ОТЧЕТ Доклинические испытания препарата «Герпезал, мазь

ОТЧЕТ
Доклинические испытания препарата «Герпезал, мазь глазная»
(Договор № 074-07)
Руководитель исследований
профессор, д.м.н.
Майчук Ю.Ф.
Москва 2008
Научный отчет
«Изучение токсичности, переносимости и терапевтической
эффективности препарата «Герпезал, мазь глазная» в эксперименте на
кроликах»
1. Экспериментальные исследования выполнены в ФГУ «МНИИ
глазных болезней им. Гельмгольца» Росмедтехнологий в отдел е
инфекционных и аллергических заболеваний глаз (103064,
Москва, ул. Садовая Черногрязская, д. 14/19).
2. Руководитель исследований: профессор, д.м.н. Майчук Ю.Ф. руководитель отдела инфекционных и аллергических заболеваний
глаз;
3. Исполнитель - вед. н. с, к.б. н. Щипанова А.И.
4. Испытуемый препарат - «Герпезал, 0,5% глазная мазь» производства
ЗАО «Интелфарм». Препарат сравнения - 3% глазная мазь
«Зовиракс», «Glaxo Wellcome», Англия
Для экспериментов отбирали кроликов с нормальными чистыми
глазами со светло-коричневым цветом радужной оболочки - без признаков
отека и раздражения. В опыт брали оба глаза кролика во всех сериях
экспериментов.
На протяжении эксперимента регистрировали изменения массы тела
у животных, следили за состоянием их шерстного покрова и слизистых
оболочек, характером выделений, поведенческими реакциями.
При исследовании безвредности и безопасности глазной мази
«Герпезал» и при изучении влияния аппликаций мази на нормальные
функции глаза изучаемый препарат вводили в нижний конъюнктивальный
мешок глаза кролика примерно по 50 мг, 3-4 раза в день ежедневно в
течение 30 суток.
Оценку состояния глаз у животных проводили с помощью методов,
описанных ниже, до начала введения лекарственных препаратов (до
лечения - «о точка», в динамике лечения и после окончания лечения на 30
день после начала лечения. Для определения возможных дефектов на
поверхности роговицы ежедневно проводили биомикроскопию глаза после
окрашивания роговицы 0,5 % раствором флюоресцеина в течение 30 дней.
О переносимости глазной мази Герпезал судили по степени тяжести
выраженности
признаков,
указывающих
на
их
токсическое
или
аллергизирующее действие.
Критерии оценки токсического действия глазного геля: гиперемия
конъюнктивы век и глазного яблока, точечная кератопатия, нитчатый
кератит.
Критерии для оценки аллергизирующего действия: зуд. дерматит
кожи
век,
гиперемия
конъюнктивы,
появление
сосочковой
или
фолликулярной реакции конъюнктивы, появление инфильтратов в лимбе
или по всей поверхности роговицы.
Для оценки влияния исследуемого препарата на нормальные
функции глаза у кроликов проводили измерения уровня чувствительности
роговицы, определение размера зрачка и внутриглазного давления.
Для измерения уровня чувствительности роговицы по Самойлову в
5 точках использовали волосок с толщиной, которая оказывает давление
10,0 г/мм2. Давление этого волоска ощущается в любой точке нормальной
роговицы. Этот волосок последовательно ставили концами на роговицу,
прижимали к ней до сгибания и регистрировали реакцию животного.
Размеры зрачка (пупиллометрию) у кроликов определяли при
дневном освещении в вертикальном и горизонтальном меридианах
линейкой с точностью 1 мм. Необходимость двух меридианах связана с
тем, что зрачок у кролика вытянут по вертикали.
Измерение внутриглазного давления (ВГД)
у животных
проводили с помощью манометра Маклакова с грузиком массой 10 г. Для
этого кролика фиксировали, его голову удерживали в горизонтальном
положении и проводили предварительную местную анестезию 0,5%
водным раствором дикаина. Для анестезии проводилась двукратное
инстиллирование анестетика по 1 капле с интервалом J -2 минуты. Расчет
ВГД проводили с помощью линейки Полякова. Результаты измерения
выражали в мм ртутного столбца.
Влияния глазной мази Герпезал на эпителизацию роговицы
исследовали на модели дозированной эрозии роговицы кроликов.
Животным после эпибульбарной анестезии 0.5% раствором дикаина в
центральной области роговицы трепаном диаметром 5 мм делали насечку
поверхностных слоев роговицы обоих глаз. Затем глазной ложечкой
удаляли эпителий. Для контроля процедуры роговицу сразу окрашивали
0.5% раствором флюоресцеина. Если эпителий удаляли равномерно, то
наблюдали равномерное окрашивание в виде круга диаметром 5 мм. Для
наблюдения за ходом регенерации производили окрашивание роговицы
глаза и измерение величины эрозии регенерирующего участка. Сроки
наблюдений: 0, 24 часа, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 суток после скарифицирования
роговицы. Формировали две группы животных: опытную и контрольную.
Опытная группа получала аппликации мази Герпезал в нижний
конъюнктивальный мешок глаза по 50 мг 3-4 раза в день. Контрольная
группа животных лечения не получала. Опыт продолжали до полной
эпителизации роговицы в опытной группе.
Результаты исследований.
Для оценки толерантности глазного геля было сформировано 2
группы животных: первая группа (опытная - 10 кроликов, 20 глаз)
получала исследуемый препарат «Герпезал, глазная мазь» 3-4 раза в день;
вторая группа - контрольная (10 кроликов, 20 глаз) - без лечения.
Изучаемый препарат закладывали в оба глаза животных.
В результате проведенных исследований на 20 кроликах не отмечено
каких-либо изменений в характере поведения (агрессивность, вялость) и
общем состоянии (внешний вид, состояние шерсти, вес, аппетит)
животных опытной группы, получавшей Герпезал по сравнению с
контрольными животными в течение всего срока наблюдений. Таблица№1.
Таблица 1. Динамика изменения массы кроликов
Срок
Масса кроликов, кг
наблюдения,сут.
Герпезал
Контроль
До лечения
2,7 ± 0,2
2,5 ± 0,1
(Осутки) лечения
После
2,6 ± 0,1
2,6 ± 0,3
(30 сутки)
Биомикроскопические
наблюдения
после
окрашивания
глаз
животных раствором флюоресцеина показали, что глаза животных
оставались спокойными в течение всего срока наблюдений (30 дней), какихлибо признаков со стороны тканей глаза свидетельствующих о токсикоаллергическом действии глазного геля не выявлено.
Оценка переносимости и толерантности мази производилась путем
измерение внутриглазного давления (ВГД), измерение размера зрачка
(пупиллометрия), и определение чувствительности роговой оболочки до
применения препарата («О» точка и через 30 дней, на следующий день
после
последней
аппликации
препарата).
Исследование
проводили
одновременно на одних и тех же животных. Сначала определяли размер
зрачка, затем чувствительность роговицы, затем измеряли ВГД.
Результаты исследований представлены в таблицах 2,3,4,5,6.
Таблица 2. Пупиллометрия глаз кроликов в динамике
применения глазного геля.
Группы
Горизонтальный меридиан Вертикальный меридиан
кроликов
ДО
после
до
после
Герпезал
8,5 ± 0,2
8,6 ± 0,2
9,5 ±0,2
9,6 ± 0,2
Контроль
8,6 ±0,1
8,7 ±0,1
9,6 ±0,1
9,7 ±0,1
Установлено, что размер зрачка (оба меридиана) в динамике
применения глазной мази не изменялся на протяжении всего срока
наблюдения. Нет статистически достоверных отличий в средних
значениях размера зрачка в опытной и контрольной группах (Р>0,05).
Таблица 4. Чувствительность роговицы глаз кроликов после
применения глазной мази «Герпезал»
Срок
Кол-во глаз (измения чувст./без изменения чувст.)
наблюдения,
Герпезал
Контроль
сутки
До
лечения
0/20
0/20
(Осутки)
После
0/20
0/20
лечения(30
сутки)
Изучаемые препараты не оказывают влияние на чувствительность
роговой оболочки в после применения исследуемого препарата в течение 30
суток.
Для оценки влияния глазной мази «Герпезал» на регенерацию
эпителия роговицы создавали модель дозированной эрозии роговицы.
Было сформировано две группы кроликов по 5 животных (10 глаз) в
каждой. Опытная группа получало сразу после скарификации исследуемый
препарат «Герпезал», контрольная группа - без лечения. Результаты
исследований представлены в таблице №5.
Таблица 5. Средние сроки эпителизации скарифицированной
роговицы после применения глазной мази «Герпезал».
Препарат
Сроки эпителизации, Критерий достоверности
сутки
Герпезал
6,7 ± 0,2
Контроль
7,0 ± 0,2
р>0,05
График №6. Средние сроки эпителизации скарифицированной
роговицы после аппликаций глазной мази «Герпезал».
Оценка терапевтической эффективности препарата «Герпезал,
глазная мазь» на модели экспериментального офтальмогерпеса
кроликов
Конечная
цель наших
исследований
состояла
в
оценке
терапевтической эффективности препарата в эксперименте. Идеальной
моделью для изучения течения офтальмогерпеса и оценки терапевтической
эффективности лекарственных препаратов, по мнению P. R. Laibson (1970),
является модель герпетического кератита кроликов.
Модель экспериментального герпетического кератита кроликов
воспроизводили по общепринятой методике. В работе был использован
штамм вируса, простого герпеса I типа "Коптев", который обычно
используется
для
воспроизведения
экспериментальной
модели
герпетического кератита кроликов в МНИИ глазных болезней им.
Гельмгольца.
Штамм вируса простого герпеса поддерживали пассированием: через
мозг белых беспородных мышей (in vivo). Вирусы культивировали in vivo,
путём внутримозгового введения 0.03 мл последовательных 10-кратных
разведений 10% мозговой суспензии в физиологическом растворе мышамсосункам массой 6-8 г. После появления выраженных симптомов
герпетического энцефалита мышей забивали, стерильно извлекали мозг,
который хранили в 50% растворе глицерина при
-20°
С. Для
инфицирования кроликов использовали 10% суспензию мозга мышей в
физиологическом растворе после её центрифугирования при 2000 об/мин. в
течение 10 мин.
После
предварительной
анестезии
роговицы
кроликов
(0.5%
раствором дикаина), по всей поверхности роговицы делали насечки острым
концом скребца в виде решётки. Насечки наносили не глубже боуменовой
мембраны. Затем в нижний конъюнктивальный мешок глаза вносили
вируссодержащую суспензию (0.1-0.2 мл) и осторожно втирали её в
роговицу. Заражали оба глаза животного. Начиная со второго дня после
заражения, кроликов ежедневно осматривали при помощи щелевой лампы
или бифокальной лупы при боковом освещении. Для выявления дефектов
роговицы производили её окрашивание 0.5% раствором флюоресцеина.
В
качестве
основных
критериев
эффективности
лечения
рассматривали возможность предупреждения образования изъязвлений и
сроки начала и конца эпителизации.
Исследование проведено на 15 кроликах (30 глаз). На 4 сутки после
заражения, когда развивалась картина типичного точечного герпетического
кератита, формировали 3 равноценные по клинической картине группы
животных по 5 кроликов (10 глаз) в каждой и начинали лечение. Опытная
группа в качестве лечения получала аппликации 0,5% глазной мази
«Герпезал» по 50 мг 3-4 раза в день до полной эпителизации роговицы. В
качестве контроля формировали 2 группы животных, одна из которых
получала лечение специфическим противогерпетическим препаратом- 3%
мазью «Зовиракс» 4 раза в день; вторая контрольная группа (контроль
вируса) лечения не получала. В качестве основных
критериев
эффективности
лечения
рассматривали
возможность
предупреждения образования изъязвлений роговицы, сроки эпителизации
роговицы и степень её помутнения. Результаты наблюдения представлены
на графике №6.
График №:6. Течения экспериментального кератита, вызванного
вирусом простого герпеса в динамике лечения его препаратом Герпезал.
Как видно из представленных данных, в контрольной группе кроликов, без
лечения, отмечено постепенное нарастание воспалительного процесса,
которое достигало своего максимального развития к 6-7 суткам после
инфицирования. Разгар герпетической болезни глаз кроликов выражался в
развитии
стромальных
кератитов,
которые
сопровождались
резковыраженной перикорнеальной инъекцией глаз.
В
группах
кроликов,
получавших
в
качестве
лечения
противовирусную терапию (Зовиракс и Герпезал), наблюдали иную
картину течения экспериментального кератита. Так, в группе кроликов,
леченных 3% мазью Зовиракс, уже на 2-3 сутки после начала лечения
отмечали
снижение
тяжести
воспалительного
процесса.
В
группе
животных, получавших Герпезал, в течение этого времени ещё отмечали
нарастание воспалительных явлений, которые характеризовались слиянием
точечных
эрозий
и
образованием только
древовидных
фигур.
В
последующие сроки наблюдения, в этой группе кроликов также отмечали
быстрое снижение среднего индекса выраженности клинических признаков
роговичного воспаления. Следует отметить, что разница в проявлении
воспалительных явлений в опытной группе и группе, получавшей
специфический противовирусный препарат Зовиракс, статистически не
достоверна почти во все сроки наблюдения (р>0,05).
Полное клиническое выздоровление в опытной группе кроликов,
наступало к 14 суткам в 100% случаев от момента заражения и к 13 суткам
- при лечении Зовираксом. В группе контрольных кроликов полное
выздоравление не отмечали к 14 суткам. Важно отметить, что к этому
сроку наблюдения в контрольной группе кроликов 2 кролика из 5 погибло
вследствие развития герпетического энцефалита, в то время как в группе
животных, леченных Зовираксом, гибели не отмеали, а в группе,леченных
Герпезалом, погиб только один кролик.
Таблица 5. Степень выраженности помутнений роговицы после
лечения экспериментального офтальмогерпеса кроликов глазной
мазью «Герпезал».
Степень помутнения
Группа
животных
лёгкая
выраженная
грубая
Контроль
2
2
6
Герпезал
6
4
0
Зовиракс
8
2
0
Как видно из представленных данных, применение глазной мази
«Герпезал»
при
лечения
экспериментального
офтальмогерпеса
предотвращало развитие грубых помутнений, так же, как и при применение
3% глазной мази «Зовиракс». В контрольной группе животных, без
лечения, в 60% случаев отмечено образование грубых помутнений типа
"маккула".
Образование лёгких помутнений роговицы наблюдалось в 80%
случаев в группе животных, получавших «Зовиракс», в 60% случаев при
применении глазной мази «Герпезал» и в 20% случаев в контрольной
группе, получавшей плацебо.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом установлено, что глазная мазь «Герпезал» обладают
выраженной терапевтической эффективностью, предотвращает развитие
грубых помутнений роговицы и сопоставима по своему терапевтическому
эффекту широко известному противогерпетическому препарату - 3%
глазной мази «Зовиракс» и может быть представлена к клиническим
исследованиям для оценки ее терапевтической эффективности при лечении
герпетических заболеваний глаз больных.