На правах рукописи Зимников Виталий Иванович

На правах рукописи
Зимников Виталий Иванович
Разработка и применение препарата мастицеф для лечения
мастита у коров в период лактации
06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией
06.02.06 – ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата ветеринарных наук
Воронеж - 2011
2
Работа выполнена в отделах фармакологии, патологии воспроизводства
и молочной железы ГНУ Всероссийский НИВИ патологии, фармакологии и
терапии Россельхозакадемии.
Научные руководители:
доктор биологических наук
Востроилова Галина Анатольевна
доктор ветеринарных наук
Климов Николай Тимофеевич
Официальные оппоненты:
доктор ветеринарных наук, профессор
Попов Леонид Кириллович
кандидат биологических наук
Бобкин Виктор Викторович
Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Саратовский
аграрный университет имени Н.И. Вавилова».
государственный
Защита состоится «__»
2011 г в
часов на заседании
диссертационного совета ДМ 006.004.01 при ГНУ Всероссийский научноисследовательский ветеринарный институт патологи, фармакологии и
терапии Россельхозакадемии по адресу: 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова,
д. 114-б.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.
Автореферат разослан « 22 » сентября 2011г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Т.И. Ермакова
3
1. Общая характеристика работы
1.1. Актуальность темы. В обеспечении потребностей населения
страны в продуктах питания животного происхождения важное место
отводится молочному скотоводству. Среди многих проблем данной отрасли
животноводства достаточно актуальной остается проблема воспаления
молочной железы или мастит, ведущий к снижению санитарных и
технологических качеств молока и недополучению 15-20% годового удоя
(М.Г. Миролюбов, 1988; В.Я. Никитин, 1988; А.Я. Батраков, 1991;
В.И. Слободяник, 1994; Г.Н. Кузьмин, 1995; Л.Д. Демидова, 1998;
Л.К. Попов, 1998; В.П. Родин, 1998; Н.Г. Гасанов, 1999; В.А. Париков с
соавт., 2000; В.И. Слободяник с соавт., 2009; И.Г. Конопельцев,
В.Н. Шулятьев, 2010).
В возникновении и распространении заболеваний молочной железы у
коров большую роль играют факторы снижающие резистентность молочной
железы и организма в целом (Сапожникова Н.А., 1992; В.И. Слободяник,
1994-2000; И.А. Родин, 1998), на фоне которых проявляет своё действие
патогенная и условно-патогенная микрофлора (В.М. Карташова,
А.И. Ивашура, 1988; В.М. Ивченко, 1991; Г.Н. Кузьмин, 1995; В.М. Багманов,
2005; P.F. Dominigues, et al, 1991; A. Dentz, W. Obritzhanser, J.Kefor, 1998;
L.F. Calvinho, et al, 1998; S. Janosi, Z. Baltay, 2004; D.P. Berry, 2005).
В последние годы в нашей стране и за рубежом ведутся интенсивные
работы по созданию лекарственных средств антимикробного и
противовоспалительного действия для лечения различных форм мастита у
лактирующих и профилактики мастита у сухостойных животных.
Однако, это не привело к существенному снижению заболеваемости
коров маститом. Разрабатываемые и применяемые противомаститные
препараты в большинстве своём быстро теряют активность из-за
приобретения микроорганизмами устойчивости к ним, провоцируют развитие
мастита грибковой этиологии, длительное время выделяются с молоком и
имеют другие побочные эффекты.
В этих условиях вполне закономерен интерес к разработке новых
высокоэффективных, быстро выводимых из организма и молочной железы
коров антимикробных препаратов.
1.2. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилась
разработка нового антибактериального препарата для лечения мастита у
лактирующих коров на основе двух антибактериальных средств обладающих
синергидным действием.
В соответствии с этим на разрешение были поставлены следующие
задачи.
1. Разработать новый антибактериальный препарат для лечения мастита
у лактирующих коров. Изучить его антимикробную активность в отношении
потенциальных возбудителей мастита.
2. Определить фармако-токсикологические свойства мастицефа.
4
3. Выявить оптимальную терапевтическую дозу и схему использования
препарата для лечения коров, больных маститом в период лактации.
4. Провести производственные испытания препарата мастицеф при
различных формах воспаления вымени у коров.
1.3. Научная новизна. Разработан новый препарат антимикробного и
противовоспалительного действия для лечения мастита у коров в период
лактации. Впервые изучена антимикробная активность препарата, его
фармако-токсикологические свойства, влияние на клинико-биохимические
показатели животных. Установлены пути и срок выведения препарата из
организма коров. Определена лечебная эффективность мастицефа при
различных формах мастита у коров, дана экономическая оценка
эффективности его применения.
1.4. Практическая значимость и реализация результатов
исследований. На основании результатов проведенных исследований
разработан и предложен производству эффективный комплексный препарат с
широким спектром антимикробного действия для лечения мастита у коров в
период лактации. Материалы исследований вошли в проект нормативную
документацию и «Методическое пособие по профилактике бесплодия у
высокопродуктивного молочного скота» (Воронеж, 2010).
1.5. Апробация результатов исследования. Основные положения
диссертации доложены и обсуждены на 1-ом съезде ветеринарных
фармакологов России «Достижения ветеринарной науки – на вооружение
практическому животноводству» (Воронеж, 2007); Международной научнопрактической
конференции
«Актуальные
проблемы
повышения
эффективности
агропромышленного
комплекса»
(Курск,
2008),
Международной научно-практической конференции, посвящённой 100летию со дня рождения проф. В.А. Акатова «Современные проблемы
ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животных» (Воронеж,
2009), II Сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы
ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2010), Международной научнопрактической конференции «Современные проблемы диагностики, лечения и
профилактики болезней животных и птиц» (Екатеринбург, 2010),
Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию
ГНУ ВНИВИПФиТ «Актуальные проблемы болезней обмена веществ у
сельскохозяйственных животных в современных условиях» (Воронеж, 2010).
1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11
научных работ, в том числе в 5 ведущих рецензируемых научных журналах,
рекомендованных перечнем ВАК РФ.
1.7. Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 128
страницах текста в компьютерном исполнении, включает обзор литературы,
материал и методы исследований, результаты собственных исследований и
их анализ, выводы, практические предложения, список литературы,
содержащий 322 источника, в том числе 84 зарубежных авторов.
Диссертация содержит 28 таблиц и 4 рисунка.
5
1.8. На защиту выносятся следующие основные положения
диссертации:
- антимикробная активность нового комплексного препарата для
лечения мастита у коров в период лактации;
- фармако-токсикологические свойства мастицефа и его влияние на
организм и молочную железу лактирующих коров;
- терапевтическая эффективность применения мастицефа при мастите у
лактирующих коров.
2. Материалы и методы исследований
Работа выполнена в 2006-2010 гг. в отделах фармакологии, патологии
воспроизводства и молочной железы и в других подразделениях института, а
также в ООО «Агротех-Гарант» Нащекино и Верхне Тойденский, ООО «СП
Вязноватовка» Воронежской области.
Для изучения степени распространения мастита у лактирующих коров
проведено клиническое обследование 1368 животных. Диагноз на
заболевание устанавливали в соответствии с «Наставлением по диагностике,
терапии и профилактике мастита у коров» (М., 2000).
Этиологическую структуру мастита изучили на основании результатов
бактериологического исследования секрета вымени от 37 коров, больных
маститом, с использованием классических методов.
Чувствительность выделенных культур к антимикробным средствам
определяли методом индикаторных бумажных дисков. Патогенность
выделенных микроорганизмов определяли с помощью постановки биопробы
на белых мышах.
Изучение антимикробной активности мастицефа и оптимального
соотношения цефотаксима натриевой соли и неомицина сульфата в
препарате проводили in vitro методом серийных разведений (Б.И. Антонов с
соавт., 1986; В.Ф. Ковалёв с соавт., 1988). В качестве тест-культур
использовали музейные и полевые штаммы микроорганизмов − возбудителей
мастита,
типированных
по
морфологическим,
тинкториальным,
культурально-биохимическим свойствам.
Оптимальное соотношение цефотаксима и неомицина определяли путем
сравнения антимикробной активности изучаемых композиций с таковой у
составляющих его компонентов.
Минимальную
бактериостатическую
концентрацию
определяли
методом серийных разведений в МПБ, а минимальную бактерицидную
концентрацию – путем высева из пробирок с прозрачной средой на плотные
питательные среды. При определении чувствительности стрептококков к
среде добавляли 1% глюкозы.
Изучение острой и хронической токсичности мастицефа проводили
общепринятыми методами (Беленький М.П., 1963; Саноцкий И.В., 1970;
Елизарова О.Н., 1971) на половозрелых конвенциональных нелинейных
6
разнополых белых мышах с массой тела 18-20 г (n=144) и белых крысах
(n=156) с массой тела 160-210 г.
Общетоксическое действие препарата оценивали по динамике массы
тела животных при взвешивании 1 раз в неделю, гематологическим
показателям и состоянию системы гомеостаза – по окончании курса
инъекций и через неделю восстановительного периода.
Гематологические исследования проведены по общепринятым
методам, биохимические – в соответствии с «Методическими указаниями по
применению унифицированных биохимических методов исследований
крови, мочи и молока в ветеринарных лабораториях» (М., 1981).
Раздражающее действие препаратов на кожу изучали на кроликах
методом кожных и конъюнктивальных проб, а его аллергенные свойства
определяли с помощью кожно-провокационной пробы (О.Л. Алексеева,
Л.А. Дуева, 1978).
Определение оптимальной терапевтической дозы мастицефа провели на
57 коровах, больных катаральным маститом, разделенных по принципу
аналогов на три группы. Животным первой группы (n=18) во все доли
вымени интрацистернально вводили мастицеф в дозе 3 мл, второй (n=20) –
5 мл, третьей (n=19) – 7 мл. Результаты испытаний учитывали по количеству
выздоровевших коров.
Влияние мастицефа на молочную железу лактирующих коров изучено
на 8 клинически здоровых коровах на 3-5 месяце лактации.
Морфологический анализ крови проводили на гематологическом
анализаторе «АВХ Micros 60», биохимичeские исследования крови – на
анализаторе
«Hitachi-902»
в
соответствии
с
«Методическими
рекомендациями по диагностике, терапии и профилактике нарушений обмена
веществ у продуктивных животных» (М., 2007). Определение
микроэлементов проводили на атомно-адсорбционном спектрофотометре6500 в соответствии с инструкцией к прибору.
Исследования по определению сроков нахождения компонентов
мастицефа (цефотаксима натриевой соли и неомицина сульфата) в секрете
молочной железы, крови и моче провели на 3 лактирующих коровах.
Исследования провели через 1, 2, 3 и 4 суток после четырехкратного
введения мастицефа. Определение содержания цефотаксима натриевой соли
и неомицина сульфата проводили микробиологическим методом диффузии в
агар. Тест-микробами служили Васillus subtils вариант АТСС-6633 и Васillus
cereus var. mycoides 537 (шероховатая форма). При проведении исследований
руководствовались
«Методическими
указаниями
по
определению
остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства» № 304984 от 29.06.84.
Терапевтическая эффективность нового комплексного препарата в
сравнении с отечественным препаратом диеномаст и импортным - мастилекс
определена на 65 коровах, больных субклиническим маститом, 59 катаральным и 56 - гнойно-катаральным маститом. Мастицеф вводили в дозе
5 мл один раз в сутки в течение 3-4 дней, диеномаст и мастилекс - согласно
наставлению по их применению.
7
Оценка эффективности лечения осуществлялась путем клинического
обследования молочной железы, количественного определения соматических
клеток в молоке и постановки пробы отстаивания.
Производственная оценка эффективности мастицефа проведена на 180
больных маститом коровах (63 - субклиническим, 60 - клинически
выраженным катаральным, 57 - гнойно-катаральным).
Расчет экономической эффективности нового препарата сделан в
соответствии с Методикой определения экономической эффективности
ветеринарных мероприятий» (Ф.Ф. Белоусов, В.А. Чулков, 1984).
Статистическая обработка полученных результатов исследований
проведена общепринятыми методиками (Меркурьев, 1964). Результаты
исследований подвергали математической обработке с использованием
программ «Winstat 557» и «ExStat».
Бактериологические исследования секрета вымени проводили совместно
с сотрудниками лаборатории диагностики инфекционных и инвазионных
болезней (зав., доцент Л.И. Ефанова), изучение антимкробной активности
препарата мастицеф - совместно с сотрудниками лаборатории
стандартизации лекарственных средств (зав., д.б.н. Г.Н. Близнецова),
морфологические и биохимические исследования крови - совместно с
сотрудниками лаборатории физико-химических методов исследования (зав.,
кандидат биологических наук В.И. Шушлебин), которым автор выражает
искреннюю признательность.
Научные исследования проведены в соответствии с планом научноисследовательских работ ГНУ Всероссийский НИВИ патологии,
фармакологии и терапии по теме 08.04.02. «Разработать новые экспресстесты и терапевтические препараты для эффективной системы мероприятий
по диагностике, профилактике и терапии болезней органов размножения и
молочной железы у коров и свиней, обеспечивающей снижение бесплодия
маточного поголовья, получение жизнеспособного приплода и производство
продукции высокого санитарного качества» (№ гос. регистрации
15070.3666026906.06.8.002.3).
3. Результаты исследований
3.1. Распространение и этиологическая структура мастита у коров
Установлено (табл.1), что в обследованных хозяйствах в течение года
маститом переболевает 51,9%-54,5% коров. В целом, из 1368 обследованных
животных мастит диагностирован у 723 коров, что составляет 52,8%. При
этом субклинический мастит диагностирован у 43,3%, а клинически
выраженный - у 9,5% коров, из которых серозный у – 1,9%, катаральный у 4,8% и гнойно-катаральный у – 2,8% животных.
Следовательно, в хозяйствах с промышленной технологией получения
молока в течение года маститом переболевает в среднем 52,8% коров, в
основном в субклинической форме.
8
Таблица 1
Распространение и формы проявления мастита
Обследовано
коров
Всего
больных
коров
423
223
343
187
602
313
1368
723
%
субклинический
коров
%
Формы мастита
клинически выраженный
серозный
катаральный
коров
%
коров
%
ООО «Агротех-Гарант» Нащекино
52,7
198
46,8
4
0,9
13
3,1
ООО «Агротех-Гарант» Верхне Тойденский
54,5
142
41,4
10
2,9
21
6,1
ООО «СП Вязноватовка»
51,9
253
42,1
13
2,1
31
5,1
Всего
52,8 593
43,3 27
1,9
65
4,8
гнойно- катаральный
коров
%
8
1,9
14
4,1
16
2,6
38
2,8
При микробиологическом исследовании 37 проб секрета вымени из
пораженных долей молочной железы больных маститом коров было
выделено 57 культур микроорганизмов, которые в 60,8% случаев
представлены грамположительными кокками, в 33,3% – представителями
семейства Enterobacteriaceae и Ps. aeruginosa и 5,9% - грибами рода кандида.
Монокультуры выделены из 21 пробы секрета вымени в том числе,
Staphylococcus aureus - 16,3%, Staphylococcus epidermidis - 13,5%,
Streptococcus agalactiae - 5,4%, Streptococcus dysgalactiae - 10,8%, Enterococcus
faecium - 2,7%, E. coli - 5,4%, Micrococcus - 2,7%.
Культуры микроорганизмов в ассоциации выделены из 14 проб секрета
молочной железы, среди них, Staphylococcus aureus + Ps. aeruginoza - 13,5%,
Staphylococcus aureus + Enterococcus faecalis - 2,7%, Staphylococcus aureus + E.
сoli + Enterococcus faecalis - 5,4%, Staphylococcus aureus + E. сoli +
Enterococcus faecalis + Сandida - 5,4%, Staphylococcus saproph. + Ps. аeruginosa
- 8,1%, E. coli + Enterococcus faecalis - 2,7%.
Из 2 (5,4%) проб секрета вымени микрофлора не выделена.
Представленные данные также свидетельствуют о том, что
микрофлора, выделяемая из секрета пораженных долей в хозяйствах
различная. В одних хозяйствах молочная железа коров инфицирована в
большей степени стафилококками или стрептококками, в других преобладает
смешанная микрофлора.
Установлено, что выделенная микрофлора была высокочувствительна к
амоксициллину, цефотаксиму, доксициклину, неомицину, энрофлоксацину; в
меньшей степени - гентамицину, норфлоксацину, левомицетину,
линкомицину, тетрациклину, эритромицину, фурагину, рифампицину,
стрептомицину, пеницилину, ампицилину; выделенные культуры оказались
устойчивы к канамицину и фуразолидону.
Таким образом, микрофлора, выделенная из секрета пораженных долей
молочной железы, больных маститом коров, в основном (60,8%)
9
представлена грамположительными кокками, обладающими множественной
лекарственной устойчивостью к антимикробным средствам. Поэтому, при
создании высокоэффективных препаратов, предназначенных для терапии и
профилактики мастита у коров в их состав необходимо включать несколько
антимикробных средств, обладающих разным механизмом антимикробного
действия и взаимоусиливающим (синергидным) эффектом.
3.2. Разработка нового антибактериального препарата для лечения
мастита у коров в период лактации
3.2.1. Оптимальное соотношение компонентов в препарате
Антимикробная активность цефотаксима и неомицина в отдельности и
в виде различных соотношений изучена методом серийных разведений.
Установлено (табл. 2), что минимальная бактериостатическая концентрация
цефотаксима в отношении Staph. аureus 209 Р и E. coli 0137 составила 0,78
мкг/мл, Str. аgalactiae 586 - 1,56 мкг/мл, а неомицина сульфата
соответственно - 3,12; 6, 25 и 1,56 мкг/мл.
Таблица 2
Антимикробная активность цефотаксима, неомицина и различных
композиций, мкг/мл
Цефотаксим
0,78
1,56
0,78
Минимальная бактериостатическая концентрация
Неомицин
Композиция 1
Композиция 2
(6,5:1)
(7:1)
Staph. аureus 209 Р
3,12
1,56
0,39
Str. аgalactiae 586
6,25
0,39
0,39
E. coli 0137
1,56
0,78
0,39
Композиция 3
(7,5:1)
0,78
0,78
0,78
Наиболее выраженным антимикробным действием обладала вторая
композиция (цефотаксим - немицин 7:1), минимальная бактериостатическая
концентрация которой в отношении Staph. аureus и E. coli 0137 снизилась в 2
раза, Str. аgalactiae 586 – в 4 раза по сравнению с таковой у цефотаксима, а по
отношению к неомицину в 8 раз - в отношении Staph. аureus, в 16 раз - в
отношении Str. аgalactiae и в 4 раза - в отношении E. coli 0137.
Обоснованность данной композиции обусловлена тем, что в данной
лекарственной форме сочетаются два антимикробных компонента с
различным спектром и механизмом антимикробного действия. Это
обеспечивает синергидный эффект за счет того, что оба компонента
действуют в одну фазу клеточного роста, но на разные метаболические пути.
На основе композиции 2 был разработан новый антимикробный
препарат для лечения мастита у лактирующих коров, получивший название
10
мастицеф, содержащий: цефотаксим - 7,0%, неомицин - 1,0%, преднизолон 0,2%, эмульгатор - 3,0%, моноглицерид - 1,0%, масло вазелиновое до 100,0.
3.2.2. Антимикробная активность препарата мастицеф
При проведении бактериологических исследований в качестве тесткультуры использовали микроорганизмы, выделенные из секрета больных
маститом коров, а также музейные штаммы. Бактериостатическое действие
комбинации лекарственных средств определено методом серийных
разведений в мясопептонном бульоне, с последующей 18–24-часовой
инкубацией в термостате. Результаты опытов представлены в таблице 4.
Таблица 3
Антимикробная активность препарата мастицеф и его компонентов в
отношении основных возбудителей мастита, мкг/мл
№
п/п
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Культура микроба
Staphylocоccus aureus 209Р
Staphylocоccus aureus 9015
Staphylocоccus epidermidis 506
Streptococcus agalactiae 587
Streptococcus agalactiae 588
Streptococcus dysgalactiae 833
Streptococcus dysgalactiae 842
Echerichia coli 0137
Echerichia coli 139
Enterococcus faecalis 2894
Цефотаксим
МБсК МБцК
0,78
1,56
1,56
3,12
0,78
1,56
1,56
12,5
3,12
6,25
0,78
1,56
1,56
3,25
6,25
12,5
1,56
12,5
6,25
12,5
Неомицин
МБсК МБцК
3,12
6,25
3,12
6,25
6,25
12,5
6,25
12,5
6,25
12,5
6,25
12,5
3,12
6,25
0,78
3,12
25,0
50,0
3,12
6,25
Мастицеф
МБсК МБцК
0,39
0,78
0,39
0,78
0,39
0,78
0,39
0,78
0,78
1,56
0,39
0,78
0,78
1,56
0,78
1,56
1,56
3,12
0,39
0,78
Как видно из представленных данных, препарат мастицеф обладает
широким спектром и высоким антимикробным действием в отношении
потенциальных
возбудителей
мастита.
Его
бактериостатическая
концентрация для кокковой микрофлоры составила 0,39-0,78 мкг/мл, в
отношении эшерихий - 0,78-1,56 мкг/мл.
Бактерицидная концентрация мастицефа в отношении изученных
культур превышала бактериостатическую в 2 раза.
3.3. Изучение параметров токсичности мастицефа
Острая токсичность. Определение параметров острой токсичности
препарата в остром опыте проведено при однократном пероральном и
подкожном введении мастицефа на белых мышах с массой тела 18-20 г и
белых крысах с массой тела 190-210 г.
Пероральный способ введения. Препарат вводили однократно внутрь в
дозах от 6000,0-30000,0 мг/кг массы тела в объеме для белых мышей - 0,6 мл,
для белых крыс - 6 мл. Высшие дозы для белых мышей и белых крыс свыше
11250 мг/кг вводили в два приема, по половине дозы с интервалом 2 часа.
11
Объем раствора препарата, вводимого животным, доводили до необходимого
количества, путем добавления к препарату 1%-ного раствора крахмала.
При внутрижелудочном введении мастицефа в изученных дозах за весь
период наблюдения (14 дней) гибели животных не отмечено.
Патоморфологическое изучение по окончании эксперимента не
выявило нарушений в структурной организации внутренних органов.
Среднелетальную дозу - LD50 при внутрижелудочном введении для
мастицефа определить не удалось, так как при введении препарата внутрь в
максимально возможных объемах (0,6 мл - белым мышам и 6,0 мл - белым
крысам с двукратным введением) в дозах: от 6000,0 до 30000,0 мг/кг массы
тела, не отмечено развития клинических признаков интоксикации и гибели
животных.
Подкожный способ введения. Для изучения острой токсичности
мастицефа при подкожном введении препарат вводили однократно в дозах от
6000,0 до 12000,0 мг/кг массы тела в объеме 0,5 мл на мышь и 5,0 мл на
крысу.
В результате проведенных исследований установлено, что при
подкожном введении препарата в исследуемых дозах не отмечено гибели
лабораторных животных.
Патоморфологическое изучение по окончании эксперимента, не
выявило нарушений в структурной организации внутренних органов.
LD50 препарата при подкожном способе введения определить также не
удалось, так как при введении мастицефа в максимально допустимом для
этих животных объеме, в дозах от 6000,0 до 12000,0 мг/кг массы тела не
отмечалось гибели животных или развития клинических признаков
интоксикации. Мастицеф по степени воздействия на организм согласно
ГОСТ 12.1.007 отнесен к малоопасным веществам (IV класс опасности).
Хроническая токсичность. Изучение хронической токсичности
мастицефа провели на белых крысах самках с массой тела 160-180 г при
подкожном введении препарата в течение 14 дней.
Установлено, что многократное (в течение 14 дней) подкожное
введение препарата в дозах 600,0 и 1200,0 мг/кг не вызывало существенных
изменений в клиническом состоянии животных. При изучении хронической
токсичности в опытных и контрольной группах на протяжении всего опыта
гибели белых крыс не регистрировали. Не выявлено существенных различий
в потреблении воды и пищи. Мастицеф не вызывал изменений в
поведенческих реакциях, реакциях на внешние раздражители, а также
нарушений в двигательной активности животных.
В результате проведенных исследований установлено, что
относительная масса внутренних органов крыс, которым применяли
препарат, существенно не отличались от контроля.
При патоморфологическом исследовании крыс не обнаружено
патологических отклонений, обусловленных токсическим действием
препарата, в паренхиматозных органах (печень, почки, легкие, сердце), во
12
всех отделах желудочно-кишечного тракта, железах внутренней секреции
(гипофиз,
надпочечники,
щитовидная
железа),
кроветворных
и
иммунокомпетентных органах (костный мозг, селезенка, тимус,
лимфатические узлы).
Не отмечено достоверных изменений в морфологическом составе
крови, биохимических показателях по сравнению с показателями в крови
животных контрольной группы.
Кожно-резорбтивное раздражающее действие. Опыты по изучению
раздражающего действия мастицефа были проведены на кроликах массой
2,4-2,6 кг породы белый великан. Количество животных в опытной и
контрольной группах составляло по 6 особей. Исследуемый препарат
наносили в «чистом» виде.
Однократное применение. Установлено, что при однократной
аппликации на кожные покровы кролика при плотности нанесения от 0,020
до 0,10 г/см2 мастицеф не вызывает повреждение кожи в виде эритемы или её
отёков.
С целью установления влияния препарата на глаз кролика, в
конъюнктивальный мешок левого глаза животных закапывали пипеткой по 2
капли подогретого до 400С препарата. Правый глаз у кроликов служил
контролем, в конъюнктивальный мешок которого препарат не вносили.
В результате проведенных клинических исследований состояния
организма подопытных кроликов после инстилляции препарата не выявлено
изменений температуры тела, частоты пульса и количества дыхательных
движений.
При визуальной оценке состояния конъюнктивы, роговицы и век
опытных животных установлено, что препарат вызывает слабое раздражение
конъюнктивы спустя 0,5-1 час после инстилляции препарата, которое
исчезало уже ко 2-му часу.
Длительное воздействие. На правый, выстриженный и выбритый,
участок кожи опытных животных наносили мастицеф в дозе 0,02 г/см2 в
течение 25 дней по 1 разу в день. Контрольным животным на правую сторону
наносили основу препарата. Левые участки всех животных не обрабатывали.
Наблюдение за животными вели весь период нанесения и в течение 5 дней
после окончания применения препарата.
За период наблюдения не установлено изменений поведения и
аппетита животных. Не отмечено различий температуры тела и живой массы
в обеих группах кроликов. Толщина складки, выстриженной и выбритой
кожи животных контрольной и опытной групп, на протяжении 29-ти
дневного срока наблюдения не отличалась.
Накожное нанесение препарата и основы приводит лишь к
незначительному увеличению толщины кожной складки в пределах 1,5-2,5%
по отношению к контролю и возвращается к исходному состоянию к 30-му
дню наблюдения. Таким образом, установлено, что разработанный нами
препарат не оказывают раздражающего действия на кожу.
13
Аллергенные свойства мастицефа. Исследования по изучению
аллергенных свойств мастицефа при накожном способе нанесения проведены
на белых беспородных крысах массой 200-220 г, конъюнктивальная проба –
на морских свинках массой 270-300 г.
Установлено, что 20-кратная аппликация мастицефа белым крысам не
вызывала контактного дерматита.
Конъюнктивальная проба, поставленная на морских свинках, показала
отсутствие реакции конъюнктивы сенсибилизированных и интактных
морских свинок через 15 минут и 24 часа на инстилляцию препаратов.
Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод об
отсутствии аллергенного действия у препарата мастицеф.
3.4. Определение оптимальной терапевтической дозы мастицефа
Положительные результаты по экспериментальной проверке
антимикробного действия мастицефа, определению его токсичности
позволили приступить к изучению его оптимальной терапевтической дозы. С
этой целью были подобрано 57 больных катаральным маститом коров,
которых по принципу аналогов разделили на три группы. Животным первой
группы (n=18) внутрицистернально вводили препарат в дозе 3 мл, второй
(n=20) - 5 мл, третьей (n=19) - 7 мл. Препарат вводили 3 - 4-х кратно с
интервалом 24 часа. Эффективность различных доз препарата определяли по
количеству
выздоровевших
животных.
Результаты
исследований
представлены в таблице 4.
Таблица 4
Терапевтическая эффективность разных доз мастицефа при катаральном
мастите.
Группа
1
2
3
Доза,
мл
3,0
5,0
7,0
Всего в опыте
коров
долей
18
20
19
24
25
22
Выздоровело
коров
кол-во
14
19
18
%
77,8
95,0
94,7
долей
кол-во
%
19
79,2
23
92,0
20
90,9
Как следует из данных таблицы 4, в первой группе, подвергнутой
лечению препаратом в дозе 3 мл выздоровело 77,8% животных (79,2% долей
вымени). Из 20 животных (25 четвертей вымени) второй группы выздоровело
95,0 коров, излечено 92,0% четвертей молочной железы, в третьей группе соответственно 94,7% коров и 90,9% четвертей молочной железы.
На основании проведенных исследований можно заключить, что
оптимальной терапевтической дозой мастицефа для лечения мастита у
лактирующих коров является доза 5 мл. Её эффективность при лечении
катарального мастита превысила дозу 3 мл на 17,2%, а её увеличение до 7 мл
не приводит к повышению терапевтической эффективности.
14
3.5. Влияние препарата мастицеф на молочную железу и организм
лактирующих коров
Изучение влияния препарата на молочную железу и организм
лактирующих животных проведено на 3 клинически здоровых коровы на 4-5
месяце лактации.
Определено, что после интрацистернального введения мастицефа в
дозе 5 мл количество соматических клеток в молоке опытных долей через 1224 часа после введения повысилось в 3,2-3,4 раза по сравнению с исходным
уровнем до 1152,3±86,3-1230,7±105,1 тыс/мл. Через 48 часов их количество
снизилось до 747,0±19,1 тыс/мл, а через 72 часа достоверно не отличалась от
исходного уровня (389,7±44,4).
Изменение общего состояния животных определяли по показателям
поведения, аппетита, температуры, пульса, дыхания, сокращений рубца. В
течение опыта изменений в состоянии организма опытных животных
выявлено не было, показатели температуры, пульса, дыхания находились в
норме.
Таким образом, мастицеф обладает слабым раздражающим действием
на молочную железу коров, признаки которого исчезают к 72 часу после
введения.
С целью определения влияния препарата на морфологический и
биохимический статус организма коров, были отобраны пробы крови от 5
коров до и через 24 часа после его интрацистернального введения.
Установлено, что введение мастицефа в молочную железу лактирующих
коров не оказывает существенного влияния на морфологические и
биохимические показатели крови.
3.6. Определение остаточных количеств мастицефа в секрете молочной
железы, крови и моче у коров
Опыт проведен на 5 лактирующих коровах голштинизированной
симментальской породы на 4-5 месяце лактации, которые были разделены на
две группы. Животным первой (опытной) группы (n=3) в пораженные доли
один раз в сутки четырехкратно вводили мастицеф в дозе 5 мл, животные
второй группы (n=2) служили контролем, им препарат не вводили.
У коров всех групп были отобраны секрет молочной железы, кровь и
моча для определения содержания в них цефотаксима гидрохлорида и
неомицина сульфата через 1, 2, 3 и 4 суток после последнего введения
препарата. Результаты исследований представлены в таблице 5.
Из приведенных в таблице 5 данных следует, что цефотаксима
натриевая соль сохраняется в молоке, а значит и в паренхиме вымени до 72
часов, через 96 часов в секрете молочной железы антибиотик не
обнаруживается, следовательно, молоко можно использовать через 96 часов
15
после последнего введения препарата. В крови и моче антибиотик во все
сроки исследования не определяется.
Неомицина сульфат всасывается в кровь и начинает выделяться с
мочой на вторые сутки после последнего введения. Через 72 часа антибиотик
полностью выводится из исследуемых биологических жидкостей организма.
Таблица 5
Содержание остаточных количеств цефотаксима и неомицина в секрете
молочной железы, моче и крови коров, мкг/мл
Объект исследования
Сроки исследования после окончания применения
24 ч
Цефотаксим
Неомицин
Цефотаксим
Неомицин
Цефотаксим
Неомицин
48 ч
Молоко
4,18±0,61
3,7±0,43
4,7±0,22
2,14±0,38
Кровь
0,00
0,00
0,00
2,02±0,2
Моча
0,00
0,00
0,00
0,9±0,09
72 ч
96 ч
0,88±0,19
0,14±0,009
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
В связи с этим можно сделать вывод, что компоненты препарата
мастицеф после проведения курса лечения выводятся из молочной железы
через 96 часов после его окончания, поэтому молоко можно использовать в
пищу по окончании этого срока.
3.7. Терапевтическая эффективность мастицефа в сравнении с другими
антибактериальными препаратами
Опыт по изучению терапевтической эффективности мастицефа в
сравнении с диеномастом и мастилексом при мастите у коров в период
лактации проведен на 57 больных субклиническим, 45 - клинически
выраженным катаральным, и 55 - гнойно-катаральным маститом, которых в
каждом случае разделили по принципу аналогов на 3 группы.
Коровам первой группы вводили мастицеф в дозе 5 мл один раз в сутки
в течение 3-4 дней, второй - диеномаст, третьей - мастилекс. Диеномаст и
мастилекс применяли согласно наставлений по их применению. Перед
введением препаратов из пораженной четверти выдаивали секрет, а сосок
дезинфицировали 70% этиловым спиртом.
Учет терапевтической эффективности препаратов проводили на 5-7
день после окончания лечения путем оценки реакции молока с 2% раствором
масттеста и учета пробы отстаивания.
16
Результаты исследований по применению мастицефа, диеномаста и
мастилекса для лечения коров, больных маститом, представлены в таблице 6.
Как
следует
из
представленных
данных,
терапевтическая
эффективность применения диеномаста оказалась самой низкой и составила
при субклиническом мастите 90,9%, катаральном - 78,9%, гнойнокатаральном - 77,8%, при этом излечено соответственно 93,9, 85,7 и 81,5%
четвертей вымени.
Таблица 6
Терапевтическая эффективность мастицефа при мастите у коров в период
лактации в сравнении с диеномастом и мастилексом
Препараты
Подвергнуто
лечению
коров долей
Мастицеф
Диеномаст
Мастилекс
23
22
20
35
33
31
Мастицеф
Диеномаст
Мастилекс
19
19
21
31
28
30
Мастицеф
Диеномаст
Мастилекс
19
18
19
27
27
28
Выздоровело
коров
% долей %
Субклинический мастит
22
95,7
34
97,1
20
90,9
31
93,9
19
95,0
29
93,6
Катаральный мастит
18
94,7
29
93,5
15
78,9
24
85,7
19
90,5
28
93,3
Гнойно-катаральный мастит
17
89,5
26
96,3
14
77,8
22
81,5
16
84,2
24
85,7
Осталось больных
коров
%
долей
%
1
2
1
4,3
9,1
5,0
1
2
2
2,9
6,1
6,4
1
4
2
5,3
21,1
9,5
2
4
2
6,5
14,3
6,7
2
4
3
10,5
22,2
15,8
1
5
4
3,7
18,5
14,3
Применение мастилекса привело к выздоровлению 95,0% коров,
больных субклиническим, 90,5% - катаральным и 84,2% - гнойнокатаральным маститом, при этом излечено 93,%, 93,3% и 85,7% четвертей
вымени.
Наиболее высокая терапевтическая эффективность получена при
использовании мастицефа. Так, при субклиническом мастите она составила
95,7%, что выше соответственно на 4,8 и 0,7%, чем при использовании
диеномаста и мастилекса. При катаральном мастите эффективность
мастицефа составила - 94,7%, что выше, чем при применении диеномаста и
мастилекса на 15,8% и 4,2% соответственно. При гнойно-катаральном
мастите эффективность составила 89,5% , что также выше на 11,7% и 5,3%
соответственно, чем при использовании диеномаста и мастилекса.
От 6 животных, больных катаральным маститом, до лечения и на 5-7
день после его окончания была отобрана кровь из яремной вены для
изучения влияния мастицефа на морфологические и биохимические
показатели крови. Результаты исследований представлены в таблице 7.
17
Таблица 7
Морфологические и биохимические показатели крови коров до и после
лечения препаратом мастицеф в дозе 5 мл
№
п/п
Показатели
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Эритроциты
Лейкоциты
Гемоглобин
Гематокрит
Общий белок
Альбумины
ά - глобулины
β-глобулины
γ-глобулины
Нейтрофилы: юные
палочкоядерные
сегментоядерные
Эозинофилы
Базофилы
Моноциты
Лимфоциты
Ед. изм.
Период исследования
До введения
(n=6)
1012/л
109 /л
г/л
%
г/л
%
%
%
%
%
%
%
%
6,01±0,2
10,8±0,54
113,5±6,4
27,36±1,4
87,38±1,8
51,7±1,9
9,3±1,45
14,9±0,51
24,3±1,64
37,0±6,2
3,0±0,9
5,0±0,9
53,0±8,8
Через 48 часов
после введения
(n=6)
7,31±0,9
8,8±0,51
134,7±10,8
40,81±6,4
84,60±1,6
54,2±0,72
9,1±0,3
13,8±0,9
22,8±1,4
26,0±4,9
7,0±1,6
5,0±1,4
62,0±4,3
Полученные данные (табл. 7) свидетельствуют о том, что на 5-7 день
после окончания лечения мастицефом коров, больных катаральным
маститом, в крови отмечено увеличение содержания гемоглобина на 18,7%,
гематокрита - 13,5%, эритроцитов - 21,5%, нейтрофилов - 11,0%, лимфоцитов
- 9,0%, эозинофилов - 4,0%, снизилось количество лейкоцитов на 22,7%,
нейтрофилов - 11,0%, что свидетельствует о снятие воспалительного
процесса в молочной железе и усилении защитных механизмов организма.
3.8. Результаты производственного испытания эффективности
применения мастицефа для терапии больных маститом коров
Исследования проведены на коровах больных субклиническим
маститом (n=63), клинически выраженным катаральным (n=60) и гнойнокатаральным маститом (n=57). Животные были разделены по принципу
аналогов на две группы. Коровы первой группы были подвергнуты лечению
мастицефом в дозе 5 мл один раз в сутки в течение 2-4 дней, второй мастилексом согласно наставлению по применению. Через 5-7 дней
животных обследовали клинически, а секрет вымени - с 2% раствором
масттеста и пробой отстаивания.
Как следует из представленных в таблице 8 данных, терапевтическая
эффективность мастицефа составила: при субклиническом мастите 96,9 %
катаральном – 90,0% и гнойно-катаральном – 85,7%.
18
Эффективность применения мастилекса при субклиническом мастите у
коров составила 93,5%, катаральном – 83,3% и гнойно-катаральном - 82,7%.
Таблица 8
Результаты производственных испытаний терапевтической
эффективности мастицефа при мастите у коров
Препарат
Подвергнуто
Кратность
лечению
введения
препарата
коров
долей
Субклинический мастит
Мастицеф
Мастилекс
32
31
Мастицеф
Мастилекс
30
30
40
39
2,67±0,05
2,85±0,04
Выздоровело
Излечено
коров
%
долей
%
31
29
96,9
93,5
38
36
95,0
92,3
27
25
90,0
83,3
34
32
89,5
86,5
24
24
85,7
82,7
28
27
84,8
79,4
Катаральный мастит
38
37
3,70±0,06
3,86±0,12
Гнойно-катаральный мастит
Мастицеф
Мастилекс
28
29
33
34
4,15±0,05
4,36±0,11
Установлено, что более высоким терапевтическим эффектом обладает
мастицеф, который на 3,4%-6,7% превосходит импортный препарат
мастилекс и может быть широко использован в производственных условиях
животноводческих хозяйств.
3.9. Экономическая эффективность применения препарата мастицеф для
лечения коров, больных маститом в период лактации
Проведение мероприятий по лечению различных форм мастита у коров
в период лактации новым антимикробным препаратом мастицеф
экономически выгодно по сравнению с мастилексом.
Экономический эффект при лечении коров препаратом мастицеф на
один рубль затрат составил при субклиническом мастите 5,12 руб.,
катаральном – 3,55 руб., гнойно-катаральном 8,22 руб., что больше, чем при
лечении мастилексом на 2,88; 1,17; 4,01 руб. соответственно.
4. ВЫВОДЫ
1. В хозяйствах с промышленным производством молока в течение
года маститом переболевает в среднем 52,8% коров в том числе
субклиническим в 43,3%, клинически выраженным 9,5%. Этиологическим
фактором
при
этом
выступает
микрофлора,
представленная
грамположительными кокками - (60,8%), семействами Enterobacteriaceae и Ps.
аeruginosa (33,3%), грибами рода Кандида (5,9%). Выделенная микрофлора
наиболее чувствительна была к амоксициллину, доксициклину, цефалексину,
цефотаксиму, неомицину.
2. Созданое сочетание антибиотиков цефотаксим - неомицин (7:1)
обладает синергидным действием в отношении грамположительной и
19
грамотрицательной микрофлоры. Разработанный на этой основе
комплексный препарат мастицеф обладает высокой активностью в
отношении потенциальных возбудителей мастита у коров. Минимальная
ингибирующая концентрация его составляет 0,39-1,56 мкг/мл, бактерицидная
концентрация превышает бактериостатическую в два раза.
3. Препарат мастицеф относится к IV классу опасности (малоопасные
вещества по ГОСТу 12.1.007-76). ЛД50 при внутрижелудочном его введении
превышает 30000,0 мг/кг массы тела.
4. Мастицеф не обладает аллергизирующими, раздражающими
(слизистая глаз, кожа) и кожно-резорбтивными свойствами. Препарат в
терапевтических дозах не оказывает отрицательного влияния на
физиологические параметры коров и биохимические показатели крови
животных.
5. Оптимальная терапевтическая доза препарата, при
его
интрацистернальном введении больным маститом коровам, составляет 5 мл.
6. При четырехкратном интрацистернальном введении животным
мастицефа его компоненты (цефотаксима натриевая соль и неомицина
сульфат) выводятся из молочной железы и организма коров через 96 часов.
7. Трех-четырех кратное ежедневное инрацистернальное введение
мастицефа
обеспечивает
выздоровление
96,9%
коров,
больных
субклиническим маститом, 90,0% - клинически выраженным катаральным и
85,7% - гнойно-катаральным.
8. Экономическая эффективность применения антимикробного
препарата мастицеф при субклиническом мастите составляет 5,1 руб. на
рубль затрат, катаральном - 3,55 руб., гнойно-катаральном - 8,22 руб. на
рубль затрат.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Для терапии коров, больных субклиническим и клинически
выраженным маститом, в период лактации применять мастицеф в дозе 5 мл
один раз в сутки в течение 3-4 дней.
2. Молоко подлежит браковке в течение 96 часов после последнего
введения мастицефа.
3. Научные результаты работы использовать в учебном процессе
студентов и специалистов зооветеринарного профиля по акушерству,
гинекологии и биотехнологии репродукции животных, по фармакологии и
токсикологии.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
*1. О нозологии скрыто протекающих патологий в молочной железе
коров /В.А. Париков, Н.Т. Климов, Н.В. Притыкин, Д.М. Пониткин,
А.Ю. Алиев, В.И. Зимников, А.М. Модин, А.В. Чурсин //Российский
ветеринарный журнал.- 2007 .- Специальный выпуск. - С. 29.
20
*2. Предупреждение мастита у коров – основа повышения
продуктивности и качества молока /Д.М. Пониткин, Н.Т. Климов,
Н.В. Притыкин, А.Ю. Алиев, В.И. Зимников, А.М. Модин, А.В. Чурсин
//Зоотехния. - 2007.-№7. С. 21-23.
3. Роль нарушения технологии доения в возникновении мастита у
коров в современных доильных залах /Н.Т. Климов, В.А. Париков,
В.И. Михалев, А.Н. Модин, В.И. Зимников, А.В. Чурсин, Д.М. Пониткин
//Матер. международ. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы
повышения эффективности агропромышленного комплекса». – Курск, 2008.Ч.3.- С. 219-221.
4. Рациональные подходы борьбы с маститом коров /Н.Т. Климов,
В.А. Париков, В.И. Михалев, А.Н. Модин, В.И. Зимников, А.В. Чурсин,
Д.М. Пониткин //Матер. международ. научно-практ. конф. «Актуальные
проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса».Курск, 2008.- Ч.3.- С. 221-224.
*5. Роль микробного фактора в возникновении и развитии мастита у
коров /Н.Т. Климов, В.А. Париков, В.И. Слободяник, Е.Е. Шевелева,
В.И. Зимников, А.Н. Модин, А.В. Чурсин, Д.М. Пониткин //Ветеринария,
2008. - №12.- С. 33-36.
6. Эффективный комплекс мероприятий в борьбе с маститом коров
/Н.Т. Климов, В.А. Париков, В.И. Зимников //Матер. Международной
научно-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения профессора
В.А. Акатова «Современные проблемы ветеринарного обеспечения
репродуктивного здоровья животных». Воронеж, 2009.- С. 212-215.
7. Влияние нового препарата для лечения мастита у коров в период
лактации на организм и молочную железу коров /В.И. Зимников//
Сибирский ветеринарный конгресс «Актуальные вопросы ветеринарной
медицины» Новосибирск, 2010.- С. 81-82.
8. Зимников В.И. Терапевтическая эффективность нового препарата
для лечения мастита у лактирующих коров /В.И. Зимников// Сборник
научных трудов ведущих ученых России и Зарубежья «Современные
проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц»
Екатеринбург 2010.- С. 333-336.
9. Зимников В.И. Активнодействующие вещества противомаститного
препарата и сроки их выведения из организма коров /В.И. Зимников,
Н.Т. Климов, Г.А. Востроилова// Материалы международной научно –
практической конференции посвященной 40-летию ГНУ ВНИВИПФиТ
«Актуальные проблемы болезней обмена веществ у сельскохозяйственных
животных в современных условиях» Воронеж 2010.- С. 110-113.
*10. Зимников В.И. Новый антимикробный препарат для лечения
мастита у коров /В.И. Зимников, Н.Т. Климов, Г.А. Востроилова, Л.И.
Ефанова// Зоотехния.- 2010.- №12. С. 19-20.
21
*11. Фармако-токсикологическая
характеристика
нового
противомаститного препарата Мастицеф /В.И. Зимников, Н.Т. Климов,
Г.А. Востроилова// Зоотехния.- 2011.- №2. С. 28-29.
*- публикации в изданиях, рекомендованных ВАК