На правах рукописи
реклама
На правах рукописи БОЖЕДОМОВ Владимир Александрович МУЖСКОЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ БЕСПЛОДИЕ (ЭТИОЛОГИЯ, ПАТОГЕНЕЗ, ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ) 14.00.40 - урология 14.00.36 - аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2001 2 Работа выполнена в Московском государственном медико-стоматолгическом университете и Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН Научные консультанты: Доктор медицинских наук, профессор Лоран О.Б. Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Сухих Г.Т. Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Гориловский Л.М. Доктор медицинских наук, профессор Евдокимов В.В. Доктор медицинских наук, профессор Ковальчук Л.В. Ведущая организация: Российская медицинская академия последипломного образования Защита состоится «28» мая 2001 г. в 14 час. на заседании диссертационного совета Д 208.049.01 Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф.Владимирского (129110, Москва, ул. Щепкина, 61/2, корп. 15) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «27» апреля 2001 года. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Сухоносенко В.М. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время в среднем каждая седьмая пара в мире бесплодна и в половине случаев это связано с нарушениями репродуктивной функции у мужчин (WHO,1993, 2000). Одной из причин мужского бесплодия являются аутоиммунные реакции против сперматозоидов (Коган М.И. и соавт.,1996; Евдокимов В.В.,1998; Mazumdar S., Levine A., 1998; Bronson R.A.,1999; Koide S.S. et al.,2000), которые сопровождаются выработкой антиспермальных антител (АСАТ). Уже более 20 лет диагноз «иммунологическое бесплодие» выделен в отдельную нозологию (Лопаткин Н.А., 1998; ВОЗ,1980-2000), но до сих пор роль АСАТ в развитии бесплодия, многие вопросы диагностики, этиологии, патогенеза, профилактики и лечения данного заболевания остаются спорными. Все еще не определены патогенетически значимые уровни АСАТ, трижды за последние 20 лет эксперты ВОЗ изменяли рекомендуемые границы нормы (менее 40, 10 и 50% АСАТ-позитивных подвижных сперматозоидов, соответственно) и рекомендуемые методы исследования. Некоторые медицинские центры вообще не учитывают данный фактор, не считая его клинически значимым (Marshburn P.B., Kutteh W.H., 1994; Krapez J.A. et al.,1998; Kutteh W.H.,1999). Отсутствует понятие иммунологической причины бесплодия в Руководстве по урологии Европейской ассоциации урологов (Colpi G.M. et al., 2001). Скептицизм, касающийся роли аутоиммунных реакций в развитии бесплодия, вызван в немалой степени существованием большого числа различных методов определения АСАТ, результаты которых слабо коррелируют друг с другом (Николаева М.А. и соавт., 2001; Helmerhorst F.M. et al., 1999). Сильно различаются данные о распространенности аутоиммунных реакций против сперматозоидов у различных категорий мужчин. От 2,2 до 40% мужчин из бесплодных пар, по данным различных авторов, имеют АСАТ (Чернышов В.П., 1990; Тер-Аванесов Г.В.,1996; Курносова Т.Р. и соавт., 2000; Almeida de M., 1993; Heidenreich A. et al.,1994; Hinting А. et al.,1996; Carbone D.J. Jr. et al., 1998; Bronson R.A., 1999; Munuce M.J. et al., 2000), причем отечественные исследования фрагментарны и касаются малочисленных групп. В то же время, очевидна важность оценки распространенности заболевания в организации деятельности органов здравоохранения. Нет единой точки зрения о том, каким образом АСАТ влияют на фер- 4 тильность. Имеются данные, что АСАТ способны нарушать сперматогенез и приводить к патоспермии, препятствовать проникновению через цервикальную слизь (ЦС) и оплодотворению яйцеклетки (Acosta A.A., Kruger T.F.,1993; Ford W.C. et al.,1996; Martin-Du Pan R.C. et al.,1997; Kurnosova T. et al., 1998; Nagy Z.P. et al.,1995,1999; Bronson R.A.,1999; Koide S.S. et al., 2000; Bohring C. et al., 2001). Однако имеется немалое количество публикаций, опровергающих каждое из этих утверждений (Lahteen-maki А. et al.,1993; Simpson J.L. et al., 1996; Gubin D.A. et al.,1998; Carbone Jr D.J. et al.,1998; Mercan R. et al., 1998). Остается недостаточно изученным этиопатогенез данного заболевания. Показано, что к выработке АСАТ могут приводить многие воздействия: обтурация семявыносящих путей, инфекции репродуктивного тракта (ИРТ), травмы яичек, варикоцеле, крипторхизм и др. (Чернышов В.П.,1990; Сизякин Д.В., Коган М.И., 1996; Евдокимов В.В.,1998; Heidenreich A. et al.,1994; Witkin S.S., 1996; Omu A.E. et al., 1997; Carbone Jr. D.J. et al.,1998) и, возможно, существует наследственная предрасположенность к развитию аутоиммунных реакций против сперматозоидов, связанная с комплексом HLA (Сизякин Д.В., Коган М.И., 1996; Low H. et al., 1979; Moncharmont P. et al., 1989; Vazquez-Levin М.Н. et al., 1994; Omu A.E. et al.,1996,1999). Показана роль гемато-тестикулярного барьера (ГТБ) в предотвращении аутоиммунного процесса в яичках (Райцина С.С.,1985), однако конкретные патогенетические механизмы развития заболевания при действии различных повреждающих факторов и возможности профилактики остаются неизвестными. Наконец, противоречивы и неутешительны результаты лечения. Показано, что классическая иммуносупрессивная терапия кортикостероидами не только малоэффективна, или вообще не эффективна, но и обладает комплексом побочных эффектов, что заставляет до двух третей пациентов от нее отказываться (Ohl D.A.,Naz R.K.,1995; Lahteenmaki A. et al.,1995; Rasanen M. et al.,1996). Вспомогательные репродуктивные технологии, основанные на отмывке сперматозоидов in vitro с последующей внутриматочной инсеминацией или ЭКО и ПЭ, при низкой эффективности технически сложны и дороги (Culligan P.J.et al.,1998; Nagy Z.P. et al.,1999; Govind C.K. et al.,2000; Check M.L. et al., 2000). При этом, как отмечают L.Hamberger et al. (1998), не ясны отдаленные последствия использования половых клеток, не прошедших «сито» естественного отбора. Поэтому немалый интерес представляет поиск новых, патогенетически обоснованных, более эффективных и безопасных способов 5 консервативной терапии. Все вышеизложенное обусловило актуальность избранной темы исследования. Цель исследования: показать роль аутоиммунных процессов против сперматозоидов в структуре мужского бесплодия и разработать наиболее рациональные программы диагностики, профилактики и лечения нарушения репродуктивной функции у мужчин с антиспермальными антителами. Для реализации поставленной цели определены следующие задачи: 1. Оценить частоту аутоиммунных реакций против сперматозоидов у мужчин репродуктивного возраста (на основе анализа клинического материала клиники урологии МГМСУ и лаборатории клинической иммунологии НЦ А, Г и П РАМН за 1993-2000 гг). 2. Показать роль аутоиммунных реакций против сперматозоидов в нарушении фертильности и уточнить патогенетически значимые уровни антиспермальных антител. 3. Охарактеризовать степень и механизмы влияния антиспермальных антител на различные этапы репродуктивного процесса: сперматогенез, качество эякулята, проникновение сперматозоидов в цервикальную слизь, акросомальную реакцию, фертилизацию яйцеклетки. 4. Уточнить этиологические факторы возникновения аутоиммунных реакций против сперматозоидов, их распространенность и потенциальный риск в развитии аутоиммунного бесплодия. 5. Установить патогенетические механизмы возникновения аутоиммунных реакций против сперматозоидов. 6. Изучить состояние клеточного и гуморального звеньев иммунитета при бесплодии, обусловленном АСАТ, и выявить возможные причины иммунной дизрегуляции. 7. Охарактеризовать особенности гормональной регуляции гипофизарногонадной системы при иммунологическом факторе мужского бесплодия. 8. Исследовать возможности предотвращения аутоиммунного процесса, сохранения структуры и функции яичка после повреждения гематотестикулярного барьера. 9. Оценить эффективность применения комплексной антибиотикотерапии хламидиоза, микоплазмоза, уреаплазмоза, бактериальной и вирусной инфекции у мужчин с аутоиммунными реакциями против сперматозоидов. 10. Оценить эффективность различных схем кортикостероидной терапии 6 при лечении мужского бесплодия, обусловленного АСАТ. 11. Исследовать возможность применения протеолитических ферментов для лечения мужчин с АСАТ. 12. Исследовать возможность клинического применения биологических продуктов фетального происхождения для лечения иммунологического мужского бесплодия и изучить механизмы их действия in vitro и in vivo. 13. Обосновать и сформулировать предложения по совершенствованию диагностического алгоритма и комплексной терапии бесплодных мужчин с АСАТ. Научная новизна В работе представлен системный подход к изучению иммунологических факторов мужской субфертильности, в частности, обусловленной аутоиммунными реакциями против сперматозоидов, что позволило рассмотреть данные нарушения мужской репродуктивной функции с позиций целостного организма. Впервые в нашей стране на большом статистическом материале (более 3500 обследованных супружеских пар) установлена частота встречаемости аутоиммунных реакций против сперматозоидов у мужчин репродуктивного возраста. Впервые для оценки аутоиммунных реакций против сперматозоидов использован комплекс методов обнаружения АСАТ (MAR-тест, ПЦМ, ИФА) и показана их прогностическая ценность при характеристике нарушений количественных показателей спермограммы, фертильности, изменений в иммунной и эндокринной системах. Впервые на большом клиническом материале (578 бесплодных мужчин с диагностированными АСАТ, 550 пациентов без АСАТ и 37 фертильных мужчин) установлены распространненность различных этиологических факторов появления АСАТ (травмы, инфекции репродуктивного тракта, варикоцеле и др.) и абсолютный риск формирования аутоиммунных реакций против сперматозоидов при действии каждого из них. На основании комплексного клинико-лабораторного обследования и экспериментальных исследований на животных (крысы) доказано, что главной причиной образования АСАТ является нарушение целостности ГТБ, а также модификация антигенных свойств сперматозоидов микроорганизмами, способными адгезироваться на поверхностной мембране сперматозоидов. Показаны особенности развития и течения аутоиммунных реакций против сперма- 7 тозоидов на фоне различных инфекций репродуктивного тракта. Впервые показана роль системы интерферонов в развитии иммунологического бесплодия на фоне ИРТ, установлены количественные закономерности продукции интерферонов при различной активности аутоиммунного процесса. Впервые описаны механизмы системной регуляции иммунологических реакций в зависимости от активности аутоиммунного процесса и продукции различных классов АСАТ. Впервые установлено наличие вторичной иммуносупрессии при высокой плотности АСАТ на сперматозоидах. Впервые установлены особенности гормональной регуляции у мужчин с АСАТ, подтверждающие наличие различных форм иммунологической перестройки при различной активности аутоиммунного процесса. Показана роль в этих реакциях кортизола (К) и свободного тестостерона (Тс) и механизмы перестройки продукции последнего. Впервые показано, что избыточная продукция секс-гормон-связывающего глобулина (СГСГ) и связанное с этим значительное снижение содержания Тс играет существенную роль в патогенезе аутоиммунного поражения яичек при обтурации. Впервые описано, что следствием гормональных и иммунных реакций является увеличение размера простаты и повышение секреции простат специфического антигена (ПСА). Впервые представлены комплексные данные о влиянии аутоиммунного процесса, характерным проявлением которого является продукция антител к антигенам сперматозоидов, на основные этапы репродукции: 1) сперматогенез, 2) продукцию и метаболизм андрогенов в яичках, 3) подвижность, морфологию, агглютинацию сперматозоидов, 4) их фагоцитоз, 5) физикохимические свойства семенной плазмы, 6) акросомальную реакцию, 7) пенетрацию цервикальной слизи и 8) фертилизацию яйцеклетки. Установлен процент встречаемости и степень выраженности каждого из этих патогенетических факторов в зависимости от клинико-анамнестических характеристик пациентов и активности аутоиммунного процесса. Описаны вероятные механизмы наблюдаемых нарушений, включающие прямое действие интерферонов, свободных радикалов кислорода и лизосомальных ферментов. На экспериментальной модели (крысы) впервые показана возможность предотвращения атрофии яичка и сохранения сперматогенной и андрогенпродуцирующей функции после дозированной травмы и резекции органа с использованием пуринового производного - инозин-гипоксантин-рибозида и 8 кофермента - липоевой кислоты. Показано, что в основе лечебного эффекта лежит способность препаратов предотвращать ишемию тканей после травмы и обеспечивать сохранение и восстановление целостности ГТБ. Уточнены показания и противопоказания для применения глюкокортикоидов у пациентов с иммунологическим фактором бесплодия, учитывающие активность локальных воспалительных реакций. Продемонстрированы преимущества пульс-терапии Метилпреднизолоном по сравнению с «дипломированной» схемой применения Преднизолона в фолликулярную фазу цикла супруги. Предложены и апробированы оригинальные методы консервативной терапии иммунологического бесплодия, основанные на применении протеолитических ферментов и продуктов фетального происхождения. Впервые проведено сравнение эффективности трансплантации тканей различных органов и фармокопейных препаратов плаценты (Альфетин) у пациентов с АСАТ. Получены данные по влиянию фетальных белков на пролиферацию и трансформацию иммунокомпетентных клеток, и продукцию интерлейкинов in vitro, раскрывающие механизмы лечебного эффекта предложенных способов лечения. Сформулирован и обоснован комплексный подход к лечению пациентов с иммунологическим компонентом бесплодия, включающий устранение всех возможных этиопатогенетических факторов, методы снижения продукции АСАТ, методы удаления АСАТ, уже связанных со сперматозоидами, и вспомогательные репродуктивные технологии. Практическая значимость Подтверждена роль аутоиммунных реакций против сперматозоидов в развитии мужского бесплодия. Показано, что у пациентов с АСАТ происходит ухудшение количественных показателей спермограммы, нарушение функционального созревания сперматозоидов, наблюдаются отрицательные результаты пост-коитального теста (ПКТ) и снижение успеха программы ЭКО и ПЭ. Установлена эпидемиология аутоиммунных реакций против сперматозоидов у мужчин репродуктивного возраста российской популяции. Показана чувствительность и прогностическое значение различных методов определения АСАТ: MAR- и IBT-тестов, ПЦМ и ИФА. Показана возможность предотвращения атрофии яичка после нарушения целостности ГТБ при использовании стимуляторов регенерации и внутри- 9 клеточного метаболизма. Показано значение первичных эпизодов ИРТ в появлении АСАТ, что подчеркивает значение профилактики и своевременного лечения. Установлены критерии, позволяющие прогнозировать снижение АСАТ после излечения ИРТ в зависимости от активности аутоиммунного процесса и показателей спермограммы. Установлено, что субкоинические ИРТ являются фактором, существенно снижающим эффективность специфической терапии. Предложен оригинальный способ диагностики урогенитальных инфекций, повышающий вероятность обнаружения субклинических ИРТ. Определены показания и противопоказания для применения у пациентов с АСАТ кортикостероидов (Преднизолон и Метилпреднизолон). Предложен и внедрен способ фармакологического лечения мужчин с аутоиммунными реакциями против сперматозоидов на основе применения протеолитических ферментов (панкреатин, трипсин, химотрипсин, бромелайн, папаин). Разработан и внедрен способ лечения мужского иммунного бесплодия на основе использования продуктов фетального происхождения в виде чистых белков и трансплантации клеток. На основании изучения патогенетических механизмов развития иммунологического бесплодия обоснованы и сформулированы предложения по профилактике иммунологического бесплодия и оптимизации ведения бесплодных мужчин репродуктивного возраста с АСАТ, включающие совершенствование методологических подходов к обследованию пациентов и принципы их терапии. Положения, выносимые на защиту 1. Аутоиммунные реакции против сперматозоидов приводят к снижению вероятности наступления беременности в результате нарушения сперматогенеза, усиления фагоцитоза половых клеток, ухудшения подвижности и морфологии сперматозоидов, нарушения акросомальной реакции, проникновения в цервикальную слизь и оплодотворения яйцеклетки. 2. Преобладающими этиологическими факторами аутоиммунного мужского бесплодия являются повреждение гемато-тестикулярного барьера в результате механической травмы мошонки (14% случаев), орхита (6%), и варикоцеле (31%), а так же инфекции репродуктивного тракта (57%). Риск образования АСАТ при этом составляет 71%, 67%, 42% и 32% 10 соответственно. Аутоиммунные реакции зависят от вида микроорганизма: преобладают перекрестные реакции (Mycoplasma hominis) или повреждение ГТБ (Chlamydia trachomatis). 3. Характерными признаками развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов являются повышенная продукция интерферонов, активация В-клеточного звена, системы НК-клеток и фагоцитоза. Активное течение аутоиммунного процесса сопровождается вторичной иммуносупрессией, признаками которой являются уменьшение процента и количества Т-хелперов, Ви НК-лимфоцитов, снижение соотношения CD4/CD8, концентрации интерферонов, гиперпродукция кортизола, увеличение концентрации свободного тестостерона. 4. Консервативная терапия пациентов с иммунологическим фактором бесплодия может включать высокоактивные кортикостероиды (Метипред) в виде пульс-терапии высокими дозами и системную энзимотерапию протеолитическими ферментами в комплексе со стимуляторами внутриклеточного метаболизма. Оптимальным видом терапии является использование специфических белков фетального происхождения (РР 12, РР14 и др.) в виде трансплантации клеток. Для профилактики атрофии яичка после травмы и плановой резекции целесообразно использовать стимуляторы внутриклеточного метаболизма (Рибоксин, Липамид), способные сохранять и стимулировать регенерацию ГТБ и обеспечивать адекватную оксигенацию тканей. 5. Ведение мужчин репродуктивного возраста с иммунологическим фактором бесплодия предусматривает комплексное лечение, включающее устранение всех возможных этиопатогенетических факторов (инфекции репродуктивного тракта, варикоцеле, обтурация, перегревание и др.), снижение продукции АСАТ, удаление АСАТ, связанных со сперматозоидами, и вспомогательные репродуктивные технологии. Апробация работы Материалы диссертации доложены на XI съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Смоленск-Полтава, 1992); XII съезде анатомов, гистологов, эмбриологов (Томск, 1994); Первом симпозиуме по трансплантации фетальных тканей человека (Москва, 1995); II Int. Congress on Andrology in Turkey (1995); Сателлитном симпозиуме фирмы «Мукос Фарма» (Москва, 1995); I Всероссийской научно-практической конференции «Применение ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний. Методы лечения» (Сочи, 1996); II Международной конференции по системной энзимотерапии (Москва, 1996); III Euro- 11 pean Chlamydia Meeting (Vienna, 1996); Семинаре «Патология шейки матки. Заболевания, передающиеся половым путем. Новое в диагностике и лечении» (Москва, 1997); International simposium on male infertility and assisted reproduction (Genk, Belgium, 1998); Fourth international meeting “Mechanisms in local immunity” and joint meeting “Fourth Meeting of Alps Adria Society for Immunology of Reproduction (Opatija, Croatia, 1998); VII International congress of Reproductive immunology (New Delhi, India, 1998); конференции «Современные подходы к диагностике и лечению урологических заболеваний» (Москва, 1999); заседании Российского Общества урологов (Москва, 1999); III симпозиуме по мужской генитальной хирургии (Москва, 2000), Первом конгрессе Профессиональной ассоциации андрологов России (Кисловодск, 2001). Внедрение результатов в практику Разработанный алгоритм обследования больных с иммунологическим фактором мужского бесплодия, а так же способы диагностики и лечения используются в урологической клинике МГМСУ, НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, Институте биологической медицины. Получены 5 Патентов РФ на оригинальные способы диагностики и лечения данной категории больных. Материалы диссертации используются при чтении лекций слушателям ФУВ, аспирантам и ординаторам по курсам «неоперативная андрология» и «оперативная андрология» на кафедре урологии МГМСУ, семинарах «Профессиональной ассоциации андрологов», частично вошли в учебное пособие «Мужская репродуктивная функция и сексуальность человека» (М., 1998 и СПб, 1999), «Проект стандартов диагностики и лечения мужского бесплодия» (2000). Апробация диссертационной работы состоялась 16 марта 2001 г. Связь с планом научных исследований. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры урологии МГМСУ (№ государственной регистрации 01960011115). Тема докторской диссертации рекомендована к утверждению Межведомственным научным советом по урологии и оперативной нефрологии №36 при НИИ урологии МЗ РФ и утверждена на Ученом совете МГМСУ (протокол №11 от 29.06.1999 г). Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 36 печатных работ, 2 учебных пособия, получены 5 Патентов РФ на изобретения и подана еще одна Заявка. 12 Объем и структура работы Диссертация состоит из пяти глав, содержащих анализ литературы и собственные данные по эпидемиологии, этиологии, патогенезу, диагностике и лечению иммунологического бесплодия, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 399 машинописных страницах, содержит 65 таблиц, 95 рисунков. Библиография включает в себя 437 литературных источников, в том числе 81 отечественных и 356 зарубежных авторов. Материалы и методы исследования Для выяснения частоты, структуры и ежегодной выявляемости иммунологического фактора у мужчин репродуктивного возраста, проведен ретроспективный анализ результатов исследований эякулята более 3500 человек, проходивших обследование в клинике урологии МГМСУ, НЦ А, Г и П РАМН и Институте биологической медицины в 1993-1999 г. В основу работы положены результаты комплексного клиниколабораторного обследования 367 пациентов с АСАТ и ретроспективный анализ историй болезни 211 пациентов (всего 578 человек) в возрасте от 18 до 59 лет (средн. 32,20,34 года). Группу сравнения составили 36 фертильных мужчин, жены которых наблюдались по поводу беременности 4-12 недель или спонтанных абортов и 550 субфертильных мужчин без АСАТ, проходивших аналогичное обследование. Для выполнения работы помимо общеклинического обследования проводили: оценку качества эякулята с соответствии с требованиями ВОЗ (1992, 1999); определение АСАТ методом MAR%IgG и IgA (Ferti Pro N.V., Бельгия); определение АСАТ методом ПЦМ для IgG, IgA, IgM с использованием проточного цитофлуориметра (Becton Dickinson, США) и ФИТЦмеченных козьих антител к IgG человека (Sigma, St.Louis); выявление АСАТ методом флуоресцентной микроскопии с использованием ФИТЦ-меченных козьих антител к IgG человека (Sigma, St.Louis) и микроскопа фирмы Leitz Laborlux S (Leica, Germany); определение концентрации АСАТ методом ИФА с использованием набора “Spermatozoa antibody ELAISA” (IBL, Германия); определение акросомальной реакции: ПЦМ и иммунофлуоресценция с использованием лектинов P.sativum, меченного флуоресцеин-изотиоциона- 13 том, и A.hypogaea, меченного ТРИТЦ (Sigma); обнаружение инфекций репродуктивного тракта методами ПЦР, ИФА, посевом на питательные среды; иммунологические исследования: ПЦМ, люминолзависимая хемолюминесценция, метод Кембела, нефелометрический метод; гормональные исследования: ИФА и РИА; морфологические методы исследования; УЗИ простаты и яичек, доплерометрия сосудов семенного канатика (по показаниям); статистические методы исследования: вычисление M и m, значимости различий по критериям Стьюдента и Фишера для независимых и парных выборок, Хи-квадрат и критерий знаков, корреляционный анализ с вычислением коэффициента корреляции Пирсона. Результаты исследования и их обсуждение Ретроспективный анализ данных спермограмм за период с 1993 по 2000 гг. показал, что АСАТ встречаются у 18% российских мужчин репродуктивного возраста, причем у 3% мужчин антитела класса IgG покрывают менее 10% сперматозоидов, у 7% - от 10 до 49% сперматозоидов, у 4% - от 50 до 99% и в 4% случаев все подвижные сперматозоиды покрыты антителами. Наиболее часто АСАТ присутствовали у мужчин из бесплодных пар (n=1374) - до 48%. Подавляющее большинство таких больных находилось в возрасте от 25 до 40 лет (75,8%). Отмечена тенденция к росту средних значений АСАТ с возрастом, однако статистические различия между разными возрастными группами отсутствовали. Частота обнаружения АСАТ зависела от использованных методов. Наиболее чувствительным оказалось прямое определение антител на сперматозоидах – MAR-тест, что соответствует литературным данным (Rajah S.V. et al., 1992; Nikolaeva M.A. et al., 1993; Keel B.A. et al., 2000; Mahmoud G.A., Comhaire F., 2000). Совпадение положительных результатов ИФА с результатами MAR%IgG>0 (т.н. чувствительность) наблюдалась в 6% случаев (2 из 32). Поэтому определение АСАТ с помощью ИФА следует считать недостаточно чувствительным для первичного скрининга. Это согласуется с данными литературы (Cunningham D.S. et al., 1991; Eggert-Kruse W. et al., 1993; Helmerhorst F.M. et al., 1999; Keel B.A. et al., 2000). Данные ПЦМ, показывающие общее число сперматозоидов покрытых АСАТ и количество на них антител, были более строго связаны с показателями спермограммы и системного им- 14 мунитета (см. ниже). Кроме того, недавние исследования группы сотрудников нашего коллектива - Николаевой М.А., Коротковой И.В. и Голубевой Е.Л., показали, что модифицированный авторами метод ПЦМ позволяет диагностировать наличие АСАТ в MAR-негативных образцах (Короткова И.В. и соавт., 2001), когда из-за изменения ригидности мембраны отсутствует агрегация комплексов антиген-антитело. В группе фертильных мужчин (n=36), когда беременность у жен наступила без лечения в естественном цикле, так же имелись случаи наличия АСАТ, в т.ч. MAR%IgG<10% - у 3 человек, от 10 до 49% - у 3 человек и больше 50% - у 2 чел. Максимальное значение MAR%IgG составляло 60% и IgA – 10%, что соответствует литературным данным (Takahashi K. et al.,1992). Ожидаемая вероятность зачатия (8 мужчин с АСАТ из 367 находящихся под наблюдением) составляла 2,2% в год и уменьшалась с увеличением доли подвижных АСАТ-позитивных сперматозоидов с 4,2% при MAR%IgG<10% до 0% при MAR%IgG =100%. С целью оценить роль АСАТ, как непосредственного фактора нарушения фертильности, были выделены группы бесплодных мужчин с нормальными показателями спермограммы, отличающиеся только по наличию или отсутствию АСАТ. Показано, что нормозооспермия существенно чаще наблюдается при бесплодном браке с аутоиммунными реакциями против сперматозоидов, чем у субфертильных мужчин без АСАТ (25% и 11% соответственно, P<0,0001). Имеются различия в продолжительности бесплодия и частоте первичных нарушений фертильности в таких группах (рис.1). **### 90 ### Рис.1. Особенности нарушения репродуктивной функции у мужчин с нормозооспермией без ИРТ в зависимости от количества подвижных сперматозоидов, покрытых АСАТ (MAR%IgG). 0% (n=44) Примечания: * - различия между бесплодными с АСАТ и без АСАТ достоверны с P<0,05; ** - c P<0,01; # - различия между бесплодными и фертильными достоверны с P<0,05; ## - с P<0,01; ### - с P<0,001. *### ### 60 *# 30 0 Фертильн (n=15) 1-10% (n=24) 11-49% (n=39) 55-99% (n=28) 100% (n=20) MAR%IgG Первичное бесплодие (%) Продолжительность бесплодия (мес) 15 Показано, что по сравнению с фертильными мужчинами продолжительность половой жизни без беременности существенно больше даже при MAR%IgG от 1 до 10% (P<0,05), и увеличивается с ростом доли АСАТпозитивных сперматозоидов (P<0,001). Аналогично растет доля первичных нарушений репродуктивной функции, которые становятся статистически значимыми при MAR%IgG>50% (P<0,01). Тем не менее, даже у тех пациентов, у которых все сперматозоиды на момент обследования были покрыты АСАТ, беременности у жен или сексуальных партнерш до брака известны в 50% случаев (10/20). Сравнение показателей спермограммы (см. Приложение 1) показало, что в АСАТ-позитивных группах меньше по сравнению с фертильными концентрация (Pt<0,001), доля активно-подвижных (Pt<0,05-0,01) и морфологически нормальных сперматозоидов (Pt<0,05), в результате индекс качества спермы (ИКС) – общее число прогрессивно-подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов, - меньше почти в 2 раза (Pt<0,05). Неблагоприятные изменения нарастают с увеличением доли MAR-позитивных сперматозоидов, и в группе с MAR%IgG>50% становятся статистически более значимыми. Однако различия между АСАТ-позитивными с MAR%IgG больше и меньше 50% группами незначительны и касаются только процента неподвижных сперматозоидов и патологии шейки и хвоста (Pt<0,05). Более дифференцированный анализ также показал отсутствие однозначной и строгой зависимости основных параметров спермограммы от величины MAR%IgG (рис.2). Даже агглютинация, которую исторически считают одним из главных признаков наличия АСАТ в сперме, хотя и имела тенденцию к увеличению с ростом значения MAR, в среднем была меньше, чем у фертильных мужчин. Данные закономерности подтверждает корреляционный анализ: существует очень слабая (меньше 0,2), хотя статистически достоверная (более 1000 образцов эякулята с MAR%IgG>0), отрицательная взаимосвязь с концентрацией (P<0,05), процентом активно-подвижных сперматозоидов (P<0,05) и ИКС (P<0,05); положительная – с процентом неподвижных сперматозоидов (P<0,01), долей сперматозоидов с измененной головкой (P<0,05), шейкой (P<0,01) и хвостом (P<0,01), а так же количеством лейкоцитов (P<0,05), клеток сперматогенеза (P<0,05) и агглютинацией (P<0,05). Различия в количестве IgA-позитивных сперматозоидов (в 3.5 раза по данным IBT-теста, P<0,001) при одинаковой величине MAR%IgG на 16 количественных показателях спермограммы практически не отражаются (приложение 2). Такая статистически слабая взаимосвязь между результатами MAR- и IBT-тестов и параметрами спермограммы, очевидно, является причиной мнения ряда исследователей об отсутствии влияния АСАТ на концентрацию (Gupta I. et al., 1975; Dimitrov D.G. et al., 1994; Eggert-Kruse W. et al., 195; Gubin D.A. et al., 1998) и подвижность сперматозоидов (Adeghe A.J. et al., 120 60 30 100 100 80 40 20 40 20 10 % 60 % 60 % Млн/мл 80 40 20 20 0 0 <10% 10-49% 50-99% 100% 0 0 Без АСАТ Фертил. Концентрация (млн/мл) в т.ч. случаев олигозооспермии 0,8 40 М лн/мл 50 30 0,4 20 0,2 10 % Б аллы 0,6 0 Ферт. < 10% 10- 50- 100% 49% 99% Без АСАТ С пе рм атозоиды кате гории А (% ) в т.ч. пацие нтов с ас те нозоос пе рм ие й (% ) 1 0 < 10% 10-49% 50-99% 100% Без АСАТ 0 ,8 40 0 ,6 30 0 ,4 20 0 ,2 10 % Ферт. 0 0 Ф е р т. <10% 10- 50- 49% 99% 100% Без АС АТ К о нцент р ация л ейко цит о в в эя кул я т е (м л н/м л ) Агглю ти н ац и я (баллы ) в т .ч . пио спер м ия (% ) Пац и е н ты с агглю ти н ац и е й сп е рм атозои дов (%) 1989; Takahashi K. et al., 1992). Рис.2. Показатели спермограммы у различных групп мужчин в зависимости от количества подвижных сперматозоидов, покрытых АСАТ IgG: фертильные (n=36), MAR=1-9% (n=89), MAR=10-49% (n=165), MAR=50-99% 17 (n=95), MAR=100% (n=95) и бесплодные с MAR=0% (n=405). А 100 Б r = - 0,21; P<0,01 100 80 ПЦМ%IgA ПЦМ%IgG 80 r = - 0,28; P<0,01 60 40 60 40 20 20 0 0 0 100 200 300 400 Индекс качества спермы (ед) 500 0 100 200 300 400 500 Индекс качества спермы (ед) Рис. 3. Зависимость от величины ПЦМ%IgG (А) и IgА (Б) количества прогрессивно-подвижных и морфологически нормальных сперматозои-дов в эякуляте - ИКС. Процент всех живых сперматозоидов, покрытых IgG, IgA и IgM по данным ПЦМ демонстрируют более тесную связь с качеством эякулята (рис.3). Наблюдаемое ухудшение качества спермы происходит за счет снижения концентрации (Pt<0,01-0,001), подвижности (Pt<0,05) и доли морфологически нормальных форм (Pt<0,05); ниже рН эякулята (Pt<0,05), время разжижения (Pt<0,01), концентрация незрелых клеток сперматогенеза (P t<0,001). Объем эякулята (Pt<0,05), процент неподвижных сперматозоидов (Pt<0,01), концентрация лейкоцитов (Pt<0,05), MAR IgG (Pt<0,001) и IgA (Pt<0,001), наоборот, повышены. Данные закономерности подтвердил и корреляционный анализ. Для оценки роли плотности антител на сперматозоиде в нарушениях качества спермы сравнили больных, сходных по проценту АСАТ-позитивных клеток для IgG, IgA и IgM, но отличающиеся по количеству сайтов связывания АСАТ со сперматозоидами. В выделенные группы вошли пациенты без ИРТ с нормальной концентрацией и процентом MAR IgG>50%, процентом ПЦМ-позитивных клеток не менее 20. Дискриминантное значение плотности антител на клетку было выбрано больше или меньше 100 У.Е.Ф. для IgG и 80 У.Е.Ф. – для IgA, что обеспечило относительно равное число пациентов в каждой выборке (медиана). Как видно из представленных данных (приложение 3 и 4), при равных 18 значениях процента ПЦМ-позитивных сперматозоидов или их популяции с активно-поступательным движением (MAR), изменение количества антител на отдельный сперматозоид не приводит к существенному изменению качества эякулята. Несмотря на почти в 10 раз большую плотность АСАТ IgG и в 6 раз – IgA у пациентов выделенных групп, концентрация, подвижность, морфология сперматозоидов ухудшаются незначительно, и эти изменения находятся в границах статистической ошибки. Это подтвердил корреляционный анализ. Только для времени разжижения спермы и концентрации лейкоцитов в эякуляте показано существование статистически значимой взаимосвязи с плотностью IgG: r=-0,38 и r=+0,54 соответственно (Pr<0,01). Плотность IgA также связана с временем разжижения (r=-0,39, Pr<0,05) и консистенцией (r=+0,50, Pr<0,01). В целом, это подтверждает мнение тех авторов, кто считает, что присутствие АСАТ в сперме и на сперматозоидах приводит к снижению их концентрации (Сизякин Д.В., Коган М.И., 1996; Check J.H. et al., 1991; Martin-Du Pan R.C. et al., 1997) и подвижности (Dimitrov D.G. et al., 1994; Kurnosova T. et al., 1998; Carbon Jr. D.J. et al., 1998; Koide S.S et al., 2000). Наибольшее влияние на подвижность сперматозоидов оказывают антитела класса IgM, в меньшей степени – IgG. Вероятно, это обусловлено высокой агглютинирующей активностью IgM и в меньшей степени IgG и способностью антител данных классов запускать реакции комплемента по классическому пути (Lawlor G.L. et al., 1995). Провоспалительный компонент изменения качества эякулята, проявляющийся повышением концентрации лейкоцитов, снижением рН и времени разжижения, определяется преимущественно АСАТ IgG. Это согласуется с данными литературы (Gonzales G.F. et al., 1992; Omu A.E. et al., 1999). Другой причиной снижения концентрации сперматозоидов, очевидно, является избыточный фагоцитоз в придатке и/или дополнительных половых железах, обусловленный АСАТ IgG- и IgM-классов. Важным фактором, приводящим к нарушениям качества спермы, является избыточная продукция активных радикалов кислорода лейкоцитами и, возможно, самими сперматозоидами: нашими исследованиями показано, что у мужчин с аутоиммунными реакциями против сперматозоидов уровень генерации свободных радикалов кислорода в 3-4 раза выше, чем в АСАТнегативных образцах. Наконец, у мужчин с иммунологическим бесплодием значительно повышена продукция интерферонов (см. ниже). Повреждающее действие интерферонов и перокисных радикалов на подвижность спермато- 19 зоидов in vitro уже описано в литературе (Oehninger S. et al., 1995; Fedder J. et al., 1995, 1996), но без учета наличия АСАТ. Наиболе известно отрицательное влияние АСАТ на прохождение сперматозоидов через цервикальный канал. Наши данные подтверждают мнение большинства исследователей (Kremer J., Jager S., 1992; Steen Y. et al., 1994; Francavilla F. et al., 1999), что в присутствии АСАТ в сперме приводит к нарушению проникновения сперматозоидов в цервикальную слизь. При оценке результатов ПКТ было показано, что в 86% случаев (18/21) цервикальная слизь через 4-6 часов после коитуса содержала менее 10 сперматозоидов категории подвижности А и В в поле зрения микроскопа при большом увеличении (х400), что соответствует отрицательному результату ПКТ. У жен трех мужчин (14%) результаты теста были положительными. В группе мужчин, у которых результаты MAR теста для IgG были не менее 50%, во всех случаях (9 из 9) результаты ПКТ были отрицательными (Pz<0,01). В случаях положительного ПКТ процент АСАТ-позитивных сперматозоидов не превышал 15%. Важнейшей функцией сперматозоидов, играющей ключевую роль в проникновении сперматозоида через оболочки яйцеклетки, является акросомальная реакция (АР) – рецепторно-опосредованный клеточный экзоцитоз ферментов, происходящий при связывании сперматозоида с прозрачной оболочкой яйцеклетки. Анализ данных исследования АР показал, что средние значения спонтанной и индуцированной АР между группами с различными значениями MAR IgG и без АСАТ статистически не отличаются (приложение 5). Однако сравнение результатов АР исследованных групп с нормальными значениями, рекомендованными ESHRE (1996) показало, что у пациентов, у которых менее половины подвижных сперматозоидов покрыты АСАТ, в 21% случаев имелось превышение допустимого порога спонтанной реакции. У мужчин, более 50% сперматозоидов которых были АСАТ-позитивными, повышенная активность спонтанной АР наблюдалась у каждого второго (50%); в 8% случаев имелись нарушения индуцированной АР (рис.4). Это согласуется с данными P.Saragueta et al. (1994) о стимулирующем действии АСАТсодержащей фолликулярной жидкости на АР. Однако наблюдаемые изменения не были специфичными для иммунологического бесплодия – нарушения АР имелись у трети пациентов с идиопатическим бесплодием. Данные литературы о влиянии АСАТ на оплодотворение и дробление яйцеклетки также противоречивы (Pagidas K. et al., 1994; Sukcharoen N., Keith 20 J., 1995; Francavilla F. et al., 1991, 1999; Goving C.K. et al., 2000). Результаты наших исследований с применением стандартного протокола ЭКО и ПЭ без агонистов Гт-РГ у мужчин с MAR IgG=100% (n=14) показали, что процент нормально дробящихся яйцеклеток после оплодотворения in vitro составил 43%. В остальных случаях наблюдалось то или иное нарушение в развитии зиготы. Беременности после переноса эмбриона были зарегистрированы у 5 женщин, что в пересчете на одну попытку составило 10,2%. Данные показатели существенно хуже, чем в случае применения аналогичного протокола ЭКО и ПЭ у мужчин без АСАТ (Финогенова Е.Я.,1996; Ford W.C.L. et al., 1996). 100% Рис.4. Нарушения акросомальной реакции у мужчин с АСАТ и идиопатическим бесплодием. Примечание: норма спонтанной АР меньше 20%; норма индуцированной АР больше 15% (ESHRE, 1996). 50% 50 31 21 0% Бе з АСАТ MAR IgG <50 MAR IgG >50 Норма Нормальная реакция Недостаточность индуцитованной реакции Избыточность спонтанной реакции Нарушения АР и оплодотворения яйцеклетки in vitro могут так же связаны с пиоспермией и гиперпродукцией свободных радикалов кислорода, что ранее было описано для бесплодных мужчин без АСАТ (Aitken R.J. et al., 1994; Krausz C. et al., 1994; Oehninger S. et al., 1995; Wolff H., 1995). Суммируя результаты проведенных исследований по изучению влияния аутоиммунных реакций против сперматозоидов на фертильность мужчины можно сделать заключение, что наличие АСАТ сопровождается снижением вероятности наступления беременности за счет ухудшения количественных показателей спермы, нарушения проникновения сперматозоидов через ЦС, нарушения АР и снижения вероятности оплодотворения яйцеклетки даже in vitro. 21 Анализ причин развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов показал, что анамнез пациентов с АСАТ по сравнению с фертильными мужчинами и бесплодными без антител имеет особенности: чаще имел место орхит и травмы мошонки без орхита, им выполнялись оперативные вмешательства по поводу варикоцеле, осуществлялось лечение различных ИРТ, в т.ч. гонореи, хламидиоза, уреаплазмоза (рис.5). Для травм яичек, орхита и операций по поводу варикоцеле это подтверждают результаты корреляционного анализа всей выборки бесплодных мужчин (Pr<0,01). Крипторхизм 100% 50% 9* Варикоцеле (операция) Инфекции РТ 41* Эпидидимит 5 5 22 19 3 4 Орхит 6* 15*** Травмы яичек Паротит 0% Ф ерт ильн. Рис. 5. Особенности анамнеза бесплодных пациентов с АСАТ (n=367), без АСАТ (n=550) и фертильных мужчин (n=36), % без АС АТ с АС АТ Частота перенесенного паротита, изолированного эпидидимита, крипторхизма в группах фертильных и бесплодных мужчин с и без АСАТ существенно не отличалась. Также отсутствуют значимые различия в частоте выявления другой сопутствующей андрологической патологии – пальпируемого варикоцеле, 120 отсутствия vas deferens, подттвержденной непро100 ходимости, анэякуляции, Патол. форм. (%) 80 сексуальных дисгармо* Подв. А+В (%) ний; существенно реже 60 Конц. (млн/мл) встречалась лишь * 40 MAR%IgG (%) эндокринная патология в * виде гипери 20 гипофункции гипофиза, гипоандрогении и/или 0 U.u. M.h. Ch.t. Фертильн. гиперпролактинемии (приложение 6). ## # ### 22 Рис.6. Особенности количественных показателей спермограммы у мужчин с АСАТ (MAR IgG>50%), ассоциированных с хламидиозом, уреа- и микоплазмозом. Примечания: * - различия между группой с хламидиозом и группой с уреаплазмозом достоверны с P<0,05; # - различия с фертильными достоверны с P<0,05, ### - с P<0,001. Одной из наиболее частых находок у больных с АСАТ являются различные ИРТ: ВПГ (33%), Chlamydia trachomatis (29%), Ureaplasma urealyticum (29%), Mycoplasma hominis (13%) изолированно или в сочетаниях. При этом наиболее выраженные нарушения качества спермы наблюдаются на фоне хламидиоза (рис.6). Однако частота обнаружения данных инфекций в группе пациентов с АСАТ статистически не отличается от таковой у бесплодных без антител и фертильных мужчин (приложение 6). Отсутствие значимой зависимости между величиной MAR% и ПЦМ% для IgG и IgA и присутствием данных ИРТ подтвердил корреляционный анализ (Pr>0,05). Но процент IgMпозитивных сперматозоидов оказался связанным положительной зависимостью с наличием Mycoplasma hominis (r=+0,36, Pr<0,05). Так же имелась существенная положительная связь между наличием микоплазм и количеством АСАТ на сперматозоидах: для IgG r=+0,49 (Pr<0,05), для IgA r=+0,47 (Pr<0,05), для IgM r=+0,61 (Pr<0,01). По сравнению с присутствием Chlamydia trachomatis плотность АСАТ на фоне Mycoplasma hominis для класса IgG составляет 1020%, для IgA – 663%, для IgM – 1360% (рис.6,7). После излечения микоплазмоза плотность АСАТ уменьшается в 9-14 раз (рис.7), в то время, как излечение хламидиоза практически не влияет на количество АСАТ на сперматозоидах (рис.8) и не сопровождается значимым улучшением качества спермы. Рис.7. Количество АСАТ различных классов на сперматозоидах у бесплодных мужчин, инфицированных Mycoplasma hominis, в различные сроки после исчезновения возбудителя в результате антибиотикотерапии, Ед. Рис.8. Количество АСАТ различных классов на сперматозоидах у бесплод- 23 ных мужчин, инфицированных Chla-mydia trachomatis, в различные сроки после исчезновения возбудителя в результате атибиотикотерапии, Ед. При осмотре обращало на себя внимание более часто встречающееся увеличение яичек и/или придатков (в одном из участков или общее), их повышенная чувствительность при пальпации. У части больных, наоборот, пальпируемый размер придатков был меньше нормы. С ростом процента АСАТ-позитивных сперматозоидов вероятность обнаружения данной патологии возрастала (приложение 7). Корреляционный анализ подтвердил наличие положительной взаимосвязи между размерами яичек и придатков и MAR%IgG (r=+0,19 и +0,17 соответственно, Pr<0,05-0,01). Процент всех сперматозоидов, покрытых антителами IgG по данным ПЦМ, кроме того, зависит от степени выраженности левостороннего варикоцеле (r=+0,21, Pr<0,05). В выборке субфертильных мужчин без ИРТ, независимо от наличия или отсутствия АСАТ, существует положительная связь между размером простаты и MAR%IgG (r=+0,15, Pr<0,05). В группе АСАТ-позитивных мужчин в 2,9 раз (P<0,001) повышена концентрация в крови простат специфического антигена (ПСА), не выходящая, однако, за пределы нормативных границ в 2 пМ/л. Суммируя клинико-анамнестические данные, можно отметить, что наиболее часто устанавливаемыми факторами риска образования АСАТ являются ИРТ, затем варикоцеле, травмы яичек с и без орхита, крипторхизм Инфекции 57% Варикоцеле 31% Травмы мошонки Орхит Эндокринопатии Обструкция 14% 18% 1%3% 4% 6% Крипторхизм Идиопатическая (рис.9). Рис. 9. Распространенность различных этиологических факторов развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов, %. 24 Однако с наибольшей вероятностью к образованию АСАТ приводят травмы яичек, как сопровождающиеся, так и не сопровождающиеся орхитом, Травмы яичек без орхита 71,3% Орхит 67,4% Эпидидимит 50,0% Варикоцеле оперированное 45,6% Варикоцеле клиническое 41,9% Инфекции: Ch.t., U.u., M.h. 32,2% 0 30 60 90 120 150 180 Число мужчин и их доля с АСАТ MAR%IgG=0% MAR%IgG 1-49% MAR%IgG>=50% эпидидимит, варикоцеле, особенно оперированное, ИРТ (рис.10). Рис. 10. Риск развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов при различной андрологической патологии, число случаев и %. Врожденная обструкция или аплазия семявыносящих путей в виде отсутствия одного из vas deferens наблюдались в единичных случаях, однако, нельзя исключить, что уменьшение размеров придатков хотя бы с одной из сторон является следствием непроходимости rete testis в результате недоразвития. Травма спинного мозга, приводящая к анэякуляции, пассивный гомосексуализм, психогенная анэякуляция, перекрут и рак яичка, описанные как возможные причины образования АСАТ (Anderson M.J. et al., 1992; Acosta A.A., Kruger T.F., 1993; Mininberg D.T. et al., 1993; Urry R.L. et al., 1994; Sinsi A.A. et al., 1997; Almagor M.A. et al., 1998) в исследованной популяции не встречались. В целом, полученные данные свидетельствуют, что наиболее патогенетически значимым фактором в развитии иммунного бесплодия является повреждение ГТБ при механической или иной травме, в результате чего открывается доступ иммунокомпетентных клеток к аутоантигенам развивающихся сперматогенных клеток, происходит сенсибилизация, выработка АСАТ и перенос аутоиммунного процесса на контрлатеральный орган. Данная точка зрения стала общепринятой после классических экспериментальных иссле- 25 дований С.С.Райциной (1970,1985) и разделяется многими клиницистами и биологами (Тиктинский О.Л, Васильченко В.В., 1990, 1998: Курносова Т.Р. и соавт., 1994; Beagley K.W. et al., 1998; Srinivas M. et al., 1999). Это подтверждают наши собственные экспериментальные исследования на половоззрелых крысах-самцах (n=156), которым удаляли часть тестикулярной паренхимы. Показано, что без лечения в большинстве случаев (90%) происходит нарушение нормальной слоистой структуры собственной оболочки канальцев, лейко- и лимфоклеточная инфильтрация интерстиция, слущивание незрелых сперматогенных клеток в просвет, разрастание соединительной ткани и, в конечном счете, атрофия органа с утратой сперматогенной и, частично, андрогенпродуцирующей функции. В то же время клинически наиболее частым фактором, приводящим к выработке АСАТ, являются инфекции. Это согласуются с данными исследований А.Hinting et al. (1996), D.A.Gubin et al. (1998), F.H.Comhaire et al. (1999), Д.А.Бондарева и соавт. (2000), в которых было показано, что между предшествовавшими сексуально-передаваемыми инфекциями и наличием АСАТ существует достоверная корреляция, и наличие в анамнезе инфекций существенно увеличивает риск развития бесплодия. Вероятным механизмом образования АСАТ на фоне воспалительного процесса является способность многих бактерий, вирусов и грибов прикрепляться к мембране сперматозоидов. Известно, что Mycoplasma genitalium и Ureaplasma urealyticum, прикрепившиеся к головке и средней части сперматозоидов, негативно влияют ни их подвижность (Taylor-Robinson D., 1995) и оплодотворение яйцеклетки in vitro (Busolo F. et al., 1985). Мы разделяем мнение S.Mazumdar и A.S.Levine (1998), что эти «частички» в дальнейшем могут служить как антигены или гаптены, запуская аутоиммунные реакции. Об этом свидетельствуют в частности наши данные о том, что излечение микоплазмоза приводит к резкому снижению (5-12 раз) количества АСАТ на сперматозоидах, и данные о наличии перекрестных реакций между антигенами сперматозоидов и Mycoplasma hominis in vitro (Mathur S. et al., 1985). Учитывая, что присутствие Chlamydia trachomatis сопровождается выраженным ухудшением количественных показателей спермограммы, что сохраняется после излечения от инфекций, можно обосновано предположить, что хламидиоз, наоборот, приводит к инфекционно-опосредованному повреждению ГТБ. Поскольку АСАТ имеются только у 1/3 мужчин с ИРТ, очевидно, существуют дополнительные факторы, определяющие развитие аутоиммунного 26 процесса на фоне ИРТ и других неблагоприятных факторов. Это требует учета комплекса иммунологических и эндокринных реакций, что являлось предметом специального исследования. Корреляционный анализ и сравнение средних величин по группам с различными уровнями АСАТ показали (приложение 8-11), что для мужчин с АСАТ характерно увеличение содержания в крови интерферонов (ИФН) (P<0,05), НК-клеток (P<0,01), В-лимфоцитов (P<0,05), Т-супрессоров/ цитотоксических лимфоцитов (P<0,01) и, наоборот, уменьшение содержания Тлимфоцитов (P<0,01) и Т-хелперов, в частности (P<0,01). Обнаруженное увеличение содержания НК- и В-лимфоциов у данной группы мужчин согласуется с литературными данными (Чернышов В.П., 1979; Bizzarro A. et al., 1987; Barrat C.L. et al., 1990; Lin J. et al., 1993). Существуют различия (P<0,05) между группами в концентрации иммуноглобулинов (приложение 12). Оценка активности макрофагов in vitro при опсонизации зимозана показала увеличение продукции активных метаболитов кислорода при существенном снижении индуцированных уровней (P<0,05), что, очевидно, является причиной повышения содержания свободных радикалов кислорода в сперме, описанное ранее. Оказалось, что взаимосвязь некоторых показателей системного иммунитета (индуцированные уровни ИФН, количество Т-лимфоцитов и Т-хелперов и др.) с процентом сперматозоидов, покрытых IgG, IgA и IgM, становится статистически значимой только в присутствии ИРТ. Принципиально важным мы считаем установление факта (рис. 11), что у мужчин с АСАТ при наличии в репродуктивном тракте инфекций, таких как Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, оказались существенно повышеными индуцированные in vitro уровни /- и -ИФН (Pt<0,05-0,01). Поскольку частота встречаемости различных ИРТ в выделенных группах примерно одинакова (приложение 13), наблюдаемые различия следует считать обусловленными присутствием АСАТ. Корреляционный анализ подтвердил (приложение 14) существование в присутствии Chlamydia trachomatis взаимосвязи между индуцированными in vitro уровнями /-ИФН (P<0,05) и -ИФН (P<0,01) и АСАТ (MAR%IgG). Поскольку ИФН играет важную роль в развитии иммунного ответа на любой инфекционный агент, стимулируя в первую очередь экспрессию антигенов HLA на всех клетках (Ершов Ф.И., 1996; Лолормладший Г. и соавт., 2000), гиперпродукция ИФН в ответ на инфекционный возбудитель у данной группы мужчин может нарушить иммунопривилегиро- 27 ванность мужских половых гамет за счет стимуляции экспрессии их HLAантигенов и/или стимулируя экспрессию антигенов HLA на макрофагах и соматических ангигенпрезентирующих клетках, способствуя, таким образом, узнаванию антигенов сперматозоидов Т-хелперами. 30 ИФН крови 25 **# 20 ИФН спонт. *# Ед /л 15 **# ИФН индуц. альфа/бета 10 5 ИФН индуц. гамма 0 0% 10-49% 50-99% 100% MAR%IgG Рис.11. Интерфероновый статус у бесплодных мужчин с ИРТ при различных значениях MAR%IgG. Примечание: * - различия между группами с различными уровнями АСАТ достоверны с P<0,05 ** - с P<0,01, # - различия между пациентами с АСАТ и контрольной группой достоверны. 40 Сывороточный ЕД/л 30 * 20 * * **# ** ** *** 10 Спонтанный *** * *** *** Альфа/беттаиндуц. *# * Гамма-индуц. 0 0% (n=21) <10% (n=11) 10-49% (n=20) 50-99% (n=16) 100% (n=26) MAR%IgG Рис.12. Концентрация ИФН в крови, спонтанная и индуцированная вирусом Ньюкасла и ФГА продкуция ИФН лейкоцитами in vitro в зависимости от активности антиспермального иммунитета, МЕ/л. Примечания: * - различия между группами с АСАТ и контрольной группой достоверны с P<0,05; *** - с P<0,001; # - различия между группами с АСАТ достоверны с P<0,05. 28 Повышенные уровни ИФН в крови имелись и в отсутствии ИРТ (рис.12). Возможно, имеется наследственная предрасположенность к развитию аутоиммунных реакций против сперматозоидов, поскольку по данным литературы известно, что выработка АСАТ ассоциирована с несколькими кластерами HLA-I и II (Сизякин Д.В.,Коган М.И.,1996; Low H. et al.,1983; Moncharmont P. et al., 1989; Vazquez-Levin М.Н. et al.,1994; A.E.Omu et al.,1996,1999), хотя некоторые авторы это отрицают (Coulam C.B., Stern J.J.,1992). О патогенетической роли ИФН в развитии обусловленного АСАТ бесплодия у женщин сообщали S.S.Witkin et al. (1988) и M.B.Parr, E.L.Parr (2000). Известна роль ИФН и в развитии соматических аутоиммунных заболеваний, например тиреоидите Хасимото (Лолор-младший Г. и соавт., 2000; Ройт А. и соавт., 2000). Обнаружено так же, что изменения параметров системного иммунитета зависят не только от активности аутоиммунного процесса, традиционно оцениваемого по доле MAR- и ПЦМ-позитивных сперматозоидов, но и от количества АСАТ на каждой клетке, их реорганизации с образованием скоплений и удаления с поверхности мембраны. Оказалось, что при равном проценте MAR-позитивных клеток, покрытых IgG (>50%), более сильное свечение образцов, интерпретируемое как большее число АСАТ на одну клетку, сопровождается существенным снижением (Pt<0,05-0,01) концентрации всех лимфоцитов, НК- и В-клеток в периферической крови по сравнению с меньшей плотностью АСАТ (рис.13). 2,5 Лейкоциты спермы Лимфоциты крови 2 ** Т-лимфоциты 1,5 Т-хелперы Млн/мл 1 Т-супрессоры/ цитотоксич. # * НК-клетки 0,5 * * В-лимфоциты 0 АСАТ - 0% плотность IgA <90 ед. плотность IgA >=90 ед. Рис.13. Концентрация лейкоцитов в сперме, лимфоцитов и их различных популяций в периферической крови у мужчин MAR%IgG>50% без ИРТ в зависимости от плотности АСАТ класса IgA на сперматозоидах. Примечания: * - различия между группами с АСАТ достоверны с P<0,05, ** - с P<0,01; # - различия между контрольной и группами с АСАТ достоверны с P<0,05. 29 Снижены (Pt<0,05-0,01) при этом и индуцированные уровни ИФН (рис.14). Сравнение различных классов иммуноглобулинов показало, что в наибольшей степени такие изменения коррелируют с количеством АСАТ класса IgA. 40 ИФН крови 30 ИФН спонт. Ед/л ## 20 ## *## **## ИФН индуц. альфа/бетта 10 ИФН индуц. Гамма 0 АСАТ - 0% плотность IgA <90 ед. плотность IgA >=90 ед. Рис. 14. Содержание ИФН в сыворотке крови, спонтанная и индуцированная вирусом Ньюкасла и ФГА активность лейкоцитов in vitro у мужчин с иммунологическим бесплодием (MAR%IgG>50%) при отсутствии ИРТ в зависимости от плотности АСАТ класса IgA на сперматозоидах. Примечания: * - различия между группами с АСАТ достоверны с P<0,05, ** - с P<0,01; # - различия между контрольной и группами с АСАТ достоверны с P<0,05, ## - с P<0,01. Установлено, что одним из механизмов такой иммуносупрессии является увеличение в 1,3 раза содержания в крови мужчин с АСАТ кортизола (P<0,05) и почти в 3 раза свободного тестостерона (P<0,01). Показано (приложение 15), что повышение концентрации свободного Т более выражено у пациентов с нарушениями сперматогенеза в виде олигозооспермии и обеспечивается главным образом за счет уменьшения содержания в крови СГСГ. Содержание общего Т и гонадотропинов при этом, как было уже описано ранее (StanwellSmith R. et al., 1985; Fisch H. et al., 1989), не отличается от аналогичных групп без АСАТ. Возможно, с увеличением концентрации свободного Т связано повышение секреции ПСА и размера простаты у мужчин с иммунологическим фактором бесплодия. С другой стороны, это может быть следствием неспецифического иммунного воспаления, вызванного присутствием АСАТ-позитивных сперматозоидов и перекрестных реакций с тканями железы (Чернышов В.П., 30 1990). Учитывая описанную выше сложность патогенеза иммунного бесплодия, были предприняты попытки терапии данного заболевания с использованием различных групп препаратов. С целью оценить возможность сохранения сперматогенеза после травмы яичек, которая дает наиболее высокий риск развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов, было выполнено специальное экспериментальное исследование на половозрелых крысах-самцах (n=165), которым выполняли дозированную резекцию яичек по С.С.Райциной (1970). Учитывая ключевую роль сохранения целостности структур ГТБ в предотвращении аутоиммунного процесса в яичке, были использованы препараты, способные стимулировать естественные регенераторные способности и метаболизм клеток: инозингипоксантин-рибозид (Рибоксин) и липоевую кислоту (Липамид) (Билич Г.Л. и соавт., 1979; Машковский М.Д., 1994). Было показано (приложение 16), что в отличие от наблюдающейся обычно атрофии яичка (Райцина С.С., 1970, 1985; Чичинадзе Н.Е., 1979), введение рибоксина в пред- и послеоперационном периоде способствует уменьшению острого отека и его более быстрой ликвидации, менее выраженной клеточной инфильтрации и предотвращению распространения ее на нетравмированные участки, сохранению структуры собственной оболочки семенного канальца и системы специфических контактов клеток Сертоли, что, в конечном счете, в ¾ случаев предотвращает развитие посттравматической атрофии органа, обеспечивая более полноценную морфологическую, а, следовательно, и функциональную перестройку оставшегося яичка. Электронномикроскопические исследования показывают, что в сустентоцитах происходит новообразование органелл взамен разрушенных и внутриклеточная компенсаторная гиперплазия ультраструктур, лежащая в основе гипертрофии клеток. Происходит компенсаторный рост объема и числа клеток интерстиция, в первую очередь эндокриноцитов, что позволяет говорить о репаративной регенерации эндокринной части семенника. Через 6 мес после операции 44% леченных животных были фертильными при 0% в контрольно-оперированной группе. Введение липоевой кислоты на ранних сроках также способствует сохранению структуры органа (приложение 17), однако к 48 сут происходит опустошение канальцев, из них исчезают поздние генерации клеток, или наблюдается соединительнотканное перерождение органа. Таким образом, полученные данные позволяют считать использование 31 неспецифических стимуляторов регенерации (Рибоксин) в комплексе со стимуляторами внутриклеточного метаболизма этиотропным способом терапии иммуноргического бесподия, снижающего риск развития аутоиммунного процесса. Аналогично, излечение микоплазмоза, как было показано выше, также способствует существенному снижению количества АСАТ на сперматозоидах, что сопровождается улучшением количественных показателей спермограммы. Поэтому антибиотикотерапия при лечении таких ИРТ может считаться этиотропной терапией. Однако, эффективность лечения хламидиоза у мужчин с АСАТ с использованием антибиотиков (тетрациклины, макролиды, хинолоны) в решающей степени зависит от активности аутоиммунного про100 100 100 100 MAR IgG (%) 80 80 80 60 60 60 60 MAR IgA (%) 40 40 40 ИКС (ед.) 20 20 % 80 40 20 * 20 Улучшение (%) ** * *** 1 мес 2 мес 0 0 До ** 0 0 До 1 мес 2 мес цесса (рис.15) и только при MAR%IgG<58% приводит к снижению количества АСАТ на сперматозоидах с вероятностью 0,95. Т.е. в случаях грубых нарушений сперматогенеза в результате инфекционно-опосредованного повреждения ГТБ антибиотикотерапия оказывается низкоэффективной. Рис.15. Изменения количества прогрессивно-подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов в эякуляте (ИКС) и количества АСАТ (MAR%) при различной активности аутоиммунных реакций. Традиционной терапией заболеваний, в которых предполагается аутоиммунный механизм развития, являются кортикостероиды. Данные литературы об эффективности применения различных кортикостероидов у мужчин с иммунным бесплодием противоречивы (Almeida M. et al., 1993; Ohl D.A., Naz R.K., 1995; Bates C.A., 1997; Rasanen M. et al., 1994). Нами было проведено сравнение двух наиболее часто применяемых схем терапии: Преднизолон по 32 40 мг/сут (n=20) в фолликулярную фазу цикла супруги и Метилпреднизолон по 96 мг/сут (n=20) в виде пульс-терапии. Показано, что за трехмесячный период приема Преднизолона отсутствуют существенные изменения количества АСАТ-позитивных сперматозоидов и показателей спермограммы (приложение 18), у 2/3 больных наблюдаются побочные явления, требующие отмены препарата, беременность наступила у одной пары (5%). На фоне применения метилпреднизолона (приложение 19) снижение АСАТ (IgG) более выражено (P<0,05), индекс качества спермы практически не меняется, побочные эффекты были сходными, наступили 2 беременности (10%). Многофакторный анализ результатов обследования всей группы пациентов, получающих кортикостероиды показал, что улучшение в течении аутоиммунного процесса имеет место только у мужчин с исходно повышенным (>0,5 млн/мл) содержанием 100 1 1 80 0,8 0,8 60 0,6 0,6 40 0,4 0,4 20 0,2 0,2 0 0 MAR IgG (%) MAR IgA (%) ИКС (ед.) Лейкоц. (млн/мл) Тренд IgG Тренд IgA 0 Исх 1 мес 2 мес Исх 1 мес 2 мес лейкоцитов в сперме, и изменение количества АСАТ-позитивных сперматозоидов прямо связано с содержанием лейкоцитов (рис.16). Наоборот, при исходно низкой концентрации лейкоцитов какая-либо позитивная динамика отсутствует. Рис.16. Влияние терапии кортикостероидами на качество эякулята и количество АСАТ-позитивных сперматозоидов в зависимости от концентрации в сперме лейкоцитов. Обнадеживающие результаты получены нами при использовании энзимов (приложение 20). Был известен положительный опыт применения протеолитических ферментов при некоторых аутоиммунных заболеваниях соматических органов (Мазуров В.И. и соавт.,1996; Steffen C., Menzel E.J.,1983; Menzel E.J.,Runge S.,1990; Ransberger K.,1995). Нами показано, что у всех больных, получающих комплекс протеолитических ферментов (пан- 33 креатин, трипсин, химотрипсин, бромелайн, папаин) в суммарной суточной дозе 35-90 мг/кг (n=36) происходило уменьшение вязкости спермы, у 3/4 мужчин – до 72% улучшалась подвижность, у 2/3 - на 10-230% выросла концентрация сперматозоидов. Снижение числа АСАТ-позитивных сперматозоидов произошло у 82% мужчин. Наблюдаемые изменения зависели от исходного уровня АСАТ: при доле АСАТ-позитивных сперматозоидов от 10 до 40% происходило снижение MAR%IgG на 23%, IgA – на 31%, ИКС увеличился на 51%; при доле АСАТ-позитивных сперматозоидов 41-99% снижение MAR% было менее выражено - 24 и 27% соответственно для IgG и IgA, а качество спермы не улучшалось. Когда все сперматозоиды были покрыты антителами MAR%IgG на фоне терапии снижался на 0-100% (в среденм на 19 ед., P<0,05), но IgA только на 1,2%, индекс качества спермы при этом уменьшился на 9,9% (P<0,05). С целью добиться улучшения качества спермы на фоне снижения значений АСАТ при высоких исходных значениях MAR%IgG, мы применили комбинацию протеолитических ферментов с инозин-гипоксантин-рибозидом (Рибоксином). Ранее нами было показано, что рибоксин стимулирует сперматогенную и андрогенпродуцирующую функцию гонад (Патент №2040258 от 27.07.1995), в основе чего лежит способность препарата стимулировать нуклеозависимый синтез белка, улучшать микроциркуляцию и повышать оксигенацию тканей (Билич Г.Л., Лепеха Л.Н.,1993; Машковский М.А.,1999; Yabe Y, Yoshimura S.,1981). Полученные данные свидетельствуют, что сочетание энзимов с рибоксином (приложение 21) позволяет получить существенное снижение процента MAR-позитивных сперматозоидов (-18,6%, Pt<0,01) при росте количественных показателей спермограммы (+46,7%, Pt<0,01) у мужчин с умеренным аутоиммунным процессом (MAR%IgG<50%), в то время как при использовании только энзимов происходит улучшение качества спермы (+32,3%, Pt<0,05), но процент подвижных сперматозоидов, покрытых IgG, не меняется (-0,8%). В группе пациентов с высокой активностью аутоиммунных реакций (MAR%IgG>50%) при использовании ферментов с рибоксином происходит снижение доли MAR-позитивных сперматозоидов (20,9%, Pt<0,05) и одновременно некоторый рост показателей качества спермы (+21,8%, Pt>0,05), в то время как при применении только энзимов снижение значений АСАТ (-23,5%, Pt<0,05) сопровождается существенным уменьшением концентрации сперматозоидов и общего ИКС (-44,7%, Pt<0,05). В целом, предложенная нами системная энзимотерапия мужского им- 34 мунного бесплодия способствует освобождению сперматозоидов от АСАТ, что раньше было достигнуто только in vitro (Bronson R.A., Cooper G.W.,1987, 1988; Kutteh W.H. et al.,1994, 1995; Katsoff D. et al.,1995), и уменьшает воспалительные реакции, однако сам процесс антителообразования, очевидно, не затрагивает, поскольку не происходит уменьшение общего количества АСАТпозитивных клеток и количества антител на каждом сперматозоиде. Наиболее вероятно, что ферменты влияют на регуляцию адгезивных рецепторов, индуцирующих воспаление. Известно (Ройт А. и соавт.,2000; Kokron E.A. et al.,1992; Kleef R.,Bovbjerg D.,1996; van Schaik W.,1995), что адгезивные молекулы играют ключевую роль на всех этапах развития иммунной реакции. Другим новым направлением в консервативном лечении иммунного мужского бесплодия следует считать применение продуктов фетального происхождения. Известно, что ряд белков, в значительном количестве вырабатываемых плодом и плацентой в период беременности, таких как альфафетопротеин, SP1 (ТБГ), SP3 (альфа2-ГП), РР12 (ПАМГ), РР14 (АМГФ) и др., обеспечивают иммуносупрессию, необходимую для сохранения и нормального протекания беременности (Петров Р.В., Сотникова Н.Ю.,1983; Горлина Н.К. и соавт.,1983; Петрунин Д.Д. и соавт., 1983, 1988, 1996; Татаринов Ю.С. и соавт.,1985; Гулянский Л.Н. и соавт., 1996; Говалло В.И.,1996; Bolton A.E. et al.,1987; Pockley A.G. et al.,1988; Messner R.P.,1997 и др.), их недостаток приводит к спонтанным абортам (Говалло В.И.,1994; Чернышов В.П.,Теличкун С.В.,1996; Clark D.A. et al.,1984). Ранее было показано (Шумаков В.И. и соавт.,1995), что применение трансплантации фетальных тканей (ТФТ) при инсулинзависимом сахарном диабете способствует восстановлению функции собственных бета-клеток. Клиническая апробация аллотрансплантации фетальных тканей (ТФТ) при лечении мужчин с иммунологическим фактором бесплодия (n=69), показала, что у 84% пациентов происходит снижение процента сперматозоидов, покрытых АСАТ (MAR%IgG), что в среднем достигает -34,7% для IgG и 53,7% - для IgA (P<0,05-0,01). При этом происходит улучшение количественных показателей спермограммы: через 6 мес. после ТФТ количество прогрессивно-подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов увеличивается в 2,74 раза (P<0,01). Содержание в крови гонадотропинов (ЛГ, ФСГ, пролактин), половых стероидов (тестостерон и эстрадиол) и андрогенсвязывающего белка через 0,5-3 мес после ТФТ меняется несущественно, следовательно, наблюдаемые изменения являются результатом иных негор- 35 мональных влияний. Беременность наступила в 26% и 18% случаев при использовании соответственно тканей генитальных- и негенитальных органов (P<0,01-0,001 по сравнению с АСАТ-позитивной группой без лечения). Исследования in vitro показали иммуносупрессивное действие экстрактов фетальных тканей, в частности, более чем двухкратное снижение активности бласттрансформации лимфоцитов и продукции лейкоцитами ИЛ-1 в культуре (P<0,01). Наличие иммуносупресии in vivo показано при исследовании количества и соотношения Т- и В-клеток, содержания иммуноглобулинов и интерферонов в периферической крови: уже через 2 нед после ТФТ происходило уменьшение доли Т-хелперов (Pt<0,05) и содержание в сыворотке крови интерферонов (Pt<0,05); способность лейкоцитов реагировать на экзогенные индукторы in vitro, наоборот, повышалась (Pt<0,05). Эффект ТФТ обратим, и в 75% случаев показатели спермограммы и АСАТ через 1 год возвращаются к исходным значениям (рис.17). 80 60 MAR IgG (%) MAR IgA (%) 40 ИКС (ед.) Рис.17. Динамика основных параметров спермограммы и доли АСАТ-позитивных сперматозоидов после трансплантации фетальных тканей (n=67) 20 Конц. (млн/мл) 0 Патол. форм (%) 12 6 Подв. А+В (%) 3 1 0,5 Мес Исх Обобщенные данные о лабораторной и клинической эффективности различных способов консервативной терапии отражены в таблице 1 и на рис. 18. Как видно из представленных данных, в настоящее время наилучших результатов удается добиться при использовании комплекса фетальных белков в виде ТФТ, минимальны при этом и побочные эффекты. Таблица 1 Изменения параметров спермограммы у мужчин с иммунным бесплодием при использовании различных способов консервативной терапии, ед. 36 Энзимотерапия Энзимы и Рибоксин Метилпреднизолон Преднизолон -19,3 +9,9 +10,4 -8,9 -9,9 -7,3 +6,7 +7,4 +17,2 +20,3 +5,5 +1,7 +12,7 +32,0 +10,8 -4,7 -19,5 -20,5 -24,7 -28,4 -12,4 -12,7 -17,9 +17,5 26*** ТФТ репрод. орг-в (n=39) ТФТ не репрод. орг.(n=17) 18** Энзимы и Рибоксин (n=47) 17*** Сист.энзимотер-я (n=38) 16*** Метилпреднизолон (n=20) 10 Альфетин (n=18) 6 Преднизолон (n=20) 5 2 Без лечения 0 5 10 15 20 25 30 % Альфетин -22,1 +3,3 -8,6 -19,5 -9,5 +7,5 Рис. 18. Частота наступления беременности от пациентов с АСАТ в зависимости от способа консервативной терапии, %. Нужно помнить, что различные способы лечения не исключают друг друга. Фармакологическую терапию следует сочетать с внутриматочной инсеминацией, эффективность которой может быть повышена новыми методами подготовки спермы. В наиболее сложных случаях, когда имеется посттравматическая атрофия яичек, концентрация сперматозоидов меньше 5 млн/мл, уровни гонадотропинов в 1,5 раз выше нормы, или когда присутствуют дополнительные факторы бесплодия, следует рассматривать возможности ЭКО и ПЭ (ICSI) с самого начала. Выводы 1. АСАТ в эякуляте присутствуют у 18% мужчин репродуктивного возраста, причем у половины из них более 50% подвижных сперматозоидов покрыты антителами класса IgG. Наблюдается абсолютный и относительный рост доли данной аутоиммунной патологии в структуре мужского бесплодия в последние годы. 37 2. Наличие антиспермальных антител в сперме приводит к повышению вероятности нарушения фертильности пропорционально количеству подвижных сперматозоидов, покрытых IgG и IgA. 3. У мужчин с аутоиммунными реакциями против сперматозоидов наблюдается снижение количественных показателей спермограммы, обусловленное нарушениями сперматогенеза, фагоцитозом АСАТ-позитивных сперматозоидов и повреждающим действием свободных радикалов кислорода, интерферонов и лизосомальных ферментов, нарушена акросомальная реакция с преобладанием преждевременного выброса ферментов, затруднено проникновение сперматозоидов в цервикальную слизь и снижена вероятность оплодотворения яйцеклетки in vitro. Нарушения зависят преимущественно от АСАТ классов IgM и IgG. 4. Причинами появления антиспермальных антител являются: субклинические травмы яичек (14% случаев), орхит (6%), эпидидимит (2%), обтурация семявыносящего тракта (3%), варикоцеле, в том числе оперированное (31%), инфекции репродуктивного тракта (ИРТ) (57%); риск развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов при этом составляет: 71.3, 67.4, 50.0, 50.0, 41.9 и 32.2% соответственно. 5. Развитие аутоиммунных реакций против сперматозоидов происходит в результате нарушения целостности гемато-тестикулярного барьера и перекрестных реакций с микроорганизмами, способными адгезироваться на мембранах сперматозоидов. Фактором развития аутоиммунных реакций является повышенная продукция интерферонов в ответ на эндо- и экзогенные индукторы, в т.ч. инфекции репродуктивного тракта: в присутствии Chlamydia trachomatis имеется прямая зависимость между MAR%IgG и уровнями , и -ИФН, индуцированными in vitro вирусом Ньюкасла и ФГА. 6. Развитие аутоиммунных реакций против сперматозоидов сопровождается увеличением доли и количества В-лимфоцитов (CD19), НК-клеток (CD16) и Т-супрессоров/цитотоксических (CD8), концентрации лейкоцитов в сперме, а так же повышением содержания интерферонов и активных радикалов кислорода. Высокая активность аутоиммунного процесса, признаком чего является большое (>80-90 ед) количество АСАТ на каждом сперматозоиде, характеризуется, наоборот, снижением количества Т- , В- и НК-клеток и фагоцитов, соотношение CD4/CD8 уменьшается до 1,1; снижаются индуцированные уровни ИФН. Наблюдаемая иммуносупрессия в наибольшей степени связана с АСАТ класса IgA и их количеством на сперматозоидах. 38 7. Для мужчин с АСАТ по сравнению с бесплодными без АСАТ характерно увеличение содержания в крови простат-специфического антигена, кортизола и свободного тестостерона. Повышение содержания свободного тестостерона обусловлено, главным образом, уменьшением концентрации секс-гормонсвязывающего глобулина (СГСГ). Наоборот, избыточная продукция СГСТ и связанное с этим значительное снижение содержания свободного Т характерно для экскреторного бесплодия с наличием АСАТ. 8. Сохранение структуры и функции яичка после его травмы или дозированной резекции возможно при использовании стимуляторов регенерации (инозин-гипоксантин-рибозид) и энергетического обмена (липоевая кислота), которые способствуют сохранению целостности ГТБ и стимулируют регенерационную и компенсаторную гипертрофию паренхимы, что проявляется в гипертрофии и пролиферации эндокриноцитов, восстановлении эндокринной функции. 9. Эффективность антибиотикотерапии обратно пропорциональна активности аутоиммунных реакций против сперматозоидов: после излечения хламидиоза снижение доли сперматозоидов, покрытых АСАТ, происходит в 85% случаев, когда исходно менее половины сперматозоидов покрыты АСАТ, и в 30% случаев, когда больше, при этом процент IgA-позитивных сперматозоидов уменьшается быстрее и в большей степени, чем IgG. Излечение микоплазмоза сопровождается уменьшением в 9-14 раз плотности АСАТ различных классов, без существенного снижения количества сперматозоидов, покрытых антителами. 10. Синтетические глюкокортикоиды Преднизолон и Метилпреднизолон не приводят к существенному улучшению качества спермы, обладают низкой ожидаемой эффективностью (5 и 10% беременностей соответственно) и имеют большое количество побочных эффектов, что делает нецелесообразным их применение при лечении мужского иммунологического бесплодия. Относительным показанием следует считать пиоспермию в отсутствии острых и субклинических ИРТ при концентрации сперматозоидов не менее 20 млн/мл и MAR%IgG от 40 до 99%. 11. Системная энзимотерапия способствует существенному снижению MAR%IgG и IgA (в среднем -20 и -13% соответственно), а в комбинации с инозин-гипоксантин-рибозидом - улучшению количественных показателей спермограммы (+32%), ожидаемая вероятность наступления беременностей 16-17%, низки (<10%) незначительно выраженные побочные эффекты 39 (диспепсия), что позволяет рекомендовать применение энзимов в качестве терапии первого уровня. 12. Наиболее эффективной терапией иммунологического бесплодия является использование продуктов фетального происхождения в виде трансплантации крупнодисперсной взвеси клеток, что приводит к снижению MAR%IgG и IgA (-34% и -53% соответственно) и улучшению качества спермы (+147%). Ожидаемая вероятность наступления беременностей составляет 26%, незначительные побочные эффекты наблюдаются менее чем у 5% мужчин. Положительный эффект данного способа лечения реализуется за счет уменьшения бласттрансформации лимфоцитов, продукции провоспалительных цитокинов и факторов роста. 13. Ведение мужчин репродуктивного возраста с иммунологическим фактором бесплодия предусматривает комплексное лечение, включающее устранение всех возможных этиопатогенетических факторов (инфекции репродуктивного тракта, варикоцеле, обтурация, перегревание и др.), снижение продукции АСАТ, удаление АСАТ, уже связанных со сперматозоидами, и вспомогательные репродуктивные технологии. Практические рекомендации Система ведения бесплодных мужчин с АСАТ предусматривает: клинико-лабораторное обследование до начала терапии; устранение всех этиопатогенетических факторов (обтурация, ИРТ, варикоцеле, перегревание и др.); консервативная терапия, направленная на снижение уровней АСАТ и улучшение количественных показателей спермограммы; ВРТ (при отсутствии успеха консервативной терапии). Клинико-лабораторное обследование больных с АСАТ должно включать: - определение доли подвижных сперматозоидов, покрытых АСАТ классов IgG и IgA методом MAR или IBT; - определение доли сперматозоидов покрытых АСАТ IgG, IgA, IgM и количества антител на каждом сперматозоиде методом ПЦМ; - исключение субклинических ИРТ, таких как Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, ВПГ и др. по материалу мазка из уретры и сперме методами ПЦР, ИФА, культуры клеток, определения антихламидийных АСАТ; 40 - исследование содержания андрогенов, эстрогенов, ЛГ, ФСГ, СГСГ, К с вычислением индекса свободного андрогена; - определение сывороточных и спермальных, а так же спонтанных и индуцированных вирусом Ньюкасла и ФГА in vitro уровней и -ИФН; - определение доли и концентрации Т-, В- и НК-лимфоцитов в периферической крови; - определение содержания свободных радикалов кислорода. Лечение иммунологического бесплодия должно быть поэтапным и комплексным, учитывать общие принципы лечения бесплодных пар, адекватность обследования супруги, включать меры профилактики, использовать возможности этиотропной, патогенетической и симптоматической терапии. Общие принципы лечения иммунного бесплодия • обязательна работа с парой; • адекватность обследования жены; • продолжительность обследования не должна превышать 2-х месяцев, последующее лечение - 2-х лет; • устранение всех этиопатогенетических факторов (варикоцеле, обтурация, урогенитальные инфекции, сексуальные дисфункции и др.) до начала специфической терапии; • регулярные с интервалом 1-2 мес. исследования эякулята, уровней АСАТ, гормонального и иммунного статусов для корректировки специфической терапии; • использование презерватива за исключением специально оговоренных случаев; • при необходимости сочетание фармакологической терапии с репродуктивными технологиями низкого уровня: отмывкой и ИОСС; • при отсутствии беременности в течение 1 года комплексной терапии выполнение ICSI; • При отсутствии успеха при ICSI или невозможности ее выполнения – ИОСД. Минимальные требования к обследованию супруги: график базальной температуры; инфекционный скрининг; гистеросальпингография; посткоитальный тест (проба Симса/Гуннера или Шуварского); тесты на предметном стекле (проба Курцрока/Мюллера); 41 определение женских АСАТ в цервикальной слизи. Профилактика иммунного бесплодия: избежание травм яичек; раннее хирургическое лечение варикоцеле; своевременное лечение хламидиоза, микоплазмоза, ВПГ и других ИРТ; минимальная травматизация элементов семенного канатика при операциях по поводу паховых и пахово-мошоночных грыж; раннее хирургическое лечение крипторхизма; микрохирургическое устранение обтурации; избежание перегревания; исключение гомосексуальных контактов с эякуляцией per rectum; применение экзогенных интерферонов и индукторов интерферонов только по жизненным показаниям; определение групп риска по HLA. Этиотропная терапия: использование фармакологических стимуляторов регенерации для сохранения и восстановления целостности гемато-тестикулярного барьера; использование комплексов пептидов (факторы роста, цитокины и др.) фетального происхождения в виде трансплантации крупнодисперсной взвеси клеток плодов; антибиотикотерапия Mycoplasma hominis и других ИРТ, способных адгезироваться к плазматической мембране и вызывать перекрестные реакции с антигенами сперматозоидов. Патогенетическая терапия: немедленная ревизия мошонки при травме; восстановление проходимости семявыносящего тракта; комплексное лечение острого орхита; системная энзимотерапия; применение экзогенных андрогенов; иммуносупрессивная терапия глюкокортикоидами; иммуносупрессивная терапия с использованием фетальных белков плацентарного происхождения (РР12, РР14 и др.) Симптоматическая терапия: отмывка сперматозоидов специальными средами; внутриматочная искусственная инсеминация спермой супруга (ИОСС); ЭКО и ПЭ; 42 ICSI. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Возможности фармакологической регуляции мужской гипофизарногонадной системы и профилактики атрофии единственного яичка после его резекции. // Современные проблемы регенерации. /Под ред. Г.Л.Билич и Л.Н. Лепеха. - Грозный, 1993.- С.58-73 (соавт.: Билич Г.Л., Чичинадзе Н.К.). 2. Возможности клинической трансплантации яичек как органа и как ткани. // Бюлл. эксперим. бил. и медицины.- 1994.- Т.117,№4.- С.400-405 (соавт.: Сухих Г.Т., Молнар Е.М.). 3. Способ предотвращения атрофии яичка. Патент № 2019177 от 15.09.1994 (соавт.: Чичинадзе Н.К., Билич Г.Л.). 4. Способ лечения урогенитальной хламидийной, уреаплазменной и микоплазменной инфекции. Патент № 2137483 от 02.08.95 (соавт.: Малинина Э.В., Сухих Г.Т., Кулаков В.И.). 5. Способ стимуляции сперматогенной и андрогенпродуцирующей функции мужских половых желез. Патент № 2040258 от 27.07.1995 (соавт.: Чичинадзе Н.К., Билич Г.Л.). 6. Asymptomatic urogenital infection in man in infertile pairs: work experience of SC OGP.// II Int. Congress on Andrology in Turkey.- 1995.- P.86 (соавт.: Zdanov A.V., Faizullin L.Z., Sukhih G.T., Kulakov V.I.). 7. Клиническая трансплантация фетальных тканей при мужском бесплодии. // Трансплантация фетальных тканей человека. / Под ред. Г.Т. Сухих, А.Н.Ерина.- М.,1996.- С.69-72 (соавт.: Билич Г.Л., Николаева М.А.). 8. Клиническая трансплантация фетальных тканей человека при лечении мужского бесплодия. // Морфология. - 1996.- №2.- С.37 (соавт.: Билич Г.Л., Сухих Г.Т.). 9. Терапевтическое действие Вобэнзима при комплексном лечении урогенитальных хламидиозов и микоплазмозов. // Материалы II Междун. конф. по Системной энзимотерапии.- М., 1996.- С.59-64 (соавт.: Сухих Г.Т., Малинина Э.В., Логинова Н.С., Жданов А.В., Бурменская О.В., Файзулин Л.З.). 10. Применение Вобэнзима и других протеолитивеских ферментов при лечении урогенитальных хламидиозов, мико- и уреаплазмозов у мужчин. // Материалы 1 Всероссийской научно-практич. конф. “Применение ПЦР для 43 диагностики инфекционных заболеваний”.- Сочи, 1996.- С.23-25 (соавт.: Жданов А.В., Бурменская О.В., Файзулин Л.З., Сухих Г.Т.). 11. Proteolyticenzimes (Wobenzime) enhance the enfficiency of antibiotic treatment of Chlamydia trachomatis.// Materials of III European Chlamydia Meeting.- Vienna, 1996.- P.294 (соавт.: Zdanov A.V., Malinina E.V., Burmenskaja O.V., Faizullin L.Z., Sukhih G.T., Kulakov V.I.). 12. The new methods for detection and therapy of urogenital chlamydiosis.// International Congress “Immunology of reproduction”.- Kiev, 1996.- P.78 (соавт.: Zdanov A.V., Malinina E.V., Loginova N.S., Faizullin L.Z., Sukhih G.T., Kulakov V.I.). 13. Частота выявления Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis методом полимеразной цепной реакции при заболеваниях репродуктивного тракта мужчин и женщин. // Материалы 1 Всероссийской научно-практич. конф. “Применение ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний”.- Сочи, 1996.- С.33-36 (соавт.: Жданов А.В., Бурменская О.В., Малинина Э.В., Файзулин Л.З., Кулаков В.И., Сухих Г.Т.). 14. Способ сохранения сперматогенеза после оперативных вмешательств на яичках. Патент № 2099053 от 20.12.1997 (соавт.: Билич Г.Л.). 15. Способ лечения мужского секреторного бесплодия. Патент № 2089188 от 10.09.1997 (соавт.: Билич Г.Л., Сухих Г.Т.). 16. The use of Wobenzim to facilitate interferon synthesis in the treatment of chronic urogenital chlamydiosis.// Int. J. Immunotherapy.- 1997.- V.13,№3-4.P.131-133 (соавт.: Sukhih G.T., Loginova N.S., Faizullin L.Z., Zdanov A.V., Malinina E.V.). 17. Способ фармакологического лечения аутоиммунного мужского бесплодия. Патент № 2149021 от 07.05.1998 (соавт.: Николаева М.А., Сухих Г.Т.). 18. Способ диагностики урогенитальных хламидиозов, микоплазмозов и уреаплазмозов. Патент № 2117943 от 20.08.1998 (соавт.: Малинина Э.В., Сухих Г.Т.). 19. Способ лечения аутоиммунного мужского бесплодия. Патент № 2155596 от 24.07.1998 (соавт.: Сухих Г.Т., Кулаков В.И.). 20. Interaction of the live antisperm antibodis-positiv spermatozoa with antibodis to IgG results in appearence of spermatozoa subpopulation without antisperm antibodies on their surfase.// Andrology in the Ninties: Modern ART in the 2000`s.- Belgium, 1998.- P.60 (соавт.: Nikolaeva M.A., Korotkova I.V., 44 Golubeva E.L., Sukhih G.T.). 21. Prednizalon and proteolytic enzymes in treatment of male autoimmune infertility.// AJRI.- 1998.- V.40,№4.- P.259-260 (соавт.: Nikolaeva M.A., Sukhikh G.T.). 22. The subpopulation analysis of peripheral blood lymphocytes in patients with urogenital chlamydiosis.// Period. biol.- 1998.- V.100,№3.- P.67 (соавт.: Zdanov A.V., Faizullin L.Z., Matveeva N.K., Vanko L.V., Malinina E.V., Sukhih G.T.). 23. Репродуктивная функция и сексуальность человека. – СПб: Деан,1999. - 368 с. (соавт.: Билич Г.Л.). 24. Преднизолон и протеолитические ферменты при лечении мужского аутоиммунного бесплодия. // Новые аспекты системной энзимотерапии. Ч.1.М., 1999.- с. 33 (соавт.: Николаева М.А., Сухих Г.Т.). 25. Системная энзимотерапия при иммунном бесплодии.// Андрология и генитальная хирургия.- 2000.-№1.- С.49-50 (соавт.: Сухих Г.Т., Лоран О.Б.). 26. Современная концепция лечения мужского иммунологического бесплодия. // Андрология и генитальная хирургия.- 2000.-№1.- С.48-49 (соавт.: Лоран О.Б., Сухих Г.Т.). 27. Преднизолон и метилпреднизолон при лечении мужского иммунного бесплодия. // Андрология и генитальная хирургия.- 2000.-№1.- С.50 (соавт.: Николаева М.А., Сухих Г.Т., Лоран О.Б.). 28. Влияние антиспермальных антител на мужскую репродуктивную функцию. // Андрология и генитальная хирургия.- 2001.- №2.- С.25-33 (соавт.: Лоран О.Б., Сухих Г.Т.). 29. Этиология и патогенез мужского аутоиммунного бесплодия. Часть 1. // Андрология и генитальная хирургия.- 2001.- №1.- С.72-77 (соавт.: Лоран О.Б., Сухих Г.Т.). 30. Этиология и патогенез мужского аутоиммунного бесплодия. Часть 2. // Андрология и генитальная хирургия.- 2001.- №1.- С.78-87 (соавт.: Лоран О.Б., Сухих Г.Т.). 31. К вопросу о патогенетически значимых уровнях АСАТ у мужчин. // Андрология и генитальная хирургия.- 2001.- №2 (принята к печати) (соавт.: Лоран О.Б., Сухих Г.Т.). 32. Уровень генерации свободных радикалов в образцах эякулята бесплодных пациентов. // Бюлл. эксперим. бил. и медицины.- 2001.- №4. (принята к печати) (соавт.: Короткова И.В., Николаева М.А., Голубева Е.Л., Крут- 45 ских А.Ю., Тер-Аванесов Г.В., Сухих Г.Т.). *** Кандидатская диссертация по теме “Влияние рибоксина на регенерацию яичка” защищена 23 января 1992 г. СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ АР – акросомальная реакция АСАТ – антиспермальные антитела ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения ВПГ – вирус простого герпеса ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии ГТБ – гемато-тестикулярный барьер Е2 – эстрадиол ИКС – индекс качества спермы (количество прогрессивно подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов в эякуляте) ИОСС – искусственное оплодотворение спермой супруга ИРТ (RTIs) – инфекции репродуктивного тракта ИФА (ELISA) – иммуноферментный анализ ИФН – интерферон К – кортизол Кон-А –конканавалин-А ЛГ – лютеинизирующий гормон МЕ – международная единица НК – нормальные киллеры ПКТ – пост-коитальный тест ПСА – простат специфический антиген ПЦМ – проточная цитофлуорометрия ПЦР – полимеразная цепная реакция рH – водородный показатель РИА – радио-иммунологический анализ СГСГ (SHBG) – секс-гормон-связывающий глобулин Т – тестостерон ТРИТЦ - тетраметилродамин-изотиоционат УЕФ – условные единицы флуоресценции УЗИ – ультразвуковое исследование ФГА – фитогемагглютинин ФСГ – фолликулостимулирующий гормон ЦС – цервикальная слизь 46 ЭКО и ПЭ – экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбриона CD – кластеры дифференцировки иммунокомпетентных клеток ESHRE - Европейское общество репродукции и эмбриологии человека HLA – главный комплекс гистосовместимости человека IBT – тест с иммунными шариками ICSI – интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида MAR-тест – смешанная реакция агглютинации
