Продолжение стадии синтеза белка

Процессы трансляции
Многоступенчатый матричный синтез белка, или собственно трансляцию,
протекающую в рибосоме, также условно делят на 3 стадии: инициацию,
элонгацию и терминацию.
Инициация трансляции
Стадия инициации, являющаяся «точкой отсчета» начала синтеза белка, требует
соблюдения ряда условий, в частности наличия в системе, помимо 70S (или 80S)
рибосом,
инициаторной амино-ацил-тРНК (аа-тРНК),
инициирующих кодонов в составе мРНК и
белковых факторов инициации.
Экспериментально доказано, что синтез белка инициирует единственная
аминокислота – метионин. В кодовом «словаре» имеется только один кодон для
метионина (АУГ), однако во всех живых организмах открыты две тРНК для
метионина: причем одна используется при инициации синтеза белка, другая – для
включения метионина во внутреннюю структуру синтезируемого
полипептида в стадии элонгации. Соответственно эти тРНК принято обозначать
тРНКфМет и тРНКМет. Укажем также, что эукариотическая клетка не
нуждается в формилировании метионина. У прокариот синтез Nформилметионил-тРНК протекает в две стадии:
Данную стадию катализирует метионил-тРНК-синтетаза. Реакция нуждается в
доставке энергии гидролиза АТФ.
Катализирующая II стадию трансформилаза оказалась более специфичной, чем
метионил-тРНК-синтетаза: она не формилирует ни свободный метионин, ни
метионин в комплексе с тРНКМет. Таким образом, N-формилметионил-тРНК
является первой аа-тРНК, которая определяет включение N-концевого остатка
аминокислоты и тем самым начало трансляции.
Процесс формилирования имеет важный химический и биологический
смысл: блокируя участие NН2-группы метионина в образовании пептидной
связи, он обеспечивает тем самым
1. синтез белка в направлении NH2 – СООН;
2. образовавшаяся формилметионил-тРНК, кроме того,
первой связывается с определенным участком 30S субчастицы рибосомы и с мРНК.
Необходимым условием инициации является также наличие инициирующих
кодонов, кодирующих формилметионин. У бактерий эту функцию выполняют
триплеты АУГ и ГУГ мРНК. Однако они кодируют формилметионин (или начальный
метионин в эукариотической клетке) только будучи начальными триплетами
при считывании мРНК. Если эти триплеты являются обычными, т.е. внутренними, то
каждый из них кодирует свою аминокислоту: в частности, АУГ кодирует
метионин, а ГУГ – валин.
Ясно, что начальный, инициаторный 5'-АУГ-кодон тРНК должен чем-то отличаться
от других АУГ-кодонов, возможно, структурой окружения триплета. Предполагают,
что инициаторному 5'-АУГ-кодону у прокариот предшествует сигнальная
полипуриновая (порядка от 8 до 13 оснований) последовательность (Shine–
Dalgarno sequence), которая узнается полипиримидиновой 3'-антипараллельной
последовательностью в молекуле 16S рРНК 30S субчастицы.
Допускается, кроме того, существование определенных различий во вторичной
структуре мРНК в участке инициирующего кодона, способствующих его узнаванию.
Белковые факторы инициации трансляции
К настоящему времени выяснена природа белковых факторов инициации. У
прокариоты Е. coli (см. табл. 14.1) открыты три таких инициирующих фактора,
обозначаемых
соответственно IF-1, IF-2, IF-3. Все они получены в высокоочищенном состоянии с
примерными молекулярными массами 9 000, 10 000 и 22 000 соответственно.
IF-3 обеспечивает узнавание участка на молекуле мРНК, к которому
присоединяется формилметионил-тРНК. Данный белковый фактор первым
связывается со свободной 30S субчастицей рибосомы и препятствует ассоциации
30S и 50S субчастиц в 70S рибосому без молекулы мРНК.
IF-1 способствует связыванию инициаторной формилметионил-тРНК с комплексом
30S субчастицы и мРНК.
IF-2, вероятнее всего, способствует объединению 30S и 50S субчастиц после того,
как на первой субчастице уже присутствуют инициирующие кодоны мРНК, Nформилметионил-тРНК, IF-3, IF-1 и ГТФ. Этот белок рассматривают как фактор
стабилизации всего инициаторного 70S комплекса (см. далее).
Рис. 14.5. Схематическое изображение взаимодействия формилметионил-тРНК
и мРНК с 30S субчастицей рибосомы (а) и транслирующей (функционально
активной) 70S рибосомой (б).
Аналогичные белковые факторы инициации обнаружены и в эукариотических
клетках. Открыто около 10 эукариотических белковых факторов инициации (см.
табл. 14.1), их принято обозначать eIF. Все они, по-видимому, важны для
инициации, однако только три из них абсолютно необходимы и существенны для
белкового синтеза: eIF-2, eIF-3 и eIF-5.
Они получены в чистом виде: eIF-2 состоит из альфа; бетта-, гамма;- -субъединиц
(мол. масса 38000, 47000 и 50000 соответственно), eIF-3 (мол. масса 500000–
700000) и eIF-5 (мол. Масса 125000).
Укажем также, что в синтезе белка их роль тождественна роли инициаторных белков
у прокариот. Отличительной особенностью синтеза белка у эукариот является,
кроме того, наличие среди 10 белковых факторов инициации еще одного белка,
названного кэп-связы-вающим.
Соединяясь с 5'-участком кэп мРНК, этот белок содействует образованию комплекса
между мРНК и 40S рибосомной субчастицей. Необходимо отметить, что до сих пор
не раскрыты тонкие молекулярные механизмы участия белковых факторов
инициации как у про-, так и у эукариот в сложном процессе синтеза белка.
Образование инициаторного комплекса
Экспериментально доказано, что в процессе белкового синтеза наблюдаются
постоянная диссоциация 70S рибосом на 30S и 50S субчастицы и последующая их
реассоциация. Сначала образуется инициаторный комплекс путем присоединения
белковых факторов, формилметионил-тРНК и ГТФ к 30S субчастице, к которой
комплементарно антикодону формилметионил-тРНК присоединяется мРНК при
участии кодона АУГ (рис. 14.5).
Следует указать на особую роль формилметионил-тРНК: она помогает мРНК
найти на 30S субчастице определенное местоположение, обеспечивающее точную
трансляцию информации о последовательности аминокислот в полипептидной
цепи (установление рамки).
Как только мРНК присоединяется к комплексу, высвобождается белковый фактор IF3 и оставшийся комплекс легко присоединяет 50S субчастицу, образуя
транслирующую, т.е. функционально активную, 70S рибосому. В процессе этих
перестроек рибосомы освобождают остальные белковые факторы инициации и
продукты гидролиза ГТФ (ГДФ и неорганический фосфат), энергия которого
расходуется, по-видимому, на формирование инициирующего 70S комплекса
рибосомы. В этом комплексе формилметионил-тРНК оказывается прикрепленной к
пептидилсвязывающему центру рибосомы. В гидролизе ГТФ принимает участие IF2. У образовавшейся активной, полностью сформировавшейся 70S рибосомы,
содержащей формилметио-нил-тРНК, оказывается свободным аминоацильный
центр, который может реагировать с определенной аа-тРНК, соответствующей
очередному кодону мРНК. С этого момента начинается II этап синтеза белка –
элонгация.
Рис. 14.6. 50S субчастица рибосомы с двумя центрами связывания тРНК.
Элонгация трансляции
Процесс элонгации полипептидной цепи у Е. coli начинается с образования первой
пептидной связи и непосредственно, точнее топографически, связан с большой
субчастицей (50S) рибосомы, содержащей два центра для связывания тРНК: один
из них называется аминоацильным (А), другой – пептидильным (П) (рис. 14.6).
В процессе элонгации у Е. coli также участвует три белковых фактора –
элонгационные факторы трансляции, сокращенно обозначаемые Tu, Ts и G (см.
табл. 14.1): EF-Tu (мол. масса 43000), EF-Ts (мол. масса 35000) и EF-G (мол.
масса 80000).
У эукариот также открыты три таких фактора, названных эукариотическими
элонгационными факторами трансляции и обозначаемых соответственно eEF1альфа; (мол. масса 53000), eEF-1альфа бетта (мол. масса 30000) и eEF-2; почти
все они получены в чистом виде, для ряда из них установлена первичная структура.
Процесс элонгации принято делить на 3 стадии:
1 узнавание кодона и связывание аминоацил-тРНК,
2 образование пептидной связи и
3 транслокация.
На I стадии в соответствии с природой кодона мРНК в свободный А-участок
рибосомы доставляется аминоацил-тРНК при участии фактора элонгации Tu.
Этот процесс требует затраты энергии и сопряжен с гидролизом ГТФ и
образованием прочно связанного комплекса Тu– ГТФ. Образовавшийся комплекс
подвергается диссоциации только в присутствии второго фактора элонгации
Ts, при котором освободившийся фактор Tu может вновь, соединяясь с
молекулой ГТФ, принять участие в доставке аа-тРНК в рибосому.
Таким образом, в транслирующей 70S рибосоме в пептидильном центре
располагается формилметионил-тРНК, а в А-центре – аминоацил-тРНК (первая
аминокислота после метионина).
С этого момента начинается II стадия элонгации – образование первой пептидной
связи. Для этого в рибосоме осуществляется ферментативная реакция
транспептидирования между формилметионил-тРНК в
П-центре и новой аа-тРНК в А-центре.
В процессе этой реакции остаток формилметионина переносится на свободную
NH2-группу аа-тРНК и замыкается первая пептидная связь в будущей
полипептидной цепи. Параллельно из пептидильного центра освобождается
тРНКфМет в цитозоль. Фермент, катализирующий реакцию транспептирования,
получил название пептидил-трансферазы (рис. 14.7); он, вероятнее всего, является
составной частью белков 50S субчастицы. Таким образом, в процессе
транспептидазной реакции в А-центре образуется дипептидил-тРНК, а П-центр
остается свободным («вакантным»).
На III стадии процесса элонгации необходимо иметь свободный амино-ацильный
центр для присоединения следующей аа-тРНК. Для этого благодаря процессу
транслокации образовавшийся фрагмент дипептидил-тРНК переносится от
аминоацильного на пептидильный центр. Достигается транслокация благодаря
передвижению рибосомы относительно мРНК при участии фермента транслоказы
(функцию ее выполняет фактор элонгации G у Е. coli и eEF-2 у эукариот) за
счет использования энергии распада еще одной молекулы ГТФ.
В результате транслокации дипептидил-тРНК занимает место в пептидильном
центре рибосомы, а аминоацильный центр освобождается для нового цикла
узнавания и может присоединить новую следующую аа-тРНК, соответствующую
кодону мРНК. В процессе транслокации рибосома перемещается вдоль мРНК по
направлению к ее 3'-концу на расстояние в один кодон, т.е. точно на один триплет.
Рис. 14.7. Перенос фМет-тРНК между двумя центрами (П и А) на большой 50S
субчастице рибосомы.
Таким образом, на стадии элонгации происходит последовательное наращивание
полипептидной цепи по одной аминокислоте в строгом соответствии с
последовательностью триплетов (кодонов) в молекуле мРНК.
Существенным является выяснение вопроса о количестве энергии, необходимой
для синтеза одной пептидной связи при биосинтезе белка. Как было отмечено,
при активировании аминокислоты еще до стадии инициации, т.е. при формировании
аа-тРНК, расходуется энергия распада АТФ на АМФ и пирофосфат, что
приблизительно эквивалентно гидролизу 2 молекул АТФ до 2 молекул АДФ,
поскольку пирофосфат подвергается распаду на 2 молекулы неорганического
фосфата. Для включения амино-ацил-тРНК в аминоацильный центр используется
энергия гидролиза молекулы ГТФ на ГДФ и неорганический фосфат. Наконец,
транслокация транслирующей 70S рибосомы также нуждается в энергии гидролиза
еще одной молекулы ГТФ. Таким образом, энергетические потребности синтеза
каждой пептидной связи эквивалентны энергии гидролиза 2 молекул АТФ и 2
молекул ГТФ (т.е. гидролиз четырех макроэргических фосфатных связей) до
соответствующих нуклеозиддифосфатов. Легко представить, насколько велики
энерготраты каждой клетки при синтезе не только одной молекулы белка, а
множества молекул самых разнообразных белков в единицу времени.
Рис. 14.8. Процесс элонгации полипептидной цепи (схема).
Терминация трансляции
На IV стадии биосинтеза белка завершается синтез полипептидной цепи в 70S
рибосоме при участии трех белковых факторов терминации (рилизинг-факторов).
Эти белки обозначаются RF-1 (мол. Масса 47000), RF-2 (мол. масса 35000–48000)
и RF-3 (мол. масса 46000) у прокариот (см. табл. 14.1). В клетках животных открыт
один-единственный белок с аналогичным свойством – рилизинг-фактор R (eRF,
мол. Масса 56000–105000). У Е. coli RF-1 наделен свойством узнавания в молекуле
мРНК терминирующих кодонов УАГ и УАА , a RF-2 – соответственно УГА и УАА.
Эукариотический рилизинг-фактор eRF узнает все три терминирующих кодона
(нонсенс-кодоны) и индуцирует освобождение синтезированного полипептида
опосредованно через пептидил-трансферазу. После того как терминирующий
кодон мРНК занимает свое место в аминоацильном центре рибосомы, к нему
присоединяется не тРНК, поскольку отсутствуют соответствующие антикодоны
тРНК, узнающие этот терминальный сигнал, а один из белковых факторов
терминации и блокируется далнейшая элонгация цепи. Считают, что
терминирующие
кодоны
и
белковые
факторы
индуцируют
изменение
специфичности пептидилтрансферазной активности таким образом, что она
катализирует перенос растущей пептидной цепи, скорее, к молекуле воды, вызывая
гидролиз, чем к аминогруппе аминокислоты.
Следствием этого являются отделение белковой молекулы от рибосомы и
освобождение молекул тРНК и мРНК (последняя подвергается распаду до
свободных рибонуклеотидов).
Одновременно 70S рибосома диссоциирует на две субчастицы – 30S и 50S,
которые поступают в свободный пул и могут вновь использоваться для
реассоциации новой рибосомы.
Схематически этот процесс представлен на рис. 14.9. ГТФ в терминации трансляции
у Е. coli рассматривается в качестве аллостерического регулятора, а у эукариотов
ГТФ, вероятнее всего, распадается на ГДФ и Pi.
Рис. 14.9. Процесс терминации синтеза белка (схема).
Рис. 14.10. Схематическое изображение роли разных типов РНК в синтезе
белка (по Уотсону).
Рис. 14.11. Схематическое изображение организации бактериальной
полирибосомы (полисомы) и движения рибосом вдоль мРНК.
В общей форме зависимость между репликацией ДНК, транскрипцией и
трансляцией мРНК представлена на рис. 14.10. Видно, что одна матричная
мРНК транслируется не одной рибосомой, а одновременно многими рибосомами,
расположенными близко друг к другу. Подобные скопления рибосом на мРНК
получили название полирибосом, или полисом (рис. 14.11). Они значительно
повышают эффективность использования мРНК, т.е. ускоряют синтез белка.
Рибосомы движутся в направлении 5' –> 3' вдоль цепи мРНК, причем каждая
рибосома работает самостоятельно, синтезируя отдельный белок. Полисома, таким
образом, позволяет обеспечить высокую скорость трансляции единственной мРНК
(см. рис. 14.11).