На правах рукописи ВЛИЯНИЕ ЭПИБРАССИНОЛИДА И
advertisement
На правах рукописи ВЛИЯНИЕ ЭПИБРАССИНОЛИДА И АМБИОЛА НА ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС И УЛЬТРАСТРУКТУРУ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПРИ РЕГУЛЯЦИИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2006 2 Работа выполнена в лаборатории биохимии фитоиммунитета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Н.П. Кораблева Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Е.Б. Кириченко кандидат биологических наук, И.И. Чернядьев Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова, биологический факультет Защита состоится «18» апреля 2006 года в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т, 33, корп. 2. С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т, 33, корп. 1. Автореферат разослан «16 » марта 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 3 Актуальность проблемы. Выяснение механизмов регуляции ростовых процессов в связи с устойчивостью растений к стрессовым воздействиям является важной проблемой биологии. Актуальным направлением работ в этой области представляется изучение сигнальных молекул, в том числе стрессовых фитогормонов и их синтетических аналогов, контролирующих рост и устойчивость растений картофеля. В основе исследований лежит концепция о взаимосвязи стадий онтогенеза с устойчивостью. Например, формирование реакций иммунитета сопряжено с длительностью генетически закрепленного признака глубокого покоя у клубней картофеля различных сортов. Одним из перспективных подходов к решению задач, связанных с повышением продуктивности картофеля, является скрининг физиологически активных соединений нового поколения, обладающих свойствами регуляторов роста и иммуномодуляторов. Основные биологические параметры отбора такого рода соединений - их влияние на покой и ростовые процессы после его окончания. Ранее были выявлены две группы веществ – брассиностероиды и антиоксиданты, способные регулировать рост и устойчивость растений к неблагоприятным факторам. Изучение влияния представителей этих групп – эпибрассинолида и амбиола на картофель важно для понимания механизма их действия и определения наиболее эффективных путей разработки технологии применения. Получение сведений об изменениях в гормональном балансе, морфогенезе и ультраструктуре тканей точек роста позволяет выяснить взаимодействие физиологически активных соединений с функционированием сигнальных систем, включающих стрессовые фитогормоны (этилен, абсцизовая кислота) и выявить зоны апикальных меристем, воспринимающие регуляторные сигналы. Особый интерес для изучения представляют генетически модифицированные (трансгенные) растения картофеля, обладающие защитными свойствами против фитопатогенов. Исследование морфогенеза и тонкой структуры клеток отдельных органов исходных и трансгенных растений необходимо для определения посттранскрипционных изменений в ответных реакциях на действие физиологически активных веществ и оптимизации путей их использования в биотехнологии. Цель работы и задачи исследования. Цель работы – исследование механизма действия эпибрассинолида и амбиола при регуляции покоя и роста растений картофеля путем выявления изменений в гормональном балансе, морфогенезе и ультраструктуре клеток апикальных меристем. В работе были поставлены следующие задачи: 1) Изучить действие эпибрассинолида и амбиола на покой и рост растений картофеля; 4 2) Определить содержание фитогормонов (этилен, абсцизовая кислота, β-индолилуксусная кислота, цитокинины) в отдельных органах растений картофеля на разных стадиях онтогенеза и под действием эпибрассинолида и амбиола; 3) Изучить влияние эпибрассинолида на отдельные клеточные параметры тканей апикальных меристем клубней картофеля; 4) Исследовать действие амбиола на формирование морфогенетических признаков у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля; 5) Изучить влияние амбиола на пластидный аппарат клеток апикальных меристем клубней исходных и трансгенных растений картофеля. Научная новизна работы. Впервые проведено исследование структурно-функциональных и гормональных изменений в тканях исходных и трансформированных по гену дефензина (трансгенных) растений картофеля под действием эпибрассинолида и амбиола, регулирующих ростовые процессы на разных стадиях онтогенеза. Установлено, что эпибрассинолид в рост-ингибирующих концентрациях пролонгирует состояние глубокого покоя путем изменения гормонального баланса в тканях апикальных меристем – увеличения образования этилена и абсцизовой кислоты. Показано, что клеткамимишенями, воспринимающими регуляторные сигналы этилена и абсцизовой кислоты, являются клетки стержневой меристемы апексов, способность которых к растяжению определяет переход от покоя к росту. Установлено, что регуляция ростовых процессов в растениях картофеля под действием амбиола определяется его влиянием на содержание фитогормонов и изменением соотношения ауксины+цитокинины/абсцизовая кислота. Амбиол изменяет морфогенетические признаки у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля, регулирует формирование стебля, образование листьев и корней. Установлены различия в ответных реакциях на амбиол пластидного аппарата клеток исходных и трансгенных растений. Амбиол стимулирует дифференцировку внутренней мембранной системы пластид, в том числе, интенсивное формирование трубчатого мембранного комплекса в пластидах клеток апикальных меристем. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные сведения о механизме действия эпибрассинолида и амбиола расширяют представления о регуляции ростовых процессов в растениях картофеля на разных стадиях онтогенеза и могут быть использованы для разработки новых биотехнологий повышения продуктивности картофеля и его устойчивости к стрессовым воздействиям. Изменение гормонального баланса - один из важных показателей при скрининге физиологически активных веществ, регулирующих покой и рост. Повышение содержания стрессовых фитогормонов (этилена и абсцизовой кислоты) может служить биохимическим 5 тестом пролонгирования глубокого покоя, стадии онтогенеза, во время которой растения обладают комплексной устойчивостью к болезням, неблагоприятным условиям температуры и влажности. В качестве ещё одного теста изменения стадии онтогенеза предлагается определение способности к растяжению клеток-мишеней (клеток стержневой меристемы апексов), воспринимающих регуляторные сигналы. Результаты анализа посттранскрипционных изменений в тканях трансформированных по гену дефензина растений позволяют наметить пути использования физиологически активных веществ как для коррекции выявленных отклонений в росте и развитии, так и для усиления положительных эффектов трансформации. Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на: International Symposium “Signalling Systems of Plant Cells” (Moscow, Russia, 2001); VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва, 2001); 17th International Conference on Plant Growth Substances (Brno, Czech Republic, 2001); VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002); III Съезде Всероссийского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); V съезде Общества физиологов растений (Пенза, 2003); II International Congress «Biotechnology: state of the art and prospects of development» (Moscow, Russia, 2003); ХI съезде Русского ботанического общества (Новосибирск-Барнаул, 2003); IV Международной научной конференции «Регуляторы роста, развития и продуктивности растений» (Беларусь, Минск, 2005). Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ (9 статей и 7 тезисов). Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на 115 страницах машинописного текста и содержит 21 рисунок, 9 таблиц и 27 электронно-микроскопических фотографий. Библиография включает в себя 250 названий отечественных и зарубежных авторов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования - растения картофеля Solanum tuberosum L., на разных стадиях онтогенеза. В опытах использовали: 1) клубни картофеля, 2) точки роста (апикальные меристемы - апексы) клубней картофеля, 3) отдельные органы растений, выращенных в полевых условиях, 4) растения-регенеранты, полученные in vitro на искусственных питательных средах. Опыты проводили на нескольких сортах картофеля – Невский, Скороплодный, Бронницкий (меристемный) и Дезире (исходные и трансгенные растения). Трансформация картофеля с. Дезире по гену антимикробных пептидов - дефензинов из амаранта Amaranthus 6 caudatus L. была проведена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН [Ляпкова и др., 2001]. Использованные физиологически активные вещества: – эпибрассинолид (22R, 23R,24R)-2α,3α,22, 23-тетраокси-В-гомо-7-окса-5α-эргостан-6ОН), синтезированный в Институте биоорганической химии АНБ, Минск [Хрипач, 1993]; – амбиол (дигидрохлорид-2-метил-4-диметиламинометил-5-гидроксибензимидазола), синтезированный в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН [Смирнов и др., 1984]. Изучение влияния физиологически активных веществ на ростовые процессы в апикальных меристемах. Клубни картофеля сорта Бронницкий обрабатывали растворами эпибрассинолида в концентрации 10-5 - 5 мг/л, сорта Невский – в концентрации 10-4 -10-2 мг/л; сортов Невский и Дезире - растворами амбиола (концентрации 1-60 мг/л). Из контрольных и опытных клубней в разное время после обработки изолировали точки роста (апексы) для оценки интенсивности прорастания. Интенсивность выделения этилена клубнями определяли методом газовой хроматографии [Ward, 1978; Ракитин, Ракитин, 1986], на хроматографе (Цвет, Газохром, Россия), оборудованном колонкой Порапак N 3000х2 мм (несущий газ гелий 23 см3 /мин-1), при температуре камеры, инжектора и пламенно-ионизационного детектора 80, 100 и 150°С. соответственно. Содержание абсцизовой кислоты методом ГЖХ [Milborrow, 1970; Сухова и др., 1987] определяли в очищенном метаноловом экстракте на газовом хроматографе (Цвет, Газохром, Россия), с пламенно-ионизационным детектором и колонкой ОV-1, (несущий газ азот, 30 см3 /мин-1). Содержание связанной абсцизовой кислоты определяли после щелочного гидролиза экстракта с 10%-ой NаоН в течение 1 часа при 60°С. Содержание β-индолилуксусной кислоты, абсцизовой кислоты и цитокининов (зеатин+зеатин-рибозид) в тканях растений картофеля определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [Веселов, Кудоярова, 1990]. Пробы для анализов отбирали в фазу цветения растений (листья) и после уборки урожая (клубни). Растительный материал фиксировали жидким азотом, высушивали в термостате при 55-600С. Экстракцию изученных групп фитогормонов проводили из одной навески (от 250 до 500 мг сухой массы) комплексным методом [Власов и др., 1979]. Вегетационные и полевые опыты проводили на базе агробиостанции Орловского государственного университета, в типовом вегетационном домике и на опытном поле (площадь учетной делянки – 160 м2). Картофель выращивали стандартным методом в соответствии с общепринятой агротехникой. 7 Для изучения влияния амбиола на рост и продуктивность картофеля растения в фазе бутонизации опрыскивали раствором препарата в концентрации 30 мг/л, из расчета 100 мл на одно растение. Контрольные растения опрыскивали водой. Продуктивность картофеля в почвенной культуре определяли взвешиванием клубней в сосудах (9 биологических повторностей), в полевом опыте – путем пробных копок (каждый 5-ый куст по диагонали делянки, всего 50 кустов), урожайность рассчитывали в ц/га. Культивирование растений in vitro. Стебли эксплантов исходных и трансгенных растений картофеля с. Дезире разрезали на несколько равных частей размером около 1 см (для каждого варианта опыта и контроля) и высаживали в стерильные пробирки с 20 мл регенерационной среды Мурасиге-Скуга [Murashige, Skoog, 1962]. Для изучения влияния амбиола на рост регенерантов препарат добавляли в среду для выращивания до получения в ней конечных концентраций амбиола 5, 20, 40 и 60 мг/л. Закрытые пробирки помещали в климокамеру с фотопериодом 16 ч и температурой 21оС. Морфолого-ботанический анализ. У регенерантов, культивируемых в климокамере, измеряли длину образовавшихся корней (на 7 сутки). На 21 сутки измеряли высоту растения, подсчитывали количество листьев; корни и листья отделяли и взвешивали. Электронная микроскопия. Электронно-микроскопическое исследование проводили по общепринятой методике. Апексы фиксировали в 2,5%-ном глутаровом альдегиде, приготовленном на 0,1 М (Nа-К) фосфатном буфере, рН 7,1-7,2, дофиксировали в 1%-ном растворе ОsО4, обезвоживали в серии спиртов возрастающей крепости и ацетоне и заключали в эпоксидную смолу ЭПОН-812 [Luft, 1961]. Для сравнительного ультраструктурного изучения брали клетки из различных зон апикальных меристем. Предварительную ориентировку срезов для определения зональности апексов выполняли с помощью полутонких срезов под световым микроскопом. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме "LКВ-3" (Швеция) контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу [Reynolds, 1963] и просматривали под электронным микроскопом "JEМ-100С" (Япония). Морфометрическую обработку электронно-микроскопических изображений проводили по методу Аветисова-Стефанова (1979), а также с помощью компьютерной программы «Cell Counter», специально разработанной для измерения площадей клеток и различных внутриклеточных структур по отсканированным изображениям, полученным с электронного микроскопа [Платонова и др., 2005]. Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы «Microsoft Excel». Результаты измерений, выраженные средними арифметическими показателями и их стандартными ошибками, представлены в таблицах и графиках. Эксперименты выполняли в 3-х и более биологических повторностях, каждый вариант не менее 3-х аналитических повторностей. 8 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение влияния эпибрассинолида и амбиола на ростовые процессы и гормональный баланс растений картофеля 1.1. Действие эпибрассинолида на покой и рост клубней картофеля Брассиностероиды - фитогормоны с широким спектром биологической активности, влияющие на различные физиологические процессы растений [Хрипач, 1993; Clouse, Sasse, 1998]. Представляло интерес выяснить, можно ли с помощью брассиностероидов, в частности, эпибрассинолида (ЭБ) воздействовать на покой клубней картофеля. Продолжительность глубокого покоя клубней связана с высоким уровнем фитогормона абсцизовой кислоты. В связи с этим, было изучено действие ЭБ на продолжительность глубокого покоя клубней, выделение этилена целыми клубнями, уровень свободной и связанной абсцизовой кислоты в точках роста клубней, а также ультраструктурные Вес апексов, г 0,12 2002 г. 0,08 2003 г. параметры клеток апикальных меристем клубней. 2001 г. 0,1 на отдельные Обработка клубней картофеля с. Бронницкий в состоянии глубокого покоя в широком диапазоне концентраций ЭБ в 0,06 течение 0,04 установить ингибирующие (10-5-10-2 мг/л) и 0,02 стимулирующие сезонов (1-5 позволила мг/л) рост концентрации препарата (рис. 1). 0 10-4 10-5 0 10-3 10-2 1 к месяцы от начала хранения 0 2 4 5 7 80 60 40 сокращению их (рис. обработанных клубней определяли после 2). 0 10 -3 10 -2 10 Концентрация ЭБ, мг/л Рис. 2. Влияние эпибрассинолида на продолжительность глубокого покоя клубней картофеля сорта Невский. к Способность к прорастанию окончания глубокого покоя у контрольных клубней (90 дней). Длительность глубокого покоя у клубней, обработанных ЭБ, заметно увеличивалась – эффект концентрации 10-2 -4 с. способности прорастанию наибольший 20 0 картофеля мг/л перед закладкой на хранение приводила 140 100 клубней Невский ЭБ в концентрациях 10-4 – 10-2 Рис. 1. Влияние эпибрассинолида на рост апексов клубней картофеля сорта Бронницкий (обработка в состоянии покоя). 120 Обработка 5 Концентрация ЭБ, мг/л Продолжительность глубокого покоя, сутки нескольких был отмечен при мг/л (36-38 суток). Клубни опытных вариантов отличались от контрольных разное время задержкой после прорастания начала в хранения. 9 Величина этой задержки зависела от концентрации ЭБ и составляла 38, 36, 17 и 7 суток спустя 2, 4, 5 и 7 месяцев после закладки на хранение соответственно (рис. 2). Таким образом, обработка клубней ЭБ перед Интенсивность выделения этилена, (см3 / г /сут) x 10-3 2,5 время после обработки, cутки 2 1 1,5 7 1 0,5 10-4 0 10-3 10-2 Концентрация ЭБ, мг/л Рис. 3. Влияние ЭБ на интенсивность выделения этилена клубнями картофеля на хранение понижает их способность к прорастанию и удлиняет период глубокого покоя. Опыты показали, что под действием 30 ЭБ усиливалось выделение этилена целыми 60 клубнями картофеля (рис. 3). Интенсивность 150 0 закладкой выделения этилена клубнями изменялась в зависимости от состояния (глубокий глубокого покоя, физиологического покой, окончание прорастание) и концентрации ЭБ. Контрольные клубни выделяли этилен в наименьшем количестве во время глубокого покоя и в максимальном — при активном прорастании. Стимулирующее действие ЭБ на выделение этилена в наибольшей степени проявлялось при концентрации 10-2 мг/л на 1 и 7 сутки после обработки. На 30 и 60 сутки все обработанные ЭБ клубни выделяли этилен в приблизительно одинаковом, но в большем, чем в контроле, количестве. На 150 сутки ЭБ не влиял на выделение этилена клубнями. Определение содержания свободной и связанной абсцизовой кислоты (АБК) в точках роста клубней картофеля показало, что изменения в количестве этого фитогормона, как и этилена, зависят от времени анализа и концентрации ЭБ (табл.1). 0 Сутки от начала хранения 30 60 120 150 А В А В А В А В 6.1 ± 0.8 1.6 ± 0.1 5.2 ± 0.5 1.7 ± 0.1 1.9 ± 0.1 0.8 ± 0.1 1.1 ± 0.1 0.8 ± 0.1 10-4 6.8 ± 0.7 2.2 ± 0.2 5.4 ± 0.6 2.1 ± 0.1 2.2 ± 0.2 1.2 ± 0.2 1.3 ± 0.1 0.9 ± 0.2 10-3 8.4 ± 0.9 2.6 ± 0.2 6.2 ± 0.4 2.7 ± 0.3 3.8 ± 0.5 2.4 ± 0.3 2.3 ± 0.3 1.6 ± 0.2 10-2 12.5 ± 1.0 2.7 ± 0.3 9.8 ± 1.1 2.6 ± 0.2 7.6 ± 0.9 2.5 ± 0.3 4.2 ± 0.8 2.4 ± 0.3 Концентрация ЭБ, мг/л Табл. 1. Влияние эпибрассинолида на содержание свободной (А) и связанной (В) абсцизовой кислоты [мкг г-1] (сырой массы) в апикальных меристемах клубней картофеля при хранении (сутки). Первоначальное содержание: свободной АБК – 8.4, связанной АБК – 1.8 [мкг г-1 ] (сырой массы). 10 В тканях точек роста контрольных клубней максимум свободной АБК отмечен во время глубокого покоя (30 и 60 суток после уборки). После окончания покоя (120 и 150 дней после уборки) содержание свободной АБК в тканях точек роста уменьшалось более чем в 3 и 5 раз соответственно. Изменения в содержании связанной АБК менее выражены; ее количество снижалось в точках роста контрольных клубней примерно в 2 раза при активном прорастании. ЭБ вызывает увеличение в содержании свободной АБК при концентрациях 10-3 и, особенно, 10-2 мг/л. Этот эффект сохраняется во время глубокого покоя, после его окончания и при прорастании (табл.1). Под действием ЭБ несколько увеличивалось содержание связанной АБК, что наиболее выражено при прорастании (120 и 150 дней хранения). Следовательно, обработка ЭБ целых клубней картофеля сразу после уборки приводит к усилению образования АБК в точках роста клубней и к изменению соотношения свободная АБК/связанная АБК. Изменение этого соотношения играет важную роль в регуляции покоя клубней картофеля и переходе к активному росту, поскольку повышение содержания свободной АБК приводит к ингибированию ростовых процессов. Таким образом, обработка эпибрассинолидом в рост-ингибирующих концентрациях целых клубней картофеля приводит к усилению выделения этилена, повышению содержания абсцизовой кислоты, изменению соотношения свободная АБК/связанная АБК и удлинению периода покоя клубней. 1.2. Действие амбиола на ростовые процессы клубней картофеля Амбиол принадлежит к одному из 14 классов химических соединений, действующих как антиоксиданты и является препаратом комплексного действия с рост-регулирующими и адаптогенными свойствами [Смирнов и др., 1984; Rajasekaran, Blake, 1999]. Однако до начала наших исследований не было данных о действии Покой Прорастание 1,2 Испытания амбиола на клубнях картофеля. 1 Вес апексов, г амбиола на растения картофеля. с. Невский показали следующее (рис. 4). При обработке 0,8 клубней в состоянии покоя препаратом в концентрациях 0,6 5, 20, 40 и 60 мг/л не было установлено, заметного 0,4 влияния на рост апексов. После окончания глубокого 0,2 покоя чувствительность клубней к амбиолу возрастает. 0 0 5 20 40 60 Концентрация амбиола, мг/л Рис. 4. Влияние амбиола на рост апексов клубней картофеля сорта Невский Так, в концентрации 5 мг/л он подавляет прорастание, а при 20 и 60 мг/л – стимулирует. Из приведенных данных следует, что влияние амбиола на клубни картофеля зависит от их физиологического состояния и становится 11 более выраженным при переходе от покоя к активному росту. В качестве модели для изучения механизма действия амбиола особый интерес представляют трансгенные растения картофеля, несущие ген антимикробных пептидов дефензинов. Установлено, антибактериальным что действием, эти что соединения имеет обладают большое фунгицидным значение для и повышения фитоиммунитета и продуктивности растений картофеля. Обработка клубней исходных и трансгенных 0,2 растений картофеля сорта Дезире амбиолом показала, 0,18 Исходные Вес глазков, г 0,16 что препарат в концентрации 5 мг/л ингибирует рост Трансгенные 0,14 апексов. При концентрациях 20 и 60 мг/л амбиол 0,12 0,1 стимулировал рост апексов только на клубнях 0,08 трансгенных растений, а у исходных - подавлял (рис. 0,06 0,04 5). Обнаруженные различия 0,02 клубней 0 0 5 20 60 Концентрация амбиола, мг/л Рис. 5. Влияние амбиола на рост апикальных меристем клубней исходного и трансгенного картофеля сорта Дезире исходных контроле и под коррелируют с и ростовых реакций трансгенных действием данными о растений амбиола связи в хорошо стимуляции прорастания с усилением активности Н+-зависимой АТФ-азы плазмалеммы активности фермента клубней, при и снижении подавлении роста [Ладыженская и др., 2001]. 1.3. Изучения влияния амбиола на гормональный баланс и продуктивность растений картофеля Для изучения действия амбиола были проведены эксперименты в вегетационном домике и полевых условиях. Опыты показали, что обработка растений амбиолом в фазу бутонизации изменяет гормональный баланс, как листьев, так и клубней, что выражается в повышении уровня ауксинов (ИУК) и цитокининов (зеатин+зеатин-рибозид (З+ЗР)), снижении содержания АБК и изменении соотношения между этими фитогормонами (табл.2). Соотношение фитогормонов ИУК/АБК З+ЗР/АБК Вариант ИУК З+ЗР АБК Контроль 25 ± 2 62.8 ± 4.4 2.50 ± 0.20 10 25 125 ± 11 198.6 ± 18.1 1.40 ± 0.09 89 142 Амбиол Табл. 2. Влияние амбиола на содержание фитогормонов в листьях картофеля, мкг/г сухой массы Таким образом, обработка амбиолом растений картофеля изменяет баланс фитогормонов в листьях. Известно, что повышение уровня ИУК и цитокининов активизирует 12 фотосинтетические процессы. Обработка амбиолом усиливала интенсивность фотосинтеза у молодых растений сосны и способствовала их росту, в том числе в условиях засухи [Rajasekaran, Blake, 1999]. Под влиянием амбиола на фоне изменения гормонального статуса листьев картофеля значительно возрастала интенсивность нециклического фотофосфорилирования и фотосинтеза [Кириллова и др., 2003]. Возможно, стимулирующее влияние амбиола на фотосинтетические процессы связано с его антиоксидантными свойствами. В листьях растений, обработанных амбиолом, повысилось соотношение З+ЗР/АБК. Это важный показатель, так как цитокинины и АБК регулируют величину открытия устьичной щели, а от работы устьиц во многом зависит водный обмен, интенсивность фотосинтеза и скорость роста растений. У растений картофеля, обработанных амбиолом, увеличивалась ширина устьичной щели и водоудерживающая способность листьев [Пузина и др., 2001]. Наши опыты подтвердили, что под влиянием амбиола соотношение З+ЗР/АБК возрастает почти в 6 раз (табл.2). Изменения гормонального баланса в листьях картофеля под действием амбиола могут отражаться на процессах дыхания, транспирации, фотосинтеза и, следовательно, на продуктивности растений. Обработка растений картофеля амбиолом имела пролонгированное действие, проявившееся в изменении гормонального баланса клубней (табл. 3). Амбиол повышал Вариант Контроль Амбиол ИУК 3.0 ± 0.2 12.5 ± 1.1 З+ЗР 1.4 ± 0.1 3.6 ± 0.3 содержание ауксинов и цитокининов и АБК 44.7 ± 4.3 17.8 ± 1.1 снижал уровень АБК в клубнях, но в меньшей степени, чем в листьях. Это, по- Табл. 3. Влияние амбиола на содержание видимому, связано с разной фитогормонов в клубнях картофеля (мкг/ г чувствительностью тканей к амбиолу и сухой массы, АБК - нг/г) эффектом последействия. Полученные данные согласуются с предположением о действии амбиола как препарата с цитокининовой активностью и фактора, ингибирующего окисление ауксинов, что способствует стабилизации в тканях растений этих гормонов и скорости регулируемых ими процессов [Дмитриев и др., 1986; Воронина и др., 2001]. Вегетационный опыт Вариант Контроль Амбиол Масса клубней Количество клубней в кусте, г в кусте, шт 253 ± 17 312 ± 21 5 ± 0.5 4 ± 0.3 Полевой опыт Средняя масса клубня, г Масса клубней в кусте, г Урожайность, ц/га 50.6 ± 4.0 78.0 ± 5.7 393 ±11 425 ±15 161 ± 5 174 ± 6 Табл. 4. Влияние амбиола на продуктивность картофеля Обработка амбиолом повышала продуктивность растений, причем на фоне снижения числа клубней в кусте увеличивалась их масса. Полевые испытания подтвердили результаты вегетационных опытов (табл. 4). Таким образом, повышение продуктивности картофеля под 13 действием амбиола связано с увеличением содержания количества цитокининов, ауксинов и усилением процессов фотосинтеза. Полевые испытания, проведенные в течение 3-х сезонов, подтвердили положительное влияние амбиола на продуктивность картофеля. Действие амбиола на урожайность было более эффективным в годы с повышенным температурным режимом и недостатком влаги. Последнее подтверждает, что амбиол усиливает адаптацию растений к неблагоприятным условиям окружающей среды, выступая в роли антистрессового фактора. 2. Изучения влияния амбиола на морфогенез исходных и трансгенных растений картофеля Универсальность путей морфогенеза в опытах in vivo и in vitro позволило нам выбрать в качестве модели растения-регенеранты, выращенные с добавлением в питательную среду амбиола в концентрациях, установленных ранее. Изучение действия амбиола на развитие в онтогенезе морфогенетических признаков у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля с. Дезире показало следующее. На 7 сутки выращивания в контроле у регенерантов трансгенных растений развивалась более мощная корневая система (рис. 6а). Присутствие амбиола в среде для выращивания изменяло интенсивность начальных этапов корнеобразования у регенерантов растений, однако в отдельных вариантах этот эффект проявлялся по-разному. Амбиол в концентрации 5 мг/л ингибировал рост корней регенерантов исходных и трансгенных форм, 20 мг/л − не влиял на их рост. При концентрации амбиола 60 мг/л в 2 раза увеличивалась длина корней у исходных и трансгенных растений (рис. 6а). На 21 сутки культивирования рост корней у исходных и трансгенных форм под действием амбиола происходил уже с другой интенсивностью. Так, в контроле сырая масса корней регенерантов исходных растений была в 1,3 раза больше, чем трансгенных (рис.6б). Амбиол вызывал уменьшение массы корней у исходных и трансгенных растений, особенно при концентрации 5 мг/л (в 3-4 раза). Трансгенные растения на ранних этапах развития лучше и быстрее формировали корневую систему, но в дальнейшем отставали в росте корней от исходных форм. Действие амбиола на корневую систему на начальных этапах развития регенерантов было различным, но впоследствии рост корней подавлялся во всех вариантах опыта. Таким образом, на 21 сутки культивирования усиливался рост-ингибирующий эффект амбиола на процесс корнеобразования у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля. На 21 сутки культивирования регенеранты исходных растений в контроле были выше трансгенных (рис. 6в). Амбиол в концентрации 5 и 60 мг/л не влиял на высоту побегов, при 14 20 мг/л снижал её, а при 40 мг/л ингибировал рост исходных растений и стимулировал его у трансгенных. 35 1 а) б) 0 ,9 Сырая масса корней, г Длина корней, см 30 25 20 15 10 5 0 ,8 0 ,7 0 ,6 0 ,5 0 ,4 0 ,3 0 ,2 0 ,1 0 0 0 5 20 40 0 60 5 20 40 60 К о н ц е н т р а ц и я а м б и о л а , м г/ л К о н ц е н т р а ц и я а м б и о л а , м г/ л 14 в) г) 12 Число листьев, шт Высота побега, см 10 8 6 4 2 0 0 5 20 40 60 К о н ц е н т р а ц и я а м б и о л а , м г/ л Сырая масса листьев, г 0 ,1 2 8 6 4 2 0 0 5 20 40 60 К онцентрация ам биола, м г/л И с хо д н ы е Т р а н с ге н н ы е д) 0 ,1 10 Р и с . 6 . В л и я н и е а м б и о л а н а р а з в и ти е м о р ф о ге н е ти ч е с к и х п р и з н а к о в у р е ге н е р а н то в и с х о д н ы х и тр а н с ге н н ы х р а с те н и й ка р то ф е л я с .Д е з и р е 0 ,0 8 0 ,0 6 а ) д л и н а ко р н е й б) сы рая м асса корней в ) в ы с о та п о б е го в г) ч и с л о л и с ть е в д ) с ы р а я м а с с а л и с ть е в 0 ,0 4 0 ,0 2 0 0 5 20 40 60 К онцентрация ам биола, м г/л По числу и массе листьев регенеранты в контроле не различались. Амбиол в концентрации 5 мг/л стимулировал образование листьев у исходных растений, а при более высоких концентрациях, как правило, не влиял на образование нормальных листьев у исходных и трансгенных растений (рис. 6, г, д). В контроле не было ни укороченных 15 безлиственных побегов, ни побегов с рудиментарными мелкими листочками. Амбиол во всех испытанных концентрациях приводил к появлению тех или иных особенностей развития растений (табл. 5). При концентрации амбиола 5 мг/л, наряду со стимуляцией листообразования у регенерантов исходных растений, наблюдалось наибольшее количество побегов безлиственных или с рудиментарными листьями. При концентрациях амбиола 20-60 мг/л также встречались регенеранты с рудиментарными листьями (исходные растения) и безлиственные (трансгенные формы) (табл. 5). Тип регенеранта Морфогенетические показатели побегов Исходные Ветвящиеся (с рудиментарными листьями) Трансгенные Исходные Трансгенные Рудиментарные (без листьев, но с корнями) Концентрация амбиола, мг/л 0 5 20 40 60 % от общего числа регенерантов 0 20 10 20 0 0 30 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 20 20 10 Табл. 5. Особенности развития побегов регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля на 21 сутки культивирования Надо отметить, что появление измененных по морфологии форм растений, несомненно, представляет большой интерес, так как наряду с нежелательными изменениями могут появляться растения с целым рядом хозяйственно-ценных признаков [Петюх, 1990]. Очевидно, что процессы роста и органогенеза растений необходимо рассматривать во взаимосвязи между гормональным комплексом и функциями генетического аппарата. Было отмечено, что экспрессия бактериального гена в трансгенных растениях приводит к изменениям морфологии и гормонального баланса растений [Голденкова и др., 2002]. Все это позволяет предположить, что экспрессия гена дефензина может оказать влияние на баланс фитогормонов трансформированных растений картофеля. Известно, что для образования корней требуются более высокие концентрации ауксинов, чем для их роста [Skoog, 1971; Либберт, 1976]. Изменение содержания ауксинов может быть причиной отличий в формировании корневой системы у регенерантов исходных и трансгенных растений на разных стадиях развития (7 и 21 сутки культивирования). Амбиол влиял на рост корней регенерантов исходных и трансгенных растений, подавляя или стимулируя корнеобразование в зависимости от концентрации и стадии развития. Действие амбиола на корнеобразование может быть связано с его способностью ингибировать окисление ауксинов и стабилизировать их количество в тканях растений [Воронина и др., 2001]. Амбиол по-разному действует на процессы побего-и листобразования регенерантов исходных и трансгенных растений. Важно подчеркнуть, что амбиол в концентрации 5 мг/л 16 может либо ингибировать рост апексов клубней (рис. 4, 5) и корней растений-регенерантов (рис. 6 а, б), либо стимулировать листообразование у регенерантов исходных растений (рис.6 г, д). Процесс листообразования в наибольшей степени зависит от уровня цитокининов, и слабое развитие листьев или их полное отсутствие в вариантах с амбиолом, вероятно, связано с низким уровнем цитокининов в местах листовых зачатков. Возможно, наличие гена дефензина в трансгенных растениях изменяет также чувствительность клеток образующихся корней и зачатков листьев к цитокининам и ауксинам. Наши исследования показали, что амбиол повышает содержание цитокининов в тканях растений картофеля (табл. 2, 3). Повидимому, добавление амбиола в среду для выращивания изменяет гормональный баланс растущих регенерантов или путем перераспределения гормонов между отдельными органами растений, или за счет изменения их содержания. Сдвиг гормонального баланса может изменять обеспечивающих морфологическую органогенез, что компетентность приводит к инициальных изменению меристем, направленности морфогенетического развития растений. Возможно, с этим связано и появление тех или иных особенностей развития регенерантов при определенных концентрациях амбиола. Таким образом, в опытах на регенерантах исходных и трансгенных растений картофеля подтверждены рост-регулирующие (стимулирующие и ингибирующие) свойства препарата амбиол. Установлены различия в развитии отдельных морфогенетических признаков между регенерантами исходных и трансгенных растений картофеля, как в контроле, так и под действием амбиола. Корнеобразование является наиболее чувствительным параметром при органогенезе исходных и трансгенных растений картофеля под действием амбиола. Можно полагать, что обнаруженные нами особенности роста и развития регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля связаны с изменением гормонального баланса, вызванным экспрессией гена дефензина и с влиянием амбиола . 3. Ультраструктурные аспекты действия эпибрассинолида и амбиола на ткани апикальных меристем клубней картофеля Известно, что точки роста (апексы) растений, несмотря на свои малые размеры, гетерогенны в цитологическом и физиологическом отношении. Они состоят из нескольких зон (рис. 7) со специфической морфогенетической функцией. Для изучения структурнофункциональных изменений в апикальных меристемах клубней картофеля использовали электронную микроскопию с привлечением методов ультраструктурной морфометрии. Рис. 7. Схема строения апекса клубня картофеля при прорастании: 1 - туника, 2 – центральная меристема, 3 - стержневая меристема, 4 – периферическая меристема, зачаток. 5 – листовой 17 3.1. Ультраморфометрическое изучение влияния эпибрассинолида на рост клеток апикальных меристем Начальные этапы прорастания клубней картофеля связаны с процессом растяжения клеток апикальной меристемы. При этом происходит вследствие обводнения цитоплазмы. В связи с увеличение размеров клеток этим, рассматривали действие эпибрассинолида на объемы клеток и их вакуолярной системы при установленных ранее на клубнях меристемного картофеля с. Бронницкий рост-ингибирующих (10-4–10-2 мг/л) концентрациях. Концен трация ЭБ (мг/л) 0 0.001 0.01 0 0.001 0.01 0 0.001 0.01 0 0.001 0.01 V3 клеток Число вакуолей на срезе V3 вакуолей Туника 304 ± 13 5.8 ± 0.3 20 ± 0.7 228 ± 12 7.8 ± 0.2 16 ± 0.6 250 ± 12 8.0 ± 0.2 17 ± 0.6 Центральная меристема 664 ± 28 6.2 ± 0.4 87 ±7 402 ±18 8.6 ± 0.5 52±4 420 ± 18 9.0 ± 0.5 57 ± 5 Стержневая меристема 930 ± 29 2.9 ± 0.2 350 ± 18 400 ± 18 6.0 ± 0.3 86 ±10 410 ± 18 6.5 ± 0.2 96 ± 9 Периферическая меристема 512 ± 22 6.7 ± 0.6 30 ± 4.5 480 ±16 7.2 ± 0.4 26 ± 3.5 490 ± 16 7.7 ± 0.4 24 ± 3.5 V3 одной вакуоли 3.4 ± 0.2 2.0 ± 0.2 2.1 ± 0.2 15.0 ± 0.9 11.5 ±1.5 10.4 ± 0.8 129 ± 9 14.0 ± 0.5 15.0 ± 1.5 4.6 ± 0.4 3.6 ± 0.3 3.1 ± 0.3 Электронно-микроскопические наблюдения и ультраморфометрические измерения что при этих концентрациях ЭБ уменьшались общие объемы клеток и их вакуолярной системы во всех зонах апексов и особенно значительно в стержневой меристемы (табл. зоне 6). Уменьшение общего объема вакуолей сопровождалось увеличением общего числа вакуолей в клетках (табл. 6), т.е. происходило «дробление» вакуолей. Анализируя приведенные данные, можно Табл. 6. Объемы (V3, условные морфометрические единицы) клеток и вакуолей в различных зонах апексов клубней картофеля под действием эпибрассинолида показали, заключить, что одно из проявлений действия ЭБ на ткани точек роста клубней картофеля - его влияние на процесс растяжения клеток. Однако действие ЭБ неоднозначно по отношению к функционально различным зонам апексов. Наиболее чувствительна к действию ЭБ зона стержневой меристемы. В этой зоне значительно подавлялся процесс растяжения клеток под действием ЭБ в концентрациях, замедляющих ростовые процессы в апикальных меристемах клубней картофеля. В связи с этим, можно полагать, что клетки зоны стержневой меристемы являются клеткамимишенями, воспринимающими сигнал данного регулятора роста. Это очень важно, так как зона стержневой меристемы играет ведущую роль в процессе вегетативного роста апексов клубней картофеля. Очевидно, что влияние брассиностероидов на процесс растяжения растительных клеток – лишь один из аспектов их полифункционального действия на растение. В наших 18 исследованиях установлено, что ЭБ увеличивает содержание абсцизовой кислоты и этилена в тканях клубней картофеля, пролонгируя период глубокого покоя (рис. 3, табл. 1). Один из механизмов рост-регулирующего действия ЭБ на ростовые процессы в клубнях картофеля состоит в его влиянии на процесс растяжения клеток апексов, особенно в зоне стержневой меристемы, вследствие чего задерживается прорастание клубней. 3.2. Ультраструктурное и морфометрическое изучение влияния амбиола на пластидный аппарат клеток апикальных меристем клубней исходных и трансгенных растений картофеля Ранее было установлено, что амбиол обладает свойствами регулятора роста, стимулируя или подавляя прорастание клубней исходных и трансгенных растений в зависимости от концентрации (рис. 5). Представляло интерес оценить влияние амбиола на пластидный аппарат клеток апексов клубней исходных и трансгенных растений картофеля. Известно, что структура пластид является показателем функционального состояния клеток. Была исследована зона стержневой меристемы апексов, клетки которой наиболее чувствительны к регуляторам роста. Согласно наблюдениям, пластидный аппарат клеток стержневой меристемы апексов клубней исходных растений картофеля с. Дезире (в контроле) представлен 1-2 лейкопластами на срез клетки (табл. 7). Вариант опыта Контроль (Н2О) Амбиол, 5 мг/л Амбиол, 60 мг/л исходные трансгенные исходные трансгенные исходные трансгенные Число пластид 1.56 ± 0.10 1.77 ± 0.21 1.43 ± 0.16 1.93 ± 0.18 1.14 ± 0.07 1.55 ± 0.10 Общая площадь Площадь одной пластид, мкм2 пластиды, мкм2 5.33 ± 0.61 3.42 ± 0.49 4.79 ± 0.77 2.71 ± 0.32 2.81 ± 0.47 1.97 ± 0.38 3.01 ± 0.33 1.56 ± 0.13 2.23 ± 0.38 1.96 ± 0.28 6.36 ± 0.69 4.39 ± 0.51 Табл. 7. Морфометрическая характеристика пластид в клетках апексов клубней исходных и трансгенных растений картофеля под влиянием амбиола Пластиды клеток имели округлую, вытянутую или слегка неправильную форму и достаточно разнообразную морфологию. В подавляющем большинстве лейкопласты содержали различной величины крахмальные зерна, иногда – округлые белковые включения, а в ряде случаев пластоглобулы с различной степенью осмиофильности (табл. 8). В неоднородной по электронной плотности (иногда достаточно конденсированной) строме (матриксе) наблюдались отдельные элементы внутренней мембранной системы в виде одиночных мембранных структур. Хорошо просматривался достаточно развитый периферический пластидный ретикулум, представленный светлыми пузырьками или 19 отдельными электронно-прозрачными тяжами по периферии лейкопласта. Элементы пластидного ретикулума представляют собой инвагинации внутренней мембраны пластидной оболочки. Число, величина и форма таких инвагинаций могут варьировать. Характеристика пластид Крахмал Белковые включения Одиночные МС ТМК Периферический ретикулум Пластоглобулы Делящиеся Почкующиеся Исходные Трансгенные Концентрация амбиола, мг/л 0 5 60 0 5 60 80 80 60 98 99 92 3 10 4 25 13 16 28 3 21 30 5 40 44 24 40 32 3 40 32 7 40 68 12 62 35 4 3 40 3 3 33 3 2 10 11 10 10 8 10 40 14 10 Табл. 8. Ультраструктурная характеристика пластид в клетках апексов клубней исходных и трансгенных растений картофеля под действием амбиола (в % от числа просмотренных пластид) Предполагается, развития что пластидного определяет степень ретикулума интенсивность обмена между пластидой и цитоплазмой, а также интенсивность синтетических процессов в Пластидный оболочке пластиды. ретикулум функциональном в отношении соответствует канальцам агранулярного эндоплазматического ретикулума цитоплазмы, сходен с ними по морфологии и является в лейкопластах местом модификации синтеза и изопреноидных [Муравник, Иванова, 2003] и фенольных [Загоскина и др., 2000] соединений. В клетках апексов клубней исходных и трансгенных растений картофеля встречались одиночные пластиды (табл. 8), внутренняя мембранная система которых представлена так называемым трубчатым комплексом, состоящим из густой сети трубочек одного размера, соединенных друг с другом и образующих единую систему – трубчатый мембранный комплекс (ТМК). Эта разновидность внутренней мембранной системы обеспечивает лейкопластам дополнительную способность к биосинтезу изопреноидов [Васильев, 1977]. В отдельных клетках наблюдали пластиды с ТМК на разных этапах его формирования. Встречались единичные достаточно крупные, делящиеся перетяжкой и почкующиеся пластиды. Изучение пластидного аппарата клеток апексов клубней трансгенных растений картофеля в контроле не выявило различий в числе пластид на срез клетки, в величине средней площади одной пластиды и в общей площади пластидного аппарата между клетками апикальных меристем клубней трансгенных и исходных растений картофеля (табл.7). Морфология пластид была также разнообразна и сходна с картиной, наблюдаемой в клетках исходных растений по содержанию в строме внутренних мембранных структур, в том числе и ТМК, который в клетках контрольных растений встречался довольно редко. Однако наблюдались и некоторые отличия от клеток исходных растений по содержанию отдельных внутрипластидных структур (табл. 8). Кроме того, в клетках апексов трансгенных растений 20 чаще встречались пластиды с признаками деления и почкования (табл.8), что указывает на более активные процессы пролиферации пластид. Таким образом, несмотря на общее сходство в размерах и ультраструктурной морфологии пластидного аппарата клеток апексов клубней исходных и трансгенных растений в контроле, некоторые различия по количеству отдельных внутрипластидных структурных элементов, по-видимому, могут свидетельствовать о большей функциональной активности пластид клеток трансгенных растений при росте апексов. Этот факт хорошо коррелирует с нашими наблюдениями за ростовыми процессами после выхода клубней из покоя, согласно которым клубни трансгенных растений лучше прорастали и их апексы имели больший вес по сравнению с апексами клубней исходных растений. Сравнительная оценка морфометрических характеристик пластидного аппарата клеток исходных и трансгенных растений показала, что амбиол в концентрации 5 мг/л уменьшал общую площадь пластид в клетках исходных и трансгенных форм (табл. 7). При этом наблюдались лишь некоторые различия в динамике отложения запасных веществ в пластидах исходных и трансгенных растений, но не менялись процессы пролиферации пластид в клетках обеих форм растений (табл. 8). Однако следует особо отметить, что амбиол (5 мг/л) стимулировал формирование ТМК в матриксе пластид как у исходных, так и у трансгенных форм растений. При концентрации амбиола (60 мг/л) наблюдалась корреляция между интенсивностью ростовых процессов в апикальных меристемах исходных и трансгенных растений и изменением числа и размеров пластид в их клетках (табл. 7). Усиление роста апексов клубней трансгенных растений сопровождалось увеличением площади пластид (укрупнением пластид), следствием чего, могло быть усиление синтетических процессов в оболочке пластид и активизация транспорта метаболитов между пластидами и цитозолем. В противоположность этому, подавление роста апексов исходных растений при этой концентрации амбиола коррелировало с уменьшением числа и размеров пластид в их клетках. Однако на фоне этих различий в клетках обеих форм растений возрастало число пластид с развитой внутренней мембранной системой - одиночными мембранными структурами, периферическим ретикулумом и, что особенно интересно, ТМК (у исходных растений – в 8 раз, у трансгенных – в 4 раза) (табл. 8, рис. 8 а, б). Изменения ультраструктуры клеточных органелл достаточно полно отражают их функциональное состояние, а точные количественные параметры этих органелл в дополнении к их морфологическим особенностям дают представление о функциональной активности самих клеток. Наблюдаемая в наших опытах корреляция между интенсивностью ростовых процессов в апикальных меристемах клубней исходных и трансгенных растений 21 картофеля под действием амбиола и размерами пластидного аппарата их клеток подтверждают это. б) а) Рис. 8. Образование трубчатого мембранного комплекса в клетках апексов исходных (а) и трансгенных (б) растений картофеля под действием амбиола (60 мг/л) Следует отметить, что амбиол во всех испытанных концентрациях, несмотря на его неоднозначное влияние на размеры и пролиферацию пластид, вызывал заметную дифференцировку пластидного аппарата как в клетках исходных, так и трансгенных растений. Это выражалось в развитии внутренней мембранной системы пластид периферического ретикулума, одиночных мембранных структур, и, в особенности, трубчатого мембранного комплекса. Выявленный нами эффект амбиола, направленный на развитие мембранной системы пластид клеток апексов клубней картофеля, согласуется с данными о действии другого синтетического антиоксиданта - ионола, который проявил себя как индуктор дифференцировки пластидного аппарата клеток корней этиолированных проростков пшеницы, стимулируя в них синтез пигментов каротиноидной природы [Замятина и др., 2003]. Подобные эффекты являются, безусловно, новой стороной действия антиоксидантов на растения. Таким образом, амбиол индуцировал дифференцировку пластид в сторону усложнения их внутренней мембранной структуры, придающей пластидам дополнительную способность к синтезу изопреноидных и фенольных соединений, выполняющих важную роль в реакциях устойчивости. Можно предположить, что потенциальная способность пластид к биосинтезу защитных соединений в реакциях иммунитета может быть оптимизирована под действием амбиола. 22 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Регуляция роста и покоя определяется структурно-функциональными особенностями апикальных меристем растений картофеля на разных стадиях онтогенеза. Индукция покоя, его длительность и прерывание связаны с изменениями соотношения ингибиторы/стимуляторы роста и чувствительности клеток апексов к действию сигнальных молекул фитогормонов [Метлицкий, Кораблева, 1984; Тарчевский, 2002]. В настоящей работе основное внимание обращено на исследование гормонального баланса и ультраструктуры клеток апикальных меристем клубней картофеля под действием эпибрассинолида и амбиола. Такой подход позволил получить новые данные об участии в регуляции покоя не только абсцизовой кислоты, но и этилена, а также оценить изменения в ультраструктуре клеток различных зон апикальных меристем и выявить клетки, наиболее чувствительные к действию фитогормонов и их синтетических аналогов. Ранее было показано, что ингибирование роста во время глубокого покоя клубней картофеля связано с влиянием абсцизовой кислоты, а прерывание покоя сопровождается уменьшением в точках роста содержания абсцизовой кислоты и увеличением гибберелловой кислоты. Интенсивность образования этилена тканями незначительна во время глубокого покоя и несколько увеличивается при прорастании. Эти данные не позволяли связать способность клеток к синтезу этилена с регуляцией покоя. Однако результаты последующих экспериментов показывают, что это не так. С одной стороны, было установлено, что экзогенный этилен, введенный в ткани при обработке растений этиленпродуцентом 2хлорэтилфосфоновой кислотой (2-ХЭФК), стимулирует синтез абсцизовой кислоты, способствует индукции глубокого покоя и его пролонгированию [Suchova et al., 1993]. С другой стороны, результаты настоящей работы показывают, что аналогичный эффект может быть получен при стимуляции синтеза эндогенного этилена под действием эпибрассинолида. Способность эпибрассинолида усиливать образование этилена в тканях растений была показана рядом исследователей [Kaufmann et al., 1982; Mendt, Thomson, 1983]. В клубнях картофеля эпибрассинолид стимулирует образование этилена и абсцизовой кислоты, что коррелирует с длительностью глубокого покоя. Опыты с метаболическими ингибиторами (СоСl2 и аминооксиуксусная кислота) показали, что эпибрассинолид стимулирует активность ферментов синтеза и расщепления эндогенного предшественника этилена в метиониновом цикле – синтазы и оксидазы 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты [Кораблева и др., 1997]. Эффективность применения физиологически активных веществ для регуляции покоя и роста картофеля зависит от знания механизма их действия на отдельные органы растений и, в особенности, на меристематические ткани точек роста. При этом важно определить внутриклеточные изменения, происходящие в функционально различных зонах апикальных 23 меристем [Платонова, 1998]. Ультраморфометрический анализ клеток различных зон апексов клубней показывает, что стимуляция или подавление растяжения является одним из эффектов эпибрассинолида на клеточном уровне. Наиболее чувствительна к эпибрассинолиду стержневая меристема, играющая ведущую роль на начальных стадиях роста. Клетки стержневой меристемы являются клетками-мишенями, воспринимающими сигналы этилена и абсцизовой кислоты, содержание которых изменяется под действием эпибрассинолида. Ранее было установлено, что клубни картофеля во время глубокого покоя обладают более высокой устойчивостью к болезням, чем при прорастании. В этой связи использование эпибрассинолида для пролонгирования глубокого покоя эффективно для сокращения потерь от преждевременного прорастания и повышения иммунного статуса клубней. Механизм действия амбиола на рост и развитие картофеля связан с изменением гормонального баланса в клубнях и листьях вегетирующих растений. Амбиол в несколько раз увеличивает соотношение индолилуксусная кислота/абсцизовая кислота и зеатин+зеатин-рибозид/абсцизовая кислота в листьях как за счет увеличения содержания ауксинов и цитокининов, так и снижения абсцизовой кислоты. Под влиянием амбиола ускоряются темпы роста и повышается продуктивность растений за счет увеличения массы клубней. Повышение продуктивности растений, обработанных амбиолом, может быть следствием увеличения количества цитокининов и ауксинов, а также усиления процесса фотофосфорилирования и интенсивности фотосинтеза [Чернядьев, 2000; Кириллова и др., 2003]. В опытах с регенерантами исходных и трансформированных по гену дефензина (трансгенных) растений картофеля было установлено, что амбиол изменяет морфогенетические признаки, регулирует формирование стебля, образование листьев и корней. Обнаружены различия в ответных реакциях на амбиол пластидного аппарата клеток исходных и трансгенных растений. Амбиол стимулирует дифференцировку внутренней мембранной системы пластид: периферического ретикулума, одиночных мембранных структур, и, в особенности, трубчатого мембранного комплекса. Подобное усложнение внутренней организации пластид повышает биосинтетические возможности пластидного аппарата клеток апикальных меристем, связанные с синтезом изопреноидных и фенольных соединений, которые могут быть реализованы при защите растений в ответ на различные стрессовые воздействия (болезни, обезвоживание, охлаждение и др.). Полученные сведения позволяют составить представление о механизме действия эпибрассинолида и амбиола, а также выявить биологические параметры для включения этих физиологически активных веществ в современные технологии повышения продуктивности картофеля и его устойчивости к стрессовым воздействиям. 24 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что эпибрассинолид в зависимости от концентрации оказывает ингибирующее или стимулирующее действие на рост апексов клубней картофеля. 2. Обработка клубней эпибрассинолидом в рост-ингибирующих концентрациях приводит к усилению синтеза этилена и абсцизовой кислоты, подавлению роста апексов и продлению периода глубокого покоя. 3. Наибольшая чувствительность к действию стержневой зоны апикальных меристем эпибрассинолида обнаружена у клеток клубней, способность которых к растяжению определяет прерывание или пролонгирование периода глубокого покоя. 4. Обработка клубней картофеля амбиолом в концентрациях 20-60 мг/л стимулирует рост апексов. Наблюдается различная чувствительность апексов к действию амбиола в покое и при прорастании. 5. Показано, что обработка амбиолом вегетирующих растений картофеля в фазу бутонизации приводит к повышению в тканях листьев и клубней содержания β-индолилуксусной кислоты и цитокининов, уменьшению количества абсцизовой кислоты и повышению продуктивности растений. 6. Амбиол ингибирует корнеобразование у регенерантов исходных и трансформированных по гену дефензина растений картофеля, стимулирует образование листьев у регенерантов исходных растений, по-разному, в зависимости от концентрации, изменяет формирование стебля у исходных и трансгенных растений. Корнеобразование является наиболее чувствительным параметром при органогенезе исходных и трансгенных растений картофеля под действием амбиола. 7. Выявлены различия по площади пластид и содержанию отдельных внутрипластидных структур в ответных реакциях на действие амбиола пластидного аппарата клеток апикальных меристем клубней исходных и трансформированных по гену дефензина растений картофеля. Наблюдается корреляция между изменением общей площади пластид в клетках и стимуляцией или подавлением ростовых процессов в апикальных меристемах клубней исходных и трансгенных растений картофеля. 8. Показано, что амбиол стимулирует дифференцировку внутренней мембранной системы пластид, в том числе интенсивное формирование трубчатого мембранного комплекса в пластидах клеток апикальных меристем клубней исходных и трансгенных растений картофеля. 25 Список основных работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1. Korableva N.P., Platonova T.A., Dogonadze M.Z., Evsyunina A.S., Machackova I. Effect of brassinolide on the formation of ethylene, abscisic acid and growth of apical meristems by regulation of potato tubers dormancy // Biologia plantarum, 2001, v. 85, № 9, р. 132-137. 2. Ляпкова Н.С., Лоскутова Н.А., Майсурян А.Н., Мазин В.А., Кораблёва Н.П., Платонова Т.А., Ладыженская Э.П., Евсюнина А.С. Получение генетически модифицированных растений картофеля, несущих ген защитного пептида из амаранта // Прикладная биохимия и микробиология, 2001, т.37, № 3, с. 349-354. 3. Кораблёва Н.П., Платонова Т.А., Евсюнина А.С., Ладыженская Э.П., Бибик Н.Д., Воронина С.С., Кузнецов Ю.В., Смирнов Л.Д. Влияние амбиола на ростовые процессы, устойчивость к стресс-факторам и продуктивность картофеля // Материалы международной научно-практической конференции «Продукционный процесс (теория, методы, его роль в формировании урожайности различных культур)», Орловский государственный Аграрный университет, Орёл, 2001, с.136-144. 4. Евсюнина А.С., Ляпкова Н.С., Платонова Т.А., Кораблёва Н.П. Влияние амбиола на рост стеблей у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля // Прикладная биохимия и микробиология, 2002, т. 38, № 2, с. 203-207. 5. Т.А. Платонова, А.С. Евсюнина, Н.С. Ляпкова, Н.П. Кораблева. Морфогенетические изменения у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля под влиянием амбиола. // Прикладная биохимия и микробиология, 2002, т.38, № 6, с.689-703. 6. И.Г. Кириллова, А.С. Евсюнина, Т.И. Пузина, Н.П. Кораблева. Влияние амбиола и 2-хлорэтилфосфоновой кислоты на содержание фитогормонов в листьях и клубнях картофеля // Прикладная биохимия и микробиология, 2003, т. 39, №.2. С.237-241. 7. Кириллова И.Г., Кораблёва Н.П., Евсюнина А.С. Влияние антиоксиданта амбиола на повышение устойчивости растений картофеля к засухе // Материалы ХI съезда Русского ботанического общества «Ботанические исследования в Азиатской России» Новосибирск-Барнаул, 2003, с. 231-232. 8. И.Г. Кириллова, А.С. Евсюнина, Н.П. Кораблева. Влияние антиоксиданта амбиола на показатели фотосинтетической активности, рост и продуктивность растений картофеля // Материалы симпозиума «Рациональные технологии в современном сельскохозяйственном производстве», Сельский консультационный центр, Орел, 2003, с.28-31. 9. Т.А. Платонова, А.С. Евсюнина, С.В. Беликов, Н.П. Кораблева. Ультраморфометрическое изучение пластидного аппарата клеток апикальных меристем клубней исходных и трансгенных растений картофеля под влиянием амбиола // Прикладная биохимия и микробиология, 2005, т. 41, № 3, с. 330-339. 26 Тезисы 1. Korableva N.P., Ladyzhenskaya E.P., Platonova T.A., Evsyunina A.S., Lyapkova N.S., Majsuran A.N., Mazin V.V. The comparative study of initial and transformed potato plants carrying the gene of defensine from Amaranthus caudatus L. in relation to growth, morphogenesis and H+ translocation across plasma membrane. Abstracts of International Symposium «Signalling Systems of Plant Cells», Moscow, Russia, 2001. ONTI, Pushchino, р. 78-79. 2. Korableva N.P., Platonova T.A., Evsyunina A.S., Ladyzhenskaya E.P., Dogonadze M.Z. Ethylene is an inducer of both the synthesis of terpenoid compounds and the resistanse of potato plants to pathogens. Abstracts of Intrnational Symposium «Signalling Systems of Plant Cells», Moscow, Russia, 2001. ONTI, Pushchino, P. 79. 3. Кириллова И.Г., Евсюнина А.С., Кораблева Н.П. Сравнительное изучение действия препаратов амбиол и 2-ХЭФК на содержание фитогормонов в листьях растения картофеля. Тезисы докладов VI Международной конфереции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях». М., МСХА, 2001, С.98-99. 4. N. Korableva, A. Evsyunina, T. Puzina, E. Ladyzhenskaya, T. Platonova, L. Smirnov. Endogenous abscisic acid concentration, membrane bound H+-ATPase activity, growth, productivity in drougth stressed, CEPA and ambiol treated potato plants. Abstracts 17th International Conference on Plant Growth Substances, 2001, Brno, Czech Republic, р. 137. 5. Кораблева Н.П., Платонова Т.А., Евсюнина А.С., Пузина Т.И., Кириллова И.Г., Воронина С.С., Кузнецов Ю.В. Индуцирование устойчивости к неблагоприятным факторам и повышение продуктивности картофеля под действием амбиола. Материалы VI Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 2002, с. 291. 6. Кораблёва Н.П., Платонова Т.А., Евсюнина А.С., Кириллова И.Г., Пузина Т.И. Индукция устойчивости картофеля к неблагоприятным факторам под действием стрессовых фитогормонов - этилена и абсцизовой кислоты. Тезисы III Съезда Всероссийского биохимического общества, СанктПетербург, 2002, с.444. 7. Кириллова И.Г., Евсюнина А.С., Кораблева Н.П. Влияние амбиола на рост и гормональный баланс апикальных меристем клубней картофеля Solanum tuberosum L. Тезисы докладов V съезда Общества физиологов растений и Международной конференции «Физиология растений – основа фитобиотехнологии», Пенза, 2003, с. 401.
