влияние растительных экстрактов на

2_27_2015_96_4_25_2014.qxd 23.06.2015 22:48 Страница 58
СЕЛЕКЦИЯ И СЕМЕНОВОДСТВО СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ
УДК 635.342:573.6
ВЛИЯНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ
ЭКСТРАКТОВ НА
МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ
ПОТЕНЦИАЛ
ИЗОЛИРОВАННЫХ
ОРГАНОВ
BRASSICA OLERACEA L. IN VITRO
Киракосян Р.Н.1 – аспирант генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства
Калашникова Е.А.1 – доктор биол. наук, профессор кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства
Бондарева Л.Л.2 – доктор с.-х. наук, зав. лабораторией селекции и семеноводства капустных культур
ФГБОУ ВО Российский государственный аграрный университет – МСХА им. К.А. Тимирязева
127550, Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, д.49
E-mail: mia41291@mail.ru; kalash0407@mail.ru
1
ФГБНУ «Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур»
143080, Россия, Московская обл., Одинцовский р-н, п. ВНИИССОК, ул. Селекционная, д.14
E-mail: vniissok@mail.ru
2
Установлена роль растительных экстрактов в процессе индукции эмбриогенных структур и
дальнейшего их развития в растения. Добавление в состав питательной среды экстрактов с
применением в качестве растворителя DMSO повышает частоту андро- и гиногенеза на 2,4 %
по сравнению контрольным вариантом. Экспериментально доказано, что растительный экстракт, полученный из репродуктивных органов определенного генотипа, повышает морфогенетический потенциал изолированных органов только этого же генотипа.
Ключевые слова: капуста белокочанная, изолированные пыльники, изолированные завязи, растительные
экстракты, андрогенез, гиногенез
Введение
тин, а также калий, фосфор, кальций,
гибриды капусты. Поэтому создание
апуста белокочанная (Brassica
железо и марганец. Кроме того, капу-
таких гибридов является приоритетным
К
oleracea L.) – универсальная
ста является хорошим источником
направлением исследований в селек-
культура, широкому распространению
сахаров и легкоусвояемых белков. По
ции данной культуры (Литвинов С.С.,
которой способствовали ее ценные
содержанию азотистых веществ она
2003).
хозяйственные свойства: высокая уро-
превышает брюкву, репу, морковь, све-
жайность, наличие большого сортового
клу (Петрушко Ю.Н., 2003).
Решение большинства практических
задач селекции во многом может опре-
разнообразия различной спелости, а
В настоящее время актуальным
деляться эффективностью вовлечения
также лежкоспособность используемых
стало использование технологий, а
современных методов биотехнологии в
органов, что позволяет иметь свежую
также сортов и гибридов, приводящих к
селекционный процесс. Значительное
продукцию в течение круглого года. В
получению
высокой
место в решении этих задач занимает
кочанах капусты белокочанной в оби-
выровненностью
урожайностью.
клеточная селекция, основанная на
лии содержатся витамины Р, К, В1, В2,
Сочетание таких важных хозяйственно
отборе клеточных популяций, устойчи-
РР, С, инозит, фолиевая кислота, био-
ценных признаков имеют гетерозисные
вых к селективному фактору, и регене-
научнопрактический
журнал
продукции
и
[ 58 ]
с
овощи
россии
№ 2 (27) 2015
2_27_2015_96_4_25_2014.qxd 23.06.2015 22:49 Страница 59
BREEDING AND SEED PRODUCTION OF AGRICULTURAL CROPS
рации из них растений, а также гапло-
вирование изолированных пыльников
ночной не обогреваемой теплице, в
идные технологии (Калашникова Е.А.,
или пыльцы in vitro (Шмыкова Н.А.,
камерах
2003; Поляков А.В., 2003).
2009).
лаборатории и в полевых условиях
Использование удвоенных гаплоид-
Работы по получению гаплоидных
искусственного
климата
открытого грунта ВНИИССОК.
ных линий позволяет проводить более
растений
рода
Работа проводилась на бутонах,
эффективно отбор желательных гено-
Brassica ведутся во многих странах.
которые изолировали как с главного,
типов из сравнительно небольших
Однако факторы, от которых зависит
так и боковых побегов. В исследова-
популяций по сравнению с традицион-
эффективность пыльцевого эмбриоге-
ниях применяли схему комплексной
ной технологией выделения самоопы-
неза, еще недостаточно изучены.
В
предобработки соцветий пониженны-
ленных генотипов (Lazar M.D. 1984).
связи с этим работы по выявлению сор-
ми температурами (+4...6°С) в течение
Кроме того, поскольку у гаплоидов
тов, гибридов, линий, обладающих
3-х суток в сочетании с обработкой
отсутствует явление доминантности, их
высокой гаплоидной способностью и
соцветий растворами регуляторов
можно успешно использовать в мута-
установление факторов, оказывающих
роста (препарат Дропп, ИУК). В каче-
ционной селекции, а также для переда-
влияние на этот процесс, являются
стве контроля был выбран вариант
чи генов от полиплоидных видов дипло-
актуальными.
предобработки соцветий водой.
у
представителей
идным, при решении теоретических
Для поверхностной стерилизации
вопросов, связанных с происхождени-
Материалы и
бутонов в качестве стерилизующего
ем видов, созданием серий моносоми-
методы исследований
агента применяли сулему в концентра-
ков (Ницше Н., Венцель П., 1980).
Объектом исследования служили
ции 0,1%. Изолированные бутоны
Включение гаплоидных технологий в
изолированные пыльники и завязи
выдерживали в сулеме в течение 3-4
схему классической селекции позволит
сортов
белокочанной
минут, после чего их промывали в трех
сократить селекционный процесс на 4
(Brassica oleracea L.) селекции ВНИ-
порциях стерильной дистиллирован-
поколения (Chu C.C., 1978).
капусты
ИССОК: Зимовка 1474, Слава грибов-
ной воды. Пыльники и завязи асепти-
Получение гаплоидных растений
ская 231, а также селекционный мате-
чески извлекали из бутонов в условиях
возможно посредством андрогенеза in
риал (инбредные линии и селекцион-
ламинар-бокса и культивировали на
vitro, гаплоиндуктора, гиногенеза, пар-
ные формы капусты белокочанной
индуцирующих питательных средах
теногенеза (апомиксис), полиэмбрио-
разных групп спелости), полученные в
МС в чашках Петри, которые помеща-
нии. Наиболее перспективным подхо-
лаборатории селекции и семеновод-
ли в климакамеру (Binder, Германия) и
дом к разработке технологии получе-
ства капустных культур ВНИИССОК.
инкубировали в темноте при темпера-
ния гаплоидных растений – это культи-
Растения-доноры выращивали в пле-
туре 35°С в течение 5-ти суток, после
Рис.1. Схема получения растительных экстрактов.
научнопрактический
журнал
[ 59 ]
овощи
россии
№ 2 (27) 2015
2_27_2015_96_4_25_2014.qxd 23.06.2015 22:49 Страница 60
СЕЛЕКЦИЯ И СЕМЕНОВОДСТВО СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ
чего температурный режим уменьша-
технологии, селекции и семеновод-
что присутствие в составе питательной
ли до 25°С.
ства
В этих условиях экспланты выращивали в течение 25 суток и затем пере-
РГАУ-МСХА
Тимирязева
имени
К.А.
среды растительных экстрактов из
(Калашникова
Е.А.,
вариантов 1 и 3 приводило к увеличе-
Чередниченко М.Ю. и др., 2014).
нию числа жизнеспособных пыльников
носили в световую комнату, где был
установлен 16-часовой фотопериод и
и завязей, по сравнению с вариантом 4
Результаты и их обсуждение
(вода) и контролем. В последних вари-
освещение белыми люминесцентны-
Известно, что частота андро- и гино-
антах наблюдалась гибель пыльников
ми лампами с интенсивностью света 5
генеза in vitro зависит от ряда факторов
и завязей уже на 20 сутки, в то время
тыс. лк.
гормональной и негормональной при-
как в вариантах 1 и 3 (ацетон и спирт,
В работе изучали влияние расти-
роды: микроэлементов, витаминов,
соответственно) этот процесс был
тельных экстрактов, полученных из
компонентов углеводного и азотного
отмечен лишь на 58 сутки с начала
пыльников и завязей капусты на мор-
питания, фитогормонов и гормонопо-
культивирования. Исключение соста-
фогенетический потенциал изолиро-
добных веществ синтетического и при-
вил вариант 2 (DMSO), в котором
ванных репродуктивных органов.
родного происхождения. Однако, изме-
частота гиногенеза составила 2,4 %, а
Растительный экстракт получали из
няя соотношение и концентрацию этих
процесс образования андроклинных
пыльников и завязей растений капусты
веществ в питательной среде, частота
структур не был отмечен (рис. 2).
белокочанной, выращенных в камерах
эмбриогенеза в культуре изолирован-
Кроме того, экспериментально дока-
искусственного климата и теплице
ных репродуктивных органов не превы-
зано, что растительный экстракт, полу-
ВНИИССОК. Для получения экстракта
шает, как правило, 4 %. Одним из путей
ченный из репродуктивных органов
брали сырую биомассу образцов (от
повышения
морфогенетического
определенного генотипа, повышает
200 до 350 мг), которые экстрагирова-
потенциала культивируемых клеток
морфогенетический потенциал изоли-
ли 100% растворителями (вариант 1 –
является включение в состав питатель-
рованных органов только этого же
ацетон, вариант 2 – DMSO, вариант 3
ной среды растительных экстрактов
генотипа.
–спирт, вариант 4 – вода), путем рас-
(Бутенко Р.Г., 1999).
В дальнейшем сформированные
тирания ее в ступке. После этого полу-
В данной работе растительные экс-
эмбриоиды отделяли от первичного
ченную массу помещали в стеклянные
тракты, полученные из репродуктивных
экспланта и переносили на среду,
пробирки и выдерживали в течении 1
органов Brassica oleracea L., были
содержащую минеральные соли по
часа при температуре 23° С, после чего
взяты не случайно, так как известно, что
прописи МС, а также гормоны ИУК – 2
экстракты фильтровали через фильт-
именно в пыльце и незрелых семенах
мг/л, БАП – 1 мг/л, сахарозу – 3 %, агар
ровальную бумагу и затем стерилизо-
присутствуют важнейшие представите-
- 7 г/л. В этих условиях формирова-
вали путем пропускания их через бак-
ли природных брассиностероидов:
лись растения, которые проявили
териальный фильтр (Millipore, pore size
гомобрассинолид, норбрассинолид,
высокую способность к последующему
0,45 μM). Экстракты добавляли в пита-
эпибрассинолид и др. Эти вещества
размножению (рис. 3).
тельную среду перед ее разливом по
контролируют процессы роста, диффе-
Таким образом, экспериментально
чашкам Петри в концентрации 1 мл/
ренцировки и размножения растений
показано, что растительные экстракты
100 мл среды. В качестве контроля
(Бахтенко Е.Ю., Курапов П.Б., 2014).
на основе DMSO оказывают положи-
была принята питательная среда, не
В результате проведенных исследо-
тельное влияние на процессы морфо-
содержащая растительный экстракт.
ваний нами было установлено, что куль-
генеза in vitro. Его действие объ-
Схема эксперимента приведена на
тивирование пыльников и завязей в
ясняется тем, что данное химическое
рисунке 1. Исследования проводили в
контрольном варианте (без раститель-
вещество является хорошим раство-
трех повторностях.
ных экстрактов), а также в вариантах 1
рителем, обладает высокой проницае-
В работе придерживались правил
(ацетон), 3 (спирт) и 4 (вода) процессы
мостью, а, следовательно, усиливает
работы в стерильных условиях, разра-
андрогенеза и гиногенеза не были
перенос
ботанных на кафедре генетики, био-
получены. Однако, следует отметить,
среды в растительную клетку.
элементов
питательной
Рис.2. Этапы получения растений-регенерантов капусты белокочанной in vitro.
научнопрактический
журнал
[ 60 ]
овощи
россии
№ 2 (27) 2015
2_27_2015_96_4_25_2014.qxd 23.06.2015 22:49 Страница 61
BREEDING AND SEED PRODUCTION OF AGRICULTURAL CROPS
EFFECT OF PLANT EXTRACTS
ON THE MORPHOGENETIC
POTENTIAL OF ISOLATED ORGANS
OF BRASSICA OLERACEA L.
IN VITRO
Kirakosyan R.N.,1
Kalashnikova E.A.,1
Bondareva L.L.2
1 Russian State Agrarian University –
Moscow Agricultural Academy named
after K.A.Timiryazev , Agronomy
Faculty, Department of Genetics and
Biotechnology, 49 Timiryazevskaya
St., 127550,Moscow,Russia,
tel.8(499)976-40-72 e-mail:
mia41291@mail.ru,
kalash0407.@mail.ru
2 Federal State Budgetary Scientific
Research Institution “All-Russian
Scientific Research Institute of vegetable breeding and seed production”
143080, Russia, Moscow region,
Odintsovo district, p. VNIISSOK,
Selectionnaya street, 14
E-mail: vniissok@mail.ru
Abstract
The role of plant extracts in the process
of induction of embryogenic structures
and its following development in plants
is revealed. Thus, the addition in the
culture medium of the extracts diluted
in DMSO increases the rate of gynoand androgenesis on 2.4% as compared with control. Experimentally
proved that the plant extract derived
from the reproductive organs of certain
genotype increases the morphogenetic
potential of isolated organs only of the
same genotype.
Рис.3. Растения-регенеранты капусты белокочанной, полученные из завязи.
7.
Литература
Петрушко
Keywords: white head cabbage, isolated anthers, isolated ovules, plant
extracts, androgenesis, gynogenesis.
Ю.Н.,
Потемкина
В.И.,
Федяй
В.П.
Белокочанная капуста. Современная ресурсосберегаю1. Бахтенко, Е.Ю., Курапов П.Б. Регуляция роста и разви-
щая технология выращивания в условиях Приморского
тия растений: учебное пособие / Е.Ю. Бахтенко,
края. — Уссурийск, 2003. – 76 с.
П.Б.Курапов:
РФ:
8. Поляков, А.В. Основные направления использования
Вологодский гос. пед. ун-т. – Вологда: ВГПУ, 2014. – 192
биотехнологических методов в селекции овощных куль-
с.
тур / А.В. Поляков // Селекция, семеноводство и биотех-
2. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro
нология овощных и бахчевых культур (Доклады III
и биотехнологии на их основе: учебное пособие /
Международной конференции, посвященной памяти Б.В.
Р.Г.Бутенко – М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. – 160 с.
Квасникова) / М.: ВНИИО, 2003. – С. 29-33.
3. Калашникова, Е.А. Клеточная селекция растений на
9. Шмыкова, Н.А. Гаплоидия у томата. Перспективы соз-
устойчивость к грибным болезням: Дис. Док. Биол. наук:
дания гомозиготных линий на основе гиногенеза и андро-
М.: ТСХА, 2003. – 279 с.
генеза in vitro / Н.А. Шмыкова // Овощи России, 2009. –
4. Калашникова, Е.А. Лабораторный практикум по сель-
№1. – С.12-16.
скохозяйственной биотехнологии / Е.А. Калашникова,
10. Chu, C.C. The N6 Medium and its Applications for Anther
М.Ю. Чередниченко, Н.П. Карсункина, М.Р. Халилуев.
Culture of Cereal Crops /C.C. Chu //Proc. Plant. Tissue cultu-
Изд. 3-е, испр. и доп. Изд-во РГАУ-МСХА, - 2014. - 147 с.
re bening Geience Press. – 1978. – P. 43-50.
5. Литвинов, С.С. Овощеводство России и его научное
11. Lazar, M.D. Combining abilities and heritability of callus
обеспечение (состояние, приоритеты, перспективы). –
formation and plantley regeneration in wheat (Triticum aesti-
М.: ВНИИО, 2003. – 35 с.
vum) anther culture /M.D. Lazar //Theor. Appl. Genet., –
6. Ницше, В. Гаплоиды в селекции растений. /В. Ницше, Г.
1984. – V.68. – P.131-134.
Мин-во
образования
и
науки
Венцель - М.: Колос, 1980. – 128с.
научнопрактический
журнал
[ 61 ]
овощи
россии
№ 2 (27) 2015