ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАЗМЫ КРОВИ В ТЕРАГЕРЦОВОМ

ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ, 2016, том 120, № 1, с. 59–67
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ
В БИОФИЗИКЕ И МЕДИЦИНЕ
УДК 535-14+681.785.423.8+616.15-07
ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАЗМЫ КРОВИ
В ТЕРАГЕРЦОВОМ ДИАПАЗОНЕ ЧАСТОТ
© 2016 г. О. П. Черкасова*, М. М. Назаров**, А. А. Ангелуц***, А. П. Шкуринов***
* Институт лазерной физики СО РАН, 630090 Новосибирск, Россия
** Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, 140700 Шатура, Россия
*** Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия
E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 05.03.2015 г.
Методом импульсной терагерцовой (ТГц) спектроскопии в диапазоне частот 0.05–2.5 ТГц проведены исследования плазмы крови лабораторных животных – здоровых и с диабетом. Выявлено достоверное изменение коэффициентов пропускания и отражения образцов крыс с диабетом как для амплитуды, так и для фазы сигнала. Обсуждена причина наблюдаемых отличий в контексте изменения
ТГц отклика воды.
DOI: 10.7868/S0030403416010074
ляется возможность непосредственного измерения не только коэффициента поглощения, но и
показателя преломления, а следовательно, и комплексной диэлектрической функции исследуемого образца. Это позволяет получить полную спектральную характеристику пробы за одно измерение, что в перспективе дает возможность
развития на этой основе экспресс-диагностики, в
том числе бесконтактной, в конфигурации отражения. Вследствие сильного поглощения воды,
спектроскопии крови и ее компонентов посвящены единичные работы, в которых исследовалась
кровь здоровых лиц и животных [7, 8]. В то же
время значительное количество работ посвящено
исследованию методами ТГц спектроскопии
водных растворов органических соединений [9],
таких как сахара [10–12], белки [13, 14] и нуклеиновые кислоты [15]. Все известные на сегодня достоверные спектры поглощения растворов не
имеют узких спектральных особенностей на частотах ниже 3.0 ТГц [6–14]. Спектральные отличия водных растворов любых веществ малы, поскольку форма измеряемого спектра на 90–99%
определяется самой водой, которая имеет сильную дисперсию в низкочастотной части ТГц диапазона. Для выявления малых изменений в
растворах и повышения достоверности наблюдаемых отличий мы предлагаем проводить исследования двумя независимыми методами, измеряя
спектры пропускания [16, 20] и отражения [9, 17,
18] образцов.
ВЕДЕНИЕ
Изучение различий между биологическими
образцами здоровых и больных лиц по интегральным показателям представляет значительный интерес, так как диагностика по одному маркеру зачастую является неинформативной. Это увеличивает
время, необходимое для постановки диагноза и
применения адекватной терапии [1]. Методы колебательной спектроскопии используются для
дифференциальной диагностики различных заболеваний, например диабета [1–3]. Так, в литературе описано применение ИК спектроскопии
для анализа глюкозы и ряда других метаболитов
[2–5]. Методы ИК спектроскопии могут определить малые концентрации того или иного вещества в биологическом образце по характеристическим частотам отдельных химических групп в молекулах. В свою очередь терагерцовая (ТГц)
спектроскопия (более низкочастотная, обычно
f = 0.1–3.0 × 1012 Гц) неэффективна для определения малых примесей в биообъектах из-за сильного поглощения в воде, но эта область частот наиболее чувствительна к состоянию самой воды,
преобладающей в таких образцах [6]. Изменения
пропорций свободной и связанной воды, изменение времен релаксации для каждого из этих состояний воды – все это проявляется в диапазоне
частот 0.1–3.0 ТГц. Эта особенность делает ТГц
спектроскопию уникальным дополняющим методом уже существующих в диагностике биотканей и растворов.
Метод ТГц импульсной спектроскопии только
начинает применяться в данной области исследований. Отличительной особенностью метода яв-
При исследовании растворов методами ТГц
спектроскопии полезная информация содержится в изменении как величины амплитуды, так и
59
60
ЧЕРКАСОВА и др.
Сигнал, произв. ед.
кому малому сдвигу во времени, а метод отражения не чувствителен к изменению толщины
образца. Это приводит к тому, что сопоставление
комплексных спектров пропускания и отражения
существенно повышает достоверность наблюдаемых малых отличий в водных растворах. Отметим
также, что результаты, получаемые в спектроскопии пропускания, наиболее достоверны на “низких” частотах (0.05–0.8 ТГц), а спектроскопия отражения имеет преимущество для “высоких” ТГц
частот (1.0–2.5 ТГц). Объединение результатов
измерений в двух конфигурациях существенно
расширяет достоверный спектральный диапазон.
В настоящей работе мы показываем чувствительность импульсной ТГц спектроскопии для
исследования плазмы крови крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом. Введение аллоксана приводит к развитию гипергликемии и характеризуется значительными изменениями
гормонально-метаболических показателей у крыс.
Плазма крови таких крыс имеет высокий уровень
глюкозы, кортикостерона, триглицеридов и ряда
других биохимических показателей по сравнению с плазмой крови здоровых крыс [19]. В работе исследуются спектры пропускания и отражения плазмы крови здоровых крыс и крыс с диабетом в диапазоне частот 0.05–2.5 ТГц. Мы
полагаем, что значительное изменение состава
плазмы крови при диабете должно оказать влияние на изменение спектральных характеристик
плазмы.
(а)
3
2
1
0
−1
−2
0
5
Время, пс
10
Сигнал, произв. ед.
(б)
0.01
1E-3
1E-4
1E-5
0
1
2
f, ТГц
3
4
Рис. 1. Временное (а) и спектральное (б) представление ТГц импульса отраженного от воды (черная кривая) и от плазмы крови крыс с диабетом (серая кривая). Для наглядности кривые сдвинуты на 20% по
вертикальной оси, так как в масштабе графика отличия между кривыми неразличимы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
общей формы широкополосного спектра. Причина изменения формы спектра состоит в изменении времени релаксации жидкости (воды) –
той доли воды, которая химически или физически связывается с молекулами, присутствующими в растворе [6, 11]. Однако эти показатели часто
зависят от способа измерений и требуют тщательной проверки повторяемости и разработки новых, стабильных методов анализа экспериментальных данных. Методы спектроскопии пропускания и отражения дополняют друг друга в
смысле устойчивости к экспериментальным артефактам. Разброс значений при обработке спектров пропускания вызван изменением толщины
кюветы (на 2–5 мкм от общей толщины в
200 мкм) при смене растворов, что приводит к
сдвигу по оси Y спектра преломления и действительной части диэлектрической проницаемости.
Разброс результатов в спектроскопии отражения
связан со сдвигом по времени между сигналом
раствора и опорным сигналом (до 10 фс), что приводит к разному наклону спектра фазы отражения. При этом метод пропускания устойчив к та-
Измерения проводились на импульсном ТГц
спектрометре [20], имеющем в качестве накачки
ТГц излучателя фемтосекундный титан-сапфировый лазер с центральной длиной волны 790 нм,
частотой повторения импульсов 80 МГц и длительностью импульсов 120 фс. Генерация ТГц излучения происходила на наклонной поверхности
полупроводника арсенида галлия, выращенного
при низкой температуре, а детектирование ТГц
излучения осуществлялось с использованием
электрооптического эффекта в нелинейном кристалле теллурида цинка толщиной 1 мм. Пучок
ТГц излучения формировался системой параболических зеркал, обеспечивая на исследуемом образце область сфокусированного излучения диаметром 2 мм. В процессе исследований не происходило деградации биологических образцов, так
как уровень средней мощности падающего на них
ТГц излучения (100 нВт) был заведомо ниже предельно допустимых значений [21]. Спектральный
диапазон для достоверных измерений составлял
от 0.2 до 2.5 ТГц при возможности ослабления
сигнала в 100 раз (рис. 1). Для измерений пропускания в области 0.05–1.0 ТГц генератором и детектором ТГц излучения являлась пара фотопро-
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ
том 120
№1
2016
ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАЗМЫ КРОВИ
водящих антенн, более эффективная в низких частотах [22]. Все измерения проводились при
фиксированной температуре 21°С.
При исследовании спектров пропускания регистрировалась временная форма импульса
(рис. 1а), прошедшего через исследуемые образцы плазмы крови, помещенные в кювету с окнами из полистирола. Толщина кюветы была выбрана равной 200 мкм для частот 0.2–2.5 ТГц и
500 мкм для частот 0.05–1.0 ТГц, что обеспечивало десятикратное превышение отношения сигнал/шум и величину коэффициента пропускания
0.2–0.5. Фурье-преобразование измеренной временной формы ТГц импульса позволяло получить комплексный спектр излучения E(f), т.е. амплитуду |E(f)| (рис. 1б) и фазу arg(E(f)) спектра.
Здесь E – величина электрической составляющей
поля электромагнитной волны, f – частота. Информацию о показателях преломления и поглощения среды, через которую прошел ТГц импульс, получали при учете спектра опорного импульса, прошедшего либо через пустую кювету
(E0(f)), либо через кювету, заполненную дистиллированной водой (Ewater(f)). Для пересчета спектров пропускания и отражения в спектры поглощения и преломления использовали формулы
Френеля и методы, описанные в работе [20].
Существует однозначная связь между измеряемой величиной комплексного пропускания
T(f) = E(f)/E0(f) и параметрами измеряемого вещества [20]: поглощением и преломлением или
диэлектрической проницаемостью. В упрощенном виде коэффициент поглощения α(f) и показатель преломления n(f) вычисляются как
α( f ) = − ln(| T ( f )|)/ d,
(1)
n( f ) = − arg(T ( f )) c + 1,
2π fd
где d – толщина исследуемого образца, c – скорость света. При этом ε(f) = n*(f)2 – связь комплексного показателя преломления n* с диэлектрической проницаемостью ε, где
α( f )с
= ε( f ). (2)
2π f
В методе нарушенного полного внутреннего
отражения (НПВО) [23] диэлектрическая проницаемость может быть восстановлена по спектру
ТГц сигнала, отраженного от поверхности раздела призмы и исследуемой жидкости. Для спектроскопии НПВО использовали призму Довэ из высокоомного кремния с показателем преломления
nSi = 3.41. При основании призмы 1.5 × 2 см и угла
при вершине 90° поляризация электрического
поля была в плоскости падения излучения [17,
18]. Призму помещали в слабо сходящийся пучок
ТГц излучения так, чтобы перетяжка пучка (диаметром 2 мм) находилась на основании призмы. В
n*( f ) = n '( f ) + in ''( f ) = n( f ) + i
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ
том 120
№1
61
качестве опорного сигнала использовали отражение от свободного основания призмы, а в качестве измерительного – сигнал, полученный при
налитом на основание призмы исследуемом растворе. Толщина слоя раствора 1 мм заведомо превышала глубину проникновения поля в вещество
(30–300 мкм) на используемых частотах.
Комплексный коэффициент отражения определяли из отношения спектров падающего на
объект E0 и отраженного от объекта Esig излучения
как Rp(f) = Esig(f)/E0(f). Величина коэффициента
отражения Rp(f), более подробно описанного в работе [20], связана с комплексным показателем
преломления n* (2) соотношением, получаемым
из формул Френеля,
Rp =
n* 2( f ) cos θ 0 − n* 2( f ) − sin 2 θ 0
n* 2( f ) cos θ 0 + n* 2( f ) − sin 2 θ 0
.
(3)
Здесь θ0 = 57о – угол падения излучения на основание призмы изнутри кремния. Из соотношений (2) и (3) можно получить выражения для n и α
как в формуле (1), но оно слишком громоздко, и
мы его здесь не приводим. Формулы Френеля,
описывающие спектр отражения, остаются применимыми и для случая НПВО, только необходимо в формуле (3) заменить n* на n*/nSi. Из-за того
что внутри призмы есть ненулевой диапазон углов падения, сходимость ТГц пучка приводит к
ошибочным значениям показателя преломления
при решении обратной задачи НПВО для частот
ниже 0.3 ТГц. В качестве эталонного образца для
подтверждения достоверности вычисляемых характеристик растворов мы использовали дистиллированную воду.
В работе исследовали плазму крови самцов
крыс популяции Вистар. Животным были разделены на две группы: группа 1 – здоровые контрольные животные (4 особи), группа 2 – животные, имеющие высокий уровень глюкозы в крови
(аллоксановый диабет, 5 особей). Эксперименты
с животными подробно описаны в работе [19].
Кровь собирали в пробирки с гепарином. Пробирки центрифугировали 15 мин при 4000 об/мин
и 4°С. Плазму отделяли и хранили до дня анализа
при –20°С. Концентрацию глюкозы определяли
ферментативным методом с использованием наборов Fluitest GLU (BioСon, Германия). Концентрацию кортикостерона в плазме крови определяли методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии [24].
В представляемых данных каждый анализируемый спектр – результат усреднения по 5 независимым измерениям. Ошибки, представленные на
рис. 2а и 2б, характеризуют повторяемость независимых измерений.
2016
62
ЧЕРКАСОВА и др.
250
250
200
(а)
α, см−1
α, см−1
200
150
100
150
100
50
50
0
2.8
(в)
0.5
1.0 1.5
f, ТГц
0
2.0
0.5
1.0
1.5
f, ТГц
2.0
(б)
2.6
2.8
2.4
(г)
n
2.6
2.4
n
2.2
2.2
2.0
1.8
2.0
0.5
1.0
1.5
f, ТГц
2.0
1.8
0.5
1.0
1.5
f, ТГц
2.0
Рис. 2. Экспериментальные и модельные спектры поглощения (а, в) и преломления (б, г). Обозначения: α – коэффициент поглощения (см–1), n – показатель преломления, f – частота (ТГц), серая линия – группа 2, черная линия на
экспериментальных спектрах (а, б) – группа 1, на модельных спектрах (в, г) – вода.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 2 приведены усредненные спектры поглощения и преломления плазмы крови по группам здоровых крыс и крыс с аллоксановым диабетом, полученные в конфигурации пропускания.
Спектр поглощения плазмы крови здоровых животных мало отличается от спектра поглощения
воды. Данный факт ранее сообщался нами [25] и
рядом авторов при исследовании как плазмы крови человека [7], так и плазмы крови крыс [8]. Известно, что плазма крови на 90–92% состоит из
воды. Сухой остаток плазмы крови (8–10%) составляют органические соединения: белки, глюкоза, гормоны и др.
При изменении состояния организма изменяется и состав плазмы крови. При введении аллоксана крысам происходит избирательная гибель βклеток поджелудочной железы и развивается состояние абсолютной недостаточности инсулина,
которое сопровождается гипергликемией и активацией синтеза кортикостероидных гормонов в
надпочечниках [19, 24]. Крысы группы 2 на момент эксперимента имели развившийся аллоксановый диабет, который сопровождался высоким
уровнем глюкозы и основного глюкокортикоид-
ного гормона крыс – кортикостерона - в крови
(таблица). Амплитуда коэффициента поглощения плазмы крови крыс группы 2 достоверно
меньше амплитуды коэффициента поглощения
воды и плазмы крови здоровых крыс (рис. 2а) во
всем используемом ТГц диапазоне частот. Показатель преломления плазмы крови крыс с высоким содержанием глюкозы также заметно отличается от показателя преломления плазмы крови
здоровых крыс (рис. 2б).
Уменьшение коэффициента поглощения растворов в ТГц диапазоне частот с увеличением
концентрации растворенного вещества показано
ранее, например для арабинозы [16] и глюкозы
[10]. Это следствие того, что часть объема воды,
сильно поглощающего ТГц излучение, замещается менее поглощающей в этом диапазоне частот
добавкой, в частности глюкозой. Спектральные
резонансы в ТГц диапазоне частот, присущие веществам в поликристаллической фазе, в растворах пропадают. Наблюдается слабый монотонный рост поглощения с частотой [9]. Исходя из
этого положения изменение концентрации глюкозы в плазме крови крыс группы 2 на 0.4% привело бы к существенно меньшему изменению
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ
том 120
№1
2016
ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАЗМЫ КРОВИ
63
Спектральные характеристики растворов на частоте 1.0 ТГц и содержание в них глюкозы и кортикостерона
Группы
α, см–1
n
|R|
Arg(R)
Глюкоза,
ммоль/л
Кортикостерон, нг/мл
Вода
1
2
112.0 ± 0.5
110.5 ± 0.8
104.1 ± 0.7*
2.210 ± 0.005
2.208 ± 0.007
2.180 ± 0.005*
0.627 ± 0.025
0.626 ± 0.025
0.633 ± 0.025
0.39 ± 0.02
0.41 ± 0.02
0.48 ± 0.02*
0
6.6 ± 0.4
24.4 ± 1.9*
0
133.2 ± 26.5
196.4 ± 17.0*
1 – плазма крови крыс группы 1, 2 – плазма крови крыс группы 2, α – коэффициент поглощения, n – показатель преломления, |R| – коэффициент отражения, Arg(R) – фаза коэффициента отражения; * – p < 0.05 – статистически значимые отличия
относительно группы 1.
ТГц отклика (∆α = 0.1%) (см., например, формулу (1) из [11]), чем мы реально наблюдаем (∆α =
= 5%) (таблица). Это свидетельство того, что наблюдаемые изменения ТГц спектров нельзя объяснить только суммой составляющих воды и компонентов плазмы. Мы предполагаем, что это отражает изменение характеристик самой воды в
плазме крови. Известно, что молекулы воды, составляющие гидратную оболочку биомолекул,
обладают другими временами релаксации по
сравнению с несвязанными, свободными молекулами воды [6, 11], что отражается в низкочастотном спектре поглощения и преломления водных растворов [6, 10–12]. Именно эти изменения
мы и исследовали в дальнейшем.
Анализ наблюдаемых отличий проводили,
сравнивая экспериментальные спектры животных группы 2 с модельной диэлектрической
функцией воды. Диэлектрическая проницаемость воды известна из литературы, и для ТГц
диапазона она может быть выражена двухкомпонентной моделью Дебая и лоренцевым слагаемым [12, 16, 20, 23, 26, 27]. Некоторые авторы
предлагают добавлять ещё ряд дебаевских слагаемых [7, 28], но мы используем максимально простую модель достаточной точности:
ε water (ω) =
(4)
A
Δ ε1
Δε 2
= ε∞ +
+
+ 2
+ ...,
2
1 + i ω τ1 1 + i ω τ 2 ω 0 − ω + i γ 1ω
где ω = 2πf – циклическая частота, τ1 = 9.4 ±
± 0.6 пс, τ2 = 0.25 ± 0.05 пс – времена релаксации
для первого и второго дебаевских слагаемых, ε∞ =
= 2.6 ± 0.2 – диэлектрическая проницаемость на
высоких частотах, ∆εi – амплитуды вкладов в диэлектрическую проницаемость на низких частотах от первого (“медленного”) ∆ε1 = 74 ± 2 и второго (“быстрого”) ∆ε2 = 1.67 ± 0.05 дебаевских
слагаемых, A = 31.5 (ТГц × 2π)2, ω0/2π = 5.6 ТГц,
γ/2π = 5.9 ТГц – амплитуда, частота и ширина линии лоренцева слагаемого [16, 20]. Значения этих
параметров у разных авторов [7, 20, 26, 28] отличаются в зависимости от того, какой именно
спектральный диапазон описывается. ТГц диапазон менее чувствителен к первому дебаевскому
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ
том 120
№1
слагаемому, чем СВЧ диапазон, так как максимум поглощения воды соответствует частоте порядка 0.01 ТГц [12, 16, 23]. Поскольку в формуле (4)
в знаменателе первого дебаевского слагаемого
ωτ1 @ 1 (даже для f = 0.1 ТГц, ωτ1 ≈ 6), то в ТГц
диапазоне мы можем точно определить отношение ∆ε1/τ1 = 7.87 ± 0.01, но не эти величины по отдельности. Ошибочное уменьшение ∆ε1 можно
скомпенсировать увеличением τ1. В используемом нами диапазоне 0.05–2.5 ТГц наблюдается
наилучшая чувствительность к параметрам второго дебаевского слагаемого и слишком слабая
чувствительность к лоренцеву слагаемому, параметры которого взяты из литературы и не варьировались. Известно, что заметный вклад от лоренцева слагаемого начинается для частот выше
3 ТГц [23]. Комбинирование данных СВЧ спектроскопии, ТГц спектроскопии и спектроскопии
оптического эффекта Керра позволяет получить
единые параметры модели диэлектрической проницаемость воды в широком диапазоне частот от
10 ГГц до 30 ТГц [29]. Полученные нами величины для дистиллированной воды согласуются с
указанными в литературе [23, 26]. Ряд авторов также
использует величину статической восприимчивости
εs = εwater(0) [26, 28, 30], которая накладывает дополнительное условие на амплитуды компонент модели
воды ε water (0) = ε ∞ + Δ ε1 + Δ ε 2 + A2 [26]. Несмотря
ω0
на то, что эта величина достаточно точно измеряется в СВЧ диапазоне, в ТГц публикациях последних лет присутствует разброс значений εs от
78.4 [26] до 80.2 [23].
Процесс обработки экспериментальных спектров состоял в том, чтобы выявить тот параметр,
при малом изменении которого модельные спектры изменялись бы так же, как экспериментальные спектры плазмы крови животных с диабетом
(группа 2). Как отмечено выше, спектры поглощения плазмы крови здоровых животных практически не отличаются от спектра поглощения
воды [22], и в данной обработке мы сравниваем
группу 2 с дистиллированной водой. Модельные
спектры строили, используя формулы (1)–(4). На
рис. 2в и 2г приведен конечный результат такой
2016
64
ЧЕРКАСОВА и др.
0.8
0.8
(а)
0.7
|R|
|R|
0.7
0.6
0.5
0.4
(в)
0.6
0.5
0.5
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
−0.1
−0.2
1.0
f, ТГц
1.5
0.4
2.0
0.5
0.6
0.5
(б)
1.0
1.5
f, ТГц
2.0
(г)
arg (R)
arg (R)
0.4
0.3
0.2
0.1
0
−0.1
−0.2
0.5
1.0
1.5
f, ТГц
2.0
0.5
1.0
1.5
f, ТГц
2.0
Рис. 3. Экспериментальные и модельные спектры амплитуды (а, в) и фазы коэффициента (б, г) отражения. Обозначения: |R| – коэффициент отражения, arg(R) – фаза коэффициента отражения (рад), f – частота (ТГц), серая линия –
группа 2, черная линия на экспериментальных спектрах (а, б) – группа 1, на модельных спектрах (в, г) – вода.
обработки для спектров пропускания. Было получено, что амплитуда первого дебаевского слагаемого ∆ε1 в 1.2 раза меньше для плазмы крови
крыс с диабетом по сравнению с водой (рис. 2в).
Видно качественное согласие отличий спектров
на модельных (рис. 2в, 2г) и экспериментальных
графиках (рис. 2а, 2б).
Перейдем к методу НПВО. Амплитуда и фаза
коэффициента отражения плазмы крови животных с аллоксановым диабетом превышает аналогичные значения для здоровых животных
(рис. 3а, 3б). Модельные спектры отражения
(рис. 3в, 3г) строятся аналогично модельным
спектрам поглощения, используя формулы (3),
(4). Из рис. 3в видно, что в отражении, как и в
пропускании, амплитуда первого дебаевского
слагаемого уменьшается для плазмы крови крыс с
диабетом в 1.2 раза. Это может свидетельствовать
об уменьшении доли молекул воды, связанных
водородными связями, т.е. возрастает доля свободной воды. Ранее методами СВЧ диэлектрометрии было показано, что в плазме крови крыс с
экспериментальным диабетом увеличивается количество свободной воды [31].
Сравнивая спектры раствора (в данном случае
плазма крови крыс с диабетом) и растворителя
(вода) в предельно одинаковых условиях, по их
отношению можно более точно выявить диапазон частот, в котором происходят изменения.
Предположим, что незначительно изменился
один из параметров дебаевского отклика воды в
растворе. В модельном отношении спектров отражения видно, в каком диапазоне частот и как
проявится изменение каждого из параметров
(рис. 4а). Сравнивая модель с экспериментальными данными по отражению, видим, что для плазмы крови крыс с диабетом, возможно, уменьшились значения первого и второго дебаевского слагаемых или увеличилось значение времени τ1.
Аналогичное сравнение эксперимента и модели в
конфигурации пропускания (рис. 4б) показывает, что изменилось в основном значение первого
дебаевского слагаемого (амплитуда уменьшилась
в 1.1 раза), что соответствует результатам, приведенным на рис. 2 и 3. При нормировке спектров
группы 2 на спектры группы 1, так же как и при
нормировке на чистую воду, наблюдаются увеличение амплитуды и уменьшение фазы коэффициента пропускания, что подтверждает наши пред-
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ
том 120
№1
2016
ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАЗМЫ КРОВИ
1.06
ε'
10
9
1
2
3
4
5
6
(а)
1.04
65
(а)
1
2
3
4
8
|R1|/|R2|
7
6
1.02
5
1.00
4
0.98
0.5
0.96
0.1
ε''
9
8
7
6
5
1
1
2
6
1.5
(б)
1.4
1.0
1.5
f, ТГц
2.0
2.5
1
2
3
4
(б)
|T1|/|T2|
4
1.3
3
1.2
2
1.1
0.5
1.0
0.01
0.1
f, ТГц
1
Рис. 4. Относительное изменение отклика водного
раствора при малом изменении одного из параметров
модели диэлектрической проницаемости, сравнение
с экспериментом. а – спектр отражения с измененным параметром (|R1|) нормировался на спектр отражения с исходными параметрами (|R2|). б – спектр
пропускания с измененным параметром (|Т1|) нормировался на спектр пропускания с исходными параметрами (|Т2|). Цифрами указано, какой именно параметр изменялся для каждой кривой: 1 – ∆ε1/1.1, 2 –
∆ε2/1.1, 3 – τ1 × 1.1, 4 – τ2 × 1.1, 5 – А/1.1, 6 – экспериментальные данные, группа 2 относительно воды,
толщина кюветы 500 мкм.
положения о причинах отличия ТГц отклика
групп 1 и 2.
В настоящее время считают, что основная
причина наблюдаемых изменений в ТГц спектрах
растворов – это влияние биомолекул на окружающие их молекулы воды в растворе. В ряде работ
показано, что в растворе изменяются время релаксации (переориентации молекул воды) и амплитуды двух дебаевских слагаемых, отвечающих
за долю связанной и свободной воды [6, 10–13,
28]. Эти изменения как раз и приводят к наблю5 ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ
том 120
№1
1.0
1.5
f, ТГц
2.0
2.5
Рис. 5. Спектр действительной ε' (а) и мнимой ε'' (б)
частей диэлектрической проницаемости. Цифрами
обозначены: модель воды (1), данные, пересчитанные из эксперимента по пропусканию воды (2), по
пропусканию образцов с диабетом (3), по отражению
образцов с диабетом (4).
даемому различию в ТГц спектрах. Нами был
получен следующий набор параметров для описания диэлектрической проницаемости плазмы
крови крыс с диабетом (рис. 4): ε∞ = 2.6 ± 0.2, τ1 =
= 9.96 ± 0.5 пс, τ2 = 0.24 ± 0.01 пс, Δε1 = 70 ± 2
(∆ε1/τ1 = 7.03 ± 0.01), Δε2 = 1.66 ± 0.03, A = 31
(ТГц × 2π)2, ω0/2π = 5.3 ТГц, γ/2π = 7 ТГц в диапазоне 0.05–2.5 ТГц. Данный метод определения
причин изменения ТГц отклика – предварительный, поскольку в строгом случае необходимо
учитывать как изменение многих параметров одновременно, так и собственный спектральный
отклик биомолекул, растворенных в воде. Отметим, что при сравнении спектров насыщенного
водного раствора глюкозы и чистой воды изменение ТГц спектров также описывается уменьшением Δε1 и возрастанием τ1 в растворе глюкозы,
2016
66
ЧЕРКАСОВА и др.
причём эти параметры изменяются примерно в
два раза относительно их значений для воды.
Величины, получаемые методами спектроскопии поглощения (показатель преломления и коэффициент поглощения) и спектроскопии
НПВО (амплитуда и фаза отраженного сигнала),
функционально связаны с комплексной диэлектрической проницаемостью. Поэтому возможно
решение обратной задачи НПВО, в которой из
данных, получаемых в эксперименте, восстанавливаются более привычные для восприятия показатели преломления и поглощения. Исходно как
пропускание, так и отражение определяются диэлектрической функцией, именно в этом виде необходимо сравнивать результаты этих разных методов. На рис. 5 сравниваются значения действительной и мнимой частей диэлектрической
функции, восстановленные из измерений в геометрии НПВО и из геометрии пропускания, с модельными спектрами, построенными с использованием приведенных формул (1)–(4). Видно их
удовлетворительное согласие в рассматриваемом
диапазоне частот. Таким образом, из экспериментальных данных по отражению и пропусканию образца можно независимо получить практически одинаковые характеристики исследуемого
раствора и повысить достоверность рассчитанных
величин.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Методом импульсной ТГц спектроскопии была исследована плазма крови здоровых крыс и
крыс с экспериментальным диабетом, имеющих
повышенный уровень глюкозы и кортикостерона. Для повышения точности определения малых
изменений в спектрах мы, во-первых, анализируем отношение спектров двух близких растворов,
во-вторых, проводим эту процедуру последовательно в двух экспериментальных конфигурациях: отражения и пропускания. Предполагая, что
наблюдаемые изменения связаны с изменением
состояния самой воды, мы подбираем изменение
одного из параметров дебаевской модели водного
раствора, приводящее к спектральным особенностям, наблюдаемым в эксперименте. Предложенный нами метод анализа изменений ТГц отклика
водных растворов предварительный и требует доработки, в частности учета изменения нескольких параметров одновременно. Проведенный
анализ позволил обнаружить малые, но достоверные отличия в ТГц спектрах поглощения и отражения плазмы крови крыс с диабетом относительно плазмы крови здоровых крыс. Показано,
что в плазме крови крыс с диабетом изменяется
вклад первого дебаевского слагаемого, описывающего “медленную” релаксацию диэлектрического отклика молекул воды, что является в
первую очередь следствием высокой концентрации глюкозы.
Работа выполнена при финансовой поддержке
РФФИ (проект № 13-02-01364 в медико-биологической части и проект №14-02-00846 в части ТГц
техники).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ellis D.I., Goodacre R. // Analyst. 2006. V. 131. P. 875.
2. Scott D.A., Renaud D.E., Krishnasamy S., Meric P., Buduneli N., Cetinkalp S., Liu K. // Diabetology & Metabolic Syndrome. 2010. V. 2. P. 48.
3. Sultana R.R., Zafarullah S.N., Kirubamaniet N.H. //
Indian J. Science and Technology. 2011. V. 4. № 8.
P. 967.
4. Petibois C., Rigalleau V., Melin A-M., Annie Perromat A.,
Cazorla G., Gin H., Déléris G. // Clinical Chemistry.
1999. V. 45. № 9. P. 1530.
5. Budinova G., Salva J., Volka K. // Appl. Spectrosc.
1997. V. 51. P. 631.
6. George D.K., Markelz A.G. // Terahertz Spectroscopy
and Imaging / Ed. by Peiponen K.-E., Zeitler A., Kuwata-Gonokami M. Heidelberg: Springer, 2012.
P. 229–250.
7. Reid C., Reese G., Gibson A.P., Wallace V.P. // IEEE J.
Biomedical and Health Informatics. 2013. V. 17. № 4.
P. 774.
8. Jeong K., Huh Y.-M., Kim S.-H. et al. // J. Biomed. Optics. 2013. V. 18. № 10. P. 107008–1.
9. Nazarov M., Shkurinov A., Tuchin V.V., Zhang X.-C. //
Handbook of Photonics for Biomedical Science. Series
in Medical Physics and Biomedical Engineering / Ed.
by Tuchin V.V. CRC Press, Taylor and Francis Group,
2010. P. 519–617.
10. Born B., Havenith M. // J. Infrared Milli Terahz Waves.
2009. V. 30. P. 1245.
11. Heyden M., Brundermann E., Heugen U., Niehues G.,
Leitner D., Havenith M. // J. Am. Chem. Soc. 2008.
V. 130. P. 5773.
12. Shiraga K., Ogawa Y., Kondo N., Irisawa A., Imamura M. //
Food Chemistry. 2013. V. 140. P. 315.
13. Kim S.J., Born B., Havenith M., Gruebele M. // Angew.
Chem. Int. Ed. 2008. V. 47. P. 6486.
14. Xu J., Plaxco K.W., Allen S.J. // J. Phys. Chem. B. 2006.
V. 110. P. 24255.
15. Globus T., Woolard D., Crowe T.W., Khromova T., Gelmont B., Hessler J. // J. Phys. D: Appl. Phys. 2006.
V. 39. P. 3405.
16. Ангелуц А.А., Балакин А.В., Евдокимов М.Г., Есаулков М.Н., Назаров М.М., Ожередов И.А., Сапожников Д.А., Солянкин П.М., Черкасова О.П., Шкуринов А.П. // Квант. электрон. 2014. Т. 44. № 7. С. 614.
17. Черкасова О.П., Назаров М.М., Шкуринов А.П., Федоров В.И. // Известия вузов. Радиофизика. 2009.
Т. 52. № 8. С. 576.
18. Колесников А.С., Колесникова Е.А., Попов А.П., Назаров М.М., Шкуринов А.П., Тучин В.В. // Квант.
электрон. 2014. Т. 44. № 7. С. 633.
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ
том 120
№1
2016
ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАЗМЫ КРОВИ
19. Черкасова О.П., Кузнецова Н.В., Пальчикова Н.А.,
Селятицкая В.Г. // Сахарный диабет. 2011. № 2.
С. 37.
20. Назаров М.М., Шкуринов А.П., Кулешов Е.А., Тучин В.В. // Квант. электрон. 2008. Т. 38. № 7.
С. 647.
21. Ангелуц А.А., Гапеев А.Б., Есаулков М.Н., Косарева О.Г., Матюнин С.Н., Назаров М.М., Пашовкин Т.Н., Солянкин П.М., Черкасова О.П., Шкуринов А.П. // Квант. электрон. 2014. Т. 44. № 3. С. 247.
22. Назаров М.М., Шкуринов А.П., Ангелуц А.А., Сапожников Д.А. // Известия вузов. Радиофизика.
2009. Т. 52. № 8. С. 595.
23. Yada H., Nagai M., Tanaka K. // Chem. Phys. Lett.
2008. V. 464. P. 166–170.
24. Черкасова О.П., Селятицкая В.Г., Пальчикова Н.А.,
Кузнецова Н.В. // Бюллетень экспериментальной
биологии и медицины. 2014. Т. 158. № 8. С. 145.
ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ
том 120
№1
67
25. Cherkasova O.P., Nazarov M.M., Smirnova I.N., Angeluts A.A., Shkurinov A.P. // Physics of Wave Phenomena. 2014. V. 22. № 3. P. 185.
26. Пеньков Н.В., Швирст Н.Э., Яшин В.А., Фесенко Е.Е. // Биофизика. 2013. Т. 58. № 6. С. 933.
27. Markelz A.G. // IEEE J. Selected Topics in Quantum
Electronics. 2008. V. 14. № 1. P. 180.
28. Kindt J.T., Schmuttenmaer C.A. // J. Phys. Chem. 1996.
V. 100. № 24. P. 10343.
29. Turton D., Harwood T., Lapthorn A., Ellis E., Wynne K. //
Proc. of SPIE. 2013. V. 8623. P. 862303–1.
30. Fitzgerald A.J., Pickwell-MacPherson E., Wallace V.P. //
PLOS ONE. 2014. V. 9. № 7. P. e99291.
31. Шаталова Т.А., Горобченко О.А., Овсянникова Т.Н.,
Гладких А.И., Николов О.Т., Гаташ С.В. // Биофизический вестник. 2011. № 26 (1). С. 94.
2016
5*