Список литературы (ко всему диплому)
advertisement
Методы трансформации. Трансформацией называется процесс доставки и экспрессии чужеродных ДНК в живых клетках. Для трансформации растительных клеток существуют несколько методов. На основании способа доставки ДНК в клетки растений выделяют два типа векторных систем. В одной из них осуществляют прямое введение ДНК (или перенос генов, опосредованный ДНК) в клетки или протопласты, лишённые клеточной стенки, с использованием группы стандартных методов (электропорации, микроинъекции, биобаллистики, Ca2+-зависимой трансформации в присутствии ПЭГ и т.п.). Системы второго типа используют ферментативный аппарат доставки ДНК бактерий Agrobacterium tumefaciens (или A. rhizogenes). Эффективность метода «прямой» трансформации растительных протопластов в среднем не превышает 0,01-0,1% от числа протопластов (Potrykus et all, 1985, цит. по Данилова, 2001). Среди его недостатков — сложность процедур получения протопластов и регенерации растений. Кроме того, при культивировании протопластов in vitro высока вероятность появления сомаклональных вариаций. Наиболее широко распространены методы агробактериальной трансформации, биобаллистики (или биолистики) и переноса ДНК с помощью вирусных векторов. При этом лишь первые два позволяют получать стабильную трансфекцию. Баллистическая трансформация, использование для трансформирования кукурузы Наиболее активно применяемым методом прямого переноса генов является способ генетической трансформации растений с использованием установки «short gun» (дробовик), называемый био(бал)листической трансформацией. Он нашёл самое широкое применение именно для трансформации злаковых. Суть метода заключается в том, что на микрочастицы-носители из химически инертного металла (золото, вольфрам, платина или лёд), размером 0,6-1,2 мкм, осаждается ДНК, а затем они с помощью порохового заряда, сжатого гелия или электрического поля разгоняются до высоких скоростей (1000 м/сек) и поток частиц кратковременно направляют на поверхность клеток. Некоторые из них проникают внутрь клеток и попадают в ядро, где могут включиться в хромосомы растения. Что касается применения баллистического метода для трансформации кукурузы, то с его помощью можно переносить гены в клетки суспензионных культур, в первичный и пассируемый эмбриогенный каллус, в организованные ткани: примордии, незрелые зародыши, меристематические ткани. Первое время для получения трансгенных растений в качестве мишени при баллистической трансфекции широко использовали эмбриогенную суспензионную культуру клеток (Gordon-Kamm et al., 1990; Walters et al., 1992). Низкая степень агрегированности суспензии обеспечивала вероятность попадания микрочастиц с ДНК во все клетки мишени. Тем не менее, частота трансформации была очень низка, например, для получения 1 трансгенного растения бомбардировали 7-10 чашек эмбриогенной суспензионной культуры кукурузы (Walters et al., 1992). Эффективность трансформации для разных объектов кукурузы в экспериментах составляет от 1% (Koziel et al., 1993) до 3% (после оптимизации метода) (Brettschneider et al., 1997), в отдельных случаях достигает 18,1 %, но при этом не все растения экспрессировали полную конструкцию вводимых генов (Tang et al., 2000). Следует отметить, что число копий вводимого гена на растительный геном при бомбардировке достаточно неопределённо, причём многие из этих копий представлены в виде неполных последовательностей, что может приводить к нежелательным последствиям, в том числе и к «молчанию» генов. Молекулярный анализ трансгенных растений кукурузы, полученных методом баллистической трансфекции, показал, что число интегрированных фрагментов ДНК варьирует от 1 до 20 копий. Наиболее удачные растения получены с 1-4 копиями (Walters et al., 1992), и с 3-8 копиями (Brettschneider et al., 1997). Ещё одним недостатком баллистического метода является ограничение размера вводимых генетических конструкций. Как правило, удаётся перенести ДНК размером не более 10 тысяч пар оснований. Плазмиды большего размера плохо закрепляются на металлических частицах или разрушаются при «бомбардировке» (Tang et al., 2000). Несмотря на недостатки, метод баллистической трансформации в настоящее время считается наиболее эффективным для злаковых растений среди методов прямого переноса генов. Агробактериальная трансформация Использование Agrobacterium tumefaciens имеет преимущества перед биолистическим методом, поскольку увеличивает пропорцию стабильных низкокопийных событий трансформации, может доставлять сегменты ДНК больших размеров и не требует специальных баллистических установок. В естественных условиях Agrobacterium tumefaciens вызывает в растениях-хозяевах опухоли с названием «корончатые галлы». Корончатые галлы возникают из-за нарушений гормонального баланса, их клетки неограниченно растут даже в отсутствие растительных гормонов и сохраняют свои свойства при элиминации бактерии. A. rhizogenes вызывает у растений формирование множества придаточных корней («бородатые корни»). Эти отклонения обусловлены наличием в клетке бактерии так называемых Ti-и Ri-плазмид (у A. tumefaciens и A. rhizogenes соответственно) (Лутова, 1998, Лутова, 2000). Строение Ti-плазмиды Ti- и Ri-плазмиды представляют собой кольцевую 2-нитевую ДНК из 12-22 т.п.о. В состав Ti-плазмиды входят так называемая Т-ДНК (transferred DNA — трансформирующая ДНК, сегмент, встраиваемый в ДНК растения), которая кодирует ферменты синтеза опинов и фитогормонов; Vir-область, кодирующая гены, отвечающие за перенос Т-ДНК в растение; гены утилизации опинов; локусы ori обеспечивают репликацию плазмиды и контролируют поддержание плазмиды в бактериальной клетке, tra — контролируют конъюгацию бактерий. При интеграции в растительный геном и экспрессии Т-ДНК изменяется дифференцировка растительных клеток из-за нарушения гормонального баланса. Происходит гормон-независимый рост клеток. Опины служат для бактерии источником C, N и энергии. В области Т-ДНК, гомологичной у разных Ti-плазмид, есть 6 генов, отвечающих за морфологию опухоли и синтез гормонов. Эти гены имеют черты эукариотического типа регуляции: 1) имеются 3’ и 5’-фланкирующие последовательности, есть TATA и GAAT-боксы и сигналы полиаденилирования; 2) транскрипция этих генов инициируется РНК-полимеразой II; 3) последовательности генов узнаются транс-действующими факторами, гены имеют тканеспецифичность, сопоставимую с растительной. В негомологичных областях находятся гены опинсинтаз. Процесс трансформации. Процесс агробактериальной трансформации (рис. 3) можно разделить на 4 этапа: 1) прикрепление бактерии к стенке растительной клетки; 2) вырезание Т-ДНК и проникновение её внутрь растительной клетки; 3) интеграция Т-ДНК в геном растения; 4) экспрессия Т-ДНК. На эффективность трансформации влияют особенности поверхности клеточной стенки растения при прикреплении бактерии. Бактерия прикрепляется к клетке латерально, возможно, полярно. В процессе участвуют: рикадгезин (14кДа), полипептид 34-38 кДа, транспортные белки, лектины, целлюлозные фибриллы, сукциноглюкан. Само по себе прикрепление не лимитирует процесс, но мутации по генам, его обеспечивающим, могут затрагивать и процесс переноса. Бактерии могут проходить через клеточную стенку, локально лизируя её, или через естественные отверстия, где отсутствует или растянута вторичная клеточная стенка (кончик корневого волоска). Для лизиса нужен VirB1, который может разрывать 1,4-β-гликозидную связь. С-конец этого белка располагается на наружной мембране бактерии, формируя агрегаты или короткие пилеобразные структуры на полюсе (Чумаков, 2001). Индукция начальных этапов происходит в сайте раневого повреждения растения (Лутова, 1998). Несмотря на то, что легче трансформируются клетки из повреждённых тканей (удаление эпидермиса и клеточной стенки обнажает специфические рецепторные сайты для бактерий, а также выделяются соединения-индукторы), механизм переноса не требует поранения (Чумаков, 2001). Для индукции требуются химические черты ранения: выделение низкомолекулярных фенольных соединений (ацетосирингон), сахаров (глюкоза, глюкуроновая кислота), кислый рН. Сигнальные молекулы впервые найдены в экссудатах корней и листьев Nicotiana tabacum (Stachel, 1985, цит. по Захарченко, 1999). Первая обнаруженная из них — ацетосирингон или 4-ацетил-2,6-диметоксифенол — синтезируется в метаболически активных повреждённых тканях растений. Также есть сигнальная активность у многих растительных фенольных соединений: синаповой, кофейной, феруловой, коричной кислот (Bolton, 1986, цит. по Захарченко, 1999). Для оптимизации индукции Vir-генов в экссудатах должны быть углеводы: глюкоза, глюкуроновая кислота, галактоза, галактуроновая кислота, арабиноза, манноза, фукоза, целлобиоза, ксилоза — компоненты клеточной стенки растений (Ankenbauer, 1990, цит. по Захарченко, 1999). Конечный результат зависит от суммарной активности всех сигналов. Сигналы распознаются хеморецепторными белками специфическими и VirA ChvE. трансмембранными Сахара связываются с периплазматическим доменом рецептора в виде комплекса с белкомпродуктом СhvE. ChvE кодируется хромосомой бактерии и изменяет способность отвечать VirA экспрессируется на фенольные конститутивно. Белок соединения. имеет VirA Ген VirA гистидин- протеинкиназную активность и способность к автофосфорилированию. В отсутствие индуктора его киназная активность ингибирована. Стимуляция ацетосирингоном и сахарами приводит к автофосфорилированию VirA, в таком состоянии Фосфорилированный он является VirG донором связывается фосфата с для VirG. 12-нуклеотидной последовательностью vir-бокса и индуцирует транскрипцию остальных virгенов. Рис. 1. Схема агробактериальной трансформации (Лутова, 2000). VirD кодирует несколько продуктов, один из них — двухкомпонентная топоизомераза/эндонуклеаза. Т-ДНК фланкирована несовершенными прямыми повторами по 25 н. п. — сайты узнавания VirD-эндонуклеазы. Разрезание происходит между 3-м и 4-м основанием сайта. VirD2 ковалентно связывается с 5’-концом Т-нити, он содержит сигнал ядерной локализации (NLS) около С-конца. (NLS важен для опухолеобразования, а образование однонитевой Т-ДНК может происходить и без него) (Лутова, 1998). VirD2 доводит белок до ядра растительной клетки, узнаёт ядерную пору, встраивает ген в растительную хромосому. Продукты VirB (11 белков) формируют структуры, напоминающие половые ворсинки E. coli (Патрушев, 2004). VirB11 нужен для транспорта ТДНК из бактерии в растение. Это АТФаза, способная автофосфорилироваться; она находится на внутренней мембране клеток бактерий. Остальные VirB находятся на бактериальной оболочке или внутри мембраны, формируя канал для Т-ДНК (Лутова, 1998). VirE2 связывается с однонитевой Т-ДНК, покрывает её оболочкой, защищая её при переносе от эндонуклеаз; формируется так называемый Ткомплекс. VirE2 также содержит NLS. Без VirE2 однонитевая Т-ДНК остаётся в цитоплазме и не транспортируется в ядро растительной клетки. Перенос Т-ДНК в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин. кокультивирования (Лутова, 1998). Инсерция Т-ДНК в растительную хромосому проходит многоступенчато. Существует гомология между растительной ДНК по обеим сторонам от сайта интеграции и наружным относительно точек вырезания ТДНК областям плазмиды. Механизм встраивания сходен с гомологичной рекомбинацией. При переносе могут возникать делеции и инсерции около концевых последовательностей. Гены Т-ДНК имеют собственные промоторы, транскрибируются ферментами хозяина. Если нет перестроек при интеграции, гены Т-ДНК и маркёры, введённые в неё, наследуются как менделевы признаки, моногенные и доминирующие. К 1976 году было известно, что 576 видов двудольных, 42 голосеменных и 5 однодольных способны подвергаться агробактериальной трансформации. Бактериальные детерминанты круга хозяев находятся в плазмиде и хромосоме; плазмидные — в Т-ДНК и vir-области. Получение трансгенных однодольных трансформации было растений долгое время с помощью агробактериальной затруднено, поскольку они характеризуются устойчивостью к этому патогену. Предположение о том, что невосприимчивость многих однодольных вызвана отсутствием специфических сигнальных молекул, индуцирующих Vir-область и вырезание Т-ДНК, проверена в работе (Захарченко, 1999). В работе показано, что такие молекулы выделяются тканями многих однодольных, тканями злаков в том числе. Сигнальная активность зависит от типа ткани и сортовых особенностей. Сигнальные молекулы однодольных могут отличаться от сигнальных молекул двудольных. Иногда в экссудатах наблюдаются вещества с бактериостатической активностью, которые могут влиять на эффективность трансформации. Растения могут вырабатывать и соединения, ингибирующие индукцию vir-генов (Захарченко, 1999). Отсюда следует, что слабая способность к трансформации однодольных не является результатом отсутствия нужных сигнальных молекул. Эффективность индукции зависит от возраста, физиологического состояния, оптимальных условий опыта. Можно использовать синтетические сигналы и экссудаты чувствительных двудольных (Захарченко, 1999). Для инфекции и переноса в растение ДНК необходимо также связывание с пектином, которого мало у злаков (Лутова, 1998). Таким образом, на трансформацию влияют: 1) физиология растения (возраст, тип ткани); 2) тип, источник, размер эксплантов; 3) условия кокультивации — состав сред; 4) физические факторы — температура, рН. Процесс трансформации мультигенно регулируется растением (Лутова, 1999, Лутова, 2000). Использование Ti-плазмид в генной инженерии. Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмиды не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удалёнными онкогенами. Вместо последних в вектор можно встроить стандартными методами последовательности клонируемой ДНК. Сайты рестрикции расположены в искусственной Т-области. В качестве селективных маркёров в этих плазмидах используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые позволяют отбирать трансформированные клетки растений (Патрушев, 2004). Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды рестриктазами, встраивают в стандартный плазмидный вектор для E.coli. Он содержит плазмиду pBR322, в которую и встраивают участок Ti-плазмиды. В E.coli вектор клонируется, затем плазмида выделяется. В Т-сегмент по сайтам рестрикции встраивают определённый ген. Затем вектор снова размножают в E.coli, вводят в A. tumefaciens с полной Ti-плазмидой. Вследствие гомологичной рекомбинации Т-ДНК с чужим геном встраивается в Ti-плазмиду, замещая нормальную ТДНК. Часто используется бинарная векторная система. В агробактерию вводят 2 модифицированных Ti-плазмиды. Одна содержит vir-область (хелперная плазмида, или плазмида-помощник), вторая — Т-ДНК с нужным геном. Vir-гены могут вырезать Т-ДНК в транс-положении (на соседней плазмиде). Иногда используют так называемую «супербинарную» систему, при которой целевая Ti-плазмида и хелперная в клетке бактерии коинтегрируют в одну (Ishida, 1996). Векторная система должна 1) содержать сигналы переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений; систему экспрессии чужеродных генов в растении (промотор, узнаваемый растительными полимеразами и пр.); маркёр, необходимый для селекции трансформированных клеток; 2) не содержать онкогенов (онкогены удаляются, например, с помощью транспозонного мутагенеза). Необходимо существование уникальных сайтов рестрикции — до 1820. Промотор должен обладать силой, возможностями регуляции, ткане- и органоспецифичностью (Лутова, 2000). Для предотвращения вмешательства в результат целевых белков, синтезируемых агробактерией (бактериальных контаминаций), в генетических конструкциях предусматривается вставка интронов в целевой, маркёрный или репортёрный ген (в зависимости от целей исследования). При наличии интронов невозможна экспрессия нормального белка в прокариотах, но при экспрессии гена в эукариотических клетках они вырезаются, что приводит к синтезу активного белка. Затем с помощью vir-генов происходит перенос генно-инженерной конструкции в клетки растений. Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно транскрибируемых генов. Возможно встраивание нескольких копий Т-ДНК. Для активации vir-генов используются экссудаты двудольных, синтезирующих сигнальные фенольные соединения (Лутова, 1998). Эксперименты по трансформации кукурузы Впервые способность инфицировать кукурузу агробактерией показана Гримсли (Grimsley at al., 1987), в котором кДНК вируса полосатости кукурузы была доставлена в растение с помощью A. tumefaciens, и растение показало признаки системной инфекции. Гоулд инокулировал апексы стебля агробактерией и получил несколько трансгенных растений (Gould at al., 1991). Шен наблюдал β-GUS в клетках кукурузы, доставленных в них с помощью агробактерии (Shen, 1993). Первая фертильная трансгенная кукуруза получена в 1990 году с помощью биолистической пушки (GordonKamn, 1990). В качестве репортёрного гена для визуализации результатов трансформации использовался ген β-глюкуронидазы (β-GUS) (Ishida, 1996; Frame, 2002; Senaratna, 1991; Shen, 1993; Gould, 1991), который придаёт трансформированным клеткам способность расщеплять субстрат X-Gluc (5бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуроновую сопровождается освобождением кислоту). соединения, Этот которое под процесс действием кислорода воздуха приобретает голубую окраску (цит. по Патрушев, 2004). Доказательством того, что Т-ДНК вошла в клетку растения и экспрессируется может служить идентификация опин-синтазной активности в экстрактах (лизопиндегидрогеназы, нопалин-дегидрогеназы). Они экспрессируются только в тканях инфицированного растения, а не в хозяйской бактерии (Graves, 1986). Однако регистрация по опиновым тестам сложна и может затрудняться присутствием иных веществ. В качестве маркеров для селекции трансформантов служат различные гены. Наиболее часто используются гены nptII — неомицинфосфотрансфераза II, обеспечивающая устойчивость клеток к антибиотикам неомицину и канамицину (Данилова, 2001), hpt — гигромицин B-фосфотрансфераза, обеспечивающая устойчивость к гигромицину (Ishida, 1996), ген bar — устойчивость к кодирует фосфоацетилтрансферазу, гербициду биалафосу обеспечивает (фосфинотрицину, PPT), ингибирующему глутамат-синтазу (Ishida, 1996; Frame, 2002). В качестве селекционного агента использовалась также манноза, а маркёрного гена — фосфоманноизомераза (pmi). Этот фермент кодирует превращение маннозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат. В случае, когда манноза является основным или единственным источником углерода, в клетках накапливается фосфоглюкоизомеразу, маннозо-6-фосфат. блокируя гликолиз, а Он также ингибирует лишает клеток ортофосфата, необходимого для синтеза АТФ. В результате манноза, не являясь токсичной сама по себе, ингибирует рост корней и дыхание, а также затрудняет образование эмбриогенного каллуса. Трансгенные по гену pmi клетки способны использовать маннозу в качестве источника углерода (Negrotto D., 2000). При трансформации важен выбор ткани, подвергающейся заражению. Поскольку из ткани, как правило, необходимо получить целое растение, то следует использовать такие объекты, из которых возможна регенерация. Трансформация протопластов в этом случае является не эффективной, так как регенерация из протопластов растений кукурузы очень низка. Поэтому в качестве объекта используются зародыши, обычно зиготические (Graves, 1986; Frame, 2002, Ishida, 1996), есть опыт трансформации соматических эмбрионов (Senaratna, 1991). Из тканей щитка незрелых зиготических эмбрионов на питательной среде развивается каллусная ткань, которая также может использоваться в качестве объекта (Данилова, 2001, Ishida, 1996). В работе Ишиды (Ishida, 1996), несмотря на высокую частоту временной трансформации (определяемой по экспрессии GUS), частота стабильной трансформации (число PPT-устойчивых событий) в клетках трансформированного каллуса была очень низка. Однако, Даниловой (Данилова, Долгих, 2005) удавалось получить при использовании каллусной ткани в зависимости от условий опыта до 40% канамицин-устойчивых растений. Трансгенная культура тканей аспарагуса продолжала экспрессировать функции, кодируемые Т-ДНК, в течение нескольких клеточных поколений (Graves, 1986). Влияние возраста эмбриона на эффективность трансформации проведена в работе (Ishida, 1996). Варианты зародышей: 1-1,2 мм (9-14 день после опыления), 1,5-2 мм (11-16 день), 2-2,5 мм (13-18 день). Максимальная частота стабильной трансформации получена из незрелых эмбрионов (1-1,2 мм). В экспериментах с эмбрионами 1,5-2 мм частота трансформации оказалась нулевой, с эмбрионами 2-2,5 мм — также относительно низкой (1,3%). В той же работе проводилось исследование эффективности трансформации в зависимости от плотности бактерий в суспензии. Оптимальным признано количество 1∙109 КОЕ/мл (5-30% стабильных трансформантов). При количестве свыше 5∙109 образовывались большие кластеры GUS-экспрессирующих клеток в эмбрионах, но стабильных трансформантов не появлялось. При концентрации 1∙108 эффективность трансформации составляла менее 10%, при концентрации меньшей 1∙107 трансформации не было. Для доставки ДНК в растительные клетки применяются разнообразные методики, и вопрос наиболее оптимальной далеко не изучен до конца. В работе Сенаратны (Senaratna, 1991) исследовалась способность вставки ДНК в сухие растительные клетки соматических эмбрионов при впитывании. Соматические эмбрионы из культуры, устойчивой к засухе, высушивались до 10-15% влажности. В этой методике использовались 2 свойства сухой ткани: 1) высокий градиент водного потенциала между клеткой и водным раствором, 2) дезорганизация клеточных мембран при низкой содержании воды и, как следствие, увеличение проницаемости липидного бислоя мембраны для цитоплазматических растворов. Клеточная стенка сухих меристематических клеток проницаема для ДНК. Зародыши быстрее поглощают воду, чем семена, поскольку не имеют семенных оболочек и эндосперма. У соматических эмбрионов выше повреждения мембран при впитывании, чем у зиготических зародышей. Но меристематические клетки первых непосредственно граничат с раствором, что способствует попаданию ДНК в клетки. Эмбрионы помещались в раствор, в котором содержалась плазмида с β-GUS. В результате наблюдалась экспрессия GUS в созревающих эмбрионах и проростках. Процент трансформации составил 70%, однако, его стоит рассматривать, скорее, как показатель временной трансформации. Отмечено, что экспозиция ДНК критична в ранней стадии впитывания, поскольку, если эмбрион выдерживался в воде 2 часа перед инкубацией, экспрессии GUS не наблюдалось. Добавление в раствор агентов, сильно повышающих проницаемость мембраны (CaCl2 и ДМСО) не способствовало повышению частоты экспрессии, а порой снижало её (Senaratna, 1991). Трансформацию можно проводить непосредственным внедрением агробактерии в раневые сайты на поверхности зародыша, например, царапая его иглой, смоченной в агробактериальной суспензии (концентрация бактерий — 108 клеток в мл). Такая работа проводилась Грейвс (Graves, 1986), анализ эффективности трансформации осуществлялся по наличию активности опинсинтаз, содержащихся в исходном штамме. Однако в этом случае велика вероятность летальных повреждений эмбриона, либо повреждений, затрудняющих его развитие во взрослое растение. Эффективность трансформации составила 60%, но её тоже стоит считать только временной. Основным способом агробактериальными основополагающими трансформации клетками факторами является тканевых выступают культивация объектов. состав сред и с Здесь условия культивирования. Данилова (Данилова, Долгих, 2005) провела работу по оптимизации условий трансформации каллусов. Эффективность трансформации (3-40%) зависела от используемой линии, при этом лучшие результаты показала линия R91 с максимальным эмбриогенным потенциалом. Добавление в среду синтетической сигнальной молекулы (ацетосирингона) способствовало повышению количества канамицинустойчивых растений (в 1,1-3,5 раза), однако в большей мере этому способствовал экссудат табака (в 1,2-5,4 раза). Вакуумная инфильтрация суспензии агробактерий с находящимися в кусочками каллусов оказалась успешнее, чем простое культивирование ткани в суспензии (в 3 раза). Ещё более продуктивным оказалось культивирование каллусов на агробактериальном газоне (в 1,4-3,8 раза). Наиболее высокие результаты были достигнуты для линии R91 и культивирования на агробактериальном газоне с добавлением экссудата табака. В работе Ишиды (Ishida, 1996) проведены эксперименты с 30секундным встряхиванием зародышей на вортексе при трансформации. Величина трансформации оказалась достаточно высокой. Процент временной трансформации оценивался по экспрессии GUS (которая достигала 80-100%), однако, при длительном селекционном отборе на PPT выживало гораздо меньшее количество растений (5-30%, в среднем 11,8% стабильных трансформантов). Результаты по стабильной трансформации были воспроизведены в работе Негротто (Negrotto, 2000), где маркёрным геном был pmi. Здесь количество выживших растений также составляло 10-30%. Возможно, стресс способствует некоторому ослаблению патогенной защиты организма, снижая сопротивляемость заражению. Не исключено и другое объяснение: повреждений) при происходит слабом стрессе активация (не защитных наносящем систем, видимых способствуя повышенному выживанию трансформированных клеток. Такое объяснение подтверждается работой Фрейма (Frame, 2002). Здесь в методиках трансформирования незрелых зиготических зародышей с агробактерией использовался L-цистеин в качестве антиоксиданта в разных концентрациях. Наиболее эффективной оказалась концентрация 400 мг/л Lцистеина. Цистеин привёл к улучшениям во временной экспрессии β-GUS и значительному повышению в эффективности стабильной трансформации. Средняя эффективность стабильной трансформации (число биалафосустойчивых событий на 100 инфицированных эмбрионов) — 5,5%. Подтверждены интеграция в геном, экспрессия и наследование в двух поколениях. Антиоксиданты при созревании экспланты, прекультивировании, инфицировании, во время и после кокультивации способствуют стабильному трансгенезу в японском рисе, винограде. С L-цистеином увеличивалась частота доставки Т-ДНК в экспланты гипокотильного узла клещевины. Антиоксиданты способствуют снижают выживанию ущерб от реакции заражённых клеток. сверхчувствительности, Возможно, главное препятствие в трансформации кукурузы — не инфицирование, а выживание клеток с Т-ДНК в хромосомах (Frame, 2002). Таким образом, на эффективность трансформации влияли: 1) тип, 2) стадия ткани, 3) концентрация бактерии, 4) состав среды культивирования ткани, 5) селективный маркер, 6) вид вектора, 7) генотип кукурузы. Похоже, главное — не доставка ДНК в клетки, а выживание клеток с Т-ДНК (Ishida, 1996). Влияние используемых антибиотиков на объект. При трансформации каллусных тканей вопрос элиминации бактерий после инфицирования ставит вопрос о влиянии используемых антибиотиков на культуру клеток. Антибиотики и фунгициды обычно ингибируют рост культуры. Но обнаружено, что пенициллин и антибиотики цефалоспоринового ряда стимулируют рост клеток в культуре табака. Фосфомицин и пенициллин стимулировали рост культур подсолнечника и барвинка. Цефалоспориновые антибиотики (широко используются карбенициллин и цефотаксим) имеют широкий спектр активности, низкую эукариотическую токсичность, эффективны в малых дозах. Цефотаксим — антибиотик цефалоспоринового ряда — стимулировал рост каллуса, эмбриогенез и регенерацию растений. Если реакция эксплантов двудольных растений на цефалоспориновые антибиотики была неоднозначной, то у злаковых растений описано только стимулирующее действие антибиотиков. В исследовании Борелли (Borelli, 1992) на 2 сортах пшеницы с разными регенерационными способностями цефотаксим не влиял на частоту индукции каллуса, но заметно стимулировал в обоих сортах регенерацию растений (в случае сорта с низкой регенерационной способностью количество регенерантов увеличилось в 17 раз). В концентрации 200 мг/л на высокоэмбриогенном сорте проявлялся токсический эффект. У ячменя и сорго цефотаксим усиливал роста каллуса, эмбриогенез и регенерацию растений (Rao et al., 1995). В опытах на кукурузе, он, наоборот, способствовал ускоренной дифференцировке эмбриогенного каллуса кукурузы. Если без применения цефотаксима регенерация побегов из эмбриогенного каллуса продолжается в течении 1 года и более, то при добавлении цефотаксима в питательную среду для роста каллуса полная дифференциация каллуса происходит за 6—7 пассажей (4—5 месяцев). Стимуляция регенерации начинается со второго пассажа, количество регенерантов достигает максимума в V пассаже, и затем резко уменьшается (Данилова, 2001). Цефотаксим может действовать как регулятор морфогенетического развития злаковых культур. Одним из продуктов разложения карбенициллина является фенилуксусная кислота, обладающая ауксиновой активностью. Возможно, биологическая активность цефотаксима, относящегося к той же группе цефалоспориновых антибиотиков, также связана с образованием при его разложении стимуляторов роста или морфогенеза. В зависимости от эндогенного уровня фитогормонов в тканях растения регуляторы роста, образующиеся при разложении антибиотиков, стимулируют или ингибируют регенерацию растений. Вероятно, с этим связана различная реакция на антибиотики разных видов или сортов растений. Есть также предположение, что неактивная форма в клетке даёт токсический эффект (Borelli, 1992). В качестве селективного антибиотика в данной работе использовался канамицин. Виды растений антибиотику. Однако отличаются по устойчивости к этому ткани кукурузы проявляют к нему высокую чувствительность. Он токсичен для эмбриогенного каллуса кукурузы, в концентрации 25 мг/л полностью подавляет эмбриогенез и регенерацию растений, хотя в первом пассаже влияние на каллус может проявляться не явно. Наиболее чувствительна стадия регенерации растений. Реакция растений-регенерантов легко регистрируется визуально по побелению листьев и замедленному развитию. Дозы 25 мг/л при 14-тидневном контакте растений с антибиотиком было достаточно для полной элиминации чувствительных к канамицину регенерантов. Однако, растения, выращенные из семян, предварительно замоченных на антибиотике, оказывались чувствительны только при дозе не менее 100 мг/л (Данилова, 2001). Список литературы (ко всему диплому) 1. Беспалов И.А., Шиянов П.А., Лукашевич Л.В., Лунев В.Е., Трибуш С.С., Гапонова Г.И., Деев С.М. Получение одноцепочечных антител к ферритину человека в E.coli. // Молекулярная биология, 1993, т. 27, с. 451460. 2. Галактионов В.Г. Иммунология, М., Изд-во МГУ, 1998. 3. Данилова С. А. Расширение возможностей увеличения производства кукурузы путем генетической трансформации агробактериальным методом. Дисс. к.с.н., 2001. 4. Данилова С.А., Долгих Ю.И. Условия, необходимые для агробактериальной (A.tumefaciens) трансформации эмбриогенного каллуса кукурузы. // Физиология растений, 2005, в печати. 5. Деев С.М., Поляновский О.Л. Трансфектомы — продуценты искусственных антител. // Биотехнология, 1987, т. 3, с. 796-801. 6. Захарченко Н. С., Каляева М. А., Бурьянов Я. И. Индуцирование процессинга агробактериальной Т-ДНК экссудатами однодольных растений. // Физиология растений, 1999, т. 46, №2, с. 282-291. 7. Лунев В.Е., Мельникова Я.И., Кошкин С.А., Лунева Н.М., Червесова Т.С., Василевская И.А., Прейгерзон В.А., Марцев С.П. Моноклональные антитела к ферритину селезенки человека. I. Получение и исследование взаимодействия с изоферритинами и апоферритином. // Биохимия, 1993, т. 58, с. 745-758. 8. Лутова Л. А. Генетическая инженерия растений: свершения и надежды.// Соросовский образовательный журнал, 2000, №10, с. 10-17. 9. Лутова Л. А., Павлова З. Б., Иванова М. И. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений. // Генетика, 1998, т. 3, №2, с. 165-182. 10.Метт В.Л., Метт В.А., Сонг Дж.Ч., Джонс В.Т., Рейнолдс П.Х. Экспрессия одиночной цепи антитела к аспартатаминотрансферазе Р2 в трансгенных растениях табака. // Физиология растений, 2000, т. 47, №3, с. 397-401. 11.Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. Т.1. Генетическая и белковая инженерия. М., Наука, 2004. 12.(a) Семенюк Е.Г. Экспрессия рекомбинантных антител к ферритину человека в растительных системах. Диссертация к.б.н., 2003. 13.(b) Семенюк Е. Г., Стремовский О. А., Орлова И. В., Баландин Т. Г., Носов А. М., Бурьянов Я. И., Деев С. М., Петров Р. В. Биосинтез мини-антител к ферритину человека в растительных и бактериальных продуцентах. // Молекулярная биология, 2003, т. 37, № 5, с. 452-457. 14.Чуб В. В. Рост и развитие растений, // В кн. «Физиология растений» под ред. Ермакова И. П., М., «Академия», 2005 г. 15.Чумаков М. И. Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растительной клеткой при переносе Т-ДНК. //????, 2001, с. 143-156. 16.Artsaenko O., Peisker M., zur Nieden U., Fiedler U., Weiler E.W., Müntz K., Conrad U. Expression of single-chain Fv antibody against abscisic acid creates a wilty phenotype in transgenic tobacco. // Plant J., 1995, v. 8, p. 745-750. 17.Borelli G. M., Fonzo N. D., Lupotto E. Effect of cefotaxime on callus culture and plant regeneration in durum wheat. // Journal of plant physiology, 1992, v. 140, p. 372-374. 18.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem., 1976, v. 72, p. 248-254. 19.Brettschneider R., Becker D., Lorz H. Efficient transformation of scutellar tissue of maize embryos. // Theor. Appl. Genet., 1997, v. 94, p. 737-748. 20.Carter P. Bispecific human IgG by design. // J. Immunol. Meth., 2001, v. 248, p. 7-15. 21.Conrad U., Fiedler U. Compartment-specific accumulation of recombinant immunoglobulins in plant cells: an essential tool for antibody production and immunomodulation of physiological functions and pathogen activity. // Plant Mol. Biol., 1998, v. 38 (1-2). p. 101-109. 22. Conrad U., Manteuffel R. Immunomodulation of phytohormones and functional protein in plant cells. // Trends in Plant Science, 2001, September, v. 6, №9. 23.Düring K., Hippe S., Kreuzaler F., Schell J. Synthesis and self-assembly of functional monoclonal antibody in transgenic Nicotiana tabacum. // Plant Mol. Biol., 1990, v. 15, p. 281-293. 24.(a) Fischer R., Drossard J., Commandeur U., Schillberg S., Emans N. Towards molecular farming in the future: moving from diagnostic protein and antibody production in microbes to plants. // Biotechnol. Appl. Biochem., 1999, v. 30, p. 101-108. 25.(b) Fisher R., Liao Y.C., Hoffman K., Schillberg S., Emans N. Molecular farming of recombinant antibodies in plants. // Biol. Chem., 1999, v. 380. p. 825-839. 26.Frame B. R., Shou H., Chikwamba R. K., Zhang Z., Xiang C., Fonger T. M., Pegg S. E. K., Li B., Nettleton B. S., Pei D., Wang K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system. // Plant Physiology, 2002, May, v. 129, p. 13-22. 27.Godoy-Hernandes G.C., Chappell J., Devarenne T.P. Antisens expression of hmg1 from Arabidopsis thaliana encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, reduces isoprenoid production in transgenic tobacco plants. // J. Plant Physiol., 1998, v. 153, p. 415-424. 28.Gordon-Kamm W. J., Spencer T.M., Mangano M.L. et al. Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. // Plant Cell., 1990, v. 2, p. 603-618. 29.Gould J., Devey M., Hasegawa O., Eugenio C.U., Peterson G., Smith R.H. Transformation of Zea mays L. using Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex. // Plant Physiology, 1991, v. 95, p. 426-434. 30.Graves A. C. F., Goldman S.L. The transformation of Zea mays seedlings with Agrobacterium tumefaciens. Detection of T-DNA specific enzyme activities. // Plant molecular biology, 1986, v. 7, p. 43-50. 31. Grimsley N., Hohn T., Davis J.W., Hohn B. Agrobacterium mediated delivery of infectious maize streak virus into maize plants. // Nature, 1987, v. 325, p. 177-179. 32.Hendy S., Chen Z.C., Barker H., Santa Cruz S., Chapman S., Torrance L., Cockburn W., Whitelam G.C. Rapid production of single-chain Fv fragments in plants using a potato virus X vector. // Journal of Immunological Methods, 1999, v. 231, p. 137-146. 33.Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants. // Nature, 1989, v. 342, p. 76-78. 34.Ishida Y., Salto H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., Kumashiro T. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. // Nature biotechnology, 1996, June, v. 14. 35.Jobling S. A., Jarman C., Teh M.-m., Holmberg N., Blake C., Verhoeyen M. E. Immunomodulation of enzyme function in plants by single-domain antybody fragments. // Nature biotechnology, 2003, v. 21, p. 77-80. 36.Koziel M.G., Beland G.L., Bowman C., Carozzi N.B., Crenshaw R., Crossland L., Dawson J., Desai N., Hill M., Kadwell S., Launis K., Lewis K., Maddox D., Mc Pherson K., Mehji M.R., Merlin E., Rhodes R., Warren G.W., Wright M., Evola M.S. Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis. // Biotechnology, 1993, v. 11, p. 194-200. 37.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, 1970, v. 227, p. 680-685. 38.Ma J. K-C., Hein M.B. Plant antibodies for immunotherapy. // Plant Phhysiol., 1995, v. 109, p. 341-346. 39.Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. // Physiol. Plant, 1962, v. 15, is. 4, p. 473-497. 40.Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. // Nucl. Acids Res., 1980, v. 8. p. 4321-4325. 41.Negrotto D., Jolley M., Beer S., Wenck A. R., Hansen G. The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plant (Zea mays L.) via Agrobacterium tumefaciens. // Plant cell reports, 2000, v. 19, p. 798-803. 42.Owen M., Gandecha A., Cock burn B., Whitelam G. Synthesis of functional antiphytochrome single-chain Fv protein in transgenic tobacco plants. // Biotechnology, 1992, v. 10. p. 790-794. 43.Rao A.M., Sree K.P., Kishor P.B.K. Enhanced plant regeneration in grain and sweet sorghum by asparagine, proline and cefotaxime // Plant Cell Rep., 1995, v. 15, № 1-2, p. 72-75. 44.Russel D.A. Feasibility of antibody production in plants for human therapeutic use. // Tous droits de properiete intellectuelle reserves. Reproduction, representation et diffusion interdites, 2000, p. 120-138. 45.Senaratna T., McKersie B. D., Kasha K.J., Procunier J. D. Direct DNA uptake during imbibition of dry cells. // Plant Science, 1991, v. 79, p. 223-228. 46. Shen W.H., Escudero J., Schlappi M., Ramos C., Hohn B., Koukolikova Z.N. T-DNA transfer to maize cells: histochemical inves tigation of -glucuronidase activiti in maize tissues. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, p. 14881492. 47.Stöger E., Vaquero C., Torres E., Sack M., Nicholson L., Drossard J., Williams S., Keen D., Perrin Y., Christou P., Fischer R. Cereal crops as viable production and storage system for pharmaceutical scFv antibodies. // Plant Mol. Biol., 2000, v. 42, p. 583-590. 48.Strauss M., Kauder F., Peisker M., Sonnewald U., Conrad U., Heineke D. Expression of an abscisic acid-binding single-chain antibody influences the subsellular distribution of abscisic acid and leads to developmental changes in transgenic potato plants. // Planta, 2000, v. 213, p. 361-369. 49.Tang K., Wu A., Yao J., Qi H., Lu X. Development mediated transformation and genetic analysis-based selektion. // Acta Biotech., 2000, v. 20, is. 2, p. 175183. 50.Voss A., Niersbach M., Hain R., Hirsch H.J., Liao Y. C., Kreuzaler F., Fischer R. Reduced virus infectivity in N. tabacum secreting a TMV-specific full-size antibody. // Mol. Breed., 1995, v. 1, p. 30-50. 51.Walkerpeach C.R., Velten J. Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: cointegrate and binary vector systems. // Plant Mol. Biol. Manual, 1985, Eds Gelvin S.B., Schilperoopt R.A. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., B1., p.119. 52.Walters D.A., Vetsch C.S., Potts D.E., Lundguist R.C. Transformation and inheritance of a hygromycin phosphotransferase gene in maize plants. // Plant Mol. Biol., 1992, v. 18, p. 189-200. 53. Zambryski P., Joos H., Genetello C., Leemans J., Van Montague M., Schell J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cell without alteration their normal regeneration caparcity. // EMBO J., 1983, v.2, p. 2143-2150.
