На правах рукописи ДЮЖЕВА ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА ГОРМОНАЛЬНАЯ ПОДГОТОВКА ЭНДОМЕТРИЯ У ПАЦИЕНТОК С
advertisement
На правах рукописи ДЮЖЕВА ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА ГОРМОНАЛЬНАЯ ПОДГОТОВКА ЭНДОМЕТРИЯ У ПАЦИЕНТОК С НЕЭФФЕКТИВНЫМИ ПОПЫТКАМИ ЭКО В АНАМНЕЗЕ 14.01.01 – акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2010 2 Работа выполнена в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия и лаборатории патоморфологии Федерального Государственного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова Росмедтехнологий». Научные руководители: доктор медицинских наук Елена Анатольевна Калинина доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Евгения Алтаровна Коган Татьяна Алексеевна Назаренко (ФГУ «НЦ АГиП им.В.И. Кулакова) профессор, доктор медицинских наук Мишнев Олеко Дмитриевич (РГМУ) Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский Университет дружбы народов Защита диссертации состоится «27» апреля 2010 г. в 13 ч. на заседании диссертационного совета Д.208.125.01 при ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» по адресу: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова». Автореферат разослан «____» __________2010г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Елена Анатольевна Калинина 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Одним из наиболее современных и перспективных методов лечения бесплодия является экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов (ЭКО и ПЭ). Улучшение результативности ЭКО во многом связано не только с особенностями фолликулярного аппарата яичников, качеством эмбриона, но и с маточными структурами, в частности - с функциональным состоянием эндометрия, его зрелостью и готовностью к имплантации. Пациентки с многократными неудачными программами вспомогательных репродуктивных технологий составляют около 30% от всех пациентов, которые лечатся с использованием этих методов (И.А. Судома, Ю.В. Маслий, 2007). Неадекватная рецептивность эндометрия ответственна приблизительно за две трети неудач имплантации, тогда как эмбрион - только за одну треть (N. LedeeBataille, 2002). Так как большинство исследований отрицают роль гистологического датирования эндометрия (определения соответствия морфологической структуры оболочки матки дню менструального цикла) в клинике бесплодия (C. Coutifaris, 2004; E.R. Myers, 2004), в настоящее время развиваются альтернативные методы оценки функции эндометрия, а также ведется активный поиск биологических маркеров «окна имплантации», способных прогнозировать наступление беременности в программах ВРТ. Многочисленные исследования посвящены изучению потенциальных маркеров восприимчивости эндометрия как предикторов наступления беременности и, при этом, в основном помогли определить клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых происходят этапы имплантации (H. Achache, 2006; K. Diedrich, 2007). Однако использование даже наиболее изученных в настоящее время биомаркеров имплантации в клинической практике крайне ограничено (B. Urman, 2005). Одними из наиболее изученных биомаркеров «окна имплантации» являются пиноподии – структуры, появляющиеся в апикальной части 4 поверхностного эпителия эндометрия в период максимальной рецептивности (C.E. Quin, 2009). Большинство идентифицированных маркеров имплантации (пиноподии, интегрин αvβ3, LIF, Е-катгерин, HOX гены и др.) регулируются путем прямого или опосредованного влияния эстрадиола и прогестерона (P.H. Kodaman, 2004; H. Achache, 2006). Однако важен не только уровень половых стероидов в организме, но и сохранение всех путей реализации гормонального эффекта, в чем решающую роль играет количество функционально полноценных рецепторов ткани эндометрия к соответствующим стероидным гормонам (А.В. Светлаков, 2002). В течение нормального менструального цикла содержание в эндометрии рецепторов к эстрогенам и прогестерону претерпевает закономерные колебания, синхронные с изменением концентрации эстрадиола и прогестерона в общем и маточном кровотоке (O.H. Лысенко, 2004; A.H. Taylor, 2005). Некоторые авторы (С.В. Никитин, 2006; A.П. Лазарев, 2007) полагают, что у пациенток, страдающих трубно-перитонеальным бесплодием, существует гормональная недостаточность яичников, связанная с низкими количеством и/или чувствительностью рецепторов эстрогенов и прогестерона в эндометрии, и указанные изменения рецептивности эндометрия у женщин с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе могут явиться причиной неудач последующих циклов ВРТ. Другие авторы приводят диаметрально противоположные данные (В.С. Бессмертная, 2008), говоря о повышение экспрессии стероидных рецепторов у пациенток с бесплодием. В настоящее время в научной литературе продолжается дальнейшая дискуссия и изучение рецепторного аппарата эндометрия у пациенток с повторными неудачами имплантации в программах ВРТ. Также нет единого мнения о схемах гормональной подготовки к программе ЭКО и ПЭ, длительности их применения и влиянии различной гормональной терапии на функциональное состояние эндометрия и готовности его к имплантации. Не разработаны прогностические критерии наступления беременности у пациенток с неудачными попытками в рамках циклов ВРТ. 5 Результаты различных исследований достаточно противоречивы, поэтому представляется актуальным определение целесообразности и эффективности применения гормональной терапии для подготовки к программе ЭКО у пациенток с ранее неэффективными попытками на основании морфофункционального состояния эндометрия. Цель исследования: повышение результативности лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ путем оптимизации тактики предварительной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками в анамнезе. Задачи исследования 1. Изучить параметры клинико-гормонального статуса, фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе. 2. Провести анализ морфологической структуры, особенностей поверхностного эпителия и состояния рецепторного аппарата эндометрия у пациенток с отрицательным результатом ЭКО по сравнению с теми, у которых впоследствии наступила беременность. 3. Выявить факторы, определяющие неудачи имплантации и разработать прогностические критерии наступления беременности на основании морфологического и иммуногистохимического исследования эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО и ПЭ. 4. Определить группы пациенток, которым целесообразно применение гормональной подготовки эндометрия. 5. Оценить динамику морфологических структурных особенностей эндометрия в циклической гормональной терапии провести и ответ изменений на и применение анализ частоты наступления беременности. 6. Разработать алгоритм предварительной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе на основании морфологических и иммуногистохимических особенностей эндометрия. 6 Научная новизна В результате проведенных исследований получены новые данные о состоянии рецепторного аппарата эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе, проведена детальная оценка состояния поверхностного эпителия эндометрия. На основании комплексной оценки морфологического и иммуногистохимического анализа эндометрия выявлены и углубленно изучены варианты нарушений экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов у пациенток с повторными неудачами имплантации в программах ВРТ: снижение уровня ПР и ЭРα в сочетании с соотношением ПР/ЭРα≥2 или ПР/ЭРα<2, гиперэкспрессия ЭРα в секреторную фазу МЦ в сочетании с соотношением ПР=ЭРα или ПР/ЭРα<2. Впервые проведена оценка количества поверхностных клеток эпителия с наличием пиноподий при гистологическом исследовании эндометрия, показана и научно подтверждена их прогностическая значимость для наступления беременности в программе ЭКО. Патогенетически применения обоснована циклической целесообразность гормональной терапии и с эффективность использованием трансдермальных эстрогенов и микронизированного прогестерона в качестве подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО при сниженной экспрессии прогестероновых и α-эстрогеновых рецепторов, не соответствующей морфологическим характеристикам эндометрия. Практическая значимость В результате проведенной работы определены наиболее важные прогностические критерии наступления беременности в рамках программ ВРТ у пациенток с ранее неэффективными попытками. Без применения электронной микроскопии в гистологических препаратах проведена количественная оценка клеток поверхностного эпителия, имеющих пиноподии. Трехкратное снижение процентного содержания пиноподий, отмеченное в образцах эндометрия у пациенток с повторными безуспешными 7 попытками ЭКО, подтверждает их роль в прогнозировании наступления беременности. Продемонстрирована возможность определения пиноподий при световой микроскопии, что позволяет рекомендовать их изучение в гистологических препаратах при подготовке к беременности у женщин с бесплодием. Обосновано включение в схему предварительного обследования пациенток с повторными неудачами имплантации иммуногистохимического исследования эндометрия, позволяющего выявить нарушения экспрессии стероидных рецепторов эндометрия, что позволяет дифференцированно подходить к назначению соответствующего гормонального лечения с целью повышения эффективности экстракорпорального оплодотворения. Разработан алгоритм предварительной гормональной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе. Положения, выносимые на защиту 1. При сходных параметрах фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза у пациенток с неэффективными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе выявляются нарушения экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов в эндометрии (снижение уровня ПР и ЭРα в сочетании с соотношением ПР/ЭРα≥2 или ПР/ЭРα<2, гиперэкспрессия ЭРα в секреторную фазу МЦ в сочетании с соотношением ПР=ЭРα или ПР/ЭРα<2) 2. Наиболее неблагоприятным прогностическим признаком для наступления беременности у пациенток в программе ЭКО при неудачах имплантации является гиперэкспрессия эстрогеновых рецепторов α в период предполагаемого «окна имплантации», а наиболее благоприятным - сочетание равномерных секреторных преобразований эндометрия с количеством пиноподий ≥50% и соотношением ПР/ЭРα≥2. 3. Комплексное морфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ВРТ в анамнезе позволяет дифференцированно подходить к целесообразному и эффективному 8 назначению циклической гормональной терапии для подготовки к ЭКО, что позволяет повысить результативность данной программы. Апробация материалов диссертации Основные положения диссертации и результаты работы доложены на X Юбилейном всероссийском форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2009) и 3rd Asia Pacific Congress on Controversies in Obstetrics Gynecology and Infertility (Пекин, 2009). Работа обсуждена на межклинической конференции сотрудников отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» 03.12.2009 и заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» 21.12.2009. Внедрение результатов исследования в практику Комплексное обследование эндометрия, включающее морфологический и иммуногистохимический методы исследования у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе и применение гормональной подготовки эндометрия внедрено в практику работы отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 135 страницах компьютерного текста, состоит из введения и 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение), а также выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 15 рисунками. Использованная литература включает 31 источник на русском и 142 источника на английском языках. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы В соответствии с поставленной целью и задачами исследования в ходе выполнения работы обследованы 108 пациенток репродуктивного возраста с 9 трубно - перитонеальным фактором бесплодия и 2-мя и более неэффективными попытками ЭКО в анамнезе, обратившихся по поводу бесплодия в отделение вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ «НЦ АГ и П им. академика В.И. Кулакова» Росмедтехнологий (руководитель - профессор Кузьмичёв Л.Н.). В дальнейшем 11 пациенток были исключены из исследования, так как по результатам гистологии у них была выявлена патология эндометрия (хронический эндометрит или гиперплазия эндометрия). Предварительное обследование супружеской пары проводилось с использованием общеклинических и специальных методов исследования. На первом этапе работы аспирационная пайпель-биопсия эндометрия выполнена у 62 пациенток в цикле, предшествующем стимуляции суперовуляции, на 7-8 день после овуляции, которую устанавливали при динамическом ультразвуковом контроле в течение изучаемого цикла и определении пика ЛГ с помощью мочевого теста. Далее сформированы 2 группы сравнения в зависимости от эффективности реализации в дальнейшем программы ЭКО: I группа (n=15) - пациентки, у которых наступила беременность, II группа (n=47) - пациентки с отрицательным результатом. На втором этапе работы, в соответствии с результатами гистологического и иммуногистохимическго (ИГХ) исследования эндометрия была сформирована III группа (n=35), которую составили больные, получившие гормональную терапию в качестве подготовки к следующей программе ЭКО и ПЭ. У пациенток III группы также проводилась контрольная биопсия на фоне приема гормональных препаратов на 21-24 день МЦ (рис. 1). Группой контроля явились 15 фертильных женщин без гинекологической патологии, у которых исследовали структуру эндометрия. 10 Всего в исследование включено 108 пациенток I этап работы II этап работы Гистологическое исследование биоптатов эндометрия 73 пациенток перед ЭКО 11 пациенток 15 пациенток исключены (хронический эндометрит, гиперплазия эндометрия) беременные после ЭКО (I группа) ИГХ исследование эндометрия (ПР и ЭРα) 47 пациенток небеременные после ЭКО (II группа) ИГХ исследование эндометрия (ПР и ЭРα) 35 пациенток с предварительной гормональной подготовкой перед ЭКО (III группа) Рисунок 1. Схема выполнения исследования и разделения пациенток на группы Стимуляция суперовуляции у всех пациенток проводилась по короткому протоколу со 2-3 дня МЦ с использованием препаратов рФСГ и антагонистов ГнРГ. Циклическая гормональная подготовка проводилась с использованием трансдермального эстрадиола и микронизированного прогестерона. Гистологическое и ИГХ исследование эндометрия проводили в лаборатории патоморфологии ФГУ «НЦ АГ и П им. академика В.И.Кулакова» Росмедтехнологий (руководитель проф. Е. А. Коган). Материалы биоптатов фиксировали в 10%-м нейтральном формалине, заключали в парафин, делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. При исследовании гистологических препаратов также проводилась оценка % клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при увеличении х400. 11 Для ИГХ реакций парафиновые срезы обрабатывали по стандартной методике, использовали мышиные моноклональные антитела к эстрогеновым рецепторам α (клон 1D5 «DAKO») и прогестероновым рецепторам (клон 636 «DAKO»). Для анализа результатов ИГХ реакций использовали метод гистологического счета H-score по формуле: HS = 1a+2b+3c, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали: 0-10 баллов – отсутствие экспрессии, 11-100 баллов – слабая экспрессия, 101-200 баллов – умеренная экспрессия, 201-300 баллов – выраженная экспрессия. Статистическая обработка данных выполнена с помощью пакета прикладных программ «Statistica for Windows» v. 7.0, StatSoft Inc.. Сравнение между группами проводили непараметрическими методами с использованием критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считались отличия при P<0,05 (95%-й уровень значимости) и при P<0,01 (99%-й уровень значимости). Для исследования влияния одной или нескольких независимых переменных на одну зависимую переменную использовался одномерный дискриминантный анализ - метод бинарной логистической регрессии. Относительный шанс (ОШ) наступления беременности вычисляли по методу Woolf. Результаты исследования и их обсуждение Возраст обследованных пациенток не различался между исследуемыми группами и колебался от 22 до 35 лет, составляя в среднем 32,2 ± 0,3 года. Средняя продолжительность бесплодия колебалась от 2 до 14 лет и составила в среднем 6,3 ± 0,4 лет. Среднее количество неудачных циклов ЭКО не различалось между исследуемыми группами и составило 2,7±0,3 в I группе, 2,7±0,2 - во II группе, 2,6±0,2 - в III группе. Более половины женщин (65%) имели 2 попытки ЭКО в анамнезе, каждая третья пациентка (35%) - 3 и более неудачных циклов лечения. Существенных и достоверных различий между группами не выявлено. 12 Изучая параметры стимуляции суперовуляции у обследованных пациенток, не выявлено статистически значимых различий между группами пациенток в отношении течения стимуяции суперовуляции, параметров фолликулогенеза, оогенезе и раннего эмбриогенеза (табл. 1). Таблица 1 Характеристика параметров стимуляции суперовуляции, фолликулогенеза, оогенеза и эмбриогенеза у пациенток исследуемых групп Параметры I группа II группа III группа Стартовая доза рФСГ, МЕ 189,3±14,8 201,6±11,1 Длительность стимуляции, 10,7±1,6 10,6±0,2 дни Общая доза рФСГ, МЕ 1942,9±133,2 1922,4±78 Среднее количество фолликулов диаметром ≥ 18 12±0,8 11,6±0,7 мм Среднее количество 8,9±1,3 полученных ооцитов 8,3±0,6 Количество зрелых ооцитов 7,2±0,9 6,4±0,5 Доля зрелых ооцитов, % 80,9 77,1 Количество оплодотворенных 6,8±0,9 5,7±0,6 ооцитов Общее количество эмбрионов 4,4 ±0,6 3,8±0,4 Количество перенесенных 1,9±0,1 1,8±0,2 эмбрионов р > 0,05 статистически значимых различий не выявлено 181,7±9,6 9,3±0,2 1830,8±54,1 11,7±0,7 7,9±0,6 6,6±0,7 83,5 6,1±0,7 4,1±0,4 1,9±0,1 В связи с этим, представлялось наиболее важным уделить особое внимание структуре эндометрия у данных пациенток. В контрольной группе во всех биоптатах наблюдался эндометрий фазы секреции. Среднее значение уровня ПР составил в клетках поверхностного эпителия и желез 132,5±9,5, в строме - 208,8±11,6 баллов. Показатели ЭРα в среднем составили в клетках поверхностного эпителия и желез 63,2±6,7, в строме – 89,8±4,1 баллов. Во всех биоптатах в группе контроля соотношение ПР/РЭα было более 2 (среднее значение в поверхностном эпителии – 2,1±0,3, в железах - 2,1±0,3, в строме – 2,3±0,2). У 93,3% пациенток, беременных после ЭКО (I группа) морфологическая картина эндометрия соответствовала фазе секреции. Как известно, основным 13 методом исследования пиноподий является сканирующая электронная микроскопия. Однако, размер пиноподий у человека составляет в среднем 6 μm (C.E. Quinn, 2009), в связи с чем в данном исследовании показалось возможным оценить процент поверхностных клеток эпителия с наличием апикального выпячивания (предположительно пиноподии) при рутинном гистологическом исследовании с использованием световой микроскопии (рис. 2). Рисунок 2. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400, 80% клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий В I группе у всех пациенток количество клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий было ≥50% (среднее значение составило 66,7±2,95). Во всех исследованных образцах отмечалось ядерное ИГХ окрашивание ПР. В поверхностном эпителии и в железах уровень ПР составил в среднем 206,7±20,2 и 230±18,2 баллов соответственно, в строме - 242,3±11,8. Количество ЭРα в ядрах клеток поверхностного эпителия составило в среднем - 98,3±15,6, железах 102,1±15,2, строме 100,3±15,6 баллов. Интересен тот факт, что помимо ядерной ИГХ реакции на ЭРα, также наблюдалось апикальное цитоплазматическое окрашивание, которое локализовалось исключительно в клетках поверхностного эпителия, где были сформированы пиноподии (рис. 3). Возможно, данное наблюдение связано с наличием мембранных ЭРα в клетках эндометрия. Механизм действия и структурные особенности мембранных эстрогеновых рецепторов (мЭР) в настоящее время точно не определены, однако предполагают, что мЭР отвечают за быструю передачу эстроген-индуцированных сигналов в клетке (E.R. Levin, 2009). 14 а б в г а - Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400, 80% клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий. б - ИГХ к ПР. H-score поверхностный эпителий – 210, железы – 210, строма – 220 в - ИГХ к ЭРα. H-score: поверхностный эпителий – 100, железы – 100, строма – 60 г - ИГХ к ЭРα. Апикальное цитоплазматическое окрашивание в проекции пиноподий Рисунок 3. Нормальная экспрессия ЭРα в фазу секреции (ПР/ЭРα>2). Соотношение ПР/ЭРα у 86,7% пациенток с морфологической картиной секреторной фазы было более 2 (среднее значение: поверхностный эпителий – 2,6±0,3, железы – 2,8±0,3, строма – 3,2±0,2). Таким образом, в группе беременных после ЭКО, наблюдалась умеренная или выраженная экспрессия ПР и слабая или умеренная экспрессия ЭРα в поверхностном эпителии и строме, подобная результатам, полученным в группе контроля. Статистически значимое различие (р<0,05) в уровне ПР и ЭРα отмечалось только в клетках желез. Существенным представляется тот факт, что показатели стероидной рецепции в строме у пациенток, беременных после ЭКО, не отличались от группы контроля, поскольку современные представления предполагают, что именно строма играет решающую роль в успешной имплантации эмбриона и последующем развитии беременности (M.T. Mazur, 2005). 15 При гистологическом исследовании эндометрия у 29,8% пациенток II группы (небеременные после ЭКО) обнаружена поздняя стадия фазы пролиферации (IIА подгруппа), у 57,5% - фаза секреции (IIБ подгруппа), у 12,8% - неполноценная фаза секреции с асинхронным развитием желез в стадии поздней пролиферации и начала ранней секреции (IIВ подгруппа). Так как в течение менструального цикла происходят физиологические колебания экспрессии ПР и ЭРα, невозможно оценивать их показатели без учета морфологической характеристики эндометрия и детального изучения уровней ПР и ЭРα в зависимости от гистологического датирования эндометрия. Среди пациенток II группы, у которых обнаружена фаза пролиферации (IIА подгруппа) соотношение ПР/ЭРα<2, обнаружено у 50% пациенток, в остальных биопсиях наблюдалось соотношение ПР/ЭРα≥2. Во IIА подгруппе обнаружено статистически значимое уменьшение уровня ПР в строме эндометрия (р<0,05) и тенденция к более низкой экспрессии ПР в клетках поверхностного эпителия и желез, чем в группе контроля. Достоверных различий в количестве ЭРα не было выявлено (р>0,05). Однако, по данным литературы поздняя стадия фазы пролиферации в нормальном эндометрии характеризуется максимально высокой экспрессией и ПР и ЭРα во всех клетках эндометрия (О.Н. Лысенко, 2004). Таким образом, у данной подгруппы пациенток наблюдалось снижение стероидной рецепции эндометрия, вызванное недостаточной эстрогеновой стимуляцией рецепторного аппарата в I фазу менструального цикла, так как у них отмечен достоверно более низкий уровень Е2 на 3-5 день МЦ, чем в группе беременных после ЭКО пациенток (187,9±16,9 пмоль/л и 263,7±18,5 пмоль/л, соответственно; р<0,05). Среди пациенток IIБ подгруппы (с фазой секреции) только у 25% наблюдалось соотношение ПР/ЭРα≥2, у 75% пациенток IIБ подгруппы выявлено соотношение ПР/ЭРα<2. Во IIБ подгруппе наблюдалось достоверно значимое увеличение уровня экспрессии ПР в поверхностном эпителии и в железах (р<0,05), показатели ПР в строме не отличались от группы контроля. В то же время количество ЭРα в 16 клетках поверхностного эпителия и желез превышало норму более чем в 2 раза, в клетках стромы – в 1,4 раза (рис. 4). а б в а - окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400, 15% клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий б - ИГХ к ПР. H-score: поверхностный эпителий – 285, железы – 285, строма – 240 в - ИГХ к ЭРα. H-score: поверхностный эпителий – 270, железы – 270, строма – 170 Рисунок 4. Гиперэкспрессия ЭРα в фазу секреции (вариант дисбаланса ПР/ЭРα<2) Известно, что в эндометрии снижение ЭРα - критическое событие, освобождающее от подавляющего влияния определенные гены и обеспечивающее сигнал для начала внутриматочной рецептивности. Высоко специализированный и специфический средне-секреторный репертуар эндометриальной экспресси геннов совпадает с сокращением экспрессии ЭРα (Talbi S, 2006). Гиперэкспрессия ЭРα в лютеиновую фазу цикла вызывает нарушение экспрессии биологических маркеров имплантации, в том числе интегрина αvβ3 (Lessey, 2006; Donaghay, 2007). Отсутствие физиологического снижения ЭРα в средне-секреторную фазу МЦ может быть связано с неадекватными уровнями прогестерона в сыворотке крови, чрезмерной экспрессией ароматаз, коактиваторов стероидных рецепторов (Gregory CW, 2002), некоторых провоспалительных цитокинов (IL-6, EGF), а также, возможно, с нарушением экспрессии ЭРβ. Следует отметить, что данная подгруппа женщин (IIБ) единственная, где не выявлено ни одной статистически значимой корреляции между концентрацией эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови и показателями экспрессии ПР и ЭРα. Дисбаланс экспрессии стероидных рецепторов в 17 эндометрии на фоне нормального профиля сывороточных гормонов у таких пациенток может свидетельствовать о повреждении рецепторного аппарата на тканевом уровне или локальном нарушении функции паракринных и аутокринных факторов регулирующих экспрессию ЭРα. Возможно, наличие гиперэкспрессии ЭРα в середине лютеиновой фазы МЦ может быть лучшим биомаркером нарушения функции эндометрия у женщин с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе. В IIВ группе (неполноценная фаза секреции) выявлено статистически значимое снижение уровня ПР в клетках поверхностного эпителия и стромы (более чем в 2 раза), а также наблюдалась тенденция к повышению уровня ЭРα в поверхностном эпителии и железах (р>0,05) по сравнению с группой контроля. Среди пациенток II группы, только у 8,5% пациенток обнаружено ≥50% пиноподий, в остальных 95,5% биоптатах этот показатель колебался от 0 до 30%. Среднее количество пиноподий во II группе было более чем в 3,5 раза меньше, чем у пациенток I группы и составило 18,3±1,9%. В результате многофакторного анализа с использованием метода бинарной логистической регрессии была построена статистически значимая модель: y=0,167 - 0,17 * РП/РЭα поверхн. + 2,8 * РП/РЭα железы - 24,9 * РП/РЭα стромы (р<0,0005285), в которой показано, что на наступление беременности в программе ЭКО влияют показатели соотношения ПР/ЭРα в поверхностном эпителии, в железах и в строме эндометрия, однако, определяющим прогностическим фактором является соотношение ПР/РЭα в строме (коэффициент 24,9). На основании полученных результатов также произведен расчет относительного шанса (ОШ) наступления беременности после ЭКО у пациенток с неэффективными попытками в анамнезе при различных показателях соотношения ПР/ЭРα в эндометрии. При соотношении ПР/ЭРα<2, ОШ отрицательного результата составил 9,43 (95% доверительный интервал 3,3726,39). При соотношении ПР/ЭРα в диапазоне 2 – 3 (3>ПР/ЭРα≥2) ОШ наступления беременности составил 4,38 (95% доверительный интервал 2,31- 18 8,29). При увеличении соотношения ПР/ЭРα более 3, ОШ наступления беременности уменьшается и составляет только 1,22, причем нижняя граница 95% доверительного интервала менее 1 (95% доверительный интервал 0,374,02), что говорит о статистически незначимом факте. Таким образом, шанс наступления беременности после ЭКО у данных пациенток при соотношении ПР/ЭРα в диапазоне 2-3 выше в 4,4 раза по сравнению с теми, у которых данная величина не входит в указанный диапазон (т.е. при ПР/ЭРα<2 и ПР/ЭРα>3). Учитывая данные, полученные на первом этапе исследования, была сформирована III группа пациенток (n=35) с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе, у которых при ИГХ исследовании выявлено снижение уровня экспрессии ПР и ЭРα и которым целесообразно назначение препаратов эстрогена и прогестерона в качестве подготовки эндометрия перед следующей программой ЭКО. Так как у пациенток IIБ группы (с отсутствием снижения уровня ЭРα в фазу секреции) отсутствовали корреляционные связи между концентрациями стероидных гормонов и соответствующих рецепторов эндометрия, они не были включены в дальнейшее исследование. До лечения в III группе фаза пролиферации наблюдалась у 54,3% пациенток (IIIА группа), фаза секреции у 31,4% (IIIБ группа) и неполноценная фаза секреции у 14,3% (IIIВ группа). До лечения в III группе количество пиноподий колебалось от 5 до 30 % и только у 2,9% пациенток обнаружено количество пиноподий ≥50%, среднее значение составило 21,4±1,9%. В IIIА подгруппе женщин средние показатели экспрессии ПР составили в клетках поверхностного эпителия и желез 91,3±14,5, в строме – 81,3±10,3 баллов. Количество ЭРα составило в среднем 60,3±16 в поверхностном эпителии и железах, 49,5±10,9 в строме. До лечения в IIIБ группе пациенток, у которых по данным гистологического исследования выявлена фаза секреции, также наблюдался низкий уровень стероидной рецепции (<100 баллов) во всех клетках эндометрия. Уровень ПР составил в среднем в клетках поверхностного эпителия 50±11, в железах - 62,7±11,9, в строме - 100,9±10,6 баллов. Средние значения 19 уровня экспрессии ЭРα составили в поверхностном эпителии – 34,6±7,9, в железах – 34,6±6,8, в строме – 22,3±5,8 баллов. До лечения у пациенток с неполноценной фазой секреции (IIIВ подгруппа) наблюдалось неравномерная ИГХ реакция в клетках эндометрия и высокие колебания показателей ПР и ЭРα. Таким образом, III группа была сформирована из пациенток со сниженной стероидной рецепцией. По данным ИГХ исследования до лечения показатели ПР в клетках поверхностного эпителия и желез были в 1,5 раза, в строме в 2 раза ниже чем уровни экспрессии ПР в группе контроля. Для показателей ЭРα наблюдалось статистически значимое (р<0,05) различие только в клетках стромы. Пациенткам III группы в течение двух менструальных циклов перед программой ЭКО и ПЭ проводилась гормональная подготовка эндометрия препаратами трансдермального эстрадиола (с 5-го по 25-й день МЦ) и микронизированного прогестерона (с 16-го по 25-й день МЦ). После проведенной гормональной подготовки в III группе пациенток во всех полученных преобразования. биоптатах При этом наблюдались у 14,3% равномерные пациенток секреторные количество клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий колебалось от 5 до 30%. У 31,4% женщин количество пиноподий составило 50%, у 54,3% пациенток – от 60 до 100%, среднее значение - 58,9±3,7%. После проведенного гормонального лечения наблюдалось статистически значимое увеличение количества клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий (р<0,05), а показатели ПР в клетках поверхностного эпителия и желез и составили в среднем 179,9±9,3, в строме - 215,1±6,1 баллов. Количество ЭРα в среднем составило в поверхностном эпителии 88,3±6,1, в железах - 88±6,1, в строме - 97,4±3,1. В III группе после проведенного лечения соотношение ПР/ЭРα≥2 во всех клетках эндометрия наблюдалось у 80% пациенток, у 8,6% - было соотношение ПР/ЭРα<2 во всех клетках эндометрия, у 11,4% женщин в строме наблюдалось соотношение ПР/ЭРα≥2, а в поверхностном эпителии и железах ПР/ЭРα<2. В 20 среднем ПР/ЭРα в III группе после проведенного лечения составило в поверхностном эпителии 2,1±0,1, в железах – 2,1±0,1, в строме – 2,3±0,1. Также наблюдалось статистически значимое (р<0,05) увеличение показателей ПР и ЭРα во всех клетках эндометрия. В поверхностном эпителии, железах и строме показатели ПР увеличились более чем в 2 раза. Уровень экспрессии ЭРα повысился в 1,6 раза в поверхностном эпителии и железах и более чем в 2 раза в клетках стромы. Данные гистологического исследования свидетельствуют о нормализации структурно-функционального состояния эндометрия, формировании более полноценных морфологических реакций поверхностного эпителия, железистого и стромального компонентов эндометрия у данной категории пациенток на фоне гормональной подготовки. Полученные результаты говорят в пользу того, что циклическая гормональная терапия обеспечивает адекватное поступление половых стероидных гормонов и повышает чувствительность к ним клеток эндометрия путем увеличения экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов, что позволяет гормонам реализовать их действие в виде адекватной и равномерной морфофункциональной реакции оболочки матки. В III группе пациенток (n=35) после предварительной гормональной подготовки эндометрия в результате программы ЭКО беременность наступила у 74,3% женщин (n=26). Следует отметить, что беременность наступила у всех пациенток, у которых до лечения была выявлена фаза пролиферации и соотношение ПР/ЭР<2 или фаза секреции и соотношение ПР/ЭР≥2. Таким образом, полученные в ходе выполнения данного исследования результаты свидетельствуют о несомненной связи между состоянием эндометрия и эффективностью реализации программы ЭКО, что диктует необходимость исследования эндометрия на этапе подготовки. На основании полученных результатов разработан алгоритм индивидуальной предварительной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе к последующей программе (рис. 5). 21 Аспирационная биопсия эндометрия на 7-8 день после овуляции (при динамическом УЗИ) Гистологическое исследование эндометрия Отсутствие органической патологии эндометрия Иммуногистохимическое исследование эндометрия с определением количества ПР, ЭРα и ПР/ЭРα При определении фазы пролиферации в сочетании с ПР/ЭРα<2 и высокой экспрессией ПР и ЭРα При определении фазы секреции в сочетании с ПР/РЭα≥2, умеренной или высокой экспрессией ПР в строме, низкой экспрессией ЭРα и количеством пиноподий ≥50% ЭКО и ПЭ При определении фазы пролиферации в сочетании с ПР/ЭРα<2 и низкой или умеренной экспрессией ПР и ЭРα Органическая патология эндометрия: - гиперплазия эндометрия - хронический эндометрит - полип эндометрия При определении фазы секреции в сочетании с ПР/ЭРα<2 и умеренной или высокой экспрессией ЭРα При определении фазы секреции в сочетании с ПР/РЭα≥2, низкой экспрессией ПР в строме и низкой экспрессией ЭРα и количеством пиноподий <50% Циклическая гормональная подготовка - комбинированные пероральные контрацептивы Специфическое лечение Рисунок 5. Алгоритм предварительной гормональной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе 22 ВЫВОДЫ 1. При сходных клинико-анамнестических характеристиках, параметрах фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в 66,1% случаев выявляются структурные изменения эндометрия. 2. При отрицательном результате ЭКО более чем в 6 раз чаще отмечено отсутствие характерных для «окна имплантации» морфологических изменений эндометрия и снижение более чем в 3,5 раза количества клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий в эндометрии. 3. При повторных неудачах имплантации наблюдаются различные варианты дисбаланса экспрессии ПР и ЭРα в эндометрии (снижение стероидной рецепции или гиперэкспрессия ЭРα), наиболее выраженные в строме. Относительный шанс наступления беременности после ЭКО при этом в 4,4 раза выше при соотношении ПР/ЭРα в диапазоне от 2 до 3. 4. Основными прогностически благоприятными критериями наступления беременности являются соотношение ПР/ЭРα, соответствующее морфологической структуре эндометрия, и количество клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий ≥50%, а наиболее неблагоприятным персистирующая гиперэкспрессия ЭРα в среднелютеиновую фазу менструального цикла. 5. эндометрия Проведение морфологической и иммуногистохимической оценки позволяет выделить группу пациенток со сниженными показателями экспрессии ПР и ЭРα, которым необходимо и целесообразно проведение циклической гормональной подготовки перед программой ЭКО с использованием препаратов эстрадиола и прогестерона. 6. Проведение предварительной циклической гормональной терапии при сниженном уровне экспрессии ПР и ЭРα в эндометрии у пациенток с неэффективными попытками ЭКО позволяет увеличить частоту наступления беременности до 74,3%. 23 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Пациенткам с неудачами имплантации в анамнезе перед проведением программы ЭКО и ПЭ необходимо проведение морфологического и иммуногистохимического исследования эндометрия с целью выявления патологических изменений рецепторного статуса (снижение уровня экспрессии ПР и ЭРα, не соответствующее морфологической структуре эндометрия, гиперэкспрессия ЭРα в фазу секреции) для определения индивидуальной подготовки к следующему циклу ЭКО. 2. При гистологическом исследовании эндометрия в период «окна имплантации» рекомендуется с помощью световой микроскопии оценивать морфологическую структуру поверхностного эпителия. 3. При определении в биоптате эндометрия фазы пролиферации в сочетании с ПР/ЭРα<2 и низкой или умеренной экспрессией ПР и ЭРα, а также фазы секреции в сочетании с ПР/РЭα≥2, низкой экспрессией ПР в строме и низкой экспрессией ЭРα и количеством пиноподий <50% следует проводить предварительную гормональную подготовку с применением препаратов эстрадиола (с 5-го по 25-й день МЦ) и прогестерона (с 16-го по 25-й день МЦ) в течение двух МЦ. 4. У пациенток с соотношением ПР/ЭРα<2 при морфологической картине ранней или средней стадии фазы секреции проведение циклической гормональной терапии с использованием препаратов прогестерона нецелесообразно. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии ГнРГ – гонадотропин релизинг гормона Е2 – эстрадиол ИГХ – иммуногистохимический ЛГ – лютеинизирующий гормон ОШ – относительный шанс ПР – прогестероновые рецепторы ПЭ – перенос эмбриона эстрадиола и 24 рФСГ – рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение ЭРα – эстрогеновые рецепторы α ЭРβ – эстрогеновые рецепторы β EGF – эпидермальный фактор роста IL - интерлейкин СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Калинина, Е.А. Применение пероральных контрацептивов в программе экстракорпорального оплодотворения [Текст] / Е.А. Калинина, Е.В. Дюжева // Акушерство и гинекология. – 2009. - №2. – С. 11 – 13. 2. Дюжева, Е.В. Иммуногистохимическое исследование эндометрия в программах ВРТ [Текст] / Е.В. Дюжева, Е.А. Калинина, Л.Н. Кузьмичев, Е.А. Коган // Вестник РУДН серия Медицина Акушерство и гинекология. – 2009. - №6. – С. 98 – 104. 3. Дюжева, Е.В. Гормональная подготовка с учетом морфофункционального состояния эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе [Текст] / Е.В. Дюжева, Е.А. Калинина, Е.А., Коган Л.Н. Кузьмичев // IV Международный конгресс по репродуктивной медицине. – Москва, 2010. – С. 255 - 256. 4. Dioujeva, Е.V. Morphological and immunohistochemistry features of the endometrium in patients with multiple failed IVF-ET cycles [Text] / Е.V. Dioujeva, Е.А. Каlinina, L.N. Кuzmichev, N.N. Volchenko // The 3rd International IVI Congress. – Madrid, 2009. – P. 80. 5. Kulakova, Е.V. The predictive value of the correlation between progesterone and estrogen receptors in endometrium in the period of «the implantation window» in patients with repeated implantation failures [Text] / Е.V. Kulakova, Е.V. Dyuzheva, Е.А. Коgan, Е.А. Каlinina, М.B. Strelchenko, L.N. Кuzmichev // The 3rd Asia Pacific Congress on Controversies in Obstetrics Gynecology and Infertility. – 2009. – Beijing. – P. 1А – 2А.