вирусология

Общая вирусология
Цель занятия: - научиться методам лабораторной диагностики
вирусных инфекций.
Знать:
- морфологию и физиологию вирусов ,
- принципы классификации
- методы культивирования вирусов,
- методы лабораторной диагностики.
- интерпретировать результаты лабораторных исследований.
Природа
вирусов и
их изучение
Вирусы - это ультрамикроскопические организмы, обладающие одним
типом нуклеиновой кислоты , лишённые систем метаболизма и
характеризующиеся внутриклеточным паразитизмом.
Открыты Д. И. Ивановским в 1892 г.
(Возбудители «табачной мозаики»)
Вирусы включены в царство Vira, которое разделено
На 2 подцарства: - рибовирусы,
- дезоксивирусы.
Подцарства делятся на: - семейства,
- роды,
- виды,
Основные свойства вирусов:
1. Ультрамикроскопические размеры.
2. Вирусы содержат нуклеиновую кислоту одного типа ДНК или РНК.
ДНК - содержащие: вирус натуральной оспы , вирус герпеса , вирус
гепатита В и др.
РНК - содержащие: вирус полиомиелита, вирус гриппа, вирус кори
вирус краснухи и др.
3. Вирусы неспособны к росту и бинарному делению.
4. Вирусы размножаются путём воспроизведения из собственной
геномной нуклеиновой кислоты только в живых клетках.
5. У вирусов отсутствуют собственные системы мобилизации энергии.
Нет белоксинтезирующих систем . В связи с этим вирусы являются
абсолютными внутриклеточными паразитами, Вирусы существуют в
двух формах: внеклеточная форма - вирион;
и внутриклеточная - вирус.
В зависимости от круга хозяев вирусы делят на:
- вирусы человека
- вирусы животных,
- вирусы растений,
- вирусы насекомых,
- вирусы бактерий.
Строение
Размеры вирионов варьируют от 15 - 18
до 300 - 400 нм. Они могут иметь разнообразную форму:
- палочковидную,
- нитевидную,
- сферическую,
- кубовидную,
- сперматозоидную.
Вирион состоит из генома (нуклеиновая кислота), окруженного одной
или двумя оболочками .
Белковая оболочка, в которой содержится геномная нуклеиновая
кислота, называется капсидом. Капсид состоит из одинаковых
белковых субъединиц - капсомеров. Число капсомеров строго
специфично для каждого вида и зависит от размеров и морфологии
вирионов. Вирусные капсиды имеют упорядоченную организацию ,в
основе которой лежат принципы спиральной или кубической симметрии
.
Основные функции капсида - защита генома от внешних воздействий и
обеспечение адсорбции и проникновения вируса в клетку. Простые
вирусы представляют собой нуклеокапсиды: они состоят из нуклеиновой
кислоты и белковой оболочки (капсида). Сложные вирусы имеют вторую
оболочку - суперкапсид, состоящую из двух слоев липидов и вирусных
белков, которые образуют на наружной поверхности шипы.
Методы культивирования вирусов.
В 1932 году Р. Гудпасчура предложил использовать для
культивирования вирусов куриные эмбрионы ( 7 - 15 дней ). Заражение
производят на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную полость
, желточный мешок , в амниотическую полость в тело зародыша.
Выбор метода заражения зависит от свойств вируса.
В 1949 году была предложена культура первичнотрипсинизированных
клеток почки обезьяны.
Культуры клеток получают после диспергирования соответствующих
органов и тканей. При помещении их на плоскую поверхность они
растут в виде монослоя, при этом используют специальные
питательные среды (среда Игла,199) .содержащие набор аминокислот,
углеводов, витамины, бычью сыворотку.
А) Первичные и вторичные культуры - это суспензии клеток
смешанного типа обладают определённой продолжительностью жизни
(2-3 недели) и не подлежат дальнейшему культивированию.
Б) Линии диплоидных клеток - пригодны к повторному
диспергированию и росту (не более 30 пассажей).
В) Перевиваемые линии - способны к многократному диспергированию
и перевиванию (Не Lа; Hер - 2).
О размножении вирусов в культурах клеток судят по их
цитопатическому действию (ЦПД).
Цитопатическое действие вирусов проявляется в виде
следующих изменений:
1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток
(полиовирусы , вирусы Коксаки).
2. Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток
(вирус гриппа).
З. Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы).
4. Крупнозернистая равномерная деструкция клеток
(вирус герпеса).
5. симластообразование (вирус кори).
О заражении вирусами клеток можно судить по изменению индикатора,
добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют
метаболизм , pH среды сдвигается в кислую сторону, и среда
окрашивается жёлтый цвет. В случае реподукции вируса клетки
погибают, рН не изменяется и среда сохраняет исходный цвет.
Широкое распространение получил метод бляшек (Р. Дюльбекко, 1952
г.), позволяющий производить количественное определение вирусов.
Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной
среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем
агара, содержащего индикатор. Флаконы инкубируют при 37 С. Через 48
- 96 часов выявляют пятна - бляшки. Они имеют диаметр, равный 1-3 мм
и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счёт
цитопатического действия вирусов.
Взаимо действие
Жизненный цикл вирусов начинается с их адсорбции
на мембране клетки - мишени и заканчивается выходом вновь
вируса с
клеткой
Методы
синтезированных вирионов из клетки.
Цикл включает следующие стадии:
1 Адсорбция - реализуется через взаимодействие со специфическими
поверхностными рецепторами.
а) Процесс адсорбции не зависит от температуры и не требует
энергетических затрат. Протекает в 2 фазы, (Iфаза - ионное притяжение
между вирусом и клеткой, носит неспецифический характер.II фаза физическое прикрепление вирусной частицы к соответствующему
поверхностному рецептору).
б) На процесс адсорбции влияет тканевая специфичность (например,
полиовирус адсорбируется только на клетках ЦНС человека).
в) « Множественность заражения » определяется количеством
инфекционных вирусных частиц, адсорбированных на клетке.
2. Проникновение вируса в клетку протекает в виде следующих
механизмов:
а) - посредствам пиноцитоза (вириопексис).
б)-с помощью протеолитических ферментов вируса, растворяющих
клеточную оболочку хозяина.
в) - посредствам слияния суперкапсида вируса с мембраной клетки
(обусловлено вирусными гликопротеинами).
3. «Раздевание» вириона - заключается в депротеинезации и
освобождении от суперкапсида и капсида.
4. Синтез вирусных частиц - включает образование нуклеиновых
кислот, ферментов, регуляторных белков. РНК - содержащие вирусы
вначале индуцируют синтез белка (с помощью и-РНК или РНК-зависимой ДНК-полимеразы ). ДНК - содержащие и двухнитевые РНК содержащие вирусы синтезируют нуклеиновые кислоты (с помощью
ДНК-зависимой РНК-полимеразы хозяина).
5. Сборка или морфогенез вириона,
Формирование вириона возможно только при строго упорядоченном
соединении вирусных структурных полипептидов и их нуклеиновой
кислоты. Это обеспечивается самосборкой белковых молекул вокруг
нуклеиновых кислот. Этот процесс может происходить в цитоплазме или
в ядре клетки хозяина.
6. Выход вирионов из клетки хозяина.
а) вирионы могут « просачиваться » через оболочку; нуклеокапсиды при
этом покрываются суперкапсидом;
б) с помощью-протеолитических ферментов;
в) « быстрое » высвобождение вирионов из клетки, которая после этого
погибает.
Взаимодействие вируса с клеткой, заканчивающееся образованием
вирусного потомства называется продуктивным. Возможен
абортивный тип взаимодействия, не завершающийся образованием
новых вирусных частиц, поскольку инфекционный процесс прерывается
на одном из этапов. И интегративный тип или вирогения,
характеризуется встраиванием - вирусной ДНК в хромосому клетки
хозяина.
1 Вирусоскопический
метод
диагностики
вирусных
инфекций
а) световая микроскопия;
Применяется для обнаружения
крупных вирусов (оспы, гриппа)
в окраске по Морозову и
внутриклеточных вирусных
включений в окраске по
Туревичу и Муромцеву.
б) электронная микроскопия;
Дает возможность обнаружить
ультраструктуру вириона.
е) метод иммунной электронной
микроскопии в основе этого метода
лежит взаимодействие антител с
вирусами при смешивании
вируссодержащего материала со
специфической сывороткой;
В результате реакции. образуется
микропреципитаты , состоящие
из вирусных частиц, покрытых
своеобразным «венчиком».
г) иммунофлюоресцентный метод
(прямой и непрямой) с
использованием
флюоресцирующих сывороток.
При положительной реакции в
люминесцентном микроскопе
наблюдается специфическое
свечение. Применяется для
экспрессдиагностики.
2. Вирусологический метод.
Этот метод основан на
культивировании вирусов с
использованием культур клеток или
куриных эмбрионов и их
последующей индикации и
идентификации.
Индикацию вирусов
осуществляют: - по характеру
специфических поражений
оболочек и тела эмбриона;
по феномену гемагглютинации;
- по цитопатическому действию
вируса (ЦПД);
- по образованию в клетках
включений;
- по образованию бляшек;
О развитии вируса
свидетельствует изменение цвета
оболочек, появление белых
бляшек ( при натуральной оспе),
гибель эмбриона.
Склеивание эритроцитов под
действием гемагглютинина вирусов.
Морфологические изменения
клеток -вплоть до их гибели .
Включения представляют собой
скопления вирусных частиц,
вирусных белков или клеточного
материала в цитоплазме или ядре
клеток.
Бляшки или негативные
«колонии» вирусов - участки
разрушенных вирусами клеток
на однослойных клеточных
культурах.
- по феномену гемадсорбции;
Клеточные культуры ,
заражённые вирусом, способны
адсорбировать на своей
поверхности эритроциты.
- по «цветной» реакции;
При репродукции вирусов в
культуре клеток нарушается их
нормальный метаболизм и среда
сохраняет свой первоначальный
цвет.
Для идентификации вирусов
используют
материал от больного ( смыв из
носоглотки), аллантоисную или
амниотическую жидкость
заражённого куриного эмбриона,
культуру клеток. Ставят реакции:
-торможения (задержки)
гемагглютинации(РТГА);'
- торможения (задержки)
гемадсорбции( РТГАд);
- связывания комплемента (РСК);
- нейтрализации (РН)
Для постановки реакций идентификации используются
специфические иммунные
сыворотки, позволяющие
определить вид, тип, вируса.
3. Серологический метод.
Применяется для обнаружения в
сыворотке крова больного
специфических противовирусных
антител в реакциях :
- РТГА;
- РТГАд;
- РСК;
- РН.
Определяют титр антител в
парных сыворотках.
В этих реакциях используются
антигены вирусов
(диагностикумы).
4. Биологический метод .
Основан на использовании
животных, чувствительных к
соответствующему вирусу.
Применяют для
культивирования, индикации и
идентификации вирусов.