На правах рукописи Хаптхаева Галина Эрдниевна ОБОСТРЕНИЕ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ ПРИ РЕСПИРАТОРНОЙ ИНФЕКЦИИ: ЗНАЧИМОСТЬ РЕСПИРАТОРНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ, СИСТЕМНЫХ БИОМАРКЕРОВ, СОСТОЯНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА 14.01.25 – пульмонология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт пульмонологии» Федерального медико-биологического агентства России Научный руководитель: Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Чучалин Александр Григорьевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Белевский Андрей Станиславович ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России. доктор медицинских наук, профессор Дидковский Николай Антонович ФГУ «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России. Ведущая организация: Центральный Научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН. Защита состоится « » …………………….2010 года в ………часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.053.01 при ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32) Автореферат разослан « » …………………....2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Анаев Эльдар Хусеевич 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Бронхиальная астма (БА) относится к наиболее распространенным заболеваниям человека во всех возрастных группах. [GINA, 2006]. У большинства пациентов БА контролируется медикаментозной терапией и не требует госпитализации в стационар. Однако примерно у половины всех больных БА возникают эпизоды ухудшения в течение заболевания – обострения БА [Авдеев С.Н., Чучалин А.Г., 2008]. У взрослых пациентов даже оптимальная терапия снижает частоту обострений приблизительно на 40 % [Pauwels RA, et al., 2003]. К обострению БА могут привести различные триггеры [GINA, 2006]. Еще William Osler писал в своем учебнике, что среди известных фактов, вызывающих обострение БА (аллергены и факторы окружающей среды), "каждая новая простуда" могла вызвать обострение болезни [Olser W. 1892]. В настоящее время вирусная инфекция считается известным триггером обострений астмы. [Carlsen KH et al., 1984., Wennergren G et al., 2000]. Роль бактериальной инфекции в инициировании или поддержке астматического воспаления изучена недостаточно. [Savykoski T., et al., 2004]. Однако в последние годы возрастает поток данных, доказывающих связь инфицирования некоторыми бактериями, например, Chlamydophila pneumoniae (C. pneumoniae), с началом БА у взрослых [Hahn DL., et al., 1991], тяжестью болезни [Black PN, et al., 2000] и частотой обострения астмы [Cunningham AF, et al., 1998, Allegra L, et al., 1994]. В целом, данные о микробном спектре возбудителей у больных с обострением атопической БА при респираторной инфекции очень скудны и противоречивы, поэтому изучение состояния микробиоценоза дыхательных путей представляет интерес в отношении его влияния на течение БА. БА характеризуется гиперреактивностью дыхательных путей и воспалением, в котором различные клетки (эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги и Тлимфоциты), цитокины и медиаторы воспаления играют важную роль. Недавние исследования продемонстрировали, что пациенты с бронхиальной астмой более подвержены влиянию респираторных вирусов вследствие преобладания Th2 клеток или уменьшения активности Th1 клеток и IL-10 [Message SD, et al., 2008]. Предполагается, что в ответ на инфекцию имеются нарушения в реакциях цитокинов врожденной иммунной системы у пациентов, страдающих БА по сравнению со здоровыми людьми [Wark PA., et al., 2005.]. Кроме локального воспаления при астме имеется системное воспаление, о чем свидетельствуют повышенные уровни плазменного фибриногена и сывороточного амилоида “А” у больных БА [Jousilahti P, et al., 2002]. Наличие системного воспаления подтверждает факт обострения болезни и диктует необходимость идентификации этиологического происхождения. Так, исследование микробного спектра возбудителей, клинико-функциональных показателей, состояние гуморального, клеточного иммунитета и системных биомаркеров, а также их взаимосвязей может уточнить механизмы обострения БА, спровоцированного инфекцией. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить спектр респираторных возбудителей, значимость системных биомаркеров, состояние гуморального и клеточного иммунитета у больных с обострением атопической бронхиальной астмы при вирусной и бактериальной инфекции. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. 1. Изучить спектр бактериальных и вирусных респираторных возбудителей при обострении атопической БА. 2. Изучить клинические и функциональные особенности обострения атопической БА при респираторной инфекции в зависимости от возбудителя. 3. Изучить цитокиновый профиль (ИЛ-5,6,8,10,1β, ИФН-γ), значимость CPБ у больных с обострением атопической БА при вирусной и бактериальной инфекциях. 4. Провести сравнительную оценку показателей клеточного (CD4, CD8, CD4/CD8, CD16, CD25, CD50, CD95, HLA-DR), гуморального (общий IgA, IgM, IgG) иммунитета и фагоцитоза (ФАН, ФЧ, ФР) в зависимости от возбудителя у больных с обострением атопической БА. НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В представленной работе впервые: 1. С помощью комплексной оценки респираторных возбудителей: микробиологической, ПЦР диагностики и серологии - установлено, что обострения атопической БА ассоциированы в 29,0% с вирусной, в 45,2% с бактериальной и в 25,8% случаев с вирусно–бактериальной инфекцией. 2. Выявлена обратная корреляционная взаимосвязь между ИЛ-8 и ОФВ1%, ИЛ1β, а также прямая корреляционная взаимосвязь между ОФВ1 и ИФН-γ, что свидетельствует о роли разных цитокинов в развитии воспаления и обструктивных нарушений. 3. В группе больных с вирусной инфекцией уровень ИФН-γ достоверно снижен в сравнении с другими группами, при этом он обратно коррелирует с CD20, CD25, а в группе пациентов с бактериальной инфекцией выявлена обратная корреляционная взаимосвязь между ИЛ-8 и CD20, CD25, что указывает на наличие различных особенностей воспаления в зависимости от этиологии возбудителя. 4. Дана характеристика фенотипов больных с обострением атопической БА при вирусной и бактериальной инфекциях. Установлено, что для вирусного фенотипа характерно снижение продукции ИФН-γ, повышение эозинофилов в мокроте, В-лимфоцитов и маркеров активации клеточного звена иммунитета (CD25, CD50), а для бактериального фенотипа характерно повышение СРБ и активация гуморального звена иммунитета (общий IgA и IgM), что указывает на участие разных иммунологических факторов в развитии обострения атопической БА. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. 1. Комплексное исследование спектра респираторных возбудителей и системных биомаркеров позволяет выделить фенотипы пациентов с частыми обострениями атопической БА при вирусной и бактериальной инфекции. 2. Выявленные взаимосвязи между клинико-функциональными параметрами, системными биомаркерами и разными звеньями иммунитета у больных с обострением атопической БА в зависимости от возбудителя респираторной инфекции позволяют уточнить отдельные звенья патогенеза обострения с целью дифференцированного лечения и повышения контроля за течением бронхиальной астмы. ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Диагностический алгоритм обследования пациентов с обострением атопической бронхиальной астмы при респираторной инфекции используется для ведения и определения тактики лечения больных в аллергологическом и пульмонологическом отделениях Городской клинической больницы №57 г. Москвы. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены и обсуждены на: - 18-м, 19-м Национальных Конгрессах по болезням органов дыхания, (Екатеринбург, 2008г, Москва, 2009г); - Ежегодном Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Берлин, 2008); - Научной сессии ФГУ НИИ Пульмонологии Росздрава 2008г. (Рязань); - Совместном заседании ФГУ НИИ Пульмонологии Росздрава и кафедры госпитальной терапии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (Москва, 2009 г); - I Форуме молодых ученых Евро-Азиатского Респираторного Общества (Бишкек,2010г). ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из которых 2 журнальные статьи (в ведущих рецензируемых журналах согласно перечню ВАК Минобразования и науки РФ), 4 тезисов национальных и европейских конгрессов, из них 1 – в зарубежной печати (European Respiratory Journal). ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на 125 страницах машинописи. Состоит из введения, глав обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Иллюстрирована 14 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель содержит 19 отечественных и 141 зарубежных источников. Диссертация изложена на русском языке. 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Общее количество, участвовавших в исследовании, составило 31 человек. Критерии включения: Обязательными клиническими и функциональными критериями для включения больных в исследование были: клинический диагноз атопической бронхиальной астмы средней степени, обострение средней степени тяжести в соответствии с классификацией тяжести астмы, GINA, 2006 года, возраст от 17 до 70 лет включительно, наличие в анамнезе частых ОРВИ, не менее 3 раз в год, длительность ОРВИ на момент поступления в стационар не более 5-ти суток на момент поступления в стационар Критерии исключения: беременные, кормящие женщины, пациенты с тяжёлым течением БА, согласно GINA, 2006, иммунотерапия в анамнезе за последние 6 месяцев к моменту поступления в стационар, любые сопутствующие заболевания в стадии декомпенсации, алкогольная, наркотическая зависимость. В исследование было включено 31 пациент с обострением атопической БА средней степени тяжести при респираторной инфекции (диагноз подтвержден данными анамнеза, клинической картиной, рентгенологическими, функциональными методами диагностики). Исследование проводилось на базе ГКБ №57 и ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России с 2006 по 2009 гг. Все больные находились на стационарном лечении. Характеристика больных атопической БА, включенных в исследование, представлена в табл.1. Таблица 1 Характеристика больных атопической БА, включенных в исследование. Параметры M/Ж (mean±SD) 4/27 Средний возраст, лет 50,4±13,5 Длительность заболевания, лет 12,4 ± 3,2 Частота обострений в год 5,4 ± 0,9 Стаж/курения, пачек/лет 7,4 ± 1,9 BMI, кг/м2 23,8 ± 2,0 Группу из 31 человека поделили на 3 подгруппы, в зависимости от выделенного возбудителя. Критерий отбора по ПЦР - диагностике, серологии, бактериологическому посеву:1) для первой подгруппы - наличие положительного результата как в группе показателей бактерий так и в группе показателей вирусов; 2) для второй подгруппы - наличие положительного результата только в группе показателей бактерий; 3) для третьей группы - наличие положительного результата только в группе показателей вирусов. Группа показателей бактерий в мокроте и сыворотке крови (определение методом ПЦР, бактериологии, серологии): Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniaе, Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae. Группа показателей вирусов в мокроте и крови (определение методом ПЦР, серологии): Аденовирус, РСВ, РВ, Герпес I типа, Герпес II типа. Распределение пациентов по группам в зависимости от выделенного возбудителя, представлено в табл.2 Таблица 2. Распределение пациентов по группам в зависимости от выделенного возбудителя ПЦР, серологическая -диагностика (мокрота+сыворотка крови) Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae + РВ Klebsiella pneumoniae Streptococcus pneumoniae + Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae + Klebsiella pneumoniae Аденовирус Риновирус РСВ Streptococcus pneumoniae+ аденовирус Streptococcus pneumoniae + РВ 1 группа n=8 (вирусы + бактерии) 2группа n=14 (бактерии) 3 группа n=9 (вирусы) 4(28.5%) 1(7.1%) 1 (12.5%) 1(7.1%) 5(35.7%) 3(21.4%) 2 (22.2%) 1(11.1%) 2(25%) 4(50%) Streptococcus pneumoniae + РСВ РВ + РСВ Герпес Iтипа Герпес IIтипа Во всех группах 1(12.5%) 3(33.3%) 2(22.2%) 1(11.1%) производилась оценка клинико-функциональных показателей, биомаркеров воспаления, оценка взаимосвязи иммунологических маркеров воспаления, с клинико-функциональными показателями. У всех больных оценивались приведенные ниже клинические, рентгенологические функциональные, лабораторные, иммунологические показатели: Оценка клинической картины больных. Учитывались следующие показатели: возраст больных, пол, ИМТ, сбор анамнеза заболевания, жалоб больного, сбор аллергологического анамнеза: наличия кожных проб с неинфекционными аллергенами, специфических IgE по данным выписок из стационаров и амбулаторной карте, определение уровней общего IgE, изучение объективного статуса пациента, электрокардиографии, исследование крови с лейкоцитограммой, частота сердечных сокращений (ЧСС), частота дыхательных движений (ЧДД), кашель, характер мокроты. Клинико-рентгенологическое обследование включало в себя - стандартную рентгенографию органов грудной клетки в прямой проекции. Исследование функции внешнего дыхания (ФВД). При оценке функции внешнего дыхания использовались показатели ОФВ1, ЖЕЛ, ОФВ1/ЖЕЛ. Исследование спирометрии проводилось путем анализа кривой «поток-объем» на компьютерном анализаторе Flowscreen фирмы Erich Jaeger, Германия. Оценку полученных результатов проводили при сопоставлении данных с должными величинами, рассчитанными по формулам Европейского Сообщества Стали и Угля, 1993 (Quanqer et. al., 1993; Cotes et al., 1993). Микробиологическое исследование включало микроскопию и культуральное исследование мокроты. Материалом для бактериологического исследования служила мокрота, полученная после глубокой экспекторации. Образцы собирались в стерильные чашки и направлялись в микробиологическую лабораторию в течение 1 часа после их получения. Порция мокроты, имеющая визуально наибольшую “гнойность “, окрашивались по Грамму, после чего под малым увеличением проводился подсчет эпителиальных клеток и лейкоцитов. Только образцы мокроты, удовлетворяющие критериям Murrey-Washington- менее 10 эпителиальных клеток и более 25 лейкоцитов в поле зрения (х 100) , исследовали на культуры. Материал высевали на твердые питательные среды (кровяной агар, Эндо, шоколадный агар, среда Сабуро) и культивировали в течение 18-24 часов при температуре 36-37ᴼС. Среди выделенных микроорганизмов рассматривались только потенциально патогенные бактерии, к непотенциально патогенным бактериям относили: Streptococcus viridians, Neisseria spp., Corynebacterium spp., Candida spp., Enetrococcus spp., коагулазо-негативные стафилококки. Диагностически значимой считали концентрацию колониеобразующих единиц (КОЕ) > 106/ мл для мокроты (>105/мл при выделении Streptococcus pneumoniaе). Также проводилось исследование индуцированной мокроты. ПЦР диагностика. Выделение ДНК, РНК: пробоподготовка универсальная (ПУН). Набор для амплификации: пробирки с ПЦР - смесью, ПЦР - буфер с полимеразой, контрольные образцы (+;-). Производитель: ООО «Лаборатория Изоген», Россия. Детекция осуществлялась методом электрофоретической разгонки амплифицированного образца в агарозном геле. Учет результатов проводился после анализа снимков агарозных гелей на основании наличия или отсутствия четкого видимого сигнала на уровне положительного контрольного образца. Чувствительность метода составляет 1000 ДНК-копий на 1 мл. Серологическое исследование. Определение уровня антител (а/т) классов IgM и IgG к Mycoplasma pneumoniaе и Chlamydophila pneumoniaе в сыворотке крови проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест систем компании Savyon Diagnostics (Израиль) на микропланшетном ридере Anthos 2020 (Австрия). Определение уровня антител классов IgM и IgG к вирусу простого герпеса в сыворотке крови проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест систем компании ООО «НПО Диагностические системы» (Россия, Нижний Новгород) на микропланшетном ридере TECAN SUNRISE (Австрия). Иммунологическое исследование включало исследование гуморального и клеточного звена иммунитета. Определение концентрации IgM, IgG, IgA в сыворотке крови проводилось методом нефелометрии на анализаторе белков крови «Беринг Нефелометр» модели BN Pro Spec производства Dade-Behring Marburg GmbH, Германия с использованием реагентов компании Dade-Behring (Германия). Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось методом проточной цитофлуорометрии. Мононуклеары выделяли из цельной гепаринизированной крови на градиенте плотности Histopaque-1077 компании Sigma (США) и метили моноклональными антителами компании Caltag Laboratories (США). Для детекции использовали хромоген и стрептавидинбиотиновую систему детекции компании Beckman Coulter (США). Оценка результатов проводилась методом микроскопии на световом микроскопе Leica DMLS (Германия). Определение уровня общего IgE проводили с помощью непрямого твёрдофазного метода иммуноферментного анализа (ИФА). Определение уровней сывороточных маркеров воспаления включало исследование цитокинового статуса и СРБ. Определение цитокинового статуса в периферической крови – ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-1β, ИФН- в сыворотке крови. Определение уровня цитокинов в сыворотке крови проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест систем Biosoruce (Бельгия) на микропланшетном ридере TECAN SUNRISE (Австрия). Уровень СРБ в сыворотке крови проводилось методом нефелометрии на анализаторе белков крови «Беринг Нефелометр» модели BN Pro Spec производства Dade-Behring Marburg GmbH, Германия с использованием реагентов компании Dade-Behring (Германия). Статистическая обработка результатов исследования проводилась с определением средних значений полученных показателей (М) и стандартных отклонений (±σ). Все численные данные представлены как Mean+SD. Достоверность различий количественных показателей между группами в случае непараметрического распределения определяли при помощи критерия MannWhitney U-test. Корреляционную зависимость рассчитывали по методу Gamma. Доверительный интервал >95% принимался как статистически значимый. Различия считались статистически достоверными при р < 0,05. При анализе сывороточных концентраций биомаркеров установлено их непараметрическое распределение, данные представлены как медиана, 25-75 процентиль. Вся статистическая обработка результатов проведена при помощи пакета прикладных программ Statistica for Windows, Release 6.0 StatSoft, Inc. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Результаты клинико-функционального обследования Характеристика пациентов представлена в таблице 3. Пациенты 3 группы с вирусной инфекцией были старше (58,11±9,12 лет против 48,00±18,31 лет, р=0,019), с более длительным анамнезом БА (14,22±3,93 лет против 10,38±2,62 лет, р=0,033). Индекс массы тела пациентов 2 группы был больше, чем у больных 1 группы (24,65±1,71 кг/м2 против 22,70±1,90 кг/м2, р=0,022). Таблица 3. Характеристика пациентов по группам Мean± SD (р) Возраст, (лет) 1 группа (бак+вир.) n=8 48,0±18,31 2 группа (бак.) n=14 51,5±8,90 3 группа (вир.) n=9 58,1±9,12 BMI (кг/м2) 22,7±1,90 24,6±1,71 10,3±2,62 5,2±0,71 Показатель Длительность БА, (лет) Частота обострений, (число раз в год) 1-2 группы 1-3 группы 2-3 группы 0,058 0,019* 0,103 23,3±2,11 0,022* 0,513 0,121 11,7±3,02 14,2±3,93 0,283 0,033* 0,108 5,5±1,02 5,5±0,88 0,440 0,447 0,970 *- достоверное (р<0,05) различие между показателями исследуемых групп. Сенсибилизация к бытовым аллергенам отмечалась у всех больных, к пыльцевым – у 5 (16,1%) больных, сенсибилизация к эпидермальным и к комбинации эпидермальных и пыльцевых аллергенов встречалась одинаково часто у 13(41,9%) больных. Температура тела достоверно выше была у пациентов с вирусной инфекцией, по сравнению с бактериальной инфекцией (37,03±0,34оС против 36,70±0,33оС, р=0,046) В первой группе повышенная температура выше 37,0 оС отмечалась у 4 пациентов (50,0%), во второй группе – у 3 пациентов (21,4%), в третьей группе – у 5 пациентов (55,6%), как представлено в табл.4. По медианам ЧДД, SpO2, ЧСС достоверного различия среди групп не выявлено. Таблица 4. Клинические параметры по группам пациентов 1-2 группы 1-3 группы 2-3 группы ЧДД, мин 1 группа (вир+бак) n=8 20,13±0,64 Мean± SD 2 группа 3 группа (бак.) (вир.) n=14 n=9 20,00±0,68 19,78±0,83 0,670 0,324 0,453 SpO2 , % 93,63±1,41 93,29±1,49 92,22±1,79 0,723 0,399 0,143 ЧСС, мин 84,13±2,85 83,50±3,63 83,56±3,28 0,604 0,661 0,949 Температура, о С 36,93±0,49 36,70±0,33 37,03±0,34 0,228 0,639 0,046* Показатель (р) *- достоверное (р<0,05) различие между показателями исследуемых групп. Явления ринита и трахеита чаще встречались у пациентов с вирусной, чем с бактериальной инфекцией (р=0,004 и р=0,010, соответственно). Фарингит наблюдался у большинства пациентов, но статистически значимой разницы в группах не обнаружено, как представлено в табл.5. Таблица 5. Характеристика клинических симптомов по группам у пациентов. Показатель, n (%) 1группа 2 группа (вир.+бак.) (бак.) n=8 n=14 5 (62,5) 3(21,4) Ринит (р) n (%) 3 группа (вир.) n=9 8(88,9) 1-2 группы 1-3 группы 2-3 группы 0,054 0,200 0,004* Фарингит 4(50,0) 9(64,2) 7(77,7) 0,512 0,232 0,493 Трахеит 2(25,0) 2(14,2) 6(66,6) 0,531 0,086 0,010* *- достоверное (р <0,05) различие между показателями исследуемых групп. Мокрота у большинства больных (24/77,4%) была слизисто-гнойная. При сравнении клеточного состава индуцированной мокроты отмечалось увеличение количества эозинофилов при вирусной инфекции по сравнению с бактериальной нагрузкой респираторных слизистых (19,89+7,57% против 14,43+7,43%, р=0,034), как представлено в табл. 6. Таблица 6. Распределение по общей характеристике индуцированной мокроты в исследуемых группах пациентов, абс(%) (р) 1 группа (вир+бак.) n=8 n (%) 2 группа (бак.) n=14 3 группа (вир.) n=9 1-2 группы 1-3 группы 2-3 группы 8(100) 10(71,4) 6(66,7) 0,095 0,072 0,809 0 4(28,6) 3(33,3) 0,096 0,072 0,809 Эозинофилы 16,38+8,70 14,43+7,43 19,89+7,57 0,705 0,412 0,034* Нейтрофилы 23,75+9,85 29,21+13,90 28,67+10,50 0,320 0,330 0,776 Показатель (мокрота) Слизистогнойная Гнойная * - достоверное (р<0,05) различие между показателями исследуемых групп. Показатели объема форсированного выдоха за 1 сек (ОФВ1) были значительно ниже у пациентов с вирусной инфекций, по сравнению с бактериальной и микст-инфекцией (р=0,039, р=0,038 соответственно). 3.2. Результаты вирусологического и бактериологического обследования. При микробиологическом исследовании мокроты у наблюдаемых нами больных идентифицированы в достоверных концентрациях штаммы Streptococcus pneumoniae (10/32.2%), Haemophilus influenzae (4/12.9%), Klebsiella pneumoniae (1/3.2%). Методом ПЦР в мокроте обнаружены Streptococcus pneumoniaе - у 17/54.8%, Haemophilus influenzae - у 8(25.8%), Klebsiella pneumoniae - у 4/12.9% больных. Кроме того, с помощью ПЦР в мокроте верифицированы вирусы, такие как аденовирус (2/6,4%), РСВ (5/16,1%), РВ (10/32,2%). В сыворотке крови с помощью ПЦР также определены вирусы Герпес I (2/6,4%), Герпес II (1/3,2%), как представлено на рис. 1, 2. Рисунок 1. Частота обнаружения бактерий у больных с обострением БА по данным ПЦР диагностики и микробиологического посева мокроты. ПЦР диагностика Бак. посев Streptococcus pneumoneae 17 (54,8%) Haemophilus inf. 8 (25,8%) Klebsiella pneumoniae 4 (12,9%) Не обнаружено 2 (6,4%) Streptococcus pneumoniae 10 (32,2%) Haemophilus inf. 4 (12,9%) Klebsiella pneumoniae 1 (3,2%) Не обнаружено 16 (51,6%) Рисунок 2. Частота обнаружения вирусов у больных с обострением БА по данным ПЦР и серологии. 32,2% 35,0% 30,0% 25,0% 20,0% Аденовирус 16,1% РСВ РВ 15,0% 10,0% 5,0% 0,0% 6,4% 9,6% Герпес I, II ПЦР - исследование образцов мокроты и крови у больных с БА показало, что в возникновении обострения болезни принимают участие как монокультуры (38,7%), так и ассоциации различных микроорганизмов (61,3%). При изучении видового состава бактериальные ассоциаций комбинации микроорганизмов вирусно-бактериальные встречались одинаково часто (8/25,8%), и реже определялись вирусные ассоциации (3/9,7%). При серологическом исследовании в крови выявлены антитела IgM к Mycoplasma pneumoniae у 3(9,7%), а антитела IgG к Chlamydophila pneumoniae были обнаружены у (23/74,1%) и к Mycoplasma pneumoniae у 13(41,9%) больных. Таким образом, у больных с атопической БА при респираторной инфекции комплексная оценка респираторных возбудителей показала, что обострения ассоциированы в 29,0% с вирусной, в 45,2% с бактериальной и в 25,8% случаях с вирусно-бактериальной инфекцией. 3.3. Характеристика сывороточных биомаркеров пациентов с обострением БА в зависимости от возбудителя Как видно из таблицы 7, уровни СРБ достоверно выше у больных 2 группы с бактериальной флорой, по сравнению с вирусной инфекцией (1,37(0,85-2,54) мг/л против 0,28(0,18-1,01) мг/л, р=0,044). Продукция ИФН-γ была снижена у пациентов с вирусной инфекцией в большей степени по сравнению с группой пациентов с бактериальной инфекцией (32,25(20,98-109,09) пг/мл против 19,10(18,60-36,80) пг/мл, р=0,043 соответственно). Таблица 7. Лабораторные показатели у больных бронхиальной астмой в зависимости от этиологического фактора. (р) Median (25-75 percentile) Показатель СРБ, мг/л ИФН-γ, пг/мл 1 группа (вир+бак.) n=8 2 группа (бак.) n=14 1,60 1,37 (0,64-3,13) (0,85-2,54) 23,10 32,25 (19,7-31,0) (20,9-109,0) 3 группа (вир.) n=9 0,28 (0,18-1,01) 19,10 (18,6-36,8) 1-2 группы 1-3 группы 2-3 группы 0,918 0,177 0,044* 0,194 0,700 0,043* *- достоверное (р<0,05) различие между показателями исследуемых групп. Частота определения цитокинов ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-1β в зависимости от этиологического фактора была различна в группах, но без достоверной разницы. Сравнение сывороточных уровней данных цитокинов в исследуемых группах больных не выявило статистически значимой разницы. 3.4. Взаимосвязь уровней цитокинов в сыворотке крови и клиникофункциональных показателей у пациентов с обострением БА При изучении взаимосвязей ИЛ-8 с функциональными показателями выявлена достоверная обратная корреляционная взаимосвязь между ИЛ-8 и ОФВ1% (r= -0,95), ИЛ-1β (r=-0,71), а также обнаружена прямая взаимосвязь между ОФВ1 и ИФН-γ (r=0,74), что свидетельствует о роли разных цитокинов в развитии обструктивных нарушений, как показано на рис.3. Рисунок 3. Корреляционные взаимосвязи ОФВ1 и системных биомаркеров в сыворотке пациентов с бактериальными возбудителями ИЛ-8 r=-0,71 p<0,04 ИЛ-1β ОФВ1 r =-0,95 p<0,001 ИФН-γ r=0,74 p<0,03 3.4.1. Корреляционные взаимосвязи системных биомаркеров в сыворотке пациентов с бактериальными возбудителями При изучении взаимосвязи СРБ с ИЛ-8 выявлена достоверная прямая корреляционная взаимосвязь (r=0,71) в группе с бактериальным возбудителем, а также обнаружена прямая корреляционная взаимосвязь умеренной силы между ИЛ-5 и СРБ (r=0,42), ИЛ-6 и СРБ (r=0,95), что свидетельствует о роли разных цитокинов в развитии и поддержании воспаления, как представлено на рисунке 4. Рисунок 4. Корреляционные взаимосвязи СРБ и цитокинов в сыворотке крови пациентов с обострением БА CРБ ИЛ-6 r=0,95 p<0,009 ИЛ-8 CРБ ИЛ-5 r=0,42 p<0,04 r=0,71 p<0,04 3.5. Показатели гуморального иммунитета у пациентов с обострением БА в зависимости от возбудителя Значения показателей IgG, по каждому показателю отдельно для всех трех групп достоверно не отличаются между группами (р>0,05). Для показателей маркеров активации гуморального звена иммунитета: IgA и IgM их значения в третьей группе достоверно меньше, чем значения аналогичных показателей во второй группе. Кроме того, медиана значений IgM в третьей группе достоверно меньше медианы в первой группы, как видно из табл.8. Таблица 8. Показатели гуморального иммунитета у пациентов с обострением БА в зависимости от возбудителя Показатель Общий Ig G Общий Ig A Общий Ig M Median (25-75 percentile) 1 группа 2группа 3 группа (вир+бак) (бак.) (вир.) n=8 n=14 n=9 10,9 9,5 10,0 (9,1-12,7) (9,04-12,4) (9,86-10,60) 2,09 2,31 1,4 (1,9-2,6) (1,7-2,7) (1,2-2,1) 1,56 1,44 1,03 (1,18-2,1) (1,18-1,8) (0,91-1,18) (p) 1-2 группы 1-3 группы 2-3 группы 0,707 0,665 0,614 0,585 0,149 0,035* 0,539 0,021* 0,044* * - достоверное (р < 0,05) различие между показателями исследуемых групп. 3.5.1. Показатели клеточного иммунитета у пациентов с обострением БА в зависимости от возбудителя Значения показателей CD3, CD4, CD8, CD95, HLA-DR, CD4/CD8 по каждому показателю отдельно для всех трех групп достоверно не отличаются между группами (р>0,05). Для В-лимфоцитов, показателей маркеров активации CD25, CD50 значения медиан этих показателей в третьей группе достоверно больше значения медиан этих показателей во второй группе при нормальных значениях иммунорегуляторного индекса, что говорит в пользу наличия различных особенностей воспаления в зависимости от этиологии возбудителя, как видно из табл.9. Таблица 9. Показатели клеточного иммунитета у пациентов с обострением БА в зависимости от возбудителя. Показатель,% CD3 CD4 CD8 CD4 /CD8 CD16 CD20 CD25 CD50 CD95 HLA-DR Median (25-75 percentile) 1 группа 2 группа 3 группа (вир+бак.) (бак.) (вир.) n=8 n=14 n=9 48,0 45,5 47,0 (43,5-50,2) (42,2-49,5) (45,0-50,0) 30,0 30,0 30,0 (27,2-30,2) (28,2-31,0) (29,0-34,0) 16,0 16,0 16,0 (14,7-18,5) (15,0-17,7) (16,0-17,0) 1,75 1,80 1,80 (1,65- 1,93) (1,70- 1,90) (1,70- 1,90) 18,0 16,0 19,0 (14,7-20,2) (15,0-17,7) (17,0-23,0) 11,50 8,50 12,0 (7,5-16,7) (7,2-9,7) (10,0-17,0) 9,50 7,50 11,0 (6,50-10,50) (7,0-10,0) (9,0-12,0) 78,5 78,0 84,0 (70,0-80,2) (69,0-83,2) (81,0-86,0) 20,5 19,5 20,0 (18,5-24,0) (16,2-20,7) (17,0-22,0) 24,0 21,0 24,0 (18,2-28,5) (19,0-24,7) (19,0-30,0) (р) 1-2 группы 1-3 группы 2-3 группы 0,784 0,847 0,377 0,626 0,497 0,612 0,755 0,626 0,424 0,875 0,806 0,991 0,372 0,595 0,049* 0,140 0,629 0,006* 0,653 0,245 0,049* 0,811 0,030* 0,037* 0,271 0,923 0,358 0,584 0,961 0,376 *- достоверное (р < 0,05) различие между показателями исследуемых групп. 3.5.2. Показатели фагоцитоза у пациентов с обострением БА в зависимости от возбудителя Значения показателей ФР для всех трех групп достоверно не отличаются между группами (р>0,05). Для показателей ФЧ, ФАН значения медиан этих показателей в третьей группе достоверно больше значения медиан этих показателей во второй группе, как видно из табл.10. Таблица 10. Показатели фагоцитоза у пациентов в группах Показатель ФАН ФЧ ФР Median (25-75 percentile) 1 группа 2 группа 3 группа (вир+бак.) (бак.) (вир.) n=8 n=14 n=9 69,0 64,5 78,0 (43,5-80,0) (52,5-67,5) (69,0-86,0) 11,40 12,05 23,5 (6,0-24,3) (8,9-17,8) (19,1-32,3) 79,0 69,0 82,0 (58,5-83,0) (58,2-76,7) (74,0-93,0) (р) 1-2 группы 1-3 группы 2-3 группы 0,390 0,228 0,021* 0,837 0,101 0,011* 0,192 0,469 0,054 *- достоверное (р < 0,05) различие между показателями исследуемых групп. 3.6. Корреляционные взаимосвязи цитокинов и системных биомаркеров в сыворотке пациентов с бактериальными и вирусными возбудителями В группе больных с вирусными возбудителями уровень ИФН-γ достоверно снижен в отличии от других групп, при этом он обратно коррелирует с CD25 (r=0,57) CD20 (r=-0,51), что указывает на наличие различных особенностей воспаления в зависимости от этиологического возбудителя. Также выявлена умеренной силы обратная взаимосвязь между ИЛ-8 и CD25 (r=-0,56), CD20 (r=0,52) в группе с бактериальными возбудителями, что подтверждает роль ИЛ-8 в деструктивных процессах и поддержании воспаления при БА. Рис.5. Рисунок 5. Корреляционные взаимосвязи показателей клеточного иммунитета и концентрации цитокинов в сыворотке крови пациентов с обострением БА в зависимости от возбудителя Группа пациентов с вирусным возбудителем CD20 ИФН-γ Группа пациентов с бактериальным возбудителем r=-0,51 p<0,03 CD25 r=-0,57 p<0,04 Таким образом, иммунологические можно особенности выделить с CD25 r=-0,56 p<0,04 ИЛ-8 CD20 r=-0,52 p<0,03 клинико-функциональные определением фенотипов пациентов и с обострением атопической бронхиальной астмы при респираторной инфекции в зависимости от возбудителя. Вирусный фенотип у пациентов с обострением атопической БА при частых респираторных инфекциях характеризовался старшим возрастом, длительным анамнезом по БА, повышенной температурой тела, наличием симптомов ринита и трахеита, низкими значениями ОФВ1 и ИФН-γ, наличием повышенного числа эозинофилов в индуцированной мокроте, а также повышенными маркерами активации клеточного звена иммунитета. Бактериальный фенотип у пациентов с обострением атопической БА четкой клинической картины не имел, но отличался по сывороточным биомаркером - более высокими показателями по СРБ и выше значениями ИФН-γ, а также повышенными маркерами активации гуморального звена иммунитета. Вирусно-бактериальный фенотип обострения атопической БА четкой характеристики не имел. Таблица.11. Таблица 11. Фенотипы обострения пациентов бронхиальной астмы Показатели Возраст Вируснобактериальная группа + Бактериальная группа Вирусная группа ++ +++ Длительность БА + + +++ Ринит ++ + +++ Фарингит + + + Трахеит ++ + +++ Повышение t о тела + + +++ Снижение ОФВ1 + + +++ + + +++ + + + ИЛ-5,6,8,10,1β + + + СРБ + +++ + ИФН-γ ++ +++ + + + +++ ФАН, ФЧ + + +++ Общий IgA + +++ + Общий IgM + +++ + Общий IgG + ++ ++ Эозинофилы нейтрофилы CD20, CD25,CD50 Выводы 1. У больных с обострением атопической БА при респираторной инфекции комплексная оценка возбудителей выявила, что обострения ассоциированы в 29,0% с вирусной, в 45,2% с бактериальной и в 25,8% случаях с вируснобактериальной инфекцией. 2. Обострения атопической БА у пациентов при вирусной инфекции характеризуются наличием симптомов ринита, трахеита, длительным анамнезом по БА, повышенной температурой тела, низкими значениями ОФВ1, повышенным содержанием эозинофилов в мокроте при сниженной продукции ИФН-γ в сыворотке крови по сравнению с другими группами. 3. При бактериальном обострении не обнаружено характерных клинических особенностей, однако уровень СРБ был достоверно выше, чем у пациентов с вирусным обострением астмы. Выявлены достоверные корреляционные взаимосвязи между ОФВ1 и ИЛ-8 (r=-0,95), ИЛ-1β (r=-0,71), что свидетельствует об активности воспаления и связанной с ним тяжести обструкции дыхательных путей. 4. Сравнение сывороточных уровней цитокинов в исследуемых группах больных не выявило статистически значимой разницы. 5. У пациентов с обострением атопической БА при вирусной инфекции отмечалось повышение В-лифоцитов и CD25, СD50 и ФАН, что свидетельствует об активации клеточного звена иммунитета, а при бактериальной инфекции отмечалось повышение общего IgA и IgM, что свидетельствует об активации иммунитета. преимущественно гуморального звена ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. У больных с частыми обострениями атопической БА целесообразно проводить комплексное обследование для верификации вирусных и бактериальных возбудителей 2. При бактериальной высокочувствительного инфекции маркера целесообразно бактериального определение воспаления, СРБ, а как также исследование гуморального звена иммунитета (общий IgA и IgM), а при вирусной инфекции целесообразно определение В-лимоцитов, маркеров активации клеточного звена иммунитета и фагоцитоза (CD25, СD50 и ФАН), исследование клеточного состава индуцированной мокроты, а также продукции ИФН-γ в сыворотке крови, с целью дифференцированного подхода к терапии обострений БА у этих пациентов. Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Хаптхаева Г.Э., Пустовалов А.А., Чучалин А.Г., Зыков К.А. Роль респираторных инфекции в обострении Бронхиальной астмы.// материалы конференции, 18-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания.Екатеринбург.- Сборник трудов резюме.- 2008: (с.19). 2. Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г. Респираторная инфекция и бронхиальная астма. // Пульмонология 2008; №5: 75-79. 3. Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г., Зыков К.А., Пустовалов А.А. Биомаркеры воспаления при инфекционном обострении бронхиальной астмы. // материалы конференции, 19-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания.- Москва.- Сборник трудов резюме.- 2009: (с.28). 4. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г. // материалы конференции, «Актуальные вопросы респираторной медицины», Москва, 4-5 марта 2009г., с.50. 5. Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г., Зыков К.А., Колганова Н.А. Роль сывороточных биомаркеров при обострении атопической бронхиальной астмы на фоне респираторной инфекции. // Пульмонология 2010; №3: 46-52. 6. Khaptkhaeva G, Zykov K, Chuchalin А. et al. Role of respiratory infection in the control and severity of asthma. // Eur Respir J 2008; Р2228; 388s. Список сокращений: БА - бронхиальная астма ВБА - вирусно-бактериальные ассоциации ИЛ-5 – интерлейкин 5 ИЛ-6 – интерлейкин 6 ИЛ-8 – интерлейкин 8 ИЛ-10 – интерлейкин 10 ИЛ- 1β – интерлейкин 1бетта ИФН- - интерферон гамма ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1секунду РСВ - респираторно-синцитиальный вирус РВ - риновирус NOex - оксид азота выдыхаемого воздуха Ig Е – иммуноглобулин класса Е Ig А – общий иммуноглобулин А Ig М – общий иммуноглобулин М Ig G – общий иммуноглобулин G CРБ - С- реактивный протеин CD - моноклональное антитело, распознающее поверхностный лейкоцитарный антиген соответствующего кластера (Claster Differention) CD16+ - натуральные киллеры CD19+ - В-лимфоциты CD3+ - Т-лимфоциты CD4+ - Т-лимфоциты-хелперы CD50+ - натуральные киллеры CD8+ - Т-лимфоциты-цитотоксические NK - клетки - натуральные (естественные) киллеры Тh1 - Т- лимфоциты хелперы 1-го типа Тh2 - Т - лимфоциты хелперы 2-го типа ФАН - Фагоцитарная активность нейтрофилов ФЧ - Фагоцитарное число нейтрофилов ФР - Фагоцитарный резерв ПЦР - полимеразная цепная реакция ИФА - иммуноферментный анализ ФВД – функция внешнего дыхания ФЖЕЛ – форсированная жизненная ёмкость легких Подписано в печать 5 июля 2010года Заказ 505. Тираж 100 экземпляров. Отпечатано в типографии ООО КПМ “Фирма Лика “ 105264, Москва, Нижняя Первомайская, 47 тел. (495)465-1154