03.02.07 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени
реклама
На правах рукописи Морданов Сергей Викторович РОЛЬ АНОМАЛИЙ ГЕНА BCR-ABL В РАЗВИТИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТЕРАПИИ ИМАТИНИБОМ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОИДНЫМ ЛЕЙКОЗОМ 03.02.07 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2013 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор медицинских наук Куцев Сергей Иванович Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Шатохин Юрий Васильевич Официальные оппоненты: Писарев Владимир Митрофанович, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение “НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского” Российской Академии медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярных механизмов критических состояний Челышева Екатерина Юрьевна, кандидат медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение “Гематологический научный центр” Министерства здравоохранения Российской Федерации, старший научный сотрудник научноклинического отделения химиотерапии миелопролиферативных заболеваний Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Российский национальный медицинский университет имени Н.И.Пирогова” Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита состоится «____»________ 2013г. в _____ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1. Автореферат разослан «___»___________ 2013 г. Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования В терапии хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) препаратами группы ингибиторов тирозинкиназ достигнуты впечатляющие успехи, оказавшие существенное влияние на развитие целенаправленной терапии онкологических заболеваний. Исследования молекулярной биологии ХМЛ, разработка таргетной терапии ингибиторами тирозинкиназ, развитие системы мониторинга эффективности терапии, молекулярно-биологический анализ механизмов резистентности по сути явились моделью для разработки современных принципов лечения лейкозов и солидных опухолей. Первым препаратом таргетной терапии ХМЛ стал иматиниб. Наиболее известным клиническим исследованием безопасности и эффективности иматиниба по сравнению с интерфероном в лечении ХМЛ является Международное рандомизированное исследование IRIS, результаты которого показали беспрецедентное превосходство иматиниба (Druker B.J. et al., 2006). После 6 лет терапии иматинибом пациентов в хронической фазе ХМЛ их общая выживаемость составила 88%, бессобытийная выживаемость – 83%, выживаемость без прогрессии в фазу акселерации и бластный криз – 93% (Hochhaus A. et al., 2007). Однако, несмотря на доказанную безопасность и безусловную эффективность иматиниба в качестве терапии ХМЛ первой линии после 5 лет терапии лишь около 2/3 общего числа пациентов достигают и удерживают полный цитогенетический ответ (O’Brien S.G. et al., 2008; de Lavallade H. et al., 2008). Таким образом, клиническая резистентность к терапии иматинибом развиваются у меньшинства пациентов с ХМЛ, но все же в достаточно высоком проценте случаев. В связи с этим исследования молекулярных причин резистентности и поиск путей возможного контроля над механизмами резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ у пациентов с ХМЛ остается актуальной проблемой. Одной из основных причин резистентности ХМЛ к терапии таргетными препаратами рассматриваются аномалии гена BCR-ABL: мутации киназного домена гена BCR-ABL (Roche-Lestienne C. et al., 2002; Shah N.P. et al., 2002), приводящие к конформационным изменениям BCR-ABL тирозинкиназы и неэффективности ингибиторов, а также появление дополнительных копий (амплификации) гена BCR-ABL (de Lavallade H.et al., 2008), обусловливающих увеличение синтеза аномальной тирозинкиназы. Однако, если о роли мутаций в развитии приобретенной резистентностии накопилось довольно много данных за последние несколько лет (Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al., 2002), то частота, спектр мутаций, их потенциальное значение в развитии первичной резистентности остаются малоизученными. Также ограниченны и противоречивы данные литературы о роли амплификации гена BCR-ABL в развитии вторичной резистентности к 4 иматинибу, не изучены влияния количества копий гена BCR-ABL и величины клона с амплификацией BCR-ABL на развитие резистентности к терапии ИТК. Цель исследования – оценить роль BCR-ABL зависимых механизмов, обусловленных мутациями гена BCR-ABL и его амплификацией в формировании резистентности к терапии иматинибом у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом. 1. 2. 3. 4. Задачи исследования Определить частоту и спектр мутаций участка гена BCR-ABL, кодирующего киназный домен BCR-ABL-тирозинкиназы (P-петля, IBдомен, С-домен, А-петля), у больных ХМЛ с первичной и вторичной резистентностью к терапии иматинибом. Оценить влияние мутаций гена BCR-ABL на развитие рефрактерности и приобретенной резистентности к иматинибу. Выявить частоту амплификации гена BCR-ABL в опухолевых клетках у больных ХМЛ с резистентностью к терапии иматинибом. Оценить значимость амплификации гена BCR-ABL на формирование первичной и вторичной резистентности к иматинибу. Новизна результатов исследования Впервые проведена комплексная оценка значения амплификации и мутаций гена BCR-ABL в формировании резистентности к терапии иматинибом на большой выборке пациентов. Определен спектр мутаций (27 миссенс мутаций), являющихся причиной рефрактерности терапии иматинибом, 70,4% из которых находятся в локусе, кодирующем P-петлю. Оценена роль амплификации гена BCR-ABL в развитии первичной резистентности к терапии иматинибом. Впервые определено влияние величины клона опухолевых клеток с амплификацией гена BCR-ABL, на развитие резистентности к терапии иматинибом. Впервые оценено значение количества копий амплфицированного гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии ХМЛ иматинибом. Практическая значимость Результаты исследования показали необходимость проведения не только анализа мутаций, но и амплификации гена BCR-ABL в случаях выявления резистентности к терапии иматинибом, поскольку амплификация гена BCR-ABL является одной из причин неудач терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ. Наличие клона опухолевых клеток с амплификацией гена BCR-ABL является фактором неблагоприятного прогноза ответа на терапию иматинибом у пациентов с ХМЛ в хронической фазе и фазе акселерации вне зависимости от величины клона опухолевых клеток с амплификацией гена BCR-ABL. Показано, что наличие мутаций гена BCR-ABL и их локализация влияют на эффективность терапии иматинибом. Выявление аномалий гена BCR-ABL (мутаций и амплификации) обусловливает необходимость изменения подходов к терапии ХМЛ 5 1. 2. 3. 4. 5. Основные положения, выносимые на защиту Аномалии гена BCR-ABL являются одними из основных механизмов развития резистентности к терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ и суммарно обнаруживаются более, чем в 50% случаев. Мутации гена BCR-ABL являются основной причиной стойкой резистентности на длительных сроках наблюдения, в отличие от резистентности, обусловленной BCR-ABL независимыми причинами. Вклад амплификации гена BCR-ABL в развитие резистентности к терапии ХМЛ иматинибом сопоставим с ролью мутаций гена BCR-ABL. Влияние аномалий гена BCR-ABL на эффективность терапии иматинибом у больных ХМЛ не зависит от величины клонов лейкозных клеток с амплификацией гена BCR-ABL. Длительность периода времени от постановки диагноза ХМЛ до начала терапии иматинибом влияет на развитие BCR-ABL зависимой резистентности (появление мутаций и амплификации гена BCR-ABL). Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 7 научнопрактических форумах: Основные положения диссертации доложены на Научно-практической конференции ЮФО “Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг” (Кисловодск, 2009), IV съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2011), 15th, 16th,17th Congress of European Hematologists Association (Barcelona 2010, London 2011, Amsterdam, 2012), 7th Scientific Symposium “Improving Research for a Common Future” (Cologne, 2012), I Конгрессе гематологов России (Москва, 2012). Публикации Всего по теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из которых – 3 в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук. Внедрение результатов в практику здравоохранения Полученные данные используются при чтении лекций и проведении семинаров на кафедре гематологии и трансфузиологии с курсами клинической лабораторной диагностики, генетики и лабораторной генетики ФПК и ППС ГБОУ ВПО Рост ГМУ Минздрава России. Результаты исследования проведенного Мордановым С.В. внедрены в практическую работу лаборатории медицинской генетики, отделения гематологии клиники ГБОУ ВПО Рост ГМУ Минздрава России, отделений гематологии республиканских, краевых и областных онкологических 6 диспансеров Южного Федерального и Северо-Кавказского Федерального округов. Личное участие диссертанта Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов, сборе первичных данных, проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи. Математическая обработка данных проведена лично соискателем. Написание глав собственных исследований, обсуждение результатов, формулировка выводов и практических рекомендаций выполнено автором самостоятельно. Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы обзора литературы, главы описания методики исследования, трех глав результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии (18 источников на русском и 177 на иностранном языках). Работа содержит 27 рисунков и 15 таблиц. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Материалом для данного исследования явились клинико-лабораторные данные 368 пациентов (соотношение мужчины/женщины – 167/201) с цитогенетически подтвержденным (Ph-позитивным) ХМЛ. Критериями включения в исследование пациентов с диагнозом ХМЛ явились: наличие хронической фазы или фазы акселерации заболевания, терапия иматинибом в дозе 400-800 мг/сут., длительность терапии иматинибом более 18 месяцев (без учёта предлеченности и длительности заболевания до назначения иматиниба). Критериями исключения – терапия ингибиторами тирозинкиназ II поколения. Медиана длительности терапии составила 30 месяцев (18-120 месяцев). В течение первых трех лет терапии иматинибом мониторинговые цитогенетические и молекулярно-генетические исследования выполнялись каждые 6 месяцев после начала приема иматиниба. В дальнейшем исследования выполнялись 1 раз в 12 месяцев. В работе использовались критерии цитогенетического и молекулярного ответов (табл.1), а также критерии оптимального, субоптимального и неудовлетворительного ответов (табл. 2) на терапию ХМЛ ингибиторами тирозиникназ, предложенные Европейским обществом по лечению лейкозов – ELN (M. Baccarani et al., 2009). 7 Таблица 1. Критерии цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом Ответ на терапию Критерии определения Цитогенетический ответ Полный цитогенетический ответ (ПЦО) 0% Ph+ клеток КМ Частичный цитогенетический ответ (ЧЦО) ≤35% Ph+ клеток КМ Малый цитогенетический ответ (МЦО) 36–65 % Ph+ клеток КМ Минимальный цитогенетический ответ 66–95 % Ph+ клеток КМ (МинЦО) Отсутствие цитогенетического ответа (ОЦО) ≥95% Ph+ клеток КМ Молекулярный ответ Полный молекулярный ответ (ПМО) Транскрипт BCR–ABL не определяется Низкий уровень экспресии: отношение уровня транскрипта BCR-ABL к уровню Большой молекулярный ответ (БМО) транскрипта контрольного гена (ABL) менее 0,1% (IS) Умеренная экспрессия гена BCR-ABL: значение уровня транскрипта BCR-ABL по отношению к уровню транскрипта Отсутствие большого молекулярного ответа контрольного гена (ABL) от 0,1% до 1,0% (ОБМО) Высокий уровень экспрессии: уровень транскрипта BCR-ABL по отношению к уровню транскрипта контрольного гена (ABL) ≥ 1% Таблица 2. Критерии отсутствия ответа, субоптимального и оптимального ответов на терапию ХМЛ иматинибом Время Отсутствие ответа терапии 3 мес. Отсутствие ГО Отсутствие ЦО 6 мес. (Ph+ 96–100%) Отсутствие ЧЦО 12 мес. (Ph+ >35%) 18 мес. Отсутствие ПЦО (Ph+ 0%) Субоптимальный ответ --Отсутствие ЧЦО (Ph+ >35%) Отсутствие ПЦО (Ph+ 0%) Отсутствие БМО Оптимальный ответ МЦО (Ph+ 36–65 %) ЧЦО (Ph+ ≤35%) ПЦО (Ph+ 0%) БМО Обследованные пациенты разделены на 3 группы в зависимости от эффективности лечения иматинибом в соответствии с критериями ELN (табл.3). Первую группу составили пациенты (n=118) с оптимальным ответом на терапию иматинибом. Вторую группу (n=35) – пациенты с субоптимальным ответом. Третью – пациенты (n=215) с отсутствием ответа на проводимую терапию. В свою очередь в последней группе выделены пациенты с первичной резистентностью к проводимой терапии ХМЛ иматинибом, и пациенты с вторичной резистентностью. В качестве критерия вторичной резистентности (рецидива) рассматривались утрата достигнутого цитогенетического и/или 8 молекулярного ответа, как при оптимальном, так и субоптимальном ответах на терапию иматинибом. Таблица 3. Общая характеристика пациентов, включенных в исследование Группы пациентов Ответ на терапию 1 Оптимальный ответ 2 Субоптимальный ответ Первичная 3 Резистентность Вторичная Общее количество Число пациентов (муж./жен.) медиана возраста 118 (60/58) 52,7 года 35 (12/23) 51,6 года 145 (69/74) 47,5 года 215 (95/120) 47,9 года 70 (26/44) 49,4 года 368 (167/201) 49,6 года Для выявления мутаций гена BCR-ABL исследовали нуклеотидную последовательности кДНК киназного домена гена BCR-ABL по оригинальной методике с одноэтапной амплификацией. РНК выделяли из образцов крови гуанидин-тиоционат хлороформ-фенольным методом. Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор RT-Dx Kit («IPSOGEN»). Амплификация интересующего фрагмента кДНК гена BCR-ABL производилась в один этап. Для амплификации использовались: 5’BCR праймер – F – gaagtgtttcagaagcttctc и 3’ABL праймер – R – tccatgcggtagtccttctc. Амплифицировали участок длиной 1407 пн (в случае варианта b2a2 гена BCRABL) или 1482 пн (при варианте b3a2). Реакция выполнена в 20 мкл общего объема смеси, содержащей 8 мкл очищенной воды («Sigma»), 5 мкл полученной кДНК, 4 мкл 5-кратного ПЦР-буфера (12,5мМ MgCl2), 0,3 мкл TaqF ДНК-полимераза («АмплиСенс»), 2 мкл смеси dNTP и по 0,5 мкл каждого праймера. Реакцию амплификации проводили по схеме: 94 0С, 10 мин; 45 циклов:940С – 30 сек, 640С – 30 сек, 700С – 120 сек; 700С – 5 мин. Результаты оценивались путем проведения горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле. Ампликоны кДНК BCR-ABL выделяли из геля и очищали методом сорбции на борсиликатной мембране с помощью колонок AxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit («Axygen»). Реакцию секвенирования проводили с помощью наборов Beckman Coulter Genome Lab Method Development Kit («Beckman Coulter») и праймеров собственного дизайна. После проведения реакции, продукты ее очищались и подвергались капиллярному электрофорезу с использованием генетического анализатора Beckman Coulter CEQ-8000. Анализ нуклеотидной последовательности и поиск мутаций проводился при помощи программного обеспечении CEQ-8000 Genetic Analysis System v.6.0.75 («Beckman Coulter»). Референтная последовательность ДНК, мРНК гена ABL, а также аминокислотная последовательность ABLтирозинкиназы получена из баз данных «The National Center for Biotechnology 9 Information» (NCBI): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (U.S.Department of Health and Human Services, http://www.nih.gov/). Для определения дополнительных копий гена BCR-ABL проводили молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH). Для определения слитного гена BCR-ABL использовались гибридизационные пробы к локусам 9q34 (ABL) и 22q11 (BCR) Vysis® LSI® BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe («Abbott»). Пробоподготовка и исследование проводилось согласно протоколу производителя. Анализу подвергались не менее 200 интерфазных ядер клеток костного мозга. При необходимости, в случае обнаружения менее 2-х ядер с искомой аномалией на 200 проанализированных, число анализируемых ядер увеличивали в 3-5 раз (до 600-1000 интерфазных ядер), с целью подтверждения наличия аберрации и уточнения величины [amp(BCR-ABL)+] клона. Процедура статистической обработки полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1 и электронных таблиц MS Excel 2007 - 2010. Расчеты выполнены в соответствии с рекомендациями О.Ю. Ребровой (2002) по обработке численных результатов экспериментов в медицине. Анализ включал определение медианы возраста, длительности терапии иматинибом, длительности предшествующей иматинибу терапии, выживаемости (общей и безрецидивной) для каждой группы наблюдения, определение частоты мутаций и амплификации гена BCR-ABL, в зависимости от фазы заболевания и вида резистентности, а также изменение указанной частоты от длительности рефрактерного течения. Методом множительных оценок Каплана-Мейра проведен анализ вероятности достижения большого, полного цитогенетического и большого молекулярного ответов в зависимости от наличия или отсутствия мутаций киназного домена гена BCR-ABL, а также в зависимости от появления дополнительных копий BCR-ABL в исследованных группах. Проведен дискриминантный анализ позволяющий выделить признаки, в наибольшей степени ответственные за различия между группами исследованных пациентов. Проверка соответствия изучаемых данных нормальному распределению проведена с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для сравнения бинарных данных использовались точный критерий Фишера и 2. Для изучения связи изучаемых показателей использовали параметрический корреляционный анализ Пирсона (r), а также непараметрические методы корреляционного анализа Спирмена (r). Исследования проводились в течение 5 лет (2007 - 2012гг.) на базе лаборатории медицинской генетики Ростовского государственного медицинского университета. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 10 Влияние мутаций киназного домена гена BCR-ABL на развитие резистентности у пациентов с ХМЛ к терапии иматинибом. Для выяснения роли мутаций гена BCR-ABL в развитии невосприимчивости к терапии ХМЛ иматинибом проведено определение нуклеотидной последовательности киназного домена гена BCR-ABL у 104 больных ХМЛ (56 мужчин и 48 женщин) с первичной и вторичной резистентностью, из которых в хронической фазе заболевания находилось 80 человек, в фазе акселерации – 24 человека. Мутации гена BCR-ABL обнаружены у 42 больных (21 – муж., 21 – жен.) из 104, что составило 40,4% от всех изученных резистентных случаев. При этом в группе пациентов находящихся в хронической фазе ХМЛ мутации киназного домена обнаружены у 28 (соотношение мужчин/женщин – 15/13) человек из 80, что составило 35,0% (рис.1). Рис.1. Частота обнаружения мутаций у пациентов резистентных к терапии иматинибом в зависимости от фазы заболевания. В группе пациентов находящихся в фазе акселерации мутации обнаружены у 14 (соотношение мужчин/женщин – 6/8) из 24 человек – 58,3%. Выявленные различия в частоте обнаружения мутаций в разных фазах заболевания статистически достоверны (p=0.0221). Различия по полу достоверными не являются (p=0.2585) (рис.1). Среди 68 пациентов (38 мужчин и 30 женщин), не достигших к 18 месяцам полного цитогенетического ответа, что соответствует понятию первичной резистентности или рефрактерности, мутации обнаружены у 23 (13 мужчин и 10 женщин), что составляет 33,8% (рис.2). Из 36 пациентов (18 мужчин и 18 женщин) с вторичной резистентностью, которым проведено аналогичное исследование, мутации выявлены у 19 (10 мужчин и 9 женщин) (52,8%). Выявленная разница в частоте встречаемости мутаций внутри группы резистентных больных ХМЛ статистически достоверна (p=0.0317). Различия по гендерному признаку не достоверны (p=0.4276). 11 Рис.2. Частота обнаружения мутаций киназного домена BCR-ABL в зависимости от типа резистентности к терапии иматинибом. Среди пациентов с первичной резистентностью обнаружены 27 миссенсмутаций, приводящие к заменам аминокислот в киназном домене ABLтирозинкиназы, которые являются причиной неэффективности терапии иматинибом согласно данным литературы (O’Hare T. et al., 2005): М244V/I (5), L248V (5), G250E (3), Q252E/L(2), Y253H(2), G255E/V (2), F311L (1), T315I (1), M351T(2), F359I (1), H396R (1), F401L (1), Y435C(1) (рис.3). В 6 случаях в опухолевых клетках обнаружены по 2 мутации гена BCR-ABL. Проведенный анализ показал, что большая часть мутаций находятся в локусе, кодирующем P-петлю. Так, в этом участке обнаружено 19 (70,4%) мутаций из 27 (рис.3). Рис.3. Схематическое изображение локализации и мутаций в областях гена BCR-ABL, кодирующих связывающий домен (IB), каталитический домен (С) (А) киназного домена BCR-ABL тирозинкиназы у резистентностью. количества выявленных P-петлю (Р), иматиниб и активационную петлю пациентов с первичной В структуре ABL-тирозинкиназы имеются 2 гибкие петлевые структуры – АТФ-связывающая петля (P-петля) и активационная петля (А-петля). Данные регионы характеризуются специфичным, стабилизирующим структуру белка, 12 пространственным расположением при неактивной конформации BCR-ABL. Иматиниб действует как конкурирующий ингибитор АТФ-связывающего домена, при этом взаимодействует с киназным доменом BCR-ABL киназы, образуя контакты минимум с 21 аминокислотой. Мутации в участке гена BCRABL, кодирующем Р- и А- петли, дестабилизируют их расположение так, что домен киназы не может перейти в неактивную пространственную организацию, необходимую для связывания с иматинибом. Среди пациентов с вторичной резистентностью обнаружены 23 миссенсмутаций, приводящие к заменам аминокислот в киназном домене ABLтирозинкиназы, и 2 мутации сплайсинга, приводящие к делеции экзонов 4 и 7 ABL домена (рис. 4): G250E(6), Q252L (1), Y253H(2), E255V/K(2), L273M (1), F311L (1), T315I (2), M351T (1), F359V/I (5), H396R (2), delL184-K274 (1), delR362-A424 (1). Данные мутации согласно литературным данным являются причиной неэффективности терапии иматинибом O’Hare T., Walters D.K., Stoffregen E.P. et al., 2005). Анализ мутаций гена BCR-ABL у пациентов с ХМЛ, утративших большой или полный цитогенетический ответ, показал, что только 11 (47,8%) из 23 мутаций локализуются в локусе, кодирующем P-петлю (рис.4) Рис.4. Схематическое изображение локализации и количества выявленных мутаций в областях гена BCR-ABL, кодирующих P-петлю (Р), иматиниб связывающий домен (IB), каталитический домен (С) и активационную петлю (А) киназного домена BCR-ABL тирозинкиназы у пациентов с вторичной резистентностью к иматинибу. При исследовании динамики выявления мутаций у резистентных к терапии иматинибом пациентов с ХМЛ обнаружено увеличение доли пациентов с мутациями от 10% на 12 месяцев терапии до 32% после 6 лет терапии иматинибом (рис.5) Для определения зависимости цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом от наличия обнаруженных мутаций киназного домена гена BCR-ABL рассчитаны показатели кумулятивной вероятности цитогенетического (БЦгО и ПЦгО) и молекулярного (БМО) ответов на терапию иматинибом. 13 12 18 24 Время (мес.) 36 48 Рис.5. Изменение частоты встречаемости мутаций гена BCR-ABL с течением времени при отсутствии эффекта в лечении ХМЛ иматинибом. В группе больных ХМЛ без мутаций (n=62) кумулятивная вероятность достижения на 60 месяцев терапии БЦгО составила 88,6%, ПЦгО – 81,6%, БМО – 67,9% (рис. 6). Рис. 6. Кумулятивная вероятность достижения а. БЦгО, ПЦгО и БМО в общей группе пациентов. б. БЦгО в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL. в. ПЦгО в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL. г. БМО в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL (n=42). Случаи без мутаций – синяя линия Пациенты с мутациями BCR-ABL – красная линия. В группе пациентов, у которых при проведении молекулярногенетических исследований обнаружены мутации киназного домена гена BCR- 14 ABL, вероятность достижения БЦгО, ПЦгО и ПМО достоверно снижается: БЦгО на 60 месяцев терапии иматинибом составила 62,4% (p<0,0001) (рис.6б), ПЦгО – 22,6% (p<0,000001) (рис.6в), БМО – 5,9% (p<0,000001) (рис.6г). Интересно, что в группе больных ХМЛ с мутациями только у одного пациента достигнут БМО после 5 лет терапии иматинибом. У данного больного ХМЛ обнаружена мутация F311L после 24 месяцев терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки. Доза была повышена до 600мг/сут, а затем до 800мг/сут. В конечном итоге повышение дозы иматиниба позволило преодолеть резистентность и достичь БМО. У остальных пациентов (41 человек) снижения уровня экспрессии BCR-ABL ниже 0,1% (IS) не достигнуто. Еще более убедительные данные о неблагоприятном влиянии мутаций киназного домена гена BCR-ABL получены при сравнении вероятности достижения ПЦгО и БМО в группах резистентных пациентов с мутациями и без мутаций. Оценка влияния мутаций на цитогенетический ответ в группе резистентных больных производилась на основе анализа вероятности достижения полного цитогенетического ответа, так как ПЦгО по нашему убеждению является более строгим критерием оценки эффективности терапии, чем большой цитогенетический ответ (БЦгО). Анализ вероятности достижения ПЦгО в диапазоне от начала терапии до 24 месяцев лечения показал, что динамика достижения ПЦгО в группе резистентных пациентов с мутациями гена BCR-ABL достоверно не различается с динамикой ответа группы пациентов без мутаций (рис. 7а). При этом в обеих группах резистентных больных вероятность достижения ПЦгО достоверно ниже, нежели в группе пациентов с оптимальным ответом на терапию иматинибом. Далее, в период от 24 до 60 месяцев в группе резистентных пациентов без мутаций гена BCR-ABL вероятность достижения ПЦгО повышается и начинает достоверно отличаться от аналогичного показателя группы резистентных пациентов с мутациями гена BCR-ABL. При этом вероятность достижения ПЦгО не достигает таковой у пациентов контрольной группы (различие достоверно). И наконец после 5 лет терапии вероятность достижения полного цитогенетического ответа в группе резистентных пациентов без мутаций гена BCR-ABL приближается к таковой в группе больных ХМЛ с оптимальным ответом (различие становится статистически недостоверно). При этом вероятность достижения ПЦгО в группе пациентов с мутациями киназного домена гена BCR-ABL остается стабильно низкой. Аналогичные особенности динамики наблюдались и в достижении большого молекулярного ответа. В течение первых 36 месяцев терапии иматинибом вероятность достижения БМО в группах резистентных пациентов без мутаций и с мутациями киназного домена гена BCR-ABL практически не различается, тогда как к 5 годам различие также становится значительным и статистически достоверным (рис. 7б). В данной ситуации особенно интересно, что резистентные пациенты без мутаций могут достигать БМО в более чем 50% случаев. Вероятность достижения БМО у пациентов с мутациями гена BCR-ABL в течение всего периода наблюдения остается минимальной. 15 Рис.7. Кумулятивная вероятность достижения ПЦгО (а) и БМО (б) у резистентных больных ХМЛ с мутациями гена BCR-ABL (красная линия), резистентных больных ХМЛ без мутаций гена BCR-ABL (красная пунктирная линия) и у больных с оптимальным ответом (синяя линия). Таким образом, наличие мутаций гена BCR-ABL достоверно снижает вероятность достижения большого и полного цитогенетического ответов, а также делает практически невозможным достижение большого молекулярного ответа. При этом обнаружены различия в вероятности достижения цитогенетического и молекулярного ответов не только между пациентами общей группы и группы с мутациями гена BCR-ABL, но и внутри группы резистентных пациентов: с одной стороны тех, у кого выявлены мутации гена BCR-ABL, с другой – без изменений нуклеотидной последовательности онкогена. Данное обстоятельство указывает на то, что резистентность, развивающаяся вследствие мутаций гена BCR-ABL, приводит к стойкому снижению вероятности достижения цитогенетического и молекулярного ответов, в отличие от резистентности, обусловленной другими причинами. Особенно важным моментом является достоверное снижение вероятности достижения большого молекулярного ответа в случае возникновения мутаций киназного домена гена BCR-ABL, так как в настоящее время доказано, что быстрое и своевременное достижение большого молекулярного ответа – основной критерий успешного подавления опухолевого клона, и как можно более быстрое достижение БМО и ПМО является основной целью терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ. Следовательно, появление мутаций гена BCR-ABL является крайне неблагоприятным прогностическим фактором. Влияние амплификации киназного домена гена BCR-ABL на развитие резистентности у пациентов с ХМЛ к терапии иматинибом. Для определения роли амплификации гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии иматинибом у больных ХМЛ проведено FISH исследование с ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL у 175 больных ХМЛ (80 мужчин, 95 женщин). Из них в хронической фазе находились 130 пациентов, в 16 фазе акселерации – 45 пациентов. По результатам стандартного цитогенетического исследования клеток костного мозга, критериям оптимального ответа (Baccarani M. Et al, 2009) соответствовали 36 человек (21%), критериям субоптимального ответа – 15 человек (9%), критериям характеризующим отсутствие ответа – 124 (70%). В результате проведенного исследования в группах пациентов с оптимальным и субоптимальным ответами на терапию иматинибом дополнительные копии гена BCR-ABL не были обнаружены ни в одном случае. Напротив, в группе резистентных пациентов амплификация гена BCR-ABL выявлена у 45 из 124 человек (36,3%). Сопоставление групп пациентов с обнаруженными дополнительными копиями гена BCR-ABL и без амплификации гена BCR-ABL показало, что они достоверно не различаются по возрасту, полу, длительности наблюдения, предшествующей назначению иматиниба терапии, медиане длительности терапии иматинибом, медиане назначенной дозы иматиниба. Однако, обнаружены достоверные различия по продолжительности периода от постановки диагноза до назначения терапии иматинибом у больных ХМЛ с обнаруженной амплификацией BCR-ABL и без таковой. Так, в первой из указанных групп медиана длительности составила 13,2 (0-128) мес., тогда как во второй группе – 4,6 (0-110) мес. (р=0,007572). Таким образом, раннее назначение терапии иматинибом достоверно снижает вероятность развития амплификации гена BCR-ABL. В группе резистентных больных ХМЛ (124 человека), у находящихся в хронической фазе заболевания, дополнительные копии гена BCR-ABL обнаружены в 21 случае из 70 (30%), у больных ХМЛ в фазе акселерации – в 24 случаях из 54 (36,4%). Выявленные различия статистически достоверны (p=0,0246) (рис.16). Таким образом, как и в случае с мутациями киназного домена BCR-ABL, прогрессия заболевания сопровождается в увеличением частоты амплификации гена BCR-ABL. amp(BCR-ABL) не обнаружена amp(BCR-ABL) не обнаружена amp(BCR-ABL) amp(BCR-ABL) Рис. 8. Частота амплификации гена BCR-ABL в клетках костного мозга в зависимости от фазы ХМЛ (N=124, p=0,0246). 17 Из 124 резистентных пациентов рефрактерных к терапии иматинибом оказалось 87 больных ХМЛ, вторично резистентных – 37. Среди 87 пациентов с первичной резистентностью (рефрактерностью) амплификация гена BCR-ABL обнаружена у 32 больных (36,8%). Из 37 пациентов с вторичной резистентностью, дополнительные копии гена BCR-ABL выявлены у 13 (35,18%). Выявленное различие по частоте встречаемости амплификации внутри группы резистентных больных ХМЛ статистически недостоверно (p=0,8471). Интересно, что в отличие от мутаций гена BCR-ABL, зависимость частоты обнаружения амплификации гена BCR-ABL от типа резистентности не обнаружена (таб.8) Рис. 9. Частота обнаружения амплификаций гена BCR-ABL в зависимости от типа резистентности (N=124, p=0,8471) Количество дополнительных слитных сигналов в опухолевых клетках костного мозга в изученных случаях ХМЛ колебалось от 1 до 7 (рис.9). В некоторых случаях амплификация гена BCR-ABL сочеталась с дополнительными хромосомными аберрациями затрагивающими локусы генов ABL1 и BCR . Рис. 10. FISH c ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL. Вариации количества дополнительных копи BCR-ABL а. nuc ish(ABL1×4),(BCR×4), (ABL1conBCR ×3). б. nuc ish(ABL1×10),(BCR×10),(ABL1conBCR×8). в. nuc ish (ABL1×4), (BCR×4) (ABL1conBCR×2)[68/200]. 18 В каждом изученном случае ХМЛ с амплификацией гена BCR-ABL, резистентного к терапии иматинибом, доля опухолевых клеток, несущих дополнительные копии гена BCR-ABL, варьировала от 1% до 78% среди всех клеток костного мозга. Среднее значение величины клона клеток с амплификацией в группе рефрактерных пациентов составило 14,06%, у вторично резистентных больных – 16,75% (p=0.3994). Анализ размера опухолевого клона с амплификацией гена BCR-ABL в динамике терапии иматинибом показал, что размер клона клеток с амплификацией гена BCR-ABL находится в обратной зависимости от частоты его встречаемости (случаи ХМЛ с амплификацией гена BCR-ABL в небольшом количестве клеток костного мозга встречались гораздо чаще, чем случаи ХМЛ с большим количеством клеток костного мозга с амплификацией) (рис. 10) . У ряда пациентов (6 человек) при проведении первого контрольного исследования (6 мес.) обнаружены ядра, содержащие дополнительные копии гена BCR-ABL. При этом отмечена значительная величина клона с амплификацией (среднее значение 24,3%, минимум 10%, максимум – 67%), обнаруженная у данных пациентов. Все пациенты в дальнейшем оказались абсолютно рефрактерны к проводимой терапии ХМЛ иматинибом. Прмн: amp(BCR/ABL) %, Распределение: Логнормальное 25 20 15 10 Число наблюдений 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Величина клона содержащего экстракопии BCR/ABL (%) Рис. 11. Частота наблюдений различных по величине клонов опухолевых клеток содержащих дополнительные копии гена BCR-ABL Подобной картины не наблюдалось у других пациентов, проанализированных методом FISH в другие мониторинговые сроки (12, 18, 24 мес. и т.д.). В случае обнаружения дополнительных копий гена BCR-ABL при проведении последующих контрольных исследований (на 12, 18, 24 мес.) отмечена значительно меньшая презентированнось этих клонов. Однако с каждым последующим контролем средний размер его увеличивался (рис. 11). Для оценки влияния появления клонов клеток с дополнительными копиями гена BCR-ABL проведен расчет кумулятивной вероятности 19 достижения БЦгО, ПЦгО и БМО в зависимости от наличия амплификации. В группе больных ХМЛ с амплификацией вероятность достижения большого цитогенетического ответа (БЦгО) на 60 месяцев терапии иматинибом составила 58,6%, тогда как в группе больных без амплификации - 89,0% (p<0,00001). Текущ. эффект: F(6, 297)=53,888, p=0,00000 Вертик. столбцы равны 0,95 доверительных интервалов 40 Доля клеток с экстракопиями BCR/ABL, % 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 0 6 12 18 24 36 48 Время (мес.) Рис. 12. Динамика изменения среднего значения величины клона клеток, содержащего дополнительные копии гена BCR-ABL в зависимости от срока мониторингового наблюдения. Также наличие амплификации гена BCR-ABL достоверно снижает вероятность достижения полного цитогенетического ответа (ПЦгО) до 31,6% (в группе пациентов без амплификации вероятность ПЦгО на 60 месяцев терапии равна 63,8%, p<0.00001) и большого молекулярного ответа (БМО) до 16,9% (в группе больных без амплификации - 67,0%, p<0.00001) (рис. 12). Рис.13. Вероятность (кумулятивная) достижения ПЦгО и БМО при наличии амплификации гена BCR-ABL на 60мес. наблюдения. Зеленая линия – пациенты с амплификацией гена BCR-ABL. 20 Таким образом, в группе пациентов, у которых при проведении молекулярно-цитогенетического (FISH) исследования в ядрах клеток костного мозга обнаружены дополнительные копии гена BCR-ABL (амплификация BCRABL) достоверно снижена вероятность достижения большого и полного цитогенетического, а также большого молекулярного ответов. Для поиска связи между значениями величины опухолевого клона с амплификацией гена BCR-ABL и вероятностью достижения полного цитогенетического и большого молекулярного ответов на терапию ХМЛ иматинибом все пациенты с амплификацией распределены на 4 квартиля. Первый квартиль (Q1) включал 25% пациентов с наименьшими значениями величины клона опухолевых клеток с амплификацией; квартили Q2 и Q3 включали по 25% пациентов со значениями меньше и больше медианы соответственно; четвертый квартиль (Q4) включал 25% пациентов с наибольшими значениями величины клона опухолевых клеток с амплификацией. Данные, касающиеся 50% пациентов Q1-Q2 и 50% пациентов Q3-Q4 объединены в две группы. Для стратификации данных использованы группы Q1-Q2 (группа пациентов с размером опухолевого клона с амплификацией 1-6%), и Q3-Q4 (группа пациентов с размером опухолевого клона с амплификацией 7-72%). Метод Каплан-Мейер не выявил статистически значимые различия между группами Q1-Q2 и Q3-Q4 по вероятности достижения ПЦгО (р=0.86454) и БМО (р=0.66071) (рис. 13). Рис. 14. Вероятность (кумулятивная) достижения ПЦгО и БМО в зависимости от величины клона с амплификацией гена BCR-ABL. Таким образом, размер клона с amp(BCR-ABL) не влияет на вероятность достижения полного цитогенетического и большого молекулярного ответов. Выявление даже единичных опухолевых клеток с амплификацией гена BCRABL обладает неблагоприятным прогностическим значением и требует модификации терапии ХМЛ. 21 Оценка значения аномалий гена BCR-ABL в комплексе демографических и клинико-лабораторных данных в развитии резистентности к терапии иматинибом методом дискриминантного анализа. С целью оценки уровня влияния некоторых клинико-лабораторных факторов, включая мутации гена BCR-ABL и его амплификацию, на вероятность возникновения неудач терапии ХМЛ иматинибом и выделения признаков, в той или иной степени ответственных за различия между группами пациентов, проведен дискриминантный анализ ряда статистических данных. Определены и выделены группы пациентов а) не достигших ответа (рефраткерность) на терапию иматинибом, б) утративших ответ (вторичная резистентность), а также в) достигших цитогенетического ответа на конец наблюдения. Оценивалось влияние таких факторов как: пол, возраст, регион проживания, скорость достижения цитогенетического ответа при терапии ХМЛ иматинибом (для этого определялась глубина цитогенетического ответа на 6 месяцев терапии иматинибом), наличие перерывов в приеме иматиниба, фаза ХМЛ на момент начала терапии иматинибом, наличие мутаций гена BCRABL, наличие амплификаций гена BCR-ABL, величина опухолевого клона имеющего amp(BCR-ABL) Рис. 15. Дискриминантный анализ: определение признаков в наибольшей степени ответственных за различие между группами пациентов: а) не достигших ПЦгО (рефрактерность); б) потерявших БЦгО (вторичная резистентность); в) достигших ПЦгО Дискриминантный анализ показал (рис. 14), что разделение неполное и группы перекрываются, это может свидетельствовать о том, что перечислены и учтены далеко не все факторы, приводящие к неудачам терапии. Более четко разделены группы а) пациентов достигших ПЦгО и б) рефрактерных к 22 проводимой терапии. Хуже отображена группа рецидивировавших пациентов, т.е. вторично резистентных. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что группа пациентов достигших, но утративших ответ, более разнородна по признакам и причинам, вызвавшим рецидив заболевания, и выбранных факторов не достаточно для четкой дискриминации группы. С другой стороны, для данной группы, в определенной мере, все же характерны те же признаки, что свойственны и другим группам пациентов: как достигшим ПЦгО, так и пациентам с рефрактерностью к проводимой терапии. И указанные причины все же в определенной мере оказывают влияние на формирование группы вторично резистентных пациентов. Результаты проведенного дискриминантного анализа дискриминантного анализа показали, что на достижение ответа при терапии ХМЛ иматинибом, а также на возникновение вторичной резистентности наибольшее влияние оказывают такие факторы как (табл. 4): глубина цитогенетического ответа на 6 месяцев терапии иматинибом (p=0,000000), наличие мутаций гена BCR-ABL (p=0,000000), наличие амплификаций BCR-ABL (p=0,000025), перерывы в терапии иматинибом (p=0,009103) и фаза ХМЛ на начало терапии иматинибом (p=0,041970). Такие факторы как пол, возраст, предлеченность не влияют на вероятность получения оптимального ответа на терапию иматинибом. Также определено, что величина клона с amp(BCR-ABL) не оказывает влияния на распределение пациентов между группами пациентов с оптимальным ответом, рефрактерных и вторично резистентных. Таблица 4. Результаты анализа дискриминантных функций (p<0.00001) Пол Возраст Регион проживания Ответ на 6 мес. терапии Наличие мутаций BCR-ABL Наличие amp (BCR-ABL) Величина клона с amp (BCR-ABL) Перерывы в терапии иматинибом Фаза ХМЛ на начало терапии иматинибом p-уров. 0,326307 0,222070 0,410515 0,000000 0,000000 0,000025 0,515810 0,009103 0,041970 кор.1 0,043545 -0,010653 -0,084058 -0,752438 -0,386263 -0,378137 -0,018700 0,101230 -0,188465 Для комплексного анализа подтверждения роли мутаций и амплификаций BCR-ABL оценена вероятность достижения ПЦгО в группах пациентов резистентных к терапии иматинибом a) с мутациями киназного домена гена BCR-ABL, б) дополнительными копиями гена BCR-ABL, в) резистентных пациентов без аномалий BCR-ABL, г) пациенты с оптимальным ответом на терапию иматинибом (на 6 месяцев). Через 12-18 месяцев после начала терапии иматинибом в группе пациентов резистентных к терапии ХМЛ без аномалий гена BCR-ABL 23 вероятность достижения цитогенетического и молекулярного ответов достоверно превышает аналогичный показатель в группах резистентных пациентов с мутациями и амплификацией BCR-ABL. После 5 лет терапии данный показатель приближается к таковому у группы пациентов с оптимальным ответом, становясь в случае полного цитогенетического ответа статистически неразличимым (рис. 15). Рис. 16. Вероятность достижения ПЦгО (а) и БМО (б) в зависимости от наличия мутаций и амплификации гена BCR-ABL 1. 2. 3. 4. 5. ВЫВОДЫ Аномалии гена BCR-ABL (мутации и амплификация) являются важными механизмами развития резистентности к терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ. Мутации гена BCR-ABL обнаружены в 40,4% случаев резистентности (первичная резистентность – 33,8%; вторичная резистентность – 52,8%). Амплификация гена BCR-ABL выявлена в 36,3% случаев (первичная резистентность – 36,8%; вторичная резистентность – 35,1%). Большая часть мутаций гена BCR-ABL у первично резистентных больных (70%) локализована в кодирующем Р-петлю участке киназного домена ABL тирозинкиназы, обусловливая высокий уровень резистентности. У вторично резистентных больных мутации в участке, кодирующем Рпетлю, обнаружены в 48% случаев. Мутации и амплификация гена BCR-ABL приводят к стойкому снижению частоты достижения цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом. Развитие резистентности на терапию иматинибом у больных ХМЛ не зависит от величины клонов лейкозных клеток с амплификацией гена BCR-ABL Длительность периода времени от постановки диагноза ХМЛ до начала терапии иматинибом влияет на развитие BCR-ABL зависимой резистентности (появление мутаций и амплификация гена BCR-ABL). 24 Практические рекомендации: 1. Анализ случаев неэффективности терапии ХМЛ иматинибом должен включать в себя комплекс исследований, включающих изучение аномалий гена BCR-ABL методами FISH-анализа с ДНК зондом к гену BCR-ABL, и определение нуклеотидной последовательности гена BCRABL 2. Появление низкопроцентных клонов с амплификацией гена BCR-ABL является неблагоприятным прогностическим фактором и требует коррекции терапии. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК: 1. С.В. Морданов Амплификация гена BCR-ABL у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом, рефрактерных к иматинибу / С.И. Куцев, С.В. Морданов // Онкогематология. – 2009. – №3. – С. 23-26. 2. С.В. Морданов Прогностическое значение дополнительных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках в терапии иматинибом хронического миелолейкоза / С.И. Куцев, С.В. Морданов, А.Н. Зельцер // Медицинская генетика. – 2009. – № 10. – С. 27-33. 3. С.В. Морданов Механизмы резистентности к терапии хронического миелолейкоза ингибитором тирозинкиназ иматинибом. / Куцев С.И., Зельцер А.Н., Оксенюк О.С., Устаева О.А., Кунгурова Т.И., Бурнашева Е.В., Гранкина Е.А., Шатохин Ю.В. // Медицинский вестник Юга России. – 2010. – №2. – С.10-17 4. 5. 6. 7. Публикации в других изданиях: S.V. Mordanov Cytogenetic and FISH analysis for diagnosis and evaluation of minimal residual disease (MRD) in CML patients / S.I. Kutsev, S.V. Mordanov, A.N. Zeltzer, Y.V. Shatokhin, E.V. Burnasheva // “Developing Research for a Common Feature”, Abstracts of 4th Scientific Symposium. – Rostov-on-Don, 2006. – P. 51-52. С.В. Морданов Мутации гена BCR-ABL в развитии рефрактерности к иматинибу у пациентов с хроническим миелолейкозом / М.В. Вельченко, С.И. Куцев // Материалы III Международной конференции “Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины”. – Ростов-на-Дону, 2009. – С. 157-158. С.В. Морданов Цитогенетический мониторинг терапии ХМЛ в ЮФО / С.И. Куцев, А.Н. Зельцер, С.В. Морданов // Материалы IV научнопрактической конференции ЮФО “Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг”. – Кисловодск, 2009. – С. 3-8. С.В. Морданов BCR-ABL зависимые механизмы резистентности к иматинибу: амплификация и мутации гена BCR-ABL / С.И. Куцев, А.Н. Зельцер, С.В. Морданов // Материалы IV научно-практической конференции ЮФО “Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг”. – Кисловодск, 2009. – С. 19-30. 25 8. С.В. Морданов Молекулярный мониторинг терапии хронического миелолейкоза (ХМЛ) иматинибом у пациентов, не достигших полного цитогенетического ответа. / Вельченко М.В., Зельцер А.Н., Устаева О.А., Гранкина Е.А., Шатохин Ю.В., Куцев С.И. // Материалы VI съезда РОМГ. – Ростов-на-Дону. – 2010. – С.36 9. С.В. Морданов Мутации в гене BCR-ABL у пациентов с первичной резистентностью к терапии иматинибом / Вельченко М.В., Устаева О.А., Шатохин Ю.В., Шамрай В.С., Сердюк О.Д., Напсо Л.И., Новоспасская Н.В., Куцев С.И. // Материалы VI съезда РОМГ. – Ростов-на-Дону. – 2010. – С.119 10. С.В. Морданов Значение амплификации гена BCR-ABL в развитии рефрактерности к терапии иматинибом у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом / О.А. Устаева, С.В. Морданов, А.Н. Зельцер, Ю.В. Шатохин, Е.В. Бурнашева, И.В. Снежко, С.И. Куцев // Материалы I Всероссийского конгресса «Генетика опухолей кроветворной системы». – г.Ростов-на-Дону. – С. 182. 11. S. Mordanov The mechanisms of resistance to TKI therapy of CML patients in routine practice / S. Kutsev, S. Mordanov, O. Oxenjuk, A. Zeltzer, M. Velchenko, O. Ustaeva, Yu Shatokhin, E. Burnasheva // Russian-German Scientific Symposium «Modern investigations from fundamental and clinical medicine» – Rostov- on-Don, 2010. Р. 14-15 12. С.В. Морданов Мутации гена BCR-ABL у больных хроническим миелолейкозом с первичной резистентностью к терапии иматинибом. / С.И. Куцев // Вестник гематологии. – 2010, – том VI, №2, – C.67-68 13. S.Mordanov The Role of Imatinib Plasma Level in the Achievment of Complete Cytogenetic Response (CCyR) in Chronic Myeloid Leukemia (CML) Therapy / S.Kutsev, O.Oxenjuk, S.Mordanov, Yu.Shatokhin, T.Pospelova, N.Khoroshko, A.Turkina. // Blood. – 2011. – V.118. N21. – P.1619. 14. S. Mordanov The low level clones of BM cells with BCR-ABL fusion gene amplification have unfavorable influence on CML imatinib therapy outcome / S. Mordanov, A. Zeltzer, E. Grankina, O. Ustaeva, T. Kungurova, Y. Shatokhin, S. Kutsev // European Journal of Human Genetics. – 2012. – Vol.20, Sup.1. – P.207 15. Mordanov S. Small Clones Of Bone Marrow Cells With BCR-ABL Gene Amplification Predict Unfavorable Outcome Of Imatinib CML Treatment / Kutsev S., Mordanov S., Ustaeva O., Grankina E., Shatokhin Y., Serdjuk O., Polevichenko E., Turkina A. // Haematologica. – 2012. – Vol. 97, Sup.1. – Р.359 16. Mordanov S. Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors (TKI) Therapy of Patients with CML: mechanisms and monitoring / Kutsev S., Mordanov S., Oxenjuk O, Zeltser A., Kungurova T., Ustaeva O., Sokolova A., Shatokhin Yu, Burnasheva E., Polevichenko E., Serdjuk O., Zaklyakova L. // 7th Scientific Symposium “Improving Research for a Common Future”. – Cologne, 2012. – P. 37-38. 26 Используемые в автореферате сокращения ELN – European leukemia net FISH – флуоресцентная in situ гибридизация IS – International scale (международная шкала оценки уровня экспрессии BCR-ABL) IRIS – international randomized study of interferon and sti57 Ph-хромосома – филадельфийская хромосома БМО – большой молекулярный ответ БЦгО – большой цитогенетический ответ ГО – гематологический ответ ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота КМ – костный мозг МинЦгО – минимальный цитогенетический ответ МЦгО – малый цитогенетический ответ ОБМО – отсутствие большого молекулярного ответа ОТ-ПЦР – реакция обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией ОЦгО – отсутствие цитогенетического ответа ПЦгО – полный цитогенетический ответ ПМО – полный молекулярный ответ РНК – рибонуклеиновая кислота ХМЛ – хронический миелолейкоз ЧЦгО – частичный цитогенетический ответ ЦгО – цитогенетический ответ