Вирусология

История вирусологии. Принципы классификации вирусов
Вирусология - наука, изучающая морфологию, физиологию, генетику, экологию и
эволюцию вирусов
Слово «вирус» означало яд. Этот термин применил ещё Л. Пастер для обозначения
заразного начала. В настоящее время под вирусом подразумеваются мельчайшие
реплицирующиеся микроорганизмы, находящиеся всюду, где есть живые клетки.
Открытие вирусов принадлежит русскому учёному Дмитрию Иосифовичу
Ивановскому, который в 1892 году опубликовал работу по изучению мозаичной болезни
табака. Д. И. Ивановский показал, что возбудитель этой болезни имеет очень малые
размеры и не задерживается на бактериальных фильтрах, являющихся непреодолимым
препятствием для мельчайших бактерий. Кроме того, возбудитель мозаичной болезни
табака не способен культивироваться на искусственных питательных средах. Д. И.
Ивановский открыл вирусы растений.
В 1898 году Леффлер и Фрош показали, что широко распространённая болезнь
крупного рогатого скота - ящур вызывается агентом, который также проходит через
бактериальные фильтры. Этот год считается годом открытия вирусов животных.
В 1901 году Рид и Кэррол показали, что фильтрующиеся агенты можно выделить из
трупов людей, умерших от жёлтой лихорадки. Этот год считается годом открытия вирусов
человека.
Д'Эррель и Туорт в 1917-1918 г.г. обнаружили вирусы у бактерий, назвав их
«бактериофагами». Позднее были выделены вирусы из насекомых, грибов, простейших.
Вирусы до сих пор остаются одними из главных возбудителей инфекционных и
неинфекционных заболеваний человека. Около 1000 различных болезней имеют вирусную
природу. Вирусы и вызываемые ими болезни человека являются объектом изучения
медицинской вирусологии.
Вирусы имеют кардинальные отличия от других прокариотических микроорганизмов:
1. Вирусы не имеют клеточного строения. Это доклеточные микроорганизмы.
2. Вирусы имеют субмикроскопические размеры, варьирующие у вирусов человека от 15-30
нм до 250 и более нм.
3. Вирусы имеют в своём составе только один тип нуклеиновой кислоты: или ДНК, или
РНК, где закодирована вся информация вируса.
4. Вирусы не обладают собственными метаболическими и энергетическими системами.
5. Размножение вирусов происходит с использованием белоксшггезирующих и
энергетических систем клетки-хозяина, поэтому вирусы облигатные внутриклеточные
паразиты.
6. Вирусы не способны к росту и бинарному делению. Они размножаются путём
репродукции их белков и нуклеиновой кислоты в клетке хозяина с последующей сборкой
вирусной частицы.
В силу своих особенностей вирусы выделены в отдельное царство Vira, включающее
вирусы позвоночных и беспозвоночных животных, растений и простейших. В основу
современной классификации вирусов положены следующие основные критерии:
1. Тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), её структура (одно- или двунитчатая,
линейная, циркулярная, непрерывная или фрагментированная).
2. Наличие липопротеидной оболочки (суперкапсида).
3. Стратегия вирусного генома (т.е. используемый вирусом путь транскрипции, трансляции,
репликации).
4. Размер и морфология вириона, тип симметрии, число капсомеров.
5. Феномены генетических взаимодействий.
6. Круг восприимчивых хозяев.
7. Патогенность, в том числе патологические изменения в клетках и образование
внутриклеточных включений,
8. Географическое распространение.
9. Способ передачи.
10. Антигенные свойства.
На основании 1 и 2 критериев вирусы делятся на подтипы и семейства, на основании
нижеперечисленных признаков - на роды, виды, серовары. Название семейства оканчивается
на «viridae», некоторые семейства делятся на подсемейства (оканчивается «virinae»), рода «vims». Вирусы человека и животных распределены в 19 семействах: 13- РНК-геномных и 6
- ДНК-геномных. Классификация и некоторые свойства вирусов человека и животных
представлены в табл. 1.
Таблица 1
КЛАССИФИКАЦИЯ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ВИРУСОВ
ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
ЦАРСТВО V1RA
Семейство
Тип нуклеиновой
Наличие
Размер
Типовые представители
вирусов
кислоты
супервириона.
капсида
нм
ДНК-ГЕНОМНЫЕ ВИРУСЫ
Adenoviridae
Линейная,
70-90 Аденовирусы
двунитчатая
млекопитаюших и птиц
Herpesviridae
линейная
двунитчатая
+
Hepadnaviridaе
Двунитчатая,
кольцевая с
однонитчатым
участком
двунитчатая,
кольцевая
Двунитчатая с
замкнутыми
концами
линейная,
однонитчатая
+
Papovaviridae
Poхviridae
Parvoviridae
+
-
Вирусы простого герпеса,
цитомегалии, ветряной
оспы, инфекционного
мононуклеоза
1 45-50 Вирус гепатита В
220
Вирусы папилломы,
полиомы
130-250 Вирус осповакцины, вирус
натуральной оспы
45-55
18-26
Аденоассоциированный
вирус
РНК-ГЕНОМНЫЕ ВИРУСЫ
+
50-300
Вирусы Ласса, Мачупо
+
90-100
Вирусы геморрагических
лихорадок и энцефалитов
Caliciviridae
фрагментированная
однонитчатая
фрагментированная
однонитчатая
кольцевая
однонитчатая
-
20-30
Coronaviridae
однонитчатая +РНК
+
80-130
Вирус гепатита Е,
калицивирусы человека
Коронавирусы человека
+
80-120
Вирусы гриппа
Areoaviridae
Bunyaviridae
Orthomyxoviridae однонитчатая,
фрагментированная - РНК
Paramyxoviridae
Однонитчатая,
линейная -РНК
+
150-300 Вирусы парагриппа, кори,
эпидпаротита, PC-вирус
Picornaviridae
однонитчатая +РНК
-
20-30
Reoviridae
двунитчатая РНК
-
60-80
Retroviridae
однонитчатая РНК
+
80-100
Togaviridae
однонитчатая +РНК
+
30-90
Flaviviridae
однонитчатая +РНК
+
30-90
Вирусы полиомиелита,
Коксаки, ЭКХО, гепатита А
риновирусы
Реовирусы, ротавирусы
Вирусы рака, лейкоза,
саркомы, ВИЧ
Вирусы Синдбис.
Лошадиных
Вирусы клещевого
Энцефатитов.
крастхи
знцефштига, жёлтой
лихорадки, Денге,
японского энцефалита,
гепатита С, G
Rhabdoviridae
однонитчатая -РНК
+
Filoviridae
однонитчатая +РНК
+
Вирус бешенства, вирус
везикулярного стоматита
200-4000 Вирусы лихорадки Эбола,
Марбург
30-40
Морфология и ультраструктура вирусов
По строению различают 2 типа вирусных частиц: простые и сложные.
Внутренняя структура простых и сложных вирусов сходна.
Сердцевина вируса - вирусная нуклеиновая кислота вирусный геном. Вирусный геном
может быть представлен одной из 4 молекул РНК или ДНК: однонитчатыми и двунитчатыми
РНК и ДНК. Большинство вирусов имеют один цельный или фрагментированный геном,
имеюший линейную или замкнутую форму. Однонитчатые геномы могут иметь 2
полярности: 1) позитивную, когда вирионная нуклеиновая кислота одновременно служит и
матрицей для синтеза новых геномов и выполняет роль и-РНК; 2) негативную,
выполняющую только функцию матрицы. Геном вирусов содержит от 3 до 100 и более
генов, которые делятся на структурные, кодирующие синтез белков, входящих в состав
вириона, и регуляторные, которые изменяют метаболизм клетки хозяина и регулируют
скорость размножения вирусов.
Ферменты вирусов также закодированы в геноме. К ним относятся: РНК-зависимая
РНК-полимераза (транскриптаза), которая обнаружена у всех РНК-содержащих вирусов с
негативной полярностью. Поксвирусы содержат ДНК-зависимую РНК-полимеразу.
Ретровирусы имеют уникальный фермент - РНК-зависимую ДНК-полимеразу, называемую
обратной транскриптазой. В геноме некоторых вирусов имеются гены, кодирующие РНКазы, эндонуклеазы, проте-инкииазы.
Снаружи нуклеиновая кислота покрыта белковым чехлом - капсидом, образуя комплекс
- нуклеокапсид (в химическом смысле - нуклеопротеид). Кап-сид состоит из отдельных
белковых субъединиц - капсомеров, которые представляют уложенную определённым
образом полипептидную цепь, создающую симметричную конструкцию. Если капсомеры
укладываются по спирали, такой тип укладки капсида носит название спиральной
симметрии. Если капсомеры укладываются по граням многогранника (12-20-гранника),
такой тип укладки капсида носит название икосаэдрической симметрии
Капсид представлен -спиральными белками, способными к полимеризации, которые
выполняют защиту генома от различных воздействий, выполняют рецепторную функцию у
этой группы вирусов, обладают антигенными свойствами.
Сложные вирусы имеют внешнюю оболочку - суперкапсид, расположенную поверх
капсида. В состав суперкапсида входят внутренний белковый слой - М-белок, затем более
объёмный слой липидов и углеводов, извлечённых из клеточных мембран клетки-хозяина.
Вирусспецифические гликопротеиды проникают внутрь суперкапсида, образуя снаружи
фигурные выпячивания, которые выполняют рецепторную функцию. Вирусы существуют в
трёх формах:
1) вирион (вирусная частица) - внеклеточная форма;
2) внутриклеточный (вегетативный) вирус;
3) интегрированный с ДНК хозяина вирус (провирус).
Взаимодействие вируса с клеткой. Репродукция
(размножение) вирусов
Вирусы - облигатные внутриклеточные паразиты, способные размножаться только в
живой клетке. В отличие от прокариотических и эукариотических микроорганизмов вирусы
не размножаются бинарным делением. Размножение вирусов происходит путём
репродукции (англ, "reproduce" - воспроизво-аить, делать копию), то есть воспроизведение
их нуклеиновых кислот и белков z последующей сборкой вирионов. Синтез нуклеиновых
кислот и белков вируса происходит в разных частях клетки (ядре и цитоплазме). Такой
способ репродукции получил название дизъюнктивного (разобщённого).
Процесс репродукции вирусов условно можно разделить на 2 фазы. Первая фаза
включает 3 стадии: 1) адсорбцию вируса на чувствительных клетках; 2) проникновение
вируса в клетку; 3) депротеинизацию вируса. Вторая фаза включает стадии реализации
вирусного генома: 1) транскрипцию, 2) трансляцию, 3) репликацию, 4) сборку, созревание
вирусных частиц и 5) выход вируса из клетки.
Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. с
прикрепления вируса к поверхности клетки.
Адсорбция представляет собой специфическое связывание вирионного белка
(антирецептора) с комплементарной структурой клеточной поверхности - клеточным
рецептором. По химической природе рецепторы, на которых фиксируются вирусы, относятся
к двум группам: мукопротеидным и липопротеидным. Вирусы гриппа, парагриппа,
аденовирусы фиксируются на мукопротеидных рецепторах. Энтеровирусы, вирусы герпеса,
арбовирусы адсорбируются на липопротеидных рецепторах клетки. Адсорбция происходит
лишь при наличии определённых электролитов, в частности ионов Са2+, которые
нейтрализуют избыточные анионные заряды вируса и клеточной поверхности и уменьшают
электростатическое отталкивание Адсорбция вирусов мало зависит от температуры
Начальные процессы адсорбции носят неспецифический характер, являются результатом
электростатического взаимодействия положительно и отрицательно заряженных структур на
поверхности вируса и клетки, а затем наступает специфическое взаимодействие
прикрепительного белка вириона со специфическими группировками на плазматической
мембране клетки. Простые вирусы человека и животных содержат прикрепительные белки в
составе капсида. У сложно организованных вирусов прикрепительные белки входят в состав
супер-капсида. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов), либо шипов,
грибоподобных структур у миксо-, ретро-, рабдо- и других вирусов. Вначале происходит
единичная связь вириона с рецептором - такое прикрепление непрочное - адсорбция носит
обратимый характер. Чтобы наступила необратимая адсорбция, должы появиться
множественные связи между рецептором вируса и рецептором клетки, т. е. стабильное
мультивалентное прикрепление. Количество специфических рецепторов на поверхности
одной клетки составляет 104-105. Рецепторы для некоторых вирусов, например, для
арбовирусов. содержатся на клетках как позвоночных, так и беспозвоночных, для других
вирусов только на клетках одного или нескольких видов.
Проникновение вирусов человека и животных в клетку происходит двумя путями: 1)
виропексисом (пиноцитозом); 2) слиянием вирусной суперкапсидной оболочки е клеточной
мембраной. Бактериофаги имеют свой механизм проникновения, так называемый
шприцевои, когда в результате сокращения белкового отростка фага нуклеиновая кислота
как бы впрыскивается в клетку.
Депротеинизация вируса освобождение геиома вируса от вирусных защитных оболочек
происходит либо с помощью вирусных ферментов, либо с помощью клеточных ферментов.
Конечными продуктами депротеинизации являются нуклеиновые кислоты или нуклеиновые
кислоты, связанные с внутренним вирусным белком. Затем имеет место вторая фаза
вирусной репродукции, ведущая к синтезу вирусных компонентов.
Транскрипция - переписывание информации с ДНК или РНК вируса на и-РНК по
законам генетического кода.
Трансляция - процесс перевода генетической информации, содержащейся в и-РНК, на
специфическую последовательность аминокислот.
Репликация - процесс синтеза молекул нуклеиновых кислот, гомологичных вирусному
геному.
Реализация генетической информации у ДНК-содержащих вирусов идёт так же, как и в
клетках:
ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок
У РНК-содержащих вирусов с негативным геномом (вирусы гриппа, пара-гриппа и др.)
формула реализации генома следующая:
-РНК транскрипция и-РНК трансляция белок
У вирусов с позитивным РНК-геномом (тогавирусы, пикорнавирусы) транскрипция
отсутствует:
+РНК трансляция белок
У ретровирусов - уникальный путь передачи генетической информации:
РНК обратная транскрипция ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок
ДНК интегрируется с геномом клетки-хозяина (провирус).
После наработки клеткой вирусных компонентов наступает последняя стадия вирусной
репродукции сборка вирусных частиц и выход вирионов из клетки. Выход вирионов из
клетки осуществляется двумя путями: 1) путём «взрыва» клетки, в результате чего клетка
разрушается. Этот путь присущ простым вирусам (пикорна-, рео-, папова- и аденовирусам),
2) выход из клеток путём почкования. Присущ вирусам, содержащим суперкапсид. При
этом способе клетка сразу не погибает, может дать многократное вирусное потомство, пока
не истощатся её ресурсы.
Методы культивирования вирусов
Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются ледуюшие
живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные мбрионы; 3)
лабораторные животные.
I. Культуры клеток
Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно
разделить на 1) первичные (первично трипсинизированные), 2) полуперевиваемые
(диплоидные) и 3) перевиваемые.
По происхождению они классифицируются на эмбрионштьные, опухолевые и из
взрослых организмов; по морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.
Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного,
которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной
поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур
ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического
измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества
клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека,
амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления
вирусов, а также для производства вирусных вакцин.
Полуперевиваемые (или диплоидные) культуры клеток - клетки одного типа,
способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный
диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека
используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных
вакцин.
Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и
гетероплоидным кариотипом.
Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры
(например, СОЦ, ПЭС, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки
морской свинки и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному
размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких
особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур трансформированными.
Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные
новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто
в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из
метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека.
Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему
назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред
должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное
размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны
обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении
в клетке вирусов.
Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например,
синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для
культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего
им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой
размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих
сред сыворотка не входит.
Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации.
При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь,
моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток,
обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения
используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением
клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси
испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения
бактерий и грибов. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток
материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до
выявления признаков размножения вируса.
Индикатором наличия вируса в заражённых культурах клеток может служить:
1) развитие специфической дегенерации клеток - цитопатическое действие вируса (ЦПД),
которое имеет три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование
многоядерных гигантских клеток - симпластов; развитие очагов клеточной
пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток ;
2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах
пораженных клеток;
3) положительная реакция гамагтлютинации (РГА);
4) положительная реакция гемадсорбции (РГАдс);
5) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким
слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон - розовый). При
наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне
агара.
6) при отсутствии ЦПД или ГА можно поставить реакцию интерференции : исследуемая
культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае
ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом
материале вируса не было, наблюдается ЦПД.
II. Выделение вирусов в куриных эмбрионах.
Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного
возраста.
Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоско-пировании
живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом
отмечают границы воздушного мешка. Заражают куриные эмбрионы в асептических
условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над
воздушным пространством йодом и спиртом.
Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на
хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный
мешок. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса.
Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона,
положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической
жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.
III. Выделение вирусов на лабораторных животных.
Лабораторные животные могут быть использованы для выделения вирусов из
инфекционного материала, когда невозможно применить более удобные системы (культуры
клеток или куриные эмбрионы). Берут преимущественно новорождённых белых мышей,
хомяков, морских свинок, крысят. Заражают животных по принципу цитотропизма вируса:
пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные - интрацеребрально,
дерматотропные - на кожу.
Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у животных, их
гибели, патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также
по положительной реакции гемагглтотинации с экстрактами из органов.
Вирусные заболевания, их особенности
Вирусы, в отличие от других микроорганизмов, вызывают 2 группы заболеваний:
1) вирусные инфекции,
2) опухоли (доброкачественные и злокачественные). Особенности
вирусных инфекций:
1. Вирусные инфекции - широко распространённые. Их удельный вес в структуре
инфекционной заболеваемости может составить 60-80%.
2. Внутриклеточное размножение вирусов приводит к массовой гибели клеток организма.
3. Размножение некоторых вирусов (ВИЧ, вирусы кори, гепатита В, С) в клетках иммунной
системы приводит к развитию иммунодефицитного состояния.
4. Способность некоторых вирусов интегрироваться с геномом клетки (ВИЧ, вирус гепатита
В, онкогенные РНК-содержащие вирусы).
5. Некоторые вирусы (краснухи, цитомегалии) обладают тератогенным действием.
6. Инфекционные вирусы могут провоцировать развитие опухолей (аденовирусы,
герпесвирусы, вирусы гепатитов В, С, G).
7. Вирусы могут вызывать медленные инфекции (ВИЧ, вирусы кори, бешенства, гепатита В,
герпеса и др.).
8. Иммунопрофилактика многих вирусных инфекций отсутствует.
9. Диагностика вирусных заболеваний применяется не в каждом конкретном случае из-за
массовости этих заболеваний.
10.До настоящего времени недостаточно эффективных средств для лечения вирусных
заболеваний.
КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Уровень клетки
Автономная инфекция
продуктивная
острая
Интеграционная инфекция
абортивная
хроническая
цитолитическая
Интеграция
полного генома
Интеграция
части генома
Неоплатическая
трансформация
Отсутстие
трансформации
острая
нецитолитическая
Уровень организма
медленная
хроническая
персистентная
инаппарантная
острая
манифестная
хроническая
латентная
персистентная
инаппарантная
манифестная
острая
Генерализованная инфекция
латентная
Очаговая инфекция
На клеточном уровне выделяют автономные инфекции, если вирусный геном
реплицируется независимо от клеточного, и интеграционные инфекции, если вирусный
геном включается в состав клеточного. Автономная инфекция делится на продуктивную,
при которой образуется инфекшюнное потомство, и абортивную, при которой
инфекционный процесс обрывается, и новые вирус ные частицы или не образуются совсем,
или образуются в небольшом количестве. Продуктивная и абортивная инфекции могут быть
острыми и хроническими. Острая инфекция в зависимости от судьбы заражённой клетки
делится на цитолитическую и нецитолитическую. Цитолитическая инфекция завершается
деструкцией клеток, или ЦПД, а вирус, вызывающий ЦПД, называется цитопатогенным.
На уровне организма вирусные инфекции делятся на 2 группы: 1) очаговые, когда
размножение и действие вируса проявляется у входных ворот; 2) генерапизованные, при
которых вирус после размножения во входных воротах разносится по различным органам и
тканям, формирует вторичные очаги инфекции. Примерами очаговой инфекции являются
ОРВИ и ОКИ, генерализованной - полиомиелит, корь, оспа.
Острая инфекция протекает непродолжительно, сопровождается выделением вируса в
окружающую среду, заканчивается либо выздоровлением, либо гибелью организма. Острая
инфекция может проявляться рядом симптомов (манифестная инфекция), а может быть
бессимптомной (инаппарантная инфекция).
При длительном взаимодействии вируса с макроорганизмом возникает персистентная
инфекция (ПИ). В зависимости от состояния организма один и тот же вирус может вызвать
как острую инфекцию, так и персистентную (вирусы кори, герпеса, гепатитов В, С,
аденовирусы). Клинические проявления при ПИ могут быть выраженными, слабо
выраженными, или отсутствовать совсем, вирус может выделяться в окружающую среду или
нет. По этим признакам ПИ делят на латентные (скрытые инфекции, без выделения вируса,
вызываются он-когенными вирусами, ВИЧ, вирусами герпеса и адено-); хронические
(характеризующиеся периодами ремиссий и обострений, когда вирус выделяется в окружающую среду. Примерами хронической инфекции являются герпетическая,
аденовирусная, хроническая форма гепатитов В и С и др.); медленные (характеризуются
длительным инкубационным периодом, медленным развитием симптомов, ведущих к
тяжёлому нарушению функций организма и летальному исходу).
Этиология медленных инфекций
Медленные инфекции, поражающие человека и животных, по этиологии можно
разделить на 2 группы:
I группа - это медленные инфекции, вызываемые прионами. Прионы - это белковые
инфекционные частицы (protein infections particle), имеют форму фибрилл, длиной от 50 до
500 нм, массой 30 кД. Не содержат нуклеиновой кислоты, устойчивые к действию протеаз,
нагреванию, к действию ультрафиолета, ультразвука и ионизирующей радиации. Прионы
способны к репродукции и накоплению в составе поражённого органа до гигантских
величин, не вызывают ЦПД, иммунного ответа и воспалительных реакций. Повреждение
ткани по дегенеративному типу.
Прионы у человека вызывают заболевания:
1) Куру («хохочущая смерть») - медленная инфекция, эндемичная для Новой Гвинеи.
Характеризуется атаксией и тремором с постепенным полным поражением двигательной
активности, дизартрией и смертью через год после появления клинических симптомов.
2) Болезнь Крейтцфельдта-Якоба, характеризуется прогрессирующей деменци-ей
(слабоумием) и симптомами поражения пирамидных и экстрапирамидных путей.
3) Амиотрофический лейкоспонгиоз, характеризуется дегенеративным разрушением
нервных клеток, в результате чего мозг приобретает губчатую (спон-гиоформную)
структуру.
Прионовые заболевания у животных:
1) Бычья спонгиоформная энцефалопатия (бешенство коров);
2) Скрепи - подострая трансмиссивная губкообразная энцефалопатия овен.
II группа - это медленные инфекции, вызываемые классическими вирусами.
К медленным вирусным инфекциям человека относятся: ВИЧ-инфеюшя -СПИД
(вызывает ВИЧ, сем. Retrovoridae); ПСПЭ - подострый склерозируюший панэнцефалит
(вирус кори, сем. Paramyxoviridae); прогрессирующая врождённая краснуха (вирус
краснухи, сем. Togaviridae); хронический гепатит В (вирус гепатита В, сем. Hepadnaviridae);
цитомегаловирусное поражение мозга (вирус цитомегалии, сем. Herpesviridae); Т-клеточная
лимфома (HTLV-I, HTLV-II, сем. Retroviridae); подострый герпетический энцефалит (herpes
simples, сем. Herpesviridae) и др.
Кроме медленных инфекций, вызываемых вирусами и прионами, существует группа
нозологических форм, которые по клинике и исходу соответствуют признакам медленной
инфекции, но точных данных об этиологии ешё не имеется. К таким заболеваниям
относятся рассеянный склероз, амиотрофический боковой склероз, атеросклероз,
шизофрения и др.
Лабораторная диагностика вирусных инфекций
В основе лабораторной диагностики вирусных инфекций лежат 3 группы методов:
1 группа - Обнаружение возбудителя или его компонентов непосредственно в
клиническом материале, взятом от больного, и получение ответа через несколько часов
(быстрая;
экспресс-диагностика).
Методы
экспресс-диагностики
наиболее
распространённых вирусных инфекций приведены в табл. 2.
Таблица 2
Вирусы
МЕТОДЫ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ РАСПРОСТРАНЁННЫХ
ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Инфекция
Материал для
Сроки забора Методы экспрессисследования
материала
диагностики
Аденовирусы
Аденовирусная
инфекция
Парагриппа, PCвирус
Гриппа
ОРВИ
Риновирусы
ОРВИ
Грипп
Простого герпеса Herpes simplex
Отделяемое носоглотки, конъюнктивы, кровь,
кал, моча
Отделяемое
носоглотки
Отделяемое
носоглотки
Отделяемое
носоглотки
Содержимое
везикулы
Ветряной оспы и Ветряная оспа,
опоясывающего опоясывающий
герпеса
герпес
Содержимое везикулы
Цитомегалии
Моча, слюна,
кровь
Цитомегаловирусная
инфекция
Первые 7 дней ИФ,
болезни
молекулярная
гибридизация
(МГ), ЭМ, ИФА,
РИАИФА
Первые 3-5
ИФ.
дней болезни
Первые 3-5
ИФ, ИФА, РИА,
дней болезни ЭМ
Первые 3-5
ИФ
дней болезни
В течение пер- ИФ, МГ, ИЭМ,
вых 12 дней
ИФА
после появления сыпи
В течение пер- ИФА, ИФ, ИЭМ
вых 7 дней после появления
сыпи
В течение все- ЭМ, микроскопия
го периода за- окрашенных
болевания
мазковотпечатков, МГ,
ИФ, выявление
IgM
Ротавирусы
Острый гастроэнтерит
Фекалии
Первые 3-5
дней болезни
Гепатита А
Гепатит А
Фекалии, кровь
Гепатита В
Гепатит В
Кровь
Первые 7- 10
дней болезни
Весь период
заболевания
ЭМ, ИЭМ, ИФА,
РИА, МГ,
электрофорез
РНК в ПААГ
ИЭМ, ИФА, РИА,
выявление IgM
ИФА, РИА,
РОПГА, МГ,
ПЦР, ВИЭФ
2 группа методов - Выделение вируса из клинического материала, его индикация и
идентификация (вирусологическая диагностика).
В большинстве случаев концентрация вируса в клиническом материале недостаточна
для быстрого обнаружения вируса или его антигенов. В этих случаях используют
вирусологическую диагностику. Эта группа методов требует продолжительного времени,
трудоёмка, часто является ретроспективной. Однако вирусологическая диагностика
является необходимой для инфекций, вызванных новыми типами вируса, или когда
невозможно провести диагностику другими методами.
Для вирусологической диагностики врач должен обеспечить взятие необходимых проб
материала в соответствующую фазу заболевания, доставку их в лабораторию, снаодив
диагностические лаборатории необходимой клинической информацией.
Материалом для вирусологического исследования при заболеваниях, сопровождающихся диареей или другими желудочно-кишечными расстройствами,
предполагающими вирусную этиологию, являются свежие порции фекалий. При
заболеваниях дыхательной системы материал для исследования лучше всего получать путём
аспирации слизи, смывов. Мазки из носоглотки мене информативны. При наличии
везикулярной сыпи материалом для исследования является жидкость, аспирированная иглой
из везикул. При петехиальной и макуло-папулёзной сыпи материалом для исследования
являются как пробы слизи из носоглотки, так и фекалии. При подозрении на нейровирусные
инфекции для вирусологического исследования следует забирать слизь из носоглотки, фекалии и спинномозговую жидкость. Для диагностики эпидемического паротита и бешенства
материалом является слюна. При подозрении на цитомегало- и пaпoвирусные инфекции
материалом может быть моча. Попытку выделить вирус из крови можно предпринять при
подозрении на инфекции, вызванные некоторыми арбовирусами, вирусами герпеса. Биопсия
мозга может быть проведена при диагностике герпетического энцефалита, ПСПЭ,
прогрессирующего
краснушного
панэнцефалита,
болезни
Крептцфельдта-Якоба,
лейкоспонгиоза и др.
Препараты слизи из носоглотки или фекалии помещаются в среду для
транспортировки, состоящую из физиологического раствора с добавлением антибиотиков и
небольшого количества белка или сыворотки животных. Материалы могут храниться при
температуре 4°С не боле 48 часов. Более длительное хранение требует температуры -70°С.
Выделение вируса из клинического материала осуществляется путём его инокуляции в
культуру клеток, куршше эмбрионы или заражения им лабораторных животных (см.
Культивирование вирусов).
Вирус гриппа следует выделять путём инокуляции вируссодержащего материала в
ампиотическую или аллантоисную полость куриного эмбриона. Для выделения вируса
Коксаки А, вируса бешенства, многих арбовнрусов, ареиави-русов рекомендуется
иптраперитонеальпая и иитрацереОратьпая инокуляция материала новорождённым мышам.
После заражения клеточной культуры, последнюю исследуют на наличие ЦП Д.
Многие энтеровнрусы вызывают раннее ЦДД (через несколько часов). Цигомегаловирусы,
аденовирусы, вирус краснухи вызывают ЦПД через несколько педель, а иногда необходимо
прибегать к получению субкультуры. Присутствие сншштия свидетельствует о наличии
таких вирусов, как PC, кори, эпидемического паротита, герпесвируеов.
Идентификация вирусов, выделенных в этих системах, проводится с по-мошыо
серологических методов. Такие серологические реакции, как РТГЛ, РН, PIT Аде,
используются только при вирусных инфекциях. РСК, РПГА, ИФА, РИА, ИФ, РП и др.
используются для диагностики как вирусных инфекций, так и инфекций, вызванных
другими возбудителями.
На схемах 2 и 3 представлена дигностика ОРВИ и кишечных инфекций.
ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ ИЗ ОТДЕЛЯЕМОГО НОСОГЛОТКИ, ИХ
ИНДИКАЦИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРИ РЕСПИРАТОРНЫХ
ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ
Слизь из носоглотки, обработанная антибиотиками
Заражение куриного эмбриона
Заражение мышей-сосунков
Гибель, специфические
поражения ХАО
РГА
Параличи, гибель
Вирусы Коксаки, герпеса
РСК, РТГА
ИФ, РН
Вирусы гриппа
Вирусы герпеса
Заражение культуры клеток
ЦПД может
отсутствовать
Интерференция
ИФ
Вирус
краснухи
Образование
синтиция
РТГАдс
ИФ, РН,
РСК
Аденовирусный
тип ЦПД
ИФ, РН,
РСК, РТГА
Пикорнавирусный
тип ЦПД
РСК,
РН
цветной пробе
по
Герпетический
тип ЦПД
ИФ, РН
ИФ, РН,
РТГА,
РТГАдс
Вирусы
гриппа,
парагриппа,
ЭП
РС-вирус,
кори,
парагриппа
Аденовирусы
Энтеровирусы,
риновирусы
Вирусы
простого
герпеса,
цитомегалии
3 группа методов - Серологическая диагностика вирусных инфекций.
Однократно проведенное серологическое исследование лишь в редких случаях
позволяет диагностировать вирусное заболевание (например, при ВИЧ-инфекции). В
большинстве случаев для серологической диагностики требуются парные сыворотки, взятые
в острой фазе заболевания и спустя 2-4 недели. Обнаружение четырёхкратного и более
повышения титра антител принято рассматривать в качестве диагностического признака
острой вирусной инфекции.
ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ ИЗ ФЕКАЛИЙ, ИХ ИНДИКАЦИЯ И
ИНДЕНТИФИКАЦИЯ ПРИ КИШЕЧНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ
Суспензия фекалий, обработанная антибиотиками, осветлённая
центрифугированием
Заражение культур клеток
Пикорновирус
ный тип ЦПД
Реовирусный
тип ЦПД
РСК, РН по
цветной пробе
ИФ, РН, РТГА
энтеровирусы
ротавирусы
Заражение мышей
Аденовирусный
тип ЦПД
Параличи, гибель
РН, РСК
РТГА, РСК,
РН
Коксаки А, В, ротавирусы
аденовирусы
Принципы терапии и профилактики вирусных инфекций
Химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций кардинально отличается от
химиотерапии бактериальных инфекций. Вирусы - внутриклеточные паразиты и не имеют
тех мишеней, на которые действуют антибиотики у бактерий. Поэтому антибиотики для
лечения вирусных инфекций, как правило, не эффективны. Общая стратегия поиска
противовирусных препаратов основана на знании цикла репродукции вируса. Мишенью
действия антивирусных веществ могут быть процессы адсорбции, проникновения вируса в
клетку, процессы депротеинизации вируса, а также синтетическая фаза вирусной репродукции (транскрипция, трансляция и репликация), сборка, созревание и выход вируса из
клетки. Основываясь на этих принципах, в настояшее время получены и успешно
используются следующие группы противовирусных препаратов:
1 группа - Аномальные нуклеозиды - аналоги предшественников нуклеинового обмена,
ингибируют функции вирусных полимераз или включаются в цепочку нуклеиновой
кислоты, делают её нефункциональной.
Аналог пиримидина - йоддезоксиуридин применяется для лечения герпетических
кератитов, кожного герпеса и цитомегалии. Пуриновые аналоги - видорабид применяют для
лечения герпетических энцефалитов, ветряной оспы и опоясывающего герпеса. Ацикловир
(зовиракс) - используют также для лечения разных видов герпетической инфекции.
Рибовирин (виразол) - эффективен против РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Для лечения
ВИЧ-инфекции получены нуклеозидные аналоги, ингибирующие обратную транскриптазу
ВИЧ, ази-дотимидин (зидовудин), тимазид (фосфатид), хивид (зальцитабин).
2 группа производные адамантанамина гидрохлорида. Препараты: амантадин и
ремантадин ингибиругот репродукцию вирусов гриппа, кори, краснухн. Наиболее эффективны в отношении гриппа А. Механизм действия
нарушение
депротеинизации вируса.
3 группа - тиосемикарбазоиы. Препарат метисазои (марборап) активен против вирусов
натуральной оспы. Механизм действия препарата заключается в подавлении синтеза
вирусных белков и сборки вирусных частиц.
4 группа ингибиторы протеолитической активности вирусов. Сущность этого феномена
заключается в том, что многие белки пикориа-, орто-, адено-, тога-, ретровирусов
приобретают вирусную активность лишь после разрезания этих белков на фрагменты
ферментами протеазами. Используют ингибиторы протеаз, такие как горлокс, контрикал, sаминокапроновую кислоту, при лечении инфекций, вызванных этими вирусами. В нашей
республике для лечения ВИЧ-инфекции используют препарат этой группы - инвиразу
(саквннавир).
5 группа. Одно из новых и перспективных направлений химиотерапия создание
препаратов типа «нуклеаз», способных повреждать вирусные гены, что даст возможность
лечить интеграционные вирусные болезни.
6 группа интерфероны. В настоящее время используется -ннтерферон
(лейкоцитарный ИФ) как для лечения, так и для профилактики, особенно респираторных
вирусных инфекций. Механизм действия - нарушение синтеза вирусных белков. Широкое
применение получил -интерферон или иммунный интерферон. -интерферон усиливает
функцию Т-киллеров и естественных киллеров, Т-эффекторов ГЗТ. Используется для
лечения злокачественных опухолей и вирусных инфекций.
7 группа - вирусспецифические иммуноглобулины. которые получают из крови
реконвалесцентов или специально вакцинированных доноров. Используются для
профилактики кори, гепатитов А, В, гриппа, парагриппа и других вирусных инфекций (для
профилактики бешенства используется антирабический иммуноглобудин, полученный из
крови иммунизированных животных). Ig интерферируют с вирионами, предотвращают
адсорбцию вируса на чувствительных клетках.
8 группа - Вакцины. Для профилактики ряда вирусных инфекций в настоящее время
используют убитые вакцины, содержащие ипактивировашше формалином или цропнолактоном вирусы (вакцина против гриппа, кори, полиомиелита, японского и
клещевого энцефалитов, бешенства), живые (аттенуированные) вирусные вакцины,
содержащие вирусы с ослабленной вирулентностью (вакцина против гриппа, кори,
эпидемического паротита, краснухи, полиомиелита, бешенства, жёлтой лихорадки и др.);
субъедипичные вакцины, содержащие вирусные протективные антигены (субъединицы)
(вакцине против гриппа); рекомбипантные (генно-инженерные) вакцины (вакцина против
гепатита В, для получения которой ген, кодирующий HBs-антиген, внедрен в геном
дрожжевой клетки). В стадии разработки находятся синтетические вакцины.
Лабораторная диагностика вирусных гепатитов
В настоящее время в категории вирусных гепатитов рассматривается 7 амостоятельных
нозологических форм: гепатиты А, В, С, D, E, F, G. По путям передачи вирусные гепатиты
делят на:
1. Энтеральные, передающиеся фекально-оральным путём. К ним относятся гепатиты
А, Е и, очевидно, F.
2. Парентеральные, передающиеся через парентеральные манипуляции, включая, в
естественных условиях, трансплацентарный и половой пути передачи. К ним относятся
гепатиты В, С, D, G.
Наибольшее распространение получили гепатиты А, В, С, сравнительная
характеристика которых представлена в табл. 3.
Таблица 3
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ А, В, С
Признак
Вирус (семейство)
Тип нуклеиновой
кислоты
Размер вириона
Гепатит А
Picomaviridae
однонитчатая +РНК
Гепатит С
Flaviviridae
однонитчатая +РНК
27-32 нм
Гепатит В
Hepadnaviridae
двунитчатая ДНК с
однонитчатым
участком
42-45 нм
Суперкапсид
отсутствует
имеется
имеется
Путь заражения
фекально-оральный
парентеральный
парентеральный
Инкубационный
период
Возрастные группы
в среднем 25-30 дней в среднем 60-90
в среднем 35-70 дней
дней, может быть до
6дети
месяцев
преимущественно
и взрослые
дети и взрослые
дети
до
1
5
лет
чаше август-сентябрь в течение всего года в течение всего гоги
Сезонность
30-60 нм
Переход в хроническую форму
отсутствует
имеет место
имеет место в
50 % случаев
Носительство
отсутствует
длительное
длительное
Онкогенность
отсутствует
имеет место
имеет место
I. Гепатит А (гА). Лабораторная диагностика гА основывается либо на выявлении самого
возбудителя (метод иммунной электронной микроскопии - ИЭМ), его антигенов
(радиоиммунный, иммуноферментный, иммунофлюорес-центный метод - РИА, ИФА, ИФ)
или антител к вирусу гА (РИА, ИФА).
Для ранней диагностики заболевания, а также выявления источников инфекции
используется определение антигена вируса гА в фекалиях больных, где он появляется за 7-10
дней до клинических симптомов и в первые дни заболевания.
Из определяемых в настоящее время специфических маркёров гА важнейшими
являются антитела класса Ig M к вирусу гА, которые появляются в сыворотке крови и слюне
уже в начале заболевания и сохраняются в течение 3-6 месяцев. Обнаружение антител класса
Ig M к вирусу гА однозначно свидетельствует о гепатите А и используется для диагностики
заболевания, в том числе и бессимптомных случаев инфекции,и выявления источников инфекции в
очагах.
Антитела к вирусу гА класса Ig G выявляются с 3-4-й недели заболевания и сохраняются
длительно, что позволяет оценить состояние иммунитета населения, динамику специфического
гуморального иммунитета.
Вирус гепатита А в материале от больного можно выявить методом иммунной электронной
микроскопии. В основе метода лежит смешивание суспензии вируса с антисывороткой, отделение
иммунных комплексов и исследование их в электронном микроскопе.
II. Гепатит В (гВ). В организме людей, заражённых вирусом гВ, с разной частотой и на разных
этапах могут выявляться серологические маркёры: поверхностный HBs Ag и сердцевинный НВе
Ag, а также антитела к ним (anti-НВс, anti-HBe, anti-HBs). Динамика их появления и интерпретация
результатов представлены в табл. 4 и 5.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЁРЫ ПРИ ГЕПАТИТЕ В
Таблица 4
Таблица 5
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЁРОВ ПРИ ГЕПАТИТЕ В
Антигены
BHs
НВе
+
+
+
Антитела к HBs-Ar
Антитела кНВс-Аг
Интерпретация
fgG
IgM
–
–
+
Острая фаза гепатита
±
–
+
–
Хронический гепатит В
+
–
–
–
–
Носительство
–
–
+
–
–
Гепатит В в прошлом
–
–
–
–
–
В прошлом
гепатита В
не
было
Все антигены и соответствующие им антитела могут служить индикаторами
инфекционного процесса.
Наличие вирусной ДНК, HBs Ag, НВе Ag и anti-HBc класса Ig M свидетельствует об
остром периоде инфекции. В период реконвалесценции - это anti-НВс-антитела класса Ig G и
выявляются они совместно с anti-Hbs-антителами. Длительное присутствие в крови HBs-Ag,
HBe-Ag и anti-HBc (IgG) - неблагоприятный признак, свидетельствующий о формировании
хронического процесса.
При формировании длительного носительства постоянно определяется HBs Ag. Для
обнаружения антигенов и антител используют РПГА, РИА и ИФА. Для обнаружения HBs Ag
используется РОПГА - реакция обратной пассивной гемагглютинации с обязательным
положительным контролем на HBs Ag.
III. Гепатит С (гС). Вызывается РНК-содержащим вирусом, который относится к семейству
Flaviviridae. Диаметр вирионов 30-60 нм, чувствительны к обработке хлороформом.
Позитивная одноцепочечная РНК кодирует синтез трёх структурных и пяти неструктурных
белков. Гепатит С по клияико-биохимическим признакам сходен с гепатитом В. У 60%
инфицированных лиц заболевание переходит в хроническую форму, а у 20% хронических
больных развивается цирроз печени. Механизм передачи вируса гепатита С в основном
парентеральный. Лабораторная диагностика гС основана на определении антител к вирусу
гС методами ИФА или РИА.
IV. Возбудитель гепатита дельта (гепатит D). РНК-содержащий, дефектный вирус,
способный решшцироваться в организме хозяина лишь при обязательном участии вирусапомощника, роль которого выполняет вирус гВ. Оболочку вируса-дельта формирует HBs Ag.
Присоединение дельта-инфекции к гВ ведет к развитию тяжёлых злокачественных форм
болезни, хронических форм заболевания с ранним формированием цирроза печени.
Лабораторная диагностика гепатита D проводится путём обнаружения маркёров вируса гВ и
дельта-вирусной инфекции, HBs Ag, anti-HBc (Ig M) и дельта Ag. Последние тестируются
при помощи ИФА и РИА. Наибольшее диагностическое значение имеют антидельта Ig M,
которые обнаруживаются в течение всего заболевания.
V. Гепатит Е. Широко распространён в тропических и субтропических странах,
распространение заболевания происходит водным путём. Вирион диаметром 27-32 им
содержит однонитчатую РНК, по физико-химическим свойствам схож с вирусами семейства
Calicivmdae. Лабораторная диагностика основана на определении AT в сыворотке крови
ИФА.
VI. Гепатит G. Вирус гепатита G открыт в 1995 г., отнесён в семейству Flaviviridae,
передаётся парентеральным путём Размеры вириона - 20-30 нм Геном вируса представлен
однонитчатой +РНК. Белок капсида дефектный или совсем не синтезируется. Поэтому
предполагают, что вирус гепатита G для своего капсида использует или белки ещё не
открытых вирусов, или же клеточные белки. Имеются указания на наличие липидной
оболочки у вируса. Маркёр репликации вируса - его РНК. Антитела против Е 2 белка вируса
гепатита G выявляются только при отсутствии РНК вируса. Это свидетельствует, что, в
отличие от гепатита С, выявление антител при гепатите G не может быть использовано для
поиска вирусоносителей, а пригодно для регистрации уже прошедшей инфекции.
VII. Гепатит F. Вирус гепатита F открыт французскими учёными и фактически не
изучен.
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции
При диагностике ВИЧ-инфекции используется 4 группы методов:
1. Определение наличия вируса, его антигенов или копий РНК в материалах от
больного или ВИЧ-инфицированного
2. Серологическая диагностика, основанная на выявлении специфических антител к
поверхностным (gp 120 и gp 41) и внутренним (р 18 и р 24) белкам ВИЧ.
3. Выявление патогномоничнъгх (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в
иммунной системе.
4. Лабораторная диагностика оппортунистических инфекций (СПИД-ассоциированных
заболеваний).
1. Вирусологическая диагностика. Материалом для выделения ВИЧ являются Тлимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, лимфатические узлы, ткани мозга, слюна,
сперма, спинномозговая жидкость, плазма крови. Полученным материалом заражают
перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (Н9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят
по ЦПД (образование симпла-стов), а также методами иммунофлюоресценции, электронной
микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы. Современные методы
исследования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток.
Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осуществляют с
помощью моноклональнъгх антител
В последние годы решающее значение для определения прогноза и тяжести ВИЧинфекции имеет определение количества копий РНК ВИЧ в плазме крови методом
полимеразной цепной реакции (ТТЦР) - так называемая вирусная нагрузка. Если у
пациентов, не получающих терапии, вирусная нагрузка находится ниже предела
определения (это менее 5000 копий РНК ВИЧ в I мл плазмы), это свидетельствует об
отсутствии прогрессирования или о медленном прогресси-ровании. Степень заразности при
этом минимальная. Высокая вирусная нагрузка (более 10000 копий РНК в 1 мл плазмы) у
пациентов с числом СО4-лимфоцитов менее 300 в 1 мкл всегда свидетельствует о
прогрессировании болезни.
2. Серологическая диагностика. В настоящее время получила наибольшее
распространение.
Материал для исследовать: 5 мл. гепаринизированной крови, которую до доставки в
лабораторию можно хранить 6-8 часов в охлажденном, но не в замороженном состоянии.
С целью серологической диагностики СПИДа используют прежде всего методы
иммуноферментного анализа со стандартными иммуноферментными системами (ИФА). Это
скрининговый метод. Принцип работы основан на классическом принципе прямого ИФА.
Иммуносорбентом являются полистироловые планшеты с иммобилизированным
инактивированным вирусспецифиче-ским антигеном, полученным из ВИЧ, либо
синтетическим путем. Затем вносят испытуемую сыворотку в разведении. Проводят
инкубацию в лунках с антигеном. После связывания АГ с AT следует трехкратное
отмывание несвязавшихся белков, а после этого в лунки вносят коньюгат антител к
иммуноглобулинам человека с ферментной меткой. Образование специфического комплекса
АГ+АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и
перекиси водорода). В результате окраска среды меняется пропорционально количеству
антител. Результаты исследования учитывают на спектрофотометре. Сыворотки крови,
имеющие вирусспецифические антитела по данным ИФА, в дальнейшем необходимо
исследовать методом иммунного блотинга.
Иммунный блотипг является подтверждающим тестом, так как позволяет выявить
антитела к различным белкам ВИЧ. Он основан на предварительном фракционировании по
молекулярной массе (разделении) белков ВИЧ электрофорезом в полиакриламидном геле с
последующим перенесением антигенов на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем на мембрану
наносится испытуемая сыворотка. При этом специфические антитела образуют комплекс с
конкретным АГ (gp.120, gp.41, p.24, p.18). Заключительный этап исследования - выявление
антител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антитела против белков
человека, меченые ферментом или радиоизотопной меткой. Таким образом, в сыворотке
пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифические антитела ко всем или
большинству антигенов ВИЧ.
3. Исследования иммунного статуса. Направлены на выявление:
1) уменьшения соотношения CD4/CD8 клеток (в N 2 и >, при СПИДе - 0,5 и <);
2) снижения содержания CD4 клеток (<200 клеток/мл.);
3) наличия одного из лабораторных признаков, включающих анемию, лейкопению,
тромбошггопению, лимфопению;
4) повышения концентрации Ig А и Ig G в сыворотке крови;
5) снижения реакции бластгрансформации лимфоцитов на митогены;
6) отсутствие кожной реакции ГТЗ на несколько антигенов;
7) повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов.
РАЗВИТИЕ ОПУХОЛЕЙ, ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ И
ИНВАЗИЙ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
Клетки ЦНС
Т-хелперы
ВИЧ
Энцефалопатия
деменция
Нарушение
ГИО и КИО
Нарушение функции Ткиллеров
онтогенез
вирусами
 Герпес симплекс I
и II типа;
 Герпес зостер;
 Цитомегаловирус;
 Вирус ЭпштейнаБарр;
 Паповирусы.
простейшими




Пневмоцисты;
Токсоплазмы;
Криптоспоридии;
Изоспоры.
Саркома Капоши,
лимфома мозга
бактериями








Микобактерии;
Камполибактерии;
Сальмонеллы;
Шигеллы;
Легионеллы;
Микоплазмы;
Актиномицеты;
Листерии.
грибами




Кандиды;
Криптококки;
Аспергиллы;
Мукоровая
плесень;
 Гистоплазма.
гельминтами
стронгилоидоз
оппортунистические инфекции,
инвазии, вызванные