1. У больных с обострением атопической БА

На правах рукописи
Хаптхаева Галина Эрдниевна
ОБОСТРЕНИЕ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ ПРИ
РЕСПИРАТОРНОЙ ИНФЕКЦИИ: ЗНАЧИМОСТЬ РЕСПИРАТОРНЫХ
ВОЗБУДИТЕЛЕЙ, СИСТЕМНЫХ БИОМАРКЕРОВ, СОСТОЯНИЕ
ГУМОРАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА
14.01.25 – пульмонология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2010
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении
«Научно-исследовательский институт пульмонологии» Федерального
медико-биологического агентства России
Научный руководитель:
Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор
Чучалин Александр Григорьевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Белевский Андрей Станиславович
ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России.
доктор медицинских наук, профессор Дидковский Николай Антонович
ФГУ «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России.
Ведущая организация:
Центральный Научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН.
Защита состоится «
» …………………….2010 года в ………часов на
заседании Диссертационного Совета Д 208.053.01 при ФГУ «НИИ
пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32)
С
диссертацией
можно
ознакомиться
в
библиотеке
ФГУ
«НИИ
пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32)
Автореферат разослан «
» …………………....2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук
Анаев Эльдар Хусеевич
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Бронхиальная
астма
(БА)
относится
к
наиболее
распространенным
заболеваниям человека во всех возрастных группах. [GINA, 2006]. У большинства
пациентов
БА
контролируется
медикаментозной
терапией
и
не
требует
госпитализации в стационар. Однако примерно у половины всех больных БА
возникают эпизоды ухудшения в течение заболевания – обострения БА [Авдеев
С.Н., Чучалин А.Г., 2008]. У взрослых пациентов даже оптимальная терапия
снижает частоту обострений приблизительно на 40 % [Pauwels RA, et al., 2003].
К обострению БА могут привести различные триггеры [GINA, 2006]. Еще
William Osler писал в своем учебнике, что среди известных фактов, вызывающих
обострение БА (аллергены и факторы окружающей среды), "каждая новая
простуда" могла вызвать обострение болезни [Olser W. 1892]. В настоящее время
вирусная инфекция считается известным триггером обострений астмы. [Carlsen KH
et al., 1984., Wennergren G et al., 2000].
Роль
бактериальной
инфекции
в
инициировании
или
поддержке
астматического воспаления изучена недостаточно. [Savykoski T., et al., 2004].
Однако в последние годы возрастает поток данных, доказывающих связь
инфицирования некоторыми бактериями, например, Chlamydophila pneumoniae (C.
pneumoniae), с началом БА у взрослых [Hahn DL., et al., 1991], тяжестью болезни
[Black PN, et al., 2000] и частотой обострения астмы [Cunningham AF, et al., 1998,
Allegra L, et al., 1994]. В целом, данные о микробном спектре возбудителей у
больных с обострением атопической БА при респираторной инфекции очень
скудны
и
противоречивы,
поэтому
изучение
состояния
микробиоценоза
дыхательных путей представляет интерес в отношении его влияния на течение БА.
БА характеризуется гиперреактивностью дыхательных путей и воспалением,
в котором различные клетки (эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги и Тлимфоциты), цитокины и медиаторы воспаления играют важную роль. Недавние
исследования продемонстрировали, что пациенты с бронхиальной астмой более
подвержены влиянию респираторных вирусов вследствие преобладания Th2 клеток
или уменьшения активности Th1 клеток и IL-10 [Message SD, et al., 2008].
Предполагается, что в ответ на инфекцию имеются нарушения в реакциях
цитокинов врожденной иммунной системы у пациентов, страдающих БА по
сравнению со здоровыми людьми [Wark PA., et al., 2005.]. Кроме локального
воспаления при астме имеется системное воспаление, о чем свидетельствуют
повышенные уровни плазменного фибриногена и сывороточного амилоида “А” у
больных БА [Jousilahti P, et al., 2002]. Наличие системного воспаления
подтверждает факт обострения болезни и диктует необходимость идентификации
этиологического
происхождения.
Так,
исследование
микробного
спектра
возбудителей, клинико-функциональных показателей, состояние гуморального,
клеточного иммунитета и системных биомаркеров, а также их взаимосвязей может
уточнить механизмы обострения БА, спровоцированного инфекцией.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Изучить спектр респираторных возбудителей, значимость системных
биомаркеров, состояние гуморального и клеточного иммунитета у больных с
обострением атопической бронхиальной астмы при вирусной и бактериальной
инфекции.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Изучить спектр бактериальных и вирусных респираторных возбудителей при
обострении атопической БА.
2. Изучить
клинические
и
функциональные
особенности
обострения
атопической БА при респираторной инфекции в зависимости от возбудителя.
3. Изучить цитокиновый профиль (ИЛ-5,6,8,10,1β, ИФН-γ), значимость CPБ у
больных с обострением атопической БА при вирусной и бактериальной
инфекциях.
4. Провести сравнительную оценку показателей клеточного (CD4, CD8,
CD4/CD8, CD16, CD25, CD50, CD95, HLA-DR), гуморального (общий IgA,
IgM, IgG) иммунитета и фагоцитоза (ФАН, ФЧ, ФР) в зависимости от
возбудителя у больных с обострением атопической БА.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
В представленной работе впервые:
1. С
помощью
комплексной
оценки
респираторных
возбудителей:
микробиологической, ПЦР диагностики и серологии - установлено, что
обострения атопической БА ассоциированы в 29,0% с вирусной, в 45,2% с
бактериальной и в 25,8% случаев с вирусно–бактериальной инфекцией.
2. Выявлена обратная корреляционная взаимосвязь между ИЛ-8 и ОФВ1%, ИЛ1β, а также прямая корреляционная взаимосвязь между ОФВ1 и ИФН-γ, что
свидетельствует о роли разных цитокинов в развитии воспаления и
обструктивных нарушений.
3. В группе больных с вирусной инфекцией уровень ИФН-γ достоверно снижен
в сравнении с другими группами, при этом он обратно коррелирует с CD20,
CD25, а в группе пациентов с бактериальной инфекцией выявлена обратная
корреляционная взаимосвязь между ИЛ-8 и CD20, CD25, что указывает на
наличие различных особенностей воспаления в зависимости от этиологии
возбудителя.
4. Дана характеристика фенотипов больных с обострением атопической БА при
вирусной и бактериальной инфекциях. Установлено, что для вирусного
фенотипа характерно снижение продукции ИФН-γ, повышение эозинофилов в
мокроте, В-лимфоцитов и маркеров активации клеточного звена иммунитета
(CD25, CD50), а для бактериального фенотипа характерно повышение СРБ и
активация гуморального звена иммунитета (общий IgA и IgM), что указывает
на участие разных иммунологических факторов в развитии обострения
атопической БА.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.
1. Комплексное исследование спектра респираторных возбудителей и системных
биомаркеров
позволяет
выделить
фенотипы
пациентов
с
частыми
обострениями атопической БА при вирусной и бактериальной инфекции.
2. Выявленные взаимосвязи между клинико-функциональными параметрами,
системными биомаркерами и разными звеньями иммунитета у больных с
обострением атопической БА в зависимости от возбудителя респираторной
инфекции позволяют уточнить отдельные звенья патогенеза обострения с
целью дифференцированного лечения и повышения контроля за течением
бронхиальной астмы.
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
Диагностический
алгоритм
обследования
пациентов
с
обострением
атопической бронхиальной астмы при респираторной инфекции используется для
ведения и определения тактики лечения больных в аллергологическом и
пульмонологическом отделениях Городской клинической больницы №57 г.
Москвы.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.
Основные положения работы доложены и обсуждены на:
- 18-м, 19-м Национальных Конгрессах по болезням органов дыхания,
(Екатеринбург, 2008г, Москва, 2009г);
- Ежегодном Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Берлин,
2008);
- Научной сессии ФГУ НИИ Пульмонологии Росздрава 2008г. (Рязань);
- Совместном заседании ФГУ НИИ Пульмонологии Росздрава и кафедры
госпитальной терапии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава
(Москва, 2009 г);
- I Форуме молодых ученых Евро-Азиатского Респираторного Общества
(Бишкек,2010г).
ПУБЛИКАЦИИ.
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из которых 2
журнальные статьи (в ведущих рецензируемых журналах согласно перечню ВАК
Минобразования и науки РФ), 4 тезисов национальных и европейских конгрессов,
из них 1 – в зарубежной печати (European Respiratory Journal).
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.
Диссертация изложена на 125 страницах машинописи. Состоит из введения,
глав
обзор
литературы,
материалы
и
методы
исследования,
результаты
собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций.
Иллюстрирована 14 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель
содержит 19 отечественных и 141 зарубежных источников. Диссертация изложена
на русском языке.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Общее количество, участвовавших в исследовании, составило 31 человек.
Критерии включения:
Обязательными
клиническими
и
функциональными
критериями
для
включения больных в исследование были: клинический диагноз атопической
бронхиальной астмы средней степени, обострение средней степени тяжести в
соответствии с классификацией тяжести астмы, GINA, 2006 года, возраст от 17 до
70 лет включительно, наличие в анамнезе частых ОРВИ, не менее 3 раз в год,
длительность ОРВИ на момент поступления в стационар не более 5-ти суток на
момент поступления в стационар
Критерии исключения:
беременные, кормящие женщины, пациенты с тяжёлым течением БА,
согласно GINA, 2006, иммунотерапия в анамнезе за последние 6 месяцев к
моменту поступления в стационар, любые сопутствующие заболевания в стадии
декомпенсации, алкогольная, наркотическая зависимость.
В исследование было включено 31 пациент с обострением атопической БА средней
степени тяжести при респираторной инфекции (диагноз подтвержден данными
анамнеза, клинической картиной, рентгенологическими, функциональными
методами диагностики). Исследование проводилось на базе ГКБ №57 и ФГУ «НИИ
пульмонологии» ФМБА России с 2006 по 2009 гг. Все больные находились на
стационарном лечении. Характеристика больных атопической БА, включенных в
исследование, представлена в табл.1.
Таблица 1
Характеристика больных атопической БА, включенных в исследование.
Параметры
M/Ж
(mean±SD)
4/27
Средний возраст, лет
50,4±13,5
Длительность заболевания, лет
12,4 ± 3,2
Частота обострений в год
5,4 ± 0,9
Стаж/курения, пачек/лет
7,4 ± 1,9
BMI, кг/м2
23,8 ± 2,0
Группу из 31 человека поделили на 3 подгруппы, в зависимости от
выделенного возбудителя. Критерий отбора по ПЦР - диагностике, серологии,
бактериологическому посеву:1) для первой подгруппы - наличие положительного
результата как в группе показателей бактерий так и в группе показателей вирусов;
2) для второй подгруппы - наличие положительного результата только в группе
показателей бактерий; 3) для третьей группы - наличие положительного результата
только в группе показателей вирусов.
Группа показателей бактерий в мокроте и сыворотке крови (определение
методом ПЦР, бактериологии, серологии): Haemophilus influenzae, Streptococcus
pneumoniae,
Klebsiella
pneumoniaе,
Chlamydophila
pneumoniae,
Mycoplasma
pneumoniae. Группа показателей вирусов в мокроте и крови (определение методом
ПЦР, серологии): Аденовирус, РСВ, РВ, Герпес I типа, Герпес II типа.
Распределение пациентов по группам в зависимости от выделенного
возбудителя, представлено в табл.2
Таблица 2.
Распределение пациентов по группам в зависимости
от выделенного возбудителя
ПЦР, серологическая -диагностика
(мокрота+сыворотка крови)
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Haemophilus influenzae + РВ
Klebsiella pneumoniae
Streptococcus pneumoniae +
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae + Klebsiella
pneumoniae
Аденовирус
Риновирус
РСВ
Streptococcus pneumoniae+
аденовирус
Streptococcus pneumoniae + РВ
1 группа
n=8
(вирусы +
бактерии)
2группа
n=14
(бактерии)
3 группа
n=9
(вирусы)
4(28.5%)
1(7.1%)
1 (12.5%)
1(7.1%)
5(35.7%)
3(21.4%)
2 (22.2%)
1(11.1%)
2(25%)
4(50%)
Streptococcus pneumoniae + РСВ
РВ + РСВ
Герпес Iтипа
Герпес IIтипа
Во
всех
группах
1(12.5%)
3(33.3%)
2(22.2%)
1(11.1%)
производилась
оценка
клинико-функциональных
показателей, биомаркеров воспаления, оценка взаимосвязи иммунологических
маркеров воспаления, с клинико-функциональными показателями.
У всех больных оценивались приведенные ниже клинические, рентгенологические
функциональные, лабораторные, иммунологические показатели:
Оценка клинической картины больных.
Учитывались следующие показатели: возраст больных, пол, ИМТ, сбор
анамнеза заболевания, жалоб больного, сбор аллергологического анамнеза:
наличия кожных проб с неинфекционными аллергенами, специфических IgE по
данным выписок из стационаров и амбулаторной карте, определение уровней
общего IgE, изучение объективного статуса пациента, электрокардиографии,
исследование крови с лейкоцитограммой, частота сердечных сокращений (ЧСС),
частота дыхательных движений (ЧДД), кашель, характер мокроты.
Клинико-рентгенологическое
обследование
включало
в
себя
-
стандартную рентгенографию органов грудной клетки в прямой проекции.
Исследование функции внешнего дыхания (ФВД). При оценке функции
внешнего
дыхания
использовались
показатели
ОФВ1,
ЖЕЛ,
ОФВ1/ЖЕЛ.
Исследование спирометрии проводилось путем анализа кривой «поток-объем» на
компьютерном анализаторе Flowscreen фирмы Erich Jaeger, Германия. Оценку
полученных результатов проводили при сопоставлении данных с должными
величинами, рассчитанными по формулам Европейского Сообщества Стали и
Угля, 1993 (Quanqer et. al., 1993; Cotes et al., 1993).
Микробиологическое
исследование
включало
микроскопию
и
культуральное исследование мокроты.
Материалом для бактериологического исследования служила мокрота,
полученная после глубокой экспекторации. Образцы собирались в стерильные
чашки и направлялись в микробиологическую лабораторию в течение 1 часа после
их получения. Порция мокроты, имеющая визуально наибольшую “гнойность “,
окрашивались по Грамму, после чего под малым увеличением проводился подсчет
эпителиальных клеток и лейкоцитов. Только образцы мокроты, удовлетворяющие
критериям Murrey-Washington- менее 10 эпителиальных клеток и более 25
лейкоцитов в поле зрения (х 100) , исследовали на культуры. Материал высевали на
твердые питательные среды (кровяной агар, Эндо, шоколадный агар, среда Сабуро)
и культивировали в течение 18-24 часов при температуре 36-37ᴼС. Среди
выделенных микроорганизмов рассматривались только потенциально патогенные
бактерии, к непотенциально патогенным бактериям относили: Streptococcus
viridians, Neisseria spp., Corynebacterium spp., Candida spp., Enetrococcus spp.,
коагулазо-негативные
стафилококки.
Диагностически
значимой
считали
концентрацию колониеобразующих единиц (КОЕ) > 106/ мл для мокроты (>105/мл
при выделении
Streptococcus pneumoniaе). Также проводилось исследование
индуцированной мокроты.
ПЦР диагностика.
Выделение ДНК, РНК: пробоподготовка универсальная (ПУН). Набор для
амплификации: пробирки с ПЦР - смесью, ПЦР - буфер с полимеразой,
контрольные образцы (+;-). Производитель: ООО «Лаборатория Изоген», Россия.
Детекция
осуществлялась
методом
электрофоретической
разгонки
амплифицированного образца в агарозном геле. Учет результатов проводился
после анализа снимков агарозных гелей на основании наличия или отсутствия
четкого видимого сигнала на уровне положительного контрольного образца.
Чувствительность метода составляет 1000 ДНК-копий на 1 мл.
Серологическое исследование.
Определение уровня антител (а/т) классов IgM и IgG к Mycoplasma
pneumoniaе и Chlamydophila pneumoniaе в сыворотке крови проводилось методом
твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест систем
компании Savyon Diagnostics (Израиль) на микропланшетном ридере Anthos 2020
(Австрия). Определение уровня антител классов IgM и IgG к вирусу простого
герпеса
в
сыворотке
крови
проводилось
методом
твердофазного
иммуноферментного анализа с использованием тест систем компании ООО «НПО
Диагностические системы» (Россия, Нижний Новгород) на микропланшетном
ридере TECAN SUNRISE (Австрия).
Иммунологическое исследование включало исследование гуморального и
клеточного звена иммунитета.
Определение концентрации IgM, IgG, IgA в сыворотке крови проводилось
методом нефелометрии на анализаторе белков крови «Беринг Нефелометр» модели
BN
Pro
Spec
производства
Dade-Behring
Marburg
GmbH,
Германия
с
использованием реагентов компании Dade-Behring (Германия).
Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось
методом проточной цитофлуорометрии. Мононуклеары выделяли из цельной
гепаринизированной крови на градиенте плотности Histopaque-1077 компании
Sigma
(США)
и
метили
моноклональными
антителами
компании
Caltag
Laboratories (США). Для детекции использовали хромоген и стрептавидинбиотиновую систему детекции компании Beckman Coulter (США). Оценка
результатов проводилась методом микроскопии на световом микроскопе Leica
DMLS (Германия).
Определение уровня общего IgE проводили с помощью непрямого
твёрдофазного метода иммуноферментного анализа (ИФА).
Определение уровней сывороточных маркеров воспаления включало
исследование цитокинового статуса и СРБ.
Определение цитокинового статуса в периферической крови – ИЛ-5, ИЛ-6,
ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-1β, ИФН- в сыворотке крови. Определение уровня цитокинов в
сыворотке крови проводилось методом твердофазного иммуноферментного
анализа с использованием тест систем Biosoruce (Бельгия) на микропланшетном
ридере TECAN SUNRISE (Австрия). Уровень СРБ в сыворотке крови проводилось
методом нефелометрии на анализаторе белков крови «Беринг Нефелометр» модели
BN
Pro
Spec
производства
Dade-Behring
Marburg
GmbH,
Германия
с
использованием реагентов компании Dade-Behring (Германия).
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с
определением средних значений полученных показателей (М) и стандартных
отклонений
(±σ).
Все
численные
данные
представлены
как
Mean+SD.
Достоверность различий количественных показателей между группами в случае
непараметрического распределения определяли при помощи критерия MannWhitney U-test. Корреляционную зависимость рассчитывали по методу Gamma.
Доверительный интервал >95% принимался как статистически значимый. Различия
считались статистически достоверными при р < 0,05. При анализе сывороточных
концентраций биомаркеров установлено их непараметрическое распределение,
данные представлены как медиана, 25-75 процентиль. Вся статистическая
обработка результатов проведена при помощи пакета прикладных программ
Statistica for Windows, Release 6.0 StatSoft, Inc.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Результаты клинико-функционального обследования
Характеристика пациентов представлена в таблице 3. Пациенты 3 группы с
вирусной инфекцией были старше (58,11±9,12 лет против 48,00±18,31 лет,
р=0,019), с более длительным анамнезом БА (14,22±3,93 лет против 10,38±2,62 лет,
р=0,033). Индекс массы тела пациентов 2 группы был больше, чем у больных 1
группы (24,65±1,71 кг/м2 против 22,70±1,90 кг/м2, р=0,022).
Таблица 3.
Характеристика пациентов по группам
Мean± SD
(р)
Возраст, (лет)
1 группа
(бак+вир.)
n=8
48,0±18,31
2 группа
(бак.)
n=14
51,5±8,90
3 группа
(вир.)
n=9
58,1±9,12
BMI (кг/м2)
22,7±1,90
24,6±1,71
10,3±2,62
5,2±0,71
Показатель
Длительность БА,
(лет)
Частота
обострений,
(число раз в год)
1-2
группы
1-3
группы
2-3
группы
0,058
0,019*
0,103
23,3±2,11
0,022*
0,513
0,121
11,7±3,02
14,2±3,93
0,283
0,033*
0,108
5,5±1,02
5,5±0,88
0,440
0,447
0,970
*- достоверное (р<0,05) различие между показателями исследуемых групп.
Сенсибилизация к бытовым аллергенам отмечалась у всех больных, к
пыльцевым – у 5 (16,1%) больных, сенсибилизация к эпидермальным и к
комбинации эпидермальных и пыльцевых аллергенов встречалась одинаково часто
у 13(41,9%) больных.
Температура тела достоверно выше была у пациентов с вирусной инфекцией,
по сравнению с бактериальной инфекцией (37,03±0,34оС против 36,70±0,33оС,
р=0,046) В первой группе повышенная температура выше 37,0 оС отмечалась у 4
пациентов (50,0%), во второй группе – у 3 пациентов (21,4%), в третьей группе – у
5 пациентов (55,6%), как представлено в табл.4. По медианам ЧДД, SpO2, ЧСС
достоверного различия среди групп не выявлено.
Таблица 4.
Клинические параметры по группам пациентов
1-2
группы
1-3
группы
2-3
группы
ЧДД, мин
1 группа
(вир+бак)
n=8
20,13±0,64
Мean± SD
2 группа
3 группа
(бак.)
(вир.)
n=14
n=9
20,00±0,68 19,78±0,83
0,670
0,324
0,453
SpO2 , %
93,63±1,41
93,29±1,49
92,22±1,79
0,723
0,399
0,143
ЧСС, мин
84,13±2,85
83,50±3,63
83,56±3,28
0,604
0,661
0,949
Температура,
о
С
36,93±0,49
36,70±0,33
37,03±0,34
0,228
0,639
0,046*
Показатель
(р)
*- достоверное (р<0,05) различие между показателями исследуемых групп.
Явления ринита и трахеита чаще встречались у пациентов с вирусной, чем с
бактериальной инфекцией (р=0,004 и р=0,010, соответственно). Фарингит
наблюдался у большинства пациентов, но статистически значимой разницы в
группах не обнаружено, как представлено в табл.5.
Таблица 5.
Характеристика клинических симптомов по группам у пациентов.
Показатель,
n (%)
1группа
2 группа
(вир.+бак.)
(бак.)
n=8
n=14
5 (62,5)
3(21,4)
Ринит
(р)
n (%)
3 группа
(вир.)
n=9
8(88,9)
1-2
группы
1-3
группы
2-3
группы
0,054
0,200
0,004*
Фарингит
4(50,0)
9(64,2)
7(77,7)
0,512
0,232
0,493
Трахеит
2(25,0)
2(14,2)
6(66,6)
0,531
0,086
0,010*
*- достоверное (р <0,05) различие между показателями исследуемых групп.
Мокрота у большинства больных (24/77,4%) была слизисто-гнойная. При
сравнении клеточного состава индуцированной мокроты отмечалось увеличение
количества эозинофилов при вирусной инфекции по сравнению с бактериальной
нагрузкой респираторных слизистых (19,89+7,57% против 14,43+7,43%, р=0,034),
как представлено в табл. 6.
Таблица 6.
Распределение по общей характеристике индуцированной мокроты в
исследуемых группах пациентов, абс(%)
(р)
1 группа
(вир+бак.)
n=8
n (%)
2 группа
(бак.)
n=14
3 группа
(вир.)
n=9
1-2
группы
1-3
группы
2-3
группы
8(100)
10(71,4)
6(66,7)
0,095
0,072
0,809
0
4(28,6)
3(33,3)
0,096
0,072
0,809
Эозинофилы
16,38+8,70
14,43+7,43
19,89+7,57
0,705
0,412
0,034*
Нейтрофилы
23,75+9,85
29,21+13,90
28,67+10,50
0,320
0,330
0,776
Показатель
(мокрота)
Слизистогнойная
Гнойная
* - достоверное (р<0,05) различие между показателями исследуемых групп.
Показатели объема форсированного выдоха за 1 сек (ОФВ1) были
значительно ниже у пациентов с вирусной инфекций, по сравнению с
бактериальной и микст-инфекцией (р=0,039, р=0,038 соответственно).
3.2. Результаты вирусологического и бактериологического обследования.
При микробиологическом исследовании мокроты у наблюдаемых нами
больных идентифицированы в достоверных концентрациях штаммы Streptococcus
pneumoniae (10/32.2%), Haemophilus influenzae (4/12.9%), Klebsiella pneumoniae
(1/3.2%). Методом ПЦР в мокроте обнаружены Streptococcus pneumoniaе - у
17/54.8%, Haemophilus influenzae - у 8(25.8%), Klebsiella pneumoniae - у 4/12.9%
больных. Кроме того, с помощью ПЦР в мокроте верифицированы вирусы, такие
как аденовирус (2/6,4%), РСВ (5/16,1%), РВ (10/32,2%). В сыворотке крови с
помощью ПЦР также определены вирусы Герпес I (2/6,4%), Герпес II (1/3,2%), как
представлено на рис. 1, 2.
Рисунок 1.
Частота обнаружения бактерий у больных с обострением БА по данным ПЦР
диагностики и микробиологического посева мокроты.
ПЦР диагностика
Бак. посев
Streptococcus pneumoneae 17 (54,8%)
Haemophilus inf. 8 (25,8%)
Klebsiella pneumoniae 4 (12,9%)
Не обнаружено 2 (6,4%)
Streptococcus pneumoniae 10 (32,2%)
Haemophilus inf. 4 (12,9%)
Klebsiella pneumoniae 1 (3,2%)
Не обнаружено 16 (51,6%)
Рисунок 2.
Частота обнаружения вирусов у больных с обострением БА по данным ПЦР и
серологии.
32,2%
35,0%
30,0%
25,0%
20,0%
Аденовирус
16,1%
РСВ
РВ
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
6,4%
9,6%
Герпес I, II
ПЦР - исследование образцов мокроты и крови у больных с БА показало, что
в возникновении обострения болезни принимают участие как монокультуры
(38,7%), так и ассоциации различных микроорганизмов (61,3%). При изучении
видового
состава
бактериальные
ассоциаций
комбинации
микроорганизмов
вирусно-бактериальные
встречались одинаково
часто
(8/25,8%),
и
реже
определялись вирусные ассоциации (3/9,7%).
При серологическом исследовании в крови выявлены антитела IgM к
Mycoplasma pneumoniae у 3(9,7%), а антитела IgG к Chlamydophila pneumoniae
были обнаружены у (23/74,1%) и к Mycoplasma pneumoniae у 13(41,9%) больных.
Таким образом, у больных с атопической БА при респираторной инфекции
комплексная оценка респираторных возбудителей показала, что обострения
ассоциированы в 29,0% с вирусной, в 45,2% с бактериальной и в 25,8% случаях с
вирусно-бактериальной инфекцией.
3.3. Характеристика сывороточных биомаркеров пациентов с обострением БА
в зависимости от возбудителя
Как видно из таблицы 7, уровни СРБ достоверно выше у больных 2 группы с
бактериальной флорой, по сравнению с вирусной инфекцией (1,37(0,85-2,54) мг/л
против 0,28(0,18-1,01) мг/л, р=0,044). Продукция ИФН-γ была снижена у пациентов
с вирусной инфекцией в большей степени по сравнению с группой пациентов с
бактериальной инфекцией (32,25(20,98-109,09) пг/мл против 19,10(18,60-36,80)
пг/мл, р=0,043 соответственно).
Таблица 7.
Лабораторные показатели у больных бронхиальной астмой в зависимости от
этиологического фактора.
(р)
Median (25-75 percentile)
Показатель
СРБ, мг/л
ИФН-γ, пг/мл
1 группа
(вир+бак.)
n=8
2 группа
(бак.)
n=14
1,60
1,37
(0,64-3,13) (0,85-2,54)
23,10
32,25
(19,7-31,0) (20,9-109,0)
3 группа
(вир.)
n=9
0,28
(0,18-1,01)
19,10
(18,6-36,8)
1-2
группы
1-3
группы
2-3
группы
0,918
0,177
0,044*
0,194
0,700
0,043*
*- достоверное (р<0,05) различие между показателями исследуемых групп.
Частота определения цитокинов ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-1β в
зависимости от этиологического фактора была различна в группах, но без
достоверной разницы. Сравнение сывороточных уровней данных цитокинов в
исследуемых группах больных не выявило статистически значимой разницы.
3.4. Взаимосвязь уровней цитокинов в сыворотке крови и клиникофункциональных показателей у пациентов с обострением БА
При изучении взаимосвязей ИЛ-8 с функциональными показателями
выявлена достоверная обратная корреляционная взаимосвязь между ИЛ-8 и
ОФВ1% (r= -0,95), ИЛ-1β (r=-0,71), а также обнаружена прямая взаимосвязь между
ОФВ1 и ИФН-γ (r=0,74), что свидетельствует о роли разных цитокинов в развитии
обструктивных нарушений, как показано на рис.3.
Рисунок 3.
Корреляционные взаимосвязи ОФВ1 и системных биомаркеров в сыворотке
пациентов с бактериальными возбудителями
ИЛ-8
r=-0,71 p<0,04
ИЛ-1β
ОФВ1
r =-0,95 p<0,001
ИФН-γ
r=0,74 p<0,03
3.4.1. Корреляционные взаимосвязи системных биомаркеров в сыворотке
пациентов с бактериальными возбудителями
При изучении взаимосвязи СРБ с ИЛ-8 выявлена достоверная прямая
корреляционная взаимосвязь (r=0,71) в группе с бактериальным возбудителем, а
также обнаружена прямая корреляционная взаимосвязь умеренной силы между
ИЛ-5 и СРБ (r=0,42), ИЛ-6 и СРБ (r=0,95), что свидетельствует о роли разных
цитокинов в развитии и поддержании воспаления, как представлено на рисунке 4.
Рисунок 4.
Корреляционные взаимосвязи СРБ и цитокинов в сыворотке крови пациентов с
обострением БА
CРБ
ИЛ-6
r=0,95 p<0,009
ИЛ-8
CРБ
ИЛ-5
r=0,42 p<0,04
r=0,71 p<0,04
3.5. Показатели гуморального иммунитета у пациентов с обострением БА в
зависимости от возбудителя
Значения показателей IgG, по каждому показателю отдельно для всех трех
групп
достоверно не отличаются между группами (р>0,05). Для показателей
маркеров активации гуморального звена иммунитета: IgA и IgM их значения в
третьей группе достоверно меньше, чем значения аналогичных показателей во
второй группе. Кроме того, медиана значений IgM в третьей группе достоверно
меньше медианы в первой группы, как видно из табл.8.
Таблица 8.
Показатели гуморального иммунитета у пациентов с обострением БА в
зависимости от возбудителя
Показатель
Общий Ig G
Общий Ig A
Общий Ig M
Median (25-75 percentile)
1 группа
2группа
3 группа
(вир+бак)
(бак.)
(вир.)
n=8
n=14
n=9
10,9
9,5
10,0
(9,1-12,7) (9,04-12,4) (9,86-10,60)
2,09
2,31
1,4
(1,9-2,6)
(1,7-2,7)
(1,2-2,1)
1,56
1,44
1,03
(1,18-2,1)
(1,18-1,8)
(0,91-1,18)
(p)
1-2
группы
1-3
группы
2-3
группы
0,707
0,665
0,614
0,585
0,149
0,035*
0,539
0,021*
0,044*
* - достоверное (р < 0,05) различие между показателями исследуемых групп.
3.5.1. Показатели клеточного иммунитета у пациентов с обострением БА в
зависимости от возбудителя
Значения показателей CD3, CD4, CD8, CD95, HLA-DR, CD4/CD8 по
каждому показателю отдельно для всех трех групп достоверно не отличаются
между группами (р>0,05). Для В-лимфоцитов, показателей маркеров активации
CD25, CD50 значения медиан этих показателей в третьей группе достоверно
больше значения медиан этих показателей во второй группе при нормальных
значениях иммунорегуляторного индекса, что говорит в пользу наличия различных
особенностей воспаления в зависимости от этиологии возбудителя, как видно из
табл.9.
Таблица 9.
Показатели клеточного иммунитета у пациентов с обострением БА в
зависимости от возбудителя.
Показатель,%
CD3
CD4
CD8
CD4 /CD8
CD16
CD20
CD25
CD50
CD95
HLA-DR
Median (25-75 percentile)
1 группа
2 группа
3 группа
(вир+бак.)
(бак.)
(вир.)
n=8
n=14
n=9
48,0
45,5
47,0
(43,5-50,2)
(42,2-49,5)
(45,0-50,0)
30,0
30,0
30,0
(27,2-30,2)
(28,2-31,0)
(29,0-34,0)
16,0
16,0
16,0
(14,7-18,5)
(15,0-17,7)
(16,0-17,0)
1,75
1,80
1,80
(1,65- 1,93) (1,70- 1,90) (1,70- 1,90)
18,0
16,0
19,0
(14,7-20,2)
(15,0-17,7)
(17,0-23,0)
11,50
8,50
12,0
(7,5-16,7)
(7,2-9,7)
(10,0-17,0)
9,50
7,50
11,0
(6,50-10,50)
(7,0-10,0)
(9,0-12,0)
78,5
78,0
84,0
(70,0-80,2)
(69,0-83,2)
(81,0-86,0)
20,5
19,5
20,0
(18,5-24,0)
(16,2-20,7)
(17,0-22,0)
24,0
21,0
24,0
(18,2-28,5)
(19,0-24,7)
(19,0-30,0)
(р)
1-2
группы
1-3
группы
2-3
группы
0,784
0,847
0,377
0,626
0,497
0,612
0,755
0,626
0,424
0,875
0,806
0,991
0,372
0,595
0,049*
0,140
0,629
0,006*
0,653
0,245
0,049*
0,811
0,030*
0,037*
0,271
0,923
0,358
0,584
0,961
0,376
*- достоверное (р < 0,05) различие между показателями исследуемых групп.
3.5.2. Показатели фагоцитоза у пациентов с обострением БА в
зависимости от возбудителя
Значения показателей ФР для всех трех групп достоверно не отличаются
между группами (р>0,05). Для показателей ФЧ, ФАН значения медиан этих
показателей в третьей группе достоверно больше значения медиан этих
показателей во второй группе, как видно из табл.10.
Таблица 10.
Показатели фагоцитоза у пациентов в группах
Показатель
ФАН
ФЧ
ФР
Median (25-75 percentile)
1 группа
2 группа
3 группа
(вир+бак.)
(бак.)
(вир.)
n=8
n=14
n=9
69,0
64,5
78,0
(43,5-80,0) (52,5-67,5)
(69,0-86,0)
11,40
12,05
23,5
(6,0-24,3)
(8,9-17,8)
(19,1-32,3)
79,0
69,0
82,0
(58,5-83,0) (58,2-76,7)
(74,0-93,0)
(р)
1-2
группы
1-3
группы
2-3
группы
0,390
0,228
0,021*
0,837
0,101
0,011*
0,192
0,469
0,054
*- достоверное (р < 0,05) различие между показателями исследуемых групп.
3.6. Корреляционные взаимосвязи цитокинов и системных биомаркеров в
сыворотке пациентов с бактериальными и вирусными возбудителями
В группе больных с вирусными возбудителями уровень ИФН-γ достоверно
снижен в отличии от других групп, при этом он обратно коррелирует с CD25 (r=0,57) CD20 (r=-0,51), что указывает на наличие различных особенностей
воспаления в зависимости от этиологического возбудителя. Также выявлена
умеренной силы обратная взаимосвязь между ИЛ-8 и CD25 (r=-0,56), CD20 (r=0,52) в группе с бактериальными возбудителями, что подтверждает роль ИЛ-8 в
деструктивных процессах и поддержании воспаления при БА. Рис.5.
Рисунок 5.
Корреляционные взаимосвязи показателей клеточного иммунитета и
концентрации цитокинов в сыворотке крови пациентов с обострением БА в
зависимости от возбудителя
Группа пациентов с
вирусным
возбудителем
CD20
ИФН-γ
Группа пациентов с
бактериальным
возбудителем
r=-0,51 p<0,03
CD25
r=-0,57 p<0,04
Таким
образом,
иммунологические
можно
особенности
выделить
с
CD25
r=-0,56 p<0,04
ИЛ-8
CD20
r=-0,52 p<0,03
клинико-функциональные
определением
фенотипов
пациентов
и
с
обострением атопической бронхиальной астмы при респираторной инфекции в
зависимости от возбудителя. Вирусный фенотип у пациентов с обострением
атопической БА при частых респираторных инфекциях характеризовался старшим
возрастом, длительным анамнезом по БА, повышенной температурой тела,
наличием симптомов ринита и трахеита, низкими значениями ОФВ1 и ИФН-γ,
наличием повышенного числа эозинофилов в индуцированной мокроте, а также
повышенными маркерами активации клеточного звена иммунитета. Бактериальный
фенотип у пациентов с обострением атопической БА четкой клинической картины
не имел, но отличался по сывороточным биомаркером - более высокими
показателями по СРБ и выше значениями ИФН-γ, а также повышенными
маркерами активации гуморального звена иммунитета. Вирусно-бактериальный
фенотип обострения атопической БА четкой характеристики не имел. Таблица.11.
Таблица 11.
Фенотипы обострения пациентов бронхиальной астмы
Показатели
Возраст
Вируснобактериальная
группа
+
Бактериальная
группа
Вирусная группа
++
+++
Длительность БА
+
+
+++
Ринит
++
+
+++
Фарингит
+
+
+
Трахеит
++
+
+++
Повышение t о тела
+
+
+++
Снижение ОФВ1
+
+
+++
+
+
+++
+
+
+
ИЛ-5,6,8,10,1β
+
+
+
СРБ
+
+++
+
ИФН-γ
++
+++
+
+
+
+++
ФАН, ФЧ
+
+
+++
Общий IgA
+
+++
+
Общий IgM
+
+++
+
Общий IgG
+
++
++
Эозинофилы
нейтрофилы
CD20,
CD25,CD50
Выводы
1. У больных с обострением атопической БА при респираторной инфекции
комплексная оценка возбудителей выявила, что обострения ассоциированы в
29,0% с вирусной, в 45,2% с бактериальной и в 25,8% случаях с вируснобактериальной инфекцией.
2. Обострения атопической БА у пациентов при вирусной инфекции
характеризуются наличием симптомов ринита, трахеита, длительным
анамнезом по БА, повышенной температурой тела, низкими значениями
ОФВ1, повышенным содержанием эозинофилов в мокроте при сниженной
продукции ИФН-γ в сыворотке крови по сравнению с другими группами.
3. При бактериальном обострении не обнаружено характерных клинических
особенностей, однако уровень СРБ был достоверно выше, чем у пациентов с
вирусным обострением астмы. Выявлены достоверные корреляционные
взаимосвязи между ОФВ1 и ИЛ-8 (r=-0,95), ИЛ-1β (r=-0,71), что
свидетельствует об активности воспаления и связанной с ним тяжести
обструкции дыхательных путей.
4. Сравнение сывороточных уровней цитокинов в исследуемых группах
больных не выявило статистически значимой разницы.
5. У пациентов с обострением атопической БА при вирусной инфекции
отмечалось повышение В-лифоцитов и CD25, СD50 и ФАН, что
свидетельствует об активации клеточного звена иммунитета, а при
бактериальной инфекции отмечалось повышение общего IgA и IgM, что
свидетельствует об активации
иммунитета.
преимущественно гуморального звена
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. У больных с частыми обострениями атопической БА целесообразно проводить
комплексное обследование для верификации вирусных и бактериальных
возбудителей
2. При
бактериальной
высокочувствительного
инфекции
маркера
целесообразно
бактериального
определение
воспаления,
СРБ,
а
как
также
исследование гуморального звена иммунитета (общий IgA и IgM), а при
вирусной инфекции целесообразно определение В-лимоцитов, маркеров
активации клеточного звена иммунитета и фагоцитоза (CD25, СD50 и ФАН),
исследование клеточного состава индуцированной мокроты, а также продукции
ИФН-γ в сыворотке крови, с целью дифференцированного подхода к терапии
обострений БА у этих пациентов.
Список опубликованных работ по теме диссертации
1. Хаптхаева Г.Э., Пустовалов А.А., Чучалин А.Г., Зыков К.А. Роль
респираторных инфекции в обострении Бронхиальной астмы.// материалы
конференции, 18-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания.Екатеринбург.- Сборник трудов резюме.- 2008: (с.19).
2. Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г. Респираторная инфекция и бронхиальная
астма. // Пульмонология 2008; №5: 75-79.
3. Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г., Зыков К.А., Пустовалов А.А. Биомаркеры
воспаления при инфекционном обострении бронхиальной астмы. //
материалы конференции, 19-й Национальный конгресс по болезням органов
дыхания.- Москва.- Сборник трудов резюме.- 2009: (с.28).
4. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г. // материалы
конференции, «Актуальные вопросы респираторной медицины», Москва, 4-5
марта 2009г., с.50.
5. Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г., Зыков К.А., Колганова Н.А. Роль
сывороточных биомаркеров при обострении атопической бронхиальной
астмы на фоне респираторной инфекции. // Пульмонология 2010; №3: 46-52.
6. Khaptkhaeva G, Zykov K, Chuchalin А. et al. Role of respiratory infection in the
control and severity of asthma. // Eur Respir J 2008; Р2228; 388s.
Список сокращений:
БА - бронхиальная астма
ВБА - вирусно-бактериальные ассоциации
ИЛ-5 – интерлейкин 5
ИЛ-6 – интерлейкин 6
ИЛ-8 – интерлейкин 8
ИЛ-10 – интерлейкин 10
ИЛ- 1β – интерлейкин 1бетта
ИФН- - интерферон гамма
ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция
ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1секунду
РСВ - респираторно-синцитиальный вирус
РВ - риновирус
NOex - оксид азота выдыхаемого воздуха
Ig Е – иммуноглобулин класса Е
Ig А – общий иммуноглобулин А
Ig М – общий иммуноглобулин М
Ig G – общий иммуноглобулин G
CРБ - С- реактивный протеин
CD
-
моноклональное
антитело,
распознающее
поверхностный
лейкоцитарный антиген соответствующего кластера (Claster Differention)
CD16+ - натуральные киллеры
CD19+ - В-лимфоциты
CD3+ - Т-лимфоциты
CD4+ - Т-лимфоциты-хелперы
CD50+ - натуральные киллеры
CD8+ - Т-лимфоциты-цитотоксические
NK - клетки - натуральные (естественные) киллеры
Тh1 - Т- лимфоциты хелперы 1-го типа
Тh2 - Т - лимфоциты хелперы 2-го типа
ФАН - Фагоцитарная активность нейтрофилов
ФЧ - Фагоцитарное число нейтрофилов
ФР - Фагоцитарный резерв
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ИФА - иммуноферментный анализ
ФВД – функция внешнего дыхания
ФЖЕЛ – форсированная жизненная ёмкость легких
Подписано в печать 5 июля 2010года
Заказ 505. Тираж 100 экземпляров.
Отпечатано в типографии ООО КПМ “Фирма Лика “
105264, Москва, Нижняя Первомайская, 47 тел. (495)465-1154