фибриногена вызывает повышенную свертываемость крови и агрегацию тромбоцитов, что способствует образованию тромбов и окклюзии сосудов, как малого, так и крупного калибра [321, 333]. В виду того, что воспаление при ИИ развивается не только через механизмы атерогенеза, но и вследствие усиления свертывающей способности крови, значительный полиморфизмов интерес генов представляет изучение фибриногена. функционально Наибольшее значение значимых отводится полиморфным участкам –148C>Т и –455G>А в промоторной области гена FGB, которые участвуют в связывании транскрипционных факторов, влияя на уровень экспрессии гена β-фибриногена. Показано, что аллели FGB*−148T и FGB*455A ассоциированы с повышенной экспрессией гена, что приводит к увеличению содержания фибриногена в крови и повышает вероятность образования тромбов [98, 141]. Достоверная ассоциация обоих участков с ИИ была показана лишь для китайской популяции [98, 99, 402]. Исследования ассоциации этих полиморфизмов с ИИ были проведены ранее в нашей лаборатории. У русских наблюдали позитивную ассоциацию с ИИ аллеля FGB*−148C, в группе лиц, у которых заболевание развивается после 60 лет, а также в общей группе пациентов, но только в составе сочетания с аллелем LPL*1595C [31, 40]. У якутов был обнаружен протективный эффект аллеля FGB*−249T в сочетании с аллелем APOE*−491T в отношении развития ИИ. Был проведен анализ неравновесия по сцеплению и сравнение частот выявленных гаплотипов для полиморфных участков −148C>T и −249C>T гена FGB, а также полиморфизма 4266A>G гена FGA, расположенного в одном кластере с FGB, однако ни для русских, ни для якутов ассоциации какого-либо гаплотипа с ИИ не наблюдалось [30]. 35 В ряде исследований авторы пришли к заключению, что наибольший вклад SNP –455G>А гена FGB вносит в развитие атеротромботического и лакунарного типов ИИ [219, 303, 399, 419]. 1.3.6. Гены, кодирующие компоненты системы воспаления Исследования последних лет показали, что в патогенезе ИИ, наряду с вышеперечисленными системами, важнейшую роль играют иммунологические механизмы. Ишемическое повреждение мозга характеризуется острым локальным воспалением и изменением концентрации цитокинов. Цитокины играют важную роль в регуляторных процессах и воспалительных реакциях и имеют большое значение в патогенезе инсульта и его основного фактора риска - атеросклероза [12, 16, 112]. В воспалении различают молекулярный и клеточный компоненты. Секретируемые одним из типов Т-хелперных (Th) клеток цитокины оказывают влияние на субпопуляции клеток других типов, вступая во взаимодействие друг с другом в сложной цитокиновой сети. Продуцируемые Th1 и Th17 цитокины, такие как интерлейкин-2 (IL2), фактор некроза опухолей (TNF), лимфотоксин (LT), интерферон-гамма (IFNγ) и IL-17 играют роль индукторов воспаления. Th2 и регуляторные Т-хелперы (Treg) продуцируют IL-4, IL-10 и трансформирующий ростовой фактор бета-1 (TGFβ1), которые обладают регуляторными и противовоспалительными свойствами [313]. При острой гипоксии мозговой ткани наблюдается миграция лейкоцитов в зону повреждения и активация клеток микроглии [417]. Местная выработка микроглией, астроцитами и эндотелиальными клетками цитокинов влияет на развитие воспалительной реакции. При артериальной окклюзии возрастает продукция макрофагами воспалительных цитокинов интерлейкина-1 (IL-1) и интерлейкина-6 (IL-6), в результате чего эндотелиальные клетки усиленно экспрессируют молекулы адгезии, такие как ELAM-1, ICAM-1, VCAM-1, Р-селектин и Е-селектин, которые инициируют повышение проницаемости интимы, а также клеточную инфильтрацию стенки сосуда воспалительными клетками и миграцию их в 36 ишемизированную ткань мозга [112, 179]. Происходит также активная пролиферация гладкомышечных клеток и продукция ими соединительной ткани, которая составляет основу фиброзной капсулы атеросклеротической бляшки [173]. В первые часы после острой церебральной ишемии возрастает концентрация C-реактивного белка (CRP), который запускает активацию системы комплемента и также способствует развитию воспаления в ишемизированной зоне и увеличению размера инфаркта мозга [2]. Происходит запуск механизмов вторичного повреждения, среди которых наибольшее значение имеют реакции локального воспаления и аутоиммунной агрессии. Показано, что воспаление предрасполагает к развитию ИИ, а также влияет на степень повреждения мозга после ИИ [11, 341]. В остром периоде ИИ наблюдается сложная динамика изменения уровня интерлейкинов IL-lα и IL-10 с развитием цитокинового дисбаланса. Обнаружено, что высокий уровень IL-6 в плазме крови ассоциирован с нестабильными бляшками в сонной артерии, что может свидетельствовать о потенциальном риске развития инсульта [404]. Тяжесть клинических проявлений ИИ зависит от соотношения провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, а также от времени, прошедшего после начала заболевания, и от обширности ишемического повреждения. Соотношение провоспалительных и противовоспалительных цитокинов может служить маркером тяжести ИИ. Значительное снижение уровня провоспалительных цитокинов к концу острого периода инсульта по сравнению с первыми сутками заболевания может указывать на высокую вероятность благоприятного течения отдаленного периода заболевания. [404]. Установлена неоднозначная роль при ишемическом инсульте некоторых регуляторных молекул, в том числе TNF, IL-10 и TGFβ1, которым свойственны как нейропротективные, так и нейротоксические свойства. Сейчас термины «прои противовоспалительные» цитокины употребляются все реже. Чаще говорят о плейотропном или двунаправленном действии цитокинов. На данный момент ассоциации с инсультом выявлены для полиморфных участков целого ряда генов системы воспаления: IL-1Ra, IL-1β, IL-4, IL-6, LT, CRP 37 и TNF и др. Результаты довольно многочисленных исследований по поиску ассоциации полиморфизма генов системы воспаления с ИИ приведены в таблице 2. Анализ данных, полученных в разных работах для одного и того же полиморфного участка, свидетельствует о невысокой воспроизводимости полученных результатов. При этом противоречивость полученныхых данных часто возрастает по мере увеличения числа исследований, что можно объяснить этническими различиями, негомогенностью исследуемых популяций, а также трудностями в подборе контрольной группы. Как видно из таблицы 2, для одного и того же аллеля показана позитивная или, напротив, негативная ассоциация с развитем ИИ у представителей различных рас. Например, в случае генов PDE4D и TNF наблюдали протективное действие одного из аллелей/генотипов в популяции европеоидов [60, 324] и предрасполагающее действие этого же аллеля в популяции монголоидов [205, 416]. Некоторые проблемы возникают в связи клинической гетерогенностью ИИ. Различные исследователи формируют выборки больных в соответствии с различными классификациями ИИ. При классификации по патофизиологическим особенностям заболевания с разделением ИИ на лакунарный, кардиоэмболический, атеротромботический и другие была выявлена связь полиморфизма генов IL-6 и SELP с отдельными формами ИИ. Однако, во многих работах патогенетическая и этиологическая неоднородность ИИ не принимались в расчет. Этим можно объяснить как отсутствие в некоторых случаях выявленных ассоциаций, так и плохую воспроизводимость результатов. В то же время, в ряде случаев наблюдается воспроизводимость полученных результатов (их валидация). Так, для аллеля IL1Ra*1 была показана позитивная ассоциация с ИИ для итальянской популяции[336], а затем была выявлена предрасполагающая роль данного аллеля и в китайской популяции [218], также подобная ассоциация c ИИ была найдена для аллеля IL-1α*–889T в китайской популяции, а позднее подтверждена в популяции индусов. Также в ряде работ для европейской популяции была показана ассоциация с ИИ аллелей IL6*−174G и 38 TNF*−308A. Участие именно таких полиморфизмов в восприимчивовости к ИИ можно считать доказанным. Из данных таблицы 2 можно видеть, что в предрасположенность к ИИ могут быть вовлечены полиморфные участки кодирующей и регуляторной (промотор, интроны или нетранслируемая область) областей генов. Для выявления того, какой именно из нескольких полиморфных участков, расположенных на одной хромосоме в одном гене или в кластере генов, отвечает за ассоциацию с заболеванием, проводится анализ неравновесия по сцеплению с определением возможных гаплотипов. Часто один из участков вносит главный вклад в риск развития заболевания, а вклад остальных обусловлен неравновесным сцеплением с ним. Подобный анализ удобен тем, что для выявления значительной части гаплотипов можно использовать один или несколько SNP (так называемые "SNP-метки"), и не требуется проведения генотипирования всех рассматриваемых SNP. Гаплотипы, ассоциированные с риском развития ИИ, были выявлены для генов CRP и PDE4D [248, 354, 387]. Таблица 2. Сведения об ассоциации полиморфизма генов системы воспаления человека с ИИ, полученные с использованием подхода «генкандидат» (представлены в соответствии с номерами хромосом, на которых локализованы исследованные гены) Белковый продукт (кодирующий его ген) C-реактивный белок (CRP) Хромосомная локализация гена, полиморфизм, rs 1q21-q23, 1059G>C, rs1800947 1q21-q23, 1444C>T, rs1130864 1q21-q23, −717A>G, rs2794521, −286C>T>A, rs3091244, 2147C>T, rs1205 Фенотип инсульта ИИ ИИ ИИ 39 Результат (см. примечание) + Носительство аллеля CRP*1059С [274] + Аллель CRP*1444T [54] − Аллель CRP*−717A, гаплотип G/C/C трех участков: rs2794521, rs3091244 и rs1205 [387] P-селектин (SELP) Циклооксигеназа-2 (COX-2) Интерлейкин-10 (IL10) Антагонист рецептора IL-1 (IL1Ra) 1q23-q25, Leul640Val, rs6133 Тромбоэмболический ИИ + Аллель SELP*l640Leu [411] 1q23-q25, Pro715Thr, rs6136 1q25.2-q25.3, −765G>C, rs20417 1q25.2-q25.3, 8473T>C, rs5275 ИИ 0 [124] ИИ 0 [385] + Генотипы COX2*−765G/C и COX2*−765C/C и генотипы COX2*8473T/C и COX2*8473C/C [207, 249] + Генотип IL10*−1082G/G [255] ИИ ИИ 1q32.1, −1082G>A, rs1800896 ИИ 1q32.1, −2849G>A, rs6703630 2q14.2, VNTR во 2-ом интроне, rs315952 ИИ + Генотип IL10*−2849A/A [371] ИИ + Аллель IL1Ra*1 [218, 336] Интерлейкин-1α (IL-1α) 2q14, –889C>T, rs1800587 ИИ + Аллель IL-1α*–889T [60, 233, 378] Интерлейкин-1β (IL-1β) 2q14, −511C>T, rs16944 ИИ + Генотип IL-1β*−511T/T[117, 181 ] 5q12 SNP 41G>A, rs152312 ИИ + Носительство аллеля PDE4D*SNP41A [10] ИИ + Генотип PDE4D*SNP83C/C [60] Фосфодиэстераза 4D (PDE4D) 5q12, SNP 83T>C, rs966221 Атеротромботический ИИ 5q12, SNP 56A>T, rs702553 5q12, SNP 45C>T, rs12188950 ИИ ИИ 40 + Генотип PDE4D*SNP83T/T и аллель PDE4D*SNP83T [416] + Гаплотип G/A rs152312 и rs702553 [354] – Аллель PDE4D*SNP45T [244] Интерлейкин-4 (IL4) Фактор некроза опухоли (TNF) Лимфотоксин α (LTA) 5q31.1, −590C>T, rs 2243250 ИИ + Аллель IL4−590T [255] 6p21.3, −308G>A, rs1800629 ИИ + Генотип TNF*−308G/G [205] 6p21.3, −308G>A, rs1800629 6p21.3, 252A>G, rs909253 ИИ ИИ 6p21.3, 252A>G, rs909253 ИИ ИИ Интерлейкин-6 (IL6) 7p21, −174G>C, rs1800795 Лакунарный ИИ Моноцитарный хемотаксический фактор-1 (MCP1) Трансформирующий фактор роста β1 (TGFB1) 17q11.2-12, −2518A>G, rs 1024611 ИИ 19q13.1, −509C>T, rs1800469 ИИ ИИ 19q13.1, 869 T>C, rs1982073 ИИ + Аллель TNF*−308А [196, 324] + Генотип LTA*252A/A [376, 388] – Генотип LTA*252G/G [359] + Генотип IL6*−174G/G [127, 148, 192, 299] – Генотип IL6*−174C/C [59] + Генотип IL6*−174C/C [93] + Генотип MCP1*−2518G/G [88] + Генотип TGFB1*−509)T/T и аллель TGFB1*−509T [295, 344] + Генотип TGFB1*869C/C и аллель TGFB1*869C [295] + Генотип TGFB1*869T/T [364] Фактор, 22q11.2, ингибирующий ИИ −173G>C, 0 [127] миграцию rs 755622 макрофагов (MIF) Примечания: (+) – выявление позитивной ассоциации с аллелем (генотипом, гаплотипом); (−) – выявление негативной ассоциации с аллелем (генотипом, гаплотипом); (0) – отсутствие ассоциации 41 1.3.7. Полногеномный поиск и мета-анализ В последнее время среди методов поиска генов предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям основным становится подход, основанный на полногеномном поиске ассоциаций (genome-wide association studies, или GWAS). Успешность этого подхода обеспечивается выполнением ряда требований, таких как анализ обширных выборок индивидов (несколько сотен или тысяч), репрезентативных для исследуемой популяции, и использование огромного набора (от 300 тысяч до 1 млн.) полиморфизмов, равномерно распределенных по геному и обеспечивающих репрезентативность в отношении вариабельности генома [172]. За последние годы исследования, выполненные методом GWAS, внесли большой вклад в понимание генетики большинства комплексных заболеваний, однако в отношении ИИ успех был достигнут сравнительно недавно. В таблице 3 приведены результаты исследований генетической предрасположенности к инсульту, полученные для европеоидов с использованием GWAS. Представлены только данные для полиморфизмов, ассоциированных с заболеванием с уровнем значимости <10-7 (получены для генов NINJ2, PITX2, IMPA2), которые соответствуют требованиям, предъявляемым к результатам GWAS. Была выявлена связь генов PITX2 и ZFHX3, лежащих на хромосомах 4q25 и 16q22 соответственно, с фактором риска кардиоэмболического ИИ - мерцательной аритмией [135, 150, 152]. Также данным методом была выявлена ассоциация с инсультом генов NINJ2 и IMPA2. Ген NINJ2 кодирует молекулу адгезии нинджурин 2(ninjurin 2), которая вырабатывается глией, причем синтез этой молекулы увеличивается при повреждении нервной ткани. Было показано, что данный ген ассоциирован с развитием атеротромботического инсульта и ИИ у представителей белой расы [185], а для японской популяции была выявлена ассоциация с атеротромботическим инсультом и атеросклерозом сосудов [260]. IMPA2 кодирует миоинозитолмонофосфатазу, которая участвует в метаболизме инозитола и катализирует превращение инозитолмонофосфата в свободный миоинозитол, роль данного фермента ранее была показана при биполярных 42 расстройствах [251]. Кроме того, исследование локуса 9p21, ассоциация с которым была ранее показана при инфаркте миокарда и ишемической болезни сердца, выявило его ассоциацию с атеротромботическим ИИ, однако с другими подтипами инсульта ассоциации данного локуса обнаружено не было [151]. Таблица 3. Результаты полногеномного поиска ассоциаций с инсультом методом GWAS (Genome-Wide Association Screening) у европеоидов. Ген Хромосомная Заболевание локализация гена NINJ2 ИИ 12p13.33 PITX2 IMPA2 Среди методов 1 х 10-9 [185] 2 x 10-10 [150] (1.26 [1.17-1.35]) 7 x 10-7 инсульт 18p11.21 [ссылка] (1.29 [1.19-1.41]) ИИ 4q25 Величина p для аллеля риска (ОШ [95% ДИ]) [258] (5.39 [2.77-10.5]) выявления генетических детерминант комплексных заболеваний особое место занимает мета-анализ. Мета-анализ представляет собой методику объединения результатов различных исследований, складывающуюся из качественного компонента (например, использование таких заранее определенных критериев включения в анализ, как полнота данных, отсутствие явных недостатков в организации исследования и т.д.) и количественного компонента (статистическая обработка имеющихся данных). Преимуществом мета-анализа является возможность увеличения статистической мощности исследования, а, следовательно, точности оценки, что позволяет более точно, чем при анализе каждого отдельно взятого небольшого клинического исследования, полученные определить результаты. категории больных, Подобный подход для которых обеспечивает применимы уменьшение вероятности случайных и систематических ошибок и может служить гарантией объективности получаемых результатов. 43 Данные подобных исследований позволяют с большей вероятностью метилентетрагидрофолатредуктазы говорить (MTHFR), об ассоциации ингибитора генов ангиотензин- превращающего фермента (ACE), коагуляционного фактора V Лейдена, а также протромбина с инсультом [55, 91, 111, 365, 402]. Однако, воспроизведение полученных результатов для некоторых генов, в частности ALOX5AP, на других выборках в странах Европы дало противоречивые результаты, а мета-анализ показал значительные различия среди исследований [9, 70, 214, 239, 420]. Подводя итоги сказанному в разделе 1.3, можно констатировать, что несмотря на многочисленные работы, направленные на поиск генов, определяющих предрасположенность к полигенным формам ИИ, проблема еще далека от своего разрешения. В то же время очевидна необходимость проводить независимые исследования для отдельных этнически гомогенных популяций. 1.4. Выбор генов-кандидатов и их полиморфных участков для настоящего исследования Наше исследование проведено методом «случай – контроль» для больных ИИ, этнических русских, с использованием контрольной группы той же этнической принадлежности. В исследование были включены SNP 8 генов, участвующих в развитии воспаления: CTLA4, PDE4D, IL4, TNF, LTA, IL6, IFNG, TGFβ1. Для анализа были выбраны функционально значимые полиморфные участки, расположенные в кодирующей или в регуляторной областях анализируемых генов. Ниже мы остановимся подробнее на описании выбранных генов, функции их белковых продуктов и выбранных полиморфимах. 1.4.1. Ген CTLA4, его белковый продукт и полиморфизм Ген CTLA4 расположен на хромосоме 2q33.2 и кодирует антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA4) костимуляторный рецептор Т-лимфоцитов, важный негативный регулятор активности T-клеток, который участвует в поддержании перифиричекой Tклеточной стимуляции [113, 210, 256]. В активированных Т-лимфоцитах изоформа рецептора (full-length isoform — flCTLA4) закодирована в 4 экзонах: лидерный белок кодируется экзоном 1, связывающий лиганды домен — экзоном 44 2, трансмембранная область — экзоном 3 и цитоплазматический домен — экзоном 4 [375]. Для активации Т–лимфоцитов требуется, как минимум, два сигнала. Один из них реализуется в процессе взаимодействия Т–клеточных рецепторов (ТКР) с комплексом «процессированный пептид антигена – молекула ГКГ» представленным на поверхности антиген–презентирующих клеток (АПК), другой – за счет взаимодействия так называемых «ко–стимулирующих» рецепторов на Т– клетках и соответствующих лигандов на АПК. Ключевой «ко–стимуляторный» сигнал обеспечивается за счет взаимодействия CD28 на Т–лимфоцитах и СD80 и СD86 на АПК. При наличии обоих сигналов Т–лимфоциты синтезируют цитокины, которые, в свою очередь активируют другие клетки иммунной системы (прежде всего макрофаги). В отсутствие «ко–стимуляторного» сигнала Т– лимфоциты теряют способность эффективно «отвечать» на антигенные стимулы и подвергаются апоптозу. CTLA4 связывает CD80 и CD86 с более высокой авидностью (примерно в 500–2500 раз выше), чем CD28. Поэтому связывание CTLA4 с CD80 и CD86 предотвращает ко–стимулирующий эффект CD28 на Т– лимфоциты (ко–стимулирующий сигнал 2) и таким образом подавляет активацию Т–лимфоцитов [261, 290]. Известно, что после активации Т клеток лимфоциты секретируют интерлейкин-2 (ИЛ-2), который влияет на пролиферацию и дифференцировку клеток. Соответственно, было обнаружено, что когда CTLA4 стимулирован, происходит снижение продукции ИЛ-2 [232]. Кроме того, экстрацеллюлярный домен CTLA4 может связываться с IgG. Комплекс CTLA4-Ig блокирует продукцию ИЛ-2 и ко-стимуляцию CD28/B7 [77, 232]. Экспериментально было показано, что мыши, нокаутные по CTLA 4, погибали, так как из-за отсутствия ингибирующего сигнала происходило снижение пролиферации и дифференцировки Т клеток [97]. В гене CTLA4 выявлено более 30 точечных однонуклеотидных замен (SNP),ассоциированых с различными аутоиммунными заболеваниями, такими как, аутоиммунный тиреоидит, диабет типа I, ревматоидный артрит, РС [198, 230, 418]. Наибольший интерес представляет однонуклеотидный полиморфизм в 45 положении 49 первого экзона, который приводит к замене треонина на аланин в 17-м положении сигнальной последовательности. Это вызывает у носителей генотипа CTLA4*49G/G повышение пролиферативной активности Т-лимфоцитов [282]. Была показана ассоциация с развитием гипертензии генотипа CTLA4*49A/A в японской популяции [209]. 1.4.2. Ген PDE4D, его белковый продукт и полиморфизм Ген PDE4D расположен на хромосоме 5q12 имеет семь промоторов, состоит из 22 экзонов и кодирует фосфодиэстеразу 4D (PDE4D), которая относится к металлофосфогидролазам суперсемейства фосфодиэстераз. В результате альтернативного сплайсинга или использования разных промоторов возможно образование как минимум восемь функционально различных изоформ белка: двух коротких форм (PDE4D1 и PDE4D2) и шесть длинных (PDE4D3, 4, 5, 7, 8 и 9), отличающихся по структуре N-концевого домена [149, 276]. Предполагается, что эти домены могут играть важную роль в регуляции активности фосфодиэстеразы [236]. Разные варианты PDE4D экспрессируются во многих типах клеток и тканей различных органов, включая мозг, легкие, почки, моноциты, B- и T-лимфоциты и сосудистые гладкомышечные клетки [71, 360]. регулирует PDE4D внутриклеточное соотношение циклических аденозинмонофосфата (цАМФ) и гуанозинмонофосфата (цГМФ) за счёт их расщепления до 5'-монофосфатных нуклеотидов. Было показано, что уменьшение уровня цАМФ вызывает усиление пролиферации и миграции сосудистых гладкомышечных клеток in vitro, что приводит к образованию фиброзной бляшки [140, 177, 293]. Показано, что ген PDE4D экспрессируется также в активированных макрофагах, таким образом, PDE4D принимает участие в процессах воспаления при атерогенезе и/или приводит к нестабильности атеросклеротичекой бляшки [245]. Показано, что активность фосфодиэстеразы 4D составляет 80% от активности всех фосфодиэстераз в клетках, участвующих в процессе воспаления фосфодиэстераз, Повышение [189]. участвующих внутриклеточного Фосфодиэстераза в регуляции уровня 46 цАМФ 4D является проницаемости увеличивает одной ГЭБ из [170]. электрическое сопротивление эндотелия путем стабилизации межклеточных контактов и таким образом уменьшает проницаемость ГЭБ [132]. На модельных животных было показано ингибирование пролиферации гладкомышечных клеток при применении антагонистов PDE4 [187]. Также на животных было показано, что значительное увеличение уровня PDE4D играет роль в повреждении клеток гиппокампа, вызванном ишемией. В свою очередь повышение уровня PDE4D после ишемии головного мозга с учетом роли в изменении проницаемости ГЭБ вдвое увеличивает повреждающее действие ишемии [169, 171]. Ферментативная активность PDE4D может играть важную роль в риске развития инсульта посредством ее участия в воспалении, формировании физиологического ответа на повреждение сосудов, ангиогенезе [69, 70, 156]. В гене PDE4D было обнаружено 260 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Gretarsdottir S.et al. выявили три гаплоблока, A, B и С, охватывающих первые три экзона гена PDE4D и прилежащие к ним участки [149, 276]. В настоящем исследовании выбраны полиморфные участки SNP87C>T и SNP41G>A, которые находятся в некодирующей области гена и относятся к гаплоблокам A и B, соответственно. Их функциональная значимость пока не ясна, однако, в исследовании [149] была показана их ассоциация с различными формами инсульта. 1.4.3. Ген IL4, его белковый продукт и полиморфизм Ген IL4 картирован на длинном плече (с q31 по q33) 5-ой хромосомы, имеет 4 экзона и расположен в кластере нескольких других Th2-цитокинов, таких как IL-5 и IL-13 [223, 257]. Ген IL4 кодирует плейотропный цитокин интерлейкин 4 (IL-4), который продуцируют Th2-клетки и который ингибирует Th1-клетки и стимулирует иммунный ответ Th2-типа. Также IL-4 является сильным ингибитором функции макрофагов и индуцирует апоптоз моноцитов [250]. Он снижает продукцию провоспалительных цитокинов, таких как TNFα, IL-6, и IL-1α активированными моноцитами и таким образом оказывает противовоспалительное действие [101]. 47 IL-4 также является ключевым фактором в дифференцировке Т-хелперов [269]. Показано, что IL-4, совместно с IL-10, тормозит экспрессию тканевого фактора, вызывая гипокоагуляцию и усиление секреции активатора плазминогена [347]. В центральной нервной системе (ЦНС) IL-4 ингибирует выработку TNF [95], провоспалительных цитокинов [62] фактора роста нервов (NGF) [242] и выработку микроглией NO [94]. В то же время он повышает цитокинетическую активность макрофагов, способствует миграции в очаг воспаления нейтрофилов, усиливает выработку колониестимулирующих факторов. Katsuno et al. показали, что уровень IL-4 повышен во внутренней яремной вене у пациентов с черепномозговыми травмами и субарахноидальными кровоизлияниями [197]. Описано несколько полиморфных участков гена IL4; некоторые из них вовлечены в регуляцию продукции IL-4. Наиболее изученным является находящийся в промоторной области гена IL4 полиморфный участок –590C>T [180], который и был выбран в нашем исследовании. Данные исследований in vitro и in vivo показали, что аллель IL4*–590T, который находится в жестком неравновесии по сцеплению с аллелем IL4*–33T, ассоциирован с повышенной экспрессией IL-4 [315, 316, 317]. 1.4.4. Ген TNF, его белковый продукт и полиморфизм Ген TNF картирован на хромосоме 6 в области 6p21.3, в пределах главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), имеет размер 2762 п.н. и содержит 4 экзона [281]. Транскрипция с гена TNF запускается NF-kappaB и может быть индуцирована различными цитокинами, например, γ-интерфероном [382, 383]. Ген кодирует фактор некроза опухоли, который, как и IL-6, является ключевым цитокином с провоспалительным действием, играющим важную роль в апоптозе, дифференцировке и пролиферации. TNF представляет собой полипептид, секретируемый стимулированными макрофагами и моноцитами, влияющий на метаболизм липидов, свертывание крови, резистентность к инсулину, функционирование клеток эндотелия и обладающий цитолитическим или цитостатическим действием в отношении широкого спектра линий опухолевых клеток [58]. TNF, через активацию макрофагов и микроглии, что, в 48 свою очередь, приводит к усилению их фагоцитирующих свойств, усиливает продукцию цитотоксических соединений, таких как окислительные радикалы, NO, протеазы и др [212]. TNF увеличивает экспрессию молекул адгезии, высвобождение эндотелиальных цитокинов, а также молекул HLA класса II, меняет архитектонику гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), модифицируя организацию плотных межклеточных контактов между эндотелиальными клетками, индуцируют продукцию хемокинов – хемоаттрактантов для клеток, участвующих в воспалении [137]. TNF, увеличивая экспрессию молекул адгезии на эндотелиальных клетках микрососудов в ЦНС [210], способствует гибели нейронов [94], повышает риск развития реперфузии ЦНС [68], а также увеличивает отек головного мозга [405]. TNF играет главную роль в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний посредством влияния на липидный обмен. Жировая ткань продуцирует TNF, который оказывает влияние на стенку сосуда или напрямую, или посредством изменения метаболизма инсулина. TNF снижает активность тирозинкиназы инсулинового рецептора, усиливает фосфорилирование серина в субстрате инсулинового рецептора, что приводит к ослаблению проведения инсулинового сигнала [107, 175, 229]. TNF может способствовать регенерации поврежденных аксонов и защите культивированных нейронов [89]. Однако, при внутрижелудочковом введении TNF крысам с окклюзией средней мозговой артерии отмечали увеличение объема инфаркта мозга [83]. Показано, что после окклюзии средней мозговой артерии наблюдается увеличение выработки TNF не только в нейронах, но и в астроцитах, микроглии, сосудистом сплетении и эндотелиальных клетках [154]. Данные эффекты можно объяснить тем, что активация специализированного рецептора TNF р55 может передавать сигналы , приводящие как к апоптозу, так и к выживанию клеток [201]. Из всех полиморфизмов в промоторной области гена TNF, наибольшее клиническое значение имеют −238G>A и −308 G>A, показана их ассоциация с изменениями в уровне белка и скоростью транскрипции [306, 334, 368 394]. 49 Из литературы известно, что полиморфизм TNF ассоциирован с различными ССЗ. Показана ассоциация генотипов TNF*−308A/A и TNF*−308A/G полиморфного участка −308A>G гена TNF с повышенным риском развития неблагоприятного исхода в группе больных, перенёсших острый коронарный синдром [7]. При исследовании ассоциации полиморфного участка −308A>G гена TNF с риском развития инфаркта миокарда (ИМ) было выявлено, что частота аллеля TNF*−308A была выше в группе больных с подъемом сегмента ST по сравнению с контрольной группой и группой больных без подъема сегмента ST [52]. Этот полиморфный участок был выбран нами для анализа в нашем исследовании. 1.4.5. Ген LTA, его белковый продукт и полиморфизм Ген LTA картирован на хромосоме 6p21.3, содержит 3 экзона и кодирует лимфотоксин альфа [193]. Лимфотоксин альфа (LTA, ранее называвшийся TNFβ) - провоспалительный цитокин, лимфокин из суперсемейства факторов некроза опухоли, обладает рядом подобных TNF биологических активностей, также показана роль LTA в метаболизме липидов и его участие в развитии дислипидемий [238]. LTA не имеет трансмембранного домена, но способен удерживаться на мембране за счет образования комплекса с трансмембранным белком рЗЗ [86]. LTА синтезируется В - и Т – лимфоцитами и играет роль в лимфоидном органогенезе и в дифференцировке Т-клеток. Было обнаружено, что LTA способен привлекать нейтрофилы в очаг воспаления, индуцировать фагоцитоз и обладает способностью индуцировать защиту от микроорганизмов, таких как Plasmodium falciparum, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis [288, 311]. LTA активирует молекулы адгезии и цитокины эндотелия сосудов, гладкомышечных клеток и некоторых видов лейкоцитов, что приводит к прогрессированию атеросклероза и развитию ишемической болезни сердца (ИБС) и ИМ [133, 272, 285]. Messer et al. выявили SNP в положении 252 A>G в интроне LTA, который связан с повышенной экспрессией LTA [267]. В исследовании Liu Y et al. на 50 американцах европеоидной расы и афроамериканцах было показано, что генотип LTA*252G/G также ассоциирован с увеличением толщины средней оболочки сонных артерий и как следствие, неблагоприятным прогнозом атеросклероза [237].Была показана ассоциация генотипа LTA*252G/G полиморфизма 252 A>G гена LTА с риском развития ИМ у японцев [291], однако в русской популяции с риском развития ИМ была выявлена ассоциация аллеля LTA*252A [37]. Учитывая эти данные, мы в настоящем исследовании остановились на анализе полиморфизма 252А>G гена LTА. 1.4.6. Ген IL6, его белковый продукт и полиморфизм Ген IL6 находится на хромосоме 7p21 и содержит 4 экзона [80]. Промотор гена напрямую активируется различными цитокинами, в том числе IL-1 и TNF. Транскрипция IL6 запускается под действием IL-1 ядерным фактором NF-IL6 [47]. Ген IL6 кодирует мультифункциональный, плейотропный провоспалительный цитокин интерлейкин 6 (IL-6), который синтезируется различными типами клеток, такими как Т- и В-лимфоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, макрофаги/моноциты, мезангиальные и глиальные клетки [304, 396]. Данный цитокин играет значимую роль в развитии атеросклеротических бляшек в сосудах головного мозга [339] и в сонной артерии [404], а также обладает нейротрофическим действием при церебральной ишемии [356]. Синтез IL-6 индуцируется IL-1, TNF-α, колониестимулирующими факторами, а ингибируется IL-4, 10, 13, эндотоксинами и интерфероном γ. Рецептор IL-6 состоит из двух функциональных белков – мембранного IL-6 рецептора (mIL6-6R)и мембранного гликопротеина (gp130), активационный сигнал [108, 163, 314]. Взаимодействие передающих комплекса IL-6 и рецептора с gp130 запускает каскад реакций, приводящий в конечном итоге к индукции дифференцировки В-клеток и синтеза антител, активации Т-клеток и макрофагов, стимуляции пролиферации синовиоцитов и синтезу сосудистого эндотелиального фактора роста, активации остеокластов, индукции матриксных 51 металлопротеиназ, активации эндотелия и пролиферации гладкомышечных клеток [314]. Нарушение продукции IL-6 приводит к нарушению взаимодействий гладкомышечных клеток с лейкоцитами, что в свою очередь приводит к накоплению внеклеточного матрикса, усилению миграции лейкоцитов в очаг поражения и изменению уровня медиаторов воспаления, усиливая атерогенез [242]. Синтезируясь в атеросклеротической бляшке, IL-6 стимулирует экспрессию матриксных металлопротеиназ, моноцит-хемоаттрактантного белка MCP-1 и TNF, способствуя нестабильности бляшки [326, 335]. IL-6 активирует также эндотелиальные клетки, что приводит к продукции молекул адгезии (ICAM-1) на поверхности эндотелия: это играет решающую роль в последующем запуске миграции лейкоцитов из сосудистого русла в зону фокальной ишемии с инфильтрацией ими поврежденной ткани. [203, 206]. IL-6, наряду с глюкокортикоидами, IL-1β и TNF, регулирует синтез фибриногена в острой фазе воспаления [141]. В промоторных областях генов, кодирующих субъединицы фибриногена человека (FGA, FGB, FGG), идентифицировано несколько IL-6 -респонсивных элементов, связывающих STAT3 – основной транскрипционный фактор, передающий сигнал от IL-6рецептора к ядру [115, 164]. По этому механизму IL-6 вносит свой вклад в повышение свертываемости крови и, в частности, в усиление атеротромбоза. Для гена IL6 известно несколько аллельных полиморфизмов. Наиболее изученным из описанных на данный момент четырех SNP является расположенный в 5'-фланкирующей области гена полиморфный участок −174G>C [126], на котором мы и остановились в нашем исследовании. Показана ассоциация генотипа IL6*–174G/G с повышенным уровнем IL-6 в плазме, что связано с усилением транскрипции у носителей этого аллеля [126]. Анализ ассоциации данного полиморфизма показал, что аллель IL6*–174C связан с ревматоидным артритом [126], сахарным диабетом [213], метаболическим синдромом [186], диабетической ретинопатией [325], астмой [338] и другими заболеваниями. 52 1.4.7. Ген IFNG, его белковый продукт и полиморфизм Ген IFNG, кодирующий провоспалительный цитокин интерферон гамма (IFNγ), локализован на хромосоме 12 в области 12q24.1 и имеет размер около 6 т.п.н., содержит 4 экзона и 3 интрона. IFNγ продуцируется субпопуляцией Th1 и активированными NK-клетками; повышение экспрессии IFNγ, вследствие активации лимфоцитов, является важным этапом в развитии воспаления. Он обладает множественным действием на рост и дифференцировку клеток самых разных типов. IFNγ, действуя непосредственно на СD8+-лимфоциты, вызывает повышение на их поверхности рецепторов к IL2 и МНС II класса. В результате происходит активация как цитотоксической, так и антигенпрезентирующей активности Т-лимфоцитов [263]. При участии матриксных металлопротеиназ IFNγ совместно с TNF могут модифицировать организацию плотных межклеточных контактов между эндотелиальными клетками ГЭБ, способствуя выходу лейкоцитов из сосудистого русла и миграции к очагу воспаления в ЦНС [289]. В исследовании Lambertsen et al. на мышах было сделано предположение, что IFNγ существенно усиливает повреждения головного мозга, вызванные ишемией [221]. IFNγ способен подавлять синтез коллагена гладкомышечными клетками и увеличивать синтез металлопротеиназ макрофагами, можно предположить, что этот цитокин активно участвует в атерогенезе, в частности, в реорганизации матрикса атеросклеротической бляшки [228]. В первом интроне гена IFNG расположены высокополиморфные (до 6 аллелей) микросателлитные повторы (вариабельное число динуклеотидных повторов СА в положении 1349; VNDR 1349). Показано, что аллель 2 (с 12 САповторами) ассоциирован с высоким уровнем продукции IFNγ in vitro, а также связан с риском развития некоторых аутоиммунных, инфекционных и хронических воспалительных заболеваний [92, 300]. В непосредственной близости от данного микросателлитного повтора, расположен SNP 874A>T гена IFNG. Сцепление аллеля IFNG*874T и аллеля 2 микросателлитного повтора (с 12 СА-повторами) является абсолютным. Показано, что с высоким и низким уровнем 53 продукции IFNγ соответственно коррелируют аллели IFNG*874T и IFNG*874A [301]. Показана ассоциация данного полиморфного участка с различными заболеваниями, в том числе онкологическими [142, 195, 235]. Исследование Ianni et al. показало увеличение частоты IFNG*874A у пациентов с ИМ [182]. Показана связь носительства данного аллеля с неблагоприятным прогнозом и исходом в случае идиопатической дилатационной кардиомиопатии [45].Авторы работы [182] высказали предположение, что носительство IFNG*874A и как следствие снижение выработки IFNγ может негативно влиять на протекание иммунных реакций в стенках сосудов, ускорение атерогенеза и увеличивают риск последующих осложнений. 1.4.8. Ген TGFB1, его белковый продукт и полиморфизм Ген TGFB1, локализованый у человека на хромосоме 19p13.1 и содержащий 7 экзонов, кодирует трансформирующий фактор роста β1 (TGFβ1). TGFβ1 является плейотропным цитокином и принадлежит к обширному суперсемейству TGFβ [96, 308]. Он принимает участие в регуляции иммунного ответа, пролиферации клеток, а также в процессах эмбрионального развития, фиброзирования ткеней, и апоптоза [165]. Регуляция внеклеточной активности TGFβ1 осуществляется при переходе из неактивной (латентной) в активную форму TGFβ1 [51]. При тканевом повреждении происходит активация латентной формы TGFβ1, осуществляемая протеазами (плазмином, матриксными металлопротеиназами) [183]. TGFβ1 способствует разрешению воспалительной инфильтрации, образовавшейся в очаге повреждения. TGFβ1 секретируется регуляторными T-лимфоцитами (Tr) и является антагонистом провоспалительных цитокинов, он подавляет активность Th1-клеток, синтез провоспалительных цитокинов, адгезию лейкоцитов и миграцию нейтрофилов [76, 120, 225, 392]. Он играет важную роль в патогенезе ССЗ, в том числе в патогенезе атеросклероза (включая ИБС и ИМ), гипертонической болезни, гипертрофии миокарда и фибротических явлений в сердце [46]. В некоторых исследованиях обнаружено, что TGFβ1 обладает антиатерогенным действием: он подавляет воспаление и усиливает стабилизацию атеросклеротической бляшки. 54 В экспериментах на мышах показано, что он способен снижать экспрессию аполипопротеина Е, таким образом, подавляя развитие и прогрессирование атеросклероза [147]. Протективное действие TGFβ1 проявляется в угнетении адгезии лейкоцитов к эндотелию [348], подавлении выработки макрофагами повреждающих окислительных радикалов и NO-метаболитов. Показана нейропротективное действие TGFβ1, связанное со стабилизацией нейронального кальциевого гомеостаза [302], что приводит к значительному торможению свободнорадикального повреждения, замедлению процессов некроза и апоптоза [119]. С другой стороны, показано, что высокий уровень TGFβ1 ассоциирован со стенозом сосудов и тромбообразованием, усиливает фиброз и подавляет регенерацию эндотелия [202, 222], являясь, таким образом, проатерогенным фактором. В частности, он может способствовать раннему образованию липидного пятна, стимулируя продукцию экстрацеллюлярного матрикса и ингибируя его деградацию [46]. Исходя из этих данных о роли TGFβ1, можно предположить, что в зависимости от совокупности других факторов неблагоприятным может оказаться как низкий, так и высокий уровень TGFβ1, и, соответственно, носительство альтернативных аллелей полиморфных участков гена, влияющих на уровень продукции белка. Для гена TGFB1 известно несколько аллельных полиморфизмов. Наиболее изученными из описанных SNP на данный момент являются: –509C>T, 869T>C и 915G>C. Полиморфный участок –509C>T гена TGFB1 расположен в –509 положении промоторной области гена. Показано, что генотип TGFB1*−509T/T этого SNP ассоциирован с повышением в плазме уровня TGFβ1 [349]. В исследовании Oda et al. показано, что аллель TGFB1*−509T является фактором риска атеросклероза мозговых артерий у японцев в пожилом возрасте [286]. Исследование на шведской популяции выявило связь аллеля TGFB1*−509C с повышенным уровнем ЛПНП у девочек подросткового возраста [284]. 55 Полиморфный участок 869T>C гена TGFB1 расположен в положении 869 первого экзона и обуславливает замену Leu на Pro (10 кодон белкапредшественника). Показано, что данный полиморфизм влияет на концентрацию мРНК TGFβ1 в мононуклеарных клетках периферической крови и уровень TGFβ1 в сыворотке крови [355, 408]. Кроме того, опыты in vitro показали, что замена Pro10Leu приводит к значительному снижению выработки TGFβ1 в клеточной линии HeLa [116]. Аллель TGFB1*869T ассоциирован с повышенным уровнем ЛП у больных ИМ в японской популяции [408], а также у больных ИМ молодых итальянцев [106], но в соответствующих исследованиях в других этнических группах ассоциации найдено не было [344, 357, 389]. Полиморфный участок 915G>C гена TGFB1 расположен в положении 915 первого экзона и обуславливает замену Arg (Аргинин) на Pro (Пролин) в 25 кодоне белка-предшественника. Показано, что аллель TGFB1*915C ассоциирован с низкой выработкой TGFB1 in vitro и in vivo [56, 57, 118]. В исследовании Wang Y. et al. была показана ассоциация генотипа TGFB1*915G/G с мерцательной аритмией, являющейся одним из факторов ИИ [390]. Перечисленные полиморфные участки гена были выбраны для анализа в нашем исслеовании. Заключение Таким образом, можно видеть, что для некоторых генов, таких как MTHFR, ALOX5AP, APOE, PDE4D и была ACE, выявлена и подтверждена с использованием различных подходов ассоциация с развитием ИИ. Несмотря на обширный экспериментальный материал, посвященный иммунно-воспалительному статусу пациентов с ИИ, роль генов воспаления в развитии инсульта изучена недостаточно, и многие вопросы остаются открытыми. Учитывая неоднозначность и противоречивость полученных ранее результатов, перспективным на сегодняшний день представляется анализ выборок больных определенной этнической принадлежности с ИИ, четко дифференцированным от других клинических форм инсульта. Также, помимо генетических, необходимо учитывать вклад в развитие ИИ других факторов риска, в частности, курения. Важную роль при анализе предрасположенности к ИИ могут играть такие 56 немодифицируемые факторы риска как пол и возраст. Тщательный подход к формированию выборок позволит сделать более точные выводы о вкладе исследуемых генов в развитие ИИ. К настоящему времени сложилось четкое представление, что генетической основой полигенных заболеваний, таких как ИИ, является совместный вклад ряда независимо действующих или взаимодействующих генов, причем вклад каждого из них по отдельности может быть невелик или вовсе не проявляться. Поэтому представляется перспективным выявление сочетаний полиморфных вариантов генов, участвующих в формировании индивидуального риска, которые можно будет использовать для проведения генетических скрининг-тестов у лиц из групп риска по развитию сосудистых заболеваний мозга. Исходя из этого, выполненная диссертационная работа была направлена на комплексный анализ вклада различных генов в развитие ИИ. 57 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Объект исследования В данном ретроспективном исследовании методом «случай-контроль» использовали образцы из коллекции крови и геномной ДНК 200 больных ишемическим инсультом (ИИ) русской этнической принадлежности, ср. возраст – 64.1 ± 10.8 лет. Из них 123 мужчины (ср. возраст – 61.2 ± 9.8) и 77 женщин (ср. возраст – 68.7 ± 10.7). Все индивиды, вошедшие в исследование, были обследованы на государственного кафедре неврологии медицинского и университета нейрохирургии на базе Российского 12-го и 13-го неврологических отделений ГКБ №1 им. Н.И.Пирогова. Во всех случаях диагноз «ишемический инсульт» был подтвержден результатами КТ и/или МРТ. Через 3-5 дней после прекращения инфузионной терапии (10-14 дни заболевания) у больных ИИ определяли уровень фибриногена в плазме венозной крови (г/л) по методу Рутберга и агрегационную активность тромбоцитов по методу G. Born в модификации В.А. Люсова и Ю.Б. Белоусова. Изучались процент изменения оптической плотности плазмы под воздействием адреналина (А тр), размер агрегатов (D агр) и скорость агрегации тромбоцитов ( ). Взятие крови в количестве 4,5 мл (консервант – 0,5 мл цитрата натрия) осуществлялось из локтевой вены методом свободного вытекания в 900 – 1000 часов утра. Интервал между взятием крови и исследованием агрегации составлял 30-40 мин. Те же показатели определяли для контрольной группы при заборе крови. Контрольная группа состояла из 146 русских без анамнестических и диагностических указаний на стойкие и преходящие нарушения мозгового кровообращения, ср. возраст – 61.8 ± 12.3 лет. Из них 83 мужчины (ср. возраст – 57.1 ± 11.9 лет) и 63 женщины (ср. возраст – 63.2 ± 14.2 лет). От всех больных или их родственников, а также индивидов контрольной группы получено информированное согласие на проведение исследования. 2.2. Использованные реактивы В работе использовали Taq-полимеразу и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (ЗАО "Силекс", Россия); эндонуклеазы рестрикции, олигонуклеотиды и маркер 58 молекулярной массы ДНК pUC19/Msp I (НПО "СибЭнзим", Россия); протеиназу K, SDS (додецилсульфат натрия) ("AppliChem", Германия); моноклональные антитела к Taq полимеразе, Taq-Start (АО"Мона", Россия); ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) ("Merck", Германия); Трис, NP-40 ("Sigma", США); агароза ("Pancreac", Испания); акриламид, бромид этидия, DMSO (диметилсульфоксид) ("Fluka", Швейцария); N,N'-метиленбисакриламид, TEMED (N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин), бромфеноловый синий, ксиленцианол, β-SH (β-меркаптоэтанол) ("BioRad", США); персульфат аммония ("Promega", США), Tween 20, Triton X-100 ("Ferak", Германия). Остальные реактивы категории о.с.ч. получали из отечественных фирм. 2.3. Выделение геномной ДНК из периферической крови Для получения ДНК необходимой чистоты и достаточного молекулярного веса применяли модифицированный метод выделения ДНК из крови с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ [331]. 1) В качестве образца брали 5 мл венозной крови, добавляли ЭДТА, pH 8.0, до 25 мМ и замораживали при −20оС. 2). После размораживания образец смешивали с 8 мл раствора Т20Е5 (20 мМ Трис-HCl pH 7.5, 5 мМ ЭДТА) и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. 3) Супернатант тщательно удаляли, добавляли 4–5 мл Т20Е5, осадок ресуспендировали, затем доводили объем раствора до 10 мл Т20Е5, перемешивали переворотом и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. 4) Повторяли дважды предыдущий этап. 5) Ресуспендировали осадок в 5 мл Т20Е5. 6) Добавляли 150 мкл 10% SDS и 25 мкл протеиназы К (20 мг/мл). 7) Инкубировали 3 часа при 65оС 8) Добавляли равный объем фенола (5 мл). Центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю фазу в чистую пробирку. Добавляли равный 59 объем фенол-хлороформа (5 мл). Центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Повторяли процедуру 2 раза. 9) Отбирали верхнюю фазу и добавляли по 4 мл хлороформа, центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю фазу. 10) К каждому образцу добавляли 1/12 объема 6 M NaCl и два объема 96% этилового спирта. 11) После преципитации ДНК проводили центрифугирование при 3000 об/мин 10 мин при комнатной температуре, отбирали этанол и подсушивали осадок на воздухе. 12) Осадок ресуспендировали в 100 мл Т10Е1 (10 мМ Трис-HCl, pH7.5, 1 мМ ЭДТА). 13) Растворяли ДНК в 400 мл Н2О. Полученную пробу ДНК хранили при −4 оС. 2.4. Геномное типирование Геномное типирование проводили методами, основанными на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применяли метод анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР (метод ПЦР-ПДРФ), где олигонуклеотидная замена входит в состав сайта узнавания специфической рестриктазы, и генотипы определяют по наличию или отсутствию фрагментов рестрикции; и метод ПЦР с использованием аллелеспецифических праймеров (метод ПЦР-SSP), где генотипы определяют по наличию или отсутствию продукта амплификации в случае праймера, специфического для определенного аллеля. Геномного типирования полиморфных участков 41G>A и 87C>T гена PDE4D проводили методом ПЦР в реальном времени (Real-time PCR). Все праймеры сконструированы с помощью пакетов программ Vector NTI 7.1 и Primo [421]. В каждый эксперимент включали отрицательный контроль, где ДНКматрицу для ПЦР заменяли dH2O. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО «ДНК Технология», Россия) или Genius (Techne, Великобритания), ПЦР в реальном времени проводили в амплификаторе Mx3000P («Stratagene», США). 60 2.4.1. Геномное типирование полиморфного участка 49A>G в гене CTLA4 Для анализа однонуклеотидной замены A на G в 49-м положении первого экзона гена CTLA4, обуславливающей замену треонина на аланин в лидерном пептиде, фрагмент ДНК длиной 152 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с AAGGCTCAGCTGAACCTGGT-3' использованием и праймеров: 5'- 5'-CTGCTGAAACAAATGAAACCC-3'. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала 0.05 М KCl, 0.01 М ТрисHCl (pH 9.0), 5% формамид, 1.5 мМ MgCl2, по 0.2 мМ каждого dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), по 5 пкмоль каждого праймера, 0.5 е.а. Taq-полимеразы и 100-200 нг ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации: 1) 94°С - 5 мин 2) 30 циклов: 94°C - 1 мин; 58°С - 1 мин; и 72°С - 1 мин; 3) 72°С - 7 мин. ПЦР проводили в амплификаторе Genius (Techne, Великобритания). Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромида этидия. (1 мкг/мл). В качестве буфера для электрофореза использовали 1хTBE: 0.89 М Трис-борат; 0.89 М борная кислота; 0.002 М ЭДТА, pH 8.0; состав 5х буфера для нанесения проб: 30% глицерин, по 0.025% бромфенолового синего и ксиленцианола. В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК плазмиды pUC19, обработанную рестриктазой MspI. Анализ гелей проводили в системе видеодокументации гелей (UVP ImageSystem). По 5 мкл полученного продукта амплификации обрабатывали 5 ед. рестриктазы PspEI в течение 4 часов в реакционном буфере, поставляемом производителем фермента, при 37°С. Продукты рестрикции разделяли методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-свете. Наличие рестрицированного фрагмента длиной 130 п.н. свидетельствовало о присутствии аллеля A, наличие интактного фрагмента длиной 152 п.н. - аллеля G. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 1. 61 а b Рисунок 1. Пример анализа полиморфизма 49A>G гена CTLA4. a. схема набора рестрикционных фрагментов, характеризующих рассматриваемый полиморфизм. b. Фрагменты рестрикции после электрофореза в 3%-ом агарозном геле. Ммаркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелками показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-9 – образцы ДНК: 2, 3, 7 – гомозиготы G/G; 4, 8 – гомозиготы A/A; 1, 5, 6, 9 – гетерозиготы A/G; «-» - отрицательный контроль. 2.4.2. Геномное типирование полиморфных участков 41G>A и 87C>T гена PDE4D Геномное типирование полиморфных участков 41G>A и 87C>T гена PDE4D проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (технология TaqMan). Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера; 2,5 мкл 25 мМ MgCl2, 2,5 мкл 2,5 мМ раствора каждого dNTP; 10 пМ каждого праймера; 4 пМ каждого зонда; 0,25 ед.HotTaqполимеразы; 0.1–0.2 мкг геномной ДНК и деионизированной воды до 25 мкл. Для анализа полиморфного участка 41G>A гена PDE4D (rs152312) использовали праймеры: 5’-CCACTAACGCGTCATCTAGCATTA-3’ (прямой) и 5’-GAGCCTATTATATGGTGACTGCTCATT-3’ 62 (обратный), а также зонды PDE4D-41-A 5'-TCCCTCCTGACAATT-3' (краситель - FAM, тушитель - BHQ1) и PDE4D-41-G 5'-CCCTCCCGACAATT-3' (краситель - ROX, тушитель - BHQ2). Для анализа полиморфного участка 87C>T гена PDE4D (rs2910829) использовали праймеры: 5’-GTGCTTGCTGGACATTCATAACATC-3’ (прямой) и 5’-TGTTTAAAGATGAGGAAGAATAATGGATGCA-3’ (обратный), а также зонды 3. PDE4D-87-C 5’-CTA GTT TGG GAA ATA TTG TGT-3’ (краситель - FAM, тушитель - BHQ1) и PDE4D-87-T 5’-TCT AGT TTG GGA AAT GTT GTG T-3’ (краситель - ROX, тушитель - BHQ2). Все реагенты фирмы "Синтол". Программа амплификации: 1) 60ºС - 30 сек 2) 95ºС - 10 мин 3) 40 циклов: 95ºС - 15 сек, 56°С (для 41G>A) или 58°С (для 87C>T) – 50 с 4) 25ºС - 2 мин ПЦР проводили в амплификаторе Mx3000P фирмы «Stratagene». 2.4.3. Геномное типирование полиморфного участка −590C>T гена IL4 Для анализа однонуклеотидной замены C на T гена IL-4 фрагмент ДНК длиной 156 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5’-CTAAACTTGGGAGAACATTGTC-3’ (прямой С), 5’-TTCTTACAACACAAAATCAAATCA-3’ (прямой T) 5’-AGTACAGGTGGCATCTTGGAAA-3’ (общий обратный). Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Tris-HCl (pH 9,5), 20 мМ (NH4)2SO4, 1 мМ MgCl2, 0,025% Tween 20, 0,025% NP40, праймеры для выявления аллелей C или T (по 5 пмоль каждого), по 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 ед. Taq-полимеразы и 100-200 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия). Программа амплификации: 1) 95°С - 5 мин 63 2) 10 циклов: 95°С - 1мин; 60°С - 1мин; 72°С - 1мин 3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 56°С - 50 с; 72°С - 50 с. Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой MspI. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 2, где каждому образцу соответствуют две дорожки. Рисунок 2. Пример анализа полиморфизма –590C>T гена IL4. Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелкой показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-4 – образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1 - гетерозигота C/T; 2 - гомозигота T/T; 3, 4 - гомозиготы С/С; «-» - отрицательный контроль. 2.4.4. Геномное типирование полиморфного участка −308A>G гена TNF Для анализа однонуклеотидной замены A на G в положении −308 гена TNF, фрагмент ДНК длиной 230 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5’-AATAGGTTTTGAGGGGCATGA-3’ (прямой A), 5'-ATAGGTTTTGAGGGGCATGG-3’ (прямой G), 5’-CATGAGCTCATCTGGAGGAA-3’ (обратный). Для амплификации фрагмента длиной 577 п.н., служащего внутренним положительным контролем амплификации, использовали общий прямой праймер 5’-AGTCTCCGGGTCAGAATGAA-3’. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 700 мМ Tris-HCI pH 9.5, 200 мМ (NH4)2SO4, 10 64 мМ MgCl2, 0. 25% Tween 20, 0.25% NP-40, праймеры для выявления аллеля C (по 5 пмоль каждого), 0,2 мМ dNTP, 0,5 ед. Taq полимеразы (Sileks, Россия), 0,2 мкг моноклональных антител к активному центру Taq полимеразы и 100-200 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации: 1) 95°С - 5 мин 2) 30 циклов: 92°С - 50 c, 64°С – 1 мин 30 с, 72°С – 1 мин 3) 72°С – 7 мин ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия). Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия (1 мкг/мл). В качестве буфера для электрофореза использовали 1хTBE: 0,89 М Tris-борат; 0,89 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, pH 8.0; состав 5х буфера для нанесения проб: 50% глицерин, по 0.025% бромфенолового синего и ксилолцианола. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК плазмиды pUC19, обработанную рестриктазой MspI. Анализ гелей проводили в системе видеодокументации гелей (UVP ImageSystem). Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 3, где каждому образцу соответствует две дорожки. Рисунок 3. Пример анализа полиморфизма –308A>G гена TNF. Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелками показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1–4 – образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1 – гомозигота A/A; 2 – гомозигота G/G; 3, 4 – гетерозиготы G/A; «-» - отрицательный контроль. 65 2.4.5. Геномное типирование полиморфного участка 252А>G в гене LTA Геномное типирование полиморфного участка 252А>G гена LTA проводили методом анализа ПДРФ рестриктазы NcoI в фрагменте ДНК длиной 419 п.н., амплифицированом c использованием праймеров: 5'-TGCCCGTGCTTCGTGCTTTG-3' (прямой), 5'- GGTGTCATGGGGAGAACCTG -3' (обратный). Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мM Tris-HCl, pH 9,5, 50 мM KCl, 1,5 мM MgCl2, 0,5мM dNTP, 0,5 ед. Taq-полимеразы, праймеры в количестве 10 пмоль каждый и 100 - 200 нг геномной ДНК. Программа амплификации: 45 циклов: 1 мин - 92°С; 1 мин 30 с - 60°С; 2 мин - 72°С. Далее 5 мкл продукта амплификации обрабатывали 5 ед. рестриктазы NcoI (СибЭнзим, Россия) в течение 4 часов и анализировали с помощью электрофореза в 3%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Изображение получали с помощью UVP ImageSystem. Продукты рестрикции разделяли методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-свете. Наличие рестрицированных фрагментов длиной 217 п.н. и 202 п.н. свидетельствовало о присутствии аллеля G, наличие интактного фрагмента длиной 419 п.н. - аллеля A. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 4. Рисунок 4. Пример анализа полиморфизма 252А>G в гене LTA. Фрагменты рестрикции после электрофореза в 3%-ом агарозном геле. Ммаркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелками показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-4 – образцы ДНК: 2 - гомозигота А/А; 3 - гомозигота G/G; 1,4 гетерозиготы A/G; «-» - отрицательный контроль. 66 2.4.6. Геномное типирование полиморфного участка в положении −174G>C промоторной области гена IL6 Для анализа однонуклеотидной замены G на С в промоторной области гена IL6, фрагмент ДНК длиной 230 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием ATGCCAAGTGCTGAGTCACTA-3’ и прямых праймеров: 5’- 5’-TCGAGGGCAGAATGAGCCTC-3’. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала 70 мМ Трис-HCl pH 9.0, 20 мМ (NH4)2SO4, 1.0 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 0.2 мМ каждого dNTP, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.5 е.а. Taq-полимеразы (Sileks, Россия) и 100-200 нг ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации: 1) 94°С - 5 мин 2) 30 циклов: 94°C - 1 мин; 58°С - 1 мин; и 72°С - 1 мин; 3) 72°С - 7 мин. ПЦР проводили в амплификаторе Genius (Techne, Великобритания). Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромида этидия. (1 мкг/мл). В качестве буфера для электрофореза использовали 1хTBE: 0.89 М Трис-борат; 0.89 М борная кислота; 0.002 М ЭДТА, pH 8.0; состав 5х буфера для нанесения проб: 30% глицерин, по 0.025% бромфенолового синего и ксиленцианола. В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК плазмиды pUC19, обработанную рестриктазой MspI. По 5 мкл полученного продукта амплификации обрабатывали 5 ед. рестриктазы NlaIII (Biolabs) в течение 5 часов в реакционном буфере, поставляемом производителем фермента, при 37°С. Продукты рестрикции разделяли методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-свете. Наличие рестрикционных фрагментов длиной 121 п.н. и 109 п.н. свидетельствовало о присутствии аллеля C, наличие интактного фрагмента длиной 230 п.н. - аллеля G. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 5. 67 a b Рисунок 5. Пример анализа полиморфизма −174G>C гена IL6. a. схема набора рестрикционных фрагментов, характеризующих рассматриваемый полиморфизм. b. Фрагменты рестрикции после электрофореза в 3%-ом агарозном геле. Ммаркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелками показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-9 – образцы ДНК: 1, 5, 7 – гомозиготы G/G; 2, 3 – гомозиготы C/C; 4, 8, 9 – гетерозиготы G/C; «-» - отрицательный контроль. 2.4.7. Геномное типирование полиморфного участка 874A>T гена IFNG Для анализа однонуклеотидной замены A на T в положении 874 гена IFNG фрагмент ДНК длиной 262 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'TTCTTACAACACAAAATCAAATCA-3' (прямой A), 5'- TTCTTACAACACAAAATCAAATCT-3' (прямой T), 5'- GTTGCTCACTGGGATTTTGG-3' (обратный). Для амплификации фрагмента длиной 398 п.н., служащего внутренним положительным контролем амплификации, дополнительно использовали общий обратный праймер 5'TCAACAAAGCTGATACTCCA-3'. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 700 мМ Tris-HCl pH 9,5, 200 мМ (NH4)2SO4, 10 мМ MgCl2, 0,25% Tween 20, 0,25% NP-40, праймеры для выявления аллеля C (по 5 пмоль каждого), 0,2 мМ dNTP, 0,5 ед. Taq полимеразы (Sileks, Россия), 0,2 мкг 68 моноклональных антител к активному центру Taq полимеразы и 100-200 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации: 1) 95°С - 5 мин 2) 10 циклов: 95°С – 1мин; 62°С – 1мин; 72°С - 1мин. 3) 20 циклов: 95°С – 30 с; 56°С – 50 с ; 72°С – 50 с. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия). Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия (1 мкг/мл). В качестве буфера для электрофореза использовали 1хTBE: 0,89 М Tris-борат; 0.89 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, pH 8.0; состав 5х буфера для нанесения проб: 50% глицерин, по 0,025% бромфенолового синего и ксилолцианола. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК плазмид pUC19, обработанную рестриктазой MspI. Анализ гелей проводили в системе видеодокументации гелей (UVP ImageSystem). Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 6. Рисунок 6. Пример анализа полиморфизма 874A>T гена IFNG. Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелками показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-4 –образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1, 3 - гомозиготы T/T; 2 - гомозигота A/A; 4 - гетерозигота A/T, «-» - отрицательный контроль. 69 2.4.8. Геномное типирование полиморфного участка −509С>Т в гене TGFB1 Для анализа однонуклеотидной замены C на T в положении −509 промоторной области гена TGFB1 фрагмент ДНК длиной 265 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-GGGCAACAGGACACCTGAA-3' (SSP A), 5'GGGCAACAGGACACCTGAG-3' (SSP G) и общего праймера 5'- AAGGCATGGCACCGCTTCTG-3'. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала70 мМ Трис-HCI pH 9.0, 20 мМ (NH4)2SO4, 1.0 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq-полимеразы и 100-200 нг ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации: 1) 95°С - 5 мин 2) 10 циклов: 95°С - 1 мин; 64°С - 1 мин; 72°С - 1 мин 3) 20 циклов: 95°С - 30 сек; 58°С - 50 сек; 72°С - 50 сек ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия) Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромида этидия. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 7, где каждому образцу соответствует две дорожки. Рисунок 7. Пример анализа полиморфизма –509C>T гена TGFB1.Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелкой показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-5 –образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1 70 гетерозигота С/T; 2, 4, 5 - гомозигота T/T; 3 - гомозигота С/С; «-» - отрицательный контроль. 2.4.9. Геномное типирование полиморфного участка 869T>C в гене TGFB1 Анализ полиморфного участка 869T>C гена TGFB1 проводили методом ПЦР-SSP. Фрагмент ДНК длиной 283 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-AGCAGCGGTAGCAGCAGCA-3' (SSP T), 5'-GCAGCGGTAGCAGCAGCG3'(SSP C) и общего праймера 5'-CTACCTTTTGCCGGGAGACC-3'. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала 70 мМ Tris-HCI pH 9.0, 20 мМ (NH4)2SO4, 1.0 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq-полимеразы и 100-200 нг ДНК, минеральное масло. Программа амплификации: 1) 95°С - 5 мин, 2) 10 циклов: 95°С - 1 мин; 64°С - 1 мин; 72°С – 1 мин, 3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 58°С – 50 с; 72°С – 50 с. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО «ДНК Технология», Россия). Присутствие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 8, где каждому образцу соответствует две дорожки. Рисунок 8. Пример анализа полиморфизма 869T>C гена TGFB1. Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелкой 71 показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-5 - образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1-2 гомозигота T/T; 3-4 - гетерозиготы C/T; 5 - гомозигота С/С; «-» - отрицательный контроль. 2.4.10. Геномное типирование полиморфного участка 915G>C в гене TGFB1 Анализ полиморфного участка 915G>C гена TGFB1 проводили методом ПЦР-SSP. Амплифицировали фрагмент ДНК длиной 125 п.н. с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-TGGTGCTGACGCCTGGCCG-3' (SSP G), 5'TGGTGCTGACGCCTGGCCC-3'(SSP C) и общего праймера 5'- GGCGAGCCGCAGCTTGGACA-3'.. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала 70 мМ Tris-HCI pH 9.0, 20 мМ (NH4)2SO4, 1.0 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq-полимеразы и 100-200 нг ДНК, минеральное масло. Программа амплификации: 1) 95°С - 5 мин, 2) 10 циклов: 95°С - 1 мин; 64°С - 1 мин; 72°С – 1 мин, 3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 58°С – 50 с; 72°С – 50 с. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО «ДНК Технология», Россия). Присутствие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 9, где каждому образцу соответствует две дорожки. Рисунок 9. Пример анализа полиморфизма 915G>C гена TGFB1. Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной 72 массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелкой показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-5 – образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1,2гомозиготы G/G; 3,4 - гетерозиготы C/G; 5 – гомозигота С/С; «-» - отрицательный контроль. 2.5. Статистический анализ У всех индивидов, составивших контрольную группу и группу больных, определяли частоты аллелей, частоты носительства аллелей и генотипов. Анализ отклонения наблюдаемых частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга и анализ неравновесия по сцеплению (LD) проводили с использованием свободно распространяемой программы Haploview 4.0 [423]. Сравнение частот аллелей, частот носительства аллелей и генотипов у больных ИИ и в контрольной группе проводили с помощью использованием точного онлайн-версии двустороннего программы критерия GraphPad Instat Фишера [424]. с Силу выявленных ассоциаций оценивали в значениях отношения шансов (ОШ) и его 95%-го доверительного интервала (ДИ) с использованием этой же программы. Статистически значимым считали различие сравниваемых величин при p<0.05, при условии, что значения 95% ДИ для ОШ не пересекают 1. Для сравнения концентраций фибриногена и агрегационной активности тромбоцитов в различных группах использовали непараметрический тест Манна-Уитни. Для выявления значимой связи с заболеванием носительства сочетания аллелей/генотипов («генетических ансамблей»), содержащих n аллелей и/или генотипов (где n≥1), применяли оригинальное ПО APSampler, использующее метод Монте-Карло Марковскими цепями и Байесовскую непараметрическую статистику [122, 422]. APSampler проводит также валидацию результатов работы алгоритма на основе традиционного статистического подхода, для чего в программный комплекс включена программа, которая оценивает значимость ассоциаций каждого найденного основным алгоритмом сочетания аллелей/генотипов с признаком по значениям точного критерия Фишера, ОШ и его 95%-го ДИ. В этом случае мы применяли односторонний точный критерий, 73 поскольку программа APSampler вместе с сочетанием аллелей указывает также и знак наблюдаемой ассоциации. Различие сравниваемых частот значимыми при p<0.05, если значения 95% ДИ для ОШ не пересекали 1. 74 считали 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В работе проведено геномное типирование следующих полиморфных участков: 49A>G гена CTLA4 (цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4), 41G>A и 87C>T гена PDE4D (фосфодиэстераза 4D),−590C>T гена IL4 (интерлейкин 4), −308A>G гена TNF (фактор некроза опухолей), 252G>A гена LTA (лимфотоксин α), −174G>C гена IL6 (интерлейкин 6), 874A>T гена IFNG (интерферон γ), −509С>Т, 869T>C и 915G>C гена TGFB1(трансформирующий фактор роста β1), с последующим сравнением частот аллелей, частот носительства (встречаемости) аллелей и частот генотипов в группе пациентов с ИИ и в контрольной группе, все русские по этнической принадлежности. Для анализа были выбраны функционально значимые полиморфные участки, расположенные в кодирующей или в регуляторной областях анализируемых генов. Возраст является существенным фактором риска мозгового инсульта, причем частота новых случаев инсульта увеличивается более чем в два раза в каждой следующей возрастной группе населения, отличающейся всего на 10 лет [27]. Исходя из предположения, что развитие инсульта в разном возрасте может быть связано с разными генетическими факторами, мы провели анализ распределения носительства аллелей и генотипов того или иного полиморфного участка у больных в зависимости от возраста развития ИИ. При этом больные ИИ были поделены на две подгруппы: лица, получившие ИИ в возрасте старше 60 лет и в возрасте моложе или равном 60 лет. Контрольная группа была разделена по возрасту на аналогичные подгруппы. По эпидемиологическим данным у мужчин инсульт встречается значительно чаще, чем у женщин. Предположив, что это различие может определяться сцепленным с полом генетическим компонентом, мы провели сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков у больных ИИ и здоровых отдельно для мужчин и для женщин. 75 3.1. Анализ ассоциации полиморфных участков исследуемых генов с развитием ИИ Анализ распределения аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков генов при сравнении общих групп больных ИИ и индивидов без ИИ и/или их подгрупп, сформированных в зависимости от пола и возраста, выявил значимые ассоциации с ИИ полиморфных участков −174G>C гена IL6, 41G>A и 87C>T гена PDE4D, 874A>T гена IFNG, а также −509С>Т и 915G>C гена TGFB1 (см. ниже). 3.1.1. Полиморфные участки 49A>G гена CTLA4, −590C>T гена IL4, −308A>G гена TNF, 252 A>G гена LTA Для полиморфных участков 49A>G гена CTLA4,−590C>T гена IL4, −308A>G гена TNF, 252А>G гена LTA, 869T>C гена TGFB1 не было выявлено значимых различий в частотах аллелей, частотах носительства аллелей и генотипов ни в общих группах больных ИИ и контролей (таблица 4), ни в их подгруппах. Таблица 4. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфных участков генов CTLA4, IL4, TNF, LTA у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности Полиморфный Аллели / участок (N человек) генотипы Больные ИИ Группа контроля Аллели, число (%) A 217(54.2) 155(54) G 183(45.8) 133(46) Аллели, число (%) носителей CTLA4 49A>G (200 больных ИИ, A 147(73,5) 113(78) 144 индивидов G 130(65) 102(71) контрольной группы) Генотипы, число (%) носителей A/A 70(35) 42(29) A/G 77(38,5) 71(49) 76 Полиморфный Аллели / участок (N человек) генотипы G/G Больные ИИ Группа контроля 53(26,5) 31(22) Аллели, число (%) С 301(75.6) 216(76.6) T 97(24.4) 66(23.4) Аллели, число (%) носителей IL4 −590C>T (199 больных ИИ, C 183(91) 133(94) 141 индивид T 81(41) 58(41) контрольной группы) Генотипы, число (%) носителей C/C 118(59) 83(59) C/T 65(32) 50(35) T/T 16(9) 8(6) Аллели, число (%) G 348(87) 234(88) A 50(13) 32(12) Аллели, число (%) носителей TNF −308A>G (199 больных ИИ, G 197(98.8) 133(100) 133 индивида A 48(24.2) 32(24) контрольной группы) Генотипы, число (%) носителей G/G 151(75,8) 101(76) A/G 46(23) 32(24) A/A 2(1.2) 0(0) Аллели, число (%) LTA 252 A>G A 295(73.75) 211(75.3) (200 больных ИИ, G 105(26.25) 69(24.6) 140 индивидов контрольной группы) Аллели, число (%) носителей A 190(95) 132(94.4) G 95(47.5) 61(43.6) 77 Полиморфный Аллели / участок (N человек) генотипы Больные ИИ Группа контроля Генотипы, число (%) носителей A/A 105(52.5) 79(56.4) A/G 85(42.5) 53(38) G/G 10(5) 8(5.6) Здесь и далее: значения р < 0.05 и OШ (95% ДИ) для этих случаев не приводятся Отклонений исследуемых распределения полиморфных наблюдаемых участков от частот равновесия генотипов всех Харди-Вайнберга в контрольной группе не наблюдалось. 3.1.2. Полиморфный участок −174G>C гена интерлейкина 6 (IL6) Данные по частоте аллелей, частоте носительства аллелей и генотипов полиморфного участка −174G>C гена IL6, полученные в настоящей работе, представлены в таблице 5. Выявлено, что частота аллеля IL6*–174G значимо выше, а аллеля IL6*–174С - ниже у больных ИИ в сравнении с группой контроля (p=0.037, OШ=1.39, 95%ДИ:1.02-1.91 и OШ=0.71, 95%ДИ:0.52-0.97, соответственно). Частота носительства аллеля IL6*–174G также значимо выше у больных (p=0.003, OШ=2.87, 95%ДИ:1.43-5.75). Это распространенный аллель; он встречается у 93% больных ИИ и 83% индивидов без ИИ. Полученные данные позволяют считать аллель IL6*–174G аллелем риска ИИ. Соответственно, выявлено значимое различие (p=0.003, OШ=0.34, 95%ДИ:0.17-0.69) в частоте генотипа IL6*–174C/C, которая была выше в контрольной группе. При разделении группы больных ИИ и контрольной группы по гендерному признаку между подгруппами больных ИИ мужчин и мужчин из контрольной группы не было выявлено значимых различий в частоте аллелей, частоте носительства аллелей и генотипов. 78 Таблица 5. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка −174G>C гена IL6 у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности Аллели / генотипы С G C G C/C C/G G/G Больные ИИ n=200 Группа контроля n=140 Значение p Аллели, число (%) 141(35) 121(43) 0.037 259(65) 159(57) 0.037 Аллели, число (%) носителей 126(63,2) 96(69) н.з. 186(93) 115(82) 0.003 Генотипы, число (%) носителей 14(7) 25(18) 0.003 113(56,2) 71(51) н.з. 73(36,8) 44(31) н.з. OШ (95% ДИ) 0.71 (0.52-0.97) 1.39 (1.02-1.91) 2.87 (1.43-5.75) 0.34 (0.17-0.69) Здесь и далее: н.з. – не выявлено значимых различий; OШ (95% ДИ) приведены только для значений p < 0.05 (даны жирным шрифтом) В то же время, в подгруппе больных ИИ женщин наблюдалась в сравнении с женщинами из контрольной группы более высокая частота аллеля IL6*–174G (p=0.02, OШ=1.82, 95%ДИ: 1.12-2.97) и носительства этого аллеля (p=0.011, OШ=4.20, 95%ДИ: 1.40-12.40) и соответственно более высокая частота в контрольной группе аллеля IL6*–174C (p=0.02, OШ=0.55, 95%ДИ: 0.33-0.90) и генотипа IL6*–174C/C (p=0.011, OШ=0.23, 95%ДИ: 0.08-0.70) (таблица 6). Таким образом, выявлен половой диморфизм в распределении генотипов гена IL6 у больных ИИ и здоровых. Несмотря на меньшее количество женщин среди больных (77 человек из 200) и среди контролей (62 человек из 140), именно у женщин наблюдаются значимые ассоциации аллелей и генотипов полиморфного участка −174G>C гена IL6 с ИИ. 79 Таблица 6. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка −174G>C гена IL6 у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности в зависимости от гендерного признака Аллели / Мужчины генотипы Больные Группа женщины Значение p OШ (95% ДИ) Больные Группа ИИ контроля ИИ контроля n=123 n=78 n=77 n=62 Значение p ОШ (95% ДИ) Аллели, число (%) C 91(37) 63(40) G 145(63) 93(60) н.з. 50(32) 58(47) 0.02 0.55(0.33-0.90) 104(68) 66(53) 0.02 1.82(1.12-2.97) Аллели, число (%) носителей C 82(67) 52(67) н.з. 45(59) 44(71) н.з. G 114(93) 67(86) н.з. 72(93) 48(77) 0.011 4.20(1.40-12.40) 5(7) 14(23) 0.011 0.23(0.08-0.70) 40(52) 30(48) н.з. 32(41) 18(29) н.з. Генотипы, число (%) носителей C/C 9(7) 11(14) C/G 73(59) 41(53) G/G 41(34) 26(33) н.з. н.з. 80 Больные ИИ были разделены на две подгруппы: лица, перенесшие ИИ в возрасте старше 60 лет и моложе или равном 60 лет. При сравнении с лицами контрольной группы тех же возрастных категорий у пациентов в группе старше 60 лет выявлена позитивная ассоциация с ИИ носительства аллеля IL6*–174G (p=0.003, OШ=3.80, 95%ДИ: 1.60-9.20) и негативная – генотипа IL6*–174C/C (p=0.003, OШ=0.26, 95%ДИ: 0.11-0.62) (таблица 7). Таким образом, результаты, полученные для общих выборок больных ИИ и контрольных индивидов, находятся в полном соответствии с данными для подгрупп, разделенных по полу и возрасту. Во всех случаях более распространенный аллель IL6*–174G является аллелем риска ИИ. При этом наблюдаемые для общей группы больных ИИ и контрольной группы различия в частотах аллелей и генотипов полиморфного участка −174G>C гена IL6 обусловлены в большей степени генетическим статусом женщин, а не мужчин, и проявляются более отчетливо в возрастной подгруппе старше 60 лет. При всех типах анализа носительство аллеля IL6*–174G у русских является фактором риска ИИ с довольно высокими значениями ОШ – от 2.80 до 4.20. Аналогичные результаты были получены для других европеоидов: итальянцев [127, 299], белых североамериканцев [192] и австрийцев [148]. Однако, в большинстве исследований не наблюдали ассоциации полиморфных участков гена IL6 с ИИ, сравнивая общую группу больных с контрольной группой [44, 59, 93, 220], хотя в некоторых из них ассоциация была выявлена при разбиении больных на различные подгруппы, например, по клиническим и лабораторным признакам, по субтипу инсульта и т.д. В английском исследовании Rothwell P.M. выявил ассоциацию генотипа IL6*–174G/G с бессимптомным атеросклерозом сонных артерий [320], одним из ранних факторов риска развития сердечно-сосудистых патологий, в частности, ИИ. Одако, согласно исследованию Tso et al., проведенному у американцев, с бессимптомным атеросклерозом сонных артерий ассоциирован генотип IL6*– 174C/C [372]. 81 Таблица 7. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка −174G>C гена IL6 у лиц русской этнической принадлежности, получивших ИИ в возрасте ≤ 60 лет и >60 лет, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности тех же возрастных категорий Аллели / генотипы лица в возрасте моложе или равном 60 лет Больные Группа ИИ n=67 Значение p ОШ (95% ДИ) лица старше 60 лет Больные Группа контроля ИИ контроля n=67 n=133 n=73 Значение p ОШ (95% ДИ) Аллели, число (%) C 46(34) 56(39) н.з. 95(36) 65(44) н.з. G 88(90) 78(61) н.з. 171(64) 81(56) н.з. Аллели, число (%) носителей C 41(62) 47(72) н.з. 86(65) 49(67) н.з. G 62(94) 58(81) н.з. 124(93) 57(78) 0.003 3.80(1.60-9.20) 9(7) 16(22) 0.003 0.26(0.11-0.62) 77(58) 33(45) н.з. 47(35) 24(33) н.з. Генотипы, число (%) носителей C/C 5(6) 9(19) C/G 36(56) 38(53) G/G 26(38) 20(28) н.з. н.з. 82 Данных об исследовании в русской популяции ассоциации полиморфных вариантов гена IL6 с развитием ИИ в литературе мы не обнаружили. 3.1.3. Полиморфные участки 41G>A и 87C>T гена фосфодиэстеразы 4D (PDE4D) Данные по частоте аллелей, носительству аллелей и генотипов полиморфных участков SNP41G>A и SNP87C>T гена PDE4D, полученные в работе, представлены в таблицах 8 и 9. Значения р, характеризующие различия в частоте носительства аллеля PDE4D*41G и генотипа PDE4D*41А/A достигали уровня значимости (p=0.049), однако значения ДИ при ОШ в обоих случаях пересекали 1 (OШ=0.15 , 95%ДИ: 0.02-1.17 и OШ= 6.78, 95%ДИ: 0.85-54.20, соответственно) (таблица 8). В то же время, частоты носительства аллеля PDE4D*87C (p=0.048, OШ=1.60, 95%ДИ:1.02-2.52) и генотипа PDE4D*87T/T (p=0.048, OШ=0.62 , 95%ДИ: 0.40-0.98) значимо различались у больных ИИ и в контрольной группе по обоим критериям (таблица 9); аллель риска PDE4D*87C встречался у 72% больных ИИ и у 62% индивидов контрольной группы. Таблица 8. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка 41G>A гена PDE4D у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности Аллели / генотипы G A G A G/G A/G A/A Больные ИИ n=200 Группа контроля Значение p n=145 Аллели, число (%) 350(87,5) 265(91,4) н.з. 50(12,5) 25(8,6) н.з. Аллели, число (%) носителей 191(95,5) 144(99,31) 0.049 41(20,5) 24(16,55) н.з. Генотипы, число (%) носителей 159(79,5) 121(83,45) н.з. 32(16) 23(15,86) н.з. 9(4,5) 1(0,69) 0.049 83 ОШ (95% ДИ) 0.15 (0.02-1.17) 6.78 (0.85-54.20) Таблица 9. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка 87C>T гена PDE4D у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности Аллели / генотипы T C T C T/T C/T C/C Группа контроля Значение p n=146 Аллели, число (%) 217(54,25) 174(59,6) н.з. 183(45,75) 118(40,4) н.з. Аллели, число (%) носителей 161(80,5) 118(80) н.з. 144(72) 90(62) 0.048 Генотипы, число (%) носителей 56(28) 56(38) 0.048 105(52,5) 62(42) н.з. 39(19,5) 28(20) н.з. Больные ИИ n=200 ОШ (95% ДИ) 1.6 (1.02-2.52) 0.62 (0.40-0.98) При разделении группы больных ИИ и контрольной группы по гендерному признаку между подгруппами мужчин и женщин не было выявлено значимых различий в частоте аллелей, частоте носительства аллелей и генотипов обоих полиморфных участков. Было также проведено сравнение частот аллелей, носительства аллелей и генотипов SNP41G>A и SNP87C>T гена PDE4D у больных ИИ и контрольной группой в разных возрастных группах. У пациентов, перенесших ИИ в возрасте не старше 60 лет частота аллеля PDE4D*41A значимо выше, а аллеля PDE4D*41G - ниже у больных ИИ в сравнении с группой контроля того же возраста (p= 0.0063, OШ= 1.54, 95%ДИ: 1.20-1.98, и OШ= 0.64, 95%ДИ: 0.50-0.83), также нами была выявлена положительная ассоциация с ИИ носительства аллеля PDE4D*41A (p=0.015, OШ=1.58, 95%ДИ: 1.15-2.2) и негативная ассоциация генотипа PDE4D*41G/G (p= 0.015, OШ= 0.63, 95%ДИ: 0.45-0.86) (таблица 10). Таким образом, мы наблюдали, что у пациентов, получивших ИИ в возрасте до 60 лет включительно, аллель PDE4D*41A является значимым аллелем риска ИИ, хотя в 84 общих группах больных ИИ и контролей различия в частоте носительства этого аллеля не достигали уровня значимости по критерию значений ДИ при ОШ. Что касается полиморфного участка SNP87C>T гена PDE4D, то при сравнении частот аллелей, носительства аллелей и генотипов у лиц, получивших ИИ в возрасте старше 60 лет или 60 лет и младше, с лицами контрольной группы тех же возрастных категорий значимых различий выявлено не было. Наши данные по анализу ассоциации полиморфных участков SNP41G>A и SNP87C>T гена PDE4D с ИИ в целом находятся в хорошем соответствии с результатами, полученными также на русской популяции, но для больных с диагнозом «острый инсульт» [10]. В этой работе выявлена ассоциация с заболеванием генотипов PDE4D*41A/A и PDE4D*41A/G, однако для полиморфного участка SNP87C>T гена PDE4D не наблюдали значимых различий. Как упоминалось выше выбранные полиморфные участки SNP87C>T и SNP41G>A гена PDE4D относятся к гаплоблокам A и B, соответственно, кроме того, исследования на различных популяциях не выявили между ними сцепления [214, 350, 354]. Полученные данные согласуются с результатами ряда исследований, выполненных для других популяций. В исследовании Milton et al. на австралийской популяции была показана предрасполагающая роль носительства аллеля PDE4D*41A в развитии атеротромботического типа ИИ [268]. В исследованиях на индийской популяции Munshi et al. выявили ассоциацию генотипа PDE4D*41A/A с фенотипическими характеристиками инфаркта мозга: его локализацией, размерами и тяжестью течения у курящих больных сахарным диабетом [275, 277]. В то же время, в исследовании на молдавской популяции данных об ассоциации с ИИ полиморфных участков SNP41G>A и SNP87C>T гена PDE4D получено не было [8]. В корейской и японской популяциях также не было обнаружено ассоциации SNP 41G>A гена PDE4D с риском развития ИИ ни в общей выборке, ни при разделении выборки по полу и возрасту, по наличию сопутствующих заболеваний (артериальная гипертензия, сахарный диабет) и в зависимости от курения [204, 259]. 85 Таблица 10. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка 41G>A гена PDE4D у лиц русской этнической принадлежности, получивших ИИ в возрасте ≤ 60 лет и >60 лет, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности тех же возрастных категорий Аллели / генотипы A G A G A/A A/G G/G лица в возрасте моложе или равном 60 лет лица старше 60 лет Группа Группа Больные Больные контроля Значение p ОШ (95% ДИ) контроля Значение p ОШ (95% ДИ) n=67 n=133 n=69 n=76 Аллели, число (%) 25(18) 10(7) 42(16) 15(10) н.з. 0.0063 1.54 (1.2-1.98) 110(82) 128(93) 137(90) н.з. 0.0063 0.64 (0.50-0.83) 224(84) Аллели, число (%) носителей 22(32) 10(14) 36(27) 14(18) н.з. 0.015 1.58 (1.15-2.2) 64(96) 69(100) н.з. 127(95) 75(99) н.з. Генотипы, число (%) носителей 3(4) 0(0) н.з. 6(5) 1(1) н.з. 19(28) 10(14) н.з. 30(22) 13(17) н.з. 45(68) 59(86) 97(73) 62(82) н.з. 0.015 0.63 (0.45-0.86) 86 3.1.4. Полиморфные участки −509С>Т, 869T>C и 915G>C гена трансформирующего фактора роста β1 (TGFB1) При сравнении частот носительства аллелей и генотипов полиморфного участка −509С>Т гена TGFB1 (таблица 11) выявлено значимое различие (p=0.02, OШ=0.43, 95%ДИ: 0.20-0.92) в частоте носительства аллеля TGFB1*−509C, которая в контрольной группе была выше. Соответственно, в группе больных ИИ генотип TGF*−509T/T встречался значимо чаще, чем в контроле (p=0.02, OШ=2.30, 95%ДИ: 1.08-4.89). Аналогичные данные об ассоциации аллелей SNP TGFB1*−509C>Т с ИИ получены в ряде исследований. В исследовании Sie et al. на голландской популяции было выявлено, что носители аллеля TGFB1*−509T и генотипа TGFB1*−509C/T имеют повышенный риск развития заболевания [344]. Исследование на китайской популяции также выявило взаимосвязь полиморфного участка −509С>Т гена TGFB1 с риском развития атеросклеротического инсульта; в группе больных инсультом была значимо выше частота генотипа TGFB1*−509T/T и аллеля TGFB1*−509T. Таблица 11. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфных участков −509С>Т, 869T>C и 915G>C гена TGFB1 у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности Полиморфный Аллели / участок генотипы Больные Группа ИИ контроля n=200 n=146 Значение p ОШ (95% ДИ) Аллели, число (%) C T TGFB1 −509С>Т 257(64.25) 143(35.75) 202(69) 90(31) н.з. н.з. Аллели, число (%) носителей C T 171(85.5) 114(57) 136(93) 80(55) 0.02 н.з. 0.43(0.20-0.92) Генотипы, число (%) носителей C/C C/T T/T 86(43) 85(42,5) 29(14.5) 66(45) 70(48) 10(7) 87 н.з. н.з. 0.02 2.30 (1.08-4.89) Полиморфный Аллели / участок генотипы Больные Группа ИИ контроля n=200 n=146 Значение p ОШ (95% ДИ) Аллели, число (%) C T 175(43.75) 225(56.25) 139(48) 153(52) н.з. н.з. Аллели, число (%) носителей TGFB1 869T>C C T 132(66) 157(78.5) 106(73) 113(77) н.з. н.з. Генотипы, число (%) носителей C/C C/T T/T 43(21,5) 89(44,5) 68(34) 33(23) 73(50) 40(27) н.з. н.з. н.з. Аллели, число (%) С G 24(6) 376(94) C G 24(12) 200(100) 28(10) 264(90) н.з. н.з. Аллели, число (%) носителей TGFB1 915G>C 27(19) 145(99) н.з. н.з. Генотипы, число (%) носителей C/C C/G G/G 0(0) 24(12) 176(88) 1(1) 26(18) 119(81) н.з. н.з. н.з. При этом индивиды, несущие генотип TGFB1*−509T/T, имели более высокое содержание триглицеридов в плазме крови. В исследовании Oda et al. показано, что аллель TGFB1*−509T является фактором риска атеросклероза мозговых артерий у японцев в пожилом возрасте [286]. Напротив, исследование на шведской популяции выявило связь аллеля TGFB1*−509C с повышенным уровнем ЛПНП у девочек подросткового возраста [284]. Что касается полиморфных участков 869T>C и 915G>C гена TGFB1, то достоверных отличий в частотах аллелей, а также в частотах носительства аллелей и генотипов между группами больных ИИ и здоровыми индивидами обнаружено не было. Однако, при разделении общей группы по гендерному признаку (таблица 12) в подгруппе больных ИИ мужчин выявлена более высокая частота аллеля TGFB1*915G (p=0.0032, OШ=3.23, 95%ДИ: 1.47-7.1), и, 88 соответственно, аллель TGFB1*915С чаще встречался в группе контроля (p=0.0032, OШ=0.31, 95%ДИ: 0.14-0.68). Наблюдалась также более высокая частота встречаемости аллеля TGFB1*915C в контрольной группе мужчин (p=0.0022, OШ=0.28, 95%ДИ: 0.12-0.63) и генотипа TGFB1*915G/G у мужчин, перенесших ИИ (p=0.0022, OШ=3.58, 95%ДИ: 1.59-8.14). Данных литературы об ассоциации данного полиморфного участка с ИИ обнаружено не было, но в исследовании Wang Y. et al. была показана ассоциация генотипа TGFB1*915G/G с мерцательной аритмией, являющейся одним из факторов ИИ [390]. Ассоциации двух других исследованных полиморфных участков гена TGFB1 с ИИ в группах мужчин и женщин не было выявлено. При разделении общей группы по возрасту ни для одного из выбранных полиморфных участков не было выявлено значимых ассоциаций с ИИ. Учитывая, что выбранные полиморфные участки расположены в гене достаточно близко друг от друга, а также данные об их неравновесном сцеплении, полученные в различных этнических группах, в том числе и для европеоидов [344, 357, 363], мы провели анализ возможных гаплотипов гена TGFB1 в контрольной группе русской этнической принадлежности [6]. 89 Таблица 12. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфных участков −509С>Т, 869T>C и 915G>C гена TGFB1 у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности в зависимости от гендерного признака ПолиморфАллели / Группа ный генотипы больных участок n=123 мужчины Группа Значение контроля p n=83 ОШ (95% ДИ) Группа больных n=77 женщины Группа Значение контроля p n=63 Аллели, число (%) TGFB1 −509С>Т TGFB1 869T>C C T 156(63) 90(37) 116(70) 50(30) C T 105(85.5) 72(58.5) 77(92.8) 44(53) C/C C/T T/T 51(41.5) 54(44) 18(14.5) 39(47) 38(45.8) 6(7.2) C T 107(43.5) 139(56.5) 72(43.3) 94(56.7) C T 79(64.2) 95(76.7) 56(67.4) 67(80.8) C/C C/T T/T 28(22.7) 51(41.5) 44(35.2) 16(19.2) 40(48.2) 27(32.6) н.з. 101(65.6) н.з. 53(34.4) Аллели, число (%) носителей н.з. 66(85.45) н.з. 42(54.55) Генотипы, число (%) носителей н.з. 35(45.45) н.з. 31(40) н.з. 11(14.55) Аллели, число (%) н.з. 68(44.15) н.з. 86(55.85) Аллели, число (%) носителей н.з. 53(68.5) н.з. 62(80.5) Генотипы, число (%) носителей н.з. 15(19.5) н.з. 38(49) н.з. 24(31.5) 90 86(68.25) 40(31.75) н.з. н.з. 59(93.6) 36(57.2) н.з. н.з. 27(42.8) 32(50.8) 4(6.4) н.з. н.з. н.з. 67(53) 59(47) н.з. н.з. 50(79.4) 46(73) н.з. н.з. 17(27) 33(52.4) 13(20.6) н.з. н.з. н.з. ОШ (95% ДИ) ПолиморфАллели / Группа ный генотипы больных участок n=123 C G 10(4) 236(96) мужчины Группа Значение контроля p n=83 20(12) 146(88) 0.0032 0.0032 ОШ (95% ДИ) Аллели, число (%) 0.31(0.14-0.68) 3.23(1.47-7.10) Группа больных n=77 14(9) 140(91) женщины Группа Значение контроля p n=63 8(6) 118(94) н.з. н.з. 7(12) 62(98) н.з. н.з. 1(2) 6(10) 56(88) н.з. н.з. н.з. Аллели, число (%) носителей TGFB1 915G>C C G 10(8) 123(100) 20(24) 83(100) C/C C/G G/G 0(0) 10(8) 113(92) 0(0) 20(24) 63(76) 14(18) 0.0022 0.28(0.12-0.63) н.з. 77(100) Генотипы, число (%) носителей н.з. 0(0) н.з. 14(18) 63(82) 0.0022 3.58(1.59-8.14) 91 ОШ (95% ДИ) Расчет попарного неравновесия по сцеплению между полиморфными участками −509C>Т, 869T>C и 915G>C гена TGFB1 выявил слабое сцепление (r2 < 0.05 для всех пар); не выявлено ни одного распространенного гаплотипа, в который бы входили рассматриваемые аллели выбранных SNP. Можно предположить, что наблюдаемые различия связаны с этноспецифичностью гаплоблоков [109].Таким образом, можно заключить, что аллели выбранных полиморфных участков гена TGFB1 вносят независимый вклад в предрасположенность к ИИ. 3.1.5. Полиморфный участок 874A>T гена интерферона гамма (IFNG) Достоверных отличий в частотах аллелей, а также в частотах носительства аллелей и генотипов полиморфного участка 874A>T гена IFNG между группами больных ИИ и здоровыми индивидами, а также при разделении по гендерному признаку обнаружено не было (таблица 13А). Однако, при сравнении этих характеристик в группах больных ИИ и здоровых индивидов в возрасте старше 60 лет были получены данные, свидетельствующие об ассоциации данного полиморфного участка с «пожилым» ИИ (таблица 13Б): аллель IFNG*874T и его носительство были положительно ассоциированы с ИИ (p=0.014, OШ=1.74, 95%ДИ: 1.13-2.67 и p=0.027, OШ=2.03, 95%ДИ: 1.10-3.73, соответственно), тогда как для аллеля IFNG*874A и генотипа IFNG*874A/A наблюдалась негативная ассоциация с ИИ (p=0.014, OШ= 0.57, 95%ДИ: 0.37-0.88 и p=0.027, OШ= 0.49, 95%ДИ: 0.26-0.90). Для возрастных групп до 60 лет включительно значимых ассоциаций не наблюдали. Таким образом, наше исследование показало, что аллель IFNG*874T ассоциирован с развитием ИИ в возрасте старше 60 лет. Известно, что интерферон гамма способен подавлять синтез коллагена гладкомышечными клетками и увеличивать синтез металлопротеиназ макрофагами. Высказывалось предположение, что этот цитокин активно участвует в атерогенезе, в частности, атеросклеротической бляшки [228]. 92 в реорганизации матрикса Таблица 13. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка 874A>T гена IFNG у лиц русской этнической принадлежности при сравнении общей группы больных, перенесших ИИ, c контрольной группой той же этнической принадлежности (А) и больных, получивших ИИ в возрасте ≤ 60 лет и >60 лет, в сравнении c контрольными группами тех же возрастных категорий (Б). А. Общие группы Аллели / генотипы A T A T A/A A/T T/T Больные ИИ n=200 Группа контроля n=140 Аллели, число (%) 215(55.7) 157(61.8) 171(44.3) 97(38.2) Аллели, число (%) носителей 152(78.6) 107(84) 130(67.4) 77(61) Генотипы, число (%) носителей 63(32.6) 50(39) 89(46) 57(45) 41(21.4) 20(16) Б.Подгруппы лиц разного возраста Аллели / генотипы A T A T A/A A/T T/T лица в возрасте моложе или равном 60 лет Группа Группа Значение ОШ Группа больных n=67 контроля n=57 p (95% ДИ) больных n=126 Аллели, число (%) 81(60) 64(56) н.з. 134(53) 53(40) 26(44) н.з. 118(47) Аллели, число (%) носителей 54(83) 45(79) н.з. 98(77) 40(58) 38(67) н.з. 90(72) Генотипы, число (%) носителей 27(42) 19(33) н.з. 36(28) 27(41) 26(46) н.з. 62(49) 13(17) 12(21) н.з. 28(23) 93 лица старше 60 лет Группа Значение p контроля n=70 ОШ (95% ДИ) 93(66) 47(34) 0.014 0.014 0.57 (0.37-0.88) 1.74 (1.13-2.67) 62(88) 39(56) н.з. 0.027 2.03 (1.10-3.73) 31(44) 31(44) 8(12) 0.027 н.з. н.з. 0.49 (0.26-0.90) Известно также, что полиморфизм участка 874A>T гена IFNG влияет на уровень продукции этого цитокина, причем носительство аллеля IFNG*874T коррелирует с высоким уровнем продукции IFNγ [120, 300, 339, 378]. Следовательно, выявленная нами ассоциация аллеля IFNG*874T с ИИ может определяться ролью интерферона гамма в патогенетических событиях, приводящих к ИИ. Данных в литературе об ассоциации аллелей SNP 874A>T гена IFNG с ИИ мы не нашли. Сводные данные по индивидуальным аллелям риска, выявленным нами при различных типах сравнения больных ИИ и индивидов контрольной группы (общие группы, только мужчины, только женщины, отдельно лица не старше 60 лет и лица старше 60 лет), представлены в таблице 14. Таблица 14. Индивидуальные аллели риска, выявленные при сравнении больных ИИ и индивидов контрольной группы: общих групп, только мужчин, только женщин, отдельно лиц не старше 60 лет и лиц старше 60 лет Аллель Общие Полиморфизм риска группы ИИ IL6 −174G>C G PDE4D 41G>A A PDE4D 87C>T C TGFB1 −509С>Т Т TGFB1 915G>C G IFNG 874A>T Т Мужчины + Женщины Лица не старше 60 лет + Лица старше 60 лет + + + + + + Примечание: «+» показывает, при каком типе сравнения больных ИИ с индивидами контрольной группы выявлен аллель риска. При сравнении общей группы больных и контрольной группы показана ассоциация с ИИ генов IL6, PDE4D и TGFB1. При этом аллель IL6*−174G – единственный из всех – был выявлен как аллель риска не только в общей группе, но и при разбиении как по полу (у женщин), так и возрасту (у лиц старше 60 лет). Аллель PDE4D*41G оказался аллелем риска только в подгруппе лиц не старше 94 60 лет, а аллель PDE4D*87С – только в общей группе. Что касается гена TGFB1, то в общей группе была выявлена ассоциация ИИ с аллелем TGFB1*−509Т, а при разделении по полу – с аллелем TGFB1*915G у мужчин. Для гена IFNG наблюдали ассоциацию с ИИ только в подгруппе лиц старше 60 лет. Таким образом, выводы об ассоциации генов IL6, PDE4D и TGFB1 (но не IFNG) с ИИ воспроизведены при использовании в ходе нашего исследования сравнений разного типа. При разделении больных ИИ и индивидов контрольной группы по полу ассоциации достигали уровня значимости только в одной из гендерных групп в двух случаях (для аллеля IL6*−174G у женщин и TGFB1*915G у мужчин), причем для полиморфизма TGFB1 915G>C в общей группе, несмотря на увеличение выборки, значимых различий не наблюдалось (см. таблицу 14). Подобные различия в ассоциации с ИИ у мужчин и женщин были выявлены в различных исследованиях в различных популяциях [159, 167, 227, 234, 253, 280, 364]. Эти результаты могут быть интерпретированы как следствие различий в проявлении генетической предрасположенности к ИИ у мужчин и женщин и объясняться гормональными различиями полов [312]. Известно, что для женщин характерно более позднее развитие ИИ, что может быть обусловлено способностью эстрогенов поддерживать в оптимальных значениях концентрацию липидов и влиянием эстрогенов на макрофаги, дендритные клетки и клетки эндотелия с дальнейшим повышением пролиферации, снижении адгезии, понижением уровня перекисного окисления и воспаления [174, 283]. Для всех анализированных генов, кроме TGFB1, факторы риска по-разному проявлялись в разных возрастных группах (см. таблицу 14). Аллели IL6*−174G и IFNG*874T были ассоциированы с развитием ИИ у лиц старше 60 лет, а аллель PDE4D*41A – в более «молодой» подгруппе. Эти результаты совпадают с данными, полученными для ИИ в других исследованиях [90, 114, 196, 266, 277, 400]. Они могут объясняться тем, что механизмы ишемического поражения мозга различаются у людей пожилого и молодого возраста [4], причем в отличии от 95 пожилого возраста, когда основными факторами риска являются атеросклероз и гиперхолестеринемия, у лиц среднего возраста основную роль играет АГ [65]. 3.2 Анализ ассоциации полиморфизма –174G>C гена IL6 с уровнями фибриногена и показателями тромбоцитарного гемостаза в плазме крови Исходя из данных, что аллельный полиморфизм гена IL6 влияет на уровень продукта [386], а IL-6 регулирует синтез фибриногена [115], мы провели сравнение уровня фибриногена у носителей различных вариантов полиморфного участка −174G>C гена IL6. Анализ проводили в объединенной группе из 127 человек, независимо от их статуса больной ИИ/здоровый. Сравнение по критерию Манна-Уитни не выявило значимых различий в концентрациях фибриногена в плазме крови у носителей различных аллелей и генотипов полиморфного участка −174G>C (рис.1). Не наблюдали также значимых отличий уровня фибриногена у носителей аллеля IL6*−174G (в гомо- или гетерозиготном состоянии, генотипы IL6*−174G/G + IL6*−174C/G) и аллеля IL6*−174C (генотипы IL6*−174C/C + IL6*−174C/G) от неносителей этих аллелей. Рисунок 1. Сравнение концентраций фибриногена в плазме крови носителей различных аллелей и генотипов полиморфного участка −174G>C гена IL6 среди 127 индивидов (независимо от статуса больной/здоровый) 96 Анализ для той же группы агрегации тромбоцитов под воздействием адреналина (% изменения оптической плотности), размера тромбоцитарных агрегатов (мм) и скорости агрегации тромбоцитов (α) также не выявил значимых различий между сравниваемыми группами (таблица 15). Таблица 15. Агрегация тромбоцитов у носителей различных аллелей и генотипов полиморфного участка −174G>C гена IL6 среди 127 индивидов (независимо от статуса больной/здоровый) Полиморфный вариант гена IL6 Показатель А тр D тр α С/С N=17 55.5±23.4 7.1±1.7 52.6±17.7 С/G N=74 64.2±21.8 7.3±2.2 57.6±20.7 G/G N=36 57.2±23.6 7.2±1.8 51.7±21.8 C N=91 62.5±22.3 7.3±2.1 56.7±20.2 G N=110 61.8±22.5 7.3±2.0 55.7±21.2 Примечание: А тр - агрегация тромбоцитов под воздействием адреналина, D тр - размер тромбоцитарных агрегатов, α - скорость агрегации тромбоцитов 3.3. Анализ ассоциации сочетаний аллелей и генотипов полиморфных участков генов CTLA4, PDE4D, IL4, TNF, LTA, IL6, IFNG, TGFB1 с использованием алгоритма APSampler В настоящей работе с помощью динамического метода Монте-Карло с использованием программного обеспечения APSampler [122, 422], обладающего высокой статистической мощностью анализа [247], был проведен анализ совместного вклада в предрасположенность к ИИ возможных сочетаний аллелей или генотипов исследуемых генов. Анализ проводили как на полных выборках больных ИИ и индивидов контрольной группы, так и в подгруппах, сформированных по половому и гендерному признакам: только мужчин, только женщин, отдельно лиц не старше 60 лет и лиц старше 60 лет. Ассоциации с ИИ, выявленные на полных выборках больных ИИ и индивидов контрольной группы, приведены в таблице 16. Обнаружены сочетания из двух и трех аллелей/генотипов различных генов, частота носительства которых 97 значимо (р<0.01, 95% ДИ для ОШ не пересекает 1), различается у больных ИИ и в контрольной группе. Эти сочетания отвечают критерию минимального множества аллелей как фактора генетического риска [123]. Под этим понимается, что любой входящий в сочетание аллель/генотип характеризуется меньшей значимостью ассоциации, чем сочетание, а добавление к сочетанию каких-либо дополнительных аллелей не увеличивает значимости его ассоциации с заболеванием (т.е. не уменьшает величины р). Аллели/генотипы полиморфных участков −174G>C гена IL6, 87C>T и 41G>A гена PDE4D и −509С>Т гена TGFB1, поодиночке значимо ассоциированные с ИИ при сравнении общих групп (см. раздел 3.1), выявлены в составе таких сочетаний с аллелями/генотипами других генов, носительство которых в одиночку при таком сравнении не было значимо ассоциировано с ИИ. Это гены IFNG, CTLA4, IL4 и TNF. Кроме того, в состав ассоциированных с ИИ сочетаний вошел еще один полиморфный участок гена TGFB1 - 915G>C. С риском развития ИИ наиболее сильно ассоциировано сочетание IL6*−174G + TGFB1*915G/G (р=0.0003, ОШ=2.44, 95% ДИ: 1.47-4.02). Два других предрасполагающих сочетания несут аллель PDE4D*87С. Это сочетания PDE4D*87С + TGFB1*−509Т/Т (р=0.004, ОШ=4.16, 95% ДИ: 1.4-12.4) и PDE4D*87С + TGFB1*915G/G (р=0.01, ОШ=1.7, 95% ДИ: 1.1-2.6). Большая часть выявленных сочетаний, чаще встречающихся в контрольной группе и таким образом отрицательно ассоциированных с ИИ (ОШ<1), несет генотип IL6*−174C/C или аллель - TGFB1*−509С. Как видно из таблицы 16, наиболее значимыми протективными сочетаниями являются IL6*−174C/C + IFNG*874A (р=0.0002, ОШ=0.23, 95% ДИ: 0.10-0.52) и IL6*−174C/C + TNF*−308G (р=0.0008, ОШ=0.3, 95% ДИ: 0.16-0.63). Сочетания, содержащие аллель TGFB1*−509С, имеют несколько большую величину р (от 0.0011 до 0.0078) и, следовательно, менее выраженное протективное действие. 98 Таблица 16. Ассоциация сочетаний аллелей и генотипов полиморфных участков исследованных генов при сравнении больных ИИ и индивидов контрольной группы (общие группы) Носители (%) /неносители (%) сочетания Аллели/генотипы в составе сочетания IL6 −174G>C PDE4D 41G>A PDE4D 87C>T TGFB1 −509С>Т * * * * TGFB1 915G>C IFNG 874A>T CTLA4 49A>G IL4 −590C>T TNF −308A>G ИИ n=200 Контроли n=146 Величина р ОШ (95% ДИ) Носительство сочетания из двух аллелей/генотипов С/C A 9(5)/184(95) 22(17)/104(83) 0.0002 163(82)/36(18) 91(65)/49(35) 0.0003 14(7)/184(93) 25(19)/104(81) 0.0008 C 12(8)/187(92) 24(17)/116(83) 0.0011 C 163(81)/37(19) 134(92)/11(8) 0.002 T/T 21(11)/179(89) 4(3)/142(97) 0.004 127(63)/73(37) 74(51)/72(49) 0.010 154(78)/44(22) 114(89)/14(11) 0.0061 114(57)/85(43) 99(71)/41(29) 0.0078 G G/G C/C G C/C G C C G/G 0.23 (0.10-0.52) 2.44 (1.47-4.02) 0.31 (0.16-0.63) 0.31 (0.15-0.64) 0.36 (0.17-0.73) 4.16 (1.40-12.40) 1.7 (1.10-2.60) Носительство сочетания из трех аллелей C C C A C Жирным шрифтом выделены аллели/генотипы и сочетания с ОШ>1. 99 G 0.43 (0.22-0.82) 0.55 (0.35-0.88) Это биаллельные сочетания TGFB1*−509С + IL6*−174C/C (р=0.0011, ОШ=0.31, 95% ДИ: 0.15-0.64) и TGFB1*−509С + PDE4D*41G (р=0.002, ОШ=0.36, 95% ДИ: 0.17-0.73) и триаллельные сочетания TGFB1*−509С + TNF*−308G + IL4*−590C (р=0.0061, ОШ=0.43, 95% ДИ: 0.22-0.82) и TGFB1*−509С + IL4*−590C + CTLA4*49A (р=0.0078, ОШ=0.55, 95% ДИ: 0.35-0.88). Таким образом, комплексный анализ позволил выявить кумулятивный эффект SNP ряда генов на развитие ИИ. При этом полиморфные участки −174G>C гена IL6, −509С>Т гена TGFB1 и 87C>T гена PDE4D, ассоциированные с ИИ поодиночке, вносят более весомый вклад в генетическую предрасположенность к ИИ. Полиморфные локусы других исследованных генов, выявленные только в составе сочетаний, вносят более слабый вклад. Во всех случаях, когда в составе различных сочетаний выявляются оба аллеля однонуклеотидного полиморфизма (SNP), соблюдается закономерность: аллель, входящий в протективное сочетание, является альтернативным для аллеля из предрасполагающего сочетания. Выявленные сочетания представляют собой составные генетические маркеры ИИ как полигенного заболевания. Данные, полученные при разделении выборки больных ИИ и контрольной группы по гендерному признаку с последующим комплексным анализом (таблица 17) выявили в подгруппах и мужчин, и женщин только биаллельные сочетания и обладают некоторыми отличиями от общей группы. У мужчин (таблица 17А) в сочетания входят аллели или генотипы SNP TGFB1*915 C>G (ассоциирован с ИИ у мужчин поодиночке, см. раздел 3.1) и TGFB1*−509C>T, а также полиморфные участки генов IL6, PDE4D и TNF. В целом, в состав ассоциированных с ИИ сочетаний входят 5 полиморфных участков 3 генов, все из которых были выявлены при сравнении общих групп больных ИИ и здоровых. Наиболее значимо у мужчин позитивно ассоциировано с ИИ сочетание IL6*−174G + TGFB1*915G/G (р=0.00025, ОШ=3.425, 95% ДИ: 1.756.8), выявленное и в общей группе как самое значимое предрасполагающее сочетание. Также наблюдаются предрасполагающие сочетания PDE4D*41A + PDE4D*87C (р=0.008, ОШ=2.73, 95% ДИ: 1.22-6.10) и IL6*−174G/G + 100 PDE4D*41A (р=0.02, ОШ=4.8, 95% ДИ: 1.06-21.80). У них с развитием ИИ отрицательно ассоциировано носительство сочетаний: TGFB1*915С + TNF*−308G (p=0.00075, ОШ=0.25, 95% ДИ: 0.11-0.57) и PDE4D*41G + TGFB1*−509C (p=0.023, ОШ=0.38, 95% ДИ: 0.15-0.94). У женщин (таблица 17Б) в сочетания входят аллели или генотипы SNP IL6*−174G>C (ассоциирован с ИИ у женщин поодиночке, см. раздел 3.1), оба полиморфных участка гена PDE4D, SNP TGFB1*915G>C, IFNG*874A>T и LTA*252G>A. Всего в состав ассоциированных с ИИ сочетаний у них входят 6 полиморфных участков 5 генов, 4 из которых были выявлены при сравнении общих групп больных ИИ и здоровых. Особый интерес представляет появление в составе предрасполагающего сочетания аллеля LTA*252G гена LTA, который не был выявлен при сравнении общих групп. Наиболее значимо позитивно ассоциировано с ИИ у женщин IL6*−174G + TGFB1*915G (р=0.001, ОШ=4.6, 95% ДИ: 1.56-13.5), сходное с наблюдаемым у мужчин и в общей группе. Выявлены также другие биаллельные предрасполагающие сочетания, несущие тот же аллель IL6*−174G в сочетании с PDE4D*87С (р=0.01, ОШ=2.36, 95% ДИ: 1.18-4.72) и с IFNG*874Т (р=0.017, ОШ=2.22, 95% ДИ: 1.11-4.44), а также сочетание LTA*252G + PDE4D*41A (р=0.013, ОШ=5.63, 95% ДИ: 1.21-26.2). У женщин выявлено также протективное для общей выборки сочетание IL6*−174C/C + IFNG*874A (р=0.001, ОШ=0.11, 95% ДИ: 0.02-0.51). В целом, распределение в составе сочетаний аллелей/генотипов, выявленное в общей группе, сохраняется и при разделении выборки на мужчин и женщин. Так, присутствие аллелей SNP−174G>C гена IL6, 41G>A и 87C>T гена PDE4D в составе сочетаний наблюдается во всех трех группах, −308A>G гена TNF – в общей группе и у мужчин, 874A>T гена IFNG - в общей группе и у женщин. SNP TGFB1*−509С>Т и/или TGFB1*915G>C в составе сочетаний ассоциированы с ИИ и в общей группе, и после разделения по гендерному признаку, хотя вклад разных полиморфных участков оказывается различным; это согласуется с представлением об отсутствии жесткого сцепления между этими SNP (см. выше). 101 Таблица 17. Ассоциация ИИ с носительством сочетаний аллелей и генотипов SNP исследованных генов в подгруппах, сформированных по гендерному признаку А. Мужчины IL6 −174G>C Аллели/генотипы в составе сочетания TGFB1 PDE4D PDE4D TGFB1 915G>C 41G>A 87C>T −509С>Т * TNF −308A>G Носители (%) /неносители (%) сочетания ИИ n=123 G G/G 105(85)/18(15) C G 10(9)/112(91) A C 31(25)/92(75) G/G A 14(11)/109(89) G C 99(80)/24(20) Жирным шрифтом выделены аллели/генотипы и сочетания с ОШ>1 Контроли n=83 49(63)/29(37) 19(32)/53(68) 9(11)/73(89) 2(3)/75(97) 75(91)/7(9) Величина р ОШ (95% ДИ) 0.00025 0.00075 0.008 0.02 0.023 3.45(1.75-6.80) 0.25(0.11-0.57) 2.73(1.22-6.10) 4.8(1.06-21.81) 0.38(0.15-0.94) Б. Женщины Аллели/генотипы в составе сочетания IL6 −174G>C * PDE4D 41G>A C/C G G PDE4D 87C>T TGFB1 915G>C IFNG 874A>T LTA 252G>A A G C A G G T Жирным шрифтом выделены аллели/генотипы и сочетания с ОШ>1 Носители (%) /неносители (%) сочетания ИИ n=77 2(3)/73(97) 72(93)/5(7) 52(67)/25(33) 12(16)/65(84) 46(61)/29(39) 102 Контроли n=63 12(20)/48(80) 47(76)/15(24) 29(47)/33(53) 2(3)/61(97) 25(42)/35(58) Величина р 0.001 0.0032 0.01 0.013 0.017 ОШ (95% ДИ) 0.11(0.02-0.51) 4.6(1.56-13.5) 2.36(1.18-4.72) 5.63(1.21-26.2) 2.22(1.11-4.44) В то же время, SNP −590C>T гена IL4 и 49A>G гена CTLA4 входят в состав сочетаний, ассоциированных с ИИ, только в общей группе, а 252А>G гена LTA только у женщин. Наблюдаемые различия могут быть связаны с уменьшением размера выборок при разделении общей группы по полу, но это объяснение вряд ли подходит для полиморфизма гена LTA. Данные, полученные при разделении выборки больных ИИ и контрольной группы в зависимости от возраста с последующим комплексным анализом (таблица 18) выявили, что аллели/генотипы полиморфного участка −174G>C гена IL6 входят практически во все предрасполагающие и протективные сочетания, ассоциированные с ИИ в возрастной группе старше 60 лет (таблица 18А). Комплексный анализ выявил у них следующие предрасполагающие к ИИ сочетания: IL6*−174G + TGFB1*915G (р=0.00088, ОШ=4.18, 95% ДИ: 1.75-9.95) и IL6*−174G + IFNG*874T (р=0.0036, ОШ=2.36, 95% ДИ: 1.3-4.3), причем первое сочетание выявлялось также в общей группе, а второе сочетание было выявлено у женщин. Таким образом, носительство этих сочетаний может рассматриваться как фактор риска ИИ. Как и в общей группе, наиболее мощным протективным сочетанием являлось сочетание IL6*−174C/C + IFNG*874A (р=0.00036, ОШ=0.17, 95% ДИ: 0.06-0.48). У лиц старше 60 лет также была выявлена отрицательная ассоциация с ИИ сочетаний IL6*−174C/C + TGFB1*−509T (р=0.00085, ОШ=0.13, 95% ДИ: 0.03-0.48) и IFNG*874A/А + TGFB1*869G (р=0.004, ОШ=0.37, 95% ДИ: 0.19-0.74), что касается последнего сочетания, то ни в общей группе, ни при разделении по гендерному признаку не была выявлена ассоциация с ИИ полиморфного участка TGFB1 869T>C. Также стоит отметить, что генотип TGFB1*−509T/Т был ассоциирован в общей группе с развитием ИИ как один (см. раздел 3.1), так и в составе сочетания. Таким образом, у лиц старше 60 лет наибольшее значение в развитии ИИ играют полиморфизм −174G>C гена IL6, как и в общей группе, и полиморфизм 874A>T гена IFNG. У лиц с ранним ИИ (моложе или равном 60 лет) (таблица 18Б), в отличие от общей группы, мы не 103 Таблица 18. Ассоциация ИИ с носительством сочетаний аллелей и генотипов SNP исследованных генов в разных возрастных группах А. Лица в возрасте старше 60 лет Аллели/генотипы в составе сочетания IL6 −174G>C * TGFB1 −509С>Т С/C C/C G G TGFB1 915G>C TGFB1 869T>C IFNG 874A>T * A T G T С A/A Жирным шрифтом выделены аллели/генотипы и сочетания с ОШ>1 Носители (%) /неносители (%) сочетания ИИ n=133 6(5)/122(95) 3(2)/130(98) 124(93)/9(7) 86(67)/42(33) 21(16)/107(84) Контроли n=76 15(22)/54(78) 11(15)/62(85) 56(77)/17(23) 32(46)/37(54) 24(34)/46(66) Величина р ОШ (95% ДИ) 0.00036 0.00085 0.00088 0.0036 0.004 0.17(0.06-0.48) 0.13(0.03-0.48) 4.18(1.75-9.95) 2.36(1.3-4.3) 0.37(0.19-0.74) Величина р ОШ (95% ДИ) 0.002 0.008 0.014 0.30(0.14-0.66) 3.57(1.31-9.72) 9.35(1.14-77.03 Б. Лица в возрасте не старше 60 лет Аллели/генотипы в составе сочетания PDE4D41G>A * G/G A PDE4D87C>T TGFB1−509С>Т C C C T/T Жирным шрифтом выделены аллели/генотипы и сочетания с ОШ>1 Носители (%) /неносители (%) сочетания ИИ n=67 38(57)/29(43) 17(25)/50(75) 8(12)/59(88) 104 Контроли n=70 56(81)/13(19) 6(9)/63(91) 1(2)/69(98) наблюдали ассоциированных с ИИ сочетаний, включающих аллели или генотипы полиморфного участка −174G>C гена IL6. Основной вклад в предрасположенность к ИИ у лиц данного возраста по нашим данным вносят полиморфизмы 41G>A и 87C>T гена PDE4D и −509С>Т гена TGFB1. С риском развития ИИ ассоциированы сочетания: PDE4D*41А+ PDE4D*87С (р=0.008, ОШ=3.57, 95% ДИ: 1.31-9.72) и PDE4D*87С + TGFB1*−509T/T (р=0.014, ОШ=9.35, 95% ДИ: 1.14-77.03). Ассоциация сочетания PDE4D*41А + PDE4D*87С с ИИ наблюдалась также у мужчин, а сочетание PDE4D*87С + TGFB1*−509T/T было ассоциировано с развитием ИИ в общей группе. Протективными для развития ИИ в подгруппе ≤60 лет является сочетание PDE4D*41G/G + TGFB1*−509C(р=0.002, ОШ=0.30, 95% ДИ: 0.14-0.66). В общей группе мы наблюдали протективное сочетание PDE4D*41G + TGFB1*−509C (р=0.002, ОШ=0.36, 95% ДИ: 0.17-0.73). Как и в случае разделения больных и контролей по полу, при их разделении по возрасту сохраняются некоторые закономерности распределения отдельных аллелей/генотипов в составе сочетаний, обнаруженные в общей группе. SNP −174G>C гена IL6, −509С>Т и 915G>C гена TGFB1 и 874A>T гена IFNG входят в состав ассоциированных с ИИ сочетаний как в общей группе, так и в подгруппе старше 60 лет, а 41G>A и 87C>T гена PDE4D и 915G>C гена TGFB1 - в общей группе и в подгруппе до 60 лет включительно. При этом SNP −590C>T гена IL4, 49A>G гена CTLA4 и −308A>G гена TNF выявлены в составе ассоциированных с ИИ сочетаний только в общей группе. Интересно, что первые два SNP не входили в состав составных маркеров и в подгруппах мужчин и женщин. Обращают на себя внимание существенные различия в распределении SNP, входящих в состав сочетаний, ассоциированных с ранним и более поздним ИИ. Если в возрастной группе ≤60 лет включительно с ИИ ассоциированы сочетания, несущие аллели SNP 41G>A и 87C>T гена PDE4D, а также 509С>Т гена TGFB1, то в группе старше 60 это оказались аллели SNP −174G>C гена IL6, 509С>Т, 869T>C и 915G>C гена TGFB1 и 874A>T гена IFNG. Единственный SNP, входящий в состав сочетаний, ассоциированных с развитием ИИ в обеих 105 возрастных группах - это −509С>Т гена TGFB1, однако при этом аллель TGFB1*−509Т входит в состав разнонаправлено ассоциированных сочетаний. Следует отметить, что при разделении больных ИИ и контрольной группы по полу и возрасту, как и в общей группе, соблюдается закономерность: аллель полиморфного участка, входящий в протективное сочетание, является альтернативным для аллеля из предрасполагающего сочетания. В целом, анализ совместного вклада в предрасположенность к ИИ сочетаний аллелей или генотипов исследуемых генов позволил увеличить число генов, влияющих на восприимчивость к ИИ, с 4 до 8. Действительно, если объединить результаты всех проведенных сравнений, ассоциация ИИ с аллелями генов IL6, PDE4D, TGFB1 и IFNG была показана как поодиночке (см. таблицу 14), так и в составе сочетаний, тогда как аллели генов CTLA4, IL4, TNF и LTA были ассоциированы с ИИ только в составе сочетаний. При этом важно отметить, что из последних только в случае гена LTA его аллель LTA*252G входил в состав предрасполагающих сочетаний, а аллели остальных генов были компонентами протективных сочетаний. В таблице 19 представлены сводные данные об аллелях риска, выявленных нами в составе сочетаний при различных типах сравнения больных ИИ и индивидов контрольной группы (общие группы, только мужчины, только женщины, отдельно лица не старше 60 лет и лица старше 60 лет). Данные этой таблицы полностью подтверждают выводы об индивидуальных аллелях риска, которые были сделаны для аналогичных групп сравнения (см. таблицу 14). Более того, они свидетельствуют о повышении мощности анализа при использовании комплексного подхода, основанного на анализе сочетаний генов. Действительно, ряд аллелей выявлен в сравниваемых подгруппах в составе значимых предрасполагающих сочетаний (выделены жирным), тогда как при анализе поодиночке для них не был достигнут уровень значимости. Особое положение в этой таблице занимает аллель риска LTA*252G, который был выявлен только в составе сочетания при комплексном анализе в подгруппе женщин. 106 Таблица 19. Аллели риска, выявленные в составе сочетаний при сравнении больных ИИ и индивидов контрольной группы: общих групп, только мужчин, только женщин, отдельно лиц не старше 60 лет и лиц старше 60 лет Аллель риска ИИ Общие группы IL6 −174G>C G + PDE4D 41G>A A PDE4D 87C>T C TGFB1 −509С>Т Т TGFB1 915G>C G IFNG 874A>T Т LTA 252 G>A G Полиморфизм + + + Мужчины Женщины + + + + + + + + + + Лица не старше 60 лет Лица старше 60 лет + + + + + + Примечание: «+» показывает, при каком типе сравнения больных ИИ и индивидов контрольной группы выявлен аллель риска. Без выделения цветом показаны аллели риска, которые были выявлены также поодиночке (представлены в таблице 14), цветом выделены аллели риска, выявленные только в составе сочетаний. В целом, проведенный нами комплексный анализ показал, что аллель IL6*−174G и генотип IL6*−174G/G полиморфизма −174G>C гена IL6 вносят существенный вклад в наследственную предрасположенность к ИИ во всех подгруппах, кроме лиц не старше 60 лет. Наши данные о значимости этого аллеля/генотипа совпадают с результатами [127, 192, 372], полученными для европеоидов. Полиморфизм −174G>C влияет на продукцию IL6. Показана ассоциация носительства генотипа IL6*–174G/G с более высоким, а аллеля IL6*– 174C – с более низким уровнем IL-6 в плазме крови [126, 386], однако в ряде аналогичных работ различия не достигали уровня значимости. Известно, что повышение продукции IL-6 вызывает нарушение взаимодействия гладкомышечных клеток в стенке сосуда с клетками иммунной системы, что в конечном итоге приводит к усилению атерогенеза [242]. Кроме того, IL-6 обладает нейротрофическим действием при церебральной ишемии [356]. В результате проведенного комплексного анализа нами были выявлены позитивные и негативные ассоциации с ИИ обоих исследованных полиморфных участков гена PDE4D в составе сочетаний – в общей группе и во всех подгруппах, 107 кроме лиц старше 60 лет. Ранее позитивные ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов в гене PDE4D с инсультом были показаны на выборках из неевропейских стран [69, 84, 277]. Выявленная в этих исследованиях роль гена PDE4D в формировании риска развития ИИ носила самостоятельный характер и не зависела от таких факторов риска как возраст и пол [72, 239, 264, 409]. Данные о позитивной ассоциации с аллелем PDE4D*41A были получены ранее в исследовании на несколько иной выборке – у больных острым инсультом из московской популяции [10]. Комплексный анализ выявил существенный вклад в развитие ИИ генотипа риска TGFB1*−509T/T в общей группе и в подгруппе лиц не старше 60 лет; соответственно, аллель TGFB1*−509С был обнаружен во многих протективных сочетаниях. Подобная ассоциация наблюдалась в голландской [344] и китайской [295] популяциях. Как было сказано выше, носительство генотипа TGFB1*−509T/T ассоциировано с более высоким содержанием триглицеридов в плазме крови [295] и может способствовать росту атеротромботической бляшки, что в свою очередь может приводить к сужению просвета сосудов и развитию ишемических процессов. Также был выявлен вклад в развитие ИИ и предрасполагающая роль генотипа TGFB1*915G/G в подгруппе мужчин, также данный генотип входил в состав сочетаний с аллелями полиморфных участков −174G>C гена IL6 и 87C>T гена PDE4D общей группы. Кроме того, в сочетании с аллелем IL6*–174G, генотип TGFB1*915G/G играл предрасполагающую роль у мужчин и у лиц старше 60 лет, а аллель TGFB1*915G был положительно ассоциирован с ИИ у женщин, соответсвенно, аллель TGFB1*915C в сочетании TNF*−308G был негативно ассоциирован с ИИ у мужчин. Полученные данные соответствуют результатам исследования на китайской популяции, где показана ассоциация генотипа TGFB1*915G/G с мерцательной аритмией, являющейся одним из факторов ИИ [390]. Что касается полиморфного участка 869C>Т, то его аллелей мы не наблюдали в составе предрасполагающих сочетаний ни в общей группе, ни при разделении по гендерному признаку. Однако, аллель TGFB1*869C 108 входил в состав протективного сочетания с IFNG*874А/А у лиц, получивших инсульт в возрасте старше 60 лет, что согласуется с данными исследования китайской популяции [295]. Мы наблюдали, что аллель IFNG*874T входит в состав предрасполагающих к развитию ИИ сочетаний как в группе старше 60 лет, так и у женщин, а в качестве индивидуального аллеля риска был выявлен для индивидов старше 60 лет. Вовлечение в формирование предрасположенности к ИИ участка IFNG*874A>T, по-видимому, выявлено нами впервые: в опубликованной литературе мы не нашли других работ, посвященных анализу связи с ИИ этого полиморфного участка. Однако, по мнению некоторых исследователей у пациентов с артериальной гипертензией 3 степени (АГ III), перенесших ИИ, совместно с выработкой IL-6 наблюдалась гиперсекреция IFNγ, и данная комбинация является наиболее опасной для развития воспалительных процессов [14]. Из указанных выше данных о влянии аллелей на уровень продукции IFNγ [182, 301], можно предположить, что носительство аллеля IFNG*874T усиливает в бляшке синтез коллагена, что приводит к увеличению ее размера. Проведенный комплексный анализ не выявил позитивной ассоциации носительства того или иного аллеля/генотипа SNP − 308A>G гена TNF с развитием ИИ, однако, нами была обнаружена негативная ассоциация с ИИ данного полиморфного участка в составе протективных сочетаний в общей группе и в подгруппе мужчин. Обнаруженная нами негативная ассоциация аллеля TNF*−308G согласуется с данными, полученными для греческой популяции [254], но не для венгерской популяции, где была показана протективная роль аллеля TNF*−308A [160]. Этот вопрос нуждается в дальнейшем исследовании. Мы наблюдали также присутствие аллеля IL4*−590C в общей группе в составе протективных сочетаний с аллелями и генотипами полиморфных участков других генов. Как уже указывалось, в литературе мы не обнаружили аналогичных данных; при этом в исследовании на греческой популяции была выявлена роль альтернативного IL4*−589T аллеля с рецидивами инсульта [255]. 109 Мы не обнаружили в составе сочетаний, ассоциированных с ИИ, полиморфного участка 252A>G гена LTA c ИИ ни в общей группе, ни в обеих возрастных группах, что, впрочем, согласуется с данными ряда других работ, например, для немецкой и японской популяций [136, 155]. В то же время, в иследовании на венгерской популяции было показано, что аллель LTA*252G служит фактором риска для развития ИИ [358]. С этим заключением согласуются полученные нами данные об ассоциации аллеля LTA*252G в составе сочетания с риском развития ИИ у женщин. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В целом, результаты, полученные при анализе 11 полиморфных участков 8 генов, свидетельствуют о том, что наиболее значимый вклад в развитие ИИ у этнических русских вносят гены IL6, PDE4D и TGFB1, белковые продукты которых участвуют в формировании патогенетических событий на различных стадиях, предшествующих ишемии (Ларина Н.В. с соавт. 2012). Проведенный анализ ассоциации полиморфного участка –174G>C гена IL6 с уровнями фибриногена и показателями тромбоцитарного гемостаза в плазме крови не выявил значимых различий. При сравнении общих групп больных и контролей аллели или генотипы полиморфных участков этих генов являются индивидуальными факторами риска. Ассоциации с SNP каждого из них наблюдаются и при стратификации сравниваемых групп на подгруппы по полу или по возрасту, причем каждая из этих ассоциаций сохраняется по крайней мере в одной из подгрупп. Аллели или генотипы генов IL6, PDE4D и TGFB1 входят в состав ассоциированных с ИИ сочетаний из двух и трех аллелей/генотипов различных генов. Выявленные при сравнении общих групп больных ИИ и контролей сочетания представляют собой составные генетические маркеры ИИ как полигенного заболевания, в которых аллели названных генов присутствуют попарно и/или совместно с аллелями других исследованных генов, а именно генов IFNG, CTLA4, IL4 и TNF, носительство которых в одиночку не было значимо ассоциировано с ИИ. Ассоциация 110 ИИ с выявленными сочетаниями характеризуется бóльшим уровнем значимости, чем с одиночными аллелями. Распределение в составе сочетаний аллелей/генотипов, выявленное в общей группе, в целом сохраняется при разделении выборок на мужчин и женщин, однако у женщин обнаружен новый компонент предрасполагающего сочетания аллель LTA*252G. При их разделении больных ИИ и контрольной группы на подгруппы по возрасту наблюдаются существенные различия в распределении SNPs, входящих в состав сочетаний, ассоциированных с ранним (не старше 60 лет) и более поздним ИИ. Полученные данные позволяют предполагать аддитивность вклада рассмотренных генов в предрасположенность к ИИ. По нашим данным, наибольшее прогностическое значение из изученных SNPs имеет анализ полиморфизмов −174G>C гена IL6, 87C>T гена PDE4D и −509С>Т гена TGFB1, а также анализ их сочетаний. Так, носительство сочетания аллеля PDE4D*87C с генотипом TGFB1*−509Т/T увеличивает риск развития ИИ более чем в 4 раза, а в возрасте ≤60 лет − более чем в 9 раз. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о важной роли воспаления при ИИ, а выявленные в работе одиночные и составные маркеры могут в дальнейшем послужить маркерами для определения индивидуального риска развития ИИ. 111 ВЫВОДЫ 1. Сравнительный анализ частот аллелей, частот носительства аллелей и генотипов полиморфных участков генов CTLA4, IL6, TGFB1, IL4, TNF, IFNG, LTA и PDE4D у больных ИИ и здоровых индивидов, русских по этнической принадлежности, выявил значимые позитивные ассоциации с развитием ИИ носительства аллелей IL6*–174G и PDE4D*87C и генотипа TGFВ1*−509T/T. Частоты аллелей, носительства аллелей и генотипов полиморфных участков 41G>A гена PDE4D, 49A>G гена CTLA4, −590C>T гена IL4, −308A>G гена TNF, 252G>A гена LTA, 874A>T гена IFNG, 869T>C и 915G>C гена TGFB1 при этом значимо не отличались. 2. При разделении группы больных ИИ и контрольной группы по гендерному признаку наблюдали значимую позитивную ассоциацию с ИИ частоты носительства аллеля IL6*–174G у женщин и генотипа TGFB1*915G/G у мужчин. При разделении больных ИИ на две группы по возрасту (лица, перенесшие ИИ в возрасте старше 60 лет и в возрасте моложе или равном 60 лет) и их сравнении с лицами контрольной группы тех же возрастных категорий у лиц старше 60 лет выявлена позитивная ассоциация с ИИ носительства аллелей IL6*–174G и IFNG*874Т, а у лиц ≤60 лет – носительства аллеля PDE4D*41А. 3. При анализе уровней фибриногена и показателей тромбоцитарного гемостаза в плазме крови не было выявлено значимых различий между носителями различных аллелей и генотипов полиморфного участка –174G>C гена IL6. 4. Анализ совместного носительства аллелей/генотипов исследованных полиморфных участков с помощью ПО APSampler у больных ИИ и здоровых индивидов выявил позитивно и/или негативно ассоциированные с ИИ би- и триаллельные сочетания аллелей/генотипов генов IL6, PDE4D и TGFB1 с аллелями других исследованных генов, а именно IFNG, CTLA4, IL4 и TNF, носительство которых в одиночку не было значимо ассоциировано с ИИ. Ассоциация ИИ с выявленными сочетаниями характеризуется бóльшим уровнем значимости, чем с одиночными аллелями. Носительство каждого из трех 112 сочетаний: IL6*–174G + TGFB1*915G/G; PDE4D*87C + TGFB1*−509T/T и PDE4D*87C + TGFB1*915G/G – оказалось маркером риска ИИ. 5. При разделении больных ИИ и контрольной группы по гендерному признаку и последующем комплексном анализе у мужчин наблюдали позитивную ассоциацию с ИИ в составе различных сочетаний носительства аллеля IL6*–174G или генотипа IL6*–174G/G, аллелей PDE4D*41А или PDE4D*87C, а также генотипа TGFB1*915G/G, а у женщин − тех же аллелей IL6*–174G, PDE4D*41А, PDE4D*87C и TGFB1*915G, что и у мужчин. Кроме того, в состав предрасполагающих сочетаний у женщин входил аллель LTA*252G>A, который не был выявлен при сравнении общих групп, и аллель IFNG*874T. 6. Комплексный анализ в подгруппе лиц в возрасте старше 60 лет выявил значимые позитивные ассоциации с ИИ в составе различных сочетаний аллелей IL6*−174G, TGFB1*915G и IFNG*874T, а у лиц в возрасте ≤ 60 лет – аллелей PDE4D*41GA, PDE4D*87C и генотипа TGFB1*−509Т/Т. 7. В целом, результаты, полученные при анализе 11 полиморфных участков 8 генов воспаления, свидетельствуют о том, что наиболее значимый вклад в развитие ИИ у этнических русских вносят гены IL6, PDE4D и TGFB1. аллели или генотипы полиморфных участков которых являются индивидуальными маркерами риска. Выявлены также составные генетические маркеры ИИ, представляющие собой «генетические ансамбли» − сочетания 2 или 3 аллелей названных генов между собой или с аллелями генов IFNG, LTA, CTLA4, IL4 и TNF. Для них характерно повышение уровня значимости по сравнению с индивидуальными маркерами риска, свидетельствующее о кумулятивном вкладе полиморфизма отдельных генов в 113 предрасположенность к ИИ. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ: 1. Авдонина М. А., Наседкина Т. В., Иконникова А. Ю., Бондаренко Е. В., Сломинский П. А., Шамалов Н. А., Шетова И. М., Лимборская С. А., Заседателев А. С., Скворцова В. И. Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов F12, PON1, PON2, NOS2, PDE4D, HIF1a, GPIba, CYP11B2 с ишемическим инсультом среди русского населения Центральной России // Журнал неврологии и психиатрии им.С.С.Корсакова. – 2012. – № 2. – С. 51-54 2. Айвазян В.А., Бояджян В.С., Манукян Л.А., Аветисян Г.В., Григорян Г.С. Компоненты системы комплемента — С3 и фактор В — в крови больных острым ишемическим инсультом // Инсульт: Приложение к Журналу неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. – 2005. – № 1. – С. 57–60 3. Алехин М.Н., Затейщиков Д.А., Цимбалова Т.Е., Зотова И.В., Ваниева О.С., Исаева М.Ю. Система гемостаза у больных с мерцательной аритмией: маркеры тромбоза ушка левого предсердия // Кардиология. – 2008. – № 2. – C. 36-40 4. Анацкая А.Н. Инфаркт мозга у пациентов пожилого возраста // Журн. неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова (приложение "Инсульт"). – 2011. – № 8, – вып. 2. – C. 74-79 5. Ардашев А. В. Типичное трепетание предсердий: классификация, клинические проявления, диагностика и лечение // Кардиология. – 2010. – № 4. – C. 57-65 6. Барсова Р.М., Титов Б.В., Матвеева Н.А., Фаворов А.В., Рыбалкин И.Н., Власик Т.Н., Тарарак Э.М., Сухинина Т.С., Шахнович Р.М., Руда М.Я., Фаворова О.О. Участие гена TGFB1 в формировании предрасположенности к инфаркту миокарда // Acta Naturae, – 2012, –№ 2. – C. 58-64 7. Благодатских К. А. Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов CRP, IL6, IL10, TNF и LTA с развитием неблагоприятного исхода у больных, перенесших острый коронарный синдром: автореферат дисс. канд. биол. наук : 03.01.03 / Благодатских Константин Александрович. – М., 2011 8. Бондаренко Е. А., Мокан Е. И., Барбакар Н. И., Тупицына Т. В., Сломинский П. А., Шетова И. М., Шамалов Н. А., Боцина А. Ю., Скворцова В. И., Лимборская 114 С. А. Анализ полиморфных вариантов гена PDE4D у больных острым инсультом в молдавской популяции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2011. – № 2. – С. 5-7 9. Бондаренко Е.А., Сломинский П. А., Лимборская С. А., Шетова И. М., Тимофеев Д. Ю., Скворцова В. И. Полиморфные варианты гена ALOX5AP риск развития острого инсульта в российской популяции // Генетика. – 2011. – №.4. – С. 570-573 10. Бондаренко Е. А., Тупицына Т. В., Сломинский П. А., Шетова И. М., Шамалов Н. А., Боцина А. Ю., Скворцова В. И., Лимборская С. А. Полиморфизм гена фосфодиэстеразы 4Д (PDE4D) у больных острым инсультом г. Москвы // Генетика. – 2010. – № 6, С. 861–864 11. Борисов А.В., Семак А.Е., Мотузова Я.М. и др. // Медицинский журнал. – 2006. – № 2. – С. 25-27 12. Бурдаков В.В., Ершов В.И. Роль мониторинга тяжести состояния больного ишемическим инсультом с сочетанной кардиальной патологией в прогнозе заболевания. //Материалы VIII Всероссийского съезда неврологов. Казань, – 2001. – С. 205-206 13. Верещагин Н. В. Гетерогенность инсульта: взгляд с позиции клинициста // Инсульт: прил. к журн. Неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. – 2003. – № 9. – С. 8- 9 14. Волошина И.Н., Состояние нейроиммунной активации у больных, перенесших ишемический инсульт // Международный неврологический журнал. – 2011. – № 46. 15. Воробьев П.А. Инсульт. Нормативные документы. М.: Ньюдиамед, 2010 16. Гусев Е.И. Проблема инсульта в России // Журнал неврологии и психиатрии. Инсульт (приложение к журналу). – 2003. – вып. 9. – С. 3-5 17. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Киликовский В.В., Стаховская Л.В., Айриян Н.Ю. Проблема инсульта в Российской Федерации // Качество жизни. – 2006. – №2(13). – С. 10-14 115 18. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Коваленко А.В., Соколов М.А. Механизмы повреждения ткани мозга на фоне острой фокальной ишемии. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. – 1999. – № 2. – С. 65-70 19. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Мартынов М.Ю. Церебральный инсульт: проблемы и решения // Вестн. РАМН. – 2003. – № 11. – С. 44-48 20. Дамбинова С.А., Каменская М.А. Молекулярные механизмы передачи импульса в мембранах нейронов. Ионные каналы, рецепторы. // В кн.: Нейрохимия. (Ашмарин И.П., Стукалов П.В. ред.). – М., – 1996; – С. 246-295 21. Деев А. С., Захарушкина И. В. Церебральные инсульты в молодом возрасте // Ж. неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. – 2000. – Т. 100, – № 1. – С. 14 – 17 22. Донахи М. Неврология / перевод с англ. под ред. проф. В. А. Парфенова. М.: МИА, – 2007. – С. 229 23. Зотова И. В., Затейщиков Д. А., Сидоренко Б. А. Предикторы внутрисердечного тромбоза у больных с мерцательной аритмией: факторы гемостаза, маркеры воспалений и генетические факторы // Кардиология. – 2007. – № 11. – С. 46 – 54 24. Кобылина О.В., Гехт А.Б., Фаворова О.О., Гусев Е.И., Николаева Т.Я. Генетические аспекты ишемического инсульта // Инсульт, приложение к Журналу неврологии и психиатрии им. Корсакова. – 2008. – № 23. – С. 49-55 25. Кобылина О.В., Николаева Т.Я. Сравнительный анализ факторов риска развития ишемического инсульта у якутов. матер. науч.-практ. конф. «Современные аспекты эпидемиологии, диагностики, лечения неврологических заболеваний на Севере». Якутск. – 2008. – С. 13-21 26. Мищенко Т. С. Инсульт // Киев: изд. Гуляев Д.В. –2006. –С. 216 27. Никифоров А. С., Гусев Е. И. Общая неврология. М.: ГЭОТАР-МЕДИА. – 2007. – С. 720 28. Оганов Р. Г. Новый способ оценки индивидуального сердечно-сосудистого суммарного риска для населения России / // Кардиология. – 2008. – № 5. – С. 87 – 91 116 29. Парфенов В. А. Факторы риска и профилактика ишемических цереброваскулярных заболеваний. //ММА имени И.М. Сеченова, Русский медицинский журнал. – 2002. – Том 10, – №17 30. Парфенов М.Г. Участие генов, кодирующих компоненты систем гемостаза, липидного метаболизма и ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, в формировании предрасположенности к ишемическому инсульту у русских и якутов: автореферат дисс. канд. биол. наук: 03.00.03/ М., – 2007 31. Парфенов М.Г., Титов Б.В., СудомоинаМ.А., Мартынов М.Ю., Фаворов А.В., M.F. Ochs, Гусев Е.И., Фаворова О.О. Комплексный анализ генетической предрасположенности к ишемическому инсульту у русских // Молекулярная биология. – 2009. – Т. 43. – № 5. – С. 937 – 945 32. Сергеев П.В., Шимановский Н.Д., Петров В.И. Рецепторы. М. Волгоград, – 1999; – С. 346-423 33. Скворцова В.И., Ефремова Н.М., Шамалов Н.А. и др. Церебральная ишемия и нейропротекция. Медицина. Инсульт. – 2006. – № 13. – С. 35-42 34. Сквоpцова В.И., Сломинский П.А., Кольцова Е.А., Тупицына Т.И., Милосеpдова О.В., Боцина А.Ю., Лимбоpская С.А.: Изучение pоли миссенсмутации (М235Т) гена ангиотензиногена в pазвитии ишемической болезни мозга. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2003. – №1. – С. 52-54 35. Суслина З. А., Варакин Ю. Я., Верещагин Н. В. Сосудистые заболевания головного мозга. 2-е издание. М.: МЕДпресс-информ. –2009. – С. 352 36. Суслина З. А., Танашян М. М., Ионова В. Г. Ишемический инсульт: кровь, сосудистая стенка, антитромботическая терапия. – М.: Медицинская книга, – 2005. – С. 248 37. Сухинина Т.С., Шахнович Р.М., Барсова Р.M., Матвеева Н.А., Титов Б.В., Судомоина М.А., Фаворова О.О., Руда М.Я Значение аллельного полиморфизма генов системы воспаления для прогноза больных инфарктом миокарда// Журнал "Кардиология". – 2012. – № 3. – С. 15-21 38. Тупицына Т.В., Бондаренко Е.А., Боцина А.Ю., Шетова И.М., Лимборская С.А., Скворцова В.И., Сломинский П.А. Роль полиморфных вариантов гена 117 индуцибельной NO-синтазы NOS2 в формировании инфаркта мозга у больных с острым ишемическим инсультом // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2010. – №3. – С. 3 – 7 39. Усачева (Авдонина) М.А., Наседкина Т.В., Иконникова А.Ю., Куликов А.В., Чудинов А.В., Лысов Ю.П., Бондаренко Е.В., Сломинский П.А., Шамалов Н.А., Шетова И.М, Лимборская С.А., Заседателев А.С., Скворцова В.И. Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов ренин-ангиотензиновой системы и системы гемостаза с ишемическим инсультом среди русских центральной России // Молекулярная биология. – 2012, – Том 46. – №2. – С. 214-223 40. Фаворова О.О., Судомоина М.А., Мартынов М.Ю., Сердюк И.Е., Парфенов М.Г., Никонова А.А., Колесникова Т.И., Ясаманова А.Н., Гусев Е.И. Влияние полиморфизма гена b-фибриногена на показатели тромбоцитарного гемостаза и уровень фибриногена у больных ишемическим инсультом // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. Приложение «Инсульт» – Москва, –2008. – Том 108. –№ 23 – С.10-15 41. Харченко Е. П., Клименко М. Н. Иммунная уязвимость мозга // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. – 2007. – №1. – С. 68-77 42. Хаспеков Л.Г., Онуфриев М.В., Лыжин А.А., и др. Влияние ишемии на активность синтазы оксида азота в органотипической культуре ткани гиппокампа. - В кн.: Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция, Материалы 2-й Всеросссийской Конференции. – М. – 1999. –С. 81 43. Хенерици Дж., Богуславски Ж., Сакко Р. Л. Инсульт: клиническое руководство / под редакцией. Пер. с англ.; под общей ред. Чл.-корр. РАМН В. И. Скворцовой. М.: МЕДпресс-информ. – 2008. – С. 224 44. Acalovschi D., Wiest T., Hartmann M., Farahmi M., Mansmann U., Auffarth G.U., Grau A.J., Green F.R., GrondGinsbach C., Schwaninger M. Multiple levels of regulation of the interleukin-6 system in stroke // Stroke. – 2003. – 34, – Pp. 1864– 1869 45. Adamopoulos S, Kolokathis F, Gkouziouta A, Georgiadou P, Chaidaroglou A, Karavolias GK, Degiannis D, Voudris V, Kremastinos DT. Cytokine gene 118 polymorphisms are associated with markers of disease severity and prognosis in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy // Cytokine. – 2011. – 54(1). – Pp. 6873 46. Aihara K, Ikeda Y, Yagi S, Akaike M, Matsumoto T. Transforming Growth Factor-β1 as a Common Target Molecule for Development of Cardiovascular Diseases, Renal Insufficiency and Metabolic Syndrome // Cardiol Res Pract. – 2011. – Pp. 175381 47. Akira S, Isshiki H, Nakajima T et al. Regulation of expression of the interleukin 6 gene: structure and function of the transcription factor NF-IL6 // Ciba Found Symp. – 1992. – 167. – Pp. 47-62 48. Allen CL., Bayraktutan U. Risk factors for ischaemic stroke // Int J Stroke. – 2008. – № 2 Vol. 3. – Pp. 105-116 49. Alzamora MT, Sorribes M, Heras A, Vila N, Vicheto M, Forés R, Sánchez- Ojanguren J, Sancho A. Ischemic stroke incidence in Santa Coloma de Gramenet (ISISCOG), Spain. A community-based study // BMC Neurol. – 2008. – № 8. – Pp 5 – 8 50. Ambrose JA, Barua RS: The pathophysiology of cigarette smoking and cardiovascular disease: an update // J Am Coll Cardiol. – 2004. – 43. – Pp. 1731-1737 51. Annes JP, Mungers JS, Rifkin DB. Making sense of latent TGF beta activation // J Cell Sci. – 2003. – 116. – 217-224 52. Antonicelli R, Olivieri F, Cavallone L et al. Tumor necrosis factor-alpha gene - 308G>A polymorphism is associated with ST-elevation myocardial infarction and with high plasma levels of biochemical ischemia markers // Coron Artery Dis. – 2005. – 16(8). – Pp. 489-93 53. Antonios N., Angiolillo DJ., Silliman S. Hypertriglyceridemia and ischemic stroke // Eur Neurol. – 2008. – Vol. 60, – № 6. – Pp. 269 – 278 54. Arenillas JF, Massot A, Alvarez-Sabín J, Fernandez-Cadenas I, del Rio-Espinola A, Chacon P, Quintana M, Molina CA, Rovira A, Montaner J. C-reactive protein gene C1444T polymorphism and risk of recurrent ischemic events in patients with 119 symptomatic intracranial atherostenoses // Cerebrovasc Dis. – 2009. – 28(1). – Pp. 95102 55. Ariyaratnam R., Casas J.P., Whittaker J., Smeeth L., Hingorani A.D. and Sharma P. (2007) Genetics of ischaemic stroke among persons of non-European descent: a meta-analysis of eight genes involving approximately 32,500 individuals // PLoS Med. – 4, – e131 56. Arkwright PD, Laurie S, Super M, Pravica V, Schwarz MJ, Webb AK, Hutchinson IV TGF-beta (1) genotype and accelerated decline in lung function of patients with cystic fibrosis // Thorax. – 2000. – 55. – Pp. 459– 462 57. Awad MR, El-Gamel A, Hasleton P, Turner DM, Sinnott PJ, Hutchinson IV Genotypic variation in the transforming growth factor-beta1 gene: association with transforming growth factor-beta1 production, fibrotic lung disease, and graft fibrosis after lung transplantation // Transplantation. – 1998. – 66. – Pp.1014– 1020 58. Azzawi M, Hasleton P. Tumour necrosis factor alpha and the cardiovascular system: its role in cardiac allograft rejection and heart disease // Cardiovasc Res. – 1999. – 43. – Pp.850–9 59. Balding J., Livingstone W.J., Pittock S.J., Mynett Johnson L., Ahern T., Hodgson A., Smith O.P. The IL-6 G174C polymorphism may be associated with ischaemic stroke in patients without a history of hypertension // Irish J. Med. Sci. – 2004. – 4. – Pp. 200– 203 60. Banerjee I, Gupta V, Ahmed T, Faizaan M, Puneet A, Ganesh S. Inflammatory system gene polymorphism and the risk of stroke: A case-control study in an Indian population // BrainResBull. – 2008. – 75. – Pp.158–65 61. Bang O.Y. Possible mechanisms and controversies of protective effects of risk factors against stroke severity // J Neurol Sci. – 2008. – 267. –Pp. 188–189 62. Barna, B.P., Estes, M.L., Pettay, J., Iwasaki, K., Zhou, P. &Barnett, G.H. Human astrocyte growth regulation: interleukin-4 sensitivity and receptor expression // Journal of Neuroimmunology. – 1995. – Pp. 60, 75 63. Baum L, Ng HK, Wong KS, Tomlinson B, Rainer TH, Chen X, Cheung WS, Tang J, Tam WW, Goggins W, Tong CS, Chan DK, Thomas GN, Chook P, Woo KS. 120 Associations of apolipoprotein E exon 4 and lipoprotein lipase S447X polymorphisms with acute ischemic stroke and myocardial infarction // Clin Chem Lab Med. – 2006. – Vol. 44, –№ 3. – Pp. 274-281 64. Baum L, Wong KS, Ng HK, Tomlinson B, Rainer TH, Chan DK, Thomas GN, Chen X, Poon P, Cheung WS, Woo KS. Methylenetetrahydrofolate reductase gene A222V polymorphism and risk of ischemic stroke // Clin Chem Lab Med. – 2004. –Vol. 42, № 12. – Pp. 1370 – 1376 65. Bejot Y. Stroke in the very old: incidence, risk factor, clinical features, outcomes and access to resources – a 22-year population based study // Cerebrovasc. Dis. – 2010. – 29. – Pp. 111—121 66. Bennet AM, Di Angelantonio E, Ye Z et al: Association of apolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronary risk // JAMA. – 2007. – 298. – Pp. 1300– 1311 67. Benowitz NL: Cigarette smoking and cardiovascular disease:pathophysiology and implications for treatment // Prog CardiovascDis. – 2003. – 46. – Pp. 91-111 68. Benveniste E.N. Inflammatory cytokines within the central nervous system: sources, function, and mechanism of action // Am J Physiol. – 1992. – 263. – Pp. 1–16 69. Bersano A., Ballabio E., Bresolin N. et al. Genetic polymorphisms for the study of multifactorial stroke //Hum. Mutat. – 2008. – V. 29. № 6. – Pp. 776–795 70. Bevan, S., Dichgans, M., Gschwendtner, A., Kuhlenba¨umer, G., Ringelstein, E.B. and Markus, H.S. Variation in the PDE4D gene and ischemic stroke risk. A systematic review and meta-analysis on 5200 cases and 6600 controls // Stroke. –2008. – P.39 71. Bevan S., Markus H. The genetics of stroke // ACNR. – 2004. – V. 4. № 4. – Pp. 9–11 72. Bevan S., Porteous L., Sitzer M., Markus H. S. Phosphodiesterase 4D gene, ischemic stroke and asymptomic carotid atherosclerosis // Stroke. – 2005. – 36. – Pp. 949—953 73. Bhat V.M., Cole J.W., Sorkin J.D., Wozniak M.A., Malarcher A.M., Giles W.H., Stern B.J., Kittner S.J. Dose-response relationship between cigarette smoking and risk of ischemic stroke in young women // Stroke. – 2008. – 39(9). – Pp. 2439-43 121 74. Bin Wanga, Hongye Zhaoa, Li Zhou, Xiaoxi Daic, Dayu Wang, Jun Cao, Wenquan Niu. Association of genetic variation in apolipoprotein E and low density lipoprotein receptor with ischemic stroke in Northern Han Chinese // Journal of the Neurological Sciences. – 2009. – V. 276, Issues 1-2. – Pp. 118-122 75. Biswas A., Ranjan R., Meena A., Akhter M.S., Yadav B.K., Munisamy M., Subbiah V., Behari M., Saxena R. Homocystine levels, polymorphisms and the risk of ischemic stroke in young Asian Indians // J Stroke Cerebrovasc Dis. – 2009. – 18. – Pp. 103–110 76. Blobe G.C., Schiemann W.P., Lodish H.F. Role of transforming growth factor beta in human disease // N Engl J Med. – 2000. – 342. – Pp. 1350–7 77. Bonilla F.A., Bernstein I.L., Khan D.A., Ballas Z.K., Chinen J., Frank M.M., Kobrynski L.J., Levinson A.I., Mazer B., Nelson R.P. Jr, Orange J.S., Routes J.M., Shearer W.T., Sorensen R.U. Practice parameter for the diagnosis and management of primary immunodeficiency // Ann Allergy Asthma Immunol. – 2005. –94 (5 Suppl 1). – Pp. 1–63, 78. Bonita R., Beaglehole R., Asplund K. The worldwide problem of stroke // Curr Opin Neurol. – 1994. – 7(1). – Pp. 5-10 79. Bonita R., Broad J.B., Beaglehole R. Ethnic Difference in Stroke Incidence and Case Fatality in Aukland, New Zeland // Stroke. – 1997. – Vol. 28, № 4. – Pp. 758 – 761 80. Bowcock A. M.; Kidd, J. R.; Lathrop, G. M. et al. The human 'interferon-beta- 2/hepatocyte stimulating factor/interleukin-6' gene: DNA polymorphism studies and localization to chromosome 7p21 // Genomics. – 1988. – 3. –Pp. 8-16 81. Bowman T. S. et al. Cholesterol and the risk of ischemic stroke // Stroke. – 2003. – Vol. 12, № 34. – Pp. 2930 – 2934 82. Brass LM, Alberts MJ.: The genetics of cerebrovascular disease. //Baillieres Clin Neurol. – 1995. Aug;4(2). – Pp. 221-45 83. Brenneman DE, Schultzberg M, Bartfai T, Gozes I. Cytokine regulation of neuronal survival // J Neurochem. – 1992. Feb;58(2). – Pp. 454-60 122 84. Brophy V.H., Ro S.K., Rhees B.K. et al. Association of phosphodiesterase 4D polymorphism with ischaemic stroke in a US population stratified by hypertension status // Stroke. – 2006. – 37. – Pp. 1385—1390 85. Brouwer D.A., van Doormaal J.J., Muskiet F.A.: Clinical chemistry of common apolipoprotein E isoforms.// J Chromatogr B Biomed Appl. – 1996. Mar 29; 678(1). – Pp. 23-41 86. Browning, J.L., Ngam-ek, A., Lawton, P., et.al. Lymphotoxin beta, a novel member of the TNF family that forms a heterodimeric complex with lymphotoxin on the cell surface // Cell. – 1993. – 72. – Pp. 847-856 87. Bullido M.J, Valdivieso F. Apolipoprotein E gene promoter polymorphisms in Alzheimerʼdisease // Micros Res Techn. – 2000. – № 50. – Pp. 261 – 267 88. Buraczynska K, Luchowski P, Wojczal J, Ksiazek A, Stelmasiak Z. Monocyte chemoattractant protein (MCP-1) A-2518G gene polymorphism in stroke patients with different comorbidities // Clin Biochem. – 2010. Dec;43(18). – Pp. 1421-6 89. Carpentier P.A., Duncan D.S., Miller S.D. Glial Toll-like Receptor Signaling in Central Nervous System Infection and Autoimmunity // Brain Behav Immun. – 2008. 22(2). – Pp. 140-147 90. Carty C.L., Heagerty P., Heckbert S.R., Jarvik G.P., Lange L.A., Cushman M., Tracy R.P., Reiner A.P. Interaction between fibrinogen and IL-6 genetic variants and associations with cardiovascular disease risk in the Cardiovascular Health Study // Ann Hum Genet. – 2010. – 74. – Pp. 1-10 91. Casas, J.P., Hingorani, A.D., Bautista, L.E. and Sharma, P. Meta-analysis of genetic studies in ischemic stroke: thirty-two genes involving approximately 18,000 cases and 58,000 controls // Arch. Neurol. – 2004. – 61. – Pp.1652–1661 92. Cavet J., Dickinson A. M., Norden J., Taylor P. R., Jackson G. H., and Middleton P. G., Interferon-gamma and interleukin-6 gene polymorphisms associate with graftversus-host disease in HLA-matched sibling bone marrow transplantation // Blood. – 2001. – 98(5). – Pp. 1594-600 123 93. Chamorro A., Revilla M., Obach V., Vargas M., Planas A.M. The -174G/C polymorphism of the interleukin 6 gene is a hallmark of lacunar stroke and not other ischemic stroke phenotypes // Cerebrovascular Diseases. – 2005. – 19. – Pp. 91−95 94. Chao C.C., Hu S., Ehrlich L., Peterson P.K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of Nmethyl-D-aspartate receptors // Brain Behav Immun. – 1995. – 9. – Pp. 355–365 95. Chao, C.C., Molitor, T.W. & Hu, S. Neuroprotective role of IL-4 against activated microglia // Journal of Immunology. – 1993. – 151. – P. 1473 96. Chen D., Zhao M., Mundy G.R. Bone morphogenetic proteins // Growth Factors. – 2004. – V.22 №4. – Рp.233-41 97. Chen W., Jin W., Wahl S.M. Engagement of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) induces transforming growth factor beta (TGF-beta) production by murine CD4(+) T cells // J Exp Med. – 1998. – V.188 №10. – Рp.1849-57 98. Chen X.C., Xu M.T., Zhou W., Han C.L., Chen W.Q. A meta-analysis of beta- fibrinogen gene -455G/A polymorphism and plasma fibrinogen level in Chinese cerebral infarction patients // Biomed Environ Sci. – 2007. – 20. – Pp. 366−372 99. Chen X.C., Xu M.T., Zhou W., Han C.L., Chen W.Q. A meta-analysis of relationship between β-fibrinogen gene -148C/T polymorphism and susceptibility to cerebral infarction in Han Chinese // Chin Med J (Engl). – 2007. – 120. – Pp.1198–1202 100. Cheng J., Liu J., Li X., Yu L., Peng J., Zhang R., Geng Y., Nie S. Effect of polymorphisms of endothelial nitric oxide synthase on ischemic stroke: a case-control study in a Chinese population // Clin Chim Acta. – 2008. Jun;392(1-2). – Pp. 46-51 101. Chomarat, P., Vannier, E., Dechanet, J., Rissoan, M. C., Banchereau, J., Dinarello, C. A., et al. Balance of IL-1 receptor antagonist/IL-1 beta in rheumatoid synovium and its regulation by IL-4 and IL-10 // Journal of Immunology. – 1995. – 154. – Pp. 1432–1439 102. Cole JW, Brown DW, Giles WH, Stine OC, O'Connell JR, Mitchell BD, Sorkin JD, Wozniak MA, Stern BJ, Sparks MJ, Dobbins MT, Shoffner LT, Zappala NK, Reinhart LJ, Kittner SJ. Ischemic stroke risk, smoking, and the genetics of inflammation 124 in a biracial population: the stroke prevention in young women study // Thromb J. – 2008. Aug 26. – Pp. 6-11 103. Conley E.C. The Ion Channel Facts Book: Extracellular Ligand-Gated Channels // Cell Calcium. – 1996. – Vol. 11. – Pp. 233-239 104. Corella D., Guillen M., Saiz C. et al. Environmental factors modulate the effect of the APOE genetic polymorphism on plasma lipid concentrations: ecogenetic studies in a Mediterranean Spanish population // Metabolism. — 2001. — 50, № 8. — Pp. 936–944 105. Crisan D., Carr J. Angiotensin I-Converting Enzyme. Genotype and Disease Associations // JMD. –2000. –Vol. 2, № 3. P. 105 106. Crobu F, Palumbo L, Franco E, Bergerone S, Carturan S, Guarrera S, Frea S, Trevi G, Piazza A, Matullo G. Role of TGF-beta1 haplotypes in the occurrence of myocardial infarction in young Italian patients // BMC Med Genet. – 2008. – Feb 29. – 9 P. 13 107. Dalziel B, Gosby A, Richman R, Bryson J, Caterson I. Association of the TNF-α (−308 G/A) promoter polymorphism with insulin resistance in obesity // Obes Res. – 2002. – 10(5). – Pp.401–407 108. Dayer J.M., Choy E. Therapeutic targets in rheumatoid arthritis: the interleukin-6 receptor // Rheumatology (Oxford). – 2010. – 49(1). – Pp. 15–24 109. de Bakker PI, Yelensky R, Pe'er I, Gabriel SB, Daly MJ, Altshuler D. Efficiency and power in genetic association studies // Nat Genet. – 2005. –Nov; 37(11). – Pp.121723 110. Dichgans, M. Genetics of ischaemic stroke // Lancet Neurol. – 2007. –6. – Pp. 149–161 111. Domingues-Montanari S, Fernandez-Cadenas I, del Rio-Espinola A, Mendioroz M, Ribo M, Obach V, Marti-Fabregas J, Freijo M, Serena J, Corbeto N, Chacon P, Alvarez-Sabin J, Montaner J. The I/D polymorphism of the ACE1 gene is not associated with ischemic stroke in Spanish individuals // Eur J Neurol. – 2010. – Nov;17(11). – Pp. 1390-1392 112. Donnan G.A., Fisher M., Macleod M., Davis S.M. Stroke // Lancet. – 2008. –10. – Pp. 1612–1623 125 113. Donner H., H. Rau P. G., Walfish J. Braun, T. Siegmund R. Finke, J. Herwi, K. H. Usadel K. Badenhoop. CTLA4 alanine-17 confers genetic susceptibility to Graves’ disease and to type 1 diabetes mellitus // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1997. – 82. – Pp. 143 114. Duan H, Cai Y, Sun X. Platelet glycoprotein IIb/IIIa polymorphism HPA-3 b/b is associated with increased risk of ischemic stroke in patients under 60 years of age // Med Sci Monit. – 2012. – Jan;18(1). – Pp. 19-24 115. Duan H.O., Simpson-Haidaris P.J. Functional analysis of interleukin 6 response elements (IL-6REs) on the human gamma-fibrinogen promoter: binding of hepatic Stat3 correlates negatively with transactivation potential of type II IL-6Res // J Biol Chem. – 2003. – 278. – Pp. 41270-41281 116. Dunning AM, Ellis PD, McBride S, Kirschenlohr HL, Healey CS, Kemp PR, Luben RN, Chang-Claude J, Mannermaa A, Kataja V, Pharoah PD, Easton DF, Ponder BA, Metcalfe JC. A transforming growth factorbeta1 signal peptide variant increases secretion in vitro and is associated with increased incidence of invasive breast cancer // Cancer Res. – 2003. – May 15;63(10). – Pp. 2610-2615 117. Dziedzic T, Slowik A, Pera J, Szczudlik A.: Interleukin 1 beta polymorphism (511) and risk of stroke due to small vessel disease. // Cerebrovasc Dis. – 2005. – 20(5). – Pp. 299-303 118. El-Gamel A, Awad M, Sim E, Hasleton P, Yonan N, Egan J, Deiraniya A, Hutchinson IV. Transforming growth factor-beta1 and lung allograft fibrosis // Eur. J. Cardiothorac. Surg. – 1998. – 13. – Pp. 424– 430 119. Ellerby L.M., Ellerby H.M., Park S.M. et al. Shift of the cellular oxidationreduction potential in neural cells expressing Bcl-2 // J Neurochem. – 1996. – 67. – Pp. 1259-1267 120. Engel M.E., Datta P.K., Moses H.L. Signal transduction by transforming growth factor-beta: a cooperative paradigm with extensive negative regulation // J Cell Biochem Suppl. – 1998. – V.30-31. – Рp.111-122 121. Etokebe GE, Bulat-Kardum L, Johansen MS, Knezevic J, Balen S, MatakovicMileusnic N, Matanic D, Flego V, Pavelic J, Beg-Zec Z, Dembic Z. Interferon-gamma 126 gene (T874A and G2109A) polymorphisms are associated with microscopy-positive tuberculosis // Scand J Immunol. – 2006. – Feb;63(2). – Pp. 136-41 122. Favorov A.V., Andreewski T.V., Sudomoina M.A., Favorova O.O., Parmigiani G., Ochs M.F. A Markov chain Monte Carlo technique for identification of combinations of allelic variants underlying complex diseases in humans // Genetics. – 2005. – Dec;171(4). – Pp. 2113-21 123. Favorova O.O., Favorov A.V., Boiko A.N., Andreewski T.V., Sudomoina M.A., Alekseenkov A.D., Kulakova O.G., Gusev E.I., Parmigiani G., Ochs M.F. Three allele combinations associated with multiple sclerosis // BMC Med Genet. – 2006. – Jul 26;7. – P. 63 124. Ferrari J, Rieger S, Endler G, Greisenegger S, Funk M, Scholze T, Lang W, Lalouschek W, Mannhalter C.: The Thr715Pro polymorphism of the P-selectin gene is not associated with ischemic stroke risk // Stroke. – 2007. – Feb; 38(2). – Pp. 395-7 125. Ferrucci L., Guralnik J.M., Pahor M., Harris T., Corti M.C., Hyman B.T., Wallace R.B., Havlik R.J.: Apolipoprotein E epsilon 2 allele and risk of stroke in the older population.// Stroke. – 1997. Dec;28(12). – Pp. 2410-2416 126. Fishman D, Faulds G, Jeffery R et al. The effect of novel polymorphisms in the interleukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis // J Clin Invest. – 1998. – Oct 1;102(7). – Pp.1369-1376 127. Flex A., Gaetani E., Papaleo P., Straface G., Proia A.S., Pecorini G., Tondi P., Pola P., Pola R. Proinflammatory genetic profiles in subjects with history of ischemic stroke // Stroke. – 2004. – Oct;35(10). – Pp. 2270-2275 128. Flossmann E., Rothwell P.M. Family history of stroke in patients with transient ischemic attack in relation to hypertension and other intermediate phenotypes. // Stroke. – 2005. – Apr;36(4). – Pp. 830-835 129. Flossmann E., Rothwell P.M. Family history of stroke does not predict risk of stroke after transient ischemic attack. // Stroke. – 2006. – Feb;37(2). – Pp. 544-546 127 130. Flossmann E., Schulz U.G., Rothwell P.M. A systematic review of the methods and results of studies of the genetic epidemiology of ischaemic stroke // Stroke. – 2004. – 35. – Pp.212–227 131. Flossmann E., Schulz U.G., Rothwell P.M. Potential confounding by intermediate phenotypes in studies of the genetics of ischaemic stroke. // Cerebrovasc Dis. – 2005 .19(1). – Pp. 1-10 132. Folcik VA, Smith T, O'Bryant S, Kawczak JA, Zhu B, Sakurai H, Kajiwara A, Staddon JM, Glabinski A, Chernosky AL, Tani M, Johnson JM, Tuohy VK, Rubin LL, Ransohoff RM. Treatment with BBB022A or rolipram stabilizes the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis: an additional mechanism for the therapeutic effect of type IV phosphodiesterase inhibitors // J Neuroimmunol. – 1999. – Jun 1;97(1-2). – Pp. 119-28 133. Folkert W., Jennifer K., Kathryn M.et al. Effects of lymphotoxin-α gene and galectin-2 gene polymorphisms on inflammatory biomarkers, cellular adhesion molecules and risk of coronary heart disease // Clinical Science. – 2007. – 112. – Pp. 291–298 134. Fornage M. Genetics of stroke // Curr Atheroscler Rep. – 2009. – 11; 3. – Pp. 167-174 135. Fornage M, Debette S, Bis JC, Schmidt H, Ikram MA, Dufouil C, Sigurdsson S, Lumley T, DeStefano AL, Fazekas F, Vrooman HA, Shibata DK, Maillard P, Zijdenbos A, Smith AV, Gudnason H, de Boer R, Cushman M, Mazoyer B, Heiss G, Vernooij MW, Enzinger C, Glazer NL, Beiser A, Knopman DS, Cavalieri M, Niessen WJ, Harris TB, Petrovic K, Lopez OL, Au R, Lambert JC, Hofman A, Gottesman RF, Garcia M, Heckbert SR, Atwood LD, Catellier DJ, Uitterlinden AG, Yang Q, Smith NL, Aspelund T, Romero JR, Rice K, Taylor KD, Nalls MA, Rotter JI, Sharrett R, van Duijn CM, Amouyel P, Wolf PA, Gudnason V, van der Lugt A, Boerwinkle E, Psaty BM, Seshadri S, Tzourio C, Breteler MM, Mosley TH, Schmidt R, Longstreth WT, DeCarli C, Launer LJ. Genome-wide association studies of cerebral white matter lesion burden: the CHARGE consortium // Ann Neurol. – 2011. – Jun;69(6). – Pp. 928-939 128 136. Freilinger T, Bevan S, Ripke S, Gschwendtner A, Lichtner P, Müller-Myhsok B, Wichmann HE, Markus HS, Meitinger T, Dichgans M. Genetic variation in the lymphotoxin-alpha pathway and the risk of ischemic stroke in European populations // Stroke. – 2009. – Mar;40(3). – Pp. 970-2 137. Frigerio S., Gelati M., Ciusani E., Corsini E., Dufour A., Massa G., Salmaggi A. Immunocompetence of human microvascular brain endothelial cells: cytokine regulation of IL-1beta, MCP-1, IL-10, sICAM-1 and sVCAM-1 // J Neurol. – 1998. – V.245 №11. – Рp.727-30 138. Frossard P.M., Malloy M.J., Lestringant G.G., Kane J.P.: Haplotypes of the human renin gene associated with essential hypertension and stroke.// Hum Hypertens. – 2001. – Jan;15(1). – Pp. 49-55 139. Frosst P, Blom HJ, Milos R,Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers GJ, den Heijer M, Kluijtmans LA, van den Heuvel LP, Rozen R. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylentetrahydrofolate reductase // Nat Genet. – 1995. – 10. – Pp. 111–113 140. Fukumoto S., Koyama H., Hosoi M. et al. Distinct role of cAMP and cGMP in the cell cycle control of vascular smooth muscle cells: cGMP delays cell cycle transition through suppression of cyclin D1 and cyclin dependent kinase 4 activation // Circ. Res. – 1999. – V. 85. № 11. – Pp. 985–991 141. Fuller G.M., Zhang Z. Transcriptional control mechanism of fibrinogen gene expression // Ann N Y Acad Sci. – 2001. – 936. – Pp. 469-447 142. Gangwar R., Pandey S., Mittal R.D. Association of interferon-γ+874A polymorphism with the risk of developing cervical cancer in north-Indian population // BJOG. 2009. – 116. – Pp. 1671–1677 143. Gao J, Sun YF, Li YL, Su LK, Guo L. Hyperhomocysteine, genetic polymorphism of methylenetetra-hydrofolate reductase in young adults with ischemic stroke // J Zhengzhou Univ Med Sci. – 2008. – 43. – Pp. 570–573 144. González Hernández A. et al. Risk factors, etiology and prognosis in patients with ischemic stroke and diabetes mellitus // Rev Clin Esp. – 2008. – Vol. 208, № 11. – Pp. 546 – 550 129 145. Goracy I, Cyryłowski L, Kaczmarczyk M, Fabian A, Koziarska D, Goracy J, Ciechanowicz A. C677T polymorphism of the methylenetetrahydrofolate reductase gene and the risk of ischemic stroke in Polish subjects // J Appl Genet. – 2009. – 50. – Pp. 63–67 146. Gormley K, Bevan S, Markus HS.: Polymorphisms in genes of the reninangiotensin system and cerebral small vessel disease. // Cerebrovasc Dis. – 2007. – 23(2-3). – Pp. 148-55 147. Grainger DJ, Kemp PR, Liu AC, Lawn RM, Metcalfe JC. Activation of transforming growth factor-ß is inhibited in transgenic apolipoprotein(a) mice // Nature. – 1994. – 370. – Pp. 460-462 148. Greisenegger S, Endler G, Haering D, Schillinger M, Lang W, Lalouschek W, et al. The (174) G/C polymorphism in the interleukin-6 gene is associated with the severity of acute cerebrovascular events // Thromb Res. – 2003. – 110. – Pp. 181–6 149. Gretarsdottir S, Thorleifsson G, Reynisdottir ST, et al. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke // Nat Genet. – 2003. – 35. – Pp. 131–138 150. Gretarsdottir, S., Thorleifsson, G., Manolescu, A., Styrkarsdottir, U.Helgadottir, A., Gschwendtner, A., Kostulas, K., Kuhlenba¨umer, G., Bevan, S., Jonsdottir, T. et al. Risk variants for atrial fibrillation on chromosome 4q25 associate with ischemic stroke // Ann. Neurol. –2008. – 64. – Pp. 402–409 151. Gschwendtner A., Bevan S., Cole J. W. et al., Sequence variants on chromosome 9p21.3 confer risk for atherosclerotic stroke // Annals of Neurology. – 2009. – vol. 65, №. 5. – Pp. 531–539 152. Gudbjartsson, D.F.,Holm, H.,Gretarsdottir, S., Thorleifsson,G.,Walters, G.B., Thorgeirsson, G., Gulcher, J., Mathiesen, E.B., Njølstad, I., Nyrnes, A. et al. Asequence variant inZFHX3on 16q22 associateswith atrial fibrillation and ischemic stroke // Nat. Genet. – 2009. – 41. – Pp. 876–878 153. Guldiken B., Guldiken S., Turgut B. et al. The roles of oxidized low-density lipoprotein and interleukin-6 levels in acute atherothrombotic and lacunar ischemic stroke // Angiology.– 2008.– Vol.59, №2.– Pp.224–229 130 154. Haddad M., Rhinn H., Bloquel C., B. Coqueran, C. Szabo, M. Plotkine, D. Scherman, I. Margaill. Anti-inflammatory effects of PJ34, a poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor, in transient focal cerebral ischemia in mice // Br. J. Pharmacol. – 2006. – 149. – Pp. 23–30 155. Hagiwara N, Kitazono T, Kamouchi M, Kuroda J, Ago T, Hata J, Ninomiya T, Ooboshi H, Kumai Y, Yoshimura S, Tamaki K, Fujii K, Nagao T, Okada Y, Toyoda K, Nakane H, Sugimori H, Yamashita Y, Wakugawa Y, Kubo M, Tanizaki Y, Kiyohara Y, Ibayashi S, Iida M. Polymorphisms in the lymphotoxin alpha gene and the risk of ischemic stroke in the Japanese population. The Fukuoka Stroke Registry and the Hisayama Study // Cerebrovasc Dis. – 2008. – 25(5). – Pp. 417-22 156. Hakonarson H. Role of FLAP and PDE4D in myocardial infarction and stroke: target discovery and future treatment options // Curr. Treat. Options Cardiovasc. Med. – 2006. – V. 8. № 3. – Pp. 183–192 157. Halliwell B.L. Packer L., Prilipko Y. Free Radicals in the Brain // Aging, Neurological and Mental Disorders (Christen Y. ed). Berlin. – 1992. – Pp. 21-40 158. Hansson GK, Robertson AK, Söderberg-Nauclér C. Inflammation and atherosclerosis.// Annu Rev Pathol. – 2006. – Pp.297-329 159. Harbuzova VIu, Matlaĭ O.I., Ataman Iu.O., Dubovyk Ie.I, Borodenko A.O., Obukhova O.A., Ataman O.V. The polymorphism of matrix Gla-protein gene in ischemic atherothrombotic stroke patients // Fiziol Zh. – 2012. – 58(5). – Pp. 14-21 160. Harcos P, Laki J, Kiszel P, Széplaki Z, Szolnoki Z, Kovács M, Melegh B, Széplaki G, Füst G, Blaskó B. Decreased frequency of the TNF2 allele of TNF-alpha 308 promoter polymorphism is associated with lacunar infarction // Cytokine. – 2006. – Jan 21;33(2). – Pp. 100-5 161. Hassan A, Gormley K, O'Sullivan M, Knight J, Sham P, Vallance P, Bamford J, Markus H. Endothelial nitric oxide gene haplotypes and risk of cerebral small-vessel disease // Stroke. – 2004. – Mar;35(3). – Pp. 654-659 162. Hassan A. and Markus H. S. Genetics and ischaemic stroke // Brain. – 2000. – vol. 123, №. 9. – Pp. 1784–1812 131 163. Heinrich P.C., Behrmann I., Haan S. et al. Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation // Biochem J. – 2003. – 15(374). – Pp. 1–20 164. Heinrich P.C., Castell J.V., Andus T. Interleukin-6 and the acute phase response // Biochem J. – 1990. – 265. – Pp. 621–636 165. Heldin C-H., Miyazono K. & Dijke P.ten TGF-b signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins // Nature. – 1997. – 390. – Pp. 465-471 166. Helgadottir, A., Manolescu, A., Thorleifsson, G., Gretarsdottir, S.,Jonsdottir, H., Thorsteinsdottir, U., Samani, N.J., Gudmundsson, G.,Grant, S.F., Thorgeirsson, G. et al. The gene encoding 5-lipoxygenase activating protein confers risk of myocardial infarction and stroke // Nat. Genet. – 2004. – 36. – Pp. 233–239 167. He Y, Bai JY, Song B, Tan S, Chang YS, Li T, Shi CC, Zhang H, Feng QC, Qi H, Song GY, Zheng H, Xu YM. Sex-dependent association of phosphodiesterase 4D gene polymorphisms with ischemic stroke in Henan Han population // Chin Med J (Engl). – 2012. – Jul;125(13). – Pp. 2255-2259 168. He Y, Lam TH, Jiang B, Wang J, Sai X, Fan L, Li X, Qin Y, Hu FB. Passive smoking and risk of peripheral arterial disease and ischemic stroke in Chinese women who never smoked // Circulation. – 2008. – Oct 7;118(15). – Pp. 1535-1540 169. He Z., Crook J.-E., Meschia J.-F., Brott T.-G., Dickson D.-W., and Mickinney M. Aging Blunts Ischemic-Preconditioning-Induced Neuroprotection Following Transient Global Ischemia in Rats // Curr. Neurovasc. Res. – 2005. – 2. – Pp.365−374 170. He Z, He B, Behrle BL, Fejleh MP, Cui L, Paule MG, Greenfield LJ. IschemiaInduced Increase in Microvascular Phosphodiesterase 4D Expression in Rat Hippocampus Associated with Blood Brain Barrier Permeability: Effect of Age // ACS Chem Neurosci. – 2012. – Jun 20;3(6). – Pp. 428-32 171. He Z., Meschia J.-F., Brott T.-G., Dickson D.-W., and Mickinney M. Aging is Neuroprotective during Global Ischemia but Leads to Increased Caspase-3 and Apoptotic Activity in Hippocampal Neurons // Curr. Neurovasc. Res. – 2006. – 3. – Pp. 181−186 172. Hindorff L.A., Sethupathy P., Junkins H.A., Ramos E.M.,Mehta J.P., Collins F.S., Manolio T.A. Potential etiologic and functional implications of genome-wide 132 association loci for human diseases and traits // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. – 2009. – V. 106. – Pp. 9362–9367 173. Hoffmeister H.M., Kozmaier S. Activation of inflammatory pathways in acute coronary syndromes // Europ. Heart J. – 2000. – Vol. 21. – Pp. 650-656 174. Horenstein R., Smith D., Mosca L. Cholesterol predicts stroke mortality in the women's pooling project // Stroke. – 2002. – 33, – Pp. 1863-1868 175. Hotamisligil G. Inflammation and metabolic disorders // Nature. – 2006. – 444(14). – Pp. 860–867 176. Hou L, Osei-Hyiaman D, Yu H, Ren Z, Zhang Z, Wang B, Harada S. Association of a 27-bp repeat polymorphism in ecNOS gene with ischemic stroke in Chinese patients // Neurology. – 2001. – Feb 27;56(4). – Pp. 490-6 177. Houslay M.D., Adams D.R. PDE4 cAMP phosphodiesterases: modular enzymes that orchestrate signaling cross-talk, desensitization and compartmentalization //Biochem. J. – 2003. – V. 370. – Pp. 1–18 178. Howard TD, Giles WH, Xu J, Wozniak MA, Malarcher AM, Lange LA, Macko RF, Basehore MJ, Meyers DA, Cole JW, Kittner SJ. Promoter polymorphisms in the nitric oxide synthase 3 gene are associated with ischemic stroke susceptibility in young black women // Stroke. – 2005. – Sep;36(9). – Pp. 1848-1851 179. Huang W., Chen Q.W., Lei H., Deng W, Ke DZ. Predictive value of fibrinogen and high-sensitivity C-reaction protein for cardiovascular events in patients with stable coronary artery disease // Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. – 2006. – Aug;34(8). – Pp. 718-21 180. Hunt P.J., Marshall S.E., Weetman A.P., Bell J.I., Wass J.A., Welsh K.I. Cytokine gene polymorphisms in autoimmune thyroid disease // J Clin Endocrinol Metab. – 2000. – V.85 №5. – Рp.1984-1988 181. Iacoviello L, Di Castelnuovo A, Gattone M, Pezzini A, Assanelli D, Lorenzet R, Del Zotto E, Colombo M, Napoleone E, Amore C, D'Orazio A, Padovani A, de Gaetano G, Giannuzzi P, Donati MB; IGIGI Investigators. Polymorphisms of the interleukin1beta gene affect the risk of myocardial infarction and ischemic stroke at young age and 133 the response of mononuclear cells to stimulation in vitro // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2005. – Jan;25(1). – Pp. 222-227 182. Ianni M, Callegari S, Rizzo A, Pastori P, Moruzzi P, Corradi D, Porcellini E, Campo G, Ferrari R, Ferrario MM, Bitonte S, Carbone I, Licastro F. Pro-inflammatory genetic profile and familiarity of acute myocardial infarction // Immun Ageing. – 2012. – Jun 24;9(1). – P. 14 183. Ignotz RA, Massague J. Transforming growth factor-beta stimulates the expression of fibronectin and collagen and their incorporation into the extracellular matrix // J Biol Chem. – 1986. – 261. – Pp. 4337-4345 184. Ikeda K, Nara Y, Matumoto C, Mashimo T, Tamada T, Sawamura M, Nabika T, Yamori Y.: The region responsible for stroke on chromosome 4 in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. // Biochem Biophys Res Commun. – 1996. – Dec 13;229(2). – Pp. 658-62 185. Ikram MA, Seshadri S, Bis JC, Fornage M, DeStefano AL, Aulchenko YS, Debette S, Lumley T, Folsom AR, van den Herik EG, Bos MJ, Beiser A, Cushman M, Launer LJ, Shahar E, Struchalin M, Du Y, Glazer NL, Rosamond WD, Rivadeneira F, Kelly-Hayes M, Lopez OL, Coresh J, Hofman A, DeCarli C, Heckbert SR, Koudstaal PJ, Yang Q, Smith NL, Kase CS, Rice K, Haritunians T, Roks G, de Kort PL, Taylor KD, de Lau LM, Oostra BA, Uitterlinden AG, Rotter JI, Boerwinkle E, Psaty BM, Mosley TH, van Duijn CM, Breteler MM, Longstreth WT Jr, Wolf PA. Genomewide association studies of stroke // N Engl J Med. – 2009. – Apr 23;360(17). – Pp. 17181728 186. Illig T, Bongardt F, Schöpfer et al. Kooperative Gesundheitsforschung im Raum Augsburg/Cooperative Research in the Region of Augsburg. Significant association of the interleukin-6 gene polymorphisms C-174G and A-598G with type 2 diabetes // J Clin Endocrinol Metab. – 2004 Oct;89(10). – Pp. 5053-5058 187. Indolfi C., Di Lorenzo E., Rapacciuolo A. et al. 8-chloro-cAMP inhibits smooth muscle cell proliferation in vitro and neointima formation induced by balloon injury in vivo // J. Am. Coll. Cardiol. – 2000. – V. 36. № 1. – Pp. 288–293 134 188. Ishikawa E, Ibayashi S. Blood pressure lowering therapy for mild hypertensive patients with a history of stroke // Nippon Rinsho. – 2008. – Vol. 66, № 8. – Pp. 1560 – 1565 189. Jacob C., Martin Chouly C., Lagente V. Type 4 phosphodiesterasedependent pathways: Role in inflammatory processes // Therapie. – 2002. – V. 57. № 2. – Pp. 163– 168 190. Jansen M, Dannhardt G. Antagonists and agonists at the glycine site of the NMDA receptor for therapeutic interventions.// Eur J Med Chem. – 2003. – v.38. – Pp. 661-670 191. Jeffs B, Clark JS, Anderson NH, Gratton J, Brosnan MJ, Gauguier D, et al. Sensitivity to cerebral ischemic insult in a rat model of stroke is determined by a single genetic locus // Nat Genet. – 1997. – 16. – Pp. 364-7 192. Jenny N.S., Tracy R.P., Ogg M.S., Luong le A., Kuller L.H., Arnold A.M., Sharrett A.R., Humphries S.E. In the elderly, interleukin6 plasma levels and the – 174G>C polymorphism are associated with the development of cardiovascular disease // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2002. – 22. – Pp. 2066–2071 193. Jongeneel C. V.; Briant L.; Udalova I. A. et al. Extensive genetic polymorphism in the human tumor necrosis factor region and relation to extended HLA haplotypes // Proc. Nat. Acad. Sci. – 1991. – 88. – Pp. 9717-9721 194. Jovanović D. R.Etiology of ischemic stroke among young adults of Serbia // Vojnosanit Pregl. – 2008. – Vol. 65, № 11. – Pp. 803 – 809 195. Kamali-Sarvestani E., Merat A., Talei A.R. Polymorphism in the genes of alpha and beta tumor necrosis factors (TNF-alpha and TNF-beta) and gamma interferon (IFNgamma) among Iranian women with breast cancer // Cancer Lett. – 2005. – 223. – Pp. 113–119 196. Karahan ZC, Deda G, Sipahi T, et al. TNF-alpha -308G/A and IL-6 -174 G/C polymorphisms in the Turkish pediatric stroke patients // Thromb Res. – 2005. – 1155. – Pp. 393 -398 135 197. Katsuno, M., Yokota, H., Yamamoto, Y. & Teramoto, A. Increased regional interleukin-4 during the acute stage of severe intracranial disorders // Neurologia Medico-Chirurgica. – 2006. – 46. – Pp. 47 198. Kavvoura F. K., Akamizu T., Awata T., Ban Y., Chistiakov D. A., Frydecka I., Ghaderi A., Gough S. C., Hiromatsu Y., Ploski R., Wang P. W., Bednarczuk T., Chistiakova E. I., Chojm M., Heward J. M., Hiratani H., Juo S. H., Karabon L., Katayama S., Kurihara S., Liu R. T., Miyake I., Omrani G. H., Pawlak E., Taniyama M., Tozaki T., and Ioannidis J. P. Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4 gene polymorphisms and autoimmune thyroid disease: a meta-analysis // J Clin Endocrinol Metab. – 2007. – 92(8). – Pp. 3162-3170 199. Khealani BA, Wasay M. The burden of stroke in Pakistan // Int J Stroke. – 2008. – Vol. 3, № 4. – Pp. 293 – 296 200. Khalangot M. et al. Gender Risk of Nonfatal Stroke in Type 2 Diabetic Patients Differs Depending on the Type of Treatment // J Womens Health. – 2008. – Pp. 23 201. Kiechl S., Reindl M., Wiedermann C.J. et al. Toll-like receptor 4 polymorphisms and atherogenesis // N Engl J Med. – 2002. – 347. – Pp. 185-192 202. Kim IY, Kim MM, Kim SJ. Transforming growth factor-beta : biology and clinical relevance // J Biochem Mol Biol. – 2005. – Jan 31;38(1). – Pp. 1-8 203. Kim JS. Cytokines and adhesion molecules in stroke and related diseases // J Neurol Sci. – 1996. – May;137(2). – Pp. 69-78 204. Kim MK, Kim JT, Choi SM, Lee SH, Park MS, Cho KH. Phosphodiesterase 4D gene and risk of noncardiogenic ischemic stroke in a Korean population // J Korean Med Sci. – 2009. – Apr;24(2). – Pp. 307-10 205. Kim OJ, Lee JH, Choi JK, Oh SH, Hong SH, Oh D, Kim NK. Association between tumor necrosis factor-alpha (-308G→A and -238G→A) polymorphisms and homocysteine levels in patients with ischemic strokes and silent brain infarctions // Cerebrovasc Dis. – 2010;30(5). – Pp. 483-90 206. Koenig W; Khuseyinova N. Biomarkers of Atherosclerotic Plaque Instability and Rupture // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. – 2007. – 27. – P.15 136 207. Kohsaka S., Volcik K., Folsom A.et al. Increased risk of incident stroke associated with the cyclooxygenase 2 (COX-2) G -765C polymorphism in AfricanAmericans: The Atherosclerosis Risk in Communities Study // Atherosclerosis. – 2008. – 196. – Pp. 926–930 208. Kokubo Y., Chowdhury A.H., Date C., Yokoyama T., Sobue H., Tanaka H.: Agedependent association of apolipoprotein E genotypes with stroke subtypes in a Japanese rural population.// Stroke. – 2000. – Jun;31(6). – Pp. 1299-306 209. Kokubo Y, Tomoike H, Tanaka C, Banno M, Okuda T, Inamoto N, Kamide K, Kawano Y, Miyata T. 13. Association of sixty-one non-synonymous polymorphisms in forty-one hypertension candidate genes with blood pressure variation and hypertension // Hypertens Res. – 2006. – Aug;29(8). – Pp. 611-9 210. Kouki T., Y. Sawai C. Gardine M.-E. Fisfalen M.-L. Alegre L. J. DeGroot. 2000. CTLA-4 gene polymorphism at position 49 in exon 1 reduces the inhibitory function of CTLA-4 and contributes to the pathogenesis of Graves’ disease // J. Immunol. – 165:6606 211. Kouwenhoven M., Carlstrom C., Ozenci V., Link H. Matrix metalloproteinase and cytokine profiles in monocytes over the course of stroke // J Clin Immunol. – 2001. – Pp. 365–375 212. Kreutzberg G.W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS // Trends Neurosci. – 1996. – V.19 №8. – Рp.312-8 213. Kristiansen OP, Nolsøe RL, Larsen L et al. Association of a functional 17betaestradiol sensitive IL6-174G/C promoter polymorphism with early-onset type 1 diabetes in females // Hum Mol Genet. – 2003. – May 153;12(10). – Pp. 1101-10 214. Kuhlenbäumer G, Berger K, Huge A, Lange E, Kessler C, John U, Funke H, Nabavi DG, Stögbauer F, Ringelstein EB, Stoll M. Evaluation of single nucleotide polymorphisms in the phosphodiesterase 4D gene (PDE4D) and their association with ischaemic stroke in a large German cohort // J Neurol Neurosurg Psychiatry. – 2006. – Apr;77(4). – Pp. 521-4 215. Kurth T. et al. Lipid levels and the risk of ischemic stroke in women // In: Neurology. – 2007. – 68. – Pp. 556-562 137 216. Labreuche J., Touboul P. J., Amarenco P. Plasma triglyceride levels and risk of stroke and carotid atherosclerosis: A systematic review of the epidemiological studies // Atherosclerosis. – 2008. – № 10 217. Lafon M., Megret F., Lafage M. The innate immune facet of brain // Journal of Molecular Neuroscience. – 2006. – 29(3). – Pp. 185-194 218. Lai J, Zhou D, Xia S, Shang Y, Zhu J, Pan J, Hua B, Zhu Y, Cui L. Association of interleukin-1 gene cluster polymorphisms with ischemic stroke in a Chinese population // Neurol India. – 2006. – Dec;54(4). – Pp. 366-9 219. Lalouschek W, Endler G, Schillinger M, Hsieh K, Lang W, Cheng S, Bauer P, Wagner O, Mannhalter C. Candidate genetic risk factors of stroke: results of a multilocus genotyping assay // Clin Chem. – 2007. – 53. – Pp. 600–605 220. Lalouschek W., Schillinger M., Hsieh K., Endler G., Greisenegger S., Marculescu R., Lang W., Wagner O., Cheng S., Mannhalter C. Polymorphisms of the inflammatory system and risk of ischemic cerebrovascular events //Clin. Chem. Lab. Med. – 2006. – 44. – Pp. 918–923 221. Lambertsen KL, Gregersen R, Meldgaard M, Clausen BH, Heibøl EK, Ladeby R, Knudsen J, Frandsen A, Owens T, Finsen B. A role for interferon-gamma in focal cerebral ischemia in mice // J Neuropathol Exp Neurol. – 2004. – Sep;63(9). – Pp. 94255 222. Leask A, Abraham DJ. TGF-beta signaling and the fibrotic response // FASEB J. – 2004. – May;18(7). – Pp. 816-27 223. Le Beau, M. M., Lemons, R. S., Espinosa 3rd, R., Larson, R. A., Arai, N., & Rowley, J. D. Interleukin-4 and interleukin-5 map to human chromosome 5 in a region encoding growth factors and receptors and are deleted in myeloid leukemias with a del(5q) // Blood. – 1989. – 73. – Pp. 647–650 224. Leppala J. M. et al. Different risk factors for different stroke subtypes // Stroke. – 1999. – Vol. 30. – Pp. 2535 – 2540 225. Letterio J.J., Roberts A.B. Regulation of immune responses by TGF-beta // Annu Rev Immunol. – 1998. – V.16. – Рp.137-61 138 226. Leung T. W, Kwon S. U, Wong K. S. Management of patients with symptomatic intracranial atherosclerosis // Int J Stroke. – 2006. – Vol. 1. – № 1. – Pp. 20 – 25 227. Liao Y.C., Lin H.F., Guo Y.C., Yu M.L., Liu C.K., Juo S.H. Sex-differential genetic effect of phosphodiesterase 4D (PDE4D) on carotid atherosclerosis // BMC Med Genet. – 2010. – Jun 12;11. – P. 93 228. Libby P. Current concepts of the pathogenesis of the acute coronary syndromes // Circulation. – 2001. – Jul 17;104(3). – Pp. 365-72 229. Libby P, Ridker PM, Maseri A. Inflammation and Atherosclerosis // Circulation. – 2002. – 105. – Pp. 1135–1143 230. Ligers A., Xu C., Saarinen S., Hillert J., and Olerup O., The CTLA-4 gene is associated with multiple sclerosis // J Neuroimmunol. – 1999. – 97(1-2). – Pp. 182-90 231. Linde R., Laursen H., Hansen A.J. Is Calcium Accumulation Post-Injury an Indicator of Cell Damage // Mechanisms of Secondary Brain Gamage in Cerebral Ischemia and Trauma. Springer Wien NY Acta Neurochir. – 1996. – 66. – Pp. 15-20 232. Lin H., Rathmell J.C., Gray G.S., Thompson C.B., Leiden J.M., Alegre M.L. Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA4) blockade accelerates the acute rejection of cardiac allografts in CD28-deficient mice: CTLA4 can function independently of CD28 //J Exp Med. – 1998. – Jul 6;188(1). – Pp. 199-204 233. Li N., He Z., Xu J., Liu F., Deng S., Zhang H. Association of PDE4D and IL-1 gene polymorphism with ischemic stroke in a Han Chinese population // Brain Res Bull. – 2010. – Jan 15;81(1). – Pp. 38-42 234. Lin R.T., Chen C.H., Tsai P.C., Ho B.L., Juo S.H., Lin H.F. Sex-specific effect of matrix metalloproteinase-9 functional promoter polymorphism on carotid artery stiffness // Atherosclerosis. – 2012. – Aug;223(2). – Pp. 416-20 235. Lio D, Marino V, Serauto A, Gioia V, Scola L, Crivello A, Forte GI, ColonnaRomano G, Candore G, Caruso C. Genotype frequencies of the +874T-->A single nucleotide polymorphism in the first intron of the interferon-gamma gene in a sample of Sicilian patients affected by tuberculosis // Eur J Immunogenet. – 2002. – Oct;29(5). – Pp. 371-4 139 236. Liu H., Maurice D.H. Phosphorylation meditated activation and translocation of the cyclic AMP specific phosphodiesterase PDE4D3 by cyclic AMP dependent protein kinase and mitogen-activated protein kinases. A potential mechanism allowing for the coordinated regulation of PDE4D activity and targeting // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 274. № 15. – Pp. 10557–10565 237. Liu Y, Herrington D, Burdon KP, Langefeld CD, Rich SS, Bowden DW, Freedman BI, Wagenknecht LE. A functional polymorphism in the lymphotoxin-alpha gene is associated with carotid artery wall thickness: the Diabetes Heart Study // Eur J Cardiovasc Prev Rehabil. – 2006. – Aug;13(4). – Pp. 655-7 238. Lo J. C.; Wang, Y.; Tumanov, A. V. et al. Lymphotoxin beta receptor-dependent control of lipid homeostasis // Science. – 2007. – 316. – Pp. 285-288 239. Lohmussaar E., Gschwendtner A., Mueller J. C. ALOX5AP gene and PDE4D gene in a central European population of stroke patients // Stroke. – 2005. – 36. – Pp. 731—736 240. Lonneke M. L. De Lau1, Frank W. G. Leebeek, Moniek P. M. De Maat, Peter J. Koudstaal, Diederik W. J. Dippel. Reviews: A review of hereditary and acquired coagulation disorders in the aetiology of ischaemic stroke // Int J Stroke. – 2010. – Oct;5(5). – Pp. 385-94 241. Lopaciuk S, Bykowska K, Kwiecinski H, Mickielewicz A, Czlonkowska A, Mendel T, Kuczynska-Zardzewialy A, Szelagowska D, Windyga J, Schröder W, Herrmann FH, Jedrzejowska H. Factor V Leiden, prothrombin gene G20210A variant, and methylenetetrahydrofolate reductase C677T genotype in young adults with ischemic stroke // Clin Appl Thromb Hemost. – 2001. – 7. – Pp. 346–350 242. Loppnow H., Zhang L., Buerke M., Lautenschläger M., Chen L., Frister A., Schlitt A., Luther T., Song N., Hofmann B., Rose-John S., Silber R.E., Müller-Werdan U., Werdan K. Statins potently reduce the cytokine-mediated IL-6 release in SMC // MNC cocultures. J Cell Mol Med. – 2010. – 15 243. Lovett-Racke, A.E., Smith, M.E., Arredondo, L.R., Bittner, P.S., Ratts, R.B., Shive, C.L., Forsthuber, T.G. & Racke, M.K. Developmentally regulated gene expression of Th2 cytokines in the brain // Brain Research. – 2000. – 870. – P.27 140 244. Lövkvist H, Smith JG, Luthman H, Höglund P, Norrving B, Kristoffersson U, Jönsson AC, Lindgren AG. Ischaemic stroke in hypertensive patients is associated with variations in the PDE4D genome region // Eur J Hum Genet. – 2008. – Sep;16(9). – Pp. 1117-25 245. Lusis A.J. Atherosclerosis // Nature. – 2000. – V. 407. – №68. – Pp. 233–241 246. Lussier Cacan S., Bolduc A., Xhignesse M. et al. Impact of alcohol intake on measures of lipid metabolism depends on context defined by gender, body mass index, cigarette smoking, and apolipoprotein E genotype // Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. — 2002. — 22. — Pp. 824–831 247. Lvovs D., Favorova O.O., Favorov A.V. A Polygenic Approach to the Study of Polygenic Diseases // Acta Naturae. – 2012. – Jul;4(3). – Pp. 59-71 248. Macko RF, Ameriso SF, Gruber A, Griffin JH, Fernandez JA, Barndt R, Quismorio FP Jr, Weiner JM, Fisher M. Impairments of the protein C system and fibrinolysis in infection-associated stroke // Stroke. – 1996. – Nov;27(11). – Pp. 200511 249. Maguire J, Thakkinstian A, Levi C, Lincz L, Bisset L, Sturm J, Scott R, Whyte S, Attia J. Impact of COX-2 rs5275 and rs20417 and GPIIIa rs5918 polymorphisms on 90day ischemic stroke functional outcome: a novel finding // J Stroke Cerebrovasc Dis. – 2011. – Mar-Apr;20(2). – Pp. 134-44 250. Mangan D.F., Robertson B., Wahl S.M. IL-4 enhances programmed cell death (apoptosis) in stimulated human monocytes // J Immunol. – 1992. – V.148, №6. – Рp.1812-6 251. Manji HK, McNamara R, Chen G, Lenox RH. Signalling pathways in the brain: cellular transduction of mood stabilisation in the treatment of manic-depressive illness // Aust N Z J Psychiatry. – 1999. – 33. – Pp. 65–83 252. Markus H.S. Stroke genetics // Hum Mol Genet. – 2011. – Oct 15;20(R2). – Pp. 124-31 253. Markoula S., Giannopoulos S., Kostoulas C., Tatsioni A., Bouba I., Maranis S., Georgiou I., Kyritsis A.P. Gender association of the angiotensin-converting enzyme 141 gene with ischaemic stroke // J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. – 2011. – Dec;12(4). – Pp. 510-5 254. Marousi S, Antonacopoulou A, Kalofonos H, Papathanasopoulos P, Karakantza M, Ellul J. Functional inflammatory genotypes in ischemic stroke: could we use them to predict age of onset and long-term outcome? // Stroke Res Treat. – 2011. – Pp.792-923 255. Marousi S, Ellul J, Antonacopoulou A, Gogos C, Papathanasopoulos P, Karakantza M. Functional polymorphisms of interleukin 4 and interleukin 10 may predict evolution and functional outcome of an ischaemic stroke // Eur J Neurol. – 2011. – Apr;18(4). – Pp. 637-43 256. Marron M.P., Raffel L.J., Garchon H.J., Jacob C.O., Serrano-Rios M., Martinez Larrad M.T., Teng W.P., Park Y., Zhang Z.X., Goldstein D.R., Tao Y.W., Beaurain G., Bach J.F., Huang H.S., Luo D.F., Zeidler A., Rotter J.I., Yang M.C., Modilevsky T., Maclaren N.K., She J.X. Insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) is associated with CTLA4 polymorphisms in multiple ethnic groups // Hum Mol Genet. – 1997. – V.6, №8. – Рp.1275-82 257. Marsh D.G., Neely J.D., Breazeale D.R., Ghosh B., Freidhoff L.R., EhrlichKautzky E., Schou C., Krishnaswamy G., Beaty T.H. Linkage analysis of IL4 and other chromosome 5q31.1 markers and total serum immunoglobulin E concentrations // Science. – 1994. – V.264, №5162. – Рp.1152-6 258. Matarín M.A. Genome-wide genotyping study in patients with ischaemic stroke: initial analysis and data release // Lancet Neurol. – 2007. – May;6(5). – Pp. 414-20 259. Matsushita T, Kubo M, Yonemoto K, Ninomiya T, Ashikawa K, Liang B, Hata J, Doi Y, Kitazono T, Ibayashi S, Iida M, Kiyohara Y, Nakamura Y. Lack of association between variations of PDE4D and ischemic stroke in the Japanese population // Stroke. – 2009. – Apr;40(4). – Pp. 1245-51 260. Matsushita T, Umeno J, Hirakawa Y, Yonemoto K, Ashikawa K, Amitani H, Ninomiya T, Hata J, Doi Y, Kitazono T. et al. Association study of the polymorphisms on chromosome 12p13 with atherothrombotic stroke in the Japanese population // J Hum Genet. – 2010. – 55. – Pp. 473–476 142 261. McAdam A. J., Schweitzer A. N., Sharpe A. H.. The role of B7 co-stimulation in activation and differentiation of CD4+ and CD8+ T cells // Immunol Rev. – 1998. – 165. – Pp. 231-247 262. McColl B.W., Allan S.M., Rothwell N.J. Systemic infection, inflammation and acute ischemic stroke // Neuroscience. – 2009. – 158. – Pp. 1049–1061 263. Mehrotra PT, Donnelly RP, Wong S, Kanegane H, Geremew A, Mostowski HS, Furuke K, Siegel JP, Bloom ET. Production of IL-10 by human natural killer cells stimulated with IL-2 and/or IL-12 // J Immunol. – 1998. – Mar 15;160(6). – Pp. 2637-44 264. Meschia J. F., Brott T. G., Brown R. D., Jr. Phosphodiesterase 4D and 5lipoxygenase activating protein in ischemic stroke // Ann. Neurol. – 2005. – 58. – Pp. 351—361 265. Meschia J. F., Brown R. D., Brott T. G., Hardy J., Atkinson E. J., and O’Brien P. C. Feasibility of an affected sibling pair study in ischemic stroke: results of a 2-center family history registry // Stroke. – 2001. – Vol. 32, № 12. – Pp. 2939–2941 266. Meschia JF, Singleton A, Nalls MA, Rich SS, Sharma P, Ferrucci L, Matarin M, Hernandez DG, Pearce K, Brott TG, Brown RD Jr, Hardy J, Worrall BB. Genomic risk profiling of ischemic stroke: results of an international genome-wide association metaanalysis // PLoS One. – 2011. – 6(9) 267. Messer G., Spengler U., Jung M.C., Honold G., Blomer K., Pape G.R. et al. Polymorphic structure of the tumor necrosis factor (TNF) locus: an NcoI polymorphism in the first intron of the human TNF-b gene correlates with a variant amino acid in position 26 and reduced level of TNF-b production // J Exp Med. – 1991. – 173. – Pp. 209–219 268. Milton AG, Aykanat VM, Hamilton-Bruce MA, Nezic M, Jannes J, Koblar SA. Association of the phosphodiesterase 4D (PDE4D) gene and cardioembolic stroke in an Australian cohort // Int J Stroke. – 2011. – Dec;6(6). – Pp. 480-6 269. Miossec P., & van den Berg W. Th1/Th2 cytokine balance in arthritis // Arthritis and Rheumatism. – 1997. – 40. – Pp. 2105–2115 270. Monraats PS, Pires NMM, Schepers A, Agema W, Boesten L, Vries M, Zwinderman A, de Maat M, Doevendans P, Winter R, Tio R, Waltenberger J, Hart L, 143 Frants R, Quax P, Vlijmen B, Havekes L, Laarse A, Wall E, Jukema W. Tumor necrosis factor- α plays and important role in restenosis development // The FASEB J. – 2005. – 19. – Pp. 1998–2004 271. Mooijaart SP, Berbee JF, van Heemst D et al: ApoE plasma levels and risk of cardiovascular mortality in old age // PLoS Med. – 2006. – 3. – e176 272. Morisaki N., Saito I., Tamura K., Tashiro J., Masuda M., Kanzaki T., et al. New indices of ischemic heart disease and aging: studies on the serum levels of soluble intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and soluble vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in patients with hypercholesterolemia and ischemic heart disease // Atherosclerosis. – 1997. – 131. – Pp. 43–48 273. Morrison AC, Ballantyne CM, Bray M, Chambless LE, Sharrett AR, Boerwinkle E. LPL polymorphism predicts stroke risk in men // Genet Epidemiol. – 2002. – Mar;22(3). – Pp. 233-42 274. Morita A, Nakayama T, Soma M. Association study betweenC-reactive protein genes and ischemic stroke in Japanese subjects //Am J Hypertens. – 2006. – 19. – Pp. 593–600 275. Munshi A., Babu M.S., Kaul S. et al. Phosphodiesterase 4D (PDE4D) gene variants and the risk of ischemic stroke in a South Indian population // J. Neurol. Sci. — 2009. — Vol. 285, № 1–2. — Pp. 142–145 276. Munshi A., Kaul S. Stroke genetics – focus on PDE4D gene // Int. J. Stroke. – 2008. – V. 3. № 3. Pp. 188–192 277. Munshi A, Roy S, Thangaraj K, Kaul S, Babu MS, Jyothy A. Association of SNP41, SNP56 and a novel SNP in PDE4D gene with stroke and its subtypes // Gene. – 2012. – Sep 10;506(1). – Pp. 31-5. 278. Myllykangas L, Polvikoski T, Sulkava R, Notkola IL, Rastas S, Verkkoniemi A, Tienari PJ, Niinistö L, Hardy J, Pérez-Tur J, Kontula K, Haltia M. Association of lipoprotein lipase Ser447Ter polymorphism with brain infarction: a population-based neuropathological study // Ann Med. – 2001. – Oct;33(7). – Pp. 486-92 144 279. My-Young Cheong, Ok-Sun Bang, Min-Ho Cha, Young-Kyu Park, Seung-Ho Kim, and Young Joo Kim. Association of the Adiponectin Gene Variations with Risk of Ischemic Stroke in a Korean Population // Yonsei Med J. – 2011. – 52(1). – Pp. 20-25 280. Napolioni V, Lucarini N. Gender-specific association of ADA genetic polymorphism with human longevity // Biogerontology. – 2010. – Aug;11(4). – Pp. 457-62 281. Nedwin G. E., Naylor S. L., Sakaguchi A. Y., Smith D., Jarrett-Nedwin J., Pennica D., Goeddel D. V., and Gray P. W., Human lymphotoxin and tumor necrosis factor genes: structure, homology and chromosomal localization // Nucleic Acids Res. – 1985. – 13(17). – Pp. 6361-73 282. Nisticò L., Buzzetti R., Pritchard L.E., Van der Auwera B., Giovannini C., Bosi E., Larrad M.T., Rios M.S., Chow C.C., Cockram C.S., Jacobs K., Mijovic C, Bain SC, Barnett AH, Vandewalle CL, Schuit F, Gorus FK, Tosi R, Pozzilli P, Todd JA. The CTLA-4 gene region of chromosome 2q33 is linked to, and associated with, type 1 diabetes. Belgian Diabetes Registry // Hum Mol Genet. – 1996. – Jul;5(7). – Pp. 107580 283. Nofer J.R. Estrogens and atherosclerosis: insights from animal models and cell systems // J Mol Endocrinol. – 2012. – 48. – Pp. 13-29 284. Nordström P., Glader C.A., Dahlén G., Birgander L.S., Lorentzon R., Waldenström A., Lorentzon M. Oestrogen receptor alpha gene polymorphism is related to aortic valve sclerosis in postmenopausal women // J Intern Med. – 2003. – Aug;254(2). – Pp. 140-6 285. O’Brien K. D., McDonald T. O., Chait A., Allen M. D., and Alpers C. E. Neovascular expression of Eselectin, intercellular adhesion molecule-1, and vascular cell adhesion molecule-1 in human atherosclerosis and their relation to intimal leukocyte content // Circulation. – 1996. – 93. – Pp. 672–682 286. Oda K., Tanaka N., Arai T., Araki J, Song Y, Zhang L, Kuchiba A, Hosoi T, Shirasawa T, Muramatsu M, Sawabe M. Polymorphisms in pro- and anti-inflammatory cytokine genes and susceptibility to atherosclerosis: a pathological study of 1503 consecutive autopsy cases // Hum Mol Genet. – 2007. – Mar 15;16(6). – Pp.592-9 145 287. Orlacchio A, Bernardi G.: Research actuality in the genetics of stroke. // Clin Exp Hypertens. – 2006. – Apr-May;28(3-4). – Pp. 191-7 288. Orlinick J.R. and Chao, M.V. TNF-related ligands and their receptors // Cell Signal. – 1998. – 10. – Pp. 543-551 289. Oshima T., Laroux F. S., Coe L. L., Morise Z., Kawachi S., Bauer P., Grisham M. B., Specian R. D., Carter P., Jennings S., Granger D. N., Joh T., and Alexander J. S., Interferon-gamma and interleukin-10 reciprocally regulate endothelial junction integrity and barrier function // Microvasc Res. – 2001. – 61(1). – Pp. 130-43 290. Ostrov D.A., Shi W., Schwartz J.C., Almo S.C., Nathenson S.G. Structure of murine CTLA-4 and its role in modulating T cell responsiveness // Science. – 2000. – Oct 27;290(5492). – Pp. 816-9 291. Ozaki K.; Ohnishi, Y.; Iida, A. et al. Functional SNPs in the lymphotoxin-alpha gene that are associated with susceptibility to myocardial infarction // Nature Genet. – 2002. – 32. – Pp. 650-654 292. Pablos Mendez A., Mayeux R., Ngai C. et al. Association of apo E polymorphism with plasma lipid levels in multiethnic elderly population // Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. – 1997. – 17. – Pp. 3534–3541 293. Pan X., Arauz E., Krzanowski J.J. et al. Synergistic interactions between selective pharmacological inhibitors of phosphodiesterase isozyme families PDE III and PDE IV to attenuate proliferation of rat vascular smooth muscle cells // Biochem. Pharmacol. – 1994. – V. 48. № 4. – Pp. 827–836 294. Parfenov MG, Nikolaeva TY, Sudomoina MA, Fedorova SA, Guekht AB, Gusev EI, Favorova OO. Polymorphism of apolipoprotein E (APOE) and lipoprotein lipase (LPL) genes and ischaemic stroke in individuals of Yakut ethnicity // J Neurol Sci. – 2007. – Apr 15;255(1-2). – Pp. 42-9 295. Peng Z, Zhan L, Chen S, Xu E. Association of transforming growth factor-β1 gene C-509T and T869C polymorphisms with atherosclerotic cerebral infarction in the Chinese: a case-control study // Lipids Health Dis. – 2011. – Jun 16;10. – P. 100 296. Perlstein TS, Lee RT: Smoking, metalloproteinases, and vascular disease // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2006. – 26. – Pp. 250-6 146 297. Petty G. W. et al. Survival and recurrence after first cerebral infarction: a population-based study in Rochester // Neurology. – 1998. – Vol. 50. – Pp. 208 – 216 298. Pezzini A, Grassi M, Del Zotto E, Giossi A, Monastero R, Dalla Volta G, Archetti S, Zavarise P, Camarda C, Gasparotti R, Magoni M, Camarada R, Padovani A. Migraine mediates the influence of C677T MTHFR genotypes on ischemic stroke risk with a stroke-subtype effect // Stroke. – 2007. – 38. – Pp. 3145–3151 299. Pola R, Flex A, Gaetani E, Flore R, Serricchio M, Pola P. Synergisticeffect of 174 G/C polymorphism of the interleukin-6 gene promoter and 469 E/K polymorphism of the intercellular adhesion molecule-1gene in Italian patients with history of ischemic stroke // Stroke. – 2003. – 34. – Pp. 881–5 300. Pravica V., Asderakis A., Perrey C., Hajeer A., Sinnott P. J., and Hutchinson I. V., In vitro production of IFN-gamma correlates with CA repeat polymorphism in the human IFN-gamma gene // Eur J Immunogenet. – 1999. – 26(1). – Pp. 1-3 301. Pravica V., Perrey C., Stevens A., Lee J. H., and Hutchinson I. V., A single nucleotide polymorphism in the first intron of the human IFN-gamma gene: absolute correlation with a polymorphic CA microsatellite marker of high IFN-gamma production // Hum Immunol. – 2000. – 61(9). – Pp. 863-6 302. Prehn J.H.M, Bindokas V.P., Marcuccilli C.J..et al. Regulation of neuronal Bcl2 protein expression and calcium homeostasis by transforming growth factor type beta confers wide-ranging protection on rat hippocampal neurons //Proc Nat Acad Sc. USA – 1994. – 91. – Pp. 12599-12603 303. Pruissen DM, Rosendaal FR, Frijns CJM, Kappelle LJ, Vos HL, Algra A; Smart Study Group. Prothrombotic gene variation and new vascular events after cerebral ischemia of arterial origin // J Thromb Haemost. – 2008. – 6. – Pp. 1639−1644 304. Rattazzi M., Puato M., Faggin E. et al. C-reactive protein and interleukin-6 in vascular disease: culprits or passive bystanders? J Hypertens 2003;21(10):1787–803 305. Razvi SS, Bone I.: Single gene disorders causing ischaemic stroke. //J Neurol. – 2006. – Jun 253(6). – Pp. 685-700 306. Reich K., Mossner R., Konig I.R., G. Westphal, A. Ziegler, C. Neumann Promoter polymorphisms of the genes encoding tumor necrosis factor-alpha and 147 interleukin-1beta are associated with different subtypes of psoriasis characterized by early and late disease onset // J Investig Dermatol. – 2002. – 118. – Pp. 155–163 307. Renzhe Cui, MD; Hiroyasu Iso, MD; Kazumasa Yamagishi, MD; Isao Saito, MD; Yoshihiro Kokubo, MD; Manami Inoue, MD; Shoichiro Tsugane, MD. Diabetes Mellitus and Risk of Stroke and Its Subtypes Among Japanese // Stroke. – 2011. – Sep;42(9). – Pp. 2611-4 308. Ring C.J., Cho K.W. Specificity in transforming growth factor-beta signaling pathways // Am J Hum Genet. – 1999. – V.64, №3. – Рp.691-7 309. Richards A., van den Maagdenberg A.M., Jen J.C., Kavanagh D. Bertram P., Spitzer D., Liszewski M.K., Barilla-Labarca M.L.,Terwindt G.M., Kasai Y. et al. Cterminal truncations in human 3′-5′ DNA exonuclease TREX1 cause autosomal dominant retinal vasculopathy with cerebral leukodystrophy // Nat. Genet. – 2007. – 39. –Pp. 1068–1070 310. Rincon F, Sacco R. L. Secondary stroke prevention // J Cardiovasc Nurs. – 2008. – Vol. 23, № 1. – Pp. 34 – 41 311. Roach D.R., Briscoe, H., Saunders, В., France, M.P., Riminton, S., and Britton, W.J. Secreted Lymphotoxin-alpha Is Essential for the Control of an Intracellular Bacterial Infection // J Exp Med. – 2001. – 193. – Pp. 239-246 312. Roest M. et al. Risk of acute ischemic heart disease in postmenopausal women depends on von Willebrand factor and fibrinogen concentrations, and blood group genotype // In: J Thromb Haemost. – 2007. – 5(1). – Pp. 189-191 313. Romagnani S. Regulation of the T cell response // Clin Exp Allergy. – 2006. – V.36, №11. – Рp.1357-66 314. Rose-John S., Scheller J., Elson G., Jones S.A. Interleukin-6 biology is coordinated by membrane-bound and soluble receptors: role in inflammation and cancer // J Leukoc Biol. – 2006. – 80(2). – Pp. 227–36 315. Rosenwasser L.J., Borish L. Genetics of atopy and asthma: the rationale behind promoter-based candidate gene studies (IL-4 and IL-10) // Am J Respir Crit Care Med. – 1997. – V.156, №4, Pt 2. – Рp. 152-5 148 316. Rosenwasser L.J., Borish L. Promoter polymorphisms predisposing to the development of asthma and atopy // Clin Exp Allergy. – 1998. – 28 (Suppl 5). – Pp. 13– 15 317. Rosenwasser L.J., Klemm D.J., Dresback J.K., Inamura H., Mascali J.J., Klinnert M., Borish L. Promoter polymorphisms in the chromosome 5 gene cluster in asthma and atopy // Clin Exp Allergy. – 1995. – V.25, Suppl 2. – Рp.74-8; discussion 95-6 318. Ross R.Cell biology of atherosclerosis // Annu Rev Physiol. – 1995. – 57. – Pp. 791-804 319. Rost NS, Rahman RM, Biffi A, Smith EE, Kanakis A, Fitzpatrick K, Lima F, Worrall BB, Meschia JF, Brown RD Jr, Brott TG, Sorensen AG, Greenberg SM, Furie KL, Rosand J. White matter hyperintensity volume is increased in small vessel stroke subtypes // Neurology. – 2010. – Nov 9;75(19). – Pp. 1670-7 320. Rothwell P.M. Carotid artery disease and the risk of ischaemic stroke and coronary vascular events // Cerebrovasc Dis. – 2000. – 10. – Pp. 21–33 321. Rothwell PM, Howard SC, Power DA, et al. Fibrinogen concentration and risk of ischemic stroke and acute coronary events in 5113 patients with transient ischemic attack and minor ischemic stroke // Stroke. – 2004. – 35. – Pp. 2300-5 322. Rubattu S, Di Angelantonio E, Stanzione R, Zanda B, Evangelista A, Pirisi A, De Paolis P, Cota L, Brunetti E, Volpe M.: Gene polymorphisms of the renin-angiotensinaldosterone system and the risk of ischemic stroke: a role of the A1166C/AT1 gene variant. //J Hypertens. – 2004. – Nov, 22(11). – Pp. 2129-34 323. Rubattu S, Lee-Kirsch MA, DePaolis P, Giliberti R, Gigante B, Lombardi A, Volpe M, Lindpaintner K.: Altered structure, regulation, and function of the gene encoding the atrial natriuretic peptide in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. //Circ Res. – 1999. – Nov 12;85(10). – Pp. 900-5 324. Rubattu S, Speranza R, Ferrari M, Evangelista A, Beccia M, Stanzione R, Assenza GE, Volpe M, Rasura M.: A role of TNF-alpha gene variant on juvenile ischemic stroke: a case-control study. //Eur J Neurol. – 2005. – Dec;12(12). – Pp. 98993 149 325. Rudofsky G., Jr., Schlotterer A., Reismann P., Engel J., Grafe I.A., Tafel J., Morcos M., Humpert P.M., Nawroth P., Bierhaus A., Hamann A. The -174G>C IL-6 gene promoter polymorphism and diabetic microvascular complications // Horm Metab Res. – 2009. – V.41, №4. – Рp.308-13 326. Rus HG, Vlaicu R, Niculescu F. Interleukin-6 and interleukin-8 protein and gene expression in human arterial atherosclerotic wall // Atherosclerosis. – 1996. – 127. – Pp. 263–271 327. Ryglewicz D., Polarowska M., Lechewicz W. et al.: Stroke Mortality Rates in Poland Did Nat Decline Between 1984 and 1992 //Stroke. – 1997. – 28,4. – Pp. 752-757 328. Sacco R. L. et al. High-density lipoprotein cholesterol and ixchemic stroke in the elderly // JAMA. – 2001. – Vol. 285. – Pp. 2729 – 2735. 329. Sampanis C., Zamboulis C. Arterial hypertension in diabetes mellitus: from theory to clinical practice // Hippocratia. – 2008. – Vol. 12, № 2. – Pp. 74 – 80 330. Saito T, Tamura K, Uchida D, Saito T, Nitta T, Sugisaki Y. Histopathological evaluation of left atrial appendage thrombogenesis removed during surgery for atrial fibrillation // Am Heart J. – 2007. – Apr;153(4). – Pp. 704-11 331. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T.: Molecular Cloning // ed Nolan, C. Cold Spring Harbor Press. – 1989. 9.17-9.19 332. Sazci A, Ergul E, Tuncer N, Akpinar G, Kara I. Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms are associated with ischemic and hemorrhagic stroke: Dual effect of MTHFR polymorphisms C677T and A1298C // Brain Res Bull. – 2006. – Dec 11;71(1-3). – Pp. 45-50 333. Scarabin PY, Arveiler D, Amouyel P, Dos Santos C, Evans A, Luc G, Ferrieres J, Juhan-Vague I. Plasma fibrinogen explains much of the difference in risk of coronary heart disease between France and Northern Ireland. The PRIME study // Atherosclerosis. – 2003. – 166. – Pp. 103-109 334. Seifart C., Plagens A., Dempfle A., Clostermann U., Vogelmeier C., von Wichert P., Seifart U. TNF-alpha, TNF-beta, IL-6, and IL-10 polymorphisms in patients with lung cancer // Dis Markers. – 2005. – V.21, №3. – Рp.157-65 150 335. Seino Y, Ikeda U, Ikeda M et al. Interleukin 6 gene transcripts are expressed in human atherosclerotic lesions // Cytokine. – 1994. – 6. – Pp. 87–91 336. Seripa D, Dobrina A, Margaglione M, Matera MG, Gravina C, Vecile E et al . Relevance of interleukin-1 receptor antagonist intron-2 polymorphism in ischemic stroke // Cerebrovasc Dis. – 2003. –15. – Pp. 276-81 337. Seshadri S, Beiser A, Pikula A, et al.: Parental occurrence of stroke and risk of stroke in their children: the Framingham study // Circulation. – 2010. – 121. – Pp. 1304–1312 338. Settin A., Zedan M., Farag M., Ezz El Regal M., Osman E. Gene polymorphisms of IL-6(-174) G/C and IL-1Ra VNTR in asthmatic children // Indian J Pediatr. – 2008. – V.75, №10. – Рp.1019-23 339. Schieffer B., Schieffer E., Hilfiker Kleiner D., Hilfiker A.,Kovanen P.T., Kaartinen M., Nussberger J.,HarringerW., Drexler H. Expression of angiotensin II and interleukin 6 in human coronary atherosclerotic plaques: potential implications for inflammation and plaque instability // Circulation. – 2000. – 101. – Pp. 1372–1378 340. Shen C, Jiao WW, Feng WX, Wu XR, Xiao J, Miao Q, Sun L, Wang BB, Wang J, Liu F, Shen D, Shen AD. IFNG polymorphisms are associated with tuberculosis in Han Chinese pediatric female population // Mol Biol Rep. – 2013. – Sep;40(9). – Pp. 5477-82. 341. Shenhar-Tsarfaty S, Assayag EB, Bova I, Shopin L, Berliner S, Shapira I, Bornstein NM. Early signaling of inflammation in acute ischemic stroke: clinical and rheological implications // Thromb Res. – 2008. – 122(2). – Pp. 167-73 342. Shi C, Kang X, Wang Y, Zhou Y. The coagulation factor V Leiden, MTHFRC677T variant and eNOS 4ab polymorphism in young Chinese population with ischemic stroke //Clin Chim Acta. – 2008. – Oct;396(1-2). – Pp. 7-9 343. Shimo-Nakanishi Y, Urabe T, Hattori N, Watanabe Y, Nagao T, Yokochi M, Hamamoto M, Mizuno Y. Polymorphism of the lipoprotein lipase gene and risk of atherothrombotic cerebral infarction in the Japanese // Stroke. – 2001. – 32. – Pp. 1481– 1486 151 344. Sie MP, Uitterlinden AG, Bos MJ, Arp PP, Breteler MM, Koudstaal PJ, Pols HA, Hofman A, van Duijn CM, Witteman JC. TGF-beta 1 polymorphisms and risk of myocardial infarction and stroke: the Rotterdam Study // Stroke. – 2006. – Nov;37(11). – Pp. 2667-71 345. Sing C. F., Davignon J. Role of the apolipoprotein E polymorphism in determining normal plasma lipid and lipoprotein variation // Am J Hum Genet. – 1985. – Vol. 37. – Pp. 268 – 285 346. Slowik A, Iskra T, Turaj W, Hartwich J, Dembinska-Kiec A, Szczudlik A: LDL phenotype B and other lipid abnormalities in patients with large vessel disease and small vessel disease // J Neurol Sci. – 2003. – 214. – Pp. 11– 16 347. Smith B.M., Irving S., Sheldon J. et al. Serum levels of the anti-inflammatory cytokine interleukin-10 are decreased in patients with unstable // Circulation. – 2001. – Vol. 104. – P. 746 348. Smith W.B., Noack L., Khew-Goodall Y. et al. Transforming growth factor-beta 1 inhibits the production of IL-8 and the transmigration of neutrophils through activated endothelium // J. Immunol. – 1996. – 157(1). – Pp. 360-368 349. Solari V., Owen D., Puri P. Association of transforming growth factor-beta1 gene polymorphism with reflux nephropathy // J Urol. – 2005. – V.174, №4, Pt 2. – Рp.160911 350. Staton JM, Sayer MS, Hankey GJ, Attia J, Thakkinstian A, Yi Q, Cole VJ, Baker R, Eikelboom JW.: Association between phosphodiesterase 4D gene and ischaemic stroke. //J Neurol Neurosurg Psychiatry. – 2006. Sep 77(9). – Pp. 1067-9 351. Steiner I, Gotkine M, Wirguin I. The protective effect of risk factors against stroke severity // J Neurol Sci. – 2008. – 267. – Pp. 187–8 352. Stoll G, Bendszus M. Inflammation and atherosclerosis: novel insights into plaque formation and destabilization.// Stroke. – 2006. – Jul, 37(7). – Pp.1923-32 353. Sudlow C, Martinez Gonzalez NA, Kim J, Clark C: Does apolipoprotein E genotype influence the risk of ischemic stroke, intracerebral hemorrhage, or subarachnoid hemorrhage. Systematic review and meta-analyses of 31 studies among 5961 cases and 17 965 controls // Stroke. – 2006. – 37. – Pp. 364– 370 152 354. Sun Y, Huang Y, Chen X, Liu Y, Lu X, Shi Y, Tang W, Yang J, Chen W, Zhao X, Gao L, Li S, Feng G, He L. Association between the PDE4D gene and ischaemic stroke in the Chinese Han population // Clin Sci (Lond). – 2009. –Aug 17,117(7). – Pp. 265-72 355. Suthanthiran M, Li B, Song JO, Ding R, Sharma VK, Schwartz JE, August P. Transforming growth factor-beta 1 hyperexpression in African-American hypertensives: A novel mediator of hypertension and/or target organ damage // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2000. – Mar 28,97(7). – Pp. 3479-84 356. Suzuki S., Tanaka K., Suzuki N. Ambivalent aspects of interleukin6 in cerebral ischemia: inflammatory versus neurotrophic aspects // J. Cerebral Blood Flow& Metabolism. – 2009. – 29. – Pp. 464–479 357. Syrris P, Carter ND, Metcalfe JC, Kemp PR, Grainger DJ, Kaski JC, Crossman DC, Francis SE, Gunn J, Jeffery S, Heathcote K. Transforming growth factor-beta1 gene polymorphisms and coronary artery disease // Clin Sci (Lond). – 1998. – Dec;95(6). – Pp. 659-67 358. Szolnoki Z, Havasi V, Talián G, Bene J, Komlósi K, Somogyvári F, Kondacs A, Szabó M, Fodor L, Bodor A, Melegh B. Lymphotoxin-alpha gene 252G allelic variant is a risk factor for large-vessel-associated ischemic stroke // J Mol Neurosci. – 2005. – 27(2). – Pp. 205-11 359. Szolnoki Z., Maasz A., Magyari L., Horvatovich K., Farago B., Kondacs A., Bodor A, Hadarits F, Orosz P, Ille A, Melegh B. Galectin-2 3279TT variant protects against the lymphotoxin-alpha 252GG genotype associated ischaemic stroke // Clin Neurol Neurosurg. – 2009. – Apr, 111(3). – Pp. 227-30 360. Szpirer C., Szpirer J., Rivière M. et al. Chromosomal localization of the human and rat genes (PDE4D and PDE4B) encoding the cAMP specific phosphodiesterases 3 and 4 // Cytogenet. Cell Genet. – 1995. – V. 69, № 1–2. – Pp. 11–14 361. Takashima S., Hirano K., Taguchi Y., Dougu N., Toyoda S., Tanaka K. Two cases of cardioembolic stroke with stepwise progression // Rinsho Shinkeigaku. – 2008. – Sep, 48(9). – Pp. 656-61 153 362. Takahashi K., Takeya M., Sakashita N. Multifunctional roles of macrophages in the development and progression of atherosclerosis in humans and experimental animals.// Med Electron Microsc. – 2002. – Dec, 35(4). – Pp.179-203 363. Tao H.M., Chen G.Z., Cheng G.P., Shan X.Y. The haplotype of the TGFβ1 gene associated with cerebral infarction in Chinese // Can J Neurol Sci. – 2012. – Sep, 39(5). – Pp. 626-31 364. Tao H.M., Chen G.Z., Lu X.D., Chen G.P., Shao B. TGF-β1 869T/C polymorphism and ischemic stroke: sex difference in Chinese // Can J Neurol Sci. – 2010. – Nov, 37(6). – Pp. 803-7 365. Tao H. M., Shao B., Chen G. Z. Meta-analysis of the ACE gene polymorphism in cerebral infarction // Can J Neurol Sci. – 2009. – Vol. 36, № 1. – Pp. 20 – 25 366. Tedgui A, Mallat Z. Cytokines in atherosclerosis: pathogenic and regulatory pathways // Physiol Rev. – 2006. – Apr, 86(2). – Pp. 515-81 367. Thabele M., Leslie-Mazwi, MD, Thomas G. Brott, MD, Robert D. Brown Jr, MD, Bradford B. Worrall, MD, Scott L. Silliman, MD, L. Douglas Case, PhD, Michael R. Frankel, MD, Stephen S. Rich, PhD, and James F. Meschia, MD. Sex Differences in Stroke Evaluations in the Ischemic Stroke Genetics Study // J Stroke Cerebrovasc Dis. – 2007. – 16(5). – Pp. 187–193 368. Tong Y, Geng Y, Xu J, Wang Z, Zhang Y, Lin L, Zhang R, Deng P, Li Y, Hou W, Chai Y, Mason KA, Lu Z, Cheng J. The role of functional polymorphisms of the TNF-alpha gene promoter in the risk of ischemic stroke in Chinese Han and Uyghur populations: Two case-control studies // Clin Chim Acta. – 2010. – Sep 6, 411(17-18). – Pp. 1291-5 369. Tonk M. and Haan J. A review of genetic causes of ischemic and hemorrhagic stroke // Journal of the Neurological Sciences. – 2007. –Vol. 257, № 1-2. – Pp. 273– 279, 370. Toni D., Sacchetti M. L., Prencipe M. Early Clinical Diagnosis of Lacunar Strokes // Stroke. – 2008. –Vol. 39. –Pp. 152 371. Trompet S, Pons D, DE Craen AJ, Slagboom P, Shepherd J, Blauw GJ, et al. Genetic variation in the interleukin-10 gene promoter and risk of coronary and 154 cerebrovascular events: the PROSPER study // Ann NY Acad Sci. – 2007. – 1100. – Pp. 189–98 372. Tso A.R., Merino J.G., Warach S. Interleukin-6 174G/C polymorphism and ischemic stroke: a systematic review // Stroke. – 2007. – 38. – Pp. 3070–3075 373. Tuomilehto J., Rastenyte D., Jousilahti F. Diabetes mellitus as a risk factors for death for stroke. Prospective study of the Middle-aged Finnish population // Stroke. – 1996. – Vol. 27. – Pp. 210 – 215 374. Uchiyama S. Cerebral infarction // Nippo Rinsho. – 2006. – Vol. 64, № 11. – P. 2039 – 2044 375. Ueda H., Howson J. M., Esposito L. et al. Association of the T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease // Nature. – 2003. – Vol. 423. – Pp. 506–511 376. Um JY, An NH, Kim HM. TNF-alpha and TNF-beta gene polymorphisms in cerebral infarction // J Mol Neurosci. – 2003. – 21(2). – Pp. 167-71 377. Um JY, An NH, Kim SH, Lee KM, Kim YS, Jang H, Cho KH, Moon BS, Kim HM. Genetic susceptibility to ischemic cerebrovascular disease in Koreans // J Mol Neurosci. – 2003. Feb, 20(1). – Pp. 31-8 378. Um JY, Moon KS, Lee KM, Yun JM, Cho KH, Moon BS, Kim HM. Association of interleukin-1 alpha gene polymorphism with cerebral infarction // Brain Res Mol Brain Res. – 2003. –Jul 4, 115(1). –Pp. 50-4 379. Vallinoto AC, Graça ES, Araújo MS, Azevedo VN, Cayres-Vallinoto I, Machado LF, Ishak MO, Ishak R. IFNG +874T/A polymorphism and cytokine plasma levels are associated with susceptibility to Mycobacterium tuberculosis infection and clinical manifestation of tuberculosis // Hum Immunol. – 2010. – Jul;71(7). – Pp. 692-6 380. Van Vliet P, Mooijaart SP, de Craen AJ, Rensen PC, van Heemst D, Westendorp RG: Plasma levels of apolipoprotein E and risk of stroke in old age // Ann NY Acad Sci. – 2007. – 1100. – Pp. 140– 147 381. Veglio F. et al. Hypertension and cerebrovascular damage // Atherosclerosis. – 2008. – № 5 155 382. Verstrepen L, Bekaert T, Chau TL et al. TLR-4, IL-1R and TNF-R signaling to NF-kappaB: variations on a common theme // Cell Mol Life Sci. – 2008. – Oct, 65(19). – Pp. 2964-2978 383. Vila-del Sol V, Punzón C, Fresno M. IFN-gamma-induced TNF-alpha expression is regulated by interferon regulatory factors 1 and 8 in mouse macrophages // J Immunol. – 2008. – Oct 1,181(7). – Pp. 4461-4470 384. Vila N, Reverter JC, Yagüe J, Chamorro A. Interaction between interleukin-6 and the natural anticoagulant system in acute stroke // J Interferon Cytokine Res. – 2000. – Mar, 20(3). – Pp. 325-329 385. Volcik KA, Ballantyne CM, Coresh J, Folsom AR, Wu KK, Boerwinkle E.: Pselectin Thr715Pro polymorphism predicts P-selectin levels but not risk of incident coronary heart disease or ischemic stroke in a cohort of 14595 participants: the Atherosclerosis Risk in Communities Study. //Atherosclerosis. – 2006. – May, 186(1). – Pp.74-79 386. Walston J.D., Fallin M.D., Cushman M., Lange L.,Psaty B., Jenny N., Browner W., Tracy R., Durda P.,Reiner A. IL-6 gene variation is associated with IL-6 and Creactive protein levels but not cardiovascular outcomes in the cardiovascular health study // Hum. Genet. – 2007. – 122. – Pp. 485–494 387. Wang Q, Ding H, Tang JR, Zhang L, Xu YJ, Yan JT, Wang W, Hui RT, Wang CY, Wang DW. C-reactive protein polymorphisms and genetic susceptibility to ischemic stroke and hemorrhagic stroke in the Chinese Han population // Acta Pharmacol Sin. – 2009. – Mar, 30(3). – Pp. 291-298 388. Wang X., Cheng S., Brophy V.H., Erlich H.A., Mannhalter C., Berger K., Lalouschek W., Browner W.S., Shi Y., Ringelstein E.B., Kessler C., Luedemann J., Lindpaintner K., Liu L., Ridker P.M., Zee R.Y., Cook N.R.; RMS Stroke SNP Consortium. A meta-analysis of candidate gene polymorphisms and ischemic stroke in 6 study populations: association of lymphotoxin-alpha in nonhypertensive patients //Stroke. – 2009. – Mar, 40(3). – Pp. 683-695 156 389. Wang X.L., Sim A.S., Wilcken D.E. A common polymorphism of the transforming growth factor-beta1 gene and coronary artery disease // Clin Sci (Lond). – 1998. – Dec, 95(6). – Pp. 745-746 390. Wang Y., Hou X., Li Y. Association between transforming growth factor beta1 polymorphisms and atrial fibrillation in essential hypertensive subjects // J Biomed Sci. – 2010. – Mar 31, 17. – Pp. 23 391. Wei-Chieh Weng , Wen-Yi Huang , Yu-Yi Chien , Chia-Lun Wu , Feng-Chieh Su , Heng Jung Hsu , Tsong-Hai Lee , Tsung-I Peng . The impact of smoking on the severity of acute ischemic stroke // Journal of the Neurological Sciences. – 2011. –308. – Pp. 94–97 392. Werner F, Jain MK, Feinberg MW et al. Transforming growth factor-beta 1 inhibition of macrophage activation is mediated via Smad3 // J Biol Chem. – 2000. – 275. –Pp. 36653-36658 393. White H, Boden-Albala B, Wang C, Elkind MS, Rundek T, Wright CB, Sacco RL. Ischemic stroke subtype incidence among whites, blacks, and Hispanics: the Northern Manhattan Study // Circulation. – 2005. – Vol. 111. – Pp. 1327 – 1331 394. Wilson A.G., Symons J.A., T.L. McDowell, H.O. McDevitt, G.W. Duff Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation // Proc Natl Acad Sci USA. – 1997. – 94. – Pp. 3195–3199 395. Wolf P. et al. Probability of stroke: a risk profile from the Framingham Study // Stroke. – 1991. – Vol. 22. – Pp. 312 – 318 396. Woods A., Brull D.J., Humphries S.E.,Montgomery H.E. Genetics of inflammation and risk of coronary artery disease: the central role of interleukin-6 // Eur Heart J. – 2000. – 21(19). – Pp. 1574–83 397. Worrall B.B., Chen D.T., Brown R.D., Brott T.G., and Meschia J.F. A survey of the SWISS researchers on the impact of sibling privacy protections on pedigree recruitment // Neuroepidemiology. – 2005. –Vol. 25, № 1. – Pp. 32–41, 398. Wu Y., Tomon M., Sumino K. Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene Polymorphism and Ischemic Stroke: Sex Difference in Japanese // Kobe J. Med. Sci. – 2001. – Vol. 47. – Pp. 255 – 262 157 399. Xing HY, Liao XP, Xiao F. Haplotypes in the promoter region of β-fibrinogen gene and their relationship with ischemic stroke in the Han population in Hainan // Guo Ji Yi Chuan Xue Za Zhi. – 2006. – 29. – Pp. 328–335 400. Xin XY, Song YY, Ma JF, Fan CN, Ding JQ, Yang GY, Chen SD. Gene polymorphisms and risk of adult early-onset ischemic stroke: A meta-analysis // Thromb Res. – 2009. –Nov,124(5). – Pp. 619-24 401. Xu E, Li W, Zhan L, Guan G, Wang X, Chen S, Shi Y. Polymorphisms of the lipoprotein lipase gene are associated with atherosclerotic cerebral infarction in the Chinese // Neuroscience. – 2008. – 155. – Pp. 403–408 402. Xu X, Li J, Sheng W, Liu L. Meta-analysis of genetic studies from journals published in China of ischemic stroke in the Han Chinese population // Cerebrovasc Dis. – 2008. –Vol. 26, № 1. – Pp. 48 – 62 403. Yamada Y, Metoki N, Yoshida H, Satoh K, Ichihara S, Kato K, Kameyama T, Yokoi K, Matsuo H, Segawa T, Watanabe S, Nozawa Y. Genetic risk for ischemic and hemorrhagic stroke // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2006. – 26. – Pp. 1920–1925 404. Yamagami H, Kitagawa K, Nagai Y, Hougaku H, Sakaguchi M, Kuwabara K, Kondo K, Masuyama T, Matsumoto M, Hori M. Higher levels of interleukin-6 are associated with lower echogenicity of carotid artery plaques // Stroke. – 2004. – Mar, 35(3). – Pp. 677-81 405. Yamasaki Y., Matsuura N., Shozuhara H., Onodera H., Itoyama Y., Kogure K. Interleukin-1 as a pathogenetic mediator of ischemic brain damage in rats // Stroke. – 1995. – 26. – Pp. 676–681 406. Yamori Y, Tomimoto K, Ooshima A, Hazama F, Okamoto K: Proceedings: Developmental course of hypertension in the SHR-substrains susceptible to hypertensive cerebrovascular lesions // Jpn Heart J. – 1974. – Mar, 15(2). – Pp. 209-210 407. Yemişçi M, Sinici I, Ozkara HA, Hayran M, Ay H, Celtikçi B, Onder E, Büyükşerbetci G, Kaya EB, Tokgözoglu L, Dalkara T. Protective role of 27bp repeat polymorphism in intron 4 of eNOS gene in lacunar infarction // Free Radic Res. – 2009. – Mar, 43(3). – Pp. 272-279 158 408. Yokota M, Ichihara S, Lin TL, Nakashima N, Yamada Y. Association of a T29->C polymorphism of the transforming growth factor-beta1 gene with genetic susceptibility to myocardial infarction in Japanese // Circulation. – 2000. – Jun, 20;101(24). – Pp. 2783-7 409. Yoon D., Park S.K., Kang D., Park T., Park J.W. Meta-analysis of homogeneous subgroups reveals association between PDE4D gene variants and ischemic stroke // Neuroepidemiology. – 2011. – 36 (4). – Pp. 213–222 410. Zee R.Y., Cheng S., Hegener H.H. et al. Genetic variants of arachidonate 5lipoxygenaseactivating protein, and risk of incident myocardial infarction and ischemic stroke: a nested casecontrol approach // Stroke. – 2006. –V. 37, № 8. – Pp. 2007–2011 411. Zee R.Y., Cook N.R., Cheng S., Reynolds R., Erlich H.A., Lindpaintner K., Ridker P.M.: Polymorphism in the P-selectin and interleukin-4 genes as determinants of stroke: a population-based, prospective genetic analysis.// Hum Mol Genet. – 2004. – Feb 15;13(4). – Pp. 389-96 412. Zgang Y. Incidence and risk factors for stroke in American Indians: the Strong Heart Study // Circulation. – 2008. – Vol. 118, № 15. – Pp. 1577 – 1584 413. Zhang J.H., Kohara K., Yamamoto Y., Nakura J., Tabara Y., Fujisawa M., Katagi R., Miki T.: Genetic predisposition to neurological symptoms in lacunar infarction.// Cerebrovasc Dis. – 2004. – 17(4). – Pp. 273-9 414. Zhang Y, Xie RP, Shen Y, Fan DS. Interaction between methylenetetrahydrofolate reductase C677T gene polymorphism and sleep duration on risk of stroke pathogenesis // Beijing Da Xue Xue Bao. – 2008. – 40. – Pp. 262–269 415. Zhao SP, Tong QG, Xiao ZJ, Cheng YC, Zhou HN, Nie S. The lipoprotein lipase Ser447Ter mutation and risk of stroke in the Chinese // Clin Chim Acta. – 2003. – 330. – Pp. 161–164 416. Zhao J, Wang X, Xu J, Li N, Shang X, He Z, Yang J. Association of inflammatory response gene polymorphism with atherothrombotic stroke in Northern Han Chinese // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). – 2012. – Oct 16 417. Zheng Z, Yenari MA. Post-ischemic inflammation: molecular mechanisms and therapeutic implications. – Neurol Res. – 2004. – Dec, 26(8). – Pp. 884-92 159 418. Zhernakova A., Eerligh P., Barrera P., Wesoly J. Z., Huizinga T. W., Roep B. O., Wijmenga C., and Koeleman B. P., CTLA4 is differentially associated with autoimmune diseases in the Dutch population // Hum Genet. – 2005. – 118(1). – Pp. 5866 419. Zhou J, Li XX. Association of β-fibrinogen gene –455G/A polymorphism with cerebral infarction // Shen Jing Sun Shang Yu Gong Neng Chong Jian. – 2006. – 1. – Pp. 149–150, – 160 420. Zintzaras, E., Rodopoulou, P. and Sakellaridis, N. Variants of the arachidonate 5lipoxygenase-activating protein (ALOX5AP) gene and risk of stroke: a HuGE genedisease association review and meta-analysis // Am. J. Epidemiol. – 2009. – 169. – Pp. 523–532 421. www.changbioscience.com/primo 422. http://code.google.com/p/apsampler/ 423. http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview 424. http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm 160
