Разработка нового токсикогеномного подхода для оценки

N-04-GRIEM-1
Паспорт совместного российско-американского проекта
1.
Название
Разработка нового токсикогеномного подхода для определения биобезопасности
наноматериалов на основе комплекса биосенсоров, позволяющих проводить мониторинг
изменения активности сигнальных каскадов, регулирующих транскрипцию клетки.
2.
АННОТАЦИЯ (Цели и задачи, область исследований, проблема, мотивация)
ПРОБЛЕМА. Серьезным препятствием в развитии нанотехнологий является отсутствие
понимания тех потенциальных опасностей и рисков которые новые материалы могут
представлять для человеческого организма и окружающей среды. Привычные физикохимические методы анализа плохо подходят для решения этой задачи, потому что, в отличие
от обычных соединений, не химическая формула, а размеры и пространственная структура в
большей степени определяют биоактивности наноматериалов. То есть, в настоящее время,
наряду с проведением классических (химическая токсичность и канцерогенность)
токсикологических исследований наноматериалов существует необходимость в разработке
новых методов анализа влияния наноматериалов на клетку и организм. Эти методы
определения токсичности наноматериалов должны быть основаны на анализе всех основных
стрессорных реакциях клетки (генотоксический, оксидативный, протеотоксический, тепловой
стрессы, стрессы, связанные с гипоксией, повреждением органелл и цитоскелета и др), которые
могут возникать в ответ на взаимодействие наноматериалов с клеткой.
ОСНОВНАЯ ЗАДАЧА данного проекта направлена на разработку нового молекулярнобиологического подхода к определению биологических свойств наноматериалов и их потенциальных
токсичных эффектов для человеческого организма. В этом подходе, экспериментатор анализирует
ответ человеческих клеток к изучаемому соединению, измеряя активности сигнальных каскадов,
регулирующих транскрипцию генной информации в клетках.
ТЕХНОЛОГИЯ. Практическое осуществление нового токсикогеномного подхода требует
применения соответствующих технологий. В ходе выполнения данного проекта будет разработан
комплекс биосенсоров, позволяющих проводить мониторинг изменения активности различных
транскрипционных факторов – белков, осуществляющих контроль и регуляцию экспрессии генов. В
качестве биосенсоров будут выступать клеточные линии, происходящие из различных органов и
тканей человека, что позволит нам моделировать эффекты наноматериалов при различных путях
попадания в организм, т.е., через дыхание, пищу, кожный контакт, печень (основную мишень
токсических соединений при системном введении) и др. При реализации нового подхода,
принципиально, будет создано 2 типа биосенсоров.
Первый тип биосенсоров представляет собой набор клеточных культур, в каждая из которых
позволяет регистрировать изменение активности одного специфического транскрипционного
фактора, активность которого является маркерной для определенного вида клеточного стресса
(генотоксический, оксидативный, протеотоксический стресс и др.). Изменение активности
транскрипционных факторов (NF-kappaB, AP-1, P53, HIF-1 NRF-2, E2F, и др.) регистрируется по
трансактивации экспрессии репортерных генов (люциферазы, b-галактозидазы и др.), находящихся
под контролем специфического (для каждого конкретного транскрипционного фактора) промотера.
Таким образом, каждый отдельный биосенсор позволяет определять интенсивность одного из видов
стрессорных реакций клетки (воспаление; тепловой шок; дефицит питательных веществ и
нуклеотидов; нарушение цитоскелета; генотоксический, оксидативный, протеотоксический стресс; и
др.).
Второй тип биосенсоров будет разработан американской стороной. По аналогии с клеточными
биосенсорами описанными выше, будут получены трансгенные животные, каждое из которых будет
позволит определять интенсивность развития определенного вида стресса (регистрируемого по
изменению трансактивации репортерных генов) в организме животного в ответ на экспозицию
наноматериалам. То есть, такие трансгенные животные будут выступать в качестве биосенсоров для
оценки биобезопасности наноматериалов в условиях in vivo. Помимо возможности оценки
системных эффектов наноматериалов на организм животного, использование такого типа
биосенсоров позволит проводить определение воздействия наноматериалов на организм в
зависимости от пола и возраста, оценить влияние наноматериалов на протекание беременности,
определить эмбриотоксичность, выявить влияние на репродуктивную и другие функции.
Третий тип биосенсоров будет реализован на основе технологической платформы, которая
позволяет количественно измерять активности множества генно-регуляторных путей в культурах
клеток. Эта технология, называемая FACTORIAL™, разработана американской биотехнологической
компанией ATTAGENE (Research Triangle Park, NC). Основой FACTORIAL’а является ансамбль
специальных рекомбинантных ДНК конструкций, используемых в качестве молекулярных зондов,
которые вводятся в изучаемые клетки и производят репортерные РНК молекулы пропорционально
активностям измеряемых генно-регуляторных каскадов. Эти репортерные РНК молекулы
детектируются особой мультиплексной системой детекции, которая обеспечивает беспрецедентную
точность и воспроизводимость измерений (Romanov et al., 2008).
FACTORIAL позволяет измерять активности 48 генно-регуляторных каскадов в различных типах
клеток. Детектируя изменения активностей этих каскадов при контакте с каким-либо химическим
соединением, экспериментатор получает результат “транскрипционной дактилоскопии”, основанный
на изменении активности 48 транскрипционных факторов-дескрипторов, которые характеризуют
воздействие данного соединения на генно-регуляторные механизмы в данном типе клеток. Многие
дескрипторы FACTORIAL’а описывают состояния специфических стресс-индуцируемых геннорегуляторных каскадов (таких как NF-kappaB, AP-1, P53, HIF-1 NRF-2, E2F, и др.). Изменения этих
дескрипторов являются индикаторами определенных видов клеточного стресса, таких как
воспалительный ответ, разрывы ДНК, гипоксию, свободнорадикальную патологию, метаболический
стресс, и др.
РАБОЧАЯ СТРАТЕГИЯ.
Наш проект включает несколько стадий.
В ходе выполнения проекта совместно российской и американской стороной будет разработана
панель клеточных биосенсоров первого типа, которая позволит моделировать эффекты
наноматериалов при различных путях попадания в организм.
Биосенсоры второго типа (трансгенные животные) будут получены американской стороной и
переданы российской стороне для проведения экспериментов (одновременно в РФ и США) по
изучению токсичности наноматериалов в условиях in vivo.
Параллельно, российской и американской будет разработана новая адаптированная модификация
FACTORIAL™ - биосенсоров третьего типа для детекции ответов человеческих клеток к
наноматериалам. Эта оптимизация затронет многие параметры, включая состояние клеточных
культур, композицию ансамбля ДНК зондов, подбор условий стимуляции и детекции, и др.
Далее, все три типа биосенсоров (биосенсоры, основанные на трансактивции репортерных генов
и адаптированный FACTORIAL™) будут использованы для изучения биобезопасности
наноматериалов. Мы будем использовать различные типы первичных или трансформированных
клеток, включая легочный и кишечный эпителий, клетки кожи (кератиноциты) и печени
(гепатоциты). Будут определены концентрационные зависимости биологических
эффектов
наноматериалов. Также, в данном проекте запланировано исследование эффектов различных
наноматериалов в обоих типах биосенсоров, при 8-10 концентрациях. Планируется получение
нескольких сотен молекулярных профилей активности генно-регуляторных каскадов, которые будут
сравниваться с помощью кластерного анализа для классификации наноматериалов по группам,
согласно их механизмам действия.
3.
Описание предполагаемых результатов реализации проекта
В результате выполнения проекта будет создано:
- три типа биосенсоров, обеспечивающих получение специфических характеристик наноматериалов,
описывающих их влияние на генно-регуляторные каскады в условиях in vitro и in vivo,
- будут определены молекулярно-биологические механизмы опосредующие действие наиболее
распространенных классов наноматериалов на наиболее вероятныe мишени, такие как
эпителиальные клетки легких, желудочно-кишечного тракта, кожи, и гепатоциты. Использование
этих данных позволит предсказывать наиболее вероятные риски этих наноматериалов и установить
количественные критерии для определения предельно допустимых концентраций наноматериалов
при различных путях попадания в организм.
- будут подготовлены протоколы и проекты рекомендаций по использованию по использованию всех
трех типов биосенсоров.
- будет подготовлена документация для сертификации разработанных биосенсоров.
4.
Наиболее близкие по тематике проекты в мире, реализующиеся в настоящее время (не
более 5 аналогов)
-Стандартные пато-морфологические методы оценки токсичности в животных моделях: определение
некротические изменения различных тканей и клеточных органелл, исследование долгосрочных
патологических эффектов, включая канцерогеннность, хроническую токсичность, дефекты
репродуктивныx функций и эмбрионального развития.
- Системно-биологические методы, основанные на аналие изменения спектра генной экспрессии
(транскриптомика) и синтезируемых протеинов (протеомика) в клетках-мишенях.
5.
Новизна, описание конкурентных преимуществ результатов
Уникальная особенность разрабатываемого токсикогеномного подхода заключается в том, что
получаемые данные позволяют непосредственно определить механизмы токсичности. Например, в
предварительных экспериментах с наноматериалами, мы установили, несколько общих сигнальных
каскадов, активированных разными наноматериалами, включая каскады, что контролируют ответы
на свободные радикалы и детоксикацию ксенобиотиков. Эти результаты доказывают, что
предложенный проект позволит получить информацию о орган-специфических эффектах
наноматериалов на генно-регуляторные механизмы клеток.
Преимуществом использования технологии FACTORIAL является ее универсальность, связанная с
тем, что она позволяет получить “транскрипционную дактилоскопию” (см. пункт 2) конкретного
наноматериала, которая определяется только его биологической активностью в отношении данного
типа клеток, но не химической структурой. Вследствие этого, FACTORIAL одинаково пригоден как
для анализа простыx химические соединений, так и сложных композитов-наноструктур.
6.
Кто является потенциальным потребителем результатов
Потребителями разработанной продукции, полученной в проекте, являются следующие учреждения:
Государственные учреждения осуществляющие контроль и мониторинг биобезопасности
наноматериалов (в частности, Министерство здравоохранения и социального развития РФ,
Министерство промышленности и торговли РФ, Министерство по чрезвычайным ситуациям и
другие заинтересованные государственные учреждения, а также частные компании, выпускающие
фармпрепараты и пищевые продукты, а также другие товары в которых используются
наноматериалы. Для коммерциализации продукта могут быть созданы Российские и совместные
Российско-Американские компании.
7.
Где, когда и какой эффект, в т.ч. экономический, ожидается от использования
результатов проекта
Продукт предназаначен для использования: на предприятиях, выпускающих различные
наноматериалы; в биомедицинских исследованиях, связанных с изучение биобезопасности
наноструктур; в фармацевтической и пищевой промышленности, выпускающей фармпрепараты и
пищевые продукты, а также другие товары в которых используются наноматериалы.
Внедрение разработанных биосенсоров в практику позволит существенно улучшить и
интенсифицировать технологии оценки биобезопасности наноструктур. Эффектом этого будет
являться улучшение качества жизни сотрудников, связанных с производством наноматериалов и
наноструктур, а также качества жизни населения РФ, являющегося потенциальным потребителем
этой продукции.
8.
Предполагаемые организации – участники консорциума по профилям: научные,
образовательные, бизнес. Контактная информация руководителей проекта в каждой
организации и общего координатора
Участниками консорциума с Российской стороны:
- ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ,
- Учреждение РАМН НИИ Питания РАМН
- Приволжский федеральный университет г.Казань
- Компания ООО «НИАРМЕДИК»
9.
Описание вклада каждой организации в итоговый результат.
С Российской стороны:
ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ будет участвовать в получении
биосенсоров на основе различных культур клеток человека, предназначенных для мониторинга и
прогнозирования негативного воздействия наноматериалов на респираторную и выделительную
систему.
С использованием адаптированной платформы FACTORIALTM будут протестированы
наноматериалы различной природы (не менее 20). Дополнительно, в институте будут проводится
протеомные исследования, целью которых будет поверка данных, полученных с использованием
разработанных биосенсоров.
НИИ питания РАМН будет вовлечен в тестирование полученных биосенсоров с использованием
продуктов питания в состав которых (или в упаковку которых) входят наноматерилы.
Приволжский федеральный университет будет вовлечен в тестирование различных наноматериалов
с использованием разработанных биосенсоров в сравнении с традиционными токсикологическими
методами.
Компания ООО «НИАРМЕДИК» будет вовлечена в проведение испытаний платформы
FACTORIALTM и получение разрешитильных документов. В случае необходимости, компания
может принимать участие в последующей коммерциализации результатов выполнения проектов.
10.
Преимущества от участия иностранных организаций
Американская сторона:
- передает технологию получения клеточных линий-биосенсоров, позволяющих проводить
мониторинг активности индивидуальных транскрипционных факоров.
- создает трансгенных животных (биосенсоры второго типа), обеспечивающих стабильную
экспрессию репортерных конструкций. Использование таких животных-биосенсоров позволит
изучать токсические эффекты наноматериалов на уровне различных систем организма.
- обеспечивает допуск и обучение технологиям регистрации биолюминисценции и
биофлюоресценции в живом организме.
- открывает доступ к технологии FACTORIALTM , которая будет являться одним из ключевых
моментов создания универсальной технологической платформы для оценки биобезопасности
наноматериалов.
- будет участвовать в испытаниях нанопрепаратов российского производства.
11.
Потенциальные иностранные участники проекта, которые могли бы внести
существенный вклад в итоговый результат
Существующие партнеры с американской стороны:
-RoswellPark Cancer Institute, Buffalo, NY (USA)
- ATTAGENE Research Triangle Park, North Carolina (USA)
12.
Краткая предыстория формирования проекта
Российская сторона (ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ) имеет многолетний
опыт сотрудничества с Институтом рака Розвелла Парка (RoswellPark Cancer Institute).
Взаимоотношения сторон регулируются действующим договором о сотрудничестве. Опыт научного
сотрудничества (на уровне ответственных исполнителей проекта с российской и американской
стороны) как в области НИР, так и НИОКР, насчитывает 8 лет. В ходе данного сотрудничества
Институтом рака Розвелла Парка совместно с ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи
Минздравсоцразвития РФ была отработан метод получения клеточных линий – биосенсоров,
позволяющих проводить мониторинг активности стресс-активируемых транскрипционных факторов.
Технология FACTORIAL применительно к молекулярно-биологическим исследовантям в
значительной степени проработана. Американской стороной апробирована и запатентована
технология измерения активности генно-регуляторных каскадов. В ходе выполнения проекта данная
технология будет адаптирована для оценки биобезопасности наночастиц и наноматериалов.
13.
Предварительный план подготовки и реализации проекта (основные вехи) по каждой
организации, включая координационные мероприятия
- ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ
В течение 2011 года будут:
1) созданы системы биосенсоров, основанных на трансактивации репортерных генов на основе
различных культур клеток человека для тестирования в условиях in vitro способности различных
видов наноматериалов индуцировать известные типы клеточного стресса.
2)
апробированы биосенсоры на основе технологии FACTORIALTM для тестирования
биобезопасности наноматериалов различной природы.
В течение 2012 года будет:
1) Проведена апробация эффективности и специфичности работы системы биосенсоров
(основанных на трансактивации репортерных генов) на основных типах наноструктур биогенного и
абиогенного происхождения.
2) Проведена апробация эффективности использования животных-биосенсоров (основанных на
трансактивации репортерных генов), полученных от американской стороны, для тестирования
биобезопасности различных наноматериалов.
3) Проведена подготовка лабораторных образцов наборов биосенсоров и проекта рекомендаций по
их использованию.
-НИИ питания РАМН
В 2011 году будет проводить тестирование возможности использования технологии FACTORIALа
для оценки безопасности продуктов питания (и их упаковок) в состав которых входят
наноматерилы.
В 2012 году будет
- проводить тестирование продуктов питания (и их упаковок) в состав которых входят
наноматерилы с использованием системы биосенсоров (основанных на трансактивации репортерных
генов)
- создавать проекты методических рекомендаций по использованию разработанных биосенсоров.
- Приволжский федеральный университет
В 2011 году
Будет проводить тестирование биобезопасности различных наноматериалов с использованием
технологии FACTORIAL, а также проводить поверку результатов FACTORIALа традиционными
методами (измерение активности отельных транскрипционных факторов по трансактивации генов ОТ-ПЦР-анализ, Вестерн-блоттинг и др.)
В 2012 году будет проведена работа аналогичная запланированной в 2011 году, но с использованием
системы биосенсоров (основанных на трансактивации репортерных генов).
- Компания ООО «НИАРМЕДИК»
В 2011 году подготовит панель наноматериалов различного происхождения (оксиды металлов,
различные формы углерода, синтетические наночастицы, наночастицы биогенного происхождения).
В 2012 году будет осуществлять деятельность связанную с подготовкой необходимой документации
для сертификации разработанных биосенсоров и методов их использования.
Координация проекта будет осуществляться в результате реализации следующих мероприятий:
- Ежегодных командировок не менее 2 российских специалистов (на срок не менее чем 2 месяца) для
проведения совместных исследований.
- Проведения ежемесячных телеконференций.
- Проведения координационных совещаний (не менее 2 раз в году).- Ежегодной конференции (поочередно, в РФ и США) основных исполнителей проекта с отчетами о
проделанной работе; подготовкой публикаций и совместных патентов.
14.
Объем финансирования (существующий и необходимый), включая предполагаемые
источники и объемы софинансирования (Указывается необходимый объем инвестиций для
реализации проекта с указанием направлений расходования средств (краткий финансовый план
проекта).
С Российской стороны:
Существующий бюджет (средства, затраченные в 2010 году на разработку методов оценки
биобезопасности) составил – 3,5 млн. рублей.
Продолжтельность проекта – 2 года.
Общая стоимость проекта – 55 млн. рублей
Необходимый объем финансирования на 2011 год – 30 млн. рублей (в том числе 22 млн. рублей
бюджетных средств).
Предполагаемый бюджет американской стороны – 3 млн. долларов.