Модуль 1. - Автоматизированная информационная система ГУ
реклама
Модуль 1. биотехнологии. Физические и биофизические методы, используемые в ЛЕКЦИЯ № 1. ВВЕДЕНИЕ Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы, клетки растений, животных и человека, биогенные вещества. Диапазоны распространяются от вирусов до человека. Для реализации биотехнологических процессов важными параметрами биообъектов являются: чистка, скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул. Следует учитывать, что при создании благоприятных условий для избранного биообъекта биотехнологии эти же условия могут оказаться благоприятными и для микробов-контаминтантов или загрязнений. Представителями контаминирующей микрофлоры оказываются вирусы, бактерии, грибы, которые находятся в культурах растительных и животных клеток. Здесь микробы-контаминанты выступают вредителями производств в биотехнологии. Так при использовании ферментов в качестве биокатализаторов возникает необходимость предохранения их в изолированном состоянии от сапрофитной микрофлоры, которая может проникнуть в сферу биотехнологического процесса извне, следствие негерметичности. Независимо от систематического положения биообъекта, на практике используют либо природные организованные частицы (фаги, вирусы) и клетки с естественной генетической информацией, либо клетки с искусственно заданной генетической информацией. В биотехнологии существуют свои специфические методы: • крупномасштабное глубинное культивирование биообъектов в периодическом непрерывном режиме. • выращивание клеток растительных и животных тканей в особых условиях. Биотехнологические методы культивирования биообъектов выполняются в специальных оборудованиях-ферментаторах. Биотехнологические процессы отличаются от химических процессов: вопервых, главными компонентами являются какой-либо биообъект (вирус, бактерии, грибы). Такие объекты отсутствуют в хим. технологии. Высокие температуры неприемлемы в биотехнологии, давление. Биотехнологические процессы подразделяются на биологические, биохимические, биоаналогичные. К первым относят те из них, которые основываются на использовании акариот, прокариот, вторые - на использовании ферментов, третьи - на химическом синтезе. Многие процессы биологической технологии являются общими (показательно на аппаратурном направлении, на выборе биореакторов). Специальные - которые имеют свои специфические особенности (т.к. выращивание пеницилина, культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах). С учетом этого все биотехнологические процессы делятся на микробиологические, фито - зообиотехнология. Биотехнологические процессы условно подразделяются на биологические, биохимические, биоаналогичные. 1 К биологическим относят те, которые основываются на использовании прокариот и эукариот, акориоты (аблигатные паразиты, которые развиваются лишь в живых клетках и тканях - бактериофаги, вирусы растений, млекопитающих). Вторые - на использовании ферментов. Третьи - на химическом синтезе или полусинтезе веществ, которые функционально близки к процессам живых организмов (получение пеницилина, нуклеиновых кислот). По условиям проведения процесса различают нестерильные (крупнотонажное производство кормовых дрожжей) и стерильные (получение антибиотиков, витаминов): аэробные и анаэробные. Процессы проводят в одном из 3 режимов: • периодическое • полунепрерывное; • непрерывное. При периодическом режиме процесс проводят от начала до конца по регламенту, после завершения всех операций его повторяют. При полунепрерывном режиме осуществляется отливно-доливной процесс, когда на пике биосинтеза какого-либо антибиотика отбирают 30-70% культуральной жидкости и одновременно (однократно) добавляют свежей питательной среды. При непрерывном режиме процессы рассчитаны на непрерывный отбор культуральной жидкости и непрерывное добавление свежей питательной среды. Применительно к фазовому состоянию ингридиентов на биотехнологических производствах различают твердофазные процессы (получение грубых кормов или производство сыра из белков молока) и газофазные процессы, которые основаны на использовании газа (метана для получения микробного белка). По условиям проведения процессов выделяют: 1) одноступенчатые; 2) двухступенчатые: 3) многоступенчатые. Одноступенчатые процессы базируются на использовании клеток, находящихся в одном фазном состоянии. Двухфазном - в разном фазном состояниях. Многоступенчатые - присуще генетической инженерии. Биотехнология базируется на протекающих в этих живых системах физикохимических, биохимических, физиологических процессах, в результате которых происходят выделение энергии, синтез и деградация продуктов, формирование организованных структур. Из этого ясно, что в биотехнологии для решения насущных научных и производственных задач имеется в готовом виде обширная материальная база. Ограничивают использование этой базы несовершенство знаний о живых объектах и протекающих в них процессах, отсутствие техники и методов оперирования ими и жесткие требования к уровню рентабельности используемых биотехнологий. Поэтому разные виды и группы живых организмов и их клетки вовлекают в сферу биотехнологии постепенно, но мере преодоления этих ограничивающих факторов. 2 Биотехнология решает не только конкретные задача науки и производства. У нее есть более глобальная методологическая задача - она расширяет и ускоряет с помощью достижений научно-технического прогресса масштабы воздействии человека на живую природу, я способствует приспособлению живых систем к условиям существования человека (ноосфере), выступая в роли нового мощного фактора антропогенной адаптивной эволюции. В прошлом влияние человека на живые организмы было ограничено главным образом искусственным отбором. В настоящее время искусственный отбор входит в формирующуюся биотехнологию как одна из ее исторических предпосылок. Этот глобальный (общебиологический) и конкретный (научно производственных взаимоотношений биотехнологии с живой природой тесно смыкаются и стимулируют друг друга. Они представляют собой единую систему, которая на верхнем уровне смыкается с эволюцией, а на нижнем все больше “сращивает” живую природу с социальной и производственной сферами жизни человека. По своим потенциям биотехнология экологически достаточно чистый и практически неисчерпаемый высокоэкономичный производитель разнообразной продукции и поэтому все больше будет вытеснять несовершенные, ограниченные ресурсами и экологически вредные современные химические технологии. Однако для большего прогресса биотехнология нуждается в успехах фундаментальных наук и в более совершенных методах оперирования живыми системами. ЛЕКЦИЯ № 2. Методы изучения и использования мембранных структур в биотехнологии. К мембранным методам разделения относятся: 1. Диализ и электродиализ. 2. Обратный осмос. 3. Микрофильтрация. 4. Ультрафильтрация. В основе этих методов лежит явление осмоса - диффузии растворенных веществ через полупроницаемую перегородку, представляющую собой мембрану с большим количеством (до 1010 – 1011 на 1 м2) мелких отверстий - пор, диаметр которых не превышает 0,5 мкм. Под мембраной обычно принято понимать высокопористую или беспористую плоскую или трубчатую перегородку, оформленную из полимерных или неорганических материалов и способную эффективно разделять частицы различных видов (ионы, молекулы, макромолекулы и коллоидные частицы), находящиеся в смеси или растворе. Использование мембран позволяет создавать экономически высокоэффективные и малоотходные технологии. Среди мембранных процессов особенно интенсивно развиваются баромембранные. Если обратный осмос изучен достаточно полно, то существенно в меньшей мере это касается микрофильтрации и тем более ультрафильтрации, несмотря на ее очевидную перспективность. Границы баромембранных методов разделения четко не определены, что, по видимому, принципиально невозможно, поскольку микро- и ультрафильтрация и обратный осмос в широких пределах 3 перекрываются как в отношении их физико-химического описания, так и решаемых задач. Следовательно, приведенная классификация барометрических методов разделения в значительной мере условна. Тем не менее, каждый из указанных методов имеет свои характерные особенности, на основании которых предложено несколько их классификаций. Микрофильтрация, в основном, является гидродинамическим процессом, близким к обычной фильтрации. Специфическая особенность микрофильтрации использование мембран с диаметром пор от 0,1 до 10 мкм для отделения мелких частиц твердой фазы, в том числе микроорганизмов, в этом случае ее называют стерилизующей фильтрацией. Поэтому в отличие от процесса фильтрации при микрофильтрации явления диффузии (особенно при небольших размерах пор от 0,1 до 0,5 мкм) также играют определенную роль. В основе ультрафильтрации лежит использование мембран с диаметром пор от 0,001 до 0,1 мкм. Ультрафильтрация применяется для разделения клеток и молекул. Мембранные методы разделения, применительно к биологическим суспензиям, обладают рядом преимуществ. 1. Концентрирование и очистка осуществляются без изменения агрегатного состояния и фазовых превращений. 2. Перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и химическим воздействиям. 3. Механическое и аэродинамическое воздействие на биологический материал незначительно. 4. Легко обеспечиваются герметичность и асептические условия. 5. Аппаратурное оформление компактно по конструкции, отсутствуют движущиеся детали. 6. Процесс не обладает высокой энергоемкостью, в большинстве случаев энергия затрачивается только на перекачивание растворов. Механизм переноса атомов, молекул или ионов различных веществ через полупроницаемые мембраны может быть объяснен одной из следующих теорий. Теория просеивания предполагает, что в полупроницаемой мембране существуют поры, размеры которых достаточны для того, чтобы пропускать растворитель, но слишком малы для того, чтобы пропускать молекулы или ионы растворенных веществ. Теория молекулярной диффузии основана на неодинаковой растворимости и на различии коэффициента диффузии разделяемых компонентов в полимерных мембранах. Теория капиллярно-фильтрационной проницаемости основана на различии физико-химических свойств граничного слоя жидкости на поверхности мембраны и раствора в объеме. Из предложенных теорий, получила распространение капиллярнофильтрационная модель. Основным рабочим органом мембранных аппаратов являются полупроницаемые мембраны. Мембраны должны обладать высокой раз-делительной способностью или селективностью, высокой удельной производительностью или проницаемостью, постоянством своих характеристик в процессе эксплуатации, 4 химической стойкостью в разделяющей среде, механической прочностью, невысокой стоимостью. Селективность и проницаемость - это наиболее важные технологические характеристики мембран и аппарата в целом. Селективность мембраны зависит от размера и формы молекул растворенного вещества. Следует иметь в виду, что практически во всех случаях существуют молекулы, задерживаемые мембраной лишь частично. Мембраны изготавливают из различных материалов: полимерных пленок, стекла, керамики, металлической фольги и т.п. Широкое распространение получили мембраны из полимерных пленок. Полупроницаемые мембраны бывают пористые и непористые. Через непористые мембраны процесс осуществляется за счет молекулярной диффузии. Такие мембраны называются диффузионными и применяются для разделения компонентов с близкими свойствами. Пористые мембраны изготавливаются в основном из полимерных материалов и могут быть анизотропными и изотропными. Пористые мембраны получают обычно путем удаления растворителей или вымыванием предварительно введенных добавок из растворов полимеров при их формировании. Полученные таким образом мембраны имеют тонкий 0,25-0,5 мкм поверхностный слой на микропористой подложке толщиной 100-250 мкм. Процесс мембранного разделения осуществляется в поверхностном активном слое, а подложка обеспечивает механическую прочность мембраны. Широкое распространение получили ядерные мембраны, или нуклеопоры. Эти мембраны образуются облучением тонких полимерных пленок, заряженными альфа-частицами с последующим травлением пор химическими реагентами. К основным достоинствам ядерных мембран относятся: - правильная круглая форма пор; - возможность получить мембраны с заранее заданными размерами и числом пор; - одинаковый размер пор; - химическая стойкость. Ядерные мембраны изготавливают на основе покарбонатныхпленок с диаметром пор от 0,1 до 8 мкм. Наряду с полимерными известны мембраны с жесткой структурой: металлические, из пористого стекла, керамики. Металлические мембраны изготавливают выщелачиванием или возгонкой одного из компонентов сплава фольги. При этом получают высокопористые мембраны с порами одинакового размера - в пределах 5- 0,1 мкм. Другой способ получения металлических мембран - спекание металлического порошка при высоких температурах методом порошковой металлургии. Недостатки мембранных методов разделения: 1. Некоторые материалы, из которых изготавливаются мембраны, быстро изнашиваются. 2. Возникают определенные трудности при обработке растворов, содержащих твердую фазу. 5 Тем не менее, следует отметить перспективность применения мембранных методов разделения в технологии микробиологического синтеза. ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ СЕЛЕКТИВНОГО РАЗДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ РАСТВОРОВ И СУСПЕНЗИЙ НА ПОРИСТЫХ МЕМБРАНАХ К основным мембранным методам разделения жидких систем относятся обратный осмос, ультра- и микрофильтрация. Эти методы характеризуются такими общими чертами, как использование полупроницаемых, т.е. по разному пропускающих разные компоненты растворов и суспензий, мембран, применение в качестве движущей силы процесса избыточного давления, способы борьбы с концентрационной поляризацией. Деление указанных методов является в значительной степени условным и базируется, как правило, на размерах фильтруемых объектов и размерах пор соответствующих полупроницаемых мембран. Более отчетливо следует разграничить методы ультра- и микрофильтрации по фазовым состояниям разделяемых систем (соответственно, растворы и суспензии), а методов ультрафильтрации и обратного осмоса по механизму проницаемости (вязкое течение и активированная диффузия). Можно приблизительно определить, что обратноосмотические мембраны могут задерживать частицы размером более 1-10-4 мкм, т.е. гидратированные неорганические ионы, а ультрафильтрация наиболее эффективна для частиц размером более 1-10-3 мкм, т.е. ультрафильтрационные мембраны могут задерживать органические молекулы и ионы. Соответственно, микрофильтрация позволяет эффективно задерживать частицы от 5-10-2 до 10 мкм, те которые не осаждаются из растворов в поле гравитационных сил. Тем не менее, четко определить границы применения различных мембранных методов не представляется возможным как из-за общности физических явлений, лежащих в основе данных методов, так и ввиду широкого спектра свойств и природы разделяемых баромембранными процессами веществ. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МИКРОФИЛЬТРАЦИИ Разделение растворов и суспензий методом микрофильтрации основано на различии и эффективных гидродинамических размерах разделяемых молекул и частиц. Процесс разделения описывается в рамках различных теорий и механизмов полупроницаемости, учитывающих влияние физико-химических, гидродинамических и межмолекулярных факторов на прохождение частиц через мембраны. Как правило, анализ и расчет процессов ультра- и микрофильтрации проводится с единых позиций. Такой подход правомерен, если учесть, что протекание этих процессов обычно сопровождается образованием слоя осадка на мембране, оказывающего основное сопротивление массопереносу. Образование этого осадка и его свойства могут быть описаны едиными зависимостями. Поверхностные явления на границе мембрана-раствор, свойства раствора и растворенного вещества (для микрофильтрации - свойства диспергированных частиц) оказывают существенное влияние на процесс ультра- и микрофильтрации. 6 Объект применения микрофильтрации - как правило, коллоидные (дисперсные) системы, имеющие дисперсную среду («растворитель») и дисперсную фазу (частицы, взвешенные в растворителе). В разделении этих фаз часто и состоит задача проведения микрофильтрации жидкостей. Важнейшую роль во всех процессах разделения мембранных играют адгезионные и электростатические взаимодействия частиц с поверхностью мембраны. Биологические клеточные объекты представляют собой типичные лиофильные системы. Для них, в отличие от лиофобных систем, характерно сильное межмолекулярное взаимодействие вещества дисперсной фазы с дисперсной средой. Такое взаимодействие приводит к образованию сольватных гидратных (в случае, если дисперсионной средой является вода) оболочек из молекул дисперсионной среды вокруг частиц дисперсной фазы. Кроме этого, клетки микроорганизмов обладают зарядом (электрокинетический потенциал — ЭКП), величина которого различна у разных микроорганизмов. Для одного и того же вида микроорганизмов величина заряда меняется в зависимости от условий среды и процессов, происходящих в самой клетке. Наличие у клеток заряда позволяет рассматривать биологические суспензии как растворы электролитов. КОНЦЕНТРАЦИОННАЯ ПОЛЯРИЗАЦИЯ При разделении растворов и суспензий с помощью полупроницаемых мембран, через мембрану преимущественно проходит растворитель. При этом концентрация растворенного вещества в пограничном слое у поверхности мембраны увеличивается. Повышение концентрации происходит до тех пор, пока под действием возникающего градиента концентраций растворенного вещества между поверхностью мембраны и объемом раствора не установится динамическое равновесие. Явление образования у поверхности мембраны пограничного слоя, в котором концентрация растворенного вещества больше, чем в основном объеме раствора, получило название концентрационной поляризации. Влияние концентрационной поляризации на фильтрацию всегда отрицательно по следующим причинам: - Снижается эффективное давление вследствие увеличения осмотического давления раствора, определяемого концентрацией именно в пограничном слое. Это приводит к снижению, как скорости процесса, так и селективности, сокращается срок службы мембран, который в значительной степени зависит от концентрации растворенного вещества. - Концентрационная поляризация связана с образованием пограничного слоя, отделяющего поверхность мембраны от раствора в объеме. Толщина этого слоя в общем случае определяется гидродинамическими условиями в установке интенсивностью перемешивания и скоростью движения потока. Профиль концентрации этого слоя зависит от режима движения раствора. Различают два режима концентрационной поляризации: - предгелевый, когда концентрация у поверхности мембраны Cw ниже концентрации гелеобразования Cg; - режим гелевой поляризации, когда Cw=Cg, и на мембране образуется слой геля. 7 Образование геля на поверхности мембраны приводит к резкому падению проницаемости и росту задерживающей способности микрофильтрационных мембран. Однако существует предположение, что снижение проницаемости при концентрационной поляризации мембраны достигается не полной блокировкой ее пор слоем геля, а их модификацией гелем таким образом, что эффективные размеры всех пор уменьшаются на некоторую постоянную величину R. Образуется так называемая динамическая гелевая мембрана. При этом в уменьшенных порах мембраны реализуется классический капиллярно-фильтрационный механизм разделения. Считается также, что для возникновения концентрационной поляризации размеры фильтруемых частиц должны обеспечивать «критическое» отношение размеров частицы и поры, характеризующее переход из предгелевого в гелевый режим концентрационной поляризации вследствие увеличения коэффициента задержания. Для уменьшения вредного влияния концентрационной поляризации на процесс микрофильтрации используют различные способы: повышают температуру (вследствие чего снижается вязкость и увеличивается концентрация гелеобразования), применяют электрическое поле, употребляют высокие скорости тангенциального потока и пульсационные режимы фильтрации. ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗДЕЛЕНИЯ Выбор рабочего давления зависит от вида процесса, природы и концентрации разделяемого раствора, типа используемой мембраны, конструкции аппарата, гидравлического сопротивления и т. д. Для микрофильтрации рабочее давление составляет 0,03-0,1 МПа, и для каждого раствора определяется экспериментальным путем. Увеличение рабочего давления приводит к увеличению скорости фильтрации до некоторых пределов, обусловленных тем, что увеличение давления приводит и к увеличению и уплотнению слоя геля на поверхности мембраны. В результате воздействия высокого давления на мембраны могут наблюдаться значительные остаточные деформации: при снятии давления структура мембраны не возвращается в исходное состояние. Усадка структуры мембраны снижает проницательность и повышает селективность. Анализ данных о влиянии температуры на селективность и проницаемость мембран при микрофильтрации показывает, что повышение температуры приводит к увеличению и проницаемости, и селективности. Это объясняется тем, что уменьшается вязкость пермеата, а также значительно снижается влияние концентрационной поляризации мембран. При увеличении концентрации растворенных веществ в разделяемом растворе ухудшаются рабочие характеристики мембран - удельная производительность и селективность. При концентрировании повышается осмотическое давление раствора, а следовательно снижается эффективная движущая сила процесса разделения. 8 ЛЕКЦИЯ № 3. ФИЗИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ. И БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В культуральной жидкости после окончания процесса ферментации содержатся микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности, остатки питательной среды, пеногаситель, растворимые и нерастворимые вещества. Целевым продуктом биосинтеза могут быть непосредственно сами микроорганизмы, либо их метаболиты, растворенные в культуральной жидкости или находящиеся внутри клеток микроорганизмов. Почти во всех случаях для получения целевого продукта необходимо отделить взвешенную фазу - массу микроорганизмов от культуральной жидкости. Культуральные жидкости обычно являются сложными смесями и содержат большое число компонентов, многие из которых обладают близкими физикохимическими свойствами. Наряду с растворенными минеральными солями, углеводами, белками и другими органическими веществами культуральные жидкости содержат в значительном количестве полидисперсные коллоидные частицы и взвеси. Следовательно, они являются не только многокомпонентными растворами, но и суспензиями. Дисперсная фаза этих суспензий состоит из мицелия или клеток микроорганизмов, а также из твердых частиц, содержащихся во многих питательных средах - муки, хлопьев из кукурузного экстракта и т.п. Содержание микроорганизмов в культуральной жидкости, как правило, очень низкое. В 1 л содержится обычно 5-10 г сухой биомассы. Отделение такого количества взвешеннойфазы-трудная технологическая задача, которую приходится решать путем концентрирования биомассы различными способами (флотирование, сепарирование, упаривание). В производственных условиях приходится затрачивать значительное количество энергии на обработку больших объемов труднофильт-руемых суспензий. Способы отделения клеточной биомассы микроорганизмов от культуральной жидкости можно разделить на: - механические (отстаивание, фильтрование, центрифугирование) - теплотехнические (сушка). В зависимости от конечной цели выбирают различные сочетания этих способов. При выборе схемы концентрирования и извлечения биомассы проводят предварительную экономическую оценку выбранного способа с учетом товарной формы биопрепаратов, концентрации микроорганизмов в культуральной жидкости и др. Большинство целевых продуктов микробиологического синтеза нестабильны и подвержены влиянию различных факторов. Белки, например, исключительно чувствительны к нагреванию, изменению рН среды, к многим физическим и химическим воздействиям. Очень часто выделить целевой продукт с помощью одного метода практически невозможно. Поэтому применяют комбинацию нескольких методов. 9 МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ПРОДУКТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА При выборе метода выделения и концентрирования того или иного продукта микробиологического синтеза необходимо учитывать следующие факторы: 1. Физико-химические свойства культуральной жидкости. 2. Свойства выделяемого продукта (термолабильность, стойкость к различным химическим агентам и др.). 3. Требования к конечной форме продукта (степень чистоты и степень концентрирования). 4. Технологические и технико-экономические показатели (выход продукта, производительность оборудования, необходимость дальнейшей обработки и др.). Все методы выделения продуктов микробиологического синтеза из культуральной жидкости делят на две группы: 1. Экстракция, ионный обмен, адсорбция, кристаллизация - если целевой продукт в растворе. 2. Осаждение, фильтрование, центрифугирование, сепарирование -если целевой продукт в виде твердой фазы. Часто невозможно выделить целевой продукт с помощью одного метода, тогда применяют комбинацию нескольких методов и в процессе выделения переводят продукт из растворимой формы внерастворимую (или наоборот). Как правило, при выделении растворенных веществкультуральную жидкость приходится подвергать предварительной обработке и очистке с помощью осаждения, фильтрования, центрифугирования, сепарирования и мембранных методов (электродиализ, ультра- и микрофильтрация). ОСАЖДЕНИЕ Осаждение (седиментация) - это процесс расслоения дисперсных систем под действием силы тяжести и отделение дисперсной фазы в виде осадка. Простейший случай седиментации - отстаивание применяют в следующих случаях: 1. При диаметре частиц более 3 мкм, когда броуновское движение не оказывает существенного влияния на процесс отстаивания. 2. При выделении стабильных продуктов, когда фактор времени не имеет решающего значения. 3. При более низких, чем при других методах, затратах. 4. В особых случаях, когда необходимо разделить частицы на фракции по размеру или плотности на основании их различных скоростей осаждения. 5. Если необходимо предварительно разделить суспензию на две фракции осадок и надосадочную жидкость, которые в дальнейшем можно обрабатывать на различном оборудовании. Скорость осаждения биомассы из культуральной жидкости невелика и составляет порядка 10-6 – 10-7 м/с. Для ускорения процесса осаждения применяют: 1. Коагулянты - вещества, переводящие взвешенные частицы в агрегатнонеустойчивое состояние. 10 2. Флокулянты - вещества, способствующие разрушению коллоидных структур и образованию крупных хлопьев. В качестве коагулянтов применяют обычно желатин, рыбный клей, казеин, в качестве флокулятов - метилцеллюлозу, пектин, альгинат натрия и др. ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ Центрифугирование - это разделение неоднородных систем под воздействием поля центробежных сил. Для центрифугирования применяют центрифуги различных конструкций. Центрифуги, имеющие высокий фактор разделения и оснащенные тарельчатым барабаном называют сепараторами. В микробиологической промышленности сепараторы являются одним из самых распространенных типов центрифуг. Сепараторы позволяют сконцентрировать осадок до влажности 60-90%. В последние годы появились специальные герметичные сепараторы, позволяющие вести процесс сепарирования в автоматизированном режиме, оптимально подобранном для специфических условий конкретныхкультуральных жидкостей. Области применения центрифугирования: 1. Выделение биомассы из культуральной жидкости (дрожжи, бактерии, грибы). 2. Отделение различных целевых продуктов микробиологического синтеза (антибиотики, ферменты, витамины и др.), переведенных предварительно в твердую фазу. 3. Разделение эмульсий, образующихся при экстракции. Недостатки центрифугирования: 1. Сложность конструкции, высокая энергоемкость и стоимость. 2. Сложность эксплуатации (ненадежность, вибрация, шум, необходимость периодической разборки и мойки). 3. Воздействие на клетку центробежной силы, нагрев, трудность герметизации и обеспечения асептических условий ведения процесса. Главные достоинства центрифугирования и сепарирования - высокая производительность и высокая степень концентрирования - позволяют успешно конкурировать с другими способами выделения и концентрирования как в промышленных, так и в лабораторных условиях. ФИЛЬТРОВАНИЕ Фильтрование - это разделение твердой и жидкой фаз суспензии при пропускании ее через пористую перегородку. Конечная цель фильтрования - получение твердой или жидкой фазы (когда одна из них является отходом), а также одновременное получение твердой и жидкой фаз. Фильтрование - гидродинамический процесс, скорость которого прямо пропорциональна разности давлений, создаваемой по обеим сторонам фильтровальной перегородки и обратно пропорциональна сопротивлению, испытываемому жидкостью при ее движении через поры перегородки и слой образовавшегося осадка. 11 На процесс фильтрования влияет ряд факторов, которые можно разделить на две группы: 1. Макрофакторы - разность давлений, толщина слоя осадка, вязкость жидкой фазы и др. Эти факторы заведомо известны и контролируются с помощью приборов. 2. Микрофакторы - размер и форма частиц осадка и пор фильтровальной перегородки, толщина двойного электрического слоя на поверхности частиц и др. Эти факторы менее изучены и их характеризуют лишь косвенными методами. Именно микрофакторы оказывают решающее влияние на процесс фильтрования и затрудняют его масштабирование. При фильтровании культуральной жидкости образуются большей частью студенистые хлопьевидные или мелкозернистые осадки, обладающие большим сопротивлением. Средняя скорость фильтрации при этом составляет всего 50 л/м2 в час. Для увеличения скорости фильтрования обычно используют два приема: 1. Предварительная обработка суспензий. 2. Применение вспомогательных фильтровальных материалов. Предварительная обработка культуральной жидкости позволяет более полно перевести целевой продукт в жидкую или твердую фазу, обеспечить лучшее разделение фаз и получить продукт, годный для дальнейшей очистки и выделения. В результате предварительной обработки происходит коагуляция взвешенных частиц. Наиболее распространены следующие способы предварительной обработки: 1. Кислотная коагуляция (применяется для выделения антибиотиков, стойких к низким рН). 2. Обработка электролитами. 3. Тепловая коагуляция (возможна в тех случаях, когда продукт стоек к нагреванию до 70-80°С). 4. Образование наполнителей при добавлении химических агентов. В качестве вспомогательных фильтровальных материалов используются фильтровальные порошки, которые вносят в фильтруемую жидкость как наполнители или предварительно наносят на рабочую поверхность фильтра в виде грунтового слоя. ЭКСТРАКЦИЯ Экстракция — процесс разделения смеси твердых и жидких веществ с помощью избирательных (селективных) растворителей (экст-рагентов). Физическая сущность экстракции состоит в переходе извлекаемого компонента их одной фазы (жидкой или твердой) в фазу жидкого экст-рагента при их взаимном соприкосновении. Экстрагируемые компоненты переходят из исходного раствора в растворитель вследствие разности концентраций, поэтому данный процесс относится к числу диффузионных. Процесс экстракции проводится обычно в двухфазных системах: «твердое тело-жидкость» или «жидкость-жидкость». Область применения экстракции: выделение и очистка антибиотиков, витаминов и аминокислот. 12 Преимущества метода: 1. Низкие затраты. 2. Высокая скорость экстракционных процессов. Недостаток метода: использование вредных, взрывоопасных органических растворителей. ИОНООБМЕН Ионообмен представляет собой сорбционный процесс. Адсорбция - это процесс поглощения одного или нескольких компонентов целевого продукта из газовой смеси или раствора твердым веществом – адсорбентом. Процессы адсорбции (как и другие процессы массопередачи) избирательны и обычно обратимы. Благодаря этому становится возможным выделение поглощенных веществ из адсорбента, т.е. проведение процесса десорбции, Первые сорбционные методы выделения и очистки биологически активных веществ и антибиотиков были основаны на применении молекулярных сорбентов (активированные угли, окись алюминия и др.). Молекулярные сорбенты которые одинаково хорошо сорбируют выделяемое вещество и ряд примесей. В настоящее время разработаны ионообменные сорбенты (иониты), которые характеризуются различной избирательностью и высокой специфичностью. Иониты - это органические и неорганические вещества, практически нерастворимые в воде и обычных растворителях, которые содержат активные (ионогенные) группы с подвижными ионами, способные обменивать эти ионы на ионы электролитов при контакте с их растворами. Наиболее перспективны синтетические ионообменные смолы (КУ-2, КБ-4, КБ-ЧП-2, КМД, АВ-17, ЭДЭ-10 и др.). В зависимости от наличия ионогенных групп иониты можно разделить на 2 основных класса: 1. Ионообменные сорбенты, содержащие кислотные группы - катиониты (нерастворимые кислоты). 2. Ионообменные сорбенты, содержащие основные группы - анио-ниты (нерастворимые основания). Иониты нашли широкое применение в технологии производства антибиотиков на этапе их сорбции из культуральной жидкости. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ Кристаллизация - это выделение твердой фазы в виде кристаллов, главным образом, из растворов и расплавов. Кристаллизация антибиотиков и других биологически активных веществ основана на резком уменьшении их растворимости в результате изменения температуры раствора (обычно понижения, но иногда, например, в случае эритромицина - повышения) или перевода их в другую плохо растворимую химическую форму. Последнее достигается изменением рН раствора или добавлением соответствующего реагента, часто с одновременным снижением температуры. Кристаллизация является не только способом получения антибиотиков в твердом виде, но и очень эффективным средством очистки от сопутствующих 13 примесей, что является существенным преимуществом по сравнению с некоторыми другими методами разделения. Метод кристаллизации нашел применение в технологии получения антибиотиков (тетрациклина, эритромицина и др.), витаминов, полисахаридов. УПАРИВАНИЕ Упаривание - это процесс концентрирования жидких растворов путем частичного удаления растворителя испарением при нагревании жидкости. В ряде случаев упаренный раствор подвергают последующей кристаллизации. Концентрированные растворы и твердые вещества, получаемые в результате упаривания, легче и дешевле перерабатывать, хранить и транспортировать. Обычно упаривание в производстве антибиотиков осуществляют при температуре 60-70°С под вакуумом, поэтому данный метод недопустим при переработке термолабильных биологически активных веществ. ЛЕКЦИЯ № 4. Методы изучения биополимеров Биополимеры — это высокомолекулярные соединения, синтезируемые живыми организмами. Некоторые из них обладают ценными физическими и химическими свойствами и могут использоваться в пищевой, перерабатывающей и фармацевтической промышленности. С возникновением технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность создавать новые биополимеры, заменять синтетические продукты их биологическими аналогами, модифицировать уже существующие биополимеры с целью улучшения их физических и структурных характеристик, повышать эффективность соответствующих промышленных процессов, уменьшать их стоимость. Создание рекомбинантной бактерии Xanthomonascampestris с целью получения ксантановой слизи Xanthomonascampestris — грамотрицательная облигатно аэробная почвенная бактерия, синтезирующая ценный коммерческий биополимер ксантановую слизь, высокомолекулярный экзополисахарид. Его структурный каркас составляет линейная полимерная цепь из молекул глюкозы. К каждому второму глюкозному остатку присоединена трисахаридная боковая цепь, состоящая из одного остатка глюкуроновой кислоты и двух остатков маннозы. Ксантановая слизь имеет высокую вязкость, не разрушается в агрессивных физических и химических средах и по физическим и химическим свойствам напоминает пластик. В частности, ее можно использовать как стабилизирующий, эмульгирующий, загущающий или суспендирующий агент. Для успешного коммерческого производства ксантановой слизи необходимо выращивать X. campestris на недорогом и доступном источнике углерода. X. campestris дикого типа эффективно утилизирует глюкозу, сахарозу и крахмал, но не лактозу. При производстве сыра в большом количестве образуется такой побочный продукт, как сыворотка. Она состоит из воды (94—95%), лактозы (3,5—4%) и небольших количеств белка, минеральных веществ и низкомолекулярных органических соединений. Огромные количества сыворотки дает молочная промышленность, и ее утилизация — это большая проблема. Часто сыворотку сливают в реки и озера, что приводит к уменьшению в них количества доступного кислорода и гибели многих водных организмов. Транспортировка 14 сыворотки к местам захоронения мусора обходится очень дорого, к тому же серьезную проблему создает риск загрязнения ею грунтовых вод. Наконец, большие средства уходят на удаление твердых компонентов сыворотки. Все это заставило попытаться найти способы выгодной переработки сыворотки. Сыворотку можно использовать как источник углерода при выращивании ценных промышленных микроорганизмов. Чтобы X. campestris приобрела способность расти на сыворотке, было проделано следующее. Гены lacZY E. coli, -галактозидазу и лактозопермеазу, встроили в плазмиду с широким кругом хозяев так, чтобы они находились под транскрипционным контролем промотора одного из бактериофагов X. campestris. Эту конструкцию ввели в E. coli, а затем перенесли из E. coli в X. campestris тройным скрещиванием. -галактозидазу и лактозопермеазу, используя лактозу как единственный источник углерода, а также продуцировали в больших количествах ксантановую слизь, используя в качестве источников углерода глюкозу, лактозу и сыворотку. Подчеркнем еще раз, что X. campestris дикого типа синтезирует много ксантановой слизи, только когда растет на глюкозе. Выделение генов биосинтеза меланина Меланины образуют многочисленное семейство различных поглощающих свет биополимеров; их синтеризуют животные, растения, бактерии и грибы. Эти пигменты можно было бы использовать при изготовлении солнцезащитных экранов и покрытий, в качестве добавки к косметическим средствам. В настоящее время меланины получают в небольших количествах либо экстракцией из природных источников, либо путем химического синтеза. С помощью технологии рекомбинантных ДНК, возможно, удастся создать недорогое крупномасштабное производство меланинов с различными физическими свойствами. Меланины — это нерегулярные полимеры, состоящие из остатков индола, бензотиазола и аминокислот. Первый этап их биосинтеза катализируется медьсодержащим ферментом монооксигеназойтирозиназы и представляет собой окисление тирозина до дигидроксифенилаланинхинона. Последние этапы полимеризации не являются каталитическими реакциями и в зависимости от химической природы нехинонных соединений, включающихся в полимерную структуру, дают конечные продукты разных цветов: черного, коричневого, желтого, красного или фиолетового. Выделены и охарактеризованы гены биосинтеза меланина в бактериальных клетках Streptomycesantibioticus. Они содержат две открытые рамки считывания (ORF), одна из которых кодирует тирозиназу (мол.масса 30 600), а вторая (ORF438) - белок (мол. масса примерно 14 800) с неизвестными функциями. Чтобы проверить, нужны ли оба этих гена для синтеза меланина, гены сначала переклонировали в экспрессирующий вектор Е. соli, при этом одна конструкция содержала только ген тирозиназы, а другая — и ген тирозиназы, и ORF438. Вектор, несущий ген тирозиназы, обеспечивал синтез больших количеств тирозиназы, чем вектор, содержащий оба указанных гена. Однако оказалось, что уровень тирозиназы не имеет особого значения, а для биосинтеза меланина необходимы продукты обоих генов. Возможно, белок, кодируемый ORF438, поставляет ионы 15 меди неактивному предшественнику тирозиназыапотирозиназе, которая активируется в их присутствии. В естественных условиях после образования дигидроксифенилаланинхинона при участии тирозиназы в полимер включаются различные низкомолекулярные соединения (нехиноны). С учетом этого можно изменять химические и физические свойства меланина, синтезируемого в клетках Е. coli с введенными в них ключевыми генами биосинтеза этого полимера, если добавлять в среду определенные низкомолекулярные соединения в разных количествах. Микробиологический синтез животного биополимера с адгезивными свойствами Весьма перспективной представляется также разработка недорогого способа получения белка с адгезивными свойствами, впервые выделенного из мидий Mytilusedulis. Этот водостойкий белок образует очень прочные нити, с помощью которых моллюски прикрепляются к разнообразным поверхностям. Сразу после секреции биополимера так называемой биссаловой железой между полимерными цепями образуются многочисленные поперечные сшивки, что затрудняет определение их аминокислотной последовательности. Это в свою очередь не позволяет установить нуклеотидную последовательность кодирующих их генов и синтезировать гибридизационные зонды. К счастью, удалось выделить внутриклеточный предшественник адгезивного белка (130 кДа-предшественник). Как показали биохимические исследования, он богат серином, треонином, лизином, пролином и тирозином. От 60 до 70% этих аминокислот содержат гидроксильную группу, при этом большинство остатков пролина и тирозина гидроксилированы до 3или 4-гидроксипролина (Hyp) и 3,4дигидроксифенилаланина (DOPA) соответственно. Кроме того, после определения аминокислотной последовательности выяснилось, что предшественник состоит в основном из повторяющихсядекапептидовAla-Lys-(Pro или Hyp)-Ser-(Tyr или DOPA)-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys. Из библиотеки кДНК, которая была получена на основе мРНК, выделенной из биссаловой железы, была изолирована кДНК 130 кДа-предшественника адгезивного белка. И адгезивный белок, и его кДНКобладают весьма необычными свойствами, затрудняющими клонирование и экспрессию соответствующих генов и получение функционального адгезивного белка. Во-первых, кДНК содержит большое число повторов, что повышает частоту гомологичной рекомбинации и вероятность утраты части клонированной последовательности. Во-вторых, поскольку примерно 70% всех аминокислот белка приходится на долю пролина, лизина и тирозина, вряд ли его удастся получить в большом количестве вследствие ограниченности внутриклеточного пула аминоацил-тРНК. Чтобы преодолеть все эти трудности, полноразмерную кДНК адгезивного белка или ее фрагменты встроили в дрожжевые экспрессирующие векторы и ввели эти векторы в дрожжевые клетки. После экспрессии были получены новые активные формы адгезивного белка мол.массой от 20 до 100 кДа, причем на их долю приходилось от 2 до 5% суммарного количества клеточных белков. Значительно более высокого уровня экспрессии удалось достичь после того, как был химически синтезирован ген адгезивного белка. Используя повторы ДНК, 16 кодирующие декапептид адгезивного белка, создали синтетический ген длиной 600 п. н., который кодировал белок мол.массой примерно 25 кДа. Его основная повторяющаяся единица длиной 30 п. н. состояла из кодонов, оптимальных для экспрессии в Е. coli, а эффективная экспрессия происходила, когда он находился под контролем промотора фага Т7. Большинство микроорганизмов обладают лишь ограниченной способностью осуществлять посттрансляционноегидроксилирование аминокислот, так что образующийся белок бывает не до конца гидроксилирован. Так, некоторые из его тирозиновых остатков не превращаются в DOPA, что снижает число образующихся поперечных сшивок. Чтобы решить эту проблему, была создана система гидроксилированияinvitro, в которой бактериальная тирозиназа в присутствии аскорбиновой кислоты гидроксилировала остатки тирозина. Аскорбиновую кислоту добавляли в реакционную смесь для того, чтобы предотвратить окисление остатков DOPA в о-хинон. Этот процесс должен строго контролироваться, поскольку он приводит к сшиванию субъединиц адгезивного белка. Как и многие другие клеи или адгезивы, адгезивный белок необходимо активировать непосредственно перед использованием. При окислении предшественника адгезивного белка и образовании сшивок белок может связываться с разнообразными поверхностями — из стекла, полистирола, коллагена и т. д. Прочность и специфичность связывания можно изменять добавлением к смеси адгезивных белков до окисления и образования сшивок других белков. Это позволяет создавать клеи с уникальными свойствами, в том числе и такие, которые можно будет использовать в медицине, в частности в стоматологии. Микробиологический синтез каучука Натуральный каучук, цис-1,4-полиизопрен, -это широко используемый биополимер, который получают из различных растений. Его биосинтез начинается с превращения простых сахаров и включает 17 ферментативных реакций. В ходе последней из них происходит полимеризация изопентенилпирофосфата с образованием аллилпирофосфата. Ввиду большой коммерческой ценности каучука были проведены исследования, направленные на то, чтобы выяснить, можно ли использовать для его получения рекомбинантные микроорганизмы. Прежде всего с помощью мРНК из растения Heveabrasiliensis, синтезирующего каучук, была создана соответствующая кДНК-библиотека. Затем проведена гибридизация с коротким ДНК-зондом, синтезированным исходя из данных об аминокислотной последовательности одного из участков молекулы полимеразы каучука. Для того чтобы доказать, что клонированнаякДНК действительно кодирует этот фермент, использовали антитела к очищенному ферменту. Теперь, используя этот клон кДНК, а также, возможно, другие гены биосинтеза каучука, можно попытаться синтезировать натуральный каучук микробиологическими методами. С другой стороны, с помощью этой кДНК можно также получить полимеразу каучука и создать каталитическую систему invitro. В любом случае исследования, которые могли бы привести к разработке нового пути биосинтеза каучука имеет смысл продолжить. Микробиологический синтез полигидроксиалканоатов 17 Полигидроксиалканоаты — это биодеградируемые полимеры, синтезируемые множеством микроорганизмов (прежде всего Alcaligeneseutphus) и использующиеся ими как внутриклеточный источник углерода и энергии. Они обладают разными свойствами в зависимости от состава и могут применяться для получения биодеградируемых пластмасс, используемых, например, для изготовления упаковочного материала. По оценкам, годовой объем продаж биодеградируемых пластмасс составляет примерно 1,3 млрд. долларов. Из всех полигидроксиалканоатов наиболее полно изучена и охарактеризована поли (3-гидроксимасляная кислота). Это относится как к самому полимеру, так и к кодирующим его синтез генам A. eutrophus. Поли (3гидроксимасляную кислоту), ее сополимер поли (3-гидроксибутират-со-3гидроксивалерат) и другой полиоксиалканоат, поли (3-гидроксивалериановую кислоту), получают в Великобритании в промышленном масштабе ферментацией при участии A. eutrophus. Однако этот микроорганизм растет относительно медленно и использует лишь ограниченное число источников углерода, что делает производство довольно дорогим. Можно использовать другой путь: при перенесении генов биосинтеза этого полимера в Е. coli получаются быстрорастущие трансформанты, накапливающие в большом количестве (до 95% сухой массы клетки) поли (3гидроксимасляную кислоту). Поли (3-гидроксимасляная кислота) синтезируется из ацетил-СоА в три стадии, катализируемые тремя разными ферментами. Оперон, содержащий эти гены, был встроен в плазмиду в составе фрагмента длиной 5,2 т.п.н., однако в отсутствие селективного давления, например при росте в отсутствие антибиотиков, примерно половина клеток Е. coli теряла данную плазмиду уже после 50 генераций. Это не очень существенно, когда масштабы культивирования малы, но становится серьезной проблемой при крупномасштабной или непрерывной ферментации. Чтобы обойти эту трудность, в плазмиду, несущую оперон поли (3-гидроксимасляной кислоты), встроили локус раrВ из другой плазмиды, который обеспечивал стабилизацию плазмид, обусловливая гибель клеток, не содержащих плазмиды после сегрегации. Модифицированные плазмидыоставались стабильными даже при конститутивном синтезе поли (3-гидрокси-масляной кислоты). Трансформанты Е. coli, синтезирующие данный продукт, образовывали лишь очень небольшое количество ацетата, гибельного для клеток, по-видимому, вследствие того, что весь избыточный ацетил-СоА превращался в поли (3-гидроксимасляную кислоту), а не в ацетат. Еще одно преимущество синтеза поли (3-гидроксимасляной кислоты) в Е. coli состоит в том, что когда ее экстрагируют щелочным раствором хлорноватистокислого натрия (калия), то она разлагается в меньшей степени, чем при экстракции из A. eutrophus. По-видимому, это связано с тем, что большая часть полимера, синтезируемого в Е. coli, находится в кристаллическом виде, в то время как в A. eutrophus — в аморфном. При этом полимеры, получаемые этими двумя способами, идентичны. Поли (3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) аналогичен по своим свойствам широко использующемуся полипропилену, так что получение его микробиологическими методами может представлять коммерческий интерес. 18 Однако штаммы Е. соli, в которых экспрессируются гены биосинтеза полимера, синтезируют только поли (3-гидроксимасляную кислоту), а не сополимер. Эту проблему можно решить, используя для экспрессии клетки Е. coli, несущие мутации в fadR и atoC. FadR ответствен за негативную регуляцию биосинтеза жирных кислот, a atoC — за позитивную регуляцию их поглощения. Роль локуса fadR в индукции биосинтеза сополимера неясна, но продукт гена аtоС влияет на синтез белков, кодируемых генами atoA и atoD и облегчающих поглощение бактериями пропионата из культуральной среды. Последний превращается в пропионил-СоА и затем реагирует с ацетил-СоА с образованием 3- кетовалерилСоА, который в свою очередь может превращаться в 3-гидроксивалерил-СоА, включаемый в сополимер. Бактерии можно не только использовать как «фабрики» для синтеза белков типа рестриктаз, но и получать с их помощью новые продукты, изменяя метаболизм бактериальных клеток введением в них чужеродных генов или модификацией уже существующих. Можно создавать рекомбинантные микроорганизмы, способные синтезировать самые разные низкомолекулярные соединения: L-аскорбиновую кислоту, краситель индиго, аминокислоты, антибиотики, мономерные единицы различных биополимеров. Общая стратегия при этом состоит во введении в организм хозяина-специфических генов, клонированных в подходящем векторе, которые кодируют один или несколько ферментов, катализирующих не свойственные микроорганизму метаболические реакции или влияющих на осуществляемый им в норме биосинтез определенных соединений. По имеющимся данным, создание новых метаболических путей не является технически неосуществимым. Этот подход поможет создать необычные, более эффективные пути синтеза самых разных соединений. ЛЕКЦИЯ № 5 Методы анализа и синтеза нуклеиновых кислот Нуклеиновые кислоты (НК) являются полимерами. Поэтому их синтез представляет собой цепочку реакций полимеризации мононуклеотидов. В ходе этих реакций идет постепенное удлинение полинуклеотидной цепи. Субстратами для синтеза являются мононуклеотиды в трифосфатной форме, они же являются источниками энергии (содержат макроэргические связи). В ходе синтеза отщепляется ФФ и происходит освобождение энергии. В общем вид процесс выглядит так: Образуется 3’,5’-фосфодиэфирная связь. Выделяющийся пирофосфат (ФФ) разрушается пирофосфатазой. Для синтеза нуклеиновых кислот, помимо субстратов и ферментов, обязательно нужна матрица, которая определяет порядок присоединения субстратов – мононуклеотидов (комплементарность к нуклеотидам ДНК). Ферменты синтеза РНК – РНК-полимеразы, ДНК – ДНК-полимеразы. Полимеразы относятся к классу синтетаз. Их биосинтез контролируют сами субстраты – нуклеиновые кислоты. Несмотря на общий механизм действия, между РНК-полимеразами и ДНКполимеразами существуют важные отличия: 19 ДНК полимераза не может начать синтез, а только удлиняет уже имеющийся полинуклеотидный фрагмент. Для начала синтеза необходима особая РНКполимераза – праймаза, синтезирующая праймеры (затравки). ДНК-полимеразные реакции протекают на протяжении всей матрицы: образуется комплементарная молекула ДНК. РНК-полимеразы действуют только на определенных участках нити ДНК – от промоторов до терминаторов (промоторы указывают на начало транскрипции, терминаторы - на ее окончание). Образующаяся молекула ДНК является готовым продуктом, а продукт действия РНК-полимераз – только первичный транскрипт (высокомолекулярный предшественник зрелой РНК). После его синтеза происходит целая серия реакций посттранкрипционной модификации РНК. Осуществляется тремя группами ферментов: Специфические эндонуклеазы. Их действие приводит к фрагментации первичноготранскрипта. Ферменты, способные образовывать 3’,5’фосфодиэфирные связи – лигазы, которые сшивают фрагменты. Действие специфических эндонуклеаз и лигаз обозначается термином «сплайсинг». Затем вступает в действие фермент, присоединяющий к каждой молекуле иРНК «кэп»-фрагмент – 3-метил ГТФ, а также фермент полиаденилатполимераза, присоединяющий АТФ к 3'-концу молекулы (полиаденилирование). Ферменты, которые осуществляют преобразование азотистых оснований в составе РНК (метилированиеаденина, гуанина, восстановление урацила до дигидроурацила, дезаминирование азотистых оснований. Модифицированные таким образом продукты известны как минорные азотистые основания. Они служат как для защиты РНК от действия нуклеаз, так и для формирования высших структур РНК. В наибольшем количестве минорные азотистые основания находятся в составе транспортной-РНК (т-РНК). Минорные азотистые основания не образуют комплементарных пар, поэтому наблюдается образование петель. В организме человека встречаются следующие полимеразы: ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ: - альфа-ДНК-полимеразы отвечают за синтез основной цепи; - бета-ДНК-полимеразы восстанавливают поврежденные участки ДНК; - гамма-ДНК полимеразы - митохондриальные ферменты, содержатся в митохондиях и осуществляют репликацию митохондриальной ДНК. РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ: I - участвуют в синтезе транспортной РНК (т-РНК). При синтезе транспортной РНК (т-РНК) к концу каждой молекулы присоединяется последовательность из трех мононуклеотидов: ЦМФ-ЦМФ-АМФ (ЦЦА). Эта последовательность необходима для присоединения аминокислоты к т-РНК. II - участвуют в синтезе информационной (матричной) РНК(и-РНК, м-РНК); III - участвуют в синтезе остальных видов РНК. Ингибитором РНК-полимеразы-II является пептид L-амонитин. Встречается в ядовитых грибах Amonyta(бледная поганка). Синтез ДНК называется репликацией. Направление фосфодиэфирных связей одной из синтезируемых полинуклеотидных цепей ДНК совпадает с направлением 20 синтеза (5'--->3'), поэтому она синтезируется непрерывно и сразу целиком. А у другой - не совпадает (3'--->5'). Поэтому она синтезируется частями. Эти части называются "фрагменты Оказаки". Синтезировать фрагменты Оказакиdenovo (с нуля) ДНК-полимеразы не могут, поэтому для синтеза каждого фрагмента нужна "затравка" - праймер. Праймер - это кусочек цепи РНК. Синтез праймеров катализируют специальные ферменты - праймазы (это один из вариантов РНКполимераз). Синтез РНК происходит на определенных участках молекулы ДНК и называется транскрипцией. В цепи ДНК существуют специальные участки. При транскрипции образуется высокомолекулярный предшественник РНК - первичный транскрипт. Затем здесь же, в ядре клетки, идет постсинтетическая модификация РНК - сплайсинг. Этот процесс катализируют ферменты эндонуклеазы - из первичноготранскрипта вырезаются интроны. Оставшиесяэкзоны сшиваются РНКлигазами. Далее к 5'-концу молекулы РНК присоединяется 7-метил-ГТФ (КЭПфрагмент) - этот процесс называется "кэпирование". К 3'-концу присоединяется полиадениловый "хвост" (полиАМФ) - реакцию катализирует. Особенностью посттранскрипционной модификации рибосомальной РНК (рРНК) является метилирование азотистых оснований. Модуль 2. Методы генетической инженерии в биотехнологии и информационные методы ЛЕКЦИЯ № 6. Методы генетической инженерии в биотехнологии С помощью современных генетических методов биологи научились превращать бактерии в своеобразные «биологические фабрики» по производству белковых препаратов (например, рестрицирующих эндонуклеаз), различных химических соединений, аминокислот, антибиотиков и т. д. Клонируя в бактериальных клетках специфические гены, они создают новые пути биосинтеза для получения уникальных метаболитов, применяют клонированные гены болезнетворных микроорганизмов в качестве зондов для диагностики заболеваний человека и домашних животных, используют изолированные гены для получения безопасных и эффективных вакцин. Методами генной инженерии можно усиливать природную способность определенных видов бактерий к осуществлению специфических биологических процессов. Например, уже получены штаммы бактерий, которые более эффективно разрушают токсичные отходы, загрязняющие окружающую среду, способствуют ускорению роста сельскохозяйственных культур, эффективно расщепляют целлюлозу до низкомолекулярных углеродных соединений, уничтожают вредных насекомых. Часто думают, что выращивание больших количеств микроорганизмов представляет собой рутинную процедуру. Однако для успешного производства рекомбинантных белков в промышленных масштабах необходимо контролировать множество параметров, от которых зависит рост синтезирующих их микроорганизмов и чистота получаемых продуктов. Молекулярная диагностика 21 Успехи современной медицины и сельского хозяйства часто зависят от того, удается ли обнаруживать специфические вирусы, бактерии, грибы, паразитические микроорганизмы, белки и низкомолекулярные соединения в организме человека или животных, в растениях, воде или почве. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов (табл.1). Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. В качестве примера можно привести облигатных внутриклеточных паразитов Chlamydiatrachomatis, которые вызывают хламидиоз, болезнь, передающуюся половым путем и распространенную в Северной Америке и Европе. Хламидиоз трудно диагностировать, поскольку для этого необходима перевиваемая культура клеток. При этом часто получают ложноотрицательные результаты (т. е. ошибочно диагностируют отсутствие микроорганизма), в результате чего не проводится адекватное лечение. Безусловно, если для выявления микроорганизма необходимо выращивать его в культуре, то рутинной может стать идентификация лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК. Таблица 1. Сравнение некоторых методов диагностики инфекционных заболеваний, вызванных паразитическими микроорганизмами Метод Mикроскопическое исследование. Преимущества Простота. Прямое выявление паразитических микроорганизмов. Возможность разграничения микроорганизмов по морфологическим признакам. Культивирование invitrou Обнаружение только иммунизация мышей. жизнеспособных паразитических микроорганизмов. Возможность определения вирулентности и инфекционности. Определение антител в Простота, сыворотке. непродолжительность 22 Недостатки Трудоемкость, длительность. Низкая чувствительность. Невозможность азграничения сходных микроорганизмов. Необходимость высокой квалификации для интерпретации результатов. Длительность анализа, высокая стоимость. Разные породы животных дают разные ответы. Потеря жизнеспособности в организме животного. Использование животных. Не всегда специфичен. Невозможность анализа. разграничения острой и Возможность автоматизации. латентной форм инфекции. Возможность тестирования большого числа образцов. Гибридизация и ПЦР. Быстрота, высокие чувствительность и Специфичность. Прямое обнаружение паразитических микроорганизмов. Возможность разграничения разных видов. Независимость результатов от предыдущих инфекций. Не требуют жизнеспособности паразитов. Возможность автоматизации. Высокая стоимость анализов, многоэтапность. Невозможность различить живые и мертвые микроорганизмы. Возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм- или молекулу-мишень, чувствительный — обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для рутинного применения. ЛЕКЦИЯ № 7. Иммунологические методы в биотехнологии Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью и специфичностью, являясь в то же время достаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных микроорганизмов, но имеют и свои ограничения. Если молекулой-мишенью является белок. То необходимо обеспечить экспрессию детермипирующих его генов и создать условия, в которых не происходит маскирование или блокирование сайта связывания с антителом. Традиционные процедуры диагностики возбудителей инфекции опираются либо на набор характеристик патогенного микроорганизма, либо, что предпочтительнее, на одну уникальную, легко различимую его особенность. Клинические микробиологи пытаются найти тот минимальный набор биологических характеристик, при помощи которого можно будет гарантирование обнаруживать и идентифицировать патогенные микроорганизмы. Например, некоторые возбудители вырабатывают специфические биохимические соединения, которые и необходимо обнаружить в биологическом образце. Часто подобную маркерную молекулу можно выявить 23 непосредственно, проведя высокоспецифичный биохимический анализ. Но такой подход неизбежно приведет к увеличению числа индивидуализированных систем детекции патогенных микроорганизмов. Более предпочтительным был бы универсальный метод, позволяющий выявлять любую маркерную молекулу независимо от ее химической природы. Именно таким является метод, основанный на идентификации комплексов антиген-антитело. Ферментный иммуносорбентный анализ Существует целый ряд подходов, позволяющих определить, произошло ли связывние антитела с антигеном-мишенью. Один из них - это ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), который часто используют для диагностики. Процедура включает следующие этапы. 1. Образец, в котором хотят обнаружить специфическую молекулу или микроорганизм, фиксируют на твердой подложке, например на пластиковой микротитровальной плашке обычно имеющей 96 лунок. 2. К фиксированному образцу добавляют антитело, специфичное к маркерной молекуле (первое антитело), затем промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы первого антитела . 3. Добавляют второе антитело, которое специфически связывается с первым антителом и не взаимодействует с маркерной молекулой. К этому антителу присоединен фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза или уреаза), катализирующий превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт. Промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы конъюгата второе антитело-фермент. 4. Добавляют неокрашенный субстрат. 5. Проводят качественное или количественное определение окрашенного продукта. Если первое антитело не связывается с мишенью образца, то оно удаляется при первом промывании. Поскольку при этом конъюгату второе антитело-фермент не с чем связываться, он удаляется при втором промывании, и образец остается неокрашенным. Если связывание с мишенью происходит, то второе антитело присоединяется к первому, и конъюгированный фермент катализирует образование легко регистрируемого окрашенного продукта. Основной принцип ELISA - специфическое связывание первого антитела с мишенью. Если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный препарат обычно используют для получения антител, при помощи которых затем и выявляют данную мишень. Антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови иммунизированного животного (обычно кролика), связываются с разными антигенными детерминантами (эпитопами) молекулымишени. Такую смесь антител называют поликлональным препаратом. Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для некоторых методов диагностики: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, т. е. когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. Однако эти проблемы вполне 24 разрешимы, поскольку сейчас научились получать препараты антител, выработанных к одной антигенной детерминанте, т. е. препараты моноклональных антител. Моноклональные антитела У млекопитающих в ходе эволюции выработался сложный набор клеточных систем, защищающих организм от токсичных веществ и инфекционных агентов. Составной частью защитной реакции является индуцированная выработка клетками лимфатической системы специфических белков (антител), которые соединяются с чужеродными веществами (антигенами) и при помощи других белков иммунной системы, включая системы комплемента, нейтрализуют их эффект. В ответ на иммунологический стимул каждая антителопродуцирующая клетка синтезирует и выделяет единственный вид антител, которые с высоким сродством распознают отдельный участок (эпитоп, антигенную детерминанту) молекулы антигена. Поскольку в молекуле антигена обычно присутствует несколько разных эпитопов, антитела против каждого из них вырабатываются отдельными клетками иммунной системы. Такие антитела, каждое из которых взаимодействует с данным антигеном, называют поликлональными. Уже в начале нынешнего века, когда о поли клональности антител ничего не знали, было ясно, что их специфичность можно использован для подавления инфекций. Позже антитела стали применять в качестве диагностического инструмента для выявления токсичных соединений в клинических образцах. К сожалению, эффективность препаратов поликлональных антител варьирует от одной партии к другой, поскольку в одних случаях при проведении иммунизации антитело продуцирующие клетки сильнее стимулируются одними детерминантами данного антигена, а в других иммунная система активнее отвечает на другие эпитопы тоге же антигена. Это может влиять на способность разных препаратов нейтрализовать антигены, поскольку отдельные эпитопы обладают разной эффективностью (стимулирующей способностью). Следовательно, в данной партии поликлональных антител может содержаться мало молекул, направленных против основного эпитопа, и в результате она будет менее эффективной, чем предыдущая. Следовательно, для практического применения антител в качестве диагностического инструмента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в культуре и продуцировала антитела одного типа, обладающие высоким сродством к специфическому антигену-мишени, - моноклональные антитела. Подобная клеточная линия могла бы стать неиссякающим источником идентичных молекул антител. К сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а приобретя способность к делению от клетки совместимого типа - расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя в то же время многие свойства В-клеток. Так клетки миеломы, в первую очередь те, которые не 25 вырабатывают антител, стали кандидатами на слияние с антитело продуцирующими В-клетками. В середине 70-х гг. эти идеи стали реальностью. Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, состоит во введении мышам антигена. После ряда иммунизации, проведенных в течение нескольких недель, проверяют, произошло ли развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развился, то животных умерщвляют, извлекают селезенку, промывают ее, измельчают и несильно встряхивают для высвобождения единичных клеток, среди которых находятся и антитело продуцирующие В-клетки. Взвесь клеток селезенки смешивают со взвесью миеломных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе (HGPRT-). Комбинированную взвесь в течение нескольких минут инкубируют в 35%-ном полиэтиленгликоле, а затем переносят в среду, содержащую гипоксангин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ). Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клетки миеломы, селезенки, а также слившиеся клетки миеломы—селезенки, миеломы—миеломы, селезенки—селезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломы—селезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать. Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенки—селезенки вообще не растут в культуре, а миеломные клетки HGPRTи слившиеся клетки миеломы—миеломы не могут использовать гипоксантин в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кислот. Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом, миеломные клетки HGPRT- и слившиеся клетки миеломы-миеломы не могут синтезировать пурины в среде ГАТ и погибают. Слившиеся клетки селезенки—миеломы растут в среде ГАТ, поскольку: 1) клетки селезенки поставляют функциональную HGPRT, которая может утилизировать экзогенный гипоксантин среды несмотря на блокирование синтеза пуринов с участием дигидрофолатредуктазыаминоптерином; 2) клетки миеломы способны активно делиться. Тимидиннеобходим для устранения блокирования в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибированием дигидрофолатредуктазы. На 10—14-е сутки после слияния клеток в среде ГАТ остаются и растут только слившиеся клетки селезенки—миеломы. Их затем вносят в лунки пластиковых микротитровальных плашек и выращивают на полной культуральной среде без ГАТ. Теперь необходимо идентифицировать гибридные клетки, вырабатывающие антитела к иммунизирующему антигену. Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содержащих секретируемые антитела. Среду из тех лунок, в которых есть растущие клетки, отбирают и переносят в лунки другой микротитровальной плашки, предварительно покрытые слоем молекул антигенамишени. Если в культуральной среде находится антитело (первое антитело), распознающее один из эпитопов данного антигена, то оно свяжется с антигеном и останется в лунках после их промывания. Затем в лунки добавляют второе 26 антитело, специфичное к мышиным антителам. Оно будет присоединяться к любому первому антителу, связанному с антигеном. К используемому в иммунном анализе второму антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержала антитело, специфичное к данному антигену. Если же такое антитело в среде отсутствовало, то второму антителу не с чем будет связываться и оно смоется при втором промывании. Субстрат в таких лунках останется неокрашенным. Лунки исходной микротитровальной плашки, среда из которых дает положительный иммунный ответ (изменение цвета), могут содержать смесь слившихся клеток. Чтобы получить линии, происходящие от одной клетки (клоны) клеточную суспензию из таких лунок разводят культуральной средой и высевают в другие лунки. После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела, распознающие антиген-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же антигенной детерминанты. Каждый клон, продуцирующий моноклональное антитело, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток. Применение моноклональных антител позволяет существенно повысить специфичность метода ELISA, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом. К настоящему времени получен целый ряд моноклональных антител, которые можно использовать для обнаружения различных соединений и патогенных микроорганизмов. Альтернативой получению моноклональных антител из культуры гибридомных клеток может быть отбор и производство моноклональных антител и их частей (Fv-фрагментов), направленных против антигена-мишени, с помощью Е. coli . ЛЕКЦИЯ № 8. Информационные методы в биотехнологии Диагностика специфических наследственных заболеваний человека на генетическом уровне дает ответ на вопрос, входят ли обследуемые индивидуумы или их потомки в группу повышенного генетического риска. ДНК-анализ можно использовать для выявления носителей генов наследственных заболеваний, а также для пренатальной и пресимптоматической диагностики серьезных генетических нарушений. Тесты на уровне ДНК позволяют безошибочно выявлять специфические мутации. Раньше для этого применялись биохимические методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. ДНК-тесты не требуют экспрессии мутантного гена для его выявления, что позволяет разработать системы скрининга для всех моногенных заболеваний. Серповидноклеточная анемия 27 Серповидноклеточная анемия — генетическое заболевание, обусловленное заменой одного нуклеотида в кодоне, который соответствует шестой аминокислоте -цепи молекулы гемоглобина. У индивидов, гомозиготных по мутантному гену (S/S), эритроциты имеют необычную серповидную форму; это связано с искажением конформации молекулы гемоглобина вследствие замены в ней валина на глутаминовую кислоту. Мутантный гемоглобин не может с достаточной эффективностью переносить кислород, и у таких больных развивается тяжелая анемия с прогрессирующим поражением сердца, легких, мозга, суставов и других органов. У индивидов, гетерозиготных по данному гену (A/S) (носителей генетического заболевания), эритроциты имеют нормальную форму, и симптомы заболевания проявляются лишь в экстремальных условиях (на большой высоте над уровнем моря либо при слишком высоких или низких температурах, когда снижается снабжение организма кислородом). Если оба родителя гетерозиготны (имеют генотип A/S), то вероятность того, что их ребенок будет гомозиготным по мутантному гену (S/S) (т. е. будет болен серповидноклеточной анемией), составляет 25%. Ген серповидноклеточной анемии с высокой частотой встречается среди афроамериканцев и их потомков, а также среди латиноамериканцев. В США проводят скрининг для выявления носителей гена серповидноклеточной анемии, которые могут передать этот ген своим потомкам. Рассмотрим один из используемых для этого тестов. -глобиновом гене, приводящая к серповидноклеточной анемии, сопровождается элиминацией сайта для рестрицирующейэндонуклеазыCvnI. Этот фермент узнает последовательность CCTNAGG и расщепляет молекулу ДНК между основаниями С и Т (N — любой из четырех нуклеотидов). В нормальном гене эта последовательность имеет вид CCTGAGG, а в гене серповидноклеточной анемии — ССТGTGG. На этом различии основывается ДНК-диагностика данного заболевания. Используя праймеры, фланкирующие сайт CvnI, амплифицируют с помощью ПЦР небольшое количество тестируемой ДНК. Амплифицированный фрагмент обрабатывают CvnI, продукты рестрикции разделяют с помощью гельэлектрофореза и окрашивают их бромистымэтидием. При наличии Cvn1-сайта на электрофореграмме появляется специфический набор полос, отличный от такового в отсутствие CvnI -сайта. Описанным способом можно без труда и достаточно быстро установить генетический статус обследуемого, не проводя при этом процедуру гибридизации. Метод ПЦР/ЛОЗ Не все генетические нарушения, приводящие к появлению дефектных генов, сопровождаются утратой или изменением сайтов рестрикции, поэтому для обнаружения однонуклеотидных замен применяют и другие подходы. В одном из них объединены ПЦР и метод, основанный на дотировании олигонуклеотидных зондов (ЛОЗ), ПЦР/ЛОЗ. Предположим, что в определенном сайте нормального гена (скажем, в 106-м положении) находится пара А-Т, а в том же сайте мутантного гена — G-C. Зная нуклеотидные последовательности, фланкирующие 106-й нуклеотид, можно синтезировать два коротких (20-нуклеотидных) фрагмента, прилегающих к 28 данному сайту и комплементарных противоположным цепям. Основная особенность этой пары олигонуклеотидов состоит в том, что З'-концевой нуклеотид одного из них (зонд X) комплементарен основанию, находящемуся в 106-м положении нормальной последовательности, а 5'-концевой нуклеотид второго (зонд Y) комплементарен нуклеотиду, примыкающему к 106-му нуклеотиду. При отжиге этих зондов с содержащей нормальную последовательность ДНК-мишенью (амплифицированной методом ПЦР) происходит их полная гибридизация, и при добавлении в реакционную смесь ДНКлигазы зонды X и Y ковалентно сшиваются. Ecли же эти зонды отжигаются с мутантной ДНК, в которой произошла замена 106-го нуклеотида, то некомплементарный ему 3'-концевой нуклетид зонда X не может образовать с ним пару. И хотя зонд Y по-прежнему гибридизуется полностью, ДНК-лигаза не может сшить зонды X и Y. Можно синтезировать и другие олигонуклеотидные зонды, полностью соответствующие последовательности с мутантным 106-м нуклеотидом. При таком наборе зондов лигирование будет происходить в случае их отжига с мутантной ДНК-мишенью и не будет в случае отжига с нормальной мишенью. Таким образом, метод ПЦР/ЛОЗ различает две ситуации: лигирование зондов и отсутствие лигирования. Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5'-конец зонда X метят биотином, а З'-конец зонда Y — дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидиномбиотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было. Располагая двумя парами зондов, можно установить генетический статус любого человека. Например, ДНК гетерозиготных носителей дает положительный ответ с обеими парами зондов, ДНК лиц, обладающих двумя копиями нормального гена, — только с тем набором зондов, который содержит нуклеотид, комплементарный нормальному сайту, и, наконец, ДНК индивидов с двумя измененными копиями гена — только с набором зондов, детектирующим мутантный сайт. Чтобы минимизировать необходимое для анализа количество исходной ДНК, перед гибридизацией участок ДНК-мишени, содержащий тестируемый сайт, амплифицируют с помощью ПЦР. ПЦР/ЛОЗ является быстрым, чувствительным и высокоспецифичным методом. Все его стадии роботизированы, что позволяет проводить до 1200 тестов в день. 29 Более простым, хотя и менее чувствительным вариантом ПЦР/ЛОЗ является метод лигазной цепной реакции. Тестируемую ДНК смешивают с избытком двух индикаторных зондов, описанных выше, в присутствии термостабильной ДНКлигазы. Проводят лигирование при 65 С. затем повышают температуру до 94 °С. чтобы произошла денатурация образовавшихся гибридов зонд—ДНК-мишень, и вновь понижают температуру до 65°С для гибридизации свободных нелигированных индикаторных ЛОЗ-зондов с ДНК-мишенью. Этот цикл повторяют 20 раз. Если индикаторные ЛОЗ-зонды полностью комплементарны ДНК-мишени, то лигирование будет происходить в каждом цикле, и после 20 циклоп накопится достаточно продуктов лигирования («сшитых» зондов X и Y) для того, чтобы их можно было обнаружить с помощью электрофореза или ELISA. Если комплементарностьнеполная то лигирование не произойдет и никаких продуктов зарегистрировано не будет. Генотипирование с использованием флуоресцентно меченных ПЦРпраймеров Колориметрическоегенотипирование основано на применении ПЦРпраймеров, меченных различными флуоресцентными красителями. Чтобы различить мутантную ДНК и ДНК дикого типа, проводят ПЦР с двумя разными праймерами. Один из них (Р1) комплементарен ДНК дикого типа и на 5'-конце помечен родамином (красный цвет), другой (РЗ) комплементарен мутантной ДНК и на 5'-конце помечен флуоресцеином (зеленый цвет). В обоих случаях амплификацию проводят в присутствии третьего, немеченногопраймера (Р2), комплементарного противоположной цепи. Поскольку ПЦР может идти только в том случае, когда праймер полностью комплементарен ДНК-мишени, в присутствии в реакционной смеси всех трех праймеров будет амплифицироваться либо ДНК дикого типа, либо мутантная ДНК, либо обе они, в зависимости от ДНКмишени, играющей роль матрицы. Если индивид гомозиготен по ДНК дикого типа, то после проведения ПЦР и удаления лишних праймеров будет наблюдаться флуоресценция красного цвета, если он гомозиготен по мутантной ДНК — зеленого, а если присутствуют и мутантная ДНК, и ДНК дикого типа (т. е. индивид гетерозиготен) — желтого. Этот метод можно автоматизировать и адаптировать для любого однонуклеотидного сайта-мишени в любом гене с известной нуклеотидной последовательностью. Мутации в разных сайтах одного гена Далеко не все генетические заболевания обусловливаются одним специфическим изменением в гене. В большинстве случаев мутации происходят в разных сайтах в пределах одного гена, но приводят к одному генетическому -талассемию — -глобина. У гетерозиготных носителей при этом обычно наблюдается небольшая анемия. Индивиды же, гомозиготные по одному из как минимум восьми возможных мутантных сайтов, для поддержания жизни нуждаются в регулярном переливании крови и другом лечении. Поскольку мутация в любом из восьми специфических -глобинового гена может приводит -талассемии, необходимо 30 провести по крайней мере восемь разных тестов. Такая диагностика возможна, хотя и весьма дорогостояща. Поэтому для скрининга мутаций, возникающих в разных сайтах одного гена, была разработана стратегия ПЦР/гибридизация, основанная на проведении одной реакции. Для этого синтезируют набор специфических 20-нуклеотидных зондов, каждый из которых полностью комплементарен фрагменту гена-мишени, несущему известную мутацию. К 3'-концу каждого зонда присоединен гомополимер poly (dT) длиной примерно 400 нуклеотидов, с помощью которого ДНК-зонд связывается с заранее отмеченной точкой на найлоновом фильтре, а остальная его часть остается свободной и может гибридизоваться. Сегменты тестируемой ДНК, каждый из которых включает по одному из возможных мутационных сайтов, одновременно амплифицируют с помощью ПЦР, причем один праймер из каждой пары на 5'-конце помечен биотипом. Амплифицированные фрагменты ДНК-мишени гибридизуют с зондами, пришитыми к фильтру, в условиях, обеспечивающих гибридизацию только полностью комплементарных последовательностей. В гибридизационную смесь добавляют стрептавидин, связанный с щелочной фосфатазой (можно также использовать пероксидазу хрена или уреазу). После гибридизации промывают фильтр и добавляют неокрашенный субстрат. Если имеет место полное соответствие между амплифицированным сегментом ДНК-мишени и специфическим олигонуклеотидным зондом, то на фильтре появится цветная точка. На один и тот же фильтр можно нанести несколько точек, соответствующих целому ряду разных специфических олигонуклеотидных зондов. Проанализировав эту цветную мозаику, можно идентифицировать один из многих возможных сайтов мутации. Молекулярная диагностика — это быстро развивающееся направление. Хотя его основные принципы уже сформировались, технические детали отдельных тестов могут различаться. Для получения в достаточном количестве ДНК-мишени сейчас успешно применяют ПЦР. Использование ПЦР и специфических зондов существенно повышает чувствительность тестов и позволяет применять нерадиоактивные хромогенные, хемилюминесцентные и флуоресцентные системы регистрации. Во многих случаях для выявления мутации или экзогенной ДНК инфекционного агента в исследуемом образце достаточно провести ПЦР с последующим электрофоретическим разделением продуктов. Не вызывает сомнения, что с помощью ДНК-диагностики можно будет выявлять большинство, а возможно и все наиболее распространенные генетические и инфекционные заболевания, а также новообразования. 31
