Современные методы в биотехнологии Лекция № 1 Введение

Современные методы в биотехнологии
Лекция № 1 Введение
Мембраны и мембранные технологии играют все более важную роль в решении
глобальных проблем, стоящих перед человечеством, прежде всего как технологии,
позволяющие навести мост через пропасть, разделяющую промышленность и экологию.
Экологическая чистота, малая энергоемкость и сравнительная простота технологического
решения обусловливают широкое применение мембранных процессов в различных сферах
деятельности, прежде всего для эффективного разделения жидких и газообразных сред,
выделения ценных продуктов из сточных вод и газовых выбросов, для сепарации ионов в
батареях, топливных элементах, для электрохимических процессов. Существуют области,
где мембранная технология вообще не имеет конкурентов, например, аппараты
“искусственная почка” и “искусственное легкое”, получение сверхчистых веществ и зон в
микроэлектронике, выделение термолабильных биологически активных веществ и др. В
США, например, уже производятся в лабораторном масштабе биокаталитические
мембраны, энерго- и информационно-преобразующие мембраны, использующиеся как
биосенсоры в устройствах для мониторинга. Россией получен ряд фундаментальных
результатов в области физикохимии мембранного разделения, создано производство
мембран разных типов, мембранных модулей, установок. Это установки для разделения и
очистки жидкостей на базе современных неорганических мембран, аппараты для
газоразделения, мембранные аппараты для разделения плазмы крови, мембранные
элементы для очистки воды и органических жидкостей и др.
Наиболее перспективные направления исследований в области мембранных технологий:
– Целенаправленное
формирование
системы
канальных
наноструктур
для
трансмембранного переноса молекул и ионов как конструкционных элементов объема
мембран.
– Создание барьерных мембранных структур с толщинами порядка 10–30 нм.
– Формирование состояния поверхности мембран с целью контролируемого изменения
избирательности переноса.
– Реализация энергозависимого активного транспорта целевых нейтральных компонентов.
– Формирование структуры жидких сред для повышения эффективности выделения
растворенных в них целевых компонентов при мембранном разделении.
Биофизика— область биологической науки, занимающаяся исследованием физикохимических и физических процессов в биологических системах на молекулярном,
субклеточном, клеточном, тканевом и организменном уровнях, включая структуру и
функции макромолекул, надмолекулярных комплексов и мембран; механизмов регуляции
жизнедеятельности; первичных стадий действия физических и химических факторов
внешней среды на живые системы и их компоненты.
Биофизика как междисциплинарная наука, находящаяся на стыке биологии, физики,
химии и математики, играет существенную роль в формировании мировоззрения
современного биолога, дает основу для глубокого усвоения других дисциплин,
относящихся к разделу физико-химической биологии и биотехнологии. Современная
биофизика стремительно развивается, ее достижения способствуют переходу биологии на
качественно более глубокий молекулярный уровень исследований.
Целями изучения биофизики являются:
освоение основных принципов и теоретических положений биофизики;
познание взаимосвязи физического и биологического аспектов функционирования живых
систем;
освоение биофизических методов исследования.
Значение биофизики для народного хозяйства состоит в разработке и использовании
биофизических методов и направленных физических воздействий на биологические
системы в биотехнологии, биоинженерии и экологии, создании экспрессных методов
диагностики, прогнозирования и эффективных методов лечения заболеваний человека и
животных.
Непосредственной наукой, занимающееся изучением биополимеров является
аналитическая биохимия. Аналитическая биохимия - раздел биохимии, предметом
изучения которого являются принципы и методы обнаружения, идентификации и
количественного определения химических соединений, входящих в состав живых
организмов. Взаимосвязь аналитической биохимии с проблемами структурного анализа в
биохимии.
Специфические
особенности
анализа
биологических
проб
(многокомпонентность, низкое содержание анализируемого вещества, невысокая
стабильность многих биологически значимых веществ вне организма).
Генетическая инженерия начинает активно воздействовать на развитие не только
медицины, но и других сфер народного хозяйства. Успешное развитие методов
генетической инженерии открывает широкие возможности для решения ряда задач,
стоящих перед сельским хозяйством. Это и создание новых ценных сортов
сельскохозяйственных растений, устойчивых к различным заболеваниям и
неблагоприятным факторам внешней среды, и ускорение процесса селекции при
выведении высокопродуктивных пород животных, и создание для ветеринарии
высокоэффективных средств диагностики и вакцин, и разработка методов биологической
фиксации азота. Решение этих проблем будет способствовать научно-техническому
прогрессу сельского хозяйства, и ключевая роль в этом будет принадлежать методам
генетической, а также, очевидно, и клеточной инженерии.
Иммунология позволяет создавать новые подходы к лечению иммунологических
заболеваний (в том числе иммунодефицитов, аутоиммуннных заболеваний и аллергии),
инфекционных и онкологических заболеваний.
Лекция № 2 Методы изучения и использования мембранных структур в биотехнологии
1. Мембранные белки
2. Нанокапсулы, имитирующие биологические мембранные структуры
1.Новая технология, основанная на размещении мембранных белков внутри
синтетических структур, может использоваться при создании нового типа биодатчиков
для обнаружения ядов, взрывчатых веществ и наркотиков. Мембранные белки выполняют
в клетке несколько функций, в том числе и функцию рецепторов, передавая сигнал внутрь
клетки при обнаружении определенных молекул снаружи. Д-р Ева-Катрин Зиннер (EvaKathrin Sinner) и ее коллеги из института Макса Планка для создания биодатчиков
использовали искусственно выращенные мембранные белки, которые на стадии
формирования вводились в искусственные липидные мембранные системы, структура
которых повторяла структуру клеточной мембраны, сообщается в пресс-релизе института
Макса Планка. Рецепторы запаха, выбранные учеными для этого исследования,
представляли собой G-протеин-связанные рецепторы, взятые у мышей. Ученые
продемонстрировали, что рецепторы, помещенные внутрь искусственных мембранных
структур, сохраняют свои биологические функции.
2.Французские ученые сконструировали из искусственных биологических молекул
шарообразные наноразмерные образования, которые являются подобием мембранных
пузырьков, органелл клетки.Вооружившись простым оптическим микроскопом легко
заметить, что основой многих биологических структур являются замкнутые образования,
покрытые мембраной и заполненные жидкостью. Они построены из липидов, белков и
углеводов. Действительно, клетки представляют собой не что иное как пузырьки, и
многие находящиеся внутри клеток органеллы, играющие важную роль во
внутриклеточном транспорте биологических молекул – так же более мелкие пузырьки.
Пытаясь понять особенности жизни клеток, а также повлиять на биохимические процессы
в них, ученые уже давно применяют различные модели мембран и мембранных
образований. В их числе – синтетические пузырьки – липосомы и полимерсомы,
сконструированные из липидов и полимеров соответственно. Такие наночастицы активно
используются в косметической и фармацевтической биотехнологии в качестве нанокапсул
для доставки активных биологических молекул внутрь клеток.
Конструирование искусственных мембрано-подобных наносистем дает ученым
возможность создания микрореакторов, моделирующих процессы в живых клетках.
Наибольших результатов в этой области можно добиться, если использовать для
конструирования природные компоненты.Ученые из французского Университета Бордо
(University of Bordeaux) осуществили синтез искусственных мембранных пузырьков из
гибридных молекул, в состав которых входят цепочки из сахаров (полисахариды) и
фрагменты белковых структур (полипептиды). Полисахарид и полипептид химически
"пришиты" друг к другу, а построенная таким образом молекула содержит ярко
выраженные гидрофобный (белковый) и гидрофильный (сахарный) участки. Такие
молекулы в водном растворе способны самопроизвольно организовываться в
шарообразные наноструктуры.
Для создания гидрофильного сахарного фрагмента ученые использовали полисахарид
декстран, состоящий из соединенных между собой остатков глюкозы. Гидрофобным
фрагментом служила α-спираль биосовместимого полипептида PBLG (поли-γ-бензил-Lглутамата). Соединение этих двух фрагментов ученые провели с использованием
современного синтетического подхода конъюгирования сложных органических молекул,
называемого
клик-химией
("click"
chemistry
–
катализируемой
реакции
циклоприсоединения азидов к алкинам с региоспецифичным образованием 1,4
дизамещенных 1,2,3 – триазолов). Этот подход обеспечивает протекание реакции в мягких
условиях, практически количественный выход продукта и отсутствие необходимости
защиты многочисленных функциональных групп.Таким способом ученым удалось
добиться получения амфифильного сополимера (имеющего гидрофобную и
гидрофильную части), молекулы которого самопроизвольно ориентируются в водном
растворе с образованием полых сферических наночастиц. Это происходит благодаря
высокому сродству друг к другу гидрофобных частей молекул, скрываемых между слоями
гидрофильных фрагментов. Толщина таких трехслойных стенок, по результатам
проведенных с помощью электронной микроскопии измерений, составляет 21 нм, а сами
частицы имеют один и тот же диаметр – около 90 нм.
Описанная методика позволяет создавать различные нано-сферы, используя и другие
синтетические гибридные молекулы гликопептидов, что дает возможность
продвигатиться в изучении свойств многочисленных типов углеводных цепей
(гликомика).
Конечно же, ученые считают, что одним из самых перспективных направлений работы с
наночастицами, имитирующими мембранные образования, станет разработка нового
поколения нано-капсул для транспорта в клетки лекарств, генов и других биологически
активных молекул. Углеводная оболочка таких капсул своим составом напоминает
поверхность клетки, и наночастицы хорошо адсорбируются на ней.
Лекция № 3 Физические и биофизические методы, используемые в биотехнологии
1. Молекулярная, мембранная и клеточная биофизика
2. Физические и биофизические методы исследования
1.Молекулярная биофизика.
1. Общие свойства биологических молекул.
Основные классы биологических молекул. Белки. Нуклеиновые кислоты. Углеводы.
Липиды. Тейхоевые кислоты. Витамины. Гормоны. Пигменты. Физические и физико-
химические свойства биологических молекул. Биологические макромолекулы как
кооперативная система. Внутреннее вращение и поворотная изомерия. Модель Изинга.
Роль воды в формировании молекулярных и надмолекулярных структур клетки.
Асимметрия биологических молекул.
2. Структура белков.
Химическая структура аминокислот. Классификация аминокислот. Физико-химические
свойства аминокислот. Химическое строение белковых молекул. Пептидная связь.
Классификация уровней макромолекулярной организации белков. Первичная структура
белков. Принцип минимизации свободной энергии и самосборка белков. Альфа - спираль
и бета-формы. Силы, стабилизирующие вторичную структуру. Вандерваальсовы силы.
Электростатические взаимодействия. Водородная связь. Третичная структура белков.
Белковая глобула. Факторы, определяющие третичную структуру. Гидрофобные
взаимодействия. Дисульфидные связи. Субъединицы белков и четвертичная структура.
Физико-химические свойства белков. Денатурационные и неденатурационные
конформационные переходы и кооперативность. Термодинамика и кинетика
денатурационного процесса. Динамика белковой макромолекулы.
3. Функция белков.
Функции белков. Ферментативный катализ. Апоферменты и коферменты. Простетические
группы.
Стереоспецифичность.
Фермент-субстратный
комплекс.
Кинетика
ферментативного катализа. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Основные параметры
ферментативного катализа. Механизмы ингибирования. Теория абсолютных скоростей
реакций. Понятие об активированном комплексе. Термодинамика ферментативного
катализа. Пути снижения энергии активации. Роль четвертичной структуры ферментов в
ферментативном катализе. Аллостерические ферменты. Положительная и отрицательная
кооперативность. Оценка степени кооперативности по уравнению Хилла. Изоферменты.
Структура и транспортная функция гемоглобина и сывороточного альбумина.
Механохимические функции белков. Структурные основы и энергетика мышечного
сокращения. Контрактильные белки. Иммунологические функции белков. Антитела.
Рецепторная и медиаторная функции белков.
4. Структура нуклеиновых кислот.
Химическое строение нуклеиновых кислот. Азотистые основания, нуклеозиды и
нуклеотиды. Первичная структура нуклеиновых кислот. Правила Чаргаффа. Вторичная
структура ДНК. Силы, стабилизирующие нуклеиновые кислоты. Механизм плавления
нуклеиновых кислот. Обратимая денатурация ДНК, ДНК-белковые и ДНК-мембранные
комплексы. Хроматин. Нуклеосомы. Гистоны. Информационная, транспортная,
рибосомальная РНК. Макромолекулярная структура РНК.
5. Функция нуклеиновых кислот.
Роль нуклеиновых кислот в хранении и передаче генетической информации.
Регуляторные гены и оперон. Онкогены. Понятие гена. Генетический код и его свойства.
Экспрессия генов. Молекулярно-биофизические аспекты мутагенеза, конъюгации,
трансформации бактерий. Механизмы рекомбинации нуклеиновых кислот. Механизмы
транскрипции. Сплайсинг. Роль комплементарности оснований и РНК-полимера в
правильности считывания информации. Функции матричной РНК и транспортной РНК.
Активация аминокислот и взаимодействие кодон-антикодон. Биосинтез белка. Рибосомы
и полирибосомы. Механизмы регуляции биосинтеза белка. Методы молекулярнобиологического синтеза. Вестерн-блоттинг. Саузерн-блоттинг. Нозерн-блоттинг. ПЦРанализ. Методы модификации экспрессии белков в клетке.
6. Структура липидов и их классификация.
Классификация липидов и их строение. Жирные кислоты. Фосфолипиды. Гликолипиды.
Физико-химическая характеристика липидов. Перекисное окисление липидов.
7. Функция липидов.
Роль липидов в осуществлении каталитических, транспортных, рецепторных и
энергетических процессов. Участие липидов в процессах внутриклеточной сигнализации
(фосфоинозитидный цикл, метаболиты арахидоновой кислоты и т.д.).
Мембранная и клеточная биофизика.
1. Искусственные фосфолипидные мембраны.
Липидный биослой. Липосомы. Мезоморфные состояния липидов. Фазовые переходы и
фазовое разделение. Понятие о кооперативной единице. Ионная проницаемость липидных
мембран.
2. Природные мембраны.
Классификация
мембран
по
происхождению
(плазматические,
ядерные,
митохондриальные и т.д.). Химический состав. Белки, липиды, углеводы.
Надмолекулярная организация мембран. Твердокаркасная и жидкомозаичная модели
мембран. Роль электростатических и гидрофобных взаимодействий в стабилизации
структуры мембран. Липидный бислой, аннулярные липиды. Белок-липидные
взаимодействия. Периферические и интегральные белки. Пространственная асимметрия
белков и липидов в мембранах. Микровязкость и текучесть мембран. Типы подвижности
мембранных компонентов и их временной диапазон. Флип-флоп переходы.
Кооперативные переходы и их классификация, роль белков и липидов.
Калориметрический анализ фазовых переходов. Понятие генерализации в
дальнодействии. Роль электрического и осмотического потенциалов в структурной
организации мембран. Примембранные белковые структуры (микротрубочки,
микрофиламенты). Проницаемость мембран и транспорт веществ. Диффузия,
облегченный транспорт. Ионные каналы. Кинетические и термодинамические
закономерности. Транспортеры. Активный транспорт. Осмотическая работа. Источники
энергии. Сопряженный характер транспорта ионов и веществ. Вторично активный
транспорт. Симпорт и антипорт. Натрий-калий активируемые АТФазы. Натриевый и
кальциевый насосы, протонная помпа- строение и функции. Ионные обменники.
Транспорт углеводов, аминокислот и нуклеотидов. Потенциал покоя. Понятие о
равновесном потенциале. Уравнение Гольдмана-Ходжкина и Каца.
3. Биофизические механизмы возбудимости.
Натриевые, калиевые и кальциевые каналы. Потенциал действия. Активация и
инактивация каналов. Механизм распространения потенциала действия по возбудимым
мембранам. Роль кальция в регуляции возбудимости. Синапсы. Химические и
электрические механизмы синаптического проведения. Медиаторы и их роль. Пре- и
постсинаптические
рецепторы.
Механизмы
выделения
нейромедиатов.
Электромеханическое сопряжение в мышечном сокращении. Биофизика клетки. Физикохимические свойства клетки и ее элементов. Биофизика клеточных процессов.
Механические, осмотические и электрические явления в клетках. Биофизические
механизмы клеточного гомеостаза. Биофизика подвижности и цитоскелета. Организация
сократительного аппарата мышц. Механизмы мышечного сокращения. Регуляция
процессов сокращения мышц. Немышечная подвижность и сократимость.
Электромеханическое сопряжение.
4. Биоэнергетика.
Источники энергии и ее запасание в макроэргических соединениях. АТФ и другие
макроэрги. Природа макроэргичности. Гликолиз, цикл Кребса, электрон-транспортные
цепи. Олигомерные комплексы дыхательной цепи. Наружная и внутренняя мембраны
митохондрий. Локализация ферментов и переносчиков электронов. Роль мембраны в
сопряжении между окислением и фосфорилированием согласно хемоосмотической
гипотезе Митчелла. АТФ-синтетаза. Роль конформационной подвижности протонных
редокс-помп и АТФ-синтазных комплексов в трансформации энергии. Электроннотранспортные процессы и сопряжение в хлоропластах. Принципы и механизмы
трансформации энергии АТФ в различные виды работы (химическая, механическая,
осмотическая).
5. Биофизика регуляторных процессов.
Нервная и гуморальная регуляция. Геномная и метаболическая регуляция. Рецепторная
природа первичного регуляторного акта. Иерархия регуляторных контуров. Регуляция на
уровне отдельных макромолекул. Аллостерия. Взаимодействие гистон - ДНК и репрессор
- ДНК. Ретроингибирование и отрицательные обратные связи. Мембранный уровень
регуляции. Основные этапы внутриклеточной сигнализации. Рецепторы для гормонов,
нейромедиаторов и биологически активных веществ. Вторичные мессенджеры. Аденилати гуанилатциклазная системы, фосфоинозитидный цикл и цикл арахидоновой кислоты.
Ионы кальция, окись азота и пероксид водорода. Протеинкиназы, фосфатазы.
Фосфорилирование и дефосфорилирование мембранных и внутриклеточных белков.
Трансдукция рецепторного сигнала. Структурные перестройки мембран. G-белки и их
функциональная роль. Участие мембранною цитоскелета во внутриклеточной
сигнализации. Клеточная информатика.
6. Физико-химические основы фотобиологических процессов.
6.1. Основные понятия и законы фотофизики и фотохимии.
Поглощение света. Биохромофоры. Пути дезактивации электронно-возбужденных
состояний. Типы фотохимических и фотобиологических реакций. Стадии
фотобиологических реакций. Фотохимия белков, нуклеиновых кислот и липидов.
6.2. Фотосинтез.
Итоговая реакция фотосинтеза, КПД. Состав и структурная организация
фотосинтетического аппарата. Пигменты. Светособирающие комплексы и миграция
энергии. Две фотосистемы и цепь транспорта электронов. Фотосинтетическое
фосфорилирование. Кислород-выделящая функция. Роль мембранной организации в
функционировании фотосинтетического аппарата. Цикл Кальвина.
6.3. Фоторецепция.
Структурная организация фоторецепторных мембран. Физика и химия зрительной
рецепции. Родопсин, его фотопревращения. Механизм передачи сигнала от мембран диска
к наружной плазматической мембране. Роль белков и циклических мононуклеотидов.
Механизм формирования и регуляции рецепторного потенциала.
2.Физические и биофизические методы исследования.
Седиментационный анализ. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности. Различные
варианты
хроматографического
анализа.
Электрофорез.
Изоэлектрическое
фокусирование. Полярография. Электронная микроскопия. Замораживание и скалывание.
Рентгеноструктурный анализ. Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм.
Флуоресцентные метки и зонды. Спектры действия, спектрально-абсорбционный анализ.
Рамановская спектроскопия. ИК-спектроскопия. ЭПР-спектроскопия. Спиновые метки и
зонды. Ядерный магнитный резонанс. Калориметрия. Изотопные методы исследования.
Методы измерения концентрации кальция и других внутриклеточных ионов. Проточная
цитометрия. Микроэлектродная техника. Физические основы томографии.
Лекция № 4 Методы изучения биополимеров
1. Биополимеры
2. Общие лабораторные методы
1.Белки и нуклеиновые кислоты, как нерегулярные линейные полимеры. Многообразие
биополимеров.
Аминокислотный состав белков. Алифатические аминокислоты - глицин, аланин, валин,
лейцин, изолейцин. Аминокислота - пролин. Ароматические аминокислоты фенилаланин, триптофан, тирозин. Оксиаминокислоты - серин и треонин. Дикарбоновые
аминокислоты и их амиды - глутаминовая и аспарагиновая аминокислоты, глутамин и
аспарагин. Основные аминокислоты - лизин, аргинин и гистидин. Серосодержащие
аминокислоты - цистеин и метионин. Цистин, оксилизин и оксипролин - продукты
превращения аминокислотных остатков в составе белковых молекул. Пептидная связь.
Электрохимические и спектральные характеристики пептидной связи, боковых и
концевых групп белков и пептидов.
Нуклеозиды и нуклеотиды - низкомолекулярные компоненты нуклеиновых кислот. Рибоза
и дезоксирибоза. Главные гетероциклы - аденин, гуанин, цитозин и тимин или уроцил.
Рибонуклеозиды - аденозин, гуанозин, цитидин, уридин. Дезоксирибонуклеозиды дезоксиаденозин, дезоксиаденозин, дезоксицитидин, тимидин. Минорные компоненты,
как продукты превращения мономеров в составе нуклеиновых кислот. Метелирование
гетероциклических оснований. Дигидроуридин. Псевдоуридин. Нуклеотиды - фосфаты
нуклеозидов. Моно-, ди- и тринуклеотиды. Межнуклеотидная связь. Рибонуклеиновые
кислоты (РНК). Дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК). Электрохимические и
спектральные характеристики нуклеозидов и нуклеотидов.
Нековалентные взаимодействия в биополимерах. Электростатические взаимодействия.
Водородные связи. Ван-дер ваальсовы взаимодействия. Гидрофобные и гидрофильные
группы в биополимерах. Специфические взаимодействия между гидрофобными
участками в водных растворах (гидрофобные взаимодействия). Межплоскостные
взаимодействия ароматических и сопряженных гетероциклических систем (стекинг взаимодействия). Понятие о вторичной структуре белков. Альфа-спиральная конформация
полипептидных цепей. Бета-конформация пептидной цепи. Образование спиральных
структур в полинуклеотидах за счет стекинг-взаимодействия.
Специфические взаимодействия в биополимерах. Многоточечность и кооперативность
специфических взаимодействий. Понятие о комплементарных гетероциклах в
нуклеиновых
кислотах.
Комплементарные
последовательности
нуклеотидов.
Специфические взаимодействия между комплементарными полинуклеотидными цепями,
как пример специфического взаимодействия. Пространственная структура нативной ДНК
(модель Уотсона и Крика). Правило Чаргаффа. Возможность комплементарных
взаимодействий между участками одной полинуклеотидной цепи. Третичная структура
биополимеров, как итог специфических внутримолекулярных взаимодействий. Роль
дисульфидных связей в образовании третичной структуры белков. Рентгеноструктурный
анализ пространственной структуры кристаллических белков и нуклеиновых кислот.
Специфические межмолекулярные взаимодействия биополимеров между собой и с
низкомолекулярными компонентами. Четвертичная структура белков. Субъединицы
белков. Комплексы белков с нуклеиновыми кислотами - нуклеопротеиды. Основные
классы нуклеопротеидов - хроматин, рибосомы, вирусы, бактериофаги. Биологические
мембраны. Фосфолипиды. Липопротеидные комплексы в биологических мембранах.
Значение специфических межмолекулярных взаимодействий. Специфическая сорбция
малых молекул. Гемоглобин и его взаимодействие с кислородом. Сорбция субстратов
ферментами. Сорбция низкомолекулярных соединений транспортными белками мембран.
Белковые рецепторы в мембранах и их взаимодействия с эффекторами. Взаимодействия
между белками. Взаимодействие антиген - антитело. Самосборка белков из субъединиц.
Самосборка вирусов и рибосом. Способность биополимеров к узнаванию и
самоорганизации - результат специфической пространственной структуры с организацией
области узнавания.
Конформационная лабильность биополимеров. Нативное и денатурированное состояние.
Потеря способности к специфическим взаимодействиям при денатурации. Обратимость
переходов между нативным и денатурированным состоянием. Множиство фиксированных
(функционально
значимых)
конформаций
биополимеров.
Направленные
конформационные переходы под действием низкомолекулярных соединений.
Конформационные переходы и мышечное сокращение. Транспорт веществ через
фосфолипидные меамбраны. Передача сигнала внутрб клетки путем взаимодействия
специальных белков-рецепторов со специфическими к ним низкомолекулярными
соединениями. Взаимодействие репрессора с оператором. Значение направленных
конформационных переходов для регуляции ферментативной активности. Направленные
перемещения молекул, как результат направленных конформационных переходов.
Первичная структура биополимеров. Направление полимерной цепи в белке от N-конца к
С-концу и от5’-конца к 3’-концу в нуклеиновой кислоте. Определение мономерного
состава биополимеров. Расщепление белков до аминокислот и гидролиз нуклеиновых
кислот до свободных гетероциклов. Ферментативные методы расщепления. Методы
разделения и анализа смесей мономеров.
Фенилтиогидантоиновый метод ступенчатого расщепления полипептидов с N-конца
(метод Эдмана). Автоматические секвенаторы полипептидов. Специфические методы
расщепления полимеров на крупные блоки. Ферментативное расщепление белков
специфическими протеазами - трипсином, химотрипсином, пепсином и др. Химические
методы расщепления полипептидных цепей. Бромциановый метод. Расщепление
дисульфидных связей. Метод перекрывающихся блоков для установления порядка
полученных фрагментов в исходной полипептидной цепи. Специфические рибонуклеазы.
Расщепление ДНК ферментами рестрикции. Физические карты ДНК. Методы
специфической химической модификации ДНК. Специфическое расщепление ДНК.
Метод Максама-Гильберта и метод Сенгера.
2. Общие принципы и составные части биохимического исследования. Место
аналитических процедур в биохимических исследованиях. Аналитический процесс,
уровни его реализации. Стадии проведения анализа. Метрологические характеристики
аналитической процедуры, цель и задачи метрологического обеспечения в биохимическом
анализе, основные метрологические характеристики. Стандартизация подходов к
выполнению анализа, принципы добросовестной лабораторной практики. Источники
ошибок и артефактов в биохимическом анализе, возможные способы их обнаружения и
устранения.
Источники опасности и меры безопасности в лаборатории при проведении
биохимического анализа. Особенности применения общих лабораторных методов в
биохимическом эксперименте. Микро- и нанометоды.
Лабораторная посуда: материалы для её изготовления, выбор оптимального материала в
зависимости от поставленной задачи биохимического эксперимента, виды лабораторной
посуды, биосовместимые способы мытья и сушки лабораторной посуды, особые способы
подготовки лабораторной посуды для биохимического анализа.
Исходные реактивы для биохимической лаборатории. Сведения о реактивах: маркировка
реактивов, использование литературных и электронных источников справочной
информации. Особенности хранения реактивов для биохимического анализа. Способы
проверки качества и чистоты реактивов, выбор способа проверки, адекватного
поставленной аналитической задаче. Методы дополнительной подготовки и очистки
реактивов для биохимического анализа. Перекристаллизация.
Методы отбора реактивов в биохимическом анализе. Взвешивание: виды весов для
аналитической биохимии, принципы и источники погрешностей взвешивания.
Дозирование жидкостей, использование пипеточных дозаторов, возможные источники
погрешностей. Особенности приготовления растворов в аналитической биохимии:
принципы приготовления, способы выражения, концентраций, растворимости,
растворители для биохимического анализа, способы постепенного добавления реактивов,
растворение плохо растворимых веществ (суспендирование, эмульгирование, детергенты,
использование которых допустимо в биохимическом анализе). Буферные растворы для
использования в биохимическом анализе.
Методы контроля температуры в биохимической лабораторной практике.
Необходимость проведения ряда биохимических анализов в специальных условиях.
Техника работ с реагентами, чувствительными к влаге, кислороды воздуха и свету.
Проведение реакций в апротонных растворителях, в безводных условиях и в инертной
атмосфере. Техника проведения фотохимических реакций.
Техника проведения экстракции в водную фазу и органическими растворителями.
Высушивание органических растворов. Распределение между растворами полимеров,
примеры
широко
применимых
в
биохимическом
анализе
систем
(декстран/полиэтиленгликоль). Барьерные методы (фильтрация, диализ, осмос на
мембранах) в аналитической биохимии. Общие принципы осаждения веществ из
растворов, особенности осаждения биомолекул, условия осаждения, препятствующие
нарушению пространственной структуры биологических макромолекул. Высушивание
осадков. Методы концентрирования растворов: ультрафильтрация, упаривание на
роторном испарителе, распылительная сушка, лиофилизация, концентрирование
диализом, осадительное концентрирование.
Лекция № 5 Методы анализа и синтеза нуклеиновых кислот
1. Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты
2. Генетическая информация и генная инженерия
1.Нуклеозиды и нуклеотиды как компоненты нуклеиновых кислот, их номенклатура,
структура, стереохимия, физические и химические свойства, биосинтез. Таутомерные
формы азотистых оснований. Минорные компоненты нуклеиновых кислот: Природные
модификации пуриновых и пиримидиновых оснований. Химические модификации
сахаро-фосфатного остова нуклеиновых кислот; свойства фосфоротиоатных и
метилфосфонатных аналогов. Нуклеотиды вне нуклеиновых кислот: аденозинтрифосфат
как универсальный аккумулятор энергии в клетке.
Первичная структура нуклеиновых кислот. Межнуклеотидные и N-гликозидные связи,
сходство и различие их свойств в составе ДНК и РНК. Полярность межнуклеотидной
связи и полинуклеотидной цепи. Определение первичной структуры нуклеиновых кислот.
Радиоактивное и нерадиоактивное мечение нуклеиновых кислот. Метод МаксамаГилберта (химическое секвенирование). Метод дидезокситерминаторов Сэнгера
(ферментативное секвенирование). Анализ первичной структуры РНК (использование
кДНК и прямые методы с применением ферментативной и химической деградации).
Нерадиоактивное мечение нуклеиновых кислот. Автоматизация секвенирования.
Вторичная структура нуклеиновых кислот. Рентгеноструктурные исследования ДНК.
Правила Чаргаффа. Двойная спираль ДНК по Уотсону и Крику и ее биологическое
значение. Основные типы двойных спиралей (правозакрученные А, В и др.,
левозакрученная Z). Стереохимические характеристики мономеров в составе различных
типов двухцепочечных ДНК. Основные характеристики двойных спиралей: шаг спирали,
углы спирального вращения, наклона, крена, пропеллер, смещение пар оснований
относительно оси спирали, большая и малая бороздки, изгиб. Хугстиновские
взаимодействия азотистых оснований; триплексы нуклеиновых кислот и их использование
в биологии. Денатурация и ренатурация двойных спиралей. Гиперхромия и гипохромия.
Гибридизация. Олиго- и полинуклеотидные зонды как инструмент исследования
нуклеиновых кислот. Сверхспирализация и зацепление ДНК: структурные характеристики
и биологическая роль. Особенности пространственной организации ДНК в биологических
системах (в вирусах, прокариотических и эукариотических клетках). Понятие о
хроматине.
2.ДНК как носитель генетической информации. Геном. Размеры геномов. Особенности
строения геномов вирусов, эубактерий, архей и эукариот. Хромосомы прокариот и
эукариот.
Уникальные
и
повторяющиеся
последовательности
нуклеотидов
эукариотического генома, их основные типы. Этапы воспроизведения и реализации
генетической информации: репликация, транскрипция, трансляция. Генетический код:
основные характеристики. Современное определение гена. Структурный ген:
непрерывность
и мозаичность
(экзон-интронная структура). Колинеарность
последовательностей генов и белков. Открытые рамки считывания (ОРС). Оперон.
Перекрывание генов. Мультигенные семейства. Экспрессия генов и уровни ее регуляции.
Основные этапы транскрипции. Необходимость регуляции экспрессии генов на уровне
транскрипции. Регуляторные последовательности прокариотических и эукариотических
генов. Особенности структуры бактериальных и эукариотических ДНК-зависимых РНКполимераз; обобщенные схемы промотора и терминатора РНК-полимеразы E.coli;
аттенюаторы; оператор; репрессоры и активаторы транскрипции бактериальных генов;
регуляция транскрипции бактериальных генов на примере lac-оперона E. coli. Промоторы
эукариотических ДНК-зависимых РНК-полимераз. Роль хроматина в регуляции
транскрипции у эукариот. Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации
РНК. Предшественники мРНК и их процессинг: обычный и альтернативный сплайсинг,
кэпирование, полиаденилирование, посттранскрипционные модификации нуклеотидов,
редактирование мРНК.
Основные этапы трансляции. Прокариотические и
эукариотические рибосомы: структура и функционирование. Рибосомные РНК и белки,
тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы. Посттрансляционный процессинг пептидов и белков.
Фолдинг белков.
Понятие о генной инженерии. Искусственный синтез нуклеиновых кислот. Основные
подходы к химическому замыканию межнуклеотидной связи (фосфодиэфирный,
фосфотриэфирный, амидофосфитный, гидрофосфонатный методы). Синтез на
полимерном носителе. Цикличность синтеза полимеров как основа для автоматизации.
Выделение, очистка и идентификация синтетических олиго- и полинуклеотидов.
Полимеразная цепная реакция и другие способы амплификации ДНК и сигналов. Общая
схема ПЦР. Критические компоненты реакции. Методы ПЦР. Ферменты, используемые в
генной инженерии. Этапы клонирования ДНК. Понятие вектора и его емкости.
Плазмидные векторы.
Белковая инженерия. Два основных направления исследований в белковой инженерии:
рациональный дизайн и направленная эволюция белковых молекул. Методы
направленного мутагенеза. Сплайсинг и транс-сплайсинг белков в лигировании пептидов.
Комбинаторные клонотеки последовательностей нуклеотидов. Методы введения
случайных мутаций. Методы отбора белков с требуемыми свойствами. Молекулярный
дисплей: фаговый, клеточный, рибосомный и мРНК-дисплей. N-Гибридные системы в
изучении белков. Исследование белок-белковых взаимодействий с использованием
тандемной аффинной очистки и тандемной масс-спектрометрии.
Геномика как новое направление исследований в постгеномную эру. Функциональная
геномика. Генетические и физические карты генома. Стратегия секвенирования больших
геномов.
Экспрессия генов. Исследование экспрессии генов на уровне транскрипции.
Транскриптом и необходимость его изучения. Северный блоттинг. Защита от действия
РНКаз. Дифференциальный дисплей (DD). Анализ репрезентативных различий РНК
(RDA). Серийный анализ экспрессии генов (SAGE). Супрессорная вычитающая
гибридизация. Использование микроматриц и микрочипов нуклеиновых кислот для
крупномасштабного профилирования экспрессии генов. Изменение уровней экспрессии
генов с использованием нуклеиновых кислот. Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды.
Лекция № 6 Методы генетической инженерии в биотехнологии
1. Определение генетической инженерии
2. Методы генетической инженерии
1.Генетическая инжене́рия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и
технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма
(клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.
Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является
инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как
молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология
2.Сейчас созданы и создаются ещё более остроумные методы введения генов в клетку
прокариотов (организмов, не имеющих оформленного ядра и хромосомного аппарата). На
очереди разработка методов введения новых генов в клетки эукариотов, прежде всего
высших растений и животных организмов.
Но и то, что уже достигнуто, позволяет сделать очень многое в практике народного
хозяйства. Возможности микробиологического производства значительно расширились.
Благодаря генетической инженерии область микробиологического синтеза различных
биологически активных соединений, полупродуктов для синтеза, кормовых белков и
добавок и других веществ стала одной из наиболее окупаемых наук: вложение средств в
перспективные биотехнологические исследования обещает получение высокого
экономического эффекта.
Для селекционной работы, независимо от того, проводится она методами мутагенеза или
«индустрии ДНК», учёные должны располагать многочисленными коллекциями
микроорганизмов. Но сейчас даже выделение нового штамма природных
микроорганизмов, ранее неизвестных науке, обходится на мировом «рынке
бактериальных культур» приблизительно в 100 долларов. А для того, чтобы получить
хороший промышленный штамм обычными селекционными методами, надо иногда
затратить миллионы.
Сейчас уже существуют способы ускорить и удешивить эти процессы. Например, во
Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции микроорганизмов
Главмикробиопрома
был
получен
промышленный
штамм-сверхпродуцент
микроорганизма, синтезирующего треонин — незаменимую аминокислоту, которая в
кормах сельскохозяйственных животных содержится в недостаточном количестве.
Добавка треонина в корм повышает привесы животных на килограммы, что в масштабах
страны оборачивается миллионами рублей прибыли, а самое главное — приростом
мясной продукции животноводства.
Коллектив учёных института под руководством директора В. Г. Дебабова за основу для
получения промышленного штамма взял обыкновенную кишечную палочку —
повсеместно распространённый микроорганизм. Сначала были получены мутантные
клетки, способные накапливать в среде избыток треонина. Затем в клетке были вызваны
генетические изменения, которые привели к усилению биосинтеза аминокислот. Таким
путём удалось получить штамм, который производил треонин, но в 10 раз меньше того
количества, которое требовалось по соображениям рентабельности производства. Тогда в
дело были выпущены методы генетической инженерии. С их помощью была увеличена
«доза треонинового гена» в молекуле бактериальной ДНК. Причём количество генов,
обусловливающих синтез треонина, было в молекуле ДНК клетки увеличено в несколько
раз: одинаковые гены оказались как бы нанизанными один за другим в молекуле ДНК.
Естественно, биосинтез треонина пропорционально увеличился и достиг уровня,
достаточного для промышленного производства.
Правда, после этого штамм пришлось ещё улучшать, причём снова генетически. Сначала
для того, чтобы культуру бактерий очистить от клеток, в которых плазмиды с
«треониновым геном» исчезали в процессе размножения культуры. Для этого в клетки
был «вшит» ген, содержащий закодированный сигнал к «самоубийству» клеток, в которых
плазмид с «треониновым геном» после деления не оказывалось. Таким путём культура
клеток самоочищалась от балластных микроорганизмов. Затем в клетки был введён ген,
благодаря которому она могла развиваться на сахарозе (а не дорогих глюкозе и фруктозе,
как раньше) и производить рекордные количества треонина.
По существу, полученный микроорганизм уже не был кишечной палочкой: манипуляции с
его генетическим аппаратом привели к появлению принципиально нового организма,
сконструированного вполне сознательно и целенаправленно. И эта сложнейшая
многоступенчатая работа, имеющая огромное практическое значение, была проведена с
помощью новых оригинальных методов генетической инженерии за очень короткий
срок — всего за три года.
К 1981 г. в ряде институтов страны, и прежде всего в Институте биоорганической химии
им. М. М. Шемякина АН СССР под руководством академика Ю. А. Овчиникова, были
выполнены ещё более впечатляющие работы. Эти исследования приобрели сейчас форму
чётких долгосрочных программ, по которым их развивают дальше ряд академических и
отраслевых институтов. Эти исследования были направлены на то, чтобы осуществить
поистине чудо — ввести в бактериальную клетку ген, выделенный из человеческого
организма.
Работа велась сразу с несколькими генами: геном ответственным за синтез гормона
инсулина, геном, обеспечивающим образование интерферона, и геном, контролирующим
синтез гормона роста.
Прежде всего учёные поставили перед собой задачу «обучения» бактерии синтезу
ценнейшего медицинского препарата — гормона инсулина. Инсулин необходим для
лечения сахарного диабета. Этот гормон надо вводить больным постоянно, а
производство его традиционным способом (из поджелудочных желез убойного скота)
сложно и дорого. К тому же молекулы инсулина свиньи или крупного рогатого скота
отличаются от молекул инсулина человека, и естественно, что активность их в организме
человека ниже, чем активность человеческого инсулина. Кроме того, инсулин — хотя и
небольшой по размерам, но всё же белок, и в организме человека со временем
накапливаются антитела к нему: организм борется против чужеродных белков, отторгает
их. Поэтому введённый бычий или свиной инсулин может начать необратимо
инактивироваться, нейтрализовываться этими антителами и в результате может исчезнуть
прежде, чем успеет оказать лечебное действие. Чтобы этого не произошло, необходимо
вводить в организм вещества, предотвращающие этот процесс, но они сами по себе не
безразличны для организма.
Человеческий инсулин можно было бы получать с помощью химического синтеза. Но этот
синтез настолько сложен и дорог, что его проводили только в экспериментальных целях, а
полученные количества инсулина были недостаточны даже для одной инъекции. Это был,
скорее, символической синтез, доказательство того, что химики могут синтезировать в
пробирке настоящий белок.
Учитывая всё это, учёные и поставили перед собой такую сложную и очень важную
задачу — наладить биохимическое производство человеческого инсулина. Был получен
ген, обеспечивающий синтез инсулина. С помощью методов генетической инженерии этот
ген был введён в бактериальную клетку, которая в результате приобрела способность
синтезировать гормон человека.
Столь же большой интерес и не меньшее (а может быть, и большее) значение имела
работа, выполненная в том же институте, по введению методами генетической инженерии
в бактериальную клетку гена, ответственного за синтез интерферона человека.
(Интерферон — это белок, играющий исключительно важную роль в борьбе организма
против вирусных инфекций.) Ген интерферона также был введён в клетку кишечной
палочки. Созданные штаммы отличались высоким выходом интерферона, обладающего
мощным противовирусным действием. Сейчас уже получены первые промышленные
партии человеческого интерферона. Осуществление промышленного производства
интерферона — очень важное достижение, так как предполагают, что интерферон
обладает также и противоопухолевой активностью.
Пока речь шла о введении генов в клетки бактерий. Но это не означает, что не ведётся
работа и по введению искусственных генов в высшие организмы — растения и животных.
Здесь не меньше, а гораздо больше привлекательных идей. Практическое воплощение
некоторых из них будет иметь для человечества исключительно важное значение. Так,
известно, что высшие растения не могут усваивать азот атмосферы: они получают его из
почвы в виде неорганических солей или в результате симбиоза с клубеньковыми
бактериями. Осуществление идеи — ввести гены этих бактерий в растения — может
привести к коренным революционным изменениям в сельском хозяйстве.
Как же обстоят дела с введением генов в генетический аппарат эукариотов? Основная
трудность здесь заключается в том, что изменить генотип всех клеток многоклеточного
организма невозможно. Поэтому надежды связывают с созданием методов генетической
инженерии, предназначенных для работы с культурами клеток растений и с
одноклеточными растениями.
Введение синтетических генов в искусственно культивируемые клетки может привести к
получению модифицированного растения: при определённых условиях изолированные
клетки могут превращаться в целые растения. И в таком растении должны действовать и
передаваться по наследству искусственно введённые в исходную клетку гены.
Здесь помимо перспектив успешного использования методов генетической инженерии
вырисовывается ещё одно преимущество биотехнологии — методом клеточной
биотехнологии из одного растения можно получить миллионы одинаковых растений, а не
десятки, как при использовании семян. Клеточная технология не требует больших
площадей, не зависит от погодных условий и отличается огромной производительностью.
Советские учёные сейчас исследуют ещё один путь введения генов в клетки растений —
создают симбиотическое сообщество, где в протопласты растений (они лишены
целлюлозной оболочки) пытаются внедрить цианобактерии, которые способны и к
фотосинтезу, и к азотфиксации.
Определённые перспективы имеются и в области использования методов генетической
инженерии в работе с животными, во всяком случае существует принципиальная
возможность переноса генетического материала в клетки животных. Особенно
убедительно это показано на гибридомах. Гибридома — это клетка, образованная из
лимфоцита, вырабатывающего антитела, и опухолевой клетки, способной к
неограниченному размножению, и сочетающая оба эти свойства. С помощь гибридом
можно получать высокоспецифичные антитела. Метод гибридом — это ещё один
биотехнологический приём получения ценных белков.
Лекция № 7 Иммунологические методы в биотехнологии
1. Иммунобиотехнология
2. Методы
анализа:
иммуноферментный,
иммунолюминесцентный,
иммунорадиологический
1.Иммунобиотехнология как один из разделов биотехнологии. Основные составляющие
и пути функционирования иммунной системы. Иммуномодулирующие агенты:
иммуностимуляторы и иммуносупрессоры (иммунодепрессанты). Усиление иммунного
ответа с помощью иммунобиопрепаратов. Вакцины на основе рекомбинантных
протективных антигенов или живых гибридных носителей. Антисыворотки к
инфекционным агентам, к микробным токсинам. Технологическая схема производства
вакцин и сывороток. Неспецифическое усиление иммунного ответа. Рекомбинантные
интерлейкины, интерфероны и др. Механизмы биологической активности. Тимические
факторы. Трансплантация костного мозга. Подавление иммунного ответа с «помощью
нммунобиопрепаратов. Рекомбинантные антигены. IgE - связующие молекулы и
созданные на их основе толерогены. Иммунотоксины. Антиидиотипические антитела в
качестве
мишени
для
аутоантител.
Специфическая
плазмоиммуносорбция.
Неспецфическое подавление иммунного ответа Моноклональные антитела против
цитокинов. Неспецифичная гемосорбция и иммуноплазмофорез. Медиаторы
иммунологических процессов. Их функциональная совокупность. Обеспечение
гомеостаза.
Технология
рекомбинантной
ДНК
и
получение
медиаторов
иммунологических процессов.
Производство моноклональных антител и использование соматических гибридов
животных клеток. Механизмы иммунного ответа на конкретный антиген. Разнообразие
антигенных
детерминантов.
Гетерогенность
(поликлональность)
сыворотки.
Преимущества при использовании моноклональных антител. Клоны клеток
злокачественных новообразований. Слияние с клетками, образующими антитела.
Гибридомы. Криоконсервирование. Банки гибридом. Технология производства
моноклональных антител. Области применения моноклональных антител. Методы
анализа, основанные на использовании моноклональных (в отдельных случаях
поликлональных) антител. Иммуноферментный анализ (ИФА). Метод твердофазного
иммуноанализа (ELISA - enzyme linked immunosorbentassay). Радиоиммунный анализ
(РИА). Преимущества перед традиционными методами при определении малых
концентраций тестируемых веществ и наличии в пробах примесей с близкой структурой и
сходной биологической активностью. ДНК- и РНК-зонды как альтернатива ИФА и РИА
при скрининге продуцентов биологически активных веществ (обнаружение генов вместо
продуктов экспрессии генов). Моноклональные антитела в медицинской диагностике.
Тестирование гормонов, антибиотиков, аллергенов и т.д. Лекарственный мониторинг.
Ранняя диагностика онкологических заболеваний. Коммерческие диагностические наборы
на международном рынке. Моноклональные антитела в терапии и профилактике.
Перспективы высокоспецифичных вакцин, иммунотоксинов. Включение моноклональных
антител в оболочку липосом и повышение направленности транспорта лекарств.
Типироваиие подлежащих пересадке тканей. Обязательное тестирование препаратов
моноклональных антител на отсутствие онкогенов. Моноклональные антитела как
специфические сорбенты при выделении и очистке биотехнологаческих продуктов.
2.Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный
инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные
фрагменты или целые клетки.
Начало широкому использованию антител в диагностических целях положил в 1955 году
американский иммунолог А. Кунс. Он присоединил к антителам светящийся краситель.
Флюоресцирующие антитела сделали видимыми места расположения интересующих его
молекул в клетке. Этот метод получил название иммунофлюоресцентного.
Чувствительность метода можно повысить несколькими путями. В первом случае
иммунный ответ усиливается за счет применения антител нескольких порядков:
Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка,
связывающиеся непосредственно с антигеном. В исследуемый образец добавляются
антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го
порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую (или другую) метку.
Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более
отчетливо. Другая система усиления сигнала основана на высоком сродстве биотина
(низкомолекулярного растворимого витамина) к стрептавидину (бактериальному белку).
Здесь возможны два варианта: А. Если возможно коваленafтно связать биотин
непосредственно с антителами, то стрептавидин метят маркером и используют аналогично
антителам второго порядка:
Б. Система “биотин-антитело + стрептавидин + меченый биотин”:
В этом случае образуется целая сеть из молекул стрептавидина, связанного с меченым
биотином. Следовательно, происходит многократное усиление сигнала. Применение
антител второго и третьего порядков позволяет также упрощать процедуру определения
микроорганизмов в мазке. При этом не обязательно иметь меченые антитела против всех
бактерий. Достаточно иметь обычные антитела кролика или мыши против интересующего
микроорганизма и меченые МКА против этих иммуноглобулинов. Если микроорганизм в
мазке присутствует, то к нему “приклеятся” специфические антитела, а к ним уже меченые. В результате мазок будет светится при люминесцентной микроскопии.
Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех
случаях, например, если измерение проводят очень мутной среде. Кроме красителя в
качестве метки можно использовать фермент (иммуноферментный анализ) или
радиоактивный изотоп (иммунорадиологический). От чувствительности детекции маркера
зависит чувствительность метода анализа. Радиоактивные метки.
Выбор маркера и способа его «привязки» к антигену является одним из важных этапов в
проведении анализа. Первоначально широко применялись радиоизо тонные метки
(радиоиммунный анализ - РИА), предложенные американскими исследователями (С. А.
Берсон, Р. С. Ялоу, 1959). Однако в последние годы все более широкое использование в
Качестве маркеров находят ферменты. Это обусловлено рядом принципиальных
трудностей, связанных с применением изотопныx маркеров. Так, изотоп 125I имеет время
полураспада 60 суток, чем ограничивается срок его использования. Изотоп 3Н имеет
длительное время жизни (12.5 лет), однако под действием бэта-излучения происходит
распад молекул антигена, в результате чего время жизни меченых 3Н-соединений тоже
ограничено. Кроме того, эффективность счета трития существенно ниже, чем 125I.
Ограничивающими факторами РИА являются сложность и высокая стоимость
оборудования,
необходимость
централизованной
системы
распределения
иммунохимических наборов, меченных радиоактивными изотопами, определенная
опасность изотопов для окружающей среды. Учитывая трудности использования
ра¬диоизотопных меток, были предложены в качестве маркеров ферменты.
При иммуноферментном анализе антиген связывается с поверхностью лунки
полистирольного планшета. В лунку добавляют антитела, несущие фермент в качестве
метки, инкубируют и отмывают. Далее приливают субстрат, который меняет окраску при
взаимодействии с этим ферментом. Изменение окраски можно измерить с помощью
спектрофотометрии. Таким способом проводится индикация и количественная оценка
биоорганических
соединений
с
чувствительностью
до
10-12
г/литр.
В настоящее время известно более 2000 разных ферментов, однако только некоторые
находят применение в иммуноферментном анализе. Это объясняется высокими
требованиями, предъявляемыми к свойствам ферментов. Фермент должен быть высоко
активен, а продукты его реакции детектироваться с высокой чувствительностью, он
должен быть стабилен, так чтобы его активность сохранялась не менее одного года.
Содержание фермента-маркера в определяемом образце должно быть минимальным.
Именно из-за этого для разных объектов используют разные ферменты. Во многих
случаях, когда необходим качественный результат, оценка иммунохимической реакции
может быть проведена визуально.
Для введения ферментативной метки разработано много разных химических,
биохимических и иммунологических способов. Первым реагентом, использованным для
синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с
аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены
конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкоамилазой. В
настоящее время широко используются иммунопероксидазные конъюгаты и конъюгаты с
бэта-галактозидазой.
Ковалентные методы получения иммуноферментных конъюгатов нашли весьма
широкое распространение, однако к некоторых случаях действие сшивающего реагента
отрицательно сказывается на ферментативной и иммунологической активности
компонентов гибридной макромолекулы. В связи с этим определенный интерес
представляют иммунологические методы введения ферментной метки. Один из подходов
получил название метода «гибридных антител». Ферментативным гидролизом получают
Fab-фрагменты молекул антител против определяемого антигена и используемого
фермента. Затем
смесь
продуктов
гидролиза подвергают
восстановлению
меркаптоэтанодом; при этом Fab-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные
части. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, образуя
гибридные молекулы антител, специфичные к определяемому антигену и ферменту. При
добавлении фермента образуется комплекс антитело—фермент (рис. 19, а). Гибридомная
технология открывает принципиально новый путь получения гибридных антител, который
заключается в том, что сливаются моноклональные клетки, специфичные против данного
антигена и фермента-маркера, в результате чего образуются гибридомы второго
поколе¬ния, синтезирующие антитела, с двумя специфичностями.
Другой путь заключается в том, что получают антитела одного и того же вида
животного (например, кролика) против определяемого антигена и фермента, которые
соединяют между собой через антитела другого вида животных (антитела барана против
кролика). Добавление фермента к такой тройной молекуле также приводит к образованию
комплекса антитело—фермент. В настоящее время разрабатываются подходы получения
гибридных антител методами клеточной и генной инженерии, что позволит существенно
упростить способ их получения. Стабильность иммуноферментных конъюгатов при
хранении — важнейший параметр, обусловливающий возможность их практического
использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не
разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и
методом их получения. Однако высокая стабильность гибридных молекул обеспечивает
их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов,
меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные
конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет. Кроме ферментов в качестве маркеров
могут быть использованы субстраты. В частности, в иммунокофакторном анализе
применяются в качестве меток АТФ и НАД, которые могут быть «пришиты» к молекуле
антигена через адениновый остаток таким образом, что сохраняется их способность
взаимодействовать с ферментом. Аналогично были использованы субстраты пероксидазы
(люминол, изолюминол), которые могут быть окислены пероксидом водорода в реакции
хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой.
Лекция № 8 Информационные методы в биотехнологии
1. Перенос эффективной информации
2. Информационное адресное воздействие
2.Феномен осознанной психической деятельности (сознания) индивида и осознания им
своего собственного "Я" связан с переносом эфферентной информации с полевого уровня
Процессора БКС на клеточный и сопряжен с переводом информации из аналоговой
формы в дискретную. Порядок переноса информации из архивов долговременной памяти,
образов и идей из подсистем характеристического поля неокортекса контролируется
входящими в Аппарат афферентного синтеза нижними отделами головного мозга. Этот
процесс предполагает возможный многократный межуровневый перенос информации с
полевого уровня (из Процессора на клеточный уровень – выборку "текущей" информации
и информации, поступающей через него из архивов памяти) и обратный перенос
информации в Процессор для последующей ее переработки. Это обстоятельство налагает
на процессы переноса информации жесткие требования высокой оперативности и
точности межуровневой передачи информации. Перенос информации с клеточного
уровня на уровень Процессора отвечает этим требованиям, поскольку возбужденному
нейрону на полевом уровне соответствует характеристическое поле, спиновая система
которого содержит адекватную информацию о состоянии ней-рона. Механизм переноса
изучен и не имеет альтернативы. Иначе обстоит дело с механизмом переноса информации
с полевого уровня на уровень нервных клеток. Отсутствие результатов прямых
исследований механизма переноса (подобные исследования просто не проводились) и
недостаточность существующего экспериментального материала, необходимого для
построения приоритетной версии переноса, обуславливает спекулятивный характер наших
построений. Под указанной недостаточностью мы подразумеваем отсутствие данных о
взаимодействии клеточных – нервных и глиальных – элементов в качестве субстрата
Процессора, а также отсутствие экспериментальных данных о специфике
физиологических процессов в нижних слоях коры головного мозга. Несмотря на то, что
проблема переноса информации на клеточный уровень является наименее разработанной
областью в предлагаемой нами концепции полевого механизма сознания, ряд косвенных
данных и существующие знания в области молекулярной биологии клетки, касающиеся
специфики механизмов возбудимой ткани, позволяют наметить пути ее решения. Для
этого рассмотрения мы используем ряд полученных экспериментальных данных и
доступные нам имеющиеся в научной литературе материалы по участию нейроглии в
процессах мышления. При рассмотрении распределения нейроглии в коре головного
мозга и его корреляции с интенсивностью психической деятельности обращают на себя
внимание следующие факты.
1. В коре головного мозга количество глиальных клеток с возрастом увеличивается. Их
плотность возрастает от 30000 клеток на 10-е сутки до 85000 к 2 годам. Возрастное
увеличение количества нейроглии происходит исключительно за счет олигодендроцитов;
количество астроцитов несколько уменьшается. Из всех отделов головного мозга
прогрессивное нарастание олигодендроцитов наблюдается только в коре. Количество
олигодендроцитов возрастает в направлении от поверхности к нижним слоям коры, где их
больше всего на уровне больших пирамид в слое VI.
2. Начатые во второй половине ХХ столетия исследования природы второго компонента
прямого ответа коры, возникающего при сильном ее раздражении – медленного
отрицательного потенциала (МОП), привели к заключению о принадлежности МОП к
процессам нейро-глиального взаимодействия. Обнаружено затухание МОП как при
погружении в кору одного только отводящего электрода (раздражающие электроды
установлены на поверхности коры), так и при погружении блока из раздражающего и
отводящего электродов. В первом случае в серии экспериментов МОП, отражающий
деполяризацию глиальных клеток, исчезал на расстоянии от 850 до 2000 мкм от
поверхности. Во втором случае МОП исчез на глубине 2000 мкм. При дальнейшем
погружении электродов в глубинные слои коры вместо него регистрировался медленный
положительный потенциал, происхождение и функция которого не известны.
Существенное отличие реакции, возникающей в глубинных слоях от реакции,
регистрируемой на глубине 200-400 мкм от поверхности коры, свидетельствует о том, что
при одинаковых параметрах воздействующего стимула ответная деполяризация мембран
эфферентных глиальных клеток-сателлитов IV- VI слоев чрезвычайно слаба или же не
возникает вовсе. Отсутствие МОП в нижних слоях коры вопреки наличию условий,
необходимых для его возникновения, говорит о недостаточной изученности процессов,
происходящих в этих слоях (ранее исследования МОП и, соответственно, механизма
глиальной деполяризации проводились, в основном, на поверхности коры и в ее
приповерхностных слоях). Все вышесказанное позволяет предположить, что описанный
ранее механизм глиальной деполяризации присущ только глиа-нейронным комплексам,
расположенным в верхних слоях коры. В нижних слоях (в предполагаемой области
переноса эфферентной информации из Процессора) взаимодействие между нервными и
глиальными клетками может соответствовать иной функциональной направленности. В
частности, глие может быть отведена роль управляющей структуры. Исследование всех
обстоятельств, связанных с механизмом возникновения медленного положительного
потенциала, может способствовать раскрытию различных аспектов, относящихся к его
функции, в том числе и проверки верности высказанного предположения.
3. В работах авторитетных исследователей Галамбоса и Пурпура содержатся указания о
непосредственной причастности глиальных клеток к работе нейронов. Галамбос считал,
что глие генетически свойственно программировать деятельность нейронов ("нейроны
выполняют "инструкции", полученные от глии). Это представление подтверждается
данными Уокера и Хайлда, полученными в экспериментах in vitro, свидетельствующими о
существовании электрической связи нейронов с глиальными клетками. Нейроны, имевшие
низкое (как у сателлитных глиальных клеток) значение мембранного потенциала (20-40
мВ) и низкое (0,3 МОм) внутриклеточное сопротивление глиа-нейронного перехода, не
генерировали потенциал действия в результате шунтирования тока ионов частично
деполяризованными глиальными клетками. Пурпура полагал, что глия участвует в
формировании нервной деятельности путем воздействия на функцию синапсов. О
непосредственном участии нейроглиальных комплексов в процессах, связанных с
психической деятельностью человека, свидетельствует повышенная концентрации
перинейрональных глиальных клеток-сател-литов корковых пирамидных нейронов,
группирующихся чаще всего в изобилующих синапсами областях аксонного холмика и
апикального дендрита.
Все существующие версии возможного механизма переноса информации с полевого
уровня на уровень нервных клеток коры головного мозга основаны на участии глиальных
сателлитных клеток-эфферентов. Предполагается, что эти клетки, несущие информацию с
уровня подсознания на клеточный уровень, входят в состав глиа-нейронных комплексовэфферентов, расположенных в нижних слоях коры. Они наделены функцией управления
активностью нейронов-эфферентов, участвующих на клеточном уровне в переносе
информации из подсознания в корковые и подкорковые структуры. Глиальные клеткиэфференты представлены в Процессоре своими характеристическими полями в качестве
подсистем характеристического поля коры головного мозга
Все компоненты глиа-нейронного комплекса-эфферента строго локализованы в
соответствующих колонках сенсорных и ассоциативных областей коры. Соответственно, в
Процессоре, на уровне характеристического поля коры строго локализованы
характеристические поля глиальных эфферентов – компонентов этих комплексов.
Различные варианты механизма переноса эфферентной информации с полевого уровня
(уровня подсознания) на уровень клеточных структур коры головного мозга содержат ряд
следующих общих моментов:
1. В отсутствии на полевом уровне характеристического поля образа-эфферента перенос
на клеточный уровень информации, адекватной отсутствующему образу, заблокирован.
Блокада переноса информации с уровня подсознания (из Процессора) осуществляется
путем предотвращения возбуждения непрерывно иннервируемых нейронов-эфферентов.
Блокада возбуждения может осуществляться как на уровне плазматической мембраны
клетки, так и на уровне проведения нервного импульса по аксону и на синаптическом
уровне.
2. Непрерывная иннервация всех нейронов-эфферентов коры головного мозга
производится от единого источника из подкорковых структур головного мозга, например
от ретикулярной формации
3. Блокада возбуждения нейронов-эфферентов осуществляется соответствуюшими им
сателлитными группами глиальных клеток-эфферентов. Управление активностью
нейрона-эфферента основано на информации, приобретенной глиальными сателлитамиэфферентами, характеристические поля которых участвуют на полевом уровне в процессе
информационного взаимодействия со всеми подсистемами характеристического поля
коры. Такая информация закодирована в виде мембранных потенциалов эфферентных
глиальных клеток, адекватных внутриклеточной концентрации ионов калия. Конкретный
механизм управления активностью нейрона-эфферента может быть назван только после
изучения всех возможных вариантов управления сателлитными олигодендроцитамиэфферентами активностью нейронов-эфферентов. Изучение должно включать также
результаты исследования природы и возможной роли медленного положительного
потенциала в процессах переноса информации.
Наличие нескольких возможных
вариантов механизма переноса эфферентной информации с уровня подсознания на
уровень клеточных структур коры головного мозга и отсутствие прямых
экспериментальных данных вынуждает нас воздержаться от заключения в пользу одного
из них. Тем не менее, с целью продемонстрировать возможность решения проблемы
переноса информации с полевого уровня на клеточный, основанного на существующих
сегодня представлениях биофизики и нейророфизиологии, приведем один из возможных
вариантов механизма регулирования активности нервных клеток-эфферентов, в котором
рассмотрен возможный сценарий блокады возбуждения нейрона-эфферента.
2.Информационное адресное воздействие оператора приводит к изменению
спектрального состава шумов датчиков на полупроводниковых ИМС. На выходе ОУ
включена интегрирующая RC-цепь с постоянной времени 4 с. Цель воздействия –
изменение частотного состава в спектре шумов на выходе ОУ. Расстояние между
оператором и ИМС – 0,5 м. Стрелкой, обращенной к кривой, обозначено начало
воздействия; от кривой – его окончание. Оператор, наблюдая за изменениями выходного
потенциала датчика, стремился полностью подавить его флуктуации. Снижение величины
шума началось примерно на 10-й минуте после начала воздействия. Изменение тренда
потенциала возникло на 4-й – 5-й минуте после начала воздействия. Воспроизведите и я
протестирую его слепым методом. Я так поступал не раз и "100% регистрация" исчезала
под давлением фактов фальсификации. Ведь замечание коллег о воспроизводимости для
технических систем тем более существенны. Это биопрепараты могут отреагировать, как
сложная система, специфически. Дистантные информационные воздействия человека на
токовые электродные системы с целью изменения протекающих в них физико-химических
процессов приэлектродной поляризации.
Явление психокинеза. В токовой электродной системе роль одного из электродов
выполняет ее корпус, выполненный из нержавеющей стали; второй – платиновый
электрод расположен на расстоянии 10-15 мм от первого. Необходимым условием для
регистрации реакции токового датчика на воздействие внешнего фактора является
неравенство реакций (неодинаковые изменения потенциалов) каждого из двух
приэлектродных ДЭС, возникающие в ответ на воздействие. При равенстве реакций обоих
ДЭС суммарный результат будет равен нулю; реакция датчика на воздействие не будет
зарегистрирована.
В ходе эксперимента оператору удалось в каждом датчике изменить развитие ответной
реакции на воздействие по крайней мере, у одного из двух приэлектродных ДЭС,
расположенных на малом расстоянии друг от друга. Таким образом, оператор обнаружил
способность путем информационного воздействия дистантно и синхронно управлять
физико-химическими процессами приэлектродной поляризации в обоих датчиках.Во
первых - не верю, что это связано с действием оператора... Уж поверьте, что без
подтверждения биодетектором такое "влияние" нельзя считать фактом.
Информация - свойство материи, поле - модельное описание процесса взаимодействия
объектов на расстоянии или градиент (цвет, плотность. В общем анизотропии или
однородности локуса в поле отличающегося, а может того самого однородного. То есть,
мы обозначаем поле в пределах описания взаимодействий или свойств локуса
пространства.