Общие регуляторы роста у эмбрионов и опухолей.

Общие регуляторы роста у эмбрионов и опухолей.
В развитии эмбриона из зиготы и опухоли из злокачественной соматической клетки
существуют сходные черты обнаруживаемые на цитоморфологическом,
биохимическом и регуляторном уровнях. В силу того, что развитие зародыша
является нормальным процессом, включающим в себя рост и дифференцировку
клеток, а опухолевый процесс напротив явление патологическое, следует определить
какие механизмы эмбриогенеза препятствуют раковому перерождению
эмбриональных клеток, по прочим характеристикам схожих с опухолевыми.
Современная наука рассматривает канцерогенез как нарастающий разлад систем
регуляции поведения клетки, первопричиной которого служат самопроизвольные
изменения протоонкогенов (мутации).
Протоонкегены - это гены регулирующие нормальное поведение клетки, ее
праывильные ответы на воздействие факторов роста, гормонов, цитоконов и других
сигнальных веществ во время эмбриогенеза и в последующем развитии. Они образуют
систему контроля роста деления и дифференцировке клеток, и сами находятся под
контролем других генов, Например, мутация BRCA-1 и BRCA –2, может привести к
возникновению опухали яичников и молочной железы. В норме эти же гены
контролируют ценность геном. Участие протоонкогенов в основополагающих клеточных
процессах обуславливает их высокая эволюционная консервативность: многие
протооонкогены чрезвычайно сходки у эволюционно далёких видов. Так, протоонкогены
кодирующие факторы роста и их рецепторы найдены не только у млекопитающих и птиц,
но и беспозвоночных – нематод и насекомых. Хотя эволюционные пути позвоночных и
насекомых разошлись 800 миллионов лет назад, Несмотря на свою важность
протоонкогены любых организмов подвержены мутациям как и любые другие гены.
Мутации обычно происходят при копировании генетической информации и сохраняются
у всех потомков клетки. За исключением очень редких случаев мутации разрушают
тонкую настройку жизненных процессов жизнедеятельности клетки и ее способность
взаимодействовать с соседними клетками, вплоть до полного разлада, способности
понимать распоряжение организма.
Эмбрион так и опухоль не нуждаются в стимулах развития, так как они выделяют
необходимые для этого вещества - цитокины и полипептидные факторы роста. Клетки
опухолей так и эмбрионов действуют на себя и друг на друга, самообеспечивают рост,
дифференцировку и самоуничтожение (апоптоз). Однако, несмотря на сходство эмбрио- и
канцерогенеза необходимо отметить, что это два процесса идущих в разных
направлениях. Эмбриогенез характеризуется ростом дифференцированности клеток,
которые адекватно подчиняются целому, а опухоль напротив развивается от более
сложной организации клеток к менее, и степень его подчиненности целому уменьшается.
В развитии этих явлений, возможно, есть стадия, в которых оба эти
процесса подчиняется сигналом и воздействиям организма, приводящих опухоль к
гибели, а зародыш к развитию.
Основные характеристики обоих процессов - это высокий и автономный потенциал роста
клеток, который является следствием:
1. Работы онкогенов, белковые продукты которых участвуют в запуске клеточного цикла.
2. Продукции стимуляторов роста клеток с автономным механизмом действия на себя.
3. Обеспечение клеточного роста благодаря стимуляции роста сосудов тканей и органов
(1).
Основное отличие этих двух процессов в том, что при малигнизации
специализированные клетки побуждаются к делению, а их хромосомный аппарат,
подвергнутый структурным изменениям в результате дифференцировки и мутации не
может достаточно точно (без ошибок) удваиваться что способствует и превращению
клетки в канцерогенную, могущую в условиях дефицита внешних ростовых стимуляторов
делиться под воздействием собственных .
Фетальные ткани, состоящие на 90% из мульти- и плюриполентных клеток, напоминают
их только в этом качестве, так как вырабатывают огромное количество факторов роста,
но, кроме того, фетальные ткани вырабатывают сильные дистантные регуляторы
дифференцировки и миграции клеток. Это позволяет им интегрироваться в организм,
учитывая свое месторасположение и свойства соседствующих тканей. Поэтому вполне
возможно не только регенерация организма реципиента стволовыми эмбриональными
клетками, но и нормализация малигнизированных клеток, несильно продвинувшихся в
развитии своей автономии.
В клетках опухолей и эмбрионов активно продуцируется фермент теломераза, которая
отвечает за восстановление нормальной длины теломерных участков хромосом,
укорачивающихся во время удвоения ДНК. Клетки нормальных тканей быстро умирают
при нарушении контактов с соседними, в результате запрограммированной гибели
апоптоза. Опухолевые же клетки способны пережить отделение от других клеток, что
и обеспечивает их способность к метастазированию. При контакте эмбриональных и
опухолевых клеток возникают различные взаимодействия, которые могут повлечь за
собой передачу от клеток эмбрионов к клеткам опухолей способности отвечать на
сигналы, вызывающие апоптоз.
Инвазивный –проникающий в ткани рост характерный, как для опухолевых клеток, так и
для эмбриональных позволяет им благодаря действию ферментов участвовать в
разрушении матрикса тканей организма.
Ферменты, в том числе протеинкиназа позволяют трофобласту проникать в эндометрий
матки, однако в нем их действие ограничено действием ингибиторов. В отличие от
проникновения клеток трофобласта в эдометрий, инвазия опухоли слабо регулируемый
процесс без выраженных склонностей к стабилизации.
Важно отметить, что именно отдельные полипептидные факторы роста служат основными
кандидатами на роль регуляторов инвазии среди них инсулиноподобный фактор роста I,
интерлейкины I и VI, лептин и фактор некроза опухолей. Все они являются
продуцируются трофобластом и выполняют роль стимуляторов протеинкиназ (2).
Фактор некроза опухолей, называемый также кахетин и фактор включения
дифференцировки, продуцируется макрофагами, моноцитами, а также в небольших
количествах многими другими клетками. Он является цитокином широкого спектра
действия, с выраженными цитотоксической иммунорегуляторной и
противовоспалительной активностями, что показано, как в организме, так и в культуре
клеток (3).
Повышенная продукция фактора некроза опухолей приводит к активизации нейтрофилов,
макрофагов и лимфоцитов. Он может участвовать в противоопухолевой защите
организма, поскольку обладает широким спектром действия на злокачественные клетки,
отвечает за включение апоптоза, усиления наработки опухолевых – антигенов,
иммуномодулирующие эффекты и разрушение сосудистой системы (3).
Очевидно, что эмбриональные стволовые клетки являясь родоначальниками всех
известных типов клеток при дифференцировке должны выделять многие вещества, в том
числе и факторы некроза опухолей, которые, вызывают снижение количества метастазов
при совместном росте.
Уменьшение количества стволовых клеток коррелирует с увеличением новообразований.
После 18-19 – кратного удвоении клеток возникают трудности в достижении
терминальных стадии дифференцировки, что приводит к увеличению вероятности их
малигнизации. Чем меньшее число удвоений происходит в процессе дифференцировке от
столовой клетки до специализированной, тем меньше вероятность образования рака.
Образование рака у человека резко повышается именно в 50 лет, когда количество
стволовых клеток снижается до 1 на 500 000. Мы полагаем: если увеличить их количество
до значений, характерных для молодого и среднего возраста, то заболеваемость раком
снизится до величин, характерных для этих возрастов, так как способность к делению
коммитированных к определенной дифференцировке клеток не будет подвергаться
опасности слишком большого количества удвоений. Программа апоптоза с большей
вероятностью не будет разрушена мутациями, и эти клетки дадут новые
дифференцированные популяции клеток.
Данные литературы демонстрируют множественность гуморальных факторов,
контролирующих деление клеток, торможение их размножения можно вызвать многими
агентами, в том числе и теми, которые выделяют нормальные клетки. По этому
взаимодействие клеток опухолей с эмбриональными стволовыми клетками может вызвать
гибель первых, благодаря запуску программы апоптоза.
Клетки выработали несколько путей контроля роста и прежде всего процесса деления.
Деление клетки – не только один из самых важных но и самый опасный этап в жизни
клетки. В неделящейся клетке гинетический материал повредить очень трудно: вся ДНК
компактно уложена в хромосомы и защищена специальными белками. Перед делением же
должно произойти удвоение всего генетического материала – со всей клеточной ДНК
снимается копия. Допущенная в этот момент ошибка будут сохраняться во всем ряду
потомков этой клетки, а поэтому с точки зрения организма таких мутаций допускать
нельзя. Один из способов их выделения и пресечения состоит в том, что бы в
определенные моменты копировать ДНК, проверить правильно ли все идет. И если что то
не так в этой точки деление может прекратиться. В этой проверке участвует множество
белков. За временную остановку ген RB, продукт которого белок, позволяет пойти дольше
только при наличии разрешающих сигналов. А при обнаружении повреждений ДНК в
дело вступает белок р 53. Он активирует ген WAF 1 который синтезирует белок р 21.
Этот белок соеденяется с ферментами, от которых зависит продолжение деления клетки, и
блокирует их. Клеточный цикл останавливается, и это дает возможность клетке устранить
повреждение ДНК. Если же повреждение слишком велико, клетка переходит в режим
апоптоза.
Необходимо учитывать тот факт, что выделяемые как опухолями, так и зародышевыми
клетками белковые продукты участвуют в регуляции роста клеток, их дифференцировки и
апоптозе, в процессе развития зародыша.
Общие генные продукты опухолей и эмбриональных клеток могут быть полезны в
терапии опухолей, посредством стимуляции апоптоза, и возможно нормализации
некоторых форм опухолей.
Продукция эмбриональных антигенов опухолевыми клетками еще один показатель
общности эмбрио- и канцерогенеза. Раково-эмбриональный антиген синтезируется как
опухолевыми клетками, так и клетками эмбрионов, но и взрослыми стволовыми клетками.
Он выявлен в качестве антигена карциномы толстой кишки человека и одновременно
«эмбрионального» антигена присутствующего в эмбриогенезе в тканях кишечника,
поджелудочной железы и печени (4).
Этот антиген присутствует в нормальных клетках слизистой толстой кишки, легких и в
лактирующих молочных железах.
α- фетопротеин является одним из общих антигенов рака печени и эмбриональной печени.
Однако в малых количествах его можно найти в тканях здорового взрослого человека.
Трофобластический фактор роста больше всего синтезируется тканями эмбриона, в то же
время ряд исследователей считают его эмбриональной формой эпидермального фактора
роста (5). Этот же антиген найден у макрофагов взрослой крысы, регенерирующих
клетках печени и в центральной нервной системе.
Таким образом, все упомянутые антигены и другие белки, характерные для раннего
эмбриогенеза, обнаруживаются в клетках некоторых типов раковых опухолей,
вырабатываются также и в нормальных клетках, которые могут дать начало опухолевым
клеткам. Наличие раково-эмбриональных антигенов в клетках нормальных тканей
взрослых организмов делает проблематичным их использование для получения вакцин
против опухолей (1).
Антираковый потенциал ранних зародышей
С 1974г., известно, что клеточное микроокружение нормальной бластоцисты воздействуя
на клетку, тератокарциномы вызывает ее нормализацию, и вступают на путь нормального
развития (6).
Тератокарциномы – это перевиваемые злокачественные опухоли, получаемые из тератом.
Они известны только у нескольких линий мышей, у других животных их получить не
удается (7). По этому опасения, что транлантация фетальных клеток приведет к
опухолевому росту на наш взгляд сильно преувеличены.
Злокачественность клеток тератом имеет обратимый характер, поскольку утрачивается в
присутствии клеток нормальной бластоцисты. Не исключено, что важную роль в
нормализации играют специфические полипептидные факторы роста выделяемые
нормальными клетками зародыша и воспринимаемые соответствующими рецепторами
клеток тератокарциномы (1).
Установлено, что трофобластический фактор роста – из нормальных мышиных
фибробластов линии СЗН10Т12 вызывает апоптоз у трансформированных мышиных
фибробластов линии SWISS 3ТЗ (7).
Известно, что рост злокачественных клеток меланомы В - 16 прекращается после их
введения в области эмбриона, где сосредоточены предшественники меланоцитов (9).
Под влиянием клеток эмбриональных зачатков молочной железы подавляется рост клеток
аденокарциномы, а в присутствие предшественников нейронов и клеток нейробластомы
(10). Существует предположение, что мощный потенциал развития и способности к
дифференцировке эмбриональных клеток позволяет им индукцировать у раковых клеток
специализацию. Кроме того стволовые клетки эмбрионов, контактирующие с раковыми
«имитируют» их раннюю тканевую специализацию, вызывая в то же время их апоптоз и
замещая раковые клетки на нормальные.
В работе MintzB. и IllmenseeK. было показано, что из производных эмбриокарциномных
клеток, инъецированных в бластоцисту, могут образовываться даже половые клетки,
способные дать начало новой особи. Полученные из таких клеток химерные животные
имели нормальные во всех отношениях ткани, хотя некоторые их них развивались из
эмбриокарциномных клеток. Таким образом, нормализация клеток карциномы была
связана с контактом с ранними стволовыми клетками (11).
Значение стволовых клеток в медицине
Стволовые клетки таят в себе невиданные возможности от регенерации поврежденных
органов и тканей до лечения заболеваний, не поддающихся лекарственной терапии (12).
Стволовые клетки способны развиваться в клетки различных специализированных тканей
и органов. Из стволовых клеток могут возникать нейроны, фибробласты, клетки сердца,
печени, крови и т.д. существует два типа стволовых клеток: эмбриональные и
региональные. Первые участвуют в построении первичных органов зародыша. Вторые
обнаруживаются позже в эмбриональном развитии, когда формируются органы и ткани.
Стволовые клетки обнаружены почти во всех органах и тканях, благодаря им
восстанавливаются органы и ткани у млекопитающих. Стволовые клетки обнаружены в
выстилке желудочков мозга, гипокампе, благодаря им мозг может восстанавливать свой
клеточный состав. Существуют универсальные клетки, способные превращаться под
влиянием различных тканевых индукторов в нужные специализированные клетки – это
клетки стромы костного мозга. Установлено, что клетки стромы костного мозга,
введенные в зону повреждения сердечной мышцы, после инфаркта полностью
компенсирует его с восстановлением клеток сердечной мышцы. Эти данные получены в
экспериментах, проведенных на свиньях.
Широко используется терапия стромальными клетками для восстановления кости. В
настоящее время в США испытываются специальные коллагеновые губки, наполненные
индуцирующими веществами, которые направляют развитие клеток по требуемому пути.
Использование такой губки позволило 91-летней пациентке заживить старый перелом за
восемь месяцев (13).
Большое значение будут иметь стволовые клетки при лечении нейродегенеративных и
неврологических заболеваний: Альцгеймера, Паркинсона, хореи Гентингтона,
рассеянного склероза. Ученые Стенфордского университета обнаружили, что
стромальные клетки можно использовать для восстановления ткани кости. Возможна их
трансформация в клетки печени, почек, а также в клетки, синтезирующие инсулин (13).
Стволовые эмбриональные клетки представляют определенный интерес и для
использования их и в других патологических процессах. Использование стволовых клеток
для предупреждения возникновения опухолей является еще одним шагом в понимании
процессов, происходящих в организме в процессе старения. Большинство известных
опухолей возникает после того, как организм пройдет стадию созревания и выполнит
программу передачи генов следующему поколению, именно в это время количество
стволовых клеток резко снижается, так, например, у новорожденного одна стволовая
клетка приходится на 10000, а у 50-летнего одна на 500000, т.е. снижение количества
стволовых клеток в 500 раз. А это вызывает снижение регенерационной способности
органов и тканей. Рассматривая опухолевый процесс как попытку соматического
эмбриогенеза, призванного в условиях недостатка стволовых клеток возместить
недостающие клетки органов и тканей, мы должны наблюдать деспециализацию этих
клеток, и стимуляцию их деления что реально и происходит. Однако геном этих
соматических клеток уже не годится на роль программы общего развития организма, в
них происходят мутация с последующим перерождением. Однако, иммунная система до
поры сдерживает эту массовую опухолевую агрессию. Поэтому при подавлении
иммунитета возможно возникновение множественных опухолей, что мы и наблюдаем при
ВИЧ инфекции.
Образование вторичных опухолей в результате мутаций происходит и при подавлении
химиотерапевтическими препаратами и Х- лучами первичной опухоли, так как в этом
случае подавляется и иммунитет.
В процессе развития организма сначала считывается программа роста, клеток затем и
специализации и после этого апотоза.
Дифференциация клеток запрограммирована и поддерживается в течение примерно 60
делений, если не произойдет нарушения структуры ДНК этого сегмента специализации.
Затем, по мере уменьшения концевых частей ДНК, уменьшается возможность считывания
этих хромосомных фрагментов в условиях, когда теломераза не работает, либо ее работа
неэффективна, считываться программа апоптоза. Увеличение числа стволовых клеток в
организме может предупредить возникновение опухолей по нескольким причинам: это
стимуляция иммунной системы за счет увеличения клеточного состава лейкоцитов,
макрофагов и улучшения общего обмена веществ; ингибирование опухолей стволовыми
клетками за счет усиления синтеза цитокинов и индукции у них апоптоза. Исходя из этих
предпосылок, мы решили по возможности снизить развитие опухолевого процесса путем
одновременного или же превентивного введения эмбриональных стволовых клеток в
организм крыс.
Материал и методики
В экспериментах использовались самцы беспородных крыс весом 160-180 г. разводки
питомника КазНИИ онкологии и радиологии.
В качестве модели злокачественного процесса был взят перевиваемый штамм,
обладающий способностью образовывать метастазы в легочной ткани при внутривенном
введении опухолевых клеток (14). В КазНИИ онкологии и радиологии штамм
поддерживается на беспородных и линейных животных путем чередования внутривенных
и внутрибрюшинных трансплантаций опухолевого материала животным-реципиентам.
При проведении экспериментов суспензию клеток этого штамма в дозе 50 тысяч вводили
в боковую хвостовую вену животным контрольной и опытной группам.
Через 30 дней животные подвергались эвтаназии путем глубокого эфирного наркоза и
вскрывались для патологоанатомического обследования внутренних органов.
Легкие же извлекались отдельно и помещались в физиологическом растворе в
холодильник при t 4 Со на 5 суток для удаления воздушных пузырьков из их ткани, а
затем на приборе ПСБ для подсёта колоний производилось снятие размеров метастазов
в мм и подсчёт их числа.
Суспензию эмбриональных клеток готовили из 10-12 дневных эмбрионов. Для этого,
выделенные из матки беременной крысы эмбрионы помещали в пиницилиновый флакон с
раствором Хенкса и гомогенизировали сначала изогнутыми глазными ножницами, а затем
многократным пропусканием гомогената через инъекционную иглу шприца до получения
однородной гомогенной смеси, состоящей из отдельных клеток.
Для удаления клеточных агрегатов суспензию фильтрировали через 4-х слойный
капроновый фильтр. Подсчет концентрации клеток осуществлялся под визуальным
контролем микроскопа в камере Горяева.
Все манипуляции с опухолевыми и эмбриональными клетками проводились в
стерильных условиях. В первом эксперименте эмбриональные клетки вводились
подопытным животным за 7 дней до трансплантации опухоли, во втором - одновременно с
опухолевыми клетками. Доза инъецируемых эмбриональных клеток составляла 25 млн. на
животное.
Результаты двух экспериментов сведены в таблице
Таблица
Торможение развития колоний опухоли яичника в легких
при превентивном и одновременном введении эмбриональных
стволовых и раковых клеток самцам крыс
Опыт
Группы
Способ введения
Кол-во Кол-во Кол-во
Торможение,
стволовых клеток крыс
клонов клонов на %
1 крысу
первый контрольная
-
18
1094
опытная за неделю до
перевивки
16
236
14,75 75,7
второй контрольная
-
8
704
88
опытная одновременное
9
224
24,8
71,8
60,7
Образование клонов опухолей наблюдали в легких крыс через 30 дней после введения
опухолевых клеток. Всего в группе опыта в легких 16 крыс обнаружено 236 клонов, что в
среднем на одну крысу составило 14,75 клона на 1 голову. В контрольной группе,
состоящей из 18 крыс, обнаружено 1094 клона, что составляет 60,7 клона на 1 голову.
Разница между контролем и опытом составила 4,1 раза (60,7 : 14,7).
Таким образом, предварительная инъекция стволовых клеток вызвала уменьшение
развития опухолевых клеток в 4,1 раза или торможение на 75,7%.
Одновременно введение стволовых и опухолевых клеток в тех же соотношениях, что и в
первом эксперименте, привели к следующим результатам. В группе контроля у 8 крыс
возникло 704 клона, что в среднем составило 88 клонов на одну голову, в группе опыта у 9
крыс возникло 224 клона или 24,8 клона на 1 голову. Разница между контролем и опытом
составила 3,5 раза (88 : 24,8).
Одномоментное введение опухолевых и стволовых клеток привело к уменьшению
образования клонов опухоли в 3,5 раза или торможение на 71,8%. В среднем по двум
опытам снижение возникновения клонов ОЯ в легких крыс составило 3,8 раза
или торможение на 73,7%.
Заключение
В наших экспериментах было убедительно показано, что в процессе эмбрионального
развития появляются некие регуляторы, возможно это ростовые белковые факторы и
цитокины препятствующие развитию опухоли. Даже такая злокачественная опухоль, как
О.Я. перенесшая сотни пассажей, все еще имеет механизмы, позволяющие ее
контролировать. В дальнейших исследованиях будут определены факторы, вызывающие
уменьшение развития опухоли за счет таких явлений, как апоптоз и торможение деления
ее клеток. Будут исследованы интегральные взаимодействия зародышевых клеток на
опухоли в комплексе с другими терапевтическими средствами.
Выводы
1. Регуляция, осуществляемая эмбриональными клетками с помощью ряда
полипептидных факторов роста и цитокинов, позволяет им в ходе регенерационных
процессов, связанных с возобновлением популяции клеток, входящих в ткани,
восстанавливать некоторые функции опухолевых клеток и делать их способными
к самоуничтожению.
2. Высокая способность к развитию эмбриональных столовых клеток позволят им в
процессе специализации достигать конечной дифференцировки, выделяя большое число
индукторов и нормализовать злокачественно трансформированные клетки. Механизмы,
обеспечивающие реализацию этого эффекта, могут быть использованы при
трансплантации эмбриональных стволовых клеток, как в качестве терапевтического
средства лечения опухолей, так и для заблаговременной вакцинации против
злокачественного перерождения клеток.
3. Введение крысам стволовых клеток эмбриона за неделю до инъекции клеток опухоли
штамма ОЯ вызвало торможение роста клонов опухоли в легких крыс в 4,1 раза или на
75,7%.
4. Одновременное введение эмбриональных и опухолевых клеток
привело к торможению роста клонов ОЯ в 3,5 раза или на 71,8%.