К заседанию Бюро ОМБН РАМН «23» октября 2012 г. СПРАВКА
реклама
К заседанию Бюро ОМБН РАМН «23» октября 2012 г. СПРАВКА к научному докладу д.м.н. В.П. Никитина на тему: «Механизмы развития амнезии, вызванной нарушением реконсолидации долговременной памяти» К настоящему времени достигнут существенный прогресс в понимании нейрофизиологических и молекулярных механизмов формирования и стабилизации долговременной памяти. Процессы «противоположной» мнестической направленности, такие как потеря памяти, забывание, амнезия, несмотря на их несомненную теоретическую, социальную и медицинскую значимость, остаются значительно менее изученными. Для исследования механизмов нарушения памяти, как правило, применяют методы экспериментальной амнезии. В качестве «амнестических» воздействий применяют фармакологические препараты, гипоксию мозга, его травматическое повреждение, электросудорожный шок и др. Следует, однако, отметить, что данные воздействия вызывают грубые, неоднозначные изменения функций мозга. Процессы нарушения памяти, возникающие в результате этих воздействий, чрезвычайно многообразны и сложны, практически не возможно исследовать специфические механизмы, лежащие в основе амнезии. Положение в данной области нейробиологии сравнительно недавно стало изменяться в связи с открытием явления реконсолидации долговременной памяти. Обнаружено, что упроченная долговременная память может подвергаться реорганизации через различные сроки после обучения. Выявлено, в частности, что реактивация ранее консолидированной памяти, например после воспроизведения навыка, приводит к ее дестабилизации, трансформации в лабильное состояние. Память в этом состоянии может быть усилена, ослаблена, искажена или даже «стерта» различными физическими и химическими воздействиями, в том числе ингибиторами процессов трансляции и транскрипции. Лабильное состояние памяти сохраняется в течение несколько часов («временное окно»), а затем память вновь стабилизируется (реконсолидируется). Необходимо особо подчеркнуть, что нарушение процессов реконсолидации приводило к специфическому дефициту памяти – нарушался только тот навык, который воспроизводился во время применения «амнестических» воздействий. Полагают, что реконсолидация служит в качестве адаптивного процесса, который позволяет к существующей памяти быстро добавлять новую информацию и ослаблять или усиливать определенные компоненты памяти. В экспериментах, проведенных на животных, стоящих на разных ступенях эволюционного развития и с использованием разных видов обучения изучен ряд ключевых механизмов реконсолидации памяти. В частности, 1 показана зависимость реконсолидации памяти от активности различных нейромедиаторных систем, процессов трансляции и транскрипции. В целом, однако, необходимо отметить, что наряду с очевидным прогрессом в изучении процессов консолидации и реконсолидации памяти, остается не ясным каковы механизмы индукции и развития амнезии, возникающие при нарушении этих процессов. Анализируя имеющиеся в литературе экспериментальные данные мы сформулировали три основных проблемы, касающиеся механизмов амнезии. Во-первых, многие авторы указывают на то, что до сих пор остается не решенным кардинальный вопрос – является ли экспериментальная амнезия, развивающаяся при нарушении механизмов консолидации и реконсолидации памяти следствием подавления процессов воспроизведения, частичного нарушения или «стирания следа» памяти? Во-вторых, исследования механизмов нарушения процессов консолидации и реконсолидации памяти не дают ответа на вопрос о том, каковы механизмы индуцируемой при этом амнезии? В третьих, не изучена динамика развития амнезии. Возникает ли она непосредственно после нарушающих память воздействий, или развитие амнезии это сравнительно длительный процесс, имеющий определенные стадии развития? В связи с изложенным, целью нашего исследования явилось изучение механизмов индукции и развития амнезии, возникающей при нарушении реконсолидации долговременной памяти. Особое внимание уделено изучению, сформулированным нами, фундаментальных проблем амнезии. Наши исследования проведены на виноградных улитках (Helix lucorum) и крысах. У улиток вырабатывали навык отвергания определенного вида пищи. У крыс формировали условную обонятельную аверсию или пространственную память в водном лабиринте Морриса. Основные опыты выполнены на виноградных улитках. У животных регистрировали пищевые и аверсивные реакции на предъявления условных и дифференцировочных пищевых стимулов. Подкрепляющим стимулом служило воздействие электрическим током при попытках поедать «условнорефлекторную» пищу. Улитки обучались узнавать «опасный» пищевой стимул и избегать его после 4-8 сочетанных раздражений, предъявляемых в течение 3-х дней. После выработки навыка улитки в течение не менее 1-2-х месяцев демонстрировали оборонительные и избегательные реакции на предъявления условного стимула. При этом животные проявляли пищевую реакцию на предъявление дифференцировочного стимула. Рецепторы серотонина и глутамата, а также процессы трансляции вовлечены в механизмах реконсолидации памяти условной пищевой аверсии В литературных источниках имеются указания на то, что различные нейромедиаторные системы специфично вовлечены в механизмы обучения и 2 формирования памяти. Так показано, что глутаматергическая система важна для консолидации и стабилизации ряда форм памяти, тогда как моноаминергические системы вовлекаются преимущественно в механизмы модуляции этих процессов. Мы предположили, что указанные медиаторные системы играют также различную роль в процессах реконсолидации памяти и развития амнезии. В этой связи нами изучены особенности участия рецепторов серотонина, а также NMDA и АМРА рецепторов глутамата в процессах реконсолидации долговременного ассоциативного навыка отвергания определенного вида пищи у виноградной улитки. Нами обнаружено, что инъекции улиткам неселективного антагониста рецепторов серотонина (метиотепина), антагонистов NMDA рецепторов глутамата (МК-801 или APV) или антагониста АМРА рецепторов DNQX сочетанные с напоминанием (предъявление условного стимула) вызывали нарушение воспроизведения навыка. При этом животные поедали «условнорефлекторную» пищу и у них не выявлено различий латентных периодов пищевых реакций на условный и дифференцировочный стимулы в течение 1-2-х месяцев после индукции амнезии. Реконсолидация памяти зависит от процессов трансляции, но не транскрипции. Одним из основных критерием процессов реконсолидации памяти является их зависимость от процессов трансляции. Мы выявили, что инъекции улиткам ингибиторов синтеза белка циклогексимида или анизомицина перед напоминанием приводили к развитию амнезии, которая сохранялась не менее 12-х месяцев. Инъекции циклогексимида через 3 ч после напоминания не оказывали влияния на сохранность памяти. Таким образом, «временное окно» зависимости реконсолидации памяти от процессов трансляции составляло менее 3-х часов. Результаты многочисленных экспериментов свидетельствуют о том, что механизмы как консолидации памяти, так и ее реконсолидации зависят от процессов транскрипции. Однако в наших опытах не обнаружено нарушения памяти условной пищевой аверсии у улиток при действии ингибиторов синтеза РНК актиномицина Д, а-аманитина или DRB перед напоминанием – животные демонстрировали избегательные реакции при предъявлении условных стимулов на протяжении как минимум 2-х недель после этих воздействий. Таким образом, ингибиторы синтеза белка нарушали реконсолидацию памяти условной пищевой аверсии, тогда как ингибиторы синтеза мРНК не влияли на этот процесс. Полученные результаты позволяют предположить, что белки необходимые для реконсолидации памяти могут транслироваться с мРНК, ранее синтезированных, и находящихся в «депонированном» («молчащем») состоянии. Проведенные нами эксперименты показали, что нарушение реконсолидации памяти антагонистами различных рецепторов нейротрансмиттеров, а также ингибиторами процессов трансляции и 3 транскрипции приводило к развитию устойчивой амнезии. Однако, оставалось не ясным, что лежит в основе амнезии: подавление процессов воспроизведения, частичного нарушения или «стирания следа» памяти? Другой кардинальный вопрос касается динамики развития амнезии: возникает ли она непосредственно после нарушающих память воздействий, или развитие амнезии это сравнительно длительный процесс, имеющий определенные стадии развития? Для решения этих вопросов у улиток, демонстрировавших амнезию, проводили повторную выработку навыка отверганию того же вида пищи, что и при первоначальном обучении. Нами обнаружено, что повторное обучение через различные сроки после индукции амнезии, вызванной действием метиотепина/напоминания, приводило к восстановлению памяти. При этом количество сочетанных раздражений условного и подкрепляющего стимулов было существенно, чем при первоначальном обучении. Можно полагать, что этот вид амнезии связан с нарушением процессов воспроизведения при сохранности энграммы, либо амнезия зависит как от нарушения процессов воспроизведения, так и частичного повреждения «следа» памяти, которое устраняется при повторном обучении. Принципиально другие механизмы развития амнезии при нарушении реконсолидации памяти антагонистами рецепторов глутамата, а также ингибиторами синтеза белка. В частности, нами выявлено, что на 3-й день после индукции амнезии, вызванной воздействием перед напоминанием антагонистов АМРА или NMDA рецепторов глутамата, либо ингибиторов синтеза белка, повторное обучение приводило к формированию навыка. При этом, для восстановления памяти достаточно было 1-2-х сочетаний условного и подкрепляющего стимулов. Вместе с тем, повторное обучение животных через 10 дней или более длительный срок после индукции амнезии, не приводило к формированию навыка, не смотря на то, что количество сочетанных пищевых и подкрепляющих раздражений было большим, чем при первоначальном обучении. В последующих опытах мы исследовали возможность восстановления памяти мнемотропным препаратом, агонистом глицинового сайта NMDA рецепторов глутамата Д-циклосерином на разных стадиях амнезии, вызванной действием МК-801 перед напоминанием. Обнаружено, что на 3-4 дни после индукции амнезии инъекции D-циклосерина сочетанные с напоминанием приводили к восстановлению памяти. Вместе с тем, инъекции D-циклосерина и напоминание через 10 дней после индукции амнезии не оказывали влияния на ее развитие. Таким образом, нами впервые обнаружено, что после нарушения реконсолидации памяти условной пищевой аверсии антагонистами рецепторов глутамата или ингибиторами синтеза белка развивалась амнезия, включающая 4 две стадии. Ранняя, стадия амнезии продолжалась менее 10 дней и характеризовалась возможностью восстановления памяти при повторном обучении или действии мнемотропного препарата. Поздняя, «необратимая» стадия, развивалась через 10 дней после индукции амнезии и характеризовалась утратой способности животных к формированию или восстановлению памяти при повторном обучении и действии Д-циклосерина. Мы предположили, что в основе развития «необратимой» амнезии лежат молекулярные и клеточные события, приводящие к «реверсии» морфофункциональных изменений, сформированных в процессе обучения. Эти изменения нарастают с увеличением времени от момента возникновения амнезии, однако, на ранней стадии амнезии они сравнительно легко обратимы процедурой повторного обучения. К 10-му дню деструктивные изменения, повидимому, завершаются формированием качественно нового морфофункционального состояния нервных клеток, которое характеризуется нарушением процессов консолидации навыка при повторном обучении. Согласно общепринятым представлениям развитие амнезии после нарушения долговременной памяти может являться следствием затруднения процессов воспроизведения, частичного нарушения «следа» памяти, либо «стирания» следа памяти, что не исключает возможности формирования того же навыка при повторном обучении. Однако нами обнаружен новый, ранее в литературе не описанный феномен - нарушение процессов реконсолидации вызывало не только потерю памяти, но и развитие такого состояния нервной системы, при котором не возможно вновь выработать утраченный навык. Следует подчеркнуть, что эта устойчивая, «необратимая» амнезия не связана с каким-либо грубым, неизбирательным нарушением работы нервной системы. Напротив, индуцированная у животных амнезия строго специфична по отношению к определенному условному стимулу, поскольку сохранена возможность у этих же животных выработки навыка на другие пищевые условные стимулы. Механизмы нарушения способности к обучению остаются не ясными. Одной из причин развития «необратимой» амнезии может быть изменение молекулярно-генетических процессов в нейронах, которые приводят к «разрушению» морфологических «носителей» энграммы, например, вследствие элиминации синаптических связей, функционально необходимых для поддержания следа памяти между нервными клетками. Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что при одной и той же форме обучения могут развиваться разные виды амнезий – «обратимой и необратимой», в основе которых могут лежать различные нейрофизиологические и молекулярные механизмы. Развитие того или иного вида амнезии зависит от механизмов действия агентов, примененных для индукции экспериментальной амнезии, особенностей парадигмы обучения и процедуры напоминания, «силы» обучения, «возраста» памяти, и др. 5 Для индукции процессов реконсолидации и амнезии требуются специфические паттерны активации рецепторов нейротрансмиттеров. Как отмечено выше воздействия антагонистов рецепторов нейротрансмиттеров перед напоминанием приводили к специфическому нарушению памяти условной пищевой аверсии и развитию «обратимой» или «необратимой» амнезии. Однако, в последующих опытах мы выявили, что совместное действие антагонистов рецепторов серотонина с антагонистами NMDA или АМРА рецепторов глутамата во время реконсолидации памяти вызывало ослабление или предотвращение развития амнезии. Таким образом, нами выявлена противоречивая ситуация - изолированное действие антагонистов рецепторов серотонина и глутамата перед напоминанием вызывало развитие амнезии, тогда как одновременное ингибирование активности этих рецепторов препятствовало развитию амнезии. Другими словами, для индукции амнезии необходимо, с одной стороны, избирательное нарушение информации поступающей к нейрону при реконсолидации памяти, а с другой - сохранение определенного уровня этой информации, определенного набора активируемых рецепторов, достаточного для индукции процессов амнезии. Полученные нами результаты представляют практический интерес. В частности, при лечении ряда заболеваний (например наркотической зависимости, фобий и др.) попытки комбинированного применения антагонистов различных рецепторов нейротрансмиттеров могут вызывать действие обратное ожидаемому – амнестический эффект может не только не усиливаться, но и ослабевать или даже полностью нивелироваться. Зависимость индукции амнезии от процессов трансляции. На основании полученных результатов мы предложили гипотезу, согласно которой амнезия является активным, развивающимся во времени процессом, механизмы индукции и развития которой, по-видимому, сходны по основным критериям с механизмами других долговременных пластических перестроек нервной ткани, лежащих в основе адаптивного поведения. Из этой гипотезы следовало, что индукция амнезии, подобно механизмам индукции других долговременных пластических перестроек в мозге, может зависеть от процессов трансляции и транскрипции. В частности, амнезия, вызываемая нарушением процессов реконсолидации памяти антагонистами рецепторов нейромедиаторов, может подавляться ингибиторами синтеза белка и РНК. Это в определенной мере контринтуитивное предположение было подтверждено в последующих исследованиях. Не смотра на то, что изолированное действие ингибиторов синтеза белка или антагонистов рецепторов нейромедиаторов перед напоминанием, приводило к индукции амнезии, совместное действие этих веществ не вызывало нарушения памяти. В частности, мы не обнаружили нарушения воспроизведения навыка после совместного действия метиотепин+циклогексимид/напоминания или МК-801+циклогексимид/ 6 напоминания либо DNQX+анизимицин/напоминания – животные демонстрировали избегание «условнорефлекторной» пищи, сходное с таковым у контрольных обученных улиток. Таким образом, при совместных инъекциях антагонистов рецепторов нейротрансмиттеров и ингибиторов трансляции перед напоминанием полностью подавлялось развитие амнезии. «Временное окно» зависимости индукции амнезии от процессов трансляции. Согласно другому следствию из предложенной нами гипотезы должно существовать «временное окно» зависимости индукции амнезии от процессов трансляции. Мы обнаружили, что ингибитор синтеза белка циклогексимид препятствовал развитию амнезии при его введениях через 3 ч или 6 ч после действия МК-801/напоминания. В то же время введения ингибитора через 9 ч после действия МК-801/напоминания, не оказывали влияния на развитие амнезии. Таким образом «временное окно» зависимости индукции амнезии, возникающей при нарушении реконсолидации долговременной памяти от процессов трансляции, составляет около 9 ч. Зависимость индукции амнезии от процессов транскрипции.. Не смотря на то, что ингибиторы синтеза РНК не оказывали влияния на процессы реконсолидации памяти, они полностью подавляли развитие амнезии, индуцируемой действием антагониста NMDA рецепторов глутамата. В частности, после совместного действия, МК-801+DRB/напоминания или APV+ актиномицин Д/напоминания не выявлено нарушения воспроизведения навыка. Таким образом, при совместных инъекциях антагонистов рецепторов NMDA глутамата и ингибиторов транскрипции перед напоминанием амнезия не развивалось. «Временное окно» зависимости индукции амнезии от процессов трансляции составляет около 9 ч. При изучении «временного окна» зависимости индукции амнезии от процессов транскрипции обнаружено, что введения улиткам ингибитора синтеза РНК актиномицина Д через 3 ч и 6 ч после действия МК-801 и напоминания препятствовали развитию амнезии. Вместе с тем, инъекции актиномицина Д через 9 ч не оказывали влияния на развитие амнезии. Таким образом «временное окно» зависимости от процессов транскрипции механизмов индукции амнезии составило около 9 ч. Заключение Исходя из полученных данных, можно предположить следующую последовательность молекулярных событий, лежащих в основе процессов реконсолидации памяти условной пищевой аверсии и индукции амнезии, вызванной нарушением процессов реконсолидации. Предъявление условного стимула вызывает активацию рецепторов нейротрансмиттеров нервных клеток, включая рецепторы глутамата и серотонина, а также синтез белков, вовлекаемых в механизмы реконсолидации памяти. Поскольку реконсолидация памяти не зависела от процессов транскрипции можно предположить, что эти белки транслируются с предсуществующих («депонированных») мРНК, 7 которые, локализуются в синапсах и/или дендритах нейронов, вовлеченных в механизмы хранения памяти. При ингибировании одного из рецепторов нейротрансмиттеров во время напоминания и сохранении активации других рецепторов нейротрансмиттеров, по-видимому, не происходит реактивации «депонированных» мРНК и синтеза белков, вовлекаемых в механизмы реконсолидации памяти. Однако подавление синтеза белков и реконсолидации памяти не дает ответа на вопрос, почему развивается амнезия и каковы механизмы ее индукции? Мы полагаем, что при ингибировании одного типа рецепторов, измененный паттерн активации других рецепторов нейротрансмиттеров во время реактивации памяти, играет роль своеобразного «переключателя», который активирует молекулярные процессы индукции и развития амнезии. В отличие от реконсолидации памяти, индукция амнезии зависит от синтез мРНК и белков de novo. Синтезируемые мРНК и белки могут вызывать функциональные и морфологические перестройки нейронов, такие как элиминация синапсов, сформировавшихся при обучении и, как следствие, исчезновение ответов на условный стимул, как на уровне идентифицированных нейронов улиток, так и поведения животных. При совместном действии антагониста рецепторов нейротрансмиттеров и ингибитора транскрипции или трансляции синтез «амнестических» мРНК и белков подавлялся, и амнезия не развивалась. Таким образом, в наших экспериментальных исследованиях получены новые данные, вносящие существенный вклад в решение ряда теоретических вопросов проблем хранения памяти и развития амнезии, а также имеющие определенное практическое значение. Особо следует отметить, выявленные различные стадии развития амнезии, которые, вероятно, являются общебиологическим феноменом, характерным, по крайней мере, для некоторых форм памяти у разных видов животных, а не только для использованной нами модели обучения. В частности, в исследованиях, проведенных нами на крысах обнаружено, что при нарушении реконсолидации памяти условной обонятельной аверсии и пространственной памяти в водном лабиринте Морриса формировалась амнезия, включавшая две стадии. При этом на поздней стадии (приблизительно с 10 дня) развивалась «необратимая» амнезия, которая характеризовалась нарушением консолидации памяти при повторном обучении. Наличие стадий чувствительности амнезии к модулирующим воздействиям требует учитывать этот факт при тестировании сохранности памяти и возможности ее восстановления на разных сроках после индукции амнезии. Кроме того, полученные нами результаты могут иметь определенное значение для клинического анализа процессов амнезии, возникающей, в частности, при «острой» потере памяти различного генеза. Тактика коррекции нарушенной памяти терапевтическими процедурами или фармакологическими препаратами может иметь существенные особенности в зависимости от стадий амнезии, вовлекающих различные молекулярные и клеточные механизмы. 8 Таким образом, у улиток, обученных условной пищевой аверсии, нами впервые обнаружены специфические механизмы реконсолидациии долговременной памяти и амнезии, индуцируемой при нарушении процессов реконсолидации. Механизмы реконсолидации памяти зависят от процессов трансляции, но не транскрипции. Тогда как механизмы индукции амнезии, зависят как от процессов трансляции, так и транскрипции. Белки и мРНК, вовлекаемые в механизмы индукции амнезии, синтезируются в ограниченный промежуток времени – около 9 ч после напоминания. Полученные результаты свидетельствуют в поддержку предложенной нами гипотезы, согласно которой амнезия является активным, развивающимся в течение нескольких дней процессом, механизмы индукции которой, подобно механизмам других долговременных пластических перестроек мозга, зависят от синтеза специфических мРНК и белков. После индукции амнезии происходит реорганизации молекулярно клеточных процессов в мозге, которая может приводить к специфическому необратимому нарушению процессов консолидации памяти. 9
