Автореферат диссертации - Московский государственный

На правах рукописи
ОСЯНИНА МАРИНА НИКОЛАЕВНА
ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЭФФЕКТИВНОСТЬ
ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТА АЗИТРОНИТ ПРИ БОЛЕЗНЯХ ОРГАНОВ
ДЫХАНИЯ У ТЕЛЯТ
06.02.01 – Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология
и морфология животных
06.02.03 – Ветеринарная фармакология с токсикологией
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Москва – 2015
1
Работа выполнена на кафедре «Ветеринарная медицина» ФГБОУ ВПО
«Московский государственный университет пищевых производств»
Научные
руководители:
Уша Борис Вениаминович
доктор ветеринарных наук, профессор, академик РАН,
заведующий кафедрой «Ветеринарная медицина»
ФГБОУ ВПО «Московский государственный
университет пищевых производств»
Абрамов Владислав Евгеньевич
доктор ветеринарных наук, профессор, ведущий научный
сотрудник ФГБНУ «Всероссийский научноисследовательский институт фундаментальной и прикладной
паразитологии животных и растений имени К.И. Скрябина»
Официальные
оппоненты:
Данилевская Наталья Владимировна
доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО
«Московская государственная академия ветеринарной
медицины и биотехнологии им. Скрябина»
Концевова Анна Алексеевна
доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник ГНУ
«Всероссийский
научно-исследовательский
институт
ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской
академии сельскохозяйственных наук»
Ведущая
организация:
ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и
стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»
Защита диссертации состоится 01 июля 2015 года в 14:00 на заседании совета по
защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.09 при ФГБОУ ВПО
«Московский государственный университет пищевых производств» по адресу:
109316, г. Москва, ул. Талалихина, д. 33, ауд. 290.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «МГУПП»
Автореферат разослан « » апреля 2015 г.
Автореферат размещен на сайте Министерства образования и науки РФ
http://vak.ed.ru/
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор ветеринарных наук, профессор
2
Т.Г. Андрианова
1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время в животноводческой отрасли
значительная
роль
отводится
скотоводству.
Тормозом
для
повышения
продуктивности и сохранности молодняка животных являются болезни, в
результате которых возникают наибольшие экономические потери в период
выращивания телят.
Для
дальнейшего
развития
животноводства
требуется
разработка
и
внедрение в практику более эффективных и безопасных лекарственных
препаратов для ветеринарного применения, в том числе и для лечения
респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота.
Уровень заболеваемости органов дыхания телят на территории Российской
Федерации зависит от региона, сопутствующих климатических условий,
технологии содержания, кормления животных и составляет от 30 до 70%, при
этом летальность может достигать 9,7-30,6% (Авакаянц Б.М. 2006). По
литературным данным (Пахмутов В.М., Балкова И.И., Бабенко Ю.В. 2006),
болезни органов дыхания регистрируются у 11% поголовья скота, что составляет
25% от всего заболевшего крупного рогатого скота. При этом потери могут
соствлять до 40% от числа заболевших животных, с учетом гибели и
вынужденного убоя (Абрамов С.В. 2010). Болезни органов дыхания у телят
проявляются в форме бронхитов, бронхопневмонии, плевритов и т.д. Наиболее
часто среди заболеваний дыхательной системы встречаются бронхопневмонии
незаразной и заразной этиологии (Абрамов С.С. 2000).
В этиопатогенезе этих болезней основную роль играют вирусы, микоплазмы,
хламидии и бактерии. При изменении внешней среды и понижении устойчивости
организма условно патогенная микрофлора становится патогенной, что может
стать причиной развития патологического процесса. Все это, в конечном итоге,
при отсутствии адекватного лечения, приводит к гибели молодняка или потере
продуктивности (Анохин В.М. 1980, Митрофанов П.М. 1981 Абрамов С.С. 1983,
Атамась В.А. 1986, Данилевский В.М. 1991, Высокопоясный А.И. 2000,
3
Кавенькин В.А. 2005, Веселов А.В. 2007, Аксенова В.М., Антипкин Ю.Г., Лапшин
В.Ф., Уманец Т.Р. 2008, Никулина Н.Б. 2012).
На сегодняшний день для лечения болезней органов дыхания молодняка
различной
этиологии
фармакологических
существуют
средств,
схемы
включая
и
большое
антибиотики,
количество
сульфаниламиды,
фторхинолоны и др. (Абрамов С.В., Жукова Н.Н., Панфилова М.Н. 2010). Общим
недостатком антимикробных средств является то, что длительное применение
одних и тех же препаратов приводит к появлению большого числа устойчивых
штаммов
микроорганизмов,
и
тем
самым
к
снижению
их
лечебной
эффективности, что в свою очередь усложняет и удорожает процесс лечения
(Воронин Е.С. 1990).
В этой связи важное практическое значение для ветеринарной практики
имеет изыскание новых резервных антибактериальных препаратов, к которым у
микроорганизмов еще не сформировалась устойчивость.
Компанией ООО «НИТА-ФАРМ» был разработан новый инъекционный
антибактериальный
препарат
на
основе
азитромицина,
являющегося
представителем новой подгруппы макролидных антибиотиков – азалидов.
Степень разработанности темы. В настоящее время фрагмент выполненной
работы был одобрен экспертным советом и препарат рекомендован к регистрации
в Российской Федерации для лечения болезней бактериальной этиологии у
крупного и мелкого рогатого скота и свиней.
Цель и задачи исследований. Изучить и внедрить в ветеринарную практику
новый антибактериальный препарат Азитронит на основе азитромицина для
лечения болезней дыхательной системы у телят.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- определить острую и подострую токсичность препарата на лабораторных
животных при пероральном и внутримышечном введении;
- изучить раздражающее действие препарата на кожный покров и конъюнктиву
кроликов и выявить возможные аллергизирующие свойства препарата на мышах и
морских свинках;
4
- изучить подострую токсичность препарата на телятах;
-
разработать
метод
ВЭЖХ
с
масс-спектрометрическим
определением
действующего вещества в биосубстратах;
- изучить фармакокинетику азитромицина в организме телят, чтобы научно
обосновать схемы и оптимальные дозировки препарата для лечения болезней
дыхательной системы у телят;
- определить наличие остаточных количеств азитромицина в органах и тканях
телят после курсового применения препарата;
- изучить клинические проявления болезней дыхательной системы у телят и
определить терапевтическую эффективность препарата при данной патологии у
молодняка крупного рогатого скота.
Научная новизна работы. Впервые дана фармако - токсикологическая
характеристика лекарственного препарата Азитронит для лечения болезней
дыхательной системы у телят. Определены параметры острой и подострой
токсичности,
раздражающего,
аллергизирующего
действия
препарата
на
лабораторных животных. Изучена токсичность повышенных доз препарата на
телятах. Разработан метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим определением
действующего вещества в органах и тканях телят.
Изучена фармакокинетика действующего вещества препарата Азитронит в
организме телят после однократного внутримышечного введения. Установлены
сроки возможного использования мяса и субпродуктов для пищевых целей после
курсового применения данного препарата. Научно обоснованы оптимальные
терапевтические дозы и схемы применения препарата для лечения болезней
дыхательной системы у телят.
Теоретическая и практическая значимость работы. Для лечения болезней
дыхательной системы у телят рекомендован новый препарат Азитронит на основе
азитромицина.
Разработана
методика
определения
остаточных
количеств
азитромицина в органах и тканях животных с использованием метода ВЭЖХ с
масс-спектрометрическим определением. Данные по исследованию фармакотоксикологических свойств, терапевтической эффективности и фармакокинетики
5
легли в основу разработки ТУ и инструкции по применению препарата
Азитронит.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- результаты изучения фармако - токсикологических свойств препарата на
лабораторных животных и телятах;
- результаты разработки метода ВЭЖХ с масс-спектрометрическим определением
действующего вещества в органах и тканях телят;
- результаты изучения фармакокинетики азитромицина и определение его
остаточных количеств в органах и тканях телят.
- результаты изучения терапевтической эффективности препарата при лечении
болезней органов дыхания у телят;
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были
доложены и обсуждены на ХХII международной научной конференции студентов
и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения»
(Москва,
2014),
на
международной
научно-практической
конференции
«Актуальные вопросы токсикологии и фармакологии» (Санкт-Петербурге, 2014).
Личный вклад соискателя. Основные результаты исследований проведены
автором самостоятельно. Статьи, написанные в соавторстве, включают более 80%
материалов диссертационной работы. Соавторы не возражают в использовании
результатов
совместных
исследований
(справки
предоставлены
в
диссертационный совет).
Публикации
результатов
исследований.
По
теме
диссертации
опубликованы 3 печатных работы в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 132 страницах
компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора
литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований,
обсуждения, выводов, практических предложений, списка
литературы и
приложения. Список литературы включает 181 источник, в том числе 97
отечественных и 84 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 34 таблицами,
12 рисунками и 8 графиками.
6
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работу выполняли в период с 2012 по 2014 гг. на базе ФГБОУ ВПО
«МГУПП» (г. Москва), в ФГБНУ «ВНИИП им. К.И. Скрябина»; ООО МНИЦ
«ОЗОС» (г. Москва). Клинические исследования проводили в хозяйствах
Нижегородской и Саратовской областях.
В исследованиях использовали опытный образец препарата «Азитронит»,
серия 002270412, предоставленный фирмой ООО «НИТА-ФАРМ».
В доклинических и клинических исследованиях препарата Азитронит было
использовано 40 белых беспородных крыс, 140 мышей, 10 кроликов, 20 морских
свинок, 282 теленка.
Грызуны и телята содержались в закрытом помещении в стандартных
условиях: температура воздуха + 20±2°С, относительная влажность 65±5%, 9часовое освещение. Грызуны находились в клетке на стандартном пищевом
рационе (свободный доступ к воде и корму). В качестве корма для телят
использовали
стандартный
комбикорм,
сбалансированный
по
основным
показателям в соответствии с нормами кормления. Кормление осуществляли 2
раза в день в соответствии с нормами, установленными для данной возрастной
категории животных. В период карантина и в процессе опыта потребление воды
было неограниченно.
Животные были распределены на две группы - основную и контрольную
Экспериментальные группы формировались по принципу аналогов (по породе,
возрасту, полу и массе).
В течение опыта постоянно велись наблюдения за состоянием здоровья
животных,
выраженностью
их
аппетита.
При
помощи
общих
методов
исследования, а именно осмотра, пальпации, перкуссии, аускультации и
термометрии исследовали дыхание, пульс, состояние слизистых оболочек,
лимфатической и пищеварительной систем. Обращали внимание на состояние
кожи, полости рта, глотки, пищевода. Исследовали органы дыхания.
7
При клиническом наблюдении (дыхания, хрипов, истечений из ноздрей,
температуры), учитывали сроки клинического выздоровления, количество
павших, вынужденно убитых и выздоровевших животных.
Изучение общетоксических свойств препарата «Азитронит» проводили в
соответствии
с
методическими
государственного
комитета
рекомендациями
(«Руководство
по
Фармакологического
экспериментальному
(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», Москва, 2005).
Острую токсичность Азитронита при пероральном введении изучали на 30
белых беспородных мышах-самцах. Препарат вводили без разведения однократно
с помощью желудочного зонда в дозах 15000; 25000 и 30 000 мг/кг, что
соответствует 0,15; 0,25 и 0,3 мл/10 г массы животного.
Острую токсичность Азитронита при внутримышечном введении изучали
на 30 мышах, которым вводили препарат в дозах 5000; 10000 и 15000 мг/кг, что
соответствует 0,05; 0,1 и 0,15 мл/10 г массы животного. В течение 14 суток
проводили наблюдение за общим состоянием и поведением животных,
проявлением симптомов интоксикации, возможной гибелью мышей.
Значение
определяли
LD50
по
и
методу
других
токсикологических
Миллера-Тейнтера.
параметров
Устанавливали
препарата
максимально
переносимую (LD0), среднесмертельную (LD50) и абсолютно смертельную (LD100)
дозы для мышей и крыс в мг/кг массы животного.
Исследование подострой токсичности Азитронита при внутримышечном
введении белым крысам - самцам. Азитронит вводили внутримышечно,
ежедневно, в течение 14 суток трем опытным группам крыс (по 10 животных в
каждой) в дозах: 1/10; 1/20 и 1/50 от LD50 (930; 465 и 186 мг/кг), установленного
при изучении острой токсичности. Контрольной группе вводили воду для
инъекций в дозе 3,0 мл на крысу. Ежедневно у крыс регистрировали массу тела на
весах ВР-05 МС-3/0,5-БР (Россия). На следующий день после отмены препарата
Азитронит животных убивали декапитацией и отбирали пробы крови для
определения гематологических и биохимических показателей (определяли
уровень гемоглобина, АсАТ и АлАТ, содержание эритроцитов, лейкоцитов),
8
внутренние органы для определения массовых коэффициентов и гистологических
исследований. Основные показатели периферической крови крыс определяли на
гематологическом анализаторе PCE 90-vet (Китай); лейкограмму – общепринятым
методом; биохимические показатели крови - анализатором Biosystems A-15
(Испания).Статистическую обработку данных проводили методом вариационной
статистики с помощью простого сравнения средних по двухстороннему tкритерию Стьюдента. Различия определяли при 0,05 уровне значимости.
Статистический анализ выполняли с помощью программы «Student-200».
Определение местного раздражающего действия прапарата Азитронит
проводили методом кожной и конъюнктивальной проб на 10 кроликах породы
шиншилла согласно методическим указаниям «Оценка воздействия вредных
химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно
допустимых уровней загрязнений кожи» (1979, Текст документа по состоянию на
июль 2011 года).
Оценку аллергизирующего действия препарата Азитронит проводили при
помощи реакции гиперчувствительности «замедленного» типа (ГЗТ) на белых
мышах и конъюнктивальной пробы на морских свинках.
Исследование токсичности повышенных доз препарата проводили на 20
телятах черно-пестрой породы, которых разделили на 4 группы по 5 голов в
каждой. Препарат «Азитронит» вводили внутримышечно в течение 9 суток в
следующих дозах: I группа – терапевтическая доза (1,0 мл/20 кг массы); II группа
– трехкратная терапевтическая доза (3,0 мл /20 кг); III группа – пятикратная
терапевтическая доза (5,0 мл/20 кг); IV группа – контрольная, телятам вводили
внутримышечно воду для инъекций. Наблюдение за животными продолжали в
течение 14 суток после окончания курса обработки. Еженедельно (1, 7 и 14 сутки
после прекращения введения препарата) учитывали общее состояние, проводили
гематологические (определяли уровень гемоглобина, содержание эритроцитов,
лейкоцитов
и
определяли
лейкограмму
-
общепринятыми
методам)
и
биохимические исследования (определяли уровень АсАТ и АлАТ).
Основные показатели периферической крови (яремной вены) определяли на
9
гематологическом анализаторе PCE 90-vet (Китай); биохимические показатели
крови определяли на анализаторе Biosystems A-15 (Испания).
Исследование
фармакокинетики
азитромицина
в
организме
телят
проводили после однократного внутримышечного применения препарата 4
клинически здоровым телятам в дозе 1,0 мл на 20 массы животного, что
соответствует 5 мг азитромицина на 1 кг массы. Пробы крови отбирали до
введения и через 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 и 96 часов после введения препарата в
пробирки с предварительно добавленным антикоагулянтом.
Определение сроков выведения остаточных количеств азитромицина из
организма телят проводили после курсового применения препарата Азитронит
17 клинически здоровым телятам (4 опытных группы по 4 животных в каждой, 1
контрольный теленок). Азитронит вводили телятам внутримышечно в суточной
дозе 1 мл на 20 кг массы животного (5 мг/кг по азитромицину) 3-кратно с
интервалом 24 ч. Через 20, 30, 35 и 40 суток после последнего введения препарата
проводили убой телят (по 4 теленка на каждый срок) и отбирали образцы печени,
почек, легких, сердца, жировой ткани и мышечной ткани с места инъекции.
Разработка метода определения азитромицина в плазме крови и тканях
телят. Для определения низких концентарций азитромицина нами был
разработан метод жидкостной хроматографии с хроматомасс-спектрометрическим
детектированием, который наиболее оптимально подходит для определения
содержания антибиотика в биологических жидкостях и тканях. При помощи
контрольных образцов тканей и плазмы, содержащих известные концентрации
азитромицина, была проведена метрологическая аттестация разработанного
метода по параметрам: линейность, точность, погрешность метода, предел
детектирования и предел количественного определения.
Определение оптимального режима дозирования препарата Азитронита
проводили на 52 телятах с диагнозом острая катаральная бронхопневмония,
которых разделили на 4 опытных группы (по 10 животных) и контрольную
группу (12 телят). Телятам опытных групп внутримышечно трехкратно с
интервалом 24 часа вводили Азитронит в следующих дозах: 0,5; 0,8; 1,0; и 1,5
10
мл/20 кг массы животного. Контрольным животным применяли Энромаг 10%
подкожно в дозе 0,5 мл на 10 кг массы животного трехкратно с интервалом 24
часа. В ходе эксперимента оценивали общее состояние, скорость выздоровления,
возможные побочные реакции на введение препарата.
Терапевтическую
эффективность
Азитронита
при
подострой
и
хронической бронхопневмонии телят бактериальной и микоплазменной этиологии
изучали в сравнении с препаратом аналогичного назначения Энромагом 10%.
Энромаг применяли в дозе 0,5 мл на 10 кг массы животного 3-5 раз с интервалом
24 часа. Азитронит вводили в дозе 1,0 мл/20 кг массы животного с интервалом 48
часов двукратно при подострой бронхопневмонии и трехкратно при хронической
бронхопневмонии.
Терапевтическую эффективность препарата при остром трахеобронхите
телят определяли на 50 больных животных, половине из которых 30 телятам
применяли Азитронит внутримышечно в дозе 1 мл на 20 кг массы животного
трехкратно с интервалом 24 часа, а 20 телятам препарат вводили внутримышечно
в той же дозе двухкратно с интервалом 48 часов. Аналогичный опыт провели на
50 телятах с диагнозом острый бронхит.
Терапевтическую эффективность препарата при серозно – катаральной
пневмонии, осложненной гастроэнтеритом, определяли путем: первой группе (22
теленка) применяли внутримышечно в дозе 1 мл на 20 кг массы животного 3-5 раз
с интервалом 24 часа; второй группе животных (17 голов) применяли
внутримышечно препарат Флорон 30% в дозе 1 мл на 15 кг массы животного,
трижды, с интервалом 48 часов.
2.2 Результаты исследований
Изучение острой токсичности при пероральном и внутримышечном
введениях. Однократное пероральное введение препарата в дозах до 30 г/кг не
вызвало гибели мышей, а также проявления признаков интоксикации вплоть до 14
дней после введения. Доза 30000 мг/кг (что соответствует 3000 мг/кг по
действующему веществу) была максимально возможной для перорального
11
введения мышам. Согласно ГОСТ 12.1.007-76 препарат относится к малоопасным
веществам.
Внутримышечное введение Азитронита оказалось более токсичным. После
введения дозы 5000 мг/кг в правую заднюю конечность отмечали общее
угнетение, отек в месте введения, конечность была вытянута и не реагировала на
прикосновения. Отмеченные изменения частично проходили на следующие сутки
после введения. Все животные этой группы остались живы. При повышении дозы
препарата до 10000 мг/кг наблюдали аналогичную картину интоксикации, через
час одно животное пало, через сутки погибла еще одна особь. Введение дозы
препарата 15000 мг/кг привело к быстрой гибели всей опытной группы животных
в течение 1-2 часов.
В таблице 1 приведены параметры острого токсического действия
Азитронита на мышах, рассчитанные методом Миллера - Тейнтера.
Таблица № 1
LD0
LD16
5000
7800
LD50
мг/кг
9300
(7888÷10712)
LD84
LD100
10900
15000
Исследование подострой токсичности Азитронита при внутримышечном
введении крысам. Введение Азитронита во всех дозах отразилось статистически
значимым образом на текущих значениях привесов, которые начинали
фиксировать на пятые сутки введения. В группах, получавших 2 максимальные
дозы 930 и 465 мг/кг, отмечали отрицательный прирост по отношению к исходной
массе тела: 82,12 и 88,41% соответственно.
При введении Азитронита в дозе 186 мг/кг, к концу опыта крысы прибавили
в массе (114,58% по отношению к исходной массе тела), однако меньше, чем
крысы контрольной группы, у которых прирост составил 129,95%. Учитывая, что
ориентировочная терапевтическая доза препарата составляет 0,05 мл/кг массы,
что значительно меньше испытанных в опыте доз, развитие токсических эффектов
при соблюдении режима дозирования маловероятно.
Двухнедельное введение Азитронита в дозах 930 и 465 мкг привело к
12
статистическому снижению относительной массы всех внутренних органов у
крыс. Значения относительной массы сердца, печени и легких в дозе 186 мг/кг
претерпели достоверные изменения и составили, соответственно 1,13±0,04;
8,64±0,21 и 1,13±0,04 против контрольных значений 1,26±0,05; 10,11±0,44 и
2,08±0,09. Следует отметить, что изменения не были дозозависимы: самое низкое
значение массового коэффициента сердца (0,80±0,06) отмечали от дозы 465 мг/кг,
в то время как в максимальной и в минимальной дозе этот показатель был
практически одинаковым: 1,08±0,06 и 1,13±0,04 соответственно. Аналогичная
картина наблюдалась и с печенью: 7,12±0,31 в средней дозе и 8,48±0,28 и
8,64±0,21 в максимальной и минимальной дозах. С легкими наибольшее различие
по сравнению с контрольной группой наблюдалось у крыс, которым вводили
минимальную дозу: 1,13 против 2,08 в контрольной группе.
Показатели периферической крови обобщены в таблице 2.
Таблица № 2
Влияние Азитронита на гематологические показатели крови крыс при
внутримышечном введении в течение 14 суток в трех дозах (n=10, p≥0,5)
Показатель
Контроль
Гематокрит, %
46,87±0,75
Гемоглобин, г/л
160,33±3,13
Эритроциты,1012/л
8,25±0,19
Лейкоциты, 109/л
Тромбоциты, 109/л
Дозы препарата, мг/кг
930
465
186
48,08±0,8
45,47±0,87
43,12±0,77*
159,50±3,58
155,00±2,34
7,57±0,16*
8,88±0,19
8,23±0,11
12,10±1,41
10,40±1,41
12,47±1,95
11,88±1,30
967,17±65,23
1149,83±44,35
1098,00±1973
1098,83±31,79
1,71±0,04
1,03±0,06
1,26±0,03
40,50±2,81
35,00±5,34
35,67±4,98
0,33±0,21
4,50±1,09
52,83±1,10
1,33±0,95
4,00±1,39
59,50±5,70
0,67±0,33
5,67±2,33
56,83±6,10
144,67±3,04*
Лейкограмма
Палочкоядерные
1,40±0,02
нейтрофилы, %
Сегментоядерные
30,67±4,26
нейтрофилы, %
Эозинофилы, %
0
Моноциты, %
5,33±2,68
Лимфоциты, %
62,67±2,43
‫٭‬- p≥0,05 при tкрит.=2,18
Длительное введение Азитронита в дозе 930 мг/кг проявилось в некотором
снижении таких гематологических показателей крыс, как гематокрит, гемоглобин
и содержание эритроцитов, остальные показатели не отличались от контрольных
13
значений. В то же время следует отметить, что все показатели находились в
пределах физиологической нормы для данного вида животных. Статистически
значимые изменения лейкограммы отсутствовали, однако имела место тенденция
к повышению количества сегментоядерных нейтрофилов и к снижению
количества лимфоцитов, что может быть обусловлено воспалительной реакцией в
месте введения препарата. Таким образом, 2-недельное внутримышечное
введение азитромицина крысам хотя и вызвало некоторые отклонения в
гематологических показателях, не повлияло существенно на картину крови.
Отмеченные изменения, скорее всего, являются следствием пониженного
потребления корма и потери массы тела.
Результаты биохимического анализа крови крыс после 14-дневного
введения Азитронита приведены в таблице 3.
Таблица № 3
Влияние Азитронита на биохимические показатели крови
(n=10, p≤0,5)
Показатель
Контроль
930
69,83±1,87
46,67±2,81
6,78±,49
5,05±0,17
Дозы, мг/кг
465
69,67±2,17
47,83±2,34
7,15±0,42
5,28±0,28
Общий белок, г/л
Креатинин,мкмоль/л
Мочевина, ммоль/л
Глюкоза, ммоль/л
Билирубин общий,
мкмоль/л
Билирубин прямой,
мкмоль/л
АЛТ, Ед/л
АСТ, Ед/л
Щелочная фосфатаза,
Ед/л
Альфа-Амилаза, общая,
Ед/л
ЛДГ, Ед/л
69,00±0,82
38,17±4,94
6,33±0,51
5,05±0,31
186
69,17±1,30
40,83±2,30
6,38±0,26
5,65±0,28
9,72±1,15
11,13±1,06
11,60±0,67
10,92±0,89
1,37±0,34
1,75±0,36
2,80±0,55
2,13±0,35
63,67±3,80
167,83±12,04
62,33±4,77
250,83±16,39*
58,00±3,45
225,67±14,06*
55,00±2,84
206,67±14,62
206,67±9,30
231,00±15,95
192,17±12,53
217,67±16,89
678,50±73,54
505,50±29,24
503,83±31,82
475,00±76,19
1830,33±101,31
2494,33±231,80*
2323,67±192,81
2489,17±165,53
‫٭‬- p≥0,05 при tкрит.=2,10
При изучении биохимических показателей было установлено, что введение
препарата в дозах 930 мг/кг и 465 мг/кг вызывает статистически достоверное
изменение уровня аспартатаминотрансферазы; в верхней дозе наблюдается
повышение уровня лактатдегидрогеназы (таблица 3). Остальные биохимические
показатели не претерпели статистически значимых изменений и находились в
14
пределах физиологической нормы, однако имела место дозозависимая тенденция
к повышению уровня креатинина, общего и прямого билирубина в опытных
группах. Описанные изменения носили скорее функциональный характер
(повышение уровня ферментов не было значительным) и свидетельствовали о
повышенной нагрузке на органы, осуществляющие обезвреживание и выведение
из организма чужеродных веществ – печень и почки. Микроскопическое
исследование внутренних органов не выявило патологии в печени, почках,
селезенке и сердце, что подтверждает вывод об отсутствии дистрофических
изменений в этих органах.
Введение препарата в максимальной дозе 930 мг/кг выявило изменения при
гистологическом
исследовании
легких
крыс:
были
выявлены
участки
альвеолярной эмфиземы, расширение просвета альвеол, разрыв межальвеолярных
перегородок; скопления лимфоидной ткани вокруг бронхов.
Наиболее существенные дозозависимые изменения при гистологическом
исследовании были выявлены в мышечной ткани с места инъекции и были
характерны для разлитого гнойного воспаления, особенно в максимальной дозе,
где были отмечены признаки некроза ткани. Таким образом, препарат оказывал
выраженное раздражающее действие при внутримышечном введении крысам в
высоких дозах, однако воспалительная реакция была локализована и не вызывала
системных
эффектов.
Следует
отметить,
что
в
данном
исследовании
испытывались дозы препарата в 4-20 раз превышающие терапевтическую, а также
курс обработки составил 14 дней, в то время как согласно рекомендациям по
применению препарата, курс лечения обычно не превышает 3 введений. Учитывая
вышесказанное, при соблюдении режима дозирования появление побочных
реакций и признаков местной воспалительной реакции маловероятно.
При изучении раздражающего действия препарата на кожу и конъюнктиву
глаза кроликов было установлено, что препарат «Азитронит» раздражающим
действием не обладает: через 1 и 5 суток ни у одного из 10 взятых в опыт
кроликов не было выявлено признаков воспаления. Проведенные на мышах и
морских свинках исследования не выявили у препарата аллергизирующих и
15
иммунотоксических свойств. Согласно литературным данным у азитромицина не
выявлены
аллергизирующие
свойства,
тератогенным,
эмбриотоксическим,
мутагенным и канцерогенным действием препарат также не обладает (Гоглидзе
К.Н. 2006, Антипкин Ю.Г., Лапшин В.Ф., Уманец Т.Р. 2008).
Проведенные токсикологические исследования показали, что дозы 930 и 465
мг/кг являются токсичными, доза 186 мг/кг – пороговой. В наибольшей степени
отрицательное влияние азитромицина сказывается на функциональном состоянии
печени и почек, следовательно, препарат не следует назначать животным с
выраженными заболеваниями этих органов. Учитывая наличие воспалительной
реакции в месте инъекции, при необходимости введения больших объемов
препарата, его следует вводить в разные точки.
Исследование токсичности повышенных доз препарата на телятах.
9-дневное введение Азитронита в терапевтической дозе не вызвало видимых
изменений в общем состоянии животных. После многократных инъекций в 3- и 5кратных терапевтических дозах на месте введения препарата появлялась
уплотненная болезненная припухлость, которая в основном рассасывалась на 6-10
сутки после отмены препарата. У животных отмечалась заметная хромота,
которая исчезала на 2-4 сутки после прекращения введения препарата.
При анализе результатов клинического и биохимического исследования
крови можно сделать вывод, что основным органом-мишенью азитромицина
является печень: при введении пятикратной терапевтической дозы на следующие
сутки после окончания обработки отмечалось статистически значимое повышение
уровня аланинаминотрансферазы до 10,80,6 Ед/л против контрольных 7,70,9
Ед/л (на 28,7%), аспартатаминотрансферазы до 50,03,9 Ед/л против контрольных
39,02,2 Ед/л (на 22%); статистически значимое снижение уровня эритроцитов и
гемоглобина – до 5,0 х 109/л и 121 г/л соответственно против 6,1 х 109/л и 127 г/л в
контроле (на 18% и 5%), а также повышение уровня лейкоцитов до 16,4 х 10 9/л
против контрольного значения 11,4 х 109/л (на 32%). Данные изменения были
обратимы: через 7 суток после прекращения применения препарата уровень
эритроцитов и гемоглобина не отличался от контрольных показателей, а
16
содержание лейкоцитов, АсАТ и АлАТ несколько снизились, но превышали
аналогичные показатели в контрольной группе (различие статистически значимо).
К 14 дню все показатели крови в опытных группах не отличались от контрольной.
Введение Азитронита в терапевтической и трехкратной терапевтической
дозах в течение 9 дней не вызывало статистически значимых изменений
гематологических и биохимических показателей крови.
Таким образом, проведенные на телятах исследования позволяют заключить,
что доза Азитронита 3,0 мл/20 кг массы животного ежедневно в течение 9 дней
подряд является максимальной переносимой дозой, не вызывающей токсических
эффектов. Доза 5,0 мл/20 кг массы животного ежедневно в течение 9 дней подряд
является пороговой дозой препарата.
Принцип метода определения азитромицина в плазме крови и тканях телят
заключалась в хроматомасс-спектрометрическом определении азитромицина в
экстрактах плазмы крови или ткани телят, полученных твердофазной экстракцией
аналита при помощи ABN-картриджей. Были подобраны оптимальные условия
хроматографии, обеспечивающие получение стабильных результатов при анализе
проб, содержащих низкие концентрации антибиотика.
При помощи контрольных образцов тканей и плазмы, содержащих
известные
концентрации
азитромицина
была
проведена
метрологическая
аттестация разработанного метода по параметрам: линейность, точность,
погрешность
метода,
предел
детектирования
и
предел
количественного
определения. Диапазон линейности метода составил 1-1000 нг/мл при R2>0,99,
что позволяло работать как с высокими концентрациями в плазме, так и с
низкими концентрациями в тканях при определении остаточных количеств
азитромицина. Предел детектирования метода составил 0,83-1,13 нг/г/мл для
разных биосубстратов, что вполне соответствовало поставленным задачам.
Разработанный метод обладал высокой степенью повторяемости и точности: 4-9%
и 18-29 % соответственно.
17
Исследование фармакокинетики азитромицина в образцах плазмы крови
телят. Для выбора оптимальной схемы применения препарата нами было
проведено исследование фармакокинетики азитромицина в крови телят после
однократного внутримышечного введения ориентировочной терапевтической
дозы 1 мл на 20 кг массы животного. Графическое изображение динамики
распределения азитромицина в плазме крови телят представлено на графике 1.
График № 1. Фармакокинетическая кривая азитромицина в составе препарата
«Азитронит» после его введения телятам
При исследовании фармакокинетики было выявлено, что азитромицин
быстро поступает из места введения в кровь: максимальную концентрацию
порядка 1 мкг/мл регистрировали уже через 30 минут после внутримышечного
введения. После достижения пиковой концентрации уровень азитромицина
достаточно резко снижался: в промежуток времени от 0,5 до 1 часа после
введения концентрация аналита уменьшилась практически в 2 раза, а через 12-24
часа составляла примерно 0,1 мкг/мл. В этом исследовании также отмечено
длительное нахождение азитромицина в плазме крови: 10-35 нг/мл в период от 24
до 72 часов после однократного внутримышечного введения. Учитывая спектр
действия азитромицина, этих концентраций более чем достаточно для подавления
развития основных возбудителей респираторных инфекций животных.
При анализе фармакокинетических параметров азитромицина, рассчитанных
на основании результатов наших исследований, обращают на себя внимание
большие значения площади под фармакокинетической кривой и кажущегося
объема
распределения,
которые
считаются
18
основными
характеристиками
тканевого и внутриклеточного распределения вещества и, как следствие, его
эффективности (таблица 4).
Таблица № 4
Фармакокинетические параметры азитромицина в составе препарата
«Азитронит» после его введения телятам
Фармакокинетические
параметры
kel (час-1)
AUC (нг/мл*час)
Cmax (нг/мл)
Tmax (час)
Cl (л/час)
t1/2 (час)
MRT (час)
Vz (л)
Cmax/AUC (ч-1)
Азитронит
0,191972
11370
995
0,5
55,40897
3,61
5,21
288,6305
0,087526
Таким образом, введение Азитронита в ориентировочной терапевтической
дозе 0,05 мл/кг массы тела (5 мг/кг в пересчете на азитромицин) создает высокие
плазматические
концентрации
антибиотика
и
обеспечивает
длительное
поддержание (48-72 часа) эффективных тканевых концентраций в отношении
основных возбудителей респираторных инфекций телят.
Анализ содержания азитромицина в образцах органов и тканей телят.
Остаточные количества азитромицина в большинстве органов и тканей телят
через 35 суток после трехкратного внутримышечного введения препарата
«Азитронит» не достигают пределов количественного определения азитромицина
(1 нг/г). В настоящее время требованиями Таможенного Союза остаточные
количества
азитромицина
в
тканях
продуктивных
животных
не
регламентируются, в отчетах Европейского Агентства (ЕМЕА) и FDA также
отсутствуют указания относительно остаточных количеств этого антибиотика в
продуктах питания. Поэтому мы ориентировались на инструментальные
возможности метода, предел детектирования которого составил 1 нг/г. Такие
низкие концентрации при поступлении в организм человека, наиболее вероятно,
не смогут оказать существенного влияния на микрофлору кишечника или
привести к возникновению побочных эффектов. Таким образом, использование
19
мяса и субпродуктов от телят в пищу людям можно разрешить спустя 40 суток
после последнего применения препарата Азитронит.
Эффективность Азитронита при лечении болезней органов дыхания телят
В опытах по фармакокинетике нами была установлена ориентировочная
терапевтическая доза препарата – 1,0 мл на 20 кг массы животного, что
соответствует 5 мг/кг в пересчете на азитромицин.
Для подтверждения эффективности предложенного режима дозирования
нами были проведены исследования по титрации различных доз Азитронита при
острой бронхопневмонии телят. Доза 0,5 мл/20 кг оказалась малоэффективной: на
7 сутки видимого улучшения состояния животных не наблюдали, в связи с чем,
было принято решение продолжить лечение по стандартной схеме, принятой в
хозяйстве. Двукратная доза 0,8 мл/20 кг с интервалом 48 ч. была более
эффективной, через 4-5 сут. состояние телят заметно улучшилось, через 7-8 сут.
констатировали клиническое выздоровление животных (дыхание становилось
мягче, хрипы практически не прослушивались, температура была в норме).
Максимально эффективным было введение Азитронита в дозах 1,0 и 1,5
мл/20 кг массы животного двукратно с интервалом 24 и 48 часов: уже на 3 сутки
произошло заметное улучшение, а через 4-5 дней наблюдалось клиническое
выздоровление животных (дыхание у животных было мягче, хрипы не
прослушивались, температура - в норме). Так как дозы 1,0 и 1,5 мл были
одинаково эффективными, оптимальным режимом дозирования при острой
катаральной бронхопневмонии было признано введение препарата в дозе 1,0
мл/20 кг массы животного, дважды, с интервалом 24 часа.
В дальнейших клинических исследованиях испытывалась эта схема, а также
3-кратное введение Азитронита с интервалом 24 и 48 ч. в случаях осложненного
течения заболевания. Результаты изучения терапевтической эффективности
Азитронита представлены в таблице 5. Предложенная схема 1 мл на 20 кг массы
тела 2-5 раз с интервалом в 24 или 48 ч. была эффективна, и Азитронит не уступал
по терапевтической эффективности препарату сравнения Энромагу 10%, а
учитывая сроки выздоровления и кратность обработок – даже превосходил.
20
Таблица № 5
Терапевтическая эффективность Азитронита при болезнях органов дыхания телят
Препарат
Кол-во
жив-х
Доза
Кратность
введения
Азитронит
Энромаг 10%
14
14
1,0 мл/20 кг
0,5 мл/10 кг
2
3-5
Интервал
Выздоро- Пало, В/убито,
между
вело, гол
гол
гол
введениями
ПОДОСТРАЯ БРОНХОПНЕВМОНИЯ
48
13
1
0
24
12
2
0
Длительность
лечения
Выздоровле
ние, сут
Эффективн
ость, %
4
3-5
7-8
8-10
92,8
85,7
6
5
10-12
13-15
92,8
75,0
1
2
2
4
3-5
6-7
96
92
0
2
2
4
3-4
7-8
100
90
10-12
10-14
93,3
90,0
Азитронит
Энромаг 10%
14
8
1,0 мл/20 кг
0,5 мл/10 кг
3
5
ХРОНИЧЕСКАЯ БРОНХОПНЕВМОНИЯ
48
13
1
0
24
6
0
2
Азитронит
25
25
1,0 мл/20 кг
1,0 мл/20 кг
2
2
ОСТРЫЙ ТРАХЕОБРОНХИТ
24
24
0
48
23
0
Азитронит
Азитронит
Флорон 30%
ОСТРЫЙ БРОНХИТ
24
20
0
48
18
0
30
20
1,0 мл/20 кг
1,0 мл/20 кг
22
17
ГНОЙНО-КАТАРАЛЬНАЯ ПНЕВМОНИЯ, ОСЛОЖНЕННАЯ ГАСТРОЭНТЕРИТОМ
1,0 мл/20 кг
3-5
24
20
0
2
3-5
1,0 мл/15 кг
3
48
15
1
1
6
3
2
21
ВЫВОДЫ
1.
Установлено, что препарат Азитронит относится к 4 классу опасности
(по ГОСТ 12.1.007-76) – вещества малоопасные. ЛД50 при внутрижелудочном
введении мышам превышает 30000 мг/кг, а при внутримышечном введении
крысам составляет 9300 (7888 ÷ 10712) мг/кг.
2.
Введение Азитронита в течение 14 дней в дозах 930 и 465 мг/кг
привело к статистически значимому дозозависимому снижению привесов.
Максимальная доза 930 мг/кг вызвала статистически значимые изменения
гематологических показателей крови: уменьшение гематокрита, гемоглобина и
содержания
эритроцитов,
увеличение
содержания
лейкоцитов.
В
двух
максимальных дозах отмечали достоверное повышение уровней АСТ и ЛДГ, а
также тенденцию к повышению креатинина, общего и прямого билирубина, что
свидетельствует об отрицательном влиянии препарата на функцию печени и
почек. Суммируя полученные данные в подостром опыте можно прийти к
заключению, что дозы Азитронита - 930 и 465 мг/кг являются – токсичными, доза
186 мг/кг – пороговой.
3.
Азитронит не обладал раздражающим действием при нанесении на
кожу и конъюнктиву глаза, аллергизирующие свойства выявлены не были. При
длительном введении препарата в повышенных дозах у крыс отмечали отек и
болезненность, а также дозозависимые гистологические изменения мышечной ткани
в месте инъекции.
4.
Проведенные исследования по переносимости препарата на телятах
позволяют заключить, что доза Азитронита 3,0 мл/20 кг массы животного
ежедневно в течение 9 дней подряд является максимальной переносимой дозой,
не вызывающей токсических эффектов. Доза 5,0 мл/20 кг массы животного
ежедневно в течение 9 дней подряд является пороговой дозой препарата.
5.
При исследовании фармакокинетики было выявлено, что азитромицин
быстро всасывается из места инъекции в кровь, достигая максимального уровня 1
мкг/мл через 30 минут после однократного внутримышечного введения. Затем его
содержание достаточно быстро снижается, что свидетельствует о переходе
22
препарата в ткани, но в крови антибиотик определяется в небольших
концентрациях вплоть до 72 часов после введения.
6.
Анализ содержания азитромицина в образцах органов и тканей телят
показал, что после трехкратного внутримышечного введения Азитронита с
интервалом 24 часа остаточные количества его в органах и тканях у телят через 40
суток не достигают пределов количественного определения азитромицина (1 нг/г).
7.
При исследовании различных доз Азитронита установлено, что доза
1,0 мл/20 кг массы животного, применяемая 2 – 3-кратно с интервалом 24 часа,
является
наиболее
оптимальной
для
лечения
острой
катаральной
бронхопневмонии, острого бронхита и острого трахебронхита у телят, вызванных
возбудителями
бактериальной
этиологии
(улучшалось
общее
состояние
животных, дыхание становилось мягче, хрипы не прослушивались, температура
была в норме).
8.
При подострой и хронической бронхопневмонии телят рекомендуется
трехкратное введение препарата в дозе 1,0 мл на 20 кг массы животного с
интервалом 48 часов, а при гнойно-катаральной пневмании 3-5 кратное введение
препарата с интервалом 24 часов. Эта доза и схемы применения препарата
обеспечивают терапевтический эффект при болезнях органов дыхания телят на
уровне 92,8-100%.
Практические предложения
Материалы
диссертационной
работы
по
изучению
фармако-
токсикологических свойств препарата, фармакокинетики действующего вещества,
определение его остаточных количеств в органах и тканях телят и лечебной
эффективности при болезнях органов дыхательной системы молодняка крупного
рогатого скота использованы при подготовке инструкции по применению,
утвержденной Россельхознадзором 15 сентября 2014 г.
Экспериментальные данные используются в учебном процессе при чтении
лекций и проведении лабораторно – практических занятий студентам ФГБОУ
МГУПП кафедры «Ветеринарная медицина».
23
Список работ опубликованных по теме диссерцации
1. Осянина М.Н. Изучение токсикологических свойств препарата Азитронит при
пероральном и внутримышечном способах введения в условиях острого опыта /
М.Н. Осянина, Н.Б. Емельянова, В.Е. Абрамов, С.В. Новикова //- Международный
вестник ветеринарии.-2014.- № 4. С. 41-43;
2. Осянина М.Н. Подострая токсичность «Азитронит» / М.Н. Осянина, В.Е.
Абрамов, Н.Б. Емельянова, А.В. Балышев // Ветеринарный врач.-2014. № 6. С. 1821;
3. Осянина М.Н. Эффективность нового препарата Азитронит при гастроэнтерите
телят / В.Е. Абрамов, М.Н. Осянина, А.В. Балышев, Е.В. Глухарева, М.И.
Сафарова // Ветеринария.-2015. № 2. С. 7-12.
24