На правах рукописи - Тихоокеанский институт биоорганической

На правах рукописи
Мартыяс Екатерина Александровна
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПИДОВ И
ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПИГМЕНТОВ ВОДОРОСЛЕЙ
ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ МОРЕЙ
03.02.14 – биологические ресурсы
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Владивосток – 2012
2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
профессор,
Анисимов Михаил Михайлович
Официальные оппоненты:
Звягинцева Татьяна Николаевна
доктор химических наук, профессор,
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова
Дальневосточного отделения РАН,
заведующий лабораторией химии ферментов
Зорикова Светлана Петровна
кандидат биологических наук,
Дальневосточный федеральный университет
Ведущая организация:
Федеральное государственное унитарное предприятие «Тихоокеанский научноисследовательский рыбохозяйственный центр» (ФГУП «ТИНРО-Центр»).
Защита состоится «31» июля 2012 г. в 10 часов на заседании
диссертационного совета Д 005.005.02 при Федеральном государственном
бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии
им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет
Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423) 231-40-50, e-mail:
komand@piboc.dvo.ru
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной
библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159,
ТИБОХ ДВО РАН).
Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru
Автореферат разослан «29» июня 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат химических наук, доцент
Командрова Н.А.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Морские водоросли издавна используются в
пищевых целях, а также в сельском хозяйстве в качестве удобрений. Это богатый
источник разнообразных по структуре и биологической активности веществ.
Некоторые из этих веществ могут служить ценным сырьем для производства
фармацевтической, косметической продукции, стимуляторов продуктивности
сельскохозяйственных животных и урожайности сельскохозяйственных культур.
Моря Дальнего Востока богаты большим разнообразием видов бурых,
красных и зеленых водорослей, некоторые из них образуют массовые скопления и
заросли.
В
последние
годы
внимание
исследователей
привлекли
низкомолекулярные метаболиты морских водорослей, такие как фенольные
соединения, отдельные классы глицерогликолипидов, триацилглицеринов, жирных
кислот и фотосинтетических пигментов. Пигменты, полиненасыщенные жирные
кислоты и свободные аминокислоты бурых водорослей при систематическом
употреблении водорослей в пищу принимают активное участие в регуляции обмена
веществ. Известно, что аккумулируемые в водорослях фотосинтетические
пигменты, а так же глицерогликолипиды, обладают широким спектром
биологического действия. Для этих соединений характерен целый ряд свойств:
противоопухолевое, противомикробное, антиоксидантное, противовирусное,
противовоспалительное и др.
В то же время данные по содержанию биологически активных веществ в
водорослях дальневосточных морей носят несистематический характер,
отсутствуют
сведения
об
изменении
биологической
активности
низкомолекулярных метаболитов в зависимости от видовой принадлежности, места
обитания и сезона сбора морских макрофитов.
Поиск соединений, содержащихся в морских водорослях и обладающих
широким спектром биологической активности, а также изучение влияния на
активность этих соединений места и сезона сбора водорослей является актуальной
задачей. Накопление подобного рода знаний может привести, с одной стороны, к
созданию новых перспективных лекарственных средств и биологически активных
препаратов, а с другой – к увеличению продуктивности комплексной переработки
и более рациональному использованию морских ресурсов.
Цель
исследования:
изучить
биологическую
активность
низкомолекулярных
метаболитов
водорослей
дальневосточных
морей,
относящихся к трем отделам: Clorophyta, Phaeophyta, Rhodophyta. Для достижения
данной цели были поставлены следующие задачи:
1) получить экстракты из морских водорослей Охотского и Японского морей
и охарактеризовать их биологическую активность, определить виды водорослей
наиболее перспективные для дальнейшего изучения;
2) выделить липофильные экстракты из бурых водорослей, относящихся к
порядкам Laminariales и Fucales и изучить влияние условий заготовки
водорослевого материала на биологическую активность липофильных экстрактов;
3) изучить биологическую активность низкомолекулярных метаболитов,
выделенных из липофильных экстрактов 4-х видов бурых водорослей: Saccharina
cichorioides, Fucus evanescens, Eualaria fistulosa и Sargassum pallidum;
4) сравнить биологическую активность глицерогликолипидов выделенных из
липофильных экстрактов двух видов красных: Tichocarpus crinitus и Neorhodomela
4
larix и четырех видов бурых водорослей: S. cichorioides, F. evanescens, E. fistulosa и
S. pallidum и охарактеризовать их жирнокислотный состав.
Научная новизна. Впервые были получены данные о биологической
активности суммарных экстрактов и отдельных классов низкомолекулярных
метаболитов морских водорослей Охотского и Японского морей. Показаны
значимые различия в биологической активности общего, гидрофильного и
липофильного экстрактов морских водорослей трех отделов: Clorophyta,
Phaeophyta, Rhodophyta, и отдельных классов низкомолекулярных метаболитов,
выделенных из четырех видов бурых водорослей: S. cichorioides, F. evanescens, E.
fistulosa и S. pallidum. Для липофильных экстрактов из F. evanescens и S.
cichorioides и отдельных классов низкомолекулярных метаболитов S. cichorioides и
S. pallidum изучена биологическая активность в зависимости от места и времени
сбора
водорослевого
материала.
Впервые
изучена
противомикробная
гемолитическая и цитотоксическая активность глицерогликолипидов из
липофильных экстрактов двух видов красных водорослей: T. crinitus и N. larix и
четырех видов бурых водорослей: S. cichorioides, F. evanescens, E. fistulosa и S.
pallidum.
Практическая значимость. Полученные сведения о противомикробной и
цитотоксической
активности
низкомолекулярных
метаболитов
морских
водорослей в отношении карциномы Эрлиха, при отсутствии цитотоксической
активности в отношении нормальных клеток теплокровных животных, могут быть
полезны при разработке на их основе различных препаратов медицинского,
ветеринарного и сельскохозяйственного назначения. Данные о влиянии
физиологического состояния морских макрофитов, места и времени сбора
водорослевого материала на изменение биологической активности могут быть
использованы при заготовке сырья для получения биологически активных веществ
из бурых водорослей.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором
на следующих конференциях: XII Всероссийская молодежная школа-конференция
по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 7-14 сентября 2009);
XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам
химии и биологии (Владивосток, 7-14 сентября 2010); Международная
конференция «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент,
12-13 октября 2010); Пятый международный симпозиум «Химия и химическое
образование» (Владивосток, 12-18 сентября 2011).
Публикации. Автором опубликовано 15 работ, из них по теме диссертации
– 8, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах из перечня ВАК, 5
тезисов в сборниках материалов научных конференций.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории
биоиспытания и механизма действия биологически активных веществ ТИБОХ ДВО
РАН 5 июня 2012 года.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора
литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их
обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 303
цитируемые работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах
машинописного текста и содержит 32 таблицы, 6 рисунков и 1 схему.
Сокращения и условные обозначения. ГЛ – глицерогликолипиды, ГЭ –
гидрофильные экстракты, ДАГ – диацилглицерины, ДГДГ – дигалактозил-
5
диацилглицерины, ЖК – жирные кислоты, КССВ – константы спин-спинового
взаимодействия, ЛЭ – липофильные экстракты, МГДГ – моногалактозилдиацилглицерины, МГМГ – моногалактозилмоноацилглицерины, МЭЖК –
метиловые эфиры ЖК, ОЭ – общие экстракты, СЖК – свободные ЖК, СС –
свободные стерины, СХДГ – сульфохиновозилдиацилглицерины, ТАГ –
триацилглицерины, ТБК – тиобарбитуровая кислота, ФЛ – фосфолипиды, ФСП –
фотосинтетические пигменты, Хл – хлорофиллы, ЭЖК – эфиры ЖК, ЭД –
эффективная доза.
Благодарность за научное сотрудничество и помощь в работе. Автор
выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н., профессору
Анисимову Михаилу Михайловичу, к.б.н. Наталье Ивановне Герасименко за
неоценимую помощь в работе, а также курировании ее химической части, Наталье
Германовне Бусаровой за помощь в проведении жирнокислотного анализа
липидов, Степану Викторовичу Логвинову за расшифровку полученных спектров
ЯМР, к.б.н. Скрипцовой Анне Владимировне за сбор и идентификацию
водорослевого материала, к.ф-м.н. Лихацкой Галине Николаевне за помощь в
изучении антиоксидантной активности. Автор выражает свою искреннюю
благодарность сотрудникам лаборатории микробиологии за внимательное
отношении и предоставление коллекционных штаммов микроорганизмов,
оборудования и реактивов для работы по определению противомикробной
активности, и сотрудникам лаборатории биоиспытания и механизма действия
биологически активных веществ, за помощь в работе. Автор также выражает
искреннюю благодарность к.х.н. Денисенко В.А., Моисеенко О.П., Ким Н.Ю.,
д.х.н. Новиковой О.Д., к.б.н. Портнягиной О.Ю.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Водорослевый материал. Исследуемые в работе виды водорослей были
определены и отнесены к 9-ти видам красных водорослей: Ceramium kondoi Yendo,
Chondrus pinnulatus (Harv.) Okamura, Mazzaella laminariodes (Bory de Saint –
Vincent) Fredericq (43º11’N, 131º54’E), Delesseria serrulata Harvey, Neorhodomela
larix (Turner) Masuda, Palmaria stenogona Perestenko, Ptilota filicina (Farl.) J.Ag.,
Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupz. (43º04’N, 131º57’E) (сбор водорослей март 2010,
бухта Соболь, Японское море), Neorhodomela larix (2) (Turner) Masuda, Laurencia
nipponica Yamada (42º37´N, 131º07´E) (сбор водорослей сентябрь 2009, бухта
Троицы, Японское море), принадлежащих к 5-и семействам; 2-ум видам зеленых
водорослей: Acrosiphonia sonderi (Kütz) Kornm, Ulva fenestrata Ruprecht (43º04´N,
131º54´E) (март 2010, бухта Соболь, Японское море) и 11 видам бурых водорослей:
Eualaria fistulosa Postels & Ruprecht (50º17,9N, 155º18,0E), Fucus evanescens C.
Agardh (1) (50º17,9N, 155º18,0E), F. evanescens C. Agardh (2) (45º58,2N, 150º11,1E),
F. evanescens C. Agardh (3) (43º30,6N, 152º49,0E), F. evanescens C. Agardh (4)
(50º18,2N, 155º17,0E) (август 2008, Охотское море), F. evanescens C. Agardh (ноябрь
2010, зал. Опричника, б. Рудная, Японское море), Undaria pinnatifida (Harv.)
Wynne, Cystoseira crassipes (Turn) C. Ag., Desmarestia viridis (Müll) Lam., Costaria
costata (Turn) Saund, Saccharina japonica (Miyabe) Okamura, Coccophora langsdorfii
(Turn) Grev, Sargassum pallidum (Turn) C. Ag., Scytosiphon lomentaria (Lyngb.) Link.
(43º04´N, 131º57´E), S. cichoriodes (Miyabe) (43º11´N, 131º54´E) (март 2010, бухта
Соболь, Японское море), L. bongardiana (Postels & Ruprecht), L. longipes (Miyabe),
6
L. yezoensis (Miyabe), L. bongardiana f bongardiana (Postels & Ruprecht) (50º17,9N,
155º18,0E) (август 2008, Охотское море), принадлежащих к 7-и семействам. Все
исследуемые водоросли были заморожены и хранились при T = 18ºС ниже нуля для
дальнейшей работы. Перед экстракцией водоросли размораживали, освобождали от
примесей льда и эпифитов, промывали трижды дистиллированной водой,
высушивали на фильтровальной бумаге в течение часа.
Экстракцию низкомолекулярных метаболитов из водорослевого материала
проводили смесью растворителей различной полярности (этанол 96%, этанол :
ацетон 1 : 2 (объемные соотношения), этанол : хлороформ 1 : 2 (объемные
соотношения) с использованием гомогенизатора MPW-324 (Польша). Все
экстракты объединяли и упаривали до Vmin с получением ОЭ. ЛЭ и ГЭ извлекали из
ОЭ добавлением к последнему хлороформа. Водная фракция содержала
преимущественно фенольные соединения – ГЭ, а хлороформная – липофильные –
ЛЭ.
Выделение низкомолекулярных метаболитов проводили методом колоночной
хроматографии, градиентом концентраций этанола в хлороформе. Содержание
веществ в элюате контролировали при помощи ТСХ в системе Поля, с
использованием стандартов липидов и пигментов из бурой водоросли Undaria
pinnatifida, состав которой описан в работе (Maeda et al., 2005).
Идентификацию глицерогликолипидов проводили с использованием метода
ЯМР. Спектры ЯМР 1H и 13C регистрировали на спектрометре Bruker Avance DPX500 (Германия) с рабочей частотой 500 МГц для ядер 1Н и 125 МГц для ядер 13С.
Взаимодействия первого порядка между ядрами 1Н и 13С определяли в
эксперименте HSQC. Взаимодействия второго, третьего и четвертого порядка
между ядрами 1Н и 13С определяли в эксперименте HMBC, оптимизированном для
КССВ 8 Гц.
Определение жирнокислотного состава липидов проводили по методу Хартмана
и Реджино (Hartman, Regino, 1973) переэтерификацией липидов с получением
МЭЖК. Жирнокислотный состав МЭЖК определяли, используя методы ГЖХ и
ГЖХ/МС. Масс-спектры получали на приборе AMD 604 S («Itektra», Германия) с
прямым вводом образца в ионный источник, способ ионизации – электронный удар
(70 эВ, 8 квт).
Противомикробную активность определяли на твердых агаризованных средах
измерением ширины зоны ингибирования роста микроорганизмов, измеряемой в
мм от края лунки (Анисимов и др., 2010). Противомикробную активность
оценивали на микроорганизмах Vibrio alginolyticus КММ 644, Staphylococcus aureus
ATCC 21027, Escherichia coli ATCC 15034, Candida albicans KMM 453 Aspergillus
niger КММ 4634, Fusarium oxysporum КММ 4639, предоставленных из Коллекции
морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН (КММ 453, Россия). Штаммы
фитопатогенных грибов Septoria glycines и Cercospora sojina были предоставлены
из коллекции ГНУ Дальневосточного научно-исследовательского института
защиты растений (ГНУ ДВНИИЗР, Уссурийск).
Гемолитическую активность определяли на эритроцитах белых мышей при рН
6,0 и рН 7,4, после инкубирования в 96-ти луночных планшетах в течение 3 ч при
37ºС. Лизис клеток оценивали по изменению оптической плотности суспензии
эритроцитов на фотометре планшетного формата PowerWave XS, при длине волны
700 нм («Biotek», США).
7
Цитотоксическую активность определяли на спленоцитах мышей и клетках
асцитной карциномы Эрлиха, после инкубирования в течение часа при 37ºС,
рассчитывая соотношение мертвых клеток к их общему числу. Гибель клеток
фиксировали трипановым синим, подсчет вели с помощью светового микроскопа
ImagerA1 («Carl Zeiss», Германия), используя программу AxioVision (версия 4,7)
(«Carl Zeiss», Германия).
Эмбриотоксическую активность определяли на оплодотворенных яйцеклетках
морского ежа Strongylocentrotus intermedius (Бузников, Подмарев, 1975).
Инкубирование эмбрионов проводили в течение 3 ч при 24ºС. Эмбриотоксическую
активность оценивали по остановке или аномалии в развитии или лизису
эмбрионов морского ежа и выражали в ЭД50.
Антиоксидантную
активность
определяли
неферментативным
железоиндуцированным методом окисления гомогената мозга мышей (Лихацкая,
2002). Изменение содержания ТБК-реагирующих продуктов определяли
спектрофотометрическим методом на спектрофотометра («Hitachi-850», Япония) в
режиме двойного сканирования образцов при λex = 488 нм и λex = 550 нм.
Статистическая обработка данных. Все полученные результаты были
обработаны при помощи программы STATISTICA 6,0.
Результаты и обсуждение
Получение и биологическая активность экстрактивных веществ морских
водорослей
Общий, гидрофильный и липофильный экстракты (ОЭ, ГЭ и ЛЭ,
соответственно) были получены в результате экстракции смесью растворителей
различной
полярности, что
позволило максимально
полно
извлечь
низкомолекулярные метаболиты. Среди всех исследованных экстрактов красных
водорослей наибольшей противомикробной активностью в отношении S. aureus
обладали ЛЭ из C. pinnulatus, L. nipponica , M. laminariodes, N. larix и P. filicina.
При этом ЛЭ красных водорослей обладали незначительной, за исключением ЛЭ из
P. filicina, гемолитической активностью, что делает их перспективными для
дальнейшего использования в качестве источника противомикробных соединений.
ОЭ и ЛЭ зеленых водорослей A. sontarii и U. fenestrata, а так же ГЭ из U.
fenestrata обладали высокой противостафилококковой активностью и не
показывали значимой гемолитической активностью. Полученные данные
свидетельствуют о перспективности поиска противомикробных агентов среди
метаболитов зеленых водорослей.
Среди исследованных бурых водорослей наибольшую биологическую
активность обнаружили экстракты из видов, принадлежащих к семействам
Laminariaceae (S. cichorioides и S. japonica) Costariaceae (C. costata), Desmarestiaceae
(D. virides) и Sargassaceae (S. pallidum). Наиболее высокая противомикробная
активность ГЭ среди всех тестируемых бурых водорослей принадлежала
представителям из отдела Fucales (F. evanescens). Наиболее значимой
гемолитической активностью при слабокислом значении рН обладали ОЭ и ЛЭ из
F. evanescens, ЛЭ S. japonica. Данные виды водорослей широко распространены в
дальневосточных морских акваториях и образуют массовые заросли, что делает их
удобным для исследования объектом. Было определено, что наиболее
перспективным и интересным для дальнейшего изучения являются вещества
липофильной природы, содержащиеся в хлороформной фракции ОЭ. Было
8
показано, что ЛЭ в основном содержат низкомолекулярные метаболиты, такие как
липиды и ФСП, которые обладают значительной гемолитической и
противомикробной активностью в отношении грамположительных бактерий S.
aureus.
Биологическая активность липофильных экстрактов, полученных
из бурых водорослей
Показано, что биологическая активность ЛЭ из бурых водорослей Е.
fistulosa, L. longipes L. bongardiana f. bongardiana, L. bongardiana и L. yezoensis,
собранных в Охотском море, в значительной степени определяется видовой
принадлежностью морских макрофитов. Также было показано, что ЛЭ полученные
из стволиков и пластин таллома водорослей, различаются по активности. Так, ЛЭ
из пластин L. bongardiana f. bongardiana, L. bongardiana и L. yezoensis показывали
более высокие значения ингибирования роста грамположительных бактерий S.
aureus, по сравнению с ЛЭ из стволиков. В то время как ЛЭ из стволиков обладали
более высокой гемолитической активностью в сравнении с ЛЭ из листовых
пластин бурых водорослей L. bongardiana f. bongardiana, L. bongardiana и L.
yezoensis.
Влияние места сбора на биологическую активность липофильных
экстрактов, полученных из Fucus evanescens
Противомикробная активность ЛЭ из бурых водорослей F. evanescens
варьировала в зависимости от места сбора исследуемого объекта, однако ее
показатели были невысоки в отношении используемого ряда микроорганизмов.
Самые высокие значения ингибирования роста используемых в работе тестовых
штаммов микроорганизмов были отмечены для ЛЭ из образцов F. evanescens,
собранных в бухте Кратерной (о. Янкича) (табл. 1).
Таблица 1. Противомикробная активность ЛЭ из F. evanescens
Место сбора водоросли
Микроорганизмы
E. coli
C. albicans
зона ингибирования роста, мм
Охотское море
2,2 ± 0,2
1,3 ± 0,2
0,3 ± 0,2
1,1 ± 0,0
н.а.
1,5 ± 0,2
3,0 ± 0,0
2,0 ± 0,0
2,3 ± 0,3
S. aureus
о. Итуруп
о. Уруп
о. Янкича, б. Кратерная
о. Парамушир
таллом
молодые приростки
зал. Опричник, б. Рудная
Нитрофунгин
1,0 ± 0,0
0,7 ± 0,2
0,8 ± 0,2
н.а.
Японское море
н.а.
н.а.
14,0± 0,0
3,8± 0,2
F. oxysporum
0,2 ± 0,2
1,2 ± 0,0
1,8 ± 0,2
1,6 ± 0,1
н.а.
н.а.
0,3 ± 0,3
н.а.
6,0± 0,0
н.а.
3,8± 0,2
н.а. – нет активности
Вероятно, это связано с тем, что бухта Кратерная является самым теплым из
исследованных мест сбора, так как расположена в кальдере действующего вулкана
и имеет обилие горячих источников. Так же в воде бухты Кратерной было
отмечено высокое содержание микроэлементов, особенно серы, а также большое
9
количество микроорганизмов, что может способствовать накоплению метаболитов
обладающих противомикробной активностью. ЛЭ из водорослей, собранных в
бухте Рудная (зал. Опричник), не показали противомикробной активности (табл. 1).
Температура воды в этом месте сбора водорослей была самой низкой.ЛЭ из F.
еvanecsens показали значительную гемолитическую активность с выраженным pHзависимым эффектом (табл. 2). Гемолиз усиливался в слабокислой среде, что
является весьма ценной информацией для дальнейших исследований в области
поиска новых противоопухолевых препаратов. Наибольшей гемолитической
активностью обладали ЛЭ из F. еvanecsens, растущих в бухте Рудная, у о. Итуруп и
у о. Уруп. Самая высокая зависимость гемолитической активности от рН среды
была отмечена у ЛЭ из водорослей, произрастающих в бухте Рудная (табл. 2).
Таблица 2. Гемолитическая активность ЛЭ из F. evanencses
Место сбора водоросли
ЭД50, мг/мл
о. Янкича, б. Кратерная
pH 6,0
8,4
16,1
75,0
pH 7,4
15,9
52,2
100,0
о. Парамушир
таллом
молодые приростки
зал. Опричник, б. Рудная
Сапонин
36,4
78,7
1,6
7,5
>100,0
> 100,0
59,9
40,0
о. Итуруп
о. Уруп
Влияние сезона сбора на биологическую активность липофильных
экстрактов, полученных из Saccharina сichorioides
Биологическая активность низкомолекулярных метаболитов морских
водорослей меняется не только в зависимости от их вида и места произрастания, но
также от сезона сбора водорослевого материала.
Таблица 3. Противомикробная активность ЛЭ из S. cichorioides
Время сбора V. alginolyticus S. aureus
водоросли
Микроорганизмы
E. coli
C. albicans
A. niger
F. oxysporum
зона ингибирования роста, мм
март:
взрослые
ювенильные
май*
июнь*
июль*
сентябрь*
октябрь*
ноябрь*
Нитрофунгин
н.а.
–
н.а.
н.а.
–
4,0 ± 0,0
2,0 ± 0,0
н.а.
6,0 ± 0,0
6,8 ± 0,2
4,3 ± 0,2
4,0 ± 0,3
3,0 ± 0,0
н.а.
6,7 ± 0,3
5,3 ± 0,2
3,4 ± 0,2
14,0 ± 0,0
2,3 ± 0,2
8,8 ± 0,2
1,3 ± 0,2
1,0 ± 0,0
1,0 ± 0,0
3,7 ± 0,2
2,5 ± 0,0
н.а.
3,8 ± 0,2
0,8 ± 0,2
1,0 ± 0,0
н.а.
1,0 ± 0,0
н.а.
3,0 ± 0,0
2,0 ± 0,0
н.а.
6,0 ± 0,0
2,2 ± 0,2
–
3,0 ± 0,2
4,0 ± 0,0
н.а.
4,0 ± 0,0
4,8 ± 0,2
н.а.
12,0 ± 0,2
3,8 ± 0,2
–
0,8 ± 0,2
3,0 ± 0,0
н.а.
9,8 ± 0,2
7,5 ± 0,5
2,0 ± 0,0
3,8 ± 0,2
н.а. – нет активности; «–» – активность не исследовали; * – взрослые водоросли.
10
Влияние сезона сбора на биологическую активность оценивали на ЛЭ,
полученных из S. cichorioides, показавших самые высокие значения
противомикробного действия среди бурых водорослей (табл. 3). Широкий спектр
противомикробного действия в отношении исследуемых микроорганизмов
показали ЛЭ из образцов S. cichorioides, собранных в марте и сентябре месяце.
Высокие значения гемолитической и цитотоксической активности были показаны
для ЛЭ из водорослей, собранных в марте и ноябре месяце (табл. 4).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о влиянии сезона
сбора водоросли на накопление веществ отвечающих за биологическую активность
ЛЭ, полученных из S. cichorioides. Отмечено, что ЛЭ из водорослей, собранных в
сентябре месяце (водоросли, находящиеся в фертильном состоянии) и в холодные
месяцы (март и ноябрь), обладают более значительным биологическим
потенциалом по сравнению с ЛЭ, полученными из водорослей в другие месяцы.
Таблица 4. Гемолитическая и цитотоксическая активность
ЛЭ из S. cichorioides
Время сбора водоросли
Март
Май
Июнь
Сентябрь
Октябрь
Ноябрь
Сапонин
Гемолитическая
активность, ЭД50,
мкг/мл
pH 6,0
pH 7,4
2,3
>100,0
15,2
40,6
26,0
2,42
7,5
3,2
43,2
25,0
36,6
24,0
5,8
40,0
Цитотоксическая
активность,
спленоциты
мышей, ЭД50,
мкг/мл
8,6
>100,0
>100,0
>100,0
63,0
15,8
-
Эмбриотоксическая
активность, ЭД50,
мкг/мл
75,3
72,8
36,0
20,3
68,4
-
«-» – активность не исследовали
Получение суммарных фракций и отдельных классов
низкомолекулярных метаболитов из бурых водорослей
С помощью колоночной хроматографии из ЛЭ бурых водорослей были
получены следующие классы соединений: ФСП (хлорофиллы, каротиноиды и
фукоксантин), ТАГ, ДАГ, СС, СЖК, ЭЖК, ФЛ, ГЛ, МГДГ, ДГДГ и СХДГ.
Показано, что содержание и соотношение низкомолекулярных метаболитов,
выделенных из ЛЭ, варьирует в зависимости от вида и сезона сбора водорослей.
Биологическая активность липидов и фотосинтетических пигментов,
выделенных из бурой водоросли Eualaria fistulosa
Было показано, что СЖК, ФСП и ГЛ, выделенные из ЛЭ Е. fistulosa,
обнаружившего отсутствие биологической активности в ходе скрининга, обладают
ингибирующим действием в отношении различных тестовых штаммах
микроорганизмов. Также было показано, что различные ГЛ (МГДГ, ДГДГ, СХДГ),
выделенные из E. fistulosa, обладают противомикробной, рН-зависимой
гемолитической и цитотоксической активностями, что подтверждает наличие
антагонистических взаимодействий веществ в экстрактах. Было отмечено
несколько классов соединений (МГДГ, ДГДГ, СХДГ и СЖК), перспективных для
дальнейшего изучения их биологической активности.
11
Àí òèî êñèäàí òí àÿ àêòèâí î ñòü, %
Биологическая активность липидов и фотосинтетических пигментов,
выделенных из Fucus evanescens
Суммарные фракции некоторых низкомолекулярных метаболитов: ФСП
(хлорофиллы, каратиноиды, β-каротин); СС, СЖК; ГЛ (МГДГ, ДГДГ, СХДГ) были
получены из ЛЭ F. evanescens с помощью колоночной хроматографии.
Было показано, что все исследуемые метаболиты показали сильное
ингибирующее действие в отношении фитопатогенных грибов S. glycines,
паразитирующих на сое. Высокой противомикробной активностью в отношении
используемого ряда микроорганизмов обладали отдельные классы ГЛ, выделенные
из F. evanescens.
Хлорофиллы и каротиноиды, за исключением β-каротина, полученные из F.
evanescens, также показали значимую антифунгальную активность в отношении
фитопатогенов сои, не ингибируя при этом рост C. albicans, A. niger и
фитопатогенных грибов F. oxysporum. Также было обнаружено, что ФСП из F.
evanescens обладают антиоксидантной активностью, причем каротиноиды из этого
вида водоросли более активны, чем хлорофиллы (рис. 1). Полученные данные об
антиоксидантной активности ФСП важны для дальнейшего использования
водорослей F. evanescens в качестве сырья для получения природных и недорогих
антиоксидантов.
120
ÄÃÄÃ
ÑÕÄÃ
Êàðî òèí î èäû
Õëî ðî ô èëëû
100
80
60
40
20
0
-20
0
200
400
600
800
1000
1200
Êî í öåí òðàöèè, ì êã/ì ë
Рис. 1. Антиоксидантная активность ГЛ и ФСП из бурых водорослей F. evanescens,
собранных в ноябре месяце
Влияние сезона сбора на биологическую активность липидов и
фотосинтетических пигментов, выделенных из Saccharina сichorioides
Ранее было описано, что ЛЭ из водорослей, собранных в марте и сентябре
месяце, обладают высокой противомикробной активностью, а в марте и ноябре –
гемолитической и цитотоксической. В связи с этим, было изучено влияние сезона
на биологическую активность липидов и ФСП из ЛЭ S. cichoriodes, собранных в
марте и ноябре.
С помощью колоночной хроматографии из ЛЭ S. cichorioides, собранных в
марте месяце, были получены суммарные фракции следующих низкомолекулярных
метаболитов: ТАГ, СЖК, Хл, в соотношении 85 : 5 : 10%, соответственно; ТАГ,
СС, Хл, в соотношении 10 : 45 : 45%, соответственно; СС, Хл, в соотношении 70 :
30%, соответственно. Кроме того, в составе индивидуальных фракций были
получены некоторые метаболиты: β-каротин; фукоксантин; Хл; ГЛ; МГДГ; ДГДГ и
12
èî êñèäàí òí àÿ àêòèâí î ñòü, %
СХДГ. Из S. cichorioides, собранных в ноябре месяце, были выделены только
индивидуальные фракции низкомолекулярных метаболитов: ТАГ; СС; Хл;
фукоксантин; МГДГ; ДГДГ и СХДГ.
Было показано, что биологическая активность липидов и пигментов из
одного вида водоросли существенно меняется в зависимости от сезона сбора
водорослевого материала. Были обнаружены вещества, выделенные из ЛЭ бурых
водорослей S. cichorioides, собранных в марте месяце, содержащие ФСП, такие как
хлорофиллы и фукоксантин, которые проявили себя как активные
противомикробные агенты в отношении всех используемых микроорганизмов, а
также как вещества с антиоксидантной активностью (рис. 2), но не показали при
этом гемолитической и цитотоксической активности.
90
ô óêî êñàí òèí
õëî ðî ô èëëû
80
70
60
50
40
30
20
10
0
200
400
600
800
1000
1200
Êî í öåí òðàöèÿ, ì êã/ì ë
Рис. 2. Антиоксидантная активность ФСП из бурых водорослей S. cichorioides,
собранных в марте месяце
ТАГ, СЖК и Хл в составе суммарных фракций, показали довольно значимые
результаты в тестах на цитотоксическую и гемолитическую активности, но не
обнаружили достаточно высокого противомикробного действия. Липиды и ФСП,
выделенные из ЛЭ S. cichorioides, собранных в ноябре месяце, обладали достаточно
высокой рН-зависимой гемолитической активностью, но в тоже время не показали
значительного противомикробного действия как таковые из водорослей, собранных
в марте месяце.
Влияние сезона сбора на биологическую активность липидов и
пигментов, выделенных из Sargassum pallidum
Водоросли рода Sargassum sp. богаты биологически активными
метаболитами и имеют перспективу для разработки новых лекарственных средств,
однако биологические функции и периоды накопления отдельных веществ в этих
водорослях требуют изучения. В качестве объекта для более глубокого
исследования влияния сезона сбора водоросли на биологическую активность
липидов и пигментов морских макрофитов был выбран вид бурых водорослей S.
pallidum, широко распространеный в дальневосточных морских акваториях.
Из образцов S. pallidum, собранных в различные месяцы (март, июнь, август,
ноябрь), были выделены липиды, отдельных классов и ФСП. Показано, что
биологическая активность липидов бурых водорослей зависит от сезона сбора
13
материала. Противомикробная активность в большей степени наблюдалась у ГЛ,
выделенных из водорослей, собранных в холодное время года, а выраженной
гемолитической активностью обладали липиды из S. pallidum, собранных в ноябре.
Было показано, что водоросли рода Sargassum sp., произрастающие в
дальневосточных морях, содержат меньшее количество биологически активных
метаболитов в сравнении с представителями этого рода в более теплых морях.
Структура глицерогликолипидов, выделенных из морских водорослей
Tichocarpus crinitus, Neorhodomela larix, Saccharina cichorioides, Fucus
evanescens, Eualaria fistulosa и Sargassum pallidum
В предыдущих частях работы были обсуждены результаты исследования
отдельных классов липидов и ФСП и их суммарных фракций, выделенных из
бурых водорослей принадлежащих к разным семействам (Alariaceae, Fucaceae,
Laminariaceae, Sargassaceae). Для дальнейшей работы по изучению взаимосвязи
между структурой и биологической активностью наше внимание привлекли ГЛ:
МГДГ, ДГДГ и СХДГ, обнаруженные в каждом из исследованных виде водорослей
в достаточном количестве и обладающие выраженной биологической активностью.
Отдельные классы МГДГ, ДГДГ и СХДГ были получены с помощью колоночной
хроматографии.
Идентификация глицерогликолипидов
Анализ липидных экстрактов из морских водорослей T. crinitus, N. larix, S.
cichorioides, F. evanescens, E. fistulosa и S. pallidum с помощью метода ТСХ в
системе растворителей (CH3)2CO–C6H6–H2O, в соотношении 91 : 30 : 8 (по объему),
показал присутствие трех основных по содержанию компонентов (ГЛ-I, ГЛ-II, ГЛIII), которые давали положительную реакцию с антроновым реагентом и имели
такую же хроматографическую подвижность как МГДГ, ДГДГ и СХДГ из листьев
шпината Spinacia oleracea. Для структурной идентификации ГЛ был использован
метод ЯМР.
На основании сравнения данных спектров ЯМР 1H и 13С ГЛ-I, ГЛ-II, ГЛ-III с
литературой (Al-Fadhli et al., 2006; Kim et al., 2007), ГЛ-I идентифицировали как
1,2-диацил-3-О-(β-D–галактопиранозил)-sn-глицерин (МГДГ) (1), ГЛ-II как 1,2диацил-3-О-(α-D-галактопиранозил -(1,6)-0-β-D-галактопиранозил)-sn-глицерин
(ДГДГ) (2), а ГЛ-III как 1,2-диацил-3-О-(6-дезокси-6-сульфо-α-D-глюкопиранозил)sn-глицерин (СХДГ) (3).
6''''
HO
CH2
OH
5'''
O
O
3'''
1'''
2'''
3
CH2
2 HC
O
2''
1''
O
n3''
n2''
n1''
1''''
6'''
O
2''''
3''''
2'
n3'
3'
n2'
5'''
1'''
2'''
3'''
n1'
O
O
O
OH
4'''
CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH3
1'
CH2
OH
OH
CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH3
1 CH2 O
OH
3''
O
OH
4''''
OH
4'''
5''''
OH
6'''
HO
CH2
3
CH2
2 HC
O
1''
O
1 CH2 O
OH
1'
O
1
2
6'''
-
O3S
CH2
5'''
O
O
4'''
OH
OH 3'''
1'''
2'''
3
CH2
2 HC
O
1''
O
2''
3''
n3''
n2''
n1''
CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH3
1 CH2 O
1'
OH
O
3
CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH3
2'
3'
n3'
n2'
n1'
2''
3''
n3''
n2''
n1''
CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH3
CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH3
2'
3'
n3'
n2'
n1'
14
Из ЛЭ S. cichorioides был выделен не идентифицированный ГЛ-IV, который
по данным ТСХ имел меньшую хроматографическую подвижность, чем МГДГ.
Анализ спектров ЯМР 1H и 13С, а так же 1H-1H COSY и HMBС позволил
идентифицировать ГЛ-IV как 1-О-ацил-3-О-(β-D–галактопиранозил)-sn-глицерин
(МГМГ) (4). Этот же класс ГЛ был выделен из СЛ E. fistulosa и S. pallidum, что
было подтверждено данными 1H ЯМР.
6'''
HO
CH2
OH
5'''
O
O
OH
4'''
3'''
1'''
2'''
OH
3
CH2
2 HC OH
1 CH2 O
1'
CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH3
2'
3'
n3'
n2'
n1'
O
4
Таким образом, из ЛЭ морских водорослей были выделены 1,2-диацил-3-О(β-D-галактопиранозил)-sn-глицерины
(МГДГ)
(1),
1,2-диацил-3-О-(α-Dгалактопиранозил-(1,6)-О-β-D-галактопиранозил)-sn-глицерины (ДГДГ) (2), 1,2диацил-3-О-(6-дезокси-6-сульфо-α-D-глюкопиранозил)-sn-глицерины (СХДГ) (3).
В бурых водорослях S. cichorioides, E. fistulosa и S. pallidum были обнаружены ГЛIV, которые были идентифицированы как 1-О-ацил-3-О-(β-D–галактопиранозил)sn-глицерины (МГМГ) (4). Все выделенные ГЛ, принадлежащие к одному классу,
имели идентичное строение гликозидной части, но в то же время существенно
отличались по составу ЖК.
Жирнокислотный состав глицерогликолипидов
В
представленной
работе
изучен
жирнокислотный
состав
идентифицированных ГЛ: МГДГ, ДГДГ, СХДГ и МГМГ, для которых была
определена противомикробная, гемолитическая и цитотоксическая активности.
Жирнокислотный состав моногалактозилдиацилглицеринов
Во всех исследованных МГДГ наблюдалось высокое содержание
пальмитиновой, миристиновая кислоты и суммы олеиновой и α-линоленовой ЖК.
Для МГДГ, выделенных из ЛЭ водорослей семейств Laminariaceae и Sargassaceae,
было показано высокое содержание стеаридоновой, арахидоновой и
эйкозапентаеновой ЖК. Состав ЖК в изученных МГДГ значительно менялся в
зависимости от видовой принадлежности водоросли и сезона их сбора.
Исследуемые МГДГ были самыми ненасыщенными из всех ГЛ изученных видов
морских водорослей.
Жирнокислотный состав дигалактозилдиацилглицеринов
Основной ЖК во всех исследованных ДГДГ являлась пальмитиновая
кислота. Кроме того, во всех выделенных ДГДГ наблюдалось высокое содержание
суммы олеиновой и α-линоленовой ЖК. Содержание миристиноваой кислоты
варьировало от 0 до 30,8% в зависимости от вида и сезона сбора водорослевого
материала. Насыщенность ЖК, входящих в состав исследуемых ДГДГ морских
водорослей, была выше, чем в МГДГ. В жирнокислотном составе ДГДГ, так же как
и в случае с МГДГ наблюдались изменения в зависимости от вида и сезона сбора
водорослей.
15
Жирнокислотный состав сульфохиновозилдиацилглицеринов
Нами было показано, что СХДГ – это самые насыщенные из ГЛ морских
водорослей, в которых пальмитиновая является основной по содержанию жирной
кислотой. Так же как и во всех изученных нами ГЛ морских водорослей, в СХДГ
содержались значимые количества миристиновой и суммы олеиновой и αлиноленовой ЖК. Кроме того, как и для первых двух классов ГЛ, для СХДГ
характерны изменения состава ЖК в зависимости от видовой принадлежности
водоросли, из которых они были получены, а также от сезона сбора водорослевого
материала.
Жирнокислотный состав моногалактозилмоноацилглицеринов
Было показано, что ЖК состав МГМГ значительно отличался от состава ЖК
изученных МГДГ, хотя содержание пальмитиновой кислоты также было
значительным во всех лизо-формах этого класса ГЛ, кроме того, все МГМГ
содержали стеариновую кислоту в достаточно больших количествах.
Биологическая активность глицерогликолипидов морских водорослей
В работе была определена противомикробная, гемолитическая и
цитотоксическая активность ГЛ двух видов красных водорослей (N. larix и T.
crinitus) и четырех видов бурых водорослей (E. fistulosa, F. evanescens, S.
сichorioides и S. pallidum). Кроме того, была определена активность ГЛ,
выделенных из ЛЭ S. сichorioides и S. pallidum, в зависимости от сезона сбора
водорослей.
Биологическая активность моногалактозилдиацилглицеринов
Противомикробная активность МГДГ варьировала в зависимости от вида
водорослей, из которых они были получены. Кроме того, нами были обнаружены
различия в активности МГДГ, выделенных из ЛЭ одного вида водоросли,
собранных в разное время (табл. 5).
Таблица 5. Противомикробная активность МГДГ
Вид
водоросли
Месяц
сбора
S. aureus
1,0 ± 0,0
н.а.
7,0 ± 0,0
5,7 ± 0,2
Микроорганизмы
C.
A. niger
F.
albicans
oxysporum
зона ингибирования роста, мм
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
5,7 ± 0,3
2,8 ± 0,2
2,5 ± 0,0 13,7 ± 0,2 5,0 ± 0,0
6,7 ± 0,3
N. larix
T. crinitus
Е. fistulosa
F.
evanescens
S.
сicharioides
S. pallidum
март
март
август
ноябрь
н.а.
2,0 ± 0,0
март
ноябрь
март
июнь
август
ноябрь
Нитрофунгин
3,0 ± 0,0
2,0 ± 0,0
2,5 ± 0,2
н.а.
н.а.
3,0 ± 0,0
14,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
2,0 ± 0,0
н.а.
2,2 ± 0,2
3,8 ± 0,2
н.а.
4,0 ± 0,0
2,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
E. coli
н.а.
н.а.
3,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
1,2 ± 0,3
6,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
4,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
12,0 ± 0,2
н.а. – нет активности; «-» – активность не определяли
н.а.
2,5 ± 0,2
н.а.
н.а.
н.а.
1,0 ± 0,0
3,8 ± 0,2
S.
glycines
16
Отмечено, что значительной противомикробной активностью в отношении
тестовых культур грибов обладали МГДГ из F. evanescens, а самую высокую
противобактериальную активность показали МГДГ из Е. fistulosa. МГДГ из
красных водорослей были неактивны в отношении использованных тестовых
штаммов микроорганизмов, только МГДГ из N. larix незначительно ингибировали
рост S. aureus (табл. 5). Наибольшую активность в отношении S. aureus показали
МГДГ из бурых водорослей Е. fistulosa и F. evanescens. Противомикробная
активность МГДГ из S. сichorioides, незначительно менялась в зависимости от
сезона сбора водорослевого материала. МГДГ из образцов S. pallidum, собранных в
холодное время года, показали умеренную противостафилококковую активность. В
то время как, МГДГ из образцов S. pallidum, собранных в летние месяцы, не
показали ингибирующего действия в отношении грамположительных бактерий S.
aureus. МГДГ из красных водорослей N. larix незначительно ингибировали рост S.
aureus, а МГДГ из красной водоросли T. crinitus были неактивными в отношении
грамположительных бактерий (табл. 5).
Противомикробная активность МГДГ, выделенных из исследуемых видов
водорослей, в отношении S. aureus и E. coli имела линейную зависимость от
количественного содержания миристиновой кислоты (рис. 3). Для остальных ГЛ,
подобные зависимости выявлены не были.
8
Çî í à èí ãèáèðî âàí èÿ, ì ì
Çî í à èí ãèáèðî âàí èÿ, ì ì
12
S. aureus
10
8
6
r2=0,79
4
2
0
-2
0
5
10
15
20
25
Ñî äåðæàí èå ÆÊ, %
30
35
E. coli
6
r2=0,62
4
2
0
-2
0
5
10
15
20
25
30
35
Ñî äåðæàí èå ÆÊ, %
Рис. 3. Взаимосвязь противобактериальной активности и количественного
содержания миристиновой кислоты в МГДГ
В литературе встречаются данные о высокой противомикробной активности
МГДГ, содержащего в первом положении пальмитиновую кислоту, а во втором
эйкозапентаеновую (Al-Fadhli et al., 2006). Возможно, что в МГДГ изученных нами
бурых водорослей активность также усиливалась за счет высокого содержания
ПНЖК, однако в этом случае не удалось обнаружить концентрационной
зависимости.
Только четыре МГДГ из десяти исследованных ингибировали рост
диморфных дрожжевых клеток C. albicans (табл. 5). В большей степени
противомикробную активность в отношении C. albicans показали МГДГ из F.
evanescens. Умеренную степень ингибирования роста дрожжей показали МГДГ из
Е. fistulosa и S. pallidum (сбор водоросли в марте месяце). Анализируя данные по
составу ЖК и биологической активности, изучаемых нами МГДГ мы
предположили, что за противомикробную активность в отношении диморфных
17
дрожжевых клеток C. albicans отвечает высокое содержание суммы олеиновой и αлиноленовой кислот в этих ГЛ
Широкий спектр ингибирующего действия в отношении грибных культур
показали МГДГ из F. evanescens. Эти ГЛ обладали высокой активностью в
отношении фитопатогенных грибов. МГДГ из образцов S. cichorioides, собранных в
ноябре месяце, показали умеренное ингибирование роста культуры
фитопатогенного гриба F. oxysporum. Все МГДГ из S. pallidum показали разную
противомикробную активность в отношении используемых в работе тестовых
штаммов грибов. Так, МГДГ из водорослей, собранных в марте месяце,
ингибировали A. niger, из водорослей, собранных в июне и августе – рост
фитопатогенных грибов сои S. glycines, а МГДГ из водорослей, собранных в ноябре
месяце, незначительно ингибировали рост F. oxysporum (табл. 5).
Гемолитической активностью в значительной степени обладали только
четыре МГДГ, выделенные из бурых водорослей (табл. 6). Для МГДГ из F.
evanescens, S. сichorioides и S. pallidum было показано цитотоксическое действие на
спленоциты мышей. МГДГ из Е. fistulosa были токсичны для клеток карциномы
Эрлиха в низкой концентрации, но не проявляли токсичности в отношении
нормальных клеток. Скорее всего, эту активность обеспечивает высокое
количественное содержание миристиновой кислоты в МГДГ из Е. fistulosa, по
сравнению с МГДГ, выделенных из других изучаемых водорослей. Гемолитическая
активность с выраженным рН-зависимым эффектом была показана для МГДГ,
выделенных из бурых водорослей F. evanescens и S. сichorioides, собранных как в
летний так и в зимний период. МГДГ из образцов S. pallidum, собранных в ноябре
месяце, вызывал лизис эритроцитов в самых низких концентрациях, при обоих
значениях рН среды (табл. 6).
Таблица 6. Гемолитическая и цитотоксическая активность МГДГ
Вид
водоросли
Месяц сбора
N. larix
T. crinitus
Е. fistulosa
F. evanescens
S.
cichorioides
S. pallidum
март
март
август
ноябрь
март
ноябрь
март
июнь
август
ноябрь
Сапонин
Гемолитическая активность,
ЭД50, мкг/мл
рН 6,0
рН 7,4
> 100,0
> 100,0
> 100,0
8,5
43,3
5,8
> 100,0
> 100,0
96,4
1,1
7,5
> 100,0
> 100,0
> 100,0
20,2
> 100,0
14,3
> 100,0
> 100,0
> 100,0
1,8
40,0
Цитотоксическая активность,
ЭД50, мкг/мл
спленоциты
карцинома
мышей
Эрлиха
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
7,3
21,7
> 100,0
32,8
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
68,4
> 100,0
> 10,0
-
«-» – активность не определяли
Таким образом, МГДГ, выделенные из ЛЭ бурых водорослей обладают
большим биологическим потенциалом, по сравнению с МГДГ из красных
водорослей. Самую значительную противомикробную активность, в сочетании с
гемолитической и цитотоксической активностью, показали МГДГ из бурой
водоросли F. evanescens. МГДГ из Е. fistulosa также значительно ингибировали
18
рост бактерий, вызывали гибель клеток карциномы Эрлиха, не оказывая при этом
токсического действия в исследуемых концентрациях на эритроциты и спленоциты
мыши. Выраженной гемолитической активностью обладали МГДГ из образцов S.
сichorioides и S. pallidum, собранных в ноябре месяце. Была показана зависимость
противобактериальной активности от содержания миристиновой кислоты в
исследуемых МГДГ.
Биологическая активность дигалактозилдиацилглицеринов
ДГДГ морских водорослей по сравнению с МГДГ в значительно меньшей
степени ингибировали, рост тестовых штаммов микроорганизмов, и в большей
степени подавляли рост дрожжеподобных грибов C. albicans. Высокие значения
противомикробной активности были отмечены для ДГДГ из N. larix, E. fistulosa и S.
pallidum (август, ноябрь) (табл. 7).
Широкий спектр ингибирующего действия показали ДГДГ из F. evanescens,
которые в разной степени ингибировали рост всех используемых штаммов
микроорганизмов за исключением A. niger (табл. 7) и C. sojina (данные не
приведены). Самую высокую противомикробную активность ДГДГ показали в
отношении фитопатогенов сои S. glycines. В отношении фитопатогенных грибов F.
oxysporum только два ДГДГ показали ингибирующую рост активность – это
дигалактозид из F. evanescens и S. pallidum, собранных в августе месяце. К
сожалению, мы не смогли проследить влияние состава ЖК на активность ДГДГ, в
связи с чем, было выдвинуто предположение, что на противомикробную
активность в большей степени оказывает влияние позиционное расположение ЖК
в этом ГЛ.
Таблица 7. Противомикробная активность ДГДГ
Вид
водоросли
Месяц
сбора
S. aureus
N. larix
T. crinitus
Е. fistulosa
F.
evanescens
S.
cichorioides
S. pallidum
март
март
август
ноябрь
н.а.
1,0 ± 0,0
н.а.
1,5 ± 0,0
Микроорганизмы
E. coli
C.
A. niger
F.
albicans
oxysporum
зона ингибирования роста, мм
н.а.
4,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
4,0 ± 0,0
1,6 ± 0,2
1,5 ± 0,0
н.а.
2,0 ± 0,0
март
ноябрь
март
июнь
август
ноябрь
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
14,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
3,8 ± 0,2
Нитрофунгин
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
4,5 ± 0,2
2,7 ± 0,2
6,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
12,0 ± 0,2
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
2,0 ± 0,0
н.а.
3,8 ± 0,2
S.
glycines
н.а.
5,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а. – нет активности; «-» – активность не определяли
Гемолитическая активность была показана для ДГДГ, выделенных из бурых
водорослей E. fistulosa, собранных в августе, F. evanescеns, S. сichorioides и S.
pallidum, собранных в ноябре (табл. 8).
19
Таблица 8. Гемолитическая и цитотоксическая активность ДГДГ
Вид
водоросли
Месяц сбора
N. larix
T. crinitus
Е. fistulosa
F. evanescens
S.
cichorioides
S. pallidum
март
март
август
ноябрь
март
ноябрь
март
июнь
август
ноябрь
Гемолитическая активность,
ЭД50, мкг/мл
рН 6,0
рН 7,4
> 100,0
> 100,0
42,3
2,3
> 100,0
2,3
> 100,0
> 100,0
> 100,0
2,4
7,5
Сапонин
> 100,0
> 100,0
71,3
10,6
> 100,0
45,3
> 100,0
> 100,0
> 100,0
4,3
40,0
Цитотоксическая активность,
ЭД50, мкг/мл
спленоциты
карцинома
мышей
Эрлиха
48,3
> 100,0
37,8
> 100,0
8,0
69,8
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 10,0
-
«-» – активность не определяли
Все ДГДГ обладали более высокой гемолитической активностью при
слабокислом значении рН среды, наибольшую активность обнаружили для ДГДГ
из водорослей F. evanescens и S. сichorioides, собранных в ноябре месяце. Показано,
что ДГДГ из N. larix и F. evanescеns обладают цитотоксическим действием в
отношении спленоцитов мыши, а ДГДГ, выделенные из T. crinitus и E. fistulosa – в
отношении карциномы Эрлиха (табл. 8). ДГДГ из E. fistulosa вызывали 50%-ную
гибель клеток опухоли в концентрации 8 мкг/мл, при этом не проявляли
токсичности в отношении нормальных клеток (табл. 8). Полученные данные весьма
перспективны для дальнейшего исследования ГЛ, как противоопухолевых агентов.
Биологическая активность сульфохиновозилдиацилгдицеринов
СХДГ морских водорослей в большей степени ингибировали рост грибов,
особенно фитопатогенных грибов S. glycines и F. oxysporum, чем бактерий (табл. 9).
Таблица 9. Противомикробная активность СХДГ
Вид
водоросли
Месяц
сбора
S. aureus
E. coli
март
март
август
ноябрь
март
ноябрь
март
июнь
август
ноябрь
Нитрофунгин
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
1.5 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
14,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
2,7 ± 0,3
н.а.
н.а.
н.а.
1,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
3,8 ± 0,2
N. larix
T. crinitus
Е. fistulosa
F. evanescens
S.
сichоrioides
S. pallidum
Микроорганизмы
C.
A. niger
F.
albicans
oxysporum
зона ингибирования, мм
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
2,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
1,5 ± 0,0
н.а.
1,5 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
1,0 ± 0,0
н.а.
2,0 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
1,0 ± 0,0
н.а.
1,7 ± 0,3
н.а.
н.а.
1,7 ± 0,3
6,0 ± 0,0 12,0 ± 0,2
3,8 ± 0,2
н.а. – нет активности; «-» – активность не определяли
S.
glycines
н.а.
3,5 ± 0,0
5,5 ± 0,3
5,7 ± 0,2
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
20
Значимая гемолитическая активность была отмечена для СХДГ из бурых
водорослей S. сichorioides и S. pallidum, собранных в ноябре месяце. СХДГ из
образцов S. сichorioides, собранных в ноябре месяце обладали более выраженной
гемолитической активностью при рН среды 6,0 (табл 10). Цитотоксической
активностью по отношению к спленоцитам мышей обладали только СХДГ из F.
evanescеns. Вероятнее всего, цитотоксическую активность данного ГЛ
обеспечивает высокое содержание миристиновой кислоты. СХДГ из T. сrinitus,
содержащие больше всего пальмитиновой кислоты, по сравнению с СХДГ,
выделенных из других водорослей, оказывали цитотоксическое действие на клетки
карциномы Эрлиха (табл. 10).
Таблица 10. Гемолитическая и цитотоксическая активность СХДГ
Вид
водоросли
Месяц сбора
N. larix
T. crinitus
Е. fistulosa
F. evenescens
S.
сichоrioides
S. pallidum
март
март
август
ноябрь
март
ноябрь
март
июнь
август
ноябрь
Сапонин
Гемолитическая активность,
ЭД50, мкг/мл
рН 6.0
рН 7.4
68,0
52,0
> 100,0
36,3
> 100,0
5,8
> 100,0
> 100,0
> 100,0
3,0
7,5
> 100,0
42,9
> 100,0
43,0
> 100,0
47,3
> 100,0
> 100,0
> 100,0
3,2
40,0
Цитотоксическая активность,
ЭД50, мкг/мл
спленоциты
карцинома
мышей
Эрлиха
> 100,0
> 100,0
28,0
> 100,0
> 100,0
46,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 100,0
> 10,0
-
«-» – активность не определяли
Биологическая активность моногалактозилмоноацилглицеринов
Противомикробная активность МГМГ, также как и их ЖК состав,
существенно отличалась, в зависимости от вида водоросли из которого они были
выделены. Только МГМГ из бурых водорослей S. cichorioides, собранных в ноябре
ингибировали рост грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов (табл.
11). Вероятнее всего, эту активность обеспечивает высокое содержание ПНЖК
(41%). МГМГ обладали более выраженной противомикробной активностью в
отношении грамположительных бактерий, самое значительное ингибирование
роста S. aureus было отмечено при действии МГМГ из S. pallidum. Скорее всего, за
противомикробную активность отвечает высокое содержание стеариновой кислоты
(57,2%), количество которой в МГМГ из S. pallidum было 2,4 – 2,7 раза больше, по
сравнению с липидами из других водорослей. Только для МГМГ из S. pallidum
было показано ингибирующее рост действие в отношении фитопатогенов F.
oxysporum. Наличие этой активности коррелирует с высоким содержанием
миристиновой и пальмитиновой кислот относительно других исследуемых МГМГ.
Показано, что все выделенные МГМГ не обладали гемолитической и
цитотоксической активностями.
Таким образом, МГМГ обладали меньшим биологическим потенциалом, чем
МГДГ, только МГМГ из S. pallidum в значимой степени ингибировали рост
21
грамположительных бактерий и условно-патогенных грибов, в то время как МГДГ
из этой водоросли не показывали такой активности.
Таблица 11. Противомикробная активность МГМГ
Вид
водоросли
Месяц
сбора
Е. fistulosa
S. сichоrioides
S. pallidum
Нитрофунгин
август
ноябрь
август
S. aureus
2,0 ± 0,0
1,0 ± 0,0
4,0 ± 0,0
14,0 ± 0,0
Микроорганизмы
C.
A. niger
F.
albicans
oxysporum
зона ингибирования, мм от края лунки
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
2,0 ± 0,0
3.0 ± 0,0
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
3,8 ± 0,2
6,0 ± 0,0 12,0 ± 0,2
3,8 ± 0,2
E. coli
S.
glycines
н.а.
н.а.
н.а.
н.а.
н.а. – нет активности; «-» – активность не определяли
При изучении биологической активности липидов морских водорослей нами
было показано, что среди ГЛ наибольшей противомикробной активностью
обладают МГДГ. Гемолитической активностью в равной степени обладают все
классы ГЛ. Вид водоросли, из которых были получены ГЛ, существенно влияет не
только на состав ЖК, но и на их биологическую активность. Кроме того, было
показано, что на биологическую активность влияет состав ЖК и их позиционное
расположение в ГЛ, а так же синергический и антагонистический эффекты при
взаимодействии молекулярных видов в пуле ГЛ одного класса.
Выводы
1. Получены общие, липофильные и гидрофильные экстракты из морских
водорослей Охотского и Японского морей относящихся к трем отделам:
Chlorophyta (2 вида), Phaeophyta (11 видов) и Rhodophyta (9 видов) и
охарактеризована их биологическая активность.
2. Показано, что липофильные экстракты, полученные из красных водорослей
Chondrus pinnulatus, Laurencia nipponica, Mazzaella laminariodes, Neorhodomela
larix, Ptilota filicina; зеленых водорослей Acrosiphonia sontarii и Ulva fenestrata и
бурых водорослей Saccharina cichorioides, S. japonica, Costaria costata и Scytosiphon
lomentaria обладают высокой противомикробной активностью в отношении
грамположительных бактерий S. aureus.
3. Установлено, что наибольшие значения противомикробной активности в
отношении грамположительных бактерий и патогенных грибов показали
липофильные экстракты из образцов S. cichorioides, собранных в марте, в сентябре
и в октябре. Самая высокая цитотоксическая активность в отношении спленоцитов
мышей, показана для липофильных экстрактов из образцов S. cichorioides,
собранных в марте и в ноябре, а в отношении эмбрионов морского ежа – для
липофильных экстрактов из образцов водорослей собранных в сентябре и в
октябре.
4. Показано, что липофильные экстракты из бурых водорослей, собранных в
холодное время года (март, ноябрь): Fucus evanescens (бухта Рудная, Японское
моря), S. cichoriodes (Японское море) и Sargassum pallidum (Японское море) и
низкомолекулярные метаболиты (липиды и пигменты) из бурой водоросли F.
evanescens, обладают высокой гемолитической активностью.
22
5. Установлено, что хлорофиллы и фукоксантин из образцов S. cichorioides,
собранных в марте, обладают значительной антиоксидантной и противомикробной
активностью, при отсутствии гемолитической и цитотоксической активности.
Суммарная фракция, содержащая триглицериды, свободные жирные кислоты,
хлорофиллы, напротив, показала высокую цитотоксическую и гемолитическую
активности. Низкомолекулярные метаболиты, выделенные из бурых водорослей S.
cichorioides, собранных в ноябре месяце, не показали высокого противомикробного
действия, но обладали значительной гемолитической активностью.
6. Из липофильных экстрактов двух видов красных водорослей: Tichocarpus crinitus
и N. larix и четырех видов бурых водорослей: S. cichorioides, F. evanescens, Eualaria
fistulosa и Sargassum pallidum выделены три характерных для растений класса
глицерогликолипидов:
1,2-диацил-3-О-(β-D-галактопиранозил)-sn-глицерин
(МГДГ), 1,2-диацил-3-О-(α-D-галактопиранозил-(1,6)-О-β-D-галактопиранозил)-snглицерин (ДГДГ), 1,2-диацил-3-О-(6-дезокси-6-сульфо-α-D-глюкопиранозил)-snглицерин (СХДГ). Из бурых водорослей S. cichorioides, E. fistulosa и S. pallidum
были выделены глицерогликолипиды, которые были идентифицированы как 1-Оацил-3-О-(β-D–галактопиранозил)-sn-глицерины (МГМГ). Структуры гликозидной
части глицерогликолипидов, принадлежащих к одному классу, имели идентичное
строение, в то же время существенно отличались по составу жирных кислот и
степени насыщенности в зависимости от вида водоросли и времени сбора.
7. Показано, что самая высокая противомикробная активность в отношении S.
aureus и C. albicans, была характерна для МГДГ из бурых водорослей F. evanescens
и E. fistulosa.
8. Показано, что МГДГ из E. fistulosa обладают цитотоксической активностью в
отношении клеток карциномы Эрлиха в достаточно низкой концентрации
(ЭД50=7,3 мкг/мл).
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Анисимов М.М., Мартыяс Е.А., Чайкина Е.Л., Герасименко Н.И.
Противомикробная, гемолитическая и фиторегулирующая активность
липидных экстрактов из морских водорослей // Химия растит. сырья. 2010. Т.
4. С. 125–130.
2. Анисимов М.М., Мартыяс Е.А., Герасименко Н.И., Горовой П.Г.
Противомикробная активность экстрактов и компонентов морских
водорослей // Раст. ресурсы. 2012. Т. 48. С. 139–154.
3. Мартыяс Е.А., Герасименко Н.И., Бусарова Н.Г., Юрченко Е.А., Скрипцова
А.В.,
Анисимов
М.М.
Биологическая
активность
липидов
и
фотосинтетических пигментов Saccharina сichorioides (Miyabe) (сем.
Laminariaceae). Сезонные изменения активности // Химия растит. сырья. 2012.
Т. 1. С. 97–105.
4. Мартыяс Е. А., Анисимов М. М., Герасименко Н. И. Противомикробная
активность экстрактов из бурых водорослей // Сборник трудов XII
Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам
химии и биологии. МЭС ТИБОХ, Владивосток. 2009. С. 44.
5. Мартыяс Е.А., Анисимов М.М., Скрипцова А.В. Противомикробная и
гемолитическая активности экстрактов водорослей дальневосточных морских
акваторий // Сборник трудов XIII Всероссийской молодежной школы-
23
конференции по актуальным проблемам химии и биологии. МЭС ТИБОХ,
Владивосток. 2010. C. 42.
6. Мартыяс Е.А., Герасименко Н.И., Юрченко Е.А., Анисимов М.М.
Противомикробная, гемолитическая и цитотоксическая активности
экстрактивных веществ бурой водоросли Laminaria cichorioides (Miyabe) //
Сборник трудов международной конференции «Актуальные проблемы химии
природных соединений» г. Ташкент. 2010. С. 56.
7. Мартыяс Е.А., Лихацкая Г.Н., Герасименко Н.И., Ким Н.Ю., Анисимов М.М.
Сравнительное изучение антиоксидантной активности пигментов и
глицерогликолипидов бурых водорослей Fucus evanescens и Saccharina
cichorioides // Сборник трудов 5-ого международного симпозиума «Химия и
химическое образование» г. Владивосток. 2011. С. 32.
8. Мартыяс Е. А., Герасименко Н. И., Бусарова Н. Г., Анисимов М. М.
Сравнительное изучение биологической активности гликолипидов бурых
водорослей Fucus evanescens и Sargassum pallidum // Сборник трудов VII
Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ»,
Сыктывкар. 2011. С. 98.
Соискатель
Мартыяс Е.А.
24
Мартыяс Екатерина Александровна
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПИДОВ И
ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПИГМЕНТОВ ВОДОРОСЛЕЙ
ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ МОРЕЙ
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Подписано в печать 29.06.12.
Формат 60х84/16.
Усл. печ. л. 1,39 Уч-изд. 1,29
Тираж 110 экз. Заказ №
Отпечатано в Типографии ИД ДВФУ
690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10