Горки 2005 - Белорусская государственная

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ, НАУКИ И КАДРОВ
УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ
«БЕЛОРУССКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ»
Кафедра ботаники и физиологии растений
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ
ЗАНЯТИЯМ
Для студентов агрономического и агроэкологического
факультетов
Горки 2005
1
Одобрена методической комиссией агрономического факультета 20.06.2005.
Составила О.С. КИЛЬЧЕВСКАЯ, канд. биол. наук
УДК 576.8 (077)
Сельскохозяйственная микробиология: Методические указания
к лабораторным занятиям /Белорусская государственная сельскохозяйственная академия; Сост. О.С. К и льч ев ск ая . Горки, 2004. 69 с.
Содержатся сведения о методах изучения и культивирования микроорганизмов:
техника микроскопирования, приготовление питательных сред, способы стерилизации,
технология культивирования. Даны методики количественного учёта и анализа
микрофлоры воздуха и почвы. Рассматриваются превращения микроорганизмами
соединений углерода и азота. Приводятся основные бактериальные удобрения. Описана
микробиология кормов.
Для студентов агрономического и агроэкологического факультетов.
Таблиц 6. Библиогр. 10.
Рецензент старший преподаватель кафедры ботаники и физиологии растений, канд.
с.х. наук Т.Т. БИЗЮКОВА.
© Составление О.С. Кильчевская, 2005
© Учреждение образования
«Белорусская государственная
сельскохозяйственная академия», 2005
2
ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ
ЛАБОРАТОРИИ
В помещении микробиологической лаборатории должны строго
соблюдаться порядок и чистота.
2. Находиться в лаборатории необходимо без верхней одежды и, по
возможности, в белых халатах.
3. Приступая к лабораторным занятиям, студенты занимают
постоянные места за учебными столами.
4. Рабочее место должно быть оборудовано всем необходимым для
выполнения работы.
5. Студенты пользуются закреплёнными за ними микроскопами на
протяжении всего курса и несут за них ответственность.
6. На рабочем столе не должно быть никаких лишних предметов.
7. Пред началом работы студенты заранее знакомятся с заданием.
8. Записи наблюдений и зарисовки в рабочих тетрадях обязательны.
9. После окончания работы препараты оставляют в эксикаторе,
металлические предметы (петли, иглы, пинцеты) после
употребления стерилизуют в пламени огня, пипетки помещают в
стакан с дезинфицирующей жидкостью.
10. В лаборатории должны быть полотенце и мыло, чтобы после
выполнения работ студенты мыли руки.
11. После окончания занятий рабочее место должно быть приведено в
порядок.
При работе в газифицированных лабораториях студенты должны
быть ознакомлены с правилами работы
с газом и заполнить
контрольный лист по технике безопасности.
Оборудование рабочего места: коробочка с предметными
стёклами, корковые пробки, бактериологические петли, газовые
горелки или спиртовки, спички, штатив с красками и иммерсионным
маслом, ёмкость с водой и приспособлением для её слива, книжка из
фильтровальной бумаги, эксикатор, микроскопы с хлопчатобумажными тряпочками для протирания объективов.
1.
3
ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ
ПРЕПАРАТОВ И МИКРОСКОПИРОВАНИЯ
Препарат-мазок. Для исследования микроорганизмов обычно
используют фиксированные и окрашенные препараты, которые
готовят следующим образом:
1. Обезжиривают предметное стекло. Для этого на него наносят
каплю воды и растирают её корковой пробкой. Можно использовать
для этой цели реактивы (спирт, эфир и т.д.).
2. Обеззараживают бактериологическую петлю – прокаливают её
в пламени и дают остыть.
3. Берут подготовленной петлей микробный материал (из жидкой
культуры или из колонии микробов на поверхности твердой
питательной среды) и делают мазок – размазывают тонким слоем по
стеклу, после чего петлю сразу прокаливают.
4. Высушивают мазок на воздухе или держат стекло высоко над
пламенем, но не допуская закипания материала.
5. Фиксируют высушенный мазок, проводя стекло тыльной
стороной 3-4 раза в пламени. Можно использовать фиксатор. Микробы
при этом погибают и закрепляются на стекле.
6. Окрашивают препарат, нанося на него несколько капель
красителя. Окраска кристаллвиолетом, например, производится в
течение 30-60 с. При простом способе окраски используют один
краситель, и весь материал получают одноцветным. При сложных
способах окраски применяют несколько красок и реактивов. Это
позволяет выявить строение клеток бактерий, так как различия в
химическом составе частей клетки обеспечивают неодинаковые
отношения к разным красителям и позволяют получить разноцветную
картинку. К сложным способам окраски относятся окраска по Граму,
капсул, спор, волютина.
7. Окрашенный препарат тщательно промывают водой.
8. Просушивают препарат, промакивая его между листами
фильтровальной бумаги.
Микроскопирование. На готовый препарат наносят каплю
иммерсионного масла. Препарат необходимо положить на столик
микроскопа и зажать его двумя клеммами. Установить объектив 8 х или
40х и, глядя в окуляр, навести свет, регулируя положение зеркала.
Поднять конденсор до упора и открыть диафрагму. Препарат можно
4
осветить, пользуясь настольной лампой или осветителем ОИ-19, а
также ОИ-32, устанавливая его вместо зеркала.
При работе с сухими объективами (8× и 40х) между стеклом и
линзами объективов находится воздух, в котором, как в среде менее
плотной, чем стекло, часть лучей преломляется и рассеивается, не
дойдя до объектива.
При рассмотрении препарата с помощью иммерсионной системы
пользуются иммерсионными объективами. Иммерсия (от лат.
immersion – погружение) означает, что объектив может работать
только будучи погруженным в жидкость – масло (масляная иммерсия)
или воду (водная иммерсия). При работе с масляной иммерсией часто
используют кедровое масло, имеющее коэффициент преломления
лучей 1,515, а коэффициент преломления стекла 1,52. Световые лучи
при переходе из стекла в слой масла остаются в гомогенной по
плотности среде, не преломляются и попадают в объектив. При этом
улучшается освещенность и четкость изображения.
В лабораторной практике обычно используют масляную
иммерсию. На оправе иммерсионного объектива имеется чёрная
круговая нарезка, обозначение МИ – масляная иммерсия и цифра 90 –
увеличение 90х. Для микроскопирования с иммерсией объектив
погружают в каплю масла до соприкосновения с предметным стеклом.
После этого, глядя в окуляр (15х), при помощи макрометрического
винта медленно поднимают тубус до появления в поле зрения
окрашенных клеток, затем микрометрическим винтом окончательно
устанавливают резкость изображения. Таким образом, при работе с
масляной иммерсией достигается увеличение 15  90.
Препарат необходимо просмотреть в разных полях зрения для
полноты изучения материала, что достигается вращением двух винтов
столика микроскопа, приводящих его вместе в препаратом в движение
в двух взаимно перпендикулярных направлениях.
После окончания просмотра препарата необходимо макрометрическим винтом поднять тубус, убрать препарат со столика
микроскопа, а линзу иммерсионного объектива протереть мягкой
чистой тряпочкой или марлей.
5
Раздел 1. МОРФОЛОГИЯ И СИСТЕМАТИКА
МИКРООРГАНИЗМОВ
Ра б о т а 1. Основные формы бактерий
Бактерии – широко распространенные микроорганизмы. Они находятся в воздухе, почве, воде, на поверхности растений, в кишечнике
животных и человека.
Одноклеточные бактерии по форме разделяются на три основные
группы – шаровидные, палочковидные и извитые.
Выполнение.
Готовят
фиксированные
и
окрашенные
кристаллвиолетом (30-60с) препараты-мазки: 1) кокков; 2)
палочковидных бактерий; 3) спирилл; 4) зубного налета.
Рассматривают с иммерсионной системой микроскопа.
Шаровидные бактерии называются кокками (от гр. kokkos –
зерно). Они имеют круглую форму и очень мелкие. В зависимости от
характера деления и поведения клеток после деления бывают:
м и кр о ко к к и (от гр. mikros – малый), или монококки (от гр.
monos –один) – после деления клетки располагаются по одной;
д и п ло ко к к и (от гр. diploos – двойной) – после деления клетки
остаются соединёнными по две;
стр е п то ко к к и (от гр. streptos – цепочка) – деление происходит
последовательно в одной плоскости, образующиеся после деления
клетки остаются соединёнными в цепочки;
те тр а ко к к и (от гр. tetra – четыре) – деление клетки происходит в
двух взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием четырёх
соединённых клеток;
сар ц ин ы (от лат. sarcio – соединяю) – деление клетки идёт
последовательно и быстро в трех взаимно перпендикулярных
плоскостях с образованием кубиков (пакетиков) из 8 клеток;
ста ф и ло ко к к и (от гр. staphyle – виноградная гроздь) – деление
клеток происходит беспорядочно в различных направлениях, что
приводит к образованию скоплений, напоминающих гроздь винограда;
Палочковидные бактерии по форме напоминают палочку или
цилиндр, бывают короткими и длинными, толстыми и тонкими, с
краями различной формы. Палочки обычно крупнее кокков. Их
подразделяют на б ак т ер и и (от гр. bakteria – палочка) – не
образующие споры и ба ц и л лы ( от лат. bacillum – палочка) –
образующие споры. Термин бактерии в узком смысле означает
6
палочковидные, а в широком смысле вообще любые формы. Деление
палочек происходит только поперёк, после чего они могут остаться
соединёнными попарно (д и п ло ба кт ер и и и д и п ло б а ц и л лы ) или в
цепочки (с тр е п то б ак т ер и и и стр е пто ба ц и л лы ).
Извитые бактерии подразделяются по их извитости на:
в ибр ио н ы (фр. vibrion и от лат. vibrare – колебаться, дрожать) –
слегка изогнутые клетки, по форме напоминают запятую,
искривленность обычно меньше половины окружности;
сп ир и л лы (от лат. spirilla – уменьшительное от spira – изгиб) –
число завитков от 1 до 6, обычно крупные;
сп ир о х ет ы (от лат. spira и гр. chaite - волосы ) – тонкие, длинные,
с большим количеством завитков.
Зарисовывают в тетради три поля зрения и делают в них рисунки с
обозначением всех форм бактерий.
В препарате, приготовленном дополнительно из собственного
зубного налета, можно найти разные формы бактерий – шаровидные,
палочковидные, извитые (например, спирохеты кариеса) и нитчатые.
Материалы и оборудование: выделенные культуры бактерий в
пробирках – воздушные кокки, почвенные палочки и навозная жижа со
спириллами; кристаллвиолет.
Ра б о т а 2 . Окраска по Граму
В 1884 г. датский ученый Г.Х. Грам предложил метод окраски,
который позволил разделить все микроорганизмы на две группы –
грамположительные (грам+) и грамотрицательные (грам-). Метод
основан на различиях в химическом составе клеточной стенки. У
грамположительных форм в состав клеточной стенки входит большое
количество гетерополимера пептидогликана (муреина) и он
локализуется в наружных слоях оболочки. У этих форм при окраске
анилиновым красителем в присутствии йода образуется с муреином
стойкое окрашенное соединение, нерастворимое в спирте. У
грамотрицательных форм муреина в клеточной стенке нет или очень
мало и он локализован в глубинных слоях, поэтому стойкого
окрашенного комплекса при окраске по Граму не образуется. Такие
клетки легко обесцвечиваются в спирте, их можно затем подкрасить
другим красителем.
Окраска по Граму положена в основу систематики бактерий и
используется при определении их вида.
7
Выполнение. Для приготовления препаратов используют
микробный материал, состоящий из двух выделенных культур
микроорганизмов, смешанных в одной пробирке, одна из которых
грамположительная, а другая грамотрицательная. Делают мазок,
высушивают, а затем фиксируют его в пламени.
Окраска по Граму заключается в следующем:
1. На фиксированный мазок накладывают бумажку Синёва,
пропитанную кристаллвиолетом, добавляют несколько капель воды
для извлечения краски и оставляют на 2-3 мин, после чего бумажку
удаляют;
2. Наливают на препарат несколько капель раствора Люголя
(KJ +J) на 1-2 мин, а затем жидкость сливают;
3. Опускают предметное стекло в стаканчик со спиртом на время
от 3-6 с до 30-60 с (в зависимости от качества спирта) для обесцвечивания грамотрицательных форм;
4. Тщательно промывают препарат водой;
5. Окрашивают грамотрицательные бактерии фуксином 30-60 с;
6. Промывают водой.
Просушивают фильтровальной бумагой и рассматривают с
иммерсионной системой микроскопа.
При просмотре препарата следует обратить внимание на то, что
грамположительные формы окрашиваются в фиолетовый цвет
кристаллвиолетом, а грамотрицательные – в красный или розовый цвет
фуксином.
Гр ам по ло ж ит е ль ны е – хлебные (пекарские) дрожжи –
Saccharomyces cerevisiae – клетки крупные и округлые, среди них
много почкующихся.
Гр ам о тр и ца те ль ны е – кишечная палочка – Escherichia coli –
клетки мелкие и короткие, иногда собраны в цепочки.
Зарисовывают микробы в одном поле зрения цветными
карандашами и делают пояснительные подписи.
Материалы и оборудование: смесь культуры дрожжей и
кишечной палочки, бумажки Синёва, раствор Люголя, водный раствор
основного фуксина или фуксин Пфейффера, стаканчики с 96º-ным
спиртом, красные и фиолетовые карандаши.
8
Ра б о т а 3. Окраска капсул методом негативного
контрастирования (по Гинсу)
Некоторые бактерии способны на наружной поверхности
клеточной стенки образовывать слизистое вещество – капсулу, что
является видовым признаком. Капсула у бактерий может достигать
значительных размеров и имеет определенную форму. Капсула
выполняет защитную функцию. Химический состав её у различных
бактерий различен. Капсульное вещество очень слабо воспринимает
краску, поэтому при простом способе окраски капсула видна в виде
слабоокрашенного ореола вокруг микробной клетки. Для обнаружения
капсул лучше пользоваться негативными способами окраски, при
которых окрашивается фон с контрастно выделяющимися
неокрашенными капсулами, обрамляющими бактериальные клетки.
Выполнение. Для просмотра капсул используют культуру
бактерий, образующих макрокапсулу.
1. Каплю исследуемого микробного материала наносят на край
предметного стекла, добавляют к ней каплю туши и размазывают
другим стеклом (можно со шлифованными срезанными краями), держа
его под углом 45º, тонким слоем по предметному стеклу;
2. Высушивают на воздухе;
3. Фиксируют в пламени;
4. Окрашивают фуксином 30-60 с;
5. Промывают водой;
Просушивают на воздухе или осторожно фильтровальной
бумагой. Рассматривают препарат с иммерсионной системой.
На фоне чёрной туши в препарате отчетливо выделяются розовомалиновые
клетки
азотобактера
(Azotobacter
chroococcum),
окруженные бесцветными капсулами крупных размеров. Клетки
палочковидные или в виде крупных кокков, соединенных попарно и
покрытых общей капсулой. Зарисовывают в тетради цветными
карандашами и подписывают.
Материалы и оборудование: культура азотобактера, стёкла со
шлифовальными срезанными краями, свежая неразведенная тушь,
водный раствор основного фуксина или фуксин Пфейффера, красные и
чёрные карандаши.
9
Ра б о т а 4. Окраска спор у бактерий (по методу ЦиляНильсена)
У бактерий могут образовываться споры, которые обладают
высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды
и выполняют защитную функцию. Образуют споры палочковидные
бактерии. Палочка со спорой называется бациллой.
Споры покрыты плотной и многослойной оболочкой, содержат
мало свободной воды, много липидов и термоустойчивых соединений.
Споры кислотоустойчивы и плохо окрашиваются красителями. Для
того, чтобы увеличить проницаемость споры, в краситель добавляют
протравитель (карболовую кислоту) и окраску производят при
нагревании. Спора красится труднее, чем вегетативная часть клетки,
но и медленнее обесцвечивается в кислотах. Поэтому, если после
окрашивания поместить препарат в серную кислоту на определенное
время, можно добиться того, что спора останется окрашенной, а
вегетативная часть клетки быстро обесцветится. Затем вегетативную
клетку легко можно покрасить в контрастный по цвету краситель,
чтобы спора и вегетативная часть клетки были окрашены в разные
цвета, тогда расположение спор в клетках будет хорошо различимо.
Выполнение. Для знакомства с особенностями спорообразования
у бактерий выделяют культуры трёх видов, которые условно
обозначают: спора №1, №2 и №3. Готовят из этого микробного
материала препараты-мазки. Мазок фиксируют в пламени дольше
обычного (проводят стекло в язычке пламени раз десять), чтобы убить
термоустойчивые споры.
Окраска спор заключается в следующем:
1. На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной
бумаги и обильно смачивают её карболовым фуксином Циля.
Препарат подогревают, держа высоко над пламенем, до появления
паров, но не доводят до кипения краски на стекле. Когда бумажка
подсохнет, подливают новую порцию красителя и опять подогревают.
Эту процедуру проводят 3-4 раза, после чего бумажку выбрасывают;
2. Погружают препарат с помощью пинцета в стаканчик с 1 %-ным
раствором серной кислоты на несколько секунд для обесцвечивания
вегетативной части клетки;
3. Препарат после обработки кислотой тщательно промывают
водой;
4. Подкрашивают клетки метиленовым синим 1-2 мин;
10
5. Промывают водой.
Просушивают препарат фильтровальной бумагой и исследуют под
микроскопом с иммерсией.
Споры окрашиваются в розовый цвет фуксином, а вегетативная
часть клеток – в голубой цвет метиленовым синим.
Расположение спор в клетке и внешний вид клетки со спорой –
видовой признак. Форма спор округлая или овальная. Расположены
они могут быть в центре (цен тр ал ь но е по ло же н ие ), смещены
ближе к одному из концов клетки (промежуточное, или
с уб тер м и на л ь но е по ло же н ие ) и находиться на одном из её
концов (концевое, или т ер м и на ль но е по ло же н ие ).
По внешнему виду клетки со спорой различают следующие
спорообразования:
ба ц и л ляр но е - присутствие споры не меняет внешнего вида
клетки, т. к. её диаметр не больше диаметра вегетативной части
клетки;
к ло с тр и ди а ль но е – диаметр споры больше диаметра
вегетативной части и клетка расширена в месте нахождения споры,
при этом клетка имеет вид веретена или лимона;
п ле к тр ид и а ль но е – спора находится на конце клетки, её
диаметр больше диаметра клетки, а вегетативная часть при этом
внешнего вида не меняет.
В работе используют следующий микробный материал:
спора 1 – Bacillus mycoides, спорообразование центральное,
бациллярное;
спора 2 – Clostridium butyricum или Clostridium pasteurianum,
спорообразование субтерминальное, клостридиальное;
спора 3 – Clostridium pectinovorum, спорообразование
терминальное, плектридиальное.
Зарисовывают в тетради цветными карандашами бациллы с
различным расположением спор и спорообразованием и делают
пояснения к рисункам.
Материалы и оборудование: культуры споровых форм бактерий
в пробирках, фильтровальные бумажки размером 2  3 см, карболовый
фуксин Циля, метиленовый синий, стаканчики с 1%-ной H2SO4,
пинцеты, красные и синие карандаши.
11
Ра б о т а 5. Окраска волютина (по методу Нейссера)
Многие микроорганизмы в определенных условиях образуют
запасные вещества в виде гранулярных включений. По химической
природе это чаще всего полисахариды, липиды, полифосфаты, белки, а
также сера, железо. К включениям микробных клеток относятся
волютин, гликоген, гранулёза, жир, сера и др. Клеточные включения
выявляются при помощи специальных способов окраски.
Волютин, или метахроматические зёрна (метахроматин) – запасное
вещество, состоящее из полифосфатов и веществ, близких к
нуклеиновым кислотам. В них сосредоточены запасы органического
фосфора. Волютин имет сродство с метиленовой синью, но при
окрашивании ею приобретает фиолетово-чёрный цвет. Способность
приобретать иной цвет, чем цвет окрашивающего вещества,
называется метахромазией. Название «волютин» произошло от
Spirillum volutans, в клетках которой он был впервые обнаружен.
Волютин в виде крупных гранул находится в вакуолях дрожжей
или
цитоплазме
бактерий (уксуснокислых,
молочнокислых,
азотфиксирующих) и актиномицетов.
Выполнение. Окраска волютина производится на культуре
дрожжей, из которой готовят фиксированный в пламени препаратмазок.
1. Окрашивают уксуснокислым синим 1-2 мин.
2. Промывают препарат водой.
3. Окрашивают раствором хризоидина 20-30 с.
4. Промывают водой.
Просушивают фильтровальной бумагой и исследуют под
микроскопом с иммерсией.
Протоплазма дрожжей окрашивается в жёлтый или светлокоричневый цвет, а зерна волютина – в фиолетовый.
Зарисовывают
клетки
хлебных
(пекарских)
дрожжей
(Saccharomyces cerevisiae) с волютином в тетради цветными
карандашами и делают пояснения.
Материалы и оборудование: жидкая культура дрожжей в
пробирках, уксуснокислый синий, хризоидин, жёлтый или коричневый
и фиолетовый или чёрный карандаши.
12
Ра б о т а 6. Исследование актиномицетов
Актиномицеты, или лучистые грибы (от лат. actis – луч и myces –
гриб) занимают промежуточное положение между бактериями и
грибами (грибобактерии).
В
систематике
их
относят
к
грамположительным бактериям. Как и бактерии они прокариоты ( не
имеют дифференцированного ядра), на питательных средах образуют
колонии, подобные бактериальным. Как и грибы они образуют
мицелий, хотя гораздо тоньше, и способны размножаться спорами.
Мицелий у актиномицетов может быть двух видов: субстратный, или
питательный (погружен в питательную среду и выполняет функции
питания) и воздушный (находится над питательной средой, на нем
формируются споры и он выполняет функцию размножения, придает
колонии лучистый вид).
К
высшим
актиномицетам
относят
стрептомицеты,
проактиномицеты,
микромоноспоры,
франки.
К
низшим
актиномицетам относят микобактерии и микококки, у которых
мицелий в зачаточном состоянии. Актиномицеты широко
распространены в почве и придают ей специфический землистый
запах.
С тр е п то м и це ты имеют два вида мицелия. Субстратный
просматривается в виде тонких разветвлённых нитей, воздушный
образует споры.
У пр о а к т и но м и це то в ( но кар д и й) воздушный мицелий
отсутствует или слабо развит, а субстратный выполняет функции и
питания, и размножения. Он хорошо виден в виде длинных и коротких
нитей, которые на определенных стадиях расчленяются на
палочковидные фрагменты, в дальнейшем переходящие в палочки,
которые затем становятся в спорами, а они потом вновь образуют
мицелий.
У м и кр о м о но с по р ы мицелий тоже только субстратный, на
гифах которого образуется по одной споре, дающей затем начало
новому мицелию.
Актиномицеты выращивают на питательной среде Чапека или
крахмало-аммиачном агаре. Колонии актиномицетов обычно
некрупные, разноцветные (розовые, жёлтые, коричневые, красные,
чёрные, белые), плотные, кожистые, пушистые, тестообразные,
срастающиеся с субстратом.
13
Выполнение. Колонии актиномицетов извлекают со средой с
помощью бактериологической петли или препаровальных игл и кладут
на обезжиренное предметное стекло. Размазывают петлей или другим
стеклом.
Фиксируют
в
пламени.
Окрашивают
30-60
с.
кристаллвиолетом. Рассматривают с помощью иммерсионной системы
микроскопа.
Зарисовывают в тетради стрептомицеты, проактиномицеты,
микромоноспоры. Отмечают виды мицелия, споры.
Материалы и оборудование: культуры актиномицетов в чашках
Петри, препаровальные иглы, кристаллвиолет.
Ра б о т а 7. Исследование микроорганизмов в живом виде
Для наблюдения за движением, питанием, размножением,
действием различных веществ на микроорганизмы необходимо
исследовать живые клетки. Для этого готовят нефиксированные и
неокрашенные препараты двумя способами: «раздавленной» и
«висячей» капли.
В живом виде исследуют плесневые грибы, которые образуют
налёт (пушок) на поверхности различных субстратов, например хлеба.
Плесени состоят из разветвлённых гифов, составляющих мицелий.
Они достаточно крупные, чтобы их можно было рассматривать даже
при малом увеличении, кроме того, плохо красятся.
Выполнение. 1. Готовят препарат «висячая капля» из навозной
жижи. Для приготовления этого препарата необходимо предметное
стекло с углублением (лункой) в центре. Каплю жидкой культуры
наносят на покровное стекло, смазывают его края вазелином,
накрывают предметным стеклом выемкой вниз, чтобы она накрывала
каплю. Благодаря вазелину предметное и покровное стекла
склеиваются. Переворачивают препарат, чтобы капля свободно
свисала в углублении, не касаясь стенок или дна. Этот препарат имеет
то преимущество, что микробы совершенно не травмируются и
препарат не высыхает длительное время.
Для исследования препарата на покровное стекло наносят каплю
иммерсионного масла и рассматривают иммерсионным объективом.
Просмотр ведут при сниженном конденсоре или закрытой диафрагме,
чтобы неокрашенные препараты не были совершенно прозрачными,
свет должен быть рассеянным.
14
При просмотре обращают внимание на форму, размеры,
способность клеток к движению. Определяют к какой группе
микробов они относятся (бактерии, простейшие, плесневые грибы).
Зарисовывают в тетради, подписывают и отмечают направление
движения микробов навозной жижи.
2. Исследуют плесневый гриб мукор (головчатая плесень) – Mucor
mucedo – для этого препаровальными иглами берут кусочек мицелия
и переносят на предметное стекло. Рассматривают при увеличении
15  8.
Зарисовывают мицелий, спорангиеносцы, спорангий, споры и
подписывают.
3. Исследуют культуру плесневого гриба пенициллиума
(кистевика) – Penicillium glaucum – для этого препаровальными иглами
извлекают кусочек мицелия на границе между зелёным и белым
участками колонии и переносят на предметное стекло. Рассматривают
при увеличении 15  8.
Зарисовывают мицелий, конидиеносцы и конидии в тетради и
подписывают.
Материалы и оборудование: навозная жижа, культуры плесневых
грибов на хлебе, стёкла с выемкой, покровные стёкла, препаровальные
иглы, баночки с вазелином, цветные карандаши (чёрный, зелёный).
Раздел 2. ПИТАНИЕ МИКРООРАГНИЗМОВ
Работа 8. Питательные среды для микроорганизмов
Для выращивания микроорганизмов в лабораторных условиях, а
также для изучения их физиологических свойств пользуются
питательными средами.
Выполнение. Ознакомиться с принципами классификации
питательных сред и приготовлением основных питательных сред для
выращивания микроорганизмов (МПБ, МПА, МПЖ).
Классификация питательных сред
По химическому составу питательные среды разделяются на
естественные, искусственные и синтетические. К естественным средам
относятся почва, молоко, мясо и др. Искусственные среды готовят из
естественных с добавлением химических веществ. Они могут быть
15
животного (МПБ, МПА, МПЖ) и растительного (пивное сусло,
картофельный агар) происхождения. Синтетические среды готовят по
рецепту, их состав точно известен (среда Эшби, Чапека, Омелянского
и др.).
По физическому состоянию, или консистенции питательные среды
делятся на жидкие и твёрдые (плотные). В жидких средах (МПБ, ПВ,
молоко) накапливают и выявляют физиолого-биохимические
особенности микроорганизмов, но их трудно выделить. Плотные
среды готовят из жидких, добавляя к ним 1,5-2 % агар-агара или 10 %
желатина. Их используют для выделения чистых культур,
количественного учета и диагностики микрофлоры. Реже используют
полужидкие (с 0,1-0,2 % агар-агара) и сыпучие среды.
По назначению питательные среды могут быть общего назначения,
на которых может развиваться большое количество микроорганизмов
(почва, МПБ, МПА и др.), и элективные (избирательные) (от лат.
electus – избираю), подходящие для одного вида микроорганизмов.
Впервые элективные среды были предложены С.Н. Виноградским
(безазотистая среда для азотфиксаторов и без органического углерода
для автотрофных нитрифицирующих бактерий).
Приготовление ряда питательных сред
Мясопептонный бульон (МПБ) – среда искусственная, жидкая,
общего назначения. Для её приготовления используют мясо –
говядину, телятину, конину и др. Из мяса получают фарш, заливают
его холодной водопроводной водой (на 1 кг фарша 2 л воды),
настаивают при температуре 5-7 ºС 18-24 ч для выделения
экстрактивных веществ. Затем мясной настой кипятят 15-30 мин,
охлаждают и фильтруют через полотно. К 1 л полученного бульона
добавляют 5 г NaCl и 10 г пептона. Сухой пептон представляет собой
жёлтый липкий порошок – продукт неполного распада белков. Соль и
пептон растворяют при нагревании, доводят щелочью рН до 7,2-7,4
(слабощелочная реакция среды благоприятна для большинства
микроорганизмов). Среду разливают в колбы и стерилизуют в
автоклаве. Используют для приготовления МПА и МПЖ, для
накопительной культуры аммонифицирующих бактерий.
Мясопептонный агар (МПА) – среда искусственная, твёрдая,
общего назначения. Представляет собой плотную студнеобразную
массу. Эта питательная среда широко применяется в лабораторной
16
практике для выращивания микроорганизмов. Для её приготовления
используют сухой агар-агар (по малайски агар-агар – желе) –
полисахарид с низким содержанием азотистых веществ и не
представляющий питательной ценности для микроорганизмов. Агарагар имеет вид серых листовидных пластинок. Добывается он из
морских водорослей багрянок. Это отличное гелеобразующее
вещество – обладает способностью набухать и растворяться при
нагревании, а после застывания образовывать плотную студенистую
массу. Для приготовления этой среды к 1 л МПБ добавляют 15-20 г
агар-агара. Замачивают несколько часов для набухания агара, кипятят
на слабом огне до полного его растворения, после этого доводят объём
жидкости до первоначального дистиллированной водой, фильтруют
через марлевый фильтр, смоченный предварительно горячей водой.
Среду в горячем виде разливают в стеклянные колбы и стерилизуют в
автоклаве. Готовый МПА имеет точку плавления 96-100 ºС и
температуру застывания около 40 ºС, т. е. при комнатной температуре
он всегда представляет собой твердую питательную среду.
Используют для количественного анализа микрофлоры воздуха и
почвы.
Мясопептонный желатин (МПЖ) - среда искусственная, твёрдая,
общего назначения. Это плотная питательная среда, для приготовления
которой используют сухой желатин. Желатин - вещество белковой
природы, кислый азотсодержащий продукт, добываемый путём
вываривания костей, хрящей. Для приготовления МПЖ к 1 л МПБ
добавляют 100-150 г желатина, настаивают несколько часов для
набухания желатина и затем нагревают до его полного растворения.
Используют щелочь для доведения реакции среды до слабощелочной.
Фильтруют горячую среду через складчатый бумажный фильтр,
разливают в колбы и стерилизуют дробно текучим паром в аппарате
Коха. Применение МПЖ ограничено в связи с тем, что он разжижается
под действием протеолитических ферментов, выделяемых многими
микроорганизмами. Кроме того, образуемый желатином гель плавится
уже при 23-25 ºС и застывает при 20 ºС и ниже, а большинство
микробов развивается при 30-37 ºС. Используют для выявления
культуральных и биохимических признаков идентифицируемых
микроорганизмов.
Крахмало-аммиачный агар (КАА) – среда синтетическая, твёрдая, элективная. Имеет следующий состав, г: крахмал – 10, (NH4)2SO4 –
2, K2HPO4 – 1, MgSO4 – 1, CaCO3 – 3, агар-агар – 20, вода дистил17
лированная – 1000 мл. Агар растворяют в 300 мл воды. Отдельно
растворяют крахмал в 100 мл воды. В остальных 600 мл воды
растворяют соли, нагревают до кипения и в кипящий раствор при
непрерывном помешивании вливают крахмал, затем добавляют воду с
агаром и стерилизуют в автоклаве. Используют для выращивания
актиномицетов.
Среда Чапека - среда синтетическая, твёрдая, элективная. Имеет
следующий состав, г: глюкоза – 14,0; CaCO3 – 0,7; KNO3 – 0,7; MgSO4
– 0,35; NaCl – 0,35; K2HPO4 – 0,35; FeSO4 – следы; агар-агар – 20,0;
вода дистиллированная – 1000 мл. Агар отдельно растворяют в 300 мл
воды. Затем всю смесь кипятят, разливают в колбы и стерилизуют в
автоклаве. Используют для выращивания актиномицетов.
Среда Эндо - среда синтетическая, твердая, элективная. Имеет
следующий состав, г: пептон – 10, лактоза – 10, K2HPO4 – 3,5, NaHSO3
– 2,5, агар-агар – 15,0, вода дистиллированная – 1000 мл. К среде
добавляют 4 мл 10 %-ного спиртового раствора основного фуксина,
поэтому она окрашивается в розово-кремовый цвет. Среду
стерилизуют в автоклаве и сохраняют в темноте. Используют для
выращивания кишечной палочки. Бактерии из рода Escherichia на этой
среде образуют малиновые колонии с металлическим блеском.
Пептонная вода - среда искусственная, жидкая, элективная. Для
ее приготовления к 1 л воды добавляют 40 г пептона и 5 г NaCl,
растворяют при нагревании, фильтруют, разливают в колбы и
автоклавируют. Используют для выращивания аммонифицирующих
(гнилостных) бактерий.
Полужидкий агар – среда синтетическая, полужидкая, общего
назначения. Для её приготовления 0,1 г агар-агара растворяют в 100 мл
воды при кипячении, фильтруют и автоклавируют. Используют для
прямого подсчета числа микроорганизмов в почве по Виноградскому.
Многие питательные среды (среда Эндо, сухой питательный агар,
питательный бульон и др.) изготавливаются промышленным способом
в виде сухих порошков. В лаборатории их доводят до готовности по
рецепту, указанному на этикетке.
Приготовление ряда элективных питательных сред описано в
работах № 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23.
Материалы и оборудование: колбы с мясопептонным бульоном,
мясопептонным агаром, средой Чапека или КАА для актиномицетов,
средой Эшби для азотобактера, средой Омелянского для
18
целлюлозоразлагающих бацилл и др.; сухой пептон, агар-агар и
желатин в баночках.
Раздел 3. МИКРОБЫ И ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА
Ра б о т а 9. Стерилизация
Стерилизация (от лат. sterilis – бесплодный) – это уничтожение
микроорганизмов в различных объектах путем воздействия на них
факторами, губительными для микробов.
В зависимости от того, с помощью каких факторов убивают
микроорганизмы, все методы стерилизации условно разделяют на
термические и холодные.
Выполнение. Знакомятся со способами термической и холодной
стерилизации.
Термическая стерилизация.
Термическая (горячая) стерилизация основана на уничтожении
микробов с помощью высоких температур. Это легко выполнить и
широко используется в практической деятельности человека. При этом
нужно помнить, что у вегетативных (неспоровых) клеток денатурация
белков и гибель клеток начинается уже при температуре 56-60 ºС.
Более термоустойчивые споры погибают в сухой атмосфере при
температуре 160 ºС в течение 1-2 ч, а во влажной среде гибель
происходит при температуре 112-120 ºС в течение 20-30 мин.
Способы термической стерилизации:
1. Фламбирование (от лат. flamma – пламя и фр. flambé – гореть)–
стерилизация путем прокаливания в пламени мелких металлических
или стеклянных предметов. Таким способом стерилизуют
бактериологические петли, металлические пинцеты, стеклянные
шпатели и трубочки, предметные стекла и др. Температура пламени
около 1000ºС. При прокаливании сгорают все микроорганизмы
(вегетативные и споровые формы). Это быстрый и надежный способ
стерилизации.
2. Кипячение. Является одним из самых простых способов
стерилизации. Проводится в стерилизаторе – металлической
прямоугольной коробке с крышкой и сеткой на дне для укладывания
стерилизуемых предметов. Наливают в него воду и нагревают до
19
кипения (нагрев электрический или на огне). Кипячение может
длиться от 15-30 мин до 2 ч при температуре около 100 ºС.
Стерилизуют мелкие металлические или стеклянные предметы –
шприцы, иглы, стеклянные трубки и др. При этом погибают
вегетативные формы микроорганизмов и часть спор. Практикуют
также ошпаривание кипятком стерилизуемого материала.
3. Стерилизация сухим жаром. Производится горячим воздухом
в печи Пастера или сушильном шкафу. Печь Пастера представляет
собой шкаф с двойными стенками, покрытый снаружи асбестом для
теплоизоляции. Внутри шкафа устроены металлические полки с
отверстиями, на которые помещают стерилизуемый материал. Нагрев
электрический. Стерилизация проводится при температуре 160-180 ºС
в течение 1-2 ч с момента достижения этих температур (контролируется по термометру). Стерилизуют сухим жаром главным образом
стеклянную посуду – чашки Петри, пипетки, шпатели (обернутые в
бумагу), а также пробирки, колбы. Этот прием надежный – погибают
неспоровые и споровые формы микроорганизмов. Обернутый в бумагу
и простерилизованный материал можно хранить.
4. Стерилизация текучим паром. Проводится горячим влажным
воздухом в аппарате Коха. Аппарат (кипятильник) Коха представляет
собой металлический цилиндр, который может быть на ножках и
покрыт линолеумом. В аппарат наливают столько воды, чтобы она не
доходила до выступа, на который помещают металлический кружок с
отверстиями и сверху на него стерилизуемый материал. Аппарат
плотно закрывают конической крышкой с отверстием посередине для
выхода пара и нагревают на огне. Когда вода закипит, горячий
водяной пар с температурой около 100 ºС «потечёт» сильной струей из
отверстия крышки. С этого момента отмечают время начала
стерилизации. Стерилизация текучим паром продолжается от 45 мин
до 1,5 ч в зависимости от объёма стерилизуемого материала.
Стерилизуют питательные среды, которые нельзя нагревать выше 100
ºС, например МПЖ (при температуре выше 100 ºС он разжижается и
не застывает). Этот способ стерилизации не вполне надежен –
полностью погибают лишь вегетативные формы микроорганизмов, а
споры сохраняются. Для достижения полной стерилизации сред в
аппарате Коха применяют дробную стерилизацию.
5. Стерилизация паром под давлением (автоклавирование).
Проводится насыщенным водяным паром в автоклаве. Автоклав
бывают разной конструкции. Вертикальный автоклав представляет
20
собой массивный двухстенный котёл, окруженный снаружи
металлическим кожухом, с тяжелой откидывающейся крышкой,
плотно привинчивающейся к котлу болтами. В нижней части котла
имеется воронка и кран, через которые наливается вода в свободное
пространство между внутренним котлом и кожухом. На дно котла
укладывают стерилизуемый материал, крышку плотно завинчивают,
включают электрический нагрев. Когда вода закипает, пар проходит во
внутренний котел. Давление в автоклаве поднимается, одновременно
повышается температура. Когда манометр покажет, что давление в
котле достигло заданной величины, отмечают время начала
стерилизации. Давление поддерживается на определенном уровне с
помощью предохранительного клапана.
Обычно в лабораторной практике стерилизация под давлением
производиться при 1,5-2 атм и температуре около 115-120 ºС в течение
20-30 мин. По истечении времени стерилизации нагрев прекращают,
открывают паровой клапан и спускают пар. Стерилизуют паром под
давлением питательные среды МПБ, МПА, стеклянную посуду с
водой, перевязочный материал, хирургические инструменты и др.
Автоклавирование является быстрым и надёжным способом
стерилизации, при котором погибают все формы микроорганизмов,
даже самые устойчивые споры.
6. Пастеризация. Этот прием частичной стерилизации назван в
честь предложившего его французского ученого Л. Пастера. Способ
заключается в том, что жидкость, налитую в стерильную посуду,
прогревают на водяной бане при температуре 60-90 ºС в течение
10-30 мин. Применяется для жидких сред, которые изменяют свои
физико-химические свойства при высоких температурах. Пастеризуют
молоко, сливки, вино, пиво, соки и др. При этом сохраняются
витамины и вкусовые качества продуктов. Пастеризованные продукты
длительному хранению не подлежат, так как при этом способе
стерилизации погибают лишь вегетативные формы микроорганизмов,
а споры остаются. В лабораторной практике этим способом
пользуются главным образом для отделения спорообразующих видов
от неспорообразующих.
7. Дробная стерилизация. Основана на обработке стерилизуемого
материала в несколько приемов. Дробным может быть кипячение или
стерилизация текучим паром в аппарате Коха. Обычно стерилизацию
проводят 3 дня по 30 мин ежедневно одним из указанных способов, а в
перерывах оставляют среды при комнатной температуре. Это делается
21
для провокации роста спор в вегетативные формы и их уничтожения
при последующих обработках, что повышает надёжность этих
приемов.
8. Тиндализация. Это разновидность дробной стерилизации
(дробная пастеризация). Прием назван в честь предложившего его
английского ученого Д. Тиндаля. Проводится в водяной бане при
температуре 56-58 ºС в течение 1 ч с 5-7-кратным повторением через
24 ч. В интервалах между прогреваниями материал выдерживается при
комнатной температуре. Тиндализации подвергают питательные
среды, бедные микроорганизмами, а также содержащие вещества,
легко разрушающиеся и денатурирующие при температуре выше 60 ºС
(белки, витамины). Это сыворотка крови, яйца и др. В результате
тиндализации достигается полное уничтожение микроорганизмов.
Холодная стерилизация.
Холодные способы стерилизации включают различные приемы
уничтожения микроорганизмов. Называют их холодными условно,
чтобы подчеркнуть, что они не основываются на действии высоких
температур. При этом нужно помнить, что низкие отрицательные
температуры не убивают, а только задерживают рост и развитие
микроорганизмов.
К холодной стерилизации относятся:
1. Химическая стерилизация, или дезинфекция – это
уничтожение патогенных (болезнетворных) микроорганизмов с
помощью химически ядовитых веществ (антисептиков). Метод
используют в медицине. К антисептикам, или дезинфицирующим
средствам относятся мыла, красители (зелёнка), соли тяжёлых
металлов, окислители (хлор, йод, перекись водорода, перманганат
калия), формалин , формальдегиды, спирты и др.
2.
Физические
методы
стерилизации:
стерилизация
ультрафиолетовыми лучами (УФ) – используют при кварцевании,
ультразвуком (УЗ), током ультравысокой частоты (УВЧ) и др. Эти
приемы широко используют в медицине.
3. Стерилизация фильтрованием. Механическое освобождение
от микроорганизмов путем фильтрации различных жидких сред через
фильтры, задерживающие микробы. К таким мелкопористым
фильтрам, у которых размеры пор меньше размеров бактерий,
относятся фильтры Шамберлана из каолина, пластинчатые асбестовые
22
фильтры Зейтца, мембранные фильтры из нитроцеллюлозы. Их
используют для обработки легко портящихся от нагревания
жидкостей.
Фильтры Шамберлана называют фильтровальными свечами,
потому что они представляют собой высокие полые цилиндры из
высококачественной мелкопористой глины – каолина. В горлышко
колбы с носиком вставляют резиновую пробку с отверстием, куда
устанавливают свечу. Стерилизуют аппарат в автоклаве. Место
соприкосновения свечи и пробки заливают парафином. На носик
колбы надевают резиновую трубку и подсоединяют к насосу.
Фильтруемую жидкость наливают в свечу. Из колбы насосом
выкачивают воздух, поэтому жидкость под давлением фильтруется в
колбу. В фильтрате могут быть только вирусы и фаги –
ультрамикроорганизмы, поэтому этим приемом обычно пользуются в
вирусологии для отделения вирусов от более крупных
микроорганизмов. Свечу после термической обработки можно
использовать многократно.
Для работы в стерильных условиях используют прибор ламинар.
Материалы и оборудование: приборы для стерилизации –
медицинский стерилизатор (кипятильник), печь Пастера, аппарат
Коха, автоклав, фильтровальная свеча в колбе с носиком.
Раздел 4. МИКРОБИОЛОГИЯ ВОЗДУХА И ПОЧВЫ
Ра б о т а 10. Количественный учёт и определение
качественного состава микрофлоры воздуха и почвы методом
агаровых пластинок
Анализ микрофлоры воздуха
Воздух – неблагоприятная среда для микроорганизмов. Он не
является средой постоянного обитания, а только временного
нахождения или переноса микроорганизмов. В воздухе нет
питательных веществ, постоянной оптимальной температуры, часто
отсутствует влага, губительно действуют на микробы солнечные лучи.
Микроорганизмы попадают в воздух главным образом с пылью или
каплями жидкости с поверхности почвы, растений, животных,
транспорта, водной поверхности. Микробы в воздухе распространены
неравномерно. Количественный и качественный состав микрофлоры
23
воздуха находится в прямой зависимости от микрофлоры почвы, над
которой берут пробу воздуха. Количество микроорганизмов зависит от
погоды (в дождливую их меньше, чем в сухую), от времени года
(летом их больше, чем зимой) и места взятия пробы (над крупными
населенными пунктами микробов больше, чем над сельской
местностью). Микроорганизмов мало в воздухе над лесами, садами,
лугами, озёрами, океаном, высоко в горах и на севере.
Микрофлора воздуха характеризуется наличием большого
количества шаровидных бактерий (микрококков, диплококков, сарцин,
стафилококков), устойчивых к недостатку влаги и ультрафиолетовым
лучам и образующих разноцветные пигментированные колонии на
питательной среде, встречаются также палочковидные формы и
плесневые грибы.
За сутки через легкие человека проходит 12-14 тыс. литров
воздуха. Воздушным путем распространяются возбудители гриппа,
туберкулёза, оспы, пневмонии, коклюша, ангины, катара верхних
дыхательных путей и др.
Посев микроорганизмов из воздуха. Наиболее простым
способом определения общего количества микроорганизмов в воздухе
является метод оседания микробов на агаровую пластинку,
предложенный Р. Кохом. Метод заключается в том, что чашку Петри с
мясопептонным агаром открывают в исследуемом помещении на
5 мин, после чего закрывают крышкой, оборачивают бумагой,
переворачивают вверх дном во избежание размыва колоний
конденсационной водой, подписывают и помещают в термостат при
28-30 ºС для выращивания микробов, которые оседают на питательную
среду вместе с пылью. По количеству выросших колоний можно
судить о степени загрязненности воздуха микроорганизмами.
Количественный учёт микроорганизмов в воздухе. Р.Кох
экспериментально установил, что за 5 мин на поверхность 100 см 2
оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л, или
0,01 м3 воздуха.
Рассчитывают, сколько микробов содержится в 1 м3 воздуха над
открытой при посеве чашкой Петри с МПА.
Для этого:
1. Через 5-7 дней после посева подсчитывают число выросших в
чашке колоний (n). Колония – это потомство одной микробной клетки
на питательной среде.
24
2. Узнают площадь чашки Петри, для чего измеряют диаметр
внутренней чашки со средой (5 см2) и рассчитывают по формуле:
S чашки Петри = π r2 = 3,14 52 = 78,5 см2.
3. Определяют число микроорганизмов в 1 м3 воздуха. Зная,
сколько микробов выросло на площади 78,5 см2, можно пересчитать,
сколько их было бы на 100 см2, а это, по методике Коха, соответствует
их содержанию в 0,01 м3, значит в 1 м3 их должно быть в 100 раз
больше. Рассчитывают число микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (x) по
формуле:
n  10000
х
.
78,5
Воздух считается загрязнённым, если в 1 м3 более 4,5 тыс.
микроорганизмов.
Делают вывод о количестве микробов в помещении, где
проводился анализ микрофлоры воздуха.
Определение качественного состава микрофлоры воздуха. Под
качественным
анализом
микрофлоры
понимается
описание
культуральных и морфологических признаков микроорганизмов, что
служит основой для определения их видовой принадлежности.
К ул ь т ур а л ьн ые пр и зн а к и – это внешний вид колоний при
выращивании на различных питательных средах. К культуральным
признакам колонии относятся:
1) размер – крупные (диаметр 4-6 мм и более), средние (2-4 мм),
мелкие (1-2 мм) и точечные (не более 1 мм) колонии;
2) форма – круглая, овальная, неправильная, амёбовидная,
ветвистая, ризоидная и др.;
3) цвет – белый, розовый, жёлтый, оранжевый, красный и др.;
4) профиль или рельеф – плоский, выпуклый, кратеровидный,
конусовидный, изогнутый и др.;
5) поверхность – блестящая, матовая, морщинистая, гладкая и др.;
6) консистенция – жидкая, вязкая, пастообразная, сухая, плотная и
др. (устанавливается прикосновением к поверхности колонии
бактериологической петлей);
7) край – ровный, волнистый, лопастной, бахромчатый и др.
(рассматривают, пользуясь лупой или под микроскопом).
К м о р фо ло г иче с к им п р из на к ам микробов относятся форма,
характер деления и размер клеток, особенности спорообразования и
жгутикования, наличие капсулы, включений, окраска по Граму и др.
25
Для описания морфологических признаков из доминирующих
колоний готовят препараты-мазки – петлей берут немного микробного
материала и тщательно размазывают по стеклу, фиксируют в пламени,
окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с и рассматривают, пользуясь
иммерсионной системой микроскопа. Отмечают форму клеток,
наличие или отсутствие спор, капсул и зарисовывают в тетради.
Делают выводы о преобладающих формах микроорганизмов в воздухе.
Анализ микрофлоры почвы
Почва
является
благоприятной
средой
для
развития
микроорганизмов, она обильно населена ими и является основным
источником распространения микробов. В почве есть всё необходимое
для жизнедеятельности микроорганизмов – органические и
минеральные вещества, влага, здесь они защищены от губительных
ультрафиолетовых лучей солнца. Количество микробов в почве и их
видовой состав зависят от различных почвенно-климатических
факторов – механического состава почвы, её влагоёмкости,
кислотности вида, обработки, времени года и др.
В почве много палочковидных бактерий, актиномицетов,
плесневых грибов.
Посев микроорганизмов из почвы. Для определения количества
микроорганизмов в 1 г почвы применяют метод питательных агаровых
пластинок – поверхностный посев на МПА в чашках Петри, используя
предварительное разведение. Из средней пробы исследуемой почвы в
день анализа берут навеску 1 г и переносят её в колбу со 100 мл
стерильной воды. Колбу взбалтывают 10 мин и дают 1 мин отстояться,
получают разведение 1:100 (в 1 мл воды находится 0,01 г почвы).
Готовят 4 пробирки с 9 мл воды в каждой и заранее стерилизуют их в
автоклаве. Из колбы пипеткой набирают 1 мл почвенной суспензии и
переносят в пробирку № 1, раствор при этом разбавляется в десять раз
(разведение 1:1000). Другой пипеткой продувают полученную смесь
для равномерного перемешивания, затем набирают 1 мл и переносят в
пробирку № 2, получая при этом десятикратное разведение
предыдущего раствора (1:10 000). Новой пипеткой сначала продувают
полученный почвенный раствор, а потом набирают 1 мл и переносят в
пробирку № 3 (разведение 1: 100 000). Затем, поступая аналогично,
переносят 1 мл из
пробирки № 3 в пробирку № 4 (разведение
26
1:1 000 000), а из неё набирают градуированной пипеткой и переносят
на поверхность МПА в чашке Петри 0,1 мл (разведение 1:10 000 000).
Стерильным стеклянным шпателем почвенную суспензию растирают
лёгкими круговыми движениями досуха по поверхности среды, не
повреждая её при этом. Чашки в момент посева только слегка
приоткрывают под углом, во избежания посева микробов из воздуха.
Посев из каждого разведения желательно проводить хотя бы в две
чашки.
Чашки Петри с МПА после посева закрывают, оборачивают
бумагой, переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания
конденсационной воды на поверхность агара, подписывают и
помещают в термостат при температуре 28-30 ºС.
Количественный учёт микроорганизмов в почве. Через неделю
после посева подсчитывают число выросших на среде колоний. Для
удобства подсчитанные колонии можно отмечать тушью на наружной
стороне дна чашки. При правильно произведенном посеве число
колоний не должно быть более 50-200. Для определения числа
микроорганизмов в 1 г почвы нужно умножить число колоний на
разведение (на 10 000 000 при посеве из пробирки № 4).
Определение качественного состава микрофлоры почвы.
Выбирают наиболее типичные колонии и описывают их
культуральные признаки. Готовят из этих колоний препараты-мазки,
фиксируют
в
пламени,
окрашивают
кристаллвиолетом
и
рассматривают с помощью иммерсионной системы микроскопа.
Описывают и зарисовывают в тетради морфологические признаки
почвенных бактерий. Делают выводы о преобладающих в почве
формах микроорганизмов.
Выделение чистых культур микроорганизмов
Чистой
культурой
называют
культуру
микроорганизма,
полученную из одной клетки или отдельной колонии. Для выделения
чистой культуры выбирают изолированную колонию и пересеивают её
штрихом на косой МПА в пробирки и культивируют в термостате.
Определение вида микроорганизма
Конечная цель микробиологического исследования – определение
вида выделенного микроорганизма. Для того, чтобы это сделать,
необходимо знать:
27
1) культуральные признаки колонии (только по внешнему виду
колоний на МПА можно легко идентифицировать некоторые
микроорганизмы, например, Bacillus mycoides образует ветвистые
стелящиеся по мясопептонному агару колонии, напоминающие
мицелий гриба);
2)
морфологические
признаки
микроорганизмов
(по
культуральным и морфологическим признакам, часто можно
определить лишь род микробов);
3) биохимические признаки - отношение к различным источникам
питательных веществ – углеводам, белкам, жирам и др. (для этого
чистую культуру пересевают на «пёстрый ряд» различных сред с
индикаторами) и физиологические признаки – отношение к кислороду,
температуре и кислотности среды.
Используя полученную информацию и пользуясь определителем
для бактерий, устанавливают род и вид выделенного в чистой
культуре микроорганизма.
Материалы и оборудование: чашки Петри со стерильным
мясопептонным агаром, колбы со 100 мл стерильной воды,
заражённые 1 г почвы, пробирки с 9 мл воды, простерилизованные в
автоклаве (по 4 штуки на стол), стерильные пипетки на 1 мл и
шпатели, бумага для обвёртывания чашек, кристаллвиолет.
Ра б о т а 11. Прямой метод подсчёта числа микроорганизмов в
почве по Виноградскому
Метод прямого микроскопического учёта количества почвенных
микробов предложен С.Н. Виноградским. Выгодно отличается от
других методов быстротой анализа и позволяет сделать подсчёт
бактерий без приготовления питательных сред и длительного
выращивания на них микроорганизмов. При этом учитываются как
живые, так и мёртвые микробные клетки. В основе метода лежит
использование карболового эритрозина, который окрашивает клетки
микробов в розовый цвет, но не окрашивает минеральные почвенные
частицы и органическое вещество почвы.
Выполнение. 1. 10 г почвы вносят колбу со 100 мл стерильной
воды, взбалтывают 5 мин и дают отстояться 30 с.
2. Из жидкой части болтушки стерильной микропипеткой
набирают почвенную взвесь.
28
3. По чистому и хорошо обезжиренному стеклу равномерно
распределяют 0,01 мл на площади 4 см 2. Для этого подкладывают под
стекло миллиметровую бумагу с очерченным прямоугольником
размером 14 см.
4. Полученный мазок высушивают на воздухе.
5. Наносят на мазок 1-2 капли полужидкого агара, равномерно
распределяют и дают агару подсохнуть.
6. Мазок фиксируют спиртом – покрывают несколькими каплями
спирта и ожидают его полного улетучивания.
7. Окрашивают препарат карболовым эритрозином от 30 мин до
24 ч, после чего краску сливают.
8. Препарат очень осторожно промывают тонкой струйкой воды.
9. Просушивают на воздухе, можно аккуратно промакнуть
фильтровальной бумагой.
10. Пользуясь иммерсионной системой микроскопа, подсчитывают
число клеток в 10-100 полях зрения. Определяют среднее число
клеток, приходящееся на одно поле зрения.
Расчёт числа микроорганизмов в 1 г почве. Обозначим среднее
число микроорганизмов в одном поле зрения через а. Известно, что в
4 см2 содержится 25 000 полей зрения. Следовательно,
на площади
4 см2 число микробов составляет 25 000  а штук. На этой площади
распределяется сотая миллиметра (0,01 мл). Десять граммов почвы
находится в ста миллилитрах воды, следовательно, 1 г почвы – в 10 мл.
Чтобы узнать сколько микроорганизмов в 1 г почвы, надо найти,
сколько их в 10 мл. В 0,01 мл –25 000  а микробов, значит в 10 мл их
в 1 000 раз больше.
Таким образом, число микроорганизмов в 1 г почвы (x)
рассчитывают по формуле:
x = 25 000 000  а,
где а – среднее число микробных клеток в одном поле зрения, шт.
Готовят препарат, просматривают его в микроскоп, подсчитывают
число микробов, хотя бы в 10 полях зрения. Строят в тетради таблицу
и заносят в неё свои данные, выводят среднее число микроорганизмов
в одном поле зрения, а затем рассчитывают по формуле, сколько
микробов содержится в 1 г анализируемой почвы.
Материалы и оборудование: колбы со 100 мл воды,
простерилизованные в автоклаве, в которые вносят 10 г почвы,
полоски миллиметровой бумаги с очерченным прямоугольником
29
размером 1  4 см, стерильные микропипетки на 0,1 мл, баночки с
96º-ным спиртом, полужидким агаром (1:1 000), карболовым
эритрозином.
Раздел 5. ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ
СОЕДИНЕНИЙ УГЛЕРОДА
Углерод является одним из важнейших элементов, он входит в
состав органических веществ. В природе происходит круговорот
углерода. Растения строят органическое вещество из углекислого газа
атмосферы, превращая лучистую энергию солнца в скрытую энергию
химических связей (осуществляют фотосинтез). Только небольшая
часть
бактерий
может
использовать
солнечную
энергию
(фотолитоавтотрофы) или энергию окисления неорганических веществ
(хемолитоавтотрофы) для самостоятельного синтеза органических
веществ из углекислоты.
В воздухе содержится 0,03 % СО2. Атмосфера пополняется
углекислым газом при вулканических извержениях, сжигании топлива,
в результате дыхания людей, животных, растений и микроорганизмов.
Почвенная микрофлора разлагает органические вещества, осуществляя
минерализацию растительных и животных остатков до углекислого
газа. Микробы получают энергию в основном при освобождении ее из
безазотистых органических веществ. Различают две формы
катаболизма (энергетического обмена): брожение – без доступа
свободного кислорода и дыхание, или окисление – с кислородом. При
дыхании энергия освобождается полностью и конечными продуктами
явялются СО2 и Н2О.
Брожение – это разложение органических безазотистых веществ
без доступа кислорода с выделением энергии и образованием
продуктов, которые дальше в среде без кислорода не разлагаются.
Название брожения дается по конечным продуктам (спиртовое,
маслянокислое, молочнокислое и др.).
Ра б о т а 12. Спиртовое брожение
Спиртовым брожением называется процесс разложения сахара под
действием микроорганизмов на этиловый спирт и углекислый газ.
Суммарное уравнение спиртового брожения:
С6Н12О6  2СН3СН2ОН + 2СО2.
30
Спиртовое брожение лежит в основе виноделия, пивоварения,
хлебопечения.
Постановка опыта. Для изучения спиртового брожения
пользуются синтетической средой следующего состава, г: сахароза
(или глюкоза) – 15,0; дрожжи – 0,5; КН2РО4 – 0,3; MgSО4 – 0,1; вода
дистиллированная – 100 мл. В колбу вносят дрожжи, добавляют часть
отмеренной цилиндром воды и тщательно взбалтывают для лучшего
растворения, а затем прибавляют все по рецепту. Колбу закрывают
пробкой, в которую вставлена изогнутая трубочка. В открытый конец
трубки капают серную кислоту, а затем закрывают его фольгой. В
результате этого из колбы будет легко выходить выделяющийся при
брожении углекислый газ, но задерживаться пары воды.
Колбу взвешивают на технических весах с точностью до 0,01 г,
прикрепляют этикетку, на которой указывают массу колбы, номер
группы, факультет и фамилию исполнителя, и помещают в термостат
при температуре 25 ºС.
Элективные условия для прохождения спиртового брожения:
1) высокая концентрация сахара;
2) присутствие в опыте дрожжей – возбудителей спиртового
брожения;
3) анаэробные условия;
4) кислая среда за счет КН2РО4;
5) накопление в процессе опыта значительного количества спирта.
Результаты опыта. Брожение обычно продолжается 2-3 дня.
Конец брожения устанавливается по прекращению газообразования.
Опр е де ле н ие
и н те н си в но с т и
бр о же н ия .
Под
интенсивностью брожения понимают количество сброженного сахара
в процентах от исходного за определенный промежуток времени.
Чтобы определить интенсивность спиртового брожения, необходимо
выполнить ряд операций:
1. Определяют массу выделенного углекислого газа. Это можно
сделать, подсчитав разность массы бродильной колбы при постановке
опыта и после его окончания.
а = m1 – m2,
где а – масса выделенной углекислоты;
m1 – масса колбы при постановке опыта;
m2– масса колбы после окончания брожения.
31
По массе выделившегося СО2 можно определить количество
образовавшегося в опыте спирта и сброженного сахара, пользуясь
суммарным уравнением спиртового брожения
С6Н12О6  2С2Н5ОН + 2СО2.
180
246 = 92
244=88
Например, а = 7 г – выделилось 7 г СО2.
2. Рассчитывают массу образовавшегося спирта (x1).
88 г СО2 – 92 г С2Н5ОН;
7 г СО2 – x1г С2Н5ОН.
7  92
x1 
 7,3 г спирта.
88
3. Рассчитывают массу сброженного сахара (х2).
88 г СО2 – 180 г С6Н12О6;
7 г СО2 – х2г С6Н12О6.
7180
х2 = 88  14,3 г сахара.
4. Определяют интенсивность брожения (х3).
Если в 100 мл среды по рецепту 15 г сахара (100 %), то 14,3 г
сброженного сахара составляет х3 %.
15 г С6Н12О6 - 100 %;
14,3 г С6Н12О6 х3 %.
14 ,3100
 95 %,
х3 
15
т. е. интенсивность брожения в примере составляет 95 %.
Взвешивают колбы и рассчитывают интенсивность брожения в
собственных бродильных колбах.
Ми кр о ско п ир о ва н ие
дрожжей
производят
методом
«раздавленной капли». Для этого со дна сброженной жидкости берут
петлей немного осадка и наносят на предметное стекло, добавляют
каплю раствора метиленового синего, накрывают покровным стеклом,
сверху капают иммерсионное масло и рассматривают с помощью
иммерсионного объектива. При просмотре обращают внимание на
дрожжевые клетки, находящиеся в стадии почкования. Определяют
процентное содержание живых и мёртвых дрожжевых клеток.
Мёртвые клетки окрашиваются метиленовым синим, живые не
окрашиваются. Делают подсчеты живых и мёртвых клеток в 10 полях
зрения, выводят средние значения этих показателей в одном поле
32
зрения и рассчитывают соотношение живых и мёртвых дрожжевых
клеток в процентах. Результаты записывают в табл. 1.
№ поля зрения
Таблица 1
Результаты исследования дрожжей
Число клеток
Живых (неокрашенных)
Мёртвых (окрашенных)
1
2
3
…
10
Сумма
Среднее
Процент
Можно приготовить препарат-мазок из колбы, фиксировать в
пламени, красить метиленовым синим 2-3 мин. и рассматривать с
иммерсией.
Возбудителями спиртового брожения являются главным образом
дрожжи, реже некоторые плесневые грибы и бактерии. Однако
практическое значение имеют только дрожжи. Они встречаются на
поверхности растений, плодов, ягод, зерна, в воздухе и почве.
Характеристика дрожжей. Относятся к микроскопическим грибам
и являются эукариотами. Принадлежат главным образом к роду
Saccharomyces. Хлебные (пекарские) дрожжи Saccharomyces cerevisiae
одноклеточные, немицеллярные. Клетки их округлой, овальной или
слегка удлиненной формы, диаметр 8-10 мкм, имеют хорошо заметное
под микроскопом ядро. Дрожжи содержат много запасных веществ –
волютин, гликоген, капли жира, зерна белковых веществ.
Размножаются обычно почкованием, но могут размножаться спорами.
При половом размножении споры образуются после слияния
содержимого двух клеток и их деления в сумке, или аске.
Неподвижные. Факультативные анаэробы. Хорошо сбраживают
моносахариды и дисахариды. Аминогетеротрофы. Ауксоавтотрофы.
Мезофилы.
Зарисовывают дрожжи в тетради и записывают их характеристику.
Материалы и оборудование: колбы на 100 мл и каучуковые
пробки с изогнутыми (s-образными) трубками, сахароза или глюкоза,
33
пептон, КН2РО4,MgSО4, дрожжи, колбы с дистиллированной водой,
мерные цилиндры на 100 мл, крепкая серная кислота (H2SO4), кусочки
фольги, этикетки, покровные стёкла, метиленовый синий.
Ра б о т а 13. Молочнокислое брожение
Молочнокислым брожением называется процесс анаэробного
разложения углеводов молочнокислыми бактериями с образованием
молочной кислоты:
С6Н12О6  2СН3СНОНСООН.
молочная кислота
Молочнокислое брожение лежит в основе переработки молока в
молочнокислые продукты, а также силосования и квашения овощей.
Для изучения молочнокислого брожения лучше всего в качестве
питательной среды пользоваться молоком. В нем имеются все
питательные вещества для развития молочнокислых бактерий (лактоза,
казеин, кальций, фосфор, витамины).
Приготовление молочнокислых продуктов
Свежее молоко разливают в три стакана и закрывают их
бумажными крышками. В этих стаканах будут готовиться следующие
молочнокислые продукты.
В первом стакане – пр о с то к ваш а – продукт только
молочнокислого брожения в результате естественного скисания
молока под действием находящихся в нем молочнокислых бактерий.
Крышку стаканчика с молоком подписывают и оставляют при
температуре 25-30 º на 18-24 ч для скисания.
Во втором стакане – кеф ир – продукт смешанных брожений
(молочнокислого и спиртового). Для его получения стакан с молоком
пастеризуют в водяной бане при температуре 60 ºС в течение 30 мин
для уничтожения собственных молочнокислых бактерий, затем
охлаждают до 25-30ºС и заквашивают кефирными зернами,
представляющими собой симбиоз молочнокислых бактерий и
кефирных дрожжей (1-2 чайные ложки кефирной закваски на 100 мл
молока (молоко можно не пастеризовать)). Подписывают и оставляют
при температуре 25-30 ºС на 12-24 ч для скисания.
34
В третьем стакане – ац и до ф и л и н – продукт только
молочнокислого брожения. Для его приготовления стакан с молоком
пастеризуют в водяной бане при температуре 60 ºС в течение 30 мин,
затем охлаждают до 35-40 ºС и заквашивают ацидофильной закваской
(1 чайная ложка на 100 мл молока). Подписывают и помещают в
термостат при температуре 40-45 ºС на 8-12 ч.
Все полученные после скисания молочнокислые продукты затем
хранят в холодильнике.
Исследование молочнокислых продуктов
Опр е де ле н ие к ис ло т но ст и . Кислотность молока и молочных
продуктов выражается в процентах накопившейся молочной кислоты
или в градусах Тернера. Градусы Тернера (ºТ) - это величина,
показывающая объём децинормальной (0,1 н.) щёлочи (в мл),
пошедшей на нейтрализацию кислотности 100 мл молочного продукта.
Отмеряют 10 мл молочного продукта цилиндром и переносят в
колбу для титрования, добавляют 20 мл дистиллированной воды (предварительно ополоснув цилиндр, которым отмеряли молочный
продукт), приливают 1-2 капли фенолфталеина и титруют 0,1 н.
раствором NaOH при постоянном взбалтывании до появления
устойчивой слабо-розовой окраски. Объём щёлочи, пошедшей на
титрование, умножают на 10.
Определяют кислотность во всех трех стаканах с готовыми
молочнокислыми продуктами (простокваша, кефир, ацидофилин).
Контролем служит свежее молоко. Если на поверхности продуктов
образовалась плёнка, то прежде, чем взять сгусток для титрования, её
снимают, затем разбивают сгусток и перемешивают содержимое.
Ми кр о ско п ир о ва н ие . Молоко – среда, богатая белком и
жиром. При высоких температурах происходит денатурация белков,
поэтому препараты из молочнокислых продуктов не фиксируют в
пламени.
1. Мазок делают очень тонким слоем на сухом обезжиренном
стекле.
2. Высушивают мазок только на воздухе (нельзя держать над
пламенем).
35
3. Фиксируют в фиксаторе, состоящем из равных объёмов (1:1)
спирта и эфира, погружая препарат в стакан с фиксатором 3-4 раза.
Спирт убивает и закрепляет микробный материал на стекле, а эфир
обезжиривает препараты.
4. После фиксации дожидаются полного испарения со стекла
спирта и эфира.
5. Окрашивают препарат метиленовым синим 2-3 мин.
6. Промывают препарат водой.
Просушивают
фильтровальной
бумагой.
Просматривают
препараты, пользуясь иммерсионной системой.
В образовании молочнокислых продуктов участвуют гомоферментативные молочнокислые бактерии.
Пр о с то к ва ша содержит почти чистую культуру молочного
стрептококка Streptococcus lactis. Клетки молочного стрептококка
мелкие (диаметром до 1 мкм), имеют овальную форму, у молодых
культур в виде коротких цепочек, а у старых - соединены попарно.
Кислотность простокваши 90-120 ºТ.
Ке ф ир - молочнокислый продукт смешанных (комбинированных)
брожений. Содержит возбудителей молочнокислого брожения –
молочный стрептококк Streptococcus lactis (в кефире образует
довольно длинные цепочки) и казеиновую палочку Lactobacterium
casei, а также возбудителей спиртового брожения – кефирные дрожжи
Saccharomyces kefire. Кислотность кефира составляет 80-110 ºТ.
Ац и до ф и л и н (ацидофильная простокваша) – содержит только
молочнокислую бактерию – ацидофильную палочку Lactobacterium
acidophilum (длиной 4-5 мкм). Кислотность ацидофилина может
достигать 250-300 ºТ.
Характеристика молочнокислых бактерий. Грамположительные.
Могут быть кокками и палочками. Содержат запасные вещества
волютин и гликоген (поэтому хорошо красятся метиленовой синью).
Неподвижные, неспоровые, факультативные анаэробы (аэротолеранты). Среди них есть мезофилы и термофилы. Источник углерода
моно- и дисахариды (глюкоза, фруктоза, лактоза). Источник азота –
белки (казеин молока) – аминогетеротрофы. Требовательны к фосфору, кальцию, витаминам – ауксогетеротрофы. Ацидофилы.
Результаты исследований заносят в табл. 2.
36
Таблица 2
Характеристика молочнокислых продуктов
Название
Кислотность,
Название микрофлоры
молочного продукта
ºТ
Молоко
Простокваша
Кефир
Ацидофилин
Делают рисунки микрофлоры молочных продуктов – простокваши,
кефира и ацидофилина и записывают характеристику молочнокислых
бактерий.
Материалы и оборудование: свежее молоко, стаканы ёмкостью
100 мл, закрытые бумажными крышками с резинками, водяная баня,
стаканы с закваской кефирных зерен и ацидофильной палочки, чайные
ложки, бюретки для титрования, 0,1 н. раствор NaOH, колбы для
титрования, фенолфталеин, фиксатор (смесь спирта и эфира 1:1),
метиленовый синий.
Работа 14. Маслянокислое брожение
Маслянокислое брожение – это процесс анаэробного разложения
углеводов маслянокислыми бактериями с образованием масляной
кислоты и других продуктов по уравнению:
С6Н12О6  СН3СН2СН2СООН + СН3СООН +СО2 +Н2.
масляная кислота
уксусная кислота
В природе маслянокислое брожение имеет большое значение как
звено в цепи превращений соединений углерода. В то же время в
народном хозяйстве маслянокислые бактерии приносят значительный
ущерб, вызывая вспучивание сыров, прогоркание молока, порчу
консервов, силоса, овощей, картофеля и других продуктов. Вместе с
тем масляная кислота требуется для некоторых промышленных целей–
её широко применяют в технике, кондитерской и парфюмерной
промышленности. Маслянокислое брожение лежит в основе брожения
(анаэробного разложения) полисахаридов – крахмала, клетчатки,
пектиновых веществ.
37
Брожение крахмала. Крахмал – это полисахарид, запасное вещество растительных клеток. Особенно много крахмала в клубнях
картофеля.
Химизм анаэробного разложения, или брожения крахмала, состоит
из двух фаз.
Первая фаза – это гидролиз крахмала под действием выделяемых
микробами экзоферментов до α-глюкозы:
αиβ
мальтаза
(С6Н10О5) n + nН2О  n С12Н22О11 + n Н2О  nС6Н12О6
крахмал
амилаза
мальтоза
α-глюкоза
Вторая фаза – это маслянокислое брожение поглощенной
микробами α-глюкозы:
С6Н12О6  СН3СН2СН2СООН + СН3СООН +СО2 +Н2.
α-глюкоза
Постановка опыта. Для изучения маслянокислого брожения крахмала опыт ставят на среде с картофелем. Сырой неочищенный
картофель нарезают мелкими кубиками, заполняют ими высокую
пробирку на 1/3, добавляют немного мела для нейтрализации масляной
кислоты, заливают водой до 2/3 объёма пробирки, закрывают ватной
пробкой, оборачивают пробку бумагой, подписывают и пастеризуют
пробирку в водяной бане при температуре 80 ºС 10 мин, а затем
помещают в термостат при 30-35 ºС.
Элективные условия для прохождения в опыте маслянокислого
брожения:
1) наличие крахмала как специфического источника углерода,
который используется только микроорганизмами, содержащими
фермент амилазу, вызывающую гидролиз крахмала до глюкозы;
2) присутствие маслянокислых бацилл на кожуре картофеля;
3) анаэробные условия под высоким столбиком жидкости;
4) нейтральная среда за счёт внесения мела;
5) пастеризация, позволяющая отделить маслянокислые бациллы
от неспоровых форм.
Результаты опыта. Через 5-6 дней брожения отмечают, что часть
картофеля под действием СО2 и Н2 всплывает на поверхность среды.
Хорошо различим неприятный запах масляной кислоты.
Ми кр о ско п ир о ва н ие . Исследование маслянокислых бацилл
проводят в «раздавленной капле». Для этого петлей делают мазок по
стенке в нижней части пробирки со средой и переносят каплю
38
жидкости на предметное стекло. Добавляют к ней каплю крепкого
раствора Люголя (KJ + J), накрывают покровным стеклом, сверху на
него наносят каплю иммерсионного масла и исследуют препарат. При
просмотре обращают внимание на крупные, подвижные палочки,
которые под действием йода постепенно замедляют движение и
останавливаются. Йод проникает внутрь клеток и окрашивает
гранулёзу в сине-фиолетовый цвет (характерная качественная реакция
йода на растительный крахмал). На фоне окрашенной части клеток
отчетливо выделяется неокрашенная или слегка желтоватая спора.
Можно приготовить также препарат-мазок, фиксированный в
пламени и окрашенный кристаллвиолетом.
Возбудителями
маслянокислого
брожения
являются
маслянокислые бациллы. Они были открыты Л. Пастером в 1861 году.
Широко распространены в почве, навозе, воде, на разлагающихся
органических остатках. Все они относятся к роду Clostridium.
Характеристика маслянокислых бацилл. Грамположительные.
Представляют собой палочки, подвижные (перитрихи – двигаются
кувыркаясь), содержат гранулёзу, споровые – у типичных спора
расположена клостридиально, у нетипичных – плектридиально.
Облигатные анаэробы. Аминоавтотрофы. Ауксоавтотрофы. Среди них
есть мезофилы и термофилы.
Брожение крахмала вызывают типичные маслянокислые бациллы
Clostridium butyricum. Это крупные палочки (1×8 мкм). Подвижные. В
клетках накапливается много запасного крахмалоподобного вещества
гранулёзы. При спорообразовании клетки приобретают веретеновидную форму – спора расположена терминально или субтерминально, спорообразование клостридиальное. В качестве источника
углерода могут использовать моно-, ди- и полисахариды (декстрины,
крахмал). Мезофилы. Облигатные анаэробы.
Зарисовывают маслянокислые бациллы в тетради, подписывают и
приводят их характеристику.
Материалы и оборудование: высокие пробирки с ватными
пробками, картофель, подставки для резки, скальпели, чашечки с
мелом и ложечки, колбы с дистиллированной водой, полоски бумаги
для обёртывания пробок, водяная баня, покровные стёкла, крепкий
раствор Люголя для окраски гранулёзы или кристаллвиолет.
39
Работа 15. Брожение пектиновых веществ
Пектиновые вещества – это межклеточные вещества растительных
тканей, склеивающие волокна. У технических культур (лён, конопля,
кенаф, джут, канатник и др.) лубяные волокна соединены с кострой и
паренхимой при помощи пектиновых веществ.
Пектиновые вещества являются сложными полисахаридами.
Имеются три типа пектиновых веществ: 1) протопектин – водонерастворимая часть клеточной стенки; 2) пектин – водорастворимый
полимер галактуроновой кислоты, содержащий метилэфирные связи;
3) пектиновая кислота – водорастворимый полимер галактуроновой
кислоты, свободный от метилэфирных связей.
Пектиновые вещества разлагаются микроорганизмами. Брожение
пектиновых веществ происходит в две фазы.
Первая фаза – гидролиз пектиновых веществ до моносахаров под
действием экзоферментов, выделяемых микроорганизмами:
протопектиназа
Протопектин + nН2О 
пектаза
пектин + nН2О 
пектиназа
С46Н68О40 + 10Н2О  4СНО(СНОН)4СООН + С6Н12О6 +
пектиновая
кислота
галактуроновая
кислота
галактоза
С5Н10О5 + С5Н10О5 + 2СН3СООН + 2СН3ОН
арабиноза
ксилоза
уксусная кислота
метиловый спирт
Вторая фаза - это маслянокислое брожение образовавшихся
моносахаров (галактозы, арабинозы, ксилозы):
С6Н12О6 (С5Н10О5)  СН3СН2СН2СООН + СН3СООН +СО2 + Н2
Брожение пектиновых веществ происходит при водяной мочке
льна.
Постановка опыта. Для изучения брожения пектиновых веществ
в лабораторных условиях воспроизводят процесс водяной мочки
льняных стеблей. Для этого готовят снопики из сухой льняной
соломки (высотой 6-8 см и толщиной соразмерно с диаметром
пробирки), перевязывают их в двух местах нитками и кипятят 3-5 мин
для удаления экстрактивных (легко сбраживающихся) веществ. Вода
40
при этом становится жёлто-зелёного цвета. Помещают снопики в
высокие пробирки, заливают на 2/3 их объёма водой, закрывают
ватными пробками и прогревают в кипящей водяной бане до
появления в жидкости пузырьков. Затем пробирки охлаждают под
краном и в снопик вводят свежий длинный стебель льняной соломки
для заражения. Пробирки вновь закрывают ватными пробками,
оборачивают их бумагой, подписывают и помещают в термостат при
температуре 28-30 ºС.
Элективные условия для брожения пектиновых веществ:
1) питательная среда – льняные волокна, освобожденные
кипячением от экстрактивных веществ;
2) присутствие бацилл мочки льна на стеблях и особенно на
соломке, используемой для заражения;
3) анаэробные условия благодаря высокому столбику жидкости в
пробирке;
4) устранение после кипячения и пастеризации неспоровых форм.
Результаты опыта. Брожение пектиновых веществ заканчивается
в пробирках через 7-8 дней. Снопики всплывают, вытесняемые
образовавшимися при брожении газами. Так как брожение пектиновых
веществ сводится к маслянокислому брожению, неприятный запах
масляной кислоты легко улавливается.
Ми кр о ско п ир о ва н ие возбудителей брожения пектиновых
веществ. Готовят препарат-мазок. Для этого извлекают снопик из
пробирки, достают из него соломинку и теребят. Затем растрёпанным
участком делают мазок по предварительно обезжиренному предметному стеклу. Мазок высушивают, фиксируют в пламени и
окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с. Рассматривают с помощью
иммерсионной системы микроскопа.
Брожение пектиновых веществ осуществляют бациллы мочки
льна. Они были открыты С.Н. Виноградским в 1895 г.
К бациллам мочки льна относятся Clostridium pectinovorum и
Clostridium felsineum.
Характеристика бациллы мочки льна. Являются нетипичными
маслянокислыми бактериями. Углерод используют только в виде
пектиновых веществ. Грамположительные. Подвижные палочки
размером 10-15 мкм. Спорообразование плектридиальное – спора
находится на конце клетки, и они имеют вид ракетки или барабанной
41
палочки. Содержат гранулёзу. Clostridium pectinovorum представляют
собой крупные палочки с длинной вегетативной частью. Clostridium
felsineum – палочки меньшего размера с более короткой вегетативной
частью, эти бактерии более кислотоустойчивые. В процессе водяной
мочки льна они сменяют предыдущие бактерии, поэтому встречаются
чаще в перекисших пробирках. Бациллы мочки льна – облигатные
анаэробы. По отношению к источнику азота малотребовательны,
способны усваивать любые его формы.
Зарисовывают бациллы мочки льна в тетради, подписывают и
дают им характеристику.
Материалы и оборудование: льняная соломка, высокие пробирки
с ватными пробками, ножницы, нитки, пинцеты, водяная баня,
кристаллвиолет.
Ра б о т а 16. Брожение клетчатки
Клетчатка, или целлюлоза представляет собой сложный полисахарид (С6Н10О5)n, входящий в состав оболочек растительных клеток.
Растения на 40-70 % состоят из клетчатки. На долю этого вещества
приходится более 50 % всего органического вещества биосферы. Огромное количество целлюлозы в виде растительных остатков и отходов попадает в почву и водоёмы, где разлагается микроорганизмами –
бактериями, актиномицетами, микроскопическими грибами.
В анаэробных условиях происходит брожение клетчатки. Химизм
разложения состоит из двух фаз.
Первая фаза – гидролиз клетчатки под действием экзоферментов,
выделяемых микроорганизмами, до глюкозы:
целлюлаза
целлобиаза
(С6Н10О5)n + nН2О  nС12Н22О11 + nН2О  nC6Н12О6.
целлюлоза
целлобиоза
β-глюкоза
Вторая фаза - это дальнейшее сбраживание глюкозы по типу
маслянокислого брожения с образованием различных органических
веществ:
С6Н12О6  СН3СН2СН2СООН + СН3СООН + СН3СНОНСООН +
β-глюкоза
масляная кислота
уксусная кислота
42
молочная кислота
СН3СН2ОН + НСООН + СО2 + Н2.
муравьиная кислота
Постановка опыта. Для получения накопительной культуры
анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий пользуются питательной
средой Омелянского следующего состава, г: (NH4)3PO4 – 1,0, K2HPO4 –
1,0, MgSO4 – 0,5, NaCl – 0,1, CaCO3 – 2,0, FeSO4 – 2 капли 1%-ного
раствора, пептон – 0,6, дистиллированная вода – 1000 мл.
При подготовке опыта среду разливают в колбы на 2/3 объема.
Добавляют 0,5-1 г почвы и кипятят колбы со средой и почвой 5 мин
для уничтожения неспоровых форм. Вносят в колбу несколько полосок
фильтровальной бумаги. Доливают доверху питательную среду и
закрывают колбу пробкой с затвором для выхода газов. Помещают в
термостат при температуре 30-35 ºС.
Элективные условия для развития целлюлозоразлагающих бацилл:
1) источник углерода – клетчатка (фильтровальная бумага);
2) внесение целлюлозоразлагающих бацилл с почвой;
3) анаэробные условия;
4) минеральные элементы и пептон для питания;
5) освобождение от неспоровых форм при кипячении.
Результаты опыта. Опыт продолжается 2-3 недели.
Микр о с ко п ир о ва н и е . Со дна колбы извлекают пинцетом
кусочек разлагающейся бумаги и делают ею мазок по обезжиренному
предметному стеклу. Высушивают, фиксируют в пламени, окрашивают кристаллвиолетом (30-60 с) и исследуют с помощью иммерсионной системы микроскопа.
Брожение целлюлозы вызывают целлюлозоразлагающие бациллы.
Они широко распространены в почве, навозе, речном иле, сточных
водах.
К целлюлозоразлагающим бациллам относятся:
Clostridium omelianskii (открытый В.Л. Омелянским в 1902 г.) и
Clostridium dissolvens – эти две формы мезофилы – оптимальная
температура для их развития 30-40 ºС. К термофильным относится
Clostridium thermocellum – оптимальная температура около 60 ºС.
В приготовленной колбе при невысоких температурах инкубации
будут развиваться первые две формы.
Характеристика целлюлозоразлагающих бацилл. Относятся к
маслянокислым бактериям, но нетипичным – углерод используют
только в виде клетчатки. Это грамположительные длинные палочки,
подвижные, спорообразование плектридиальное (крупная спора
43
находится на конце тонкой вегетативной
клетки), облигатные
анаэробы. Clostridium omelianskii – имеет круглую правильной формы
спору, а у Clostridium dissolvens – спора грушевидной, чуть
сплюснутой формы.
Зарисовывают в тетради и описывают целлюлозоразлагающие
бациллы.
Материалы и оборудование: колбы ёмкостью 100 мл с резиновой
пробкой и затвором, (NH4)3PO4, K2HPO4, MgSO4, NaCl, FeSO4, CaCO3,
пептон, почва, полоски фильтровальной бумаги, пинцеты,
кристаллвиолет.
Ра б о т а 17. Окисление клетчатки
Аэробное разложение, или окисление клетчатки (целлюлозы)
проходит в две фазы. Первая фаза – это гидролиз под действием
выделяемых микроорганизмами экзоферментов до β-глюкозы, а вторая
фаза – это полное окисление поглощенной микробами β-глюкозы до
углекислого газа и воды:
целлюлаза
целлобиаза
(С6Н10О5)n + nН2О  nС12Н22О11 + nН2О 
целлюлоза
целлобиоза
nC6Н12О6 + О2  СО2 + Н2О.
β-глюкоза
Постановка опыта. В работе используют метод почвенных
пластинок Кристенсена. Чашку Петри заполняют почвой слоем около
1 см, предварительно увлажнённой водой или средой Гетчинсона
следующего состава, г: NaNO3 – 2,5, K2HPO4 – 1,0, MgSO4 – 0,3, CaCl2
– 0,1, NaCl – 0,1, FeCl3 – 0,01, вода дистиллированная – 1000 мл.
Поверхность почвы выравнивают шпателем, сверху накладывают
кружок фильтровальной бумаги и плотно прижимают к поверхности
среды, чашки помещают в термостат, при 27-30 ºС. Периодически
смачивают почву в чашке водой, но не допускают того, чтобы вода
полностью заливала фильтровальную бумагу, и не развивались бы на
фильтровальной бумаге анаэробные целлюлозоразлагающие бактерии.
Результаты опыта. Через 4-5 суток после постановки опыта на
бумаге появляются пигментные зоны и ослизненные участки,
указывающие на разрушение клетчатки. Через 1,5-2 недель их можно
микроскопировать.
44
Ми кр о ско п ир о ва н ие . Для микроскопического изучения
аэробных целлюлозоразлагающих бактерий бактериологической
петлей берут немного слизи, покрывающей фильтровальную бумагу,
растирают её на предметном стекле, фиксируют мазок в пламени и
окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с. Препарат рассматривают,
пользуясь иммерсионной системой микроскопа.
Возбудителями аэробного разложения клетчатки являются
бактерии, актиномицеты, плесневые грибы. Наибольшее значение
имеют бактерии. К ним относятся миксобактерии, цитофаги и
вибрионы. Миксобактерии образуют яркоокрашенные слизистные
плодовые тела на разлагающейся древесине. На фильтровальной
бумаге в нашем опыте развиваются в основном цитофаги и вибрионы.
Цитофаги – Cytophaga – крупные длинные слегка изогнутые
палочки с острыми краями.
Вибрионы: Cellvibrio – мелкие тонкие изогнутые клетки и
Cellfalcicula – мелкие короткие толстые изогнутые клетки с
заостренными концами.
Характеристика аэробных целлюлозоразлагающих бактерий:
грамотрицательные, палочки и вибрионы, подвижные, неспоровые.
Зарисовывают и описывают аэробные целлюлозоразлагающие
бактерии в тетради.
Материалы и оборудование: чашки Петри, среда Гетчинсона,
дистиллированная вода, почва, простерилизованные кружки
фильтровальной бумаги, шпатели, кристаллвиолет.
Ра б о т а 18. Окисление спирта в уксусную кислоту
Типичным примером процессов неполного окисления является
окисление спирта в уксусную кислоту:
СН3СН2ОН + О2  СН3СООН + Н2О.
При неполном окислении вещества окисляется не до СО 2 и Н2О, а до
различных органических кислот, имеющих применение в народном
хозяйстве. Окисление спирта в уксусную кислоту используют в
производстве уксуса из вина и спирта.
Постановка опыта. В колбы наливают по 30-50 мл непастеризованного пива или лёгкого вина (виноградного, яблочного или
ягодного) и добавляют 5-10 мл 10 %-ной уксусной кислоты для
подкисления среды. Помещают в термостат при температуре 25-30 ºС.
45
Результаты опыта. Через несколько дней (2-6) на поверхности
среды появляется серовато-белая плёнка уксуснокислых бактерий.
Препаровальными иглами переносят небольшие кусочки плёнки с
поверхности скисшего пива или вина в фарфоровую чашку и на
предметное стекло.
Опр е де ле н ие в ид а ук с у сно к ис л ы х ба к тер и й . Добавляют к
плёнке в фарфоровой чашке несколько капель раствора Люголя и
устанавливают реакцию на йод.
Ми кр о ско п ир о ва н ие . Для микроскопического исследования
бактериальную пленку на предметном стекле аккуратно расправляют,
фиксируют в пламени, окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с, рассматривают с иммерсией.
Уксуснокислые бактерии широко распространены в природе,
встречаются на зрелых плодах, ягодах, в квашеных овощах, вине, пиве,
квасе. Они были открыты Л. Пастером в 1868 г.
На пиве и вине хорошо развиваются:
Acetobacter aceti – типичные уксуснокислые бактерии, образуют на
поверхности гладкую слизистую пленку, окрашивающуюся йодом в
жёлтый цвет. Развиваются при относительно низких температурах
(20-22 ºС);
Acetobacter pasteurianum – образуют на поверхности среды
морщинистую сухую плёнку, окрашивающуюся йодом в синий цвет.
Оптимальная температура развития 30-34 ºС.
Характеристика уксуснокислых бактерий. Грамотрицательные.
Представляют собой короткие палочки, расположенные цепочками,
неспоровые, в основном подвижные, строгие аэробы – образуют
плёнки на поверхности среды, отличаются высокой устойчивостью к
кислотам (ацидофильные).
Зарисовывают и описывают уксуснокислые бактерии в тетради.
Материалы и оборудование: пиво или лёгкое вино в
плоскодонных колбах на 100 мл, 10 %-ная уксусная кислота,
цилиндры, препаровальные иглы, кристаллвиолет, раствор Люголя,
фарфоровые чашки.
Ра б о т а 19. Окисление микроорганизмами жира
Жир входит в состав клеток всех организмов как конституционное
и запасное вещество. В почву жир попадает с растительными,
животными и микробными остатками. Микроорганизмы, окисляющие
46
жир, выделяют фермент липазу, который вызывает гидролиз жира до
глицерина и жирных кислот. Продукты гидролиза в дальнейшем
постепенно полностью окисляются до углекислого газа и воды:
липаза
С3Н5(С17Н35СОО)3 + 3Н2О  С3Н5(ОН)3 +
тристеарин
глицерин
3С17Н35СООН + О2  СО2 + Н2О.
стеариновая кислота
Постановка опыта. Приготавливается среда Рана, г: К2НРО4 – 5;
(NН4)3РO4 – 5; CaCl2 – 1; MgSO4 – 1; NaCl – следы; FeCl3 – следы; вода
дистиллированная - 1000 мл. Среду наливают в колбы по 30 мл и
заражают 1/3 чайной ложки почвы. Вносят 1 мл касторового (или
подсолнечного) масла. Помещают в термостат при 25-30 ºС.
Результаты опыта. На 7-10-е сутки по мере развития
жироокисляющих микроорганизмов в прозрачном масле появляются
белые хлопья нерастворимых в воде жирных кислот.
Ми кр о ско п ир о ва н ие . Готовят препарат-мазок с поверхности
среды в колбе, фиксируют в фиксаторе из спирта и эфира несколько
минут, окрашивают фуксином (30-60 с), исследуют с иммерсионной
системой.
Кроме того, используется простокваша, которая хранится при
комнатной температуре, на её поверхности появляется кремовая
бархатистая морщинистая плёнка молочной плесени, из которой
готовят препарат мазок, фиксируют в фиксаторе, окрашивают
метиленовым синим (2-3 мин) и рассматривают с иммерсией.
Окисление жира в почве происходит под действием некоторых
бактерий и плесневых грибов.
Из бактерий наиболее энергично в почве разлагает жиры
Pseudomonas fluorescens – мелкая, подвижная, неспоровая аэробная
палочка, образующая в питательной среде зеленоватый пигмент.
На молочном продукте легко можно найти молочную плесень
Oidium lactis – относится к дрожжеподобным грибам, растёт в виде
крупных длинных нитей, размножается делением и почкованием.
Зарисовывают все микробы в тетради и подписывают.
Материалы и оборудование: колбы на 100 мл, среда Рана,
касторовое или подсолнечное масло, стаканчик на 100 мл с
простоквашей и плёнкой на её поверхности, фиксатор из спирта и
эфира (1:1), фуксин, метиленовый синий.
47
Раздел 6. ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ АЗОТА
Азот – один из элементов-органогенов, он входит в состав
аминокислот, белков, мочевины, хитина, нуклеиновых кислот и других
органических веществ. Его значение в питании растений велико. В
почве азот находится в первом минимуме. В воздухе атмосферный
молекулярный азот (N2) составляет 78,1 %, но растения не могут его
усваивать. Растениям недоступен и органический азот, они могут
усваивать только минеральные формы азота (аммиачный, нитратный,
нитритный). Превращение форм азота в почве осуществляется
микроорганизмами и состоит из следующих этапов:
1) аммонификация;
2) нитрификация;
3) денитрификация:
4) биологическая азотфиксация.
Ра б о т а 20. Аммонификация белковых веществ
Аммонификация – это разложение органических азотсодержащих
веществ с выделением азота в виде аммиака (NH3). Этот процесс
называется также минерализацией азота или гниением. В почву
белковые вещества попадают с остатками отмерших растений,
животных, микроорганизмов, с органическими удобрениями. При
аммонификации белковых веществ выделяется аммиак, углекислый
газ, при анаэробном распаде могут образовываться дурнопахнущие
продукты – сероводород, меркаптаны, скатол, индол, кадаверин
(трупные яды).
Постановка опыта. Для выращивания аммонифицирующих
бактерий используют мясопептонный бульон (МПБ) с 3 % пептона или
пептонную воду. Среду разливают в маленькие пробирки с ватными
пробками чуть больше, чем наполовину их объёма, добавляют немного
почвы для заражения, закрепляют две индикаторные бумажки:
розовую лакмусовую – индикатор на аммиак, а полоску
фильтровальной бумажки, пропитанную в растворе уксуснокислого
свинца – индикатор на сероводород (бумажки не должны касаться
среды). Пробирки закрывают ватными пробками, плотно оборачивают
пробки пергаментной бумагой, подписывают и помещают в термостат
при температуре 25-30 ºС.
Элективные условия для аммонификации:
48
1) обилие в среде белковых форм азота;
2) высокий столбик среды позволяет развиваться на поверхности
среды аэробам, в середине толщи среды – факультативным анаэробам,
а на дне пробирки - облигатным анаэробам.
Результаты опыта. Через неделю делают выводы о продуктах,
выделяемых
при
аммонификации
белковых
веществ
и
микроскопируют возбудителей этого процесса.
Опр е де ле н ие ам м иа ка и с ер о во до р о да.
Посинение розовой лакмусовой бумажки свидетельствует о
выделении аммиака.
Почернение фильтровальной бумажки, смоченной уксуснокислым
свинцом, говорит о выделении сероводорода, а если она еще и
покроется серебристым налетом, значит наряду с сероводородом
выделяются и меркаптаны.
Отмечают в опытных пробирках изменение цвета индикаторных
бумажек и делают выводы о выделяющихся в результате
аммонификации белковых веществ газах.
Ми кр о ско п ир о ва н ие . Готовят препарат-мазок, для этого
бактериальную петлю опускают почти до самого дна пробирки и
удерживают там несколько секунд, потом медленно поднимают петлю,
задерживаясь посередине толщи среды еще на несколько секунд, а
затем извлекают из пробирки и делают мазок, чтобы в готовом
препарате можно было найти разных по отношению к кислороду
микробов. Фиксируют в пламени, красят кристаллвиолетом (30-60 с) и
рассматривают с иммерсией.
Белки могут разлагаться бактериями, актиномицетами, грибами.
Среди аммонифицирующих (гнилостных) бактерий встречается
большое разнообразие, различных по форме и по-разному
относящихся к кислороду. Среди них есть легко узнаваемые по ряду
морфологических признаков:
Аэр о б ы . Bacillus mycoides – грибовидная бацилла – небольшие
палочки (0,8×5-7 мкм), подвижные, спорообразование центральное,
бациллярное, клетки соединены в длинные цепочки. (На твёрдых
питательных средах дают характерные грибовидные колонии).
Bacillus mesentericus – картофельная палочка – крупные палочки
(0,6×8-10 мкм) с бациллярным спорообразованием, с закругленными
концами, одиночные или соединенные в цепочки.
Ф ак ул ь т ат и в ны е а на э р о бы . Proteus vulgaris протей
обыкновенный – тонкие, подвижные, неспоровые палочки различной
49
длины (0,3×4-6 и более мкм). Из-за своей полиморфности названы в
честь мифического бога Протея.
Escherichia coli – кишечная палочка – подвижные, мелкие,
короткие, неспоровые палочки (0,5×2-4 мкм).
Об л и га т ные а на э р о б ы . Clostridium putrificus – гнилостная
палочка – подвижные палочки с плектридиальным расположением
споры (спора на конце клетки, которая имеет вид барабанной
палочки).
Clostridium sporogenes – спорогенная палочка –палочки округлой
формы (5-6 мкм), подвижные, спорообразование клостридиальное
(спора занимает почти всю центральную часть клетки, имеющий вид
лимона).
Характеристика аммонифицирующих (гнилостных) бактерий:
среди них есть грамположительные и грамотрицательные формы, они
представляют собой палочки, подвижные, споровые и неспоровые,
аэробы, факультативные анаэробы и облигагатные анаэробы,
гетеротрофы.
Зарисовывают найденные аммонифицирующие бактерии в тетради
и подписывают.
Материалы и оборудование: питательная среда (МПБ с 3 %
пептона или ПВ), разлитая в малые пробирки с ватными пробками,
фарфоровые чашки с почвой и ложечками, чашки Петри с розовой
лакмусовой бумагой и полосками фильтровальной бумаги,
пропитанные раствором уксуснокислого свинца Pb(CH3COO)2,
кристаллвиолет.
Ра б о т а 21. Нитрификация
Нитрификация – это процесс окисления аммиака (или аммиачных
форм азота) сначала в азотистую кислоту (или нитриты), а затем в
азотную кислоту (или нитраты). Этот процесс идет в две фазы:
I фаза – 2NH3 + 3O2 = 2HNO2 + 2H2O + 275 кДж,
II фаза – 2HNO2 + O2 = 2HNO3 + 87 кДж.
Постановка опыта. Для исследования процесса нитрификации
готовят питательную среду Виноградского по табл. 3.
50
Таблица 3
Питательная среда для нитрификации
Состав
питательной среды
(NН4)2 SO4
К2НРО4
MgSO4
NaCl
FeSO4
CaCO3 (сухой)
Концентрация, %
Объём рабочих
растворов, мл
Объём среды, мл
0,2
0,1
0,05
0,2
0,04
0,5
5
5
5
5
5
0,13 г
25
Питательную среду наливают в плоскодонные колбы
Виноградского или Эрленмейера, заражают 0,1 г почвы, плотно
закрывают ватными пробками, подписывают и помещают в термостат
при температуре 25-30 ºС.
Элективные условия для нитрификации:
1) присутствие в среде аммиачной формы азота;
2) отсутствие в среде органических форм углерода, так как
нитрифицирующие бактерии строгие автотрофы;
3) аэробные условия за счёт тонкого слоя среды на большой
поверхности дна колбы;
4) нейтральная среда за счёт внесения мела;
5) набор минеральных элементов питания.
Результаты опыта. Нитрификация проходит очень медленно. В
почве обе фазы идут одновременно, а в жидких питательных средах
фазы нитрификации проходят последовательно. Пока есть аммиак,
идет первая фаза его окисления в азотистую кислоту, и только после
полного исчезновения аммиака начинается вторая фаза – окисление
азотистой кислоты в азотную.
Для наблюдения за ходом нитрификации на 7, 14, 21 и 28-й день
производят капельные реакции на аммиак, азотистую и азотную
кислоты.
Пр о б а н а ам м иа к . В фарфоровую чашечку вносят 2-3 капли
жидкости из колбы и 1 каплю реактива Несслера. В присутствии
аммиака появляется желто-оранжевое окрашивание, при его избытке –
коричневые хлопья.
Пр о б а на азо т ис т ую к и сло т у и л и н итр и ты . В фарфоровую
чашечку вносят 2-3 капли жидкости из колбы, каплю 20 %-ной серной
51
кислоты и 1-2 капли реактива цинк-йод-крахмал. В присутствии
азотистой кислоты появляется синее окрашивание.
Пр о б а н а азо т н ую к и сло т у и л и н итр ат ы . Делают при
отсутствии аммиака (в присутствии нитритов можно добавить для их
нейтрализации несколько кристаллов мочевины). В фарфоровую
чашечку вносят 2-3 капли жидкости из колбы и 1-2 капли
дифениламина в крепкой серной кислоте. В присутствии азотной
кислоты появляется синее окрашивание.
Результаты капельных реакций заносят в табл. 4.
Таблица 4
Наблюдение за ходом нитрификации
Дата
Результаты капельных реакций на:
NН3
HNO2
HNO3
Вывод о ходе
нитрификации
Условные обозначения:
+ + очень сильная реакция,
+ положительная реакция,
+ – неопределенная реакция,
– отрицательная реакция.
Ми кр о ско п ир о ва н ие . После завершения первой фазы
нитрификации (на 21-й или 28-й день) готовят препарат-мазок с
поверхности
среды.
Фиксируют
в
пламени,
окрашивают
кристаллвиолетом (30-60 с), исследуют под микроскопом с иммерсией.
Нитрификацию вызывают нитрифицирующие бактерии, которые
были впервые получены в чистой культуре в 1890г С.Н Виноградским.
Нитрификаторы распространены почти повсеместно. Особенно их
много в хорошо обработанных плодородных почвах, а в кислых
почвах они отсутствуют.
Нитрифицирующие бактерии строго специфичны в отношении
окисляемого вещества. Нитрифицирующие бактерии первой фазы
окисляют аммиак в азотистую кислоту и не способны окислять
азотистую кислоту в азотную. Они называются нитрозными
бактериями. К ним относится Nitrosomonas europaea – европейский
нитрозомонас – это мелкие (1-1,5 мкм), подвижные, округлые палочки.
Нитрифицирующие бактерии второй фазы способны окислять
только азотистую кислоту в азотную и не развиваются в присутствии
52
аммиака. Они называются нитратными бактериями. К ним относится
Nitrobacter winogradskii – нитробактер Виноградского – это мелкие
(1 мкм) палочки клиновидной (грушевидной) формы – один конец у
них более узкий, неподвижные.
Характеристика
нитрифицирующих
бактерий:
грамположительные, среди них встречаются кокки, палочки, извитые и
другие формы, бывают подвижные и неподвижные формы,
неспоровые, строгие аэробы и автотрофы (хемолитоавтотрофы) –
осуществляют хемосинтез – энергию, получаемую при окислении
аммиака или азотистой кислоты используют для построения из СО 2
органического вещества.
Находят и зарисовывают нитрифицирующие бактерии первой и
второй фазы в тетради.
Материалы и оборудование: колбы Виноградского или
Эрленмейера на 250 мл с ватными пробками, штативы с пробирками с
приготовленными растворами (NH4)2SO4, К2НРО4, MgSO4, NaCl, FeSO4
и пустыми подписанными пробирками-подставками с пипетками на
5 мл, фарфоровые чашки с почвой и ложечками, а также мелом и
ложечками, карандаши по стеклу, фарфоровые чашечки для капельных
реакций, длинные пипетки, реактив Несслера, цинк-йод-крахмал, 20
%-ная Н2SО4, дифениламин, кристаллвиолет.
Ра б о т а 22. Денитрификация
Денитрификация – это процесс восстановления нитратов и
нитритов до молекулярного азота (N2). При этом происходит потеря
почвой доступных растениям минеральных форм азота. Это явление
носит отрицательный характер. Денитрификация делится на прямую,
или микробиологическую – это биологическое восстановление
нитратов, и косвенную, или химическую – это химическое
восстановление нитратов (происходит в кислой среде).
Прямая денитрификация осуществляется денитрифицирующими
бактериями и происходит в анаэробных условиях в результате их
нитратного дыхания, когда микроорганизмы используют для
окисления органического вещества не свободный молекулярный
кислород, а при его отсутствии связанный кислород нитратов или
нитритов.
Постановка
опыта.
Для
наблюдения
за
процессом
денитрификации готовят питательную среду следующего состава, г:
53
сегнетовая соль (калий натрий виннокислый) - 20,0; KNO3 – 2,0;
K2HPO4 – 0,5; MgSO4 – 0,1; вода дистиллированная – 1000 мл.
Среду наливают в колбу на половину её объёма, добавляют 0,5 г
почвы, тщательно перемешивают для удаления пузырьков воздуха,
затем наполняют колбу питательной средой до самых краёв и
закрывают пробкой, в которую вставлена открытая с двух сторон
стеклянная трубка, расширенная в средней части. Пробка вытесняет
часть жидкости из колбы в стеклянную трубку. Наливают в трубку
несколько капель вазелинового масла, чтобы создать в колбе
анаэробные условия. Колбу подписывают и помещают в термостат.
Элективные условия для денитрификации:
1) нитратная форма азота в среде;
2) анаэробные условия;
3) набор элементов питания для денитрифицирующих бактерий.
Результаты опыта. Через неделю опыт завершается. Отмечают
появление пузырьков газов (СО2 и N2) и изменение цвета среды.
Чтобы доказать, что нитраты исчезли, делают капельную реакцию на
нитраты с дифениламином (см. лабораторную работу 21) и записывают вывод в тетради.
Ми кр о с ко п ир о в а н ие . Для знакомства с денитрифицирующими бактериями берут пробу петлей из нижней части колбы и
делают препарат-мазок. Фиксируют в пламени, красят кристаллвиолетом (30-60 с), рассматривают с иммерсионной системой
микроскопа.
К денитрифицирующим бактериям относятся:
Paracoccus denitrificans, Pseudomonas studzeri, Pseudomonas fluorescens
(последний вызывает позеленение среды, т. к. выделяет зеленый
флуоресцирующий пигмент).
Характеристика денитрифицирующих бактерий: грамотрицательные, мелкие палочки и кокки, подвижные, неспоровые,
факультативные анаэробы – в аэробных условиях они осуществляют
аэробное дыхание, а при отсутствии кислорода – анаэробное
(нитратное) дыхание, гетеротрофы.
Зарисовывают в тетради возбудителей денитрификации.
Материалы
и оборудование:
питательная
среда
для
денитрифицирующих бактерий, колба на 100 мл с затвором,
вазелиновое масло, почва, этикетка, фарфоровые чашки, дифениламин,
пипетки, кристаллвиолет.
54
Ра б о т а 23. Свободноживущие азотфиксирующие
микроорганизмы
Микроорганизмы, обитающие в почве самостоятельно и
способные использовать молекулярный азот атмосферы для
построения
своего
органического
вещества,
называются
свободноживущими азотфиксаторами. После их отмирания в почве
происходит минерализация органического азота до аммиака,
доступного для питания растений. Масштабы поступления
биологического азота в почву за счёт деятельности свободноживущих
в ней азотфиксаторов значительны и могут составлять 15-50 кг азота
на гектар и более.
Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы делятся на
анаэробные и аэробные.
1. Аэробный свободноживущий азотфиксатор Clostridium
pasteurianum
Этот микроб был открыт в 1893 г. С.Н. Виноградским и назван в
честь Л. Пастера. Энергию, получаемую в результате маслянокислого
брожения органических форм углерода (моно-, ди- и полисахаридов),
использует на связывание молекулярного азота. Азотфиксирующая
способность составляет 10-12 мг азота на 1 г сброженного сахара. Эти
микроорганизмы встречаются во всех почвах.
Постановка опыта. Для создания накопительной культуры
Clostridium
pasteurianum
используют
безазотистую
среду
Виноградского следующего состава, г: глюкоза – 20,0; К2НРО4 – 1,0;
MgSO4 – 0,5; NaCl – 0,5; вода дистиллированная – 1000 мл.
Среду разливают в высокие пробирки на 2/3 их объема, добавляют
0,5 г мела (для нейтрализации масляной кислоты) и заражают 1 г
почвы. Пробирки закрывают ватными пробками, оборачивают пробки
бумагой, подписывают. Подготовленные пробирки пастеризуют при
температуре 60 С в течение 30 мин, а затем помещают в термостат
при 25-30 С.
Элективные условия для развития Clostridium pasteurianum:
1) отсутствие в среде азота;
2) анаэробные условия за счёт высокого столбика среды в
пробирке;
3) присутствие глюкозы, необходимой для маслянокислого
брожения;
4) нейтральная среда за счёт мела;
55
5) необходимый набор элементов минерального питания;
6) пастеризация уничтожает неспоровые формы, а бациллы
остаются.
Результаты опыта. Через неделю пробирки исследуют.
Отмечают выделение газов и масляной кислоты в результате
брожения.
Ми кр о ско п ир о ва н ие .
Для
исследования
микробов
бактериологической петлей проводят по стенке в нижней части
пробирки, где в осадке мела, часто покрытые пленкой, накапливаются
клостридиумы. Быстро переносят микробы на предметное стекло и
готовят препарат-мазок, фиксированный в пламени и окрашенный
кристаллвиолетом (30-60 с). Рассматривают, пользуясь иммерсионной
системой микроскопа.
Характеристика Clostridium pasteurianum. Являются типичными
маслянокислыми
бациллами.
Грамположительные.
Клетки
представляют собой крупные палочки шириной 0,8-1,3 и длиной
1,5-8 мкм, подвижные (перитрихи), споровые (спорообразование
клостридиальное, клетки имеют вид веретена), откладывают в теле
гранулёзу, облигатные анаэробы, гетеротрофы.
Зарисовывают в тетради споровые формы.
2. Аэробный свободноживущий азотфиксатор Азотобактер
(Azotobacter chroococcum)
Азотобактер впервые выделен в чистой культуре голландским
ученым М. Бейеринком в 1901 г. В настоящее время известно около 10
видов азотобактера. Наиболее распространенным и хорошо изученным
является Azotobacter chroococcum – обитатель почв всех типов, кроме
кислых. Образует на плотной питательной среде Эшби колонии с
бурым, почти чёрным пигментом. Для Azotobacter agilis характерны
бесцветные колонии, Azotobacter vinelandii дает флуоресцирующую
желтовато-зеленоватую
окраску
колоний.
Азотфиксирующая
способность у азотобактера составляет 15-20 мг азота на 1 г
потребляемого органического вещества.
Постановка опыта. Для выявления азотобактера в почве и
определения относительного его содержания пользуются методом
почвенных комочков. Для этого используют агаризованную
питательную среду Эшби следующего состава, г: маннит или глюкоза
– 20,0; К2НРО4 – 0,2; MgSO4 – 0,2; NaCl – 0,2; K2SO4 – 0,1; CaCO3 – 5,0;
агар-агар – 20,0; вода дистиллированная – 1000 мл.
56
Приготовленную среду разливают в чашки Петри и дают ей
застыть. Для оценки плодородия почв по плотности населения в них
азотобактера можно использовать две различные по плодородности
почвы. Тогда дно чашки карандашом по стеклу делят на две равные
части и отмечают их цифрами (1 и 2). Производят посев комочков
почвы диаметром примерно 2 мм с помощью стеклянной палочки,
смоченной в воде (25 комочков почвы № 1 на половину чашки с
номером один и 25 комочков почвы № 2 на половину чашки с номером
два). Комочки раскладывают на некотором расстоянии друг от друга и
хорошо смачивают водой.
Чашки закрывают, оборачивают бумагой, подписывают и
помещают в термостат при температуре 28-30 С.
Элективные условия для развития азотобактера:
1) отсутствие в среде азота;
2) аэробные условий, так как посев поверхностный;
3) присутствие в среде маннита, фосфора и минеральных
элементов для питания;
4) нейтральная среда за счёт мела;
5) достаточная влажность при хорошем увлажнении комочков.
Результаты опыта. Посеянные чашки исследуют через неделю.
Опр е де ле н ие
п ло тно ст и
нас ел е н ия
а зо т о ба к тер а.
Подсчитывают комочки почвы, вокруг которых появились
густослизистые бесцветные, светло-коричневые или тёмно-бурые
колонии азотобактера. Выражают число комочков обрастания в
процентах от общего количества разложенных комочков отдельно для
каждой почвы. Сравнивают эти показатели у анализируемых почв и
делают выводы об их плодородии.
Азотобактер очень требователен к плодородию почвы. Почва
должна быть нейтральной (рН 7,2-7,4), структурной (аэрируемой), с
влажностью 60-80 % ПВ, богатой органическим веществом, фосфором,
микроэлементами (Мо, В). Присутствие азотобактера в почве является
показателем её окультуренности и плодородия.
Ми кр о ско п ир о ва н ие . Для знакомства с азотобактером из
неподсохших блестящих слизистых колоний готовят препарат-мазок,
фиксированный в пламени и окрашенный метиленовым синим
(2-3 мин). Рассматривают с иммерсией.
В нашем опыте хорошо развивается Azotobacter chroococcum.
Характеристика азотобактера: грамотрицательный, по форме
встречаются кокки, палочки и цисты. Имеет ясно выраженный цикл
57
развития. В молодой культуре клетки имеют форму крупных, коротких
палочек с закругленными концами (размером 3×6 мкм), подвижные
(перитрихи), неспоровые. С возрастом клетки азотобактера принимают
округлую форму, становятся крупными кокками (диаметром 4 мкм) и
теряют подвижность. Кокки соединены по две или четыре клетки и
покрыты общей толстой слизистой капсулой. Содержат запасные
вещества волютин и гликоген. Именно эти клетки и фиксируют азот
атмосферы. Азотобактер очень влаголюбив – при нехватке влаги
становится цистами – покоящимися клетками, покрытыми плотной
оболочкой. Аэроб. Гетеротроф.
Из Azotobacter chroococcum готовят бактериальное удобрение –
азотобактерин (ризофил), которым обрабатывают семена различных
культур (овощных, картофеля, зерновых) перед посевом для
улучшения азотного питания растений и ростстимулирующего
действия в результате деятельности микроорганизмов.
Зарисовывают в тетради азотобактер и делают поясняющие
подписи.
Материалы и оборудование: для посева клостридиума - колбы со
средой Виноградского, фарфоровые чашки с почвой и ложечками, а
также чашки с мелом и ложечками, высокие пробирки с ватными
пробками, полоски бумаги для обертывания пробирок, водяная баня;
для посева азотобактера – чашки Петри со средой Эшби, две
чашки Петри с различными почвами и два стаканчика с
дистиллированной водой и стеклянными палочками, бумага для
обёртывания чашек;
для микроскопирования – кристаллвиолет и метиленовый синий.
Работа 24. Клубеньковые бактерии бобовых растений
Клубеньковые
бактерии
относятся
к
симбиотическим
азотфиксаторам. Они живут в клубеньках на корнях бобовых растений
и способны фиксировать азот атмосферы только в таком симбиозе.
Клубеньки у одних растений (горох, бобы) крупные, у других (клевер)
мелкие, у некоторых могут иметь вид больших бородавчатых наростов
на главном корне (люпин).
Клубеньковые бактерии характеризуются специфичностью –
заражают
только
определенные
виды
бобовых
растений;
вирулентностью – проникают в ткань корня, где размножаются и
58
вызывают образование клубеньков; активностью – способны
использовать молекулярный азот.
Наиболее энергично процесс усвоения азота в клубеньках
отмечается в фазе бутонизации и цветения бобовых, когда
клубеньковые бактерии принимают форму бактероидов. Однолетние
бобовые растения способны в симбиозе с клубеньковыми бактериями
накапливать за вегетационный период на 1 га от 50 до 100 кг азота, а
многолетние – 150-300 кг.
Ми кр о ско п ир о ва н ие . Для знакомства с клубеньковыми
бактериями готовят препараты-отпечатки или мазки из клубеньков
бобовых растений. Для этого отделяют клубеньки от корней,
помещают на предметное стекло и другим предметным стеклом
раздавливают и размазывают по поверхности. У люпина надрезают
нарост на корне и делают мазок обнажённой тканью. Фиксируют в
пламени, окрашивают кристаллвиолетом (30-60 с), рассматривают с
помощью иммерсионной системы. В препаратах отыскивают мелкие,
неспоровые палочки и крупные бактероиды.
Клубеньковые бактерии относятся к роду Rhizobium. В клубеньках
люпина развиваются Rhizobium lupini, клевера – Rhizobium trifolii,
гороха и бобов – Rhizobium leguminosarum.
Характеристика клубеньковых бактерий бобовых растений.
Грамотрицательные. В почве они представляют собой подвижные или
неподвижные палочки и кокки, азот фиксировать не могут. Проникая и
развиваясь в клетках корней, они становятся сначала неподвижными
палочками, которые с возрастом накапливают запасные вещества и
переходят в состояние так называемых опоясанных палочек (такие
клетки особенно хорошо видны у гороха). Затем из этих клеток
образуются бактероиды – клетки крупных размеров, неподвижные и
различной формы, специфичной для разных видов клубеньковых
бактерий: У-образной, Т-образной, нитевидной, грушевидной и др.
Именно бактероиды обладают азотфиксирующей способностью.
Клубеньковые бактерии неспоровые, аэробы и гетеротрофы.
Из клубеньковых бактерий готовят бактериальное удобрение –
нитрагин (ризоторфин, ризобин, сапронит), которым обрабатывают
семена бобовых растений перед посевом для ускорения образования
клубеньков и улучшения азотного питания растений. Бактеризация
культур производится специфичными им расами клубеньковых
бактерий.
59
Зарисовывают в тетради и подписывают бактероиды различных
видов клубеньковых бактерий.
Материалы и оборудование: зафиксированные в формалине
корни бобовых растений с клубеньками (горох, бобы, люпин, клевер),
маленькие пинцеты, лезвия, кристаллвиолет.
Раздел 7 . МИКРОБИОЛОГИЯ КОРМОВ
Ра б о т а 25. Исследование силоса, сенажа и квашеных
продуктов
Силос
Силосование – это способ консервирования влажной зеленой
растительной массы. Силос (от исп. silos – яма) один из древнейших
видов корма. В основе силосования (заквашивания) лежит
молочнокислое брожение. Силосованный корм сохраняет сочность,
приобретает кислый вкус, становится более мягким, лучше поедается
скотом и может храниться продолжительное время. Силос имеет
влажность 70-80 % и кислотность (рН) 4,0-4,2.
Для оценки качества силоса проводят органолептические,
химические и микробиологические исследования.
К
о р га но леп ти ч ески м п о ка за т еля м качества силоса
относятся цвет, запах, консистенция и вкус.
Цв ет должен быть ближе к цвету растений, из которых
приготовлен силос. Доброкачественный силос имеет оттенки зелёного,
жёлто-зелёного, коричнево-зелёного цвета. У испорченного силоса
преобладает тёмно-коричневый и чёрный цвет.
Зап а х доброкачественного силоса должен быть приятным,
напоминающим запах свежеиспечённого хлеба, мочёных яблок. При
порче силоса появляется запах уксуса и неприятный запах масляной
кислоты.
Ко нс ис т ен ц и я у доброкачественного силоса должна быть
выраженной. У испорченного силоса растительная масса делается
ослизнённой, листочки не отделяются друг от друга.
В к ус доброкачественного силоса слабокислый, приятный. У
испорченного силоса вкус резко кислый с горьковатым привкусом.
Важнейшим хи ми ч е ски м п о ка за те ле м качества силоса
является его к ис ло тно с ть . У силоса хорошего качества рН должна
быть около 4,0-4,2.
60
Ми кр о би о ло ги ч е ска я о ц енка качества силоса проводится по
его м и кр о ф ло р е . В силосе хорошего качества должны быть
молочнокислые бактерии и немного дрожжей, не должно быть
маслянокислых, гнилостных бактерий и плесневых грибов.
Выполнение. Для анализа из торцовой части траншеи, ямы или
наземных буртов берут среднюю пробу силоса и помещают в
стерильный кристаллизатор. Исследования рекомендуется проводить
не позднее 1-2 суток после взятия пробы.
Опр е де ле н ие р Н с и ло са . Навеску силоса 1 г растирают в
фарфоровой ступке с 10 мл дистиллированной воды. Настаивают
около 5 мин и определяют кислотность полученной вытяжки с
помощью индикаторной бумаги для определения рН силоса (цвет
опущенной в вытяжку бумажки сравнивают со шкалой).
Оц е н ка ка чес т ва с ил о са . Для определения
качества
исследуемого силоса используют метод его балльной оценки
органолептических и химических показателей, предложенный
А.Н. Михиным (табл. 5).
Таблица 5
Оценка качества силоса по А.Н. Михину
Показатели
Цвет:
зелёный
жёлто-зелёный или коричневый
чёрно-зелёный
чёрный
Запах:
ароматический, фруктовый, слабокислый, хлебный
слабоароматический, уксуснокислый, огуречный
резко уксуснокислый, запах масляной кислоты
затхлый, навозный, сильный запах масляной кислоты
Величина рН:
4,2 и ниже
4,3-4,5
4,6-5,0
5,1-6,0
6,1-6,3
6,4 и выше
Балл
3
2
1
0
4
3
2-1
0
5
4
3
2
1
0
Данные балльной оценки при определении цвета, запаха и рН
суммируют и получают общий балл, по которому определяют качество
силоса: 11-12 баллов – силос очень хорошего качества, 9-10 –
хорошего качества, 7-8 – среднего качества, 4-5 – плохого качества.
61
Силос, имеющий оценку 3 балла и ниже, считается очень плохим и
к скармливанию животным непригоден.
Производят оценку указанных показателей в баллах и делают
вывод о качестве исследуемого силоса.
Ми кр о ско п ир о ва н ие . Для знакомства с микрофлорой силоса из
него готовят препарат-отпечаток следующим образом. Берут пинцетом
наиболее сочный стебель и плотно прижимают его к предметному
стеклу. Можно положить силос на предметное стекло и прижать его
другим стеклом, тогда сразу на двух стеклах получится отпечаток.
Использованный растительный материал удаляют со стекла, а мазок
сушат, фиксируют в пламени и окрашивают кристаллвиолетом
30-60 с. Рассматривают препараты, пользуясь иммерсионной системой
микроскопа.
На поверхности растений находится эпифитная микрофлора –
гнилостные, молочнокислые бактерии, дрожжи, плесневые грибы. При
силосовании измельченная растительная масса помещается в ямы,
траншеи или башни, спрессовывается и изолируется от доступа
воздуха. Накопление молочной и уксусной кислот под действием
молочнокислых бактерий обуславливает сохранность силоса, потому
что нежелательные для силосования бактерии (маслянокислые,
гнилостные) не могут развиваться в среде с кислой реакцией.
Критические значения рН для развития различных групп бактерий:
молочнокислых – 3,5-4,0, маслянокислых – 4,7-5,0, гнилостных – 5,05,5. Кислую среду (рН 4,0) хорошо переносят плесневые грибы, но они
являются строгими аэробами и в хорошо укрытом засилосованным
корме
в
анаэробных
условиях
развиваться
не
могут.
Кислотоустойчивость свойственна также дрожжам, они встречаются в
силосе обычно в небольших количествах. Дрожжи сбраживают сахара
до спирта, что придает корму приятный запах и вкус, продуцируют
витамины и другие биологически активные вещества.
В препарате находят гомоферментативные молочнокислые
бактерии: растительную палочку - Lactobacterium plantarum – тонкие
неспоровые палочки, варьирующие в размере, и молочный
стрептококк – Streptococcus lactis – короткие цепочки или пары
кокков. Иногда встречаются клетки почкующихся дрожжей. В силосе
низкого качества обнаруживаются маслянокислые бациллы,
гнилостные бактерии и плесневые грибы.
Зарисовывают и подписывают микрофлору силоса в тетради.
62
Сенаж
Сенажирование – это способ консервирования провяленных
растений, главным образом бобовых, убранных в начале стадии
бутонизации. Сначала растительная масса 1-2 суток лежит в валках, а
затем ее подбирают, измельчают, загружают в траншеи или башни, ,
уплотняют и изолируют от воздуха. Влажность сенажа (сено-силоса)
составляет 40-60 %. Сохраняется под влиянием «физиологической
сухости»
и
биохимических
процессов,
вызываемых
микроорганизмами.
При подсушивании растений повышается осмотическое давление
их клеток и водоудерживающая сила растений может превышать
сосущую силу микробов. У гнилостных и маслянокислых бактерий
осмотическое давление меньше, чем у молочнокислых, поэтому при
подсушивании растительной массы гнилостные и маслянокислые
бактерии не развиваются, но действуют молочнокислые бактерии,
которые
вызывают
молочнокислое
брожение.
Однако
микробиологические процессы при сенажировании протекают
медленно. Сенаж содержит в 2,4 раза меньше молочной кислоты, чем
силос, нет масляной кислоты, рН сенажа составляет 4,7-5,0.
Микрофлора сенажа такая же, как у силоса, но количественно
микробов меньшее.
Выполнение. Для исследования сенажа определяют рН и готовят
препарат-отпечаток как и при исследовании силоса.
Зарисовывают в тетради микрофлору сенажа и отмечают его
кислотность.
Квашеные продукты
Молочнокислое брожение лежит в основе квашения капусты,
огурцов и др. Микробиологические процессы при этом такие же , как и
при силосовании.
Выполнение. Для исследования выжимают сок из квашеных
продуктов и определяют его кислотность с помощью индикаторной
бумаги для определения рН силоса. Затем делают препаратыотпечатки как и при исследовании силоса. Микрофлора квашеной
капусты и солёных огурцов такая же, как и в силосе.
В квашеной капусте развивается молочный стрептококк –
Streptococcus lactis, капустная палочка (разновидность растительной) –
Lactobacterium plantarum var. brassica и дрожжи Saccharomyces
cerevisiae.
63
В солёных огурцах – молочный стрептококк - Streptococcus lactis,
огуречная палочка (разновидность растительной) - Lactobacterium
plantarum var. cucumis и дрожжи - Saccharomyces cerevisiae.
В более кислых продуктах больше палочковидных молочнокислых
бактерий, а в менее кислых – шаровидных. Число дрожжевых клеток
также может быть различным – это зависит от содержания в растениях
сахара. Заполняют табл. 6.
Таблица 6
Результаты исследования квашеных продуктов
Название продукта
Кислотность,
рН
Название микрофлоры
Квашеная капуста
Солёный огурец
Зарисовывают в тетради микрофлору квашеных продуктов.
Материалы и оборудование: силос или сенаж, квашеная капуста,
солёные огурцы, ступки с пестиками, цилиндры на 100 или 50 мл,
дистиллированная вода, индикаторная бумага для определения рН
силоса со шкалой, кристаллвиолет.
64
Приложение
Приготовление красителей и индикаторов
Кристаллвиолет (метиловый фиолетовый), водный раствор:
метиловый фиолетовый кристаллический – 7 г, этиловый спирт
96-ный – 100 мл, вода дистиллированная – 900 мл. Раствор устойчив.
Фуксин основной, насыщенный спиртовой раствор: фуксин
основной кристаллический – 10 г, этиловый спирт 96-ный – 100 мл.
Раствор может хранится долгое время в бутылке из тёмного стекла.
Фуксин основной карболовый – фуксин Циля: фуксин основной
кристаллический – 1 г, карболовая кислота (фенол) – 5 г, этиловый
спирт 96-ный – 10 мл, вода дистиллированная – 100 мл. К спиртовому
раствору основного фуксина приливают 5%-ный раствор фенола (воду
для его приготовления подогревают до 50С), добавляют несколько
капель глицерина. Настаивают в термостате 48 ч и фильтруют через
бумажный фильтр. Раствор устойчив. Хранят в укупоренной таре.
Фуксин Пфейффера: карболовый фуксин Циля – 1мл, вода
дистиллированная – 9 мл. Готовят на срок не более 10 дней.
Фуксин основной, водный раствор: фуксин основной,
насыщенный спиртовой раствор – 1 мл, вода дистиллированная – 9мл.
Раствор устойчив.
Метиленовый синий, насыщенный спиртовой раствор:
метиленовый синий кристаллический – 10 г, этиловый спирт 96-ный –
100 мл. Оставляют на 2-3 дня в термостате, периодически встряхивая,
а затем фильтруют. Раствор устойчив.
Метиленовый синий, водный раствор: насыщенный спиртовой
раствор метиленового синего – 1 мл, вода дистиллированная – 9 мл.
Раствор устойчив.
Уксуснокислый синий Нейссера: готовят два раствора –
1. Метиленовый синий кристаллический – 0,1 г, этиловый спирт 96ный – 2 мл, уксусная кислота ледяная – 5 мл, вода дистиллированная –
100 мл;
2. Метиловый фиолетовый кристаллический – 0,1 г, этиловый спирт
96-ный – 1 мл, вода дистиллированная – 30 мл. Перед употреблением
смешивают две части первого раствора с одной частью второго.
Раствор неустойчив.
65
Раствор хризоидина: хризоидин кристаллический – 1,0 г, вода
дистиллированная горячая – 300 мл. Горячий раствор фильтруют через
бумажный фильтр, после охлаждения готов к употреблению.
Эритрозин карболовый, г: эритрозин кристаллический – 3, фенол
(карболовая кислота) – 5, вода дистиллированная – 100 мл.
Карболовую кислоту растворяют в воде, нагретой до 50 С, добавляют
эритрозин, отстаивают и фильтруют через бумажный складчатый
фильтр.
Раствор Люголя (для окраски по Граму), г: йод кристаллический–
1, калий йодистый – 2, вода дистиллированная – 300 мл. Навеску йода
и йодистого калия растирают в ступке пестиком, доливают 1 мл воды и
растирают, добавляют еще 5 мл воды, продолжая растирать. Когда
кристаллы растворятся, доливают всю оставшуюся порцию воды.
Хранят в темной посуде. Срок годности не более 30 дней.
Раствор Люголя (крепкий, для выявления гранулёзы), г: йод
кристаллический – 7, калий йодистый – 20, вода дистиллированная –
100 мл. Раствор готовят так же, как и предыдущий.
Бумажки Синёва: нарезают кусочки фильтровальной бумаги
размером 2×3 см; готовят 0,5%-ный спиртовой раствор
кристаллвиолета; пропитывают бумажки 2-3 раза в этом растворе,
высушивают; хранят защищенными от действия света.
Реактив Несслера, г: KJ – 7, HgJ2– 10, KOH – 10. Готовят два
раствора: 1. Навески KJ и HgJ2 растворяют в 40 мл дистиллированной
воды. 2 . Навеску КОН растворяют в 40 мл дистиллированной воды.
Растворы 1 и 2 смешивают и доводят общий объём до 100 мл. Хранят в
темной стеклянной посуде. В продаже имеется готовый реактив
Несслера.
Цинк-йод-крахмал: 2 г хлористого цинка (ZnCl2) растворяют в
100 мл дистиллированной воды, нагревают до кипения и приливают
растворённый крахмал (0,4 г крахмала в 10 мл воды). Объём смеси
доводят водой до 100 мл, кипятят до тех пор, пока она не станет
прозрачной, охлаждают (можно настаивать неделю) и добавляют 100
мл 0,2 %-ного раствора йодистого калия (0,2 г KJ в 100 мл воды) или
йодистого цинка.
Дифениламин: 1 г дифениламина (С6Н5-NН-С6Н5) растворяют в
100 мл крепкой серной кислоты и полученный раствор приливают к
20 мл дистиллированной воды.
66
Уксуснокислый свинец: 10 г уксуснокислого свинца Pb
(CH3COO)2 растворяют в 100 мл воды и приливают 10%-ный раствор
NaOH (10 г щелочи на 100 мл воды) до исчезновения осадка.
ЛИТЕРАТУРА
Аристовская Т.В. и др. Большой практикум оп микробиологии. М.: Высшая школа,
1962.
Авраменко И.Ф. Микробиология. М.: Колос, 1979.
Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии. М.: Агропромиздат, 1988.
Ежов Г.И. Руководство к практическим занятиям по сельскохозяйственной
микробиологии. М.: Высшая школа, 1981.
Колешко О.И. Экология микроорганизмов почвы. Мн.: Вышэйшая школа, 1981.
Микробиология: Методические указания к лабораторным занятиям /БСХА. Сост.
О.С. Кильчевская. Горки, 1995.
Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. М.: Агропромиздат, 1987.
Разумовская З.Г., Чижик Т.Я., Громов Б.В. Лабораторные занятия по почвенной
микробиологии. Л.: Изд-во ЛГУ, 1960.
Руководство к практическим занятиям по микробиологии /Под ред. Н.С. Егорова.
М.: Изд-во МГУ, 1983.
Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.:
Колос, 1993.
67
СОДЕРЖАНИЕ
ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ . . . 3
ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ . . . 4
Раздел 1. МОРФОЛОГИЯ И СИСТЕМАТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ . . 6
Р а б о т а 1. Основные формы бактерий . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Работа 2. Окраска по Граму . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Р а б о т а 3. Окраска капсул методом негативного контрастирования
(по Гинсу) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Работа 4. Окраска спор у бактерий (по методу Циля Н и л ь с е н а ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Р а б о т а 5 . О к р а с к а в о л ю т и н а ( п о м е т о д у Н е й с с е р а ) . . . . . . 12
Р а б о т а 6 . И с с л е д о в а н и е а к т и н о м и ц е т о в . . . . . . . . . . . . . 13
Работа 7. Исследование микроорганизмов в живом виде . . 14
Раздел 2. ПИТАНИЕ МИКРООРАГНИЗМОВ. . . . . . . . . . . . . 15
Р а б о т а 8. Питательные среды для микроорганизмов. . . . . . . . . . 15
Раздел 3. МИКРОБЫ И ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА. . . . . . . . . . . . 19
Р а б о т а 9 . С т е р и л и з а ц и я . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Р.аздел 4. МИКРОБИОЛОГИЯ ВОЗДУХА И ПОЧВЫ . . . . . . . . . 23
Р а б о т а 10. Количественный учёт и определение качественного состава
микрофлоры воздуха и почвы методом агаровых пластинок. . 23
Р а б о т а 1 1 . Прямой метод подсчёта числа микроорганизмов в почве по
Виноградскому. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Раздел 5. ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ
УГЛЕРОДА. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Р а б о т а 1 2 . Спиртовое брожение. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Р а б о т а 1 3 . Молочнокислое брожение. . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Р а б о т а 1 4 . Маслянокислое брожение. . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Р а б о т а 1 5 . Брожение пектиновых веществ. . . . . . . . . . . . . . 40
Р а б о т а 1 6 . Брожение клетчатки. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
Р а б о т а 1 7 . Окисление клетчатки. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Р а б о т а 1 8 . Окисление спирта в уксусную кислоту. . . . . . . . . . . 46
Р а б о т а 1 9 . Окисление микроорганизмами жира. . . . . . . . . . . . 47
Раздел 6. ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ АЗОТА. . . . . . 48
Р а б о т а 20. Аммонификация белковых веществ. . . . . . . . . . . .
49
Р а б о т а 21. Нитрификация. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
Р а б о т а 22. Денитрификация. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
Р а б о т а 23. Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы. . . 55
Р а б о т а 24. Клубеньковые бактерии бобовых растений. . . . . . . . . . 59
Раздел 7 . МИКРОБИОЛОГИЯ КОРМОВ. . . . . . . . . . . . . . . 61
Р а б о т а 25. Исследование силоса, сенажа и квашеных продуктов. . . . . 61
ПРИЛОЖЕНИЕ Приготовление красителей и индикаторов. . . . . . . 66
ЛИТЕРАТУРА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
68