Метод

Vitamin D there is a world beyond the bone
1
Vitamin D there is a world beyond the bone
3
Holick MF, JCI 2006; 116: 2062 - 72
Кожа
7дегидрохолестерол
t°
Витамин D3
Витамин D
Пищевые источники
Витамина D2 и D3
C помощью хиломикронов
И лимфатической системы
Липопротеин
Витамин D
Витамин D
Витамин D
Печень
Р, Ca2+ и др. факторы
Кальцитриоловая
кислота
Почка
Моча
Преостеокласт
Остеобласт
Кость
Кишечник
Паращитовидные
железы
Материнский
остеокласт
Выделение
Ca2+ и HPO42-
Кальций и
Фосфор
Кровь
Абсорбция
Ca2+ и HPO42-
Минерализация кости Метаболические Нейромышечные функции
функции
Vitamin D there is a world beyond the bone
4
Holick MF, JCI 2006; 116: 2062 -
Связывание лиганда
Гетеродимеризация
Ядро
Связывание ДНК
Трансактивация/трансрепрессия
Схема 1. 1,25 (ОН)2D3 регуляция генной транскрипции. 1,25 (ОН)2D3 Кислота
соединение активирует VDR для взаимодействия с ядерной RXR, факторами
базальной транскрипции, и кофакторными молекулами для активации р21 или
подавления PTH генной транскрипции с помощью РНК полимеразы II. B – это
базальный фактор транскрипции.
Vitamin
beyond
thethe
bone
VitaminDDthere
thereisisa aworld
world
beyond
bone
Dusso Kidney international 2003
Моча
5
Zittermann A. Prog Biophys Mol Biol 2006;92:39-48
Secundary Вторичный
hyperparatheroidism
sHPT!
гиперпаратиреодизм!
Соотношение уровней паратиреоидного
гормона и витамина D в сыворотке крови
Zittermann A. Prog Biophys Mol Biol 2006;92:39-48
Время года (месяц)
Woitge HW, et al., J Bone Miner Res 2000; 15: 2443–2450
Время года (месяц)
Vitamin D there is a world beyond the bone
7
RR (95%, CI)
Полученный витамин D, IU/d
Относительный риск не
позвоночной
фракции
в соответствии
с дозой
Relative
risk
of non vertebral
витамина
и концентрацией
fracture
according
to vitamin D
25(ОН)D
RR (95%, CI)
dose and 25(OH)D concentration
Достигнутая концентрация 25-Гидроксивитамина D в лечебной группе, нмоль/л
Bishoff-Ferrari et al.
Arch Intern Med 2009;
169(6):551-561
Vitamin D there is a world beyond the bone
8
Предотвращение падения с помощью Витамина D
Относительный риск (95% Cl)
Предотвращение падения с помощью высокой дозы витамина D
Относительный риск (95% CI)
Высокая доза Витамина D
Общий относительный
Риск (95% Cl)
0,81 (0,71 до 0,92)
Смешанный
Маленькая доза витамина D
Общий относительный
Риск (95% Cl)
1,10 (0,89 до 1,35)
Смешанная
Благоприятное влияние
дополняющее витамин D
Относительный риск (95% CI)
Доза витамина D2 или D3 (МЕ)
Предотвращение падения с использованием уровня 25-гидроксивитамина D3
Контроль
Благоприятного
воздействия
Рис.2 | Предотвращение падения с помощью высокой дозы (700-1000 МЕ в день) и
низкой дозы (200-600 МЕ в день) дополнительного витамина D. Боксы.
Концентрация 25-гидроксивитамин D3 в сыворотке крови
Bishoff-Ferrari HA et al.,
BMJ 2009; 3391 - 11
Айсберг Витамина D
Витамин D играет существенную роль в
кальциевом гомеостазе и в развитии и
поддержании скелета.
Рахит, остеомаляция, остеопороз
Мышечная слабость, мышечная боль, потеря
равновесия (шатание) – падение – переломы.
Эндокринная,
паракринная
и аутокринная
функция витамина
D
Endocrine, paracrine
and
autocrine Function
of Vitamin
D
Кальциевый гомеостаз
Мышечное состояние
Костное состояние
Регуляция кровяного давления
Сердечнососудистое состояние
Развитие нервной системы
Витамин D
Почка
Печень
Иммуномодуляция
•Предотвращение
аутоиммунных заболеваний
• Контроль инвазивных
антигенов
Моноциты,
макрофаги
Простата
Молочная железа
Толстая кишка
Легкое
Кератиноциты
Регуляция клеточного роста
и дифференцировки
Hollis, B. W. et al. CMAJ 2006; 174: 1287-1290
Уровень смертности от рака толстой кишки по экономическим областям
Штатов: Белые мужчины, 1970-94
Нормальное прямое солнечное излучение
Ежегодный
Модель оценивает среднюю дневную общую радиацию с использованием
входящего сигнала, полученного со спутника и/или поверхностного
наблюденя облачного покрытия, аэрозольной оптической глубины,
осаждаемого водного пара, отражательной способности, атмосферного
давление и озона с 40 км расстояния. Смотрите
http://www.nrel.gov./gis/il_csp.htm документацию для более подробной
информации
Уровень смертности от рака молочной железы по экономическим областям Штатов
(население США1970 возраст/фокусированное):
Белые женщины, 1970-94
Молочная железа
Предстательная железа
Уровень смертности от рака по экономическим областям Штатов (население 1970 US
связанное с возрастом)
Почка, почечная лоханка и мочеточник: Белые женщины, 1970-94
Почка, мочевая система
Уровень смертности от рака предстательной железы по экономическимобластям Штатов
(население США 1970 возраст/фокусированное) : Белые мужчины, 1970-94
Уровень смертности от рака по экономическим областям Штатов (население 1970 US
связанное с возрастом)
Желудок: Белые мужчины, 1970-94
Желудок
Снижение на 77 % всех рисков рака после
4 лет
Витамин D, кальций и рак
Безраковая фракция
1100 МЕ
ВитD3/d
Только Са
Плацебо
Время (в годах)
Рис. 2. Кривые жизнеспособности Каплан-Мэера (т.е. без рака) для 3 терапевтических групп случайно выбранных в когорте женщин, которые не были больны раком через 1год
(n=1085). Размер образца составляет 266 для группы «плацебо», 416 для группы «Только кальций (Са)» и 403 для группы «Кальций плюс витамин D» (Ca+D). Выживаемость по
окончанию исследования для Ca+D группы намного превысила таковую группы «Плацебо». (Copyright Robert P Heaney, 2006. Использовалось с разрешения)
Значения 25OHD: 72 нмоль/л = 29 мкг/л 96 нмоль/л = 38 мкг/л
Lappe et al. Am J Clin Nutr 2007;85: 1586-91
Айсберг Витамина D
Витамин D играет существенную роль в кальциевом гомеостазе
и в развитии и поддержании скелета.
Рахит, остеомаляция, остеопороз
Мышечная слабость, мышечная боль, потеря равновесия
(шатание) – падение – переломы.
Развитие рака и исход
Молочная железа, толстая кишка, яичники, ростата, лимфома
Иммунная система (Аутоиммунное заболевание)
Туберкулез, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, тиреоидит,
болезнь Крона, грипп.
Сахарный диабет I и II типа
Снижение резистентности в инсулиновой секреции, функция
бета клеток.
Сердечная и циркуляторная система, сердечные
метаболические расстройства
Инфаркт миокарда, атеросклероз, гипертония
Нервная система
Депрессия, шизофрения, аутизм . . .
Липополисахарид или
туберкулезный бугорок
Цитокиновая регуляция
Противомикробныйпол
ипептид
VDR- вит.Dрецептор
Повышенный
кателицидин
Повышен VDR
Повышена 1-ОНаза
Туберкулезный
очаг
Синтез
иммуноглбулина
Кателицидин=дефенЗин (антмикробный
полипептид)
Активированный T-лимфоцит
Активированный В-лимфоцит
Иммуномодуляция
Макрофаг/
моноцит
Врожденный иммунитет
Паращитовидные железы
Кровь
> 30 нг/мл
Молочная железа,
Толстый кишечник,
простата и т.д.
Увеличивает р21 и р27
Угнетает ангиогенез
Вызывает апоптоз
Почки
1-ОНаза
Повышенный
паратгормон
ME Holick, N Engl J Med 2007; 357: 266-81
Регуляция паратиреоидного
гормона
Увеличенный
инсулин
Поджелудочная
железа
Пониженный
ренин
Регуляция кровяного
давления
Контроль сахара в крови
График 1. Заболеваемость гриппом/простудой после 2 000 МЕ витамина D ежедневно в течении одного года
Зима
Весна
Лето
Осень
Заболеваемость по отчетности симптомов гриппа/простуды в соответствии с сезоном. Группа плацебо показала больше симптомов
зимой. Только один субъект имел симптомы гриппа/простуды во время приема повышенной дозы витамина D (2000 МЕ).
Плацебо
800 МЕ/д
2000 МЕ/д
На 78% снижен риск развития Сахарного
Диабета Тип I
Relatives Risiko
(ОР)
риск(RR)
Относительный
1.2
Продолжительность
исследования
1
1966 - 1997
0.8
n = 10 821
n = 81 I тип СБ
0.6
0.4
0.2
0
< 2000
<
2000МЕ
IU
2000 МЕ
2000
IU
Vitamin D
Tag
Витамин
D/ /Метка
Hyppönen et al. Lancet 2001; 358: 1500 - 3
Установленный коэффициент риска (с 95% CIs) для
смертности в соответствии с 25(OH)D уровнем
(пациенты с ГБ)
Категория 25(ОН)D
нг/мл
Значение Р
Общая смертность
Отношение
Смертность от сердечной патологии
Отношение
Смертность от инфекционных заболеваний
ERA-EDTA :
Смертность от сердечной патологии
(n=779)
Код 11, 14 - 16
Смертность от инфекционных
заболеваний (n = 348)
Код 31 - 38
Отношение
Установленный коэффициент риска (95% CI)
Submitted to Clinical Nephrology
Сердечнометаболические расстройства
Недостаток витамина D
PTH
Инсулиновая резистентность
+
Дисфункция панкреатических бета-клеток
Воспаление
Сахарный диабет и
Метаболический синдром
РААС
Гипертония и
гипертрофия
Атеросклроз
Патологические
сердечнососудистые
изменения
Потенциальный механизм токсичности недостатка витамина D для ССС
Возможный механизм повышенного СС риска от недостатка витамина D. PTH – паратгормон; РААС – ренинангиотензин-альдостероновая система.
Lee et al. JACC 2008; 52: 1949 - 56
25OHD мкг/л
Показательное распространение 25(OH)D [мг/л]
Германия (2006) n ~ 50 000 случаев
(20)30 – 70 мкг/л
Vitamin D there is a world beyond the bone
22
Наглядное 25(OH)D распространение
– ГБ пациентов1995 - 2006
3й квартиль
25(OH)D (нг/мл)
Мин относительный
уровень
Медиана
1й квартиль
Submitted to Clinical Nephrology
ВО ВСЕМ МИРЕ МЫ
ДЕЙСТВИТЕЛЬНО СТРАДАЕМ ОТ
БОЛЕЕ ИЛИ МЕНЕЕ
ВЫРАЖЕННОГО ДЕФИЦИТА
ВИТАМИНА D ИЛИ ЕГО
НЕДОСТАТОЧНОСТИ
Дефицит и недостаточность витамина D
 Дефицит и недостаточность витамина D являются общей и одной
из главных экономических проблем заболеваемости по всему
миру.
 Питательная потребность, рекомендуемая государством и др.
управляющими организациями (400 – 1000 МЕ/д) не
адаптированы к современным знаниям действительной
потребности в витамине D для достижения потребности > 30
мкг/л.
 Так как дефицит витамина D является наиболее
распространенным медицинским состоянием в мире, то
достаточное потребление витамина D настоятельно
рекомендуется и реальное количественное измерение
показателей существенно.
Факторы влияющие на выработку витамина D
и следовательно на значения 25(OH)D

Сниженная выработка витамина D кожей
 Широта, время года, загрязнение окружающей среды, возраст, религия, использование
солнцезащитного крема, косметики, профессия

Биодоступность
 Индекс массы тела
 мальбсорбция

Повышенный катаболизм
 Противосудорожные средства


глюкокортикостероиды
Пониженный синтез
 Функция печени

Нефротический синдром
 Потеря DBP (D-связывающего протеина)
 Потеря DВР-связанного 25(OH)D
Последний по счету, но
не по значимости
Метод
определенияса
м по себе!
20 мкг/л
Сывороточный 25OHD (нг/мл)
Сывороточный 25OHD (нг/мл)
Лаборатории n=6; Индивидуумы n = 10
Лаборатория
Номер ID субъекта
Среднее значение 25OHD значений (n = 10) на лабораторию:
Сильно различающиеся средние значения 17.1 мкг/л до 35.6 мкг/л
Дефицит либо недостаточность витамина D определяется методом
но не концентрацией.
Binkley et al. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 3152 - 57
Аномальное поведение экзо- и эндогенного
25-гидроксивитамина D при его определении компетитивными
связывающими методами
Метод
Метод
Схема 2. Эндогенный 25-OHD (образец С). Ключи к методу см. на схеме 1.
Схема 1. Восстановление экзогенного 25-OHD. Методы: (1) DiaSorin
радиоиммуннологическое исследование (n=53). (2) DiaSorin Liaison
автоматизированное иммунологическое исследование (n=16). (3) IDS OCTEIA
ферментное иммунологическое исследование (n=16). (4) IDS
радиоиммунологическое исследование (n=21). (5) Nichols Adbantage
автоматизированный протеин связывающий тест (n=21). (6) HPLC (n=6). (7) LC-MS
(n=4). DiaSorin, MN, USA: IDS, Tyne & Wear, UK: Nichols Diagnostics, San Juan
Capristano, CA.
Carter et al. of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 2007;103: 480–482
RIA = 0.6405 LCTMS + 3.768
n = 299; r = 0.9611
LIA = 0.7446 LCT MS + 0.542
n = 298; r = 0.8723
100
100
Тест B = 27 мкг/л
Тест A = мкг/л
80
60
60
LIA
RIA
80
40
40
20
20
0
0
0
20
40
60
80
100
0
20
Заданное значение(LCMS/MS) = 35 мкг/л
LCTMS
ADV = 0.8473 LCT MS - 0.466
n = 297; r = 0.882
40
60
80
100
LCTMS
Elecsys = 0.9584 LCT MS - 1.892
n = 291; r = 0.9256
120
100
Test D = 32 мкг/л
Тест C = 30 мкг/л
100
80
80
ADV
Elecsys
60
40
60
40
20
20
0
0
0
20
40
60
LCTMS
80
100
0
20
40
60
80
100
LCTMS
Roth et al. Ann Clin Biochem 2008;45: 153 - 9
120
Измерение 25(OH)D– не простая задача
 Доступны различные методики
 LC-MS/MS (эталонный метод)
 HPLC
 Экстракция и после иммунологическое исследование
 Прямое иммунологическое исследование
 Разные производители
 Затруднения в необратимом выделении 25OHD из
связывающего его протеина (DBP)
 Равномолярное определение 25(OH)D3 и 25(OH)D2
 Высоко вариабельные значения – точность
Основная задача– освобождение 25(OH)D от
связывающего его протеина
Высокий аффинитет 25(OH)D („сильное“ связывание) к его
связывающему протеину (DBP)
Verboven et al. Nat Struct Biol 2002;9: 131 -6
Основная задача– освобождение 25(OH)D
от связывающего его протеина
Лучшее решение – полное удаление DBP:
LC-MS/MS и HPLC используют химическое выделение анализируемого вещества из DBP, которое следует за
преципитацией белка перед отделением 25(OH)D с помощью хроматографии и окончательным подсчетом с
помощью масс-спектрометрии или УФ определения.
Данная предварительная очистка образца гарантирует оценку концентрации 25(OH)D
без каких-либо лишних составляющих образца.
Основная задача– освобождение 25(OH)D
от связывающего его протеина
Различие (HPLC – LC-MS/MS) (мкг/л)
50
40
30
20
10
+1.96 SD
Mean
4.1
-1.96 SD
-0.1
-4.4
0
-10
-20
-30
-40
-50
0
20
40
60
80
100
AVERAGE
of HPLC
and– LC-MS/MS
Среднее
значение
(HPLC
LC-MS/MS)(µg/L)
(мкг/л)
120
Vitamin D there is a world beyond the bone
33
Основная задача– освобождение 25(OH)D
от связывающего его протеина
Некоторые методы используют сравнительную химическую очистку образца, которая следует после
классического иммунологического исследования, таким образом другие методы также химически выделяют 25
(OH)D из связывающего протеина, но сохраняют все составляющие сыворотки в виде жидкой реакционной смеси
для конечного количественного определения, которое проводится посредством иммунологического
исследования
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
-40
+1.96 SD
7.4
Mean
-5.6
-1.96 SD
-18.6
-50
Различие (IDS-EIA– LC-MS/MS) (мкг/л)
50
Difference (IDS-EIA - LC-MS/MS) (µg/L)
Различие (IDS-RIA– LC-MS/MS) (мкг/л)
50
40
30
20
+1.96 SD
8.5
10
0
Mean
-10
-6.6
-20
-1.96 SD
-21.7
-30
-40
-50
0
20
40
60
80
100
AVERAGE
of IDS-RIA
and LC-MS/MS
(µg/L)
Среднее
значение
IDS-RIA
и LC-MS/MS)
(мкг/л)
120
0
20
40
60
80
100
AVERAGE
of IDSEIA
and LC-MS/MS
(µg/L)
Среднее
значение
IDS-EIA
и LC-MS/MS)
(мкг/л)
120
Основная задача– освобождение 25(OH)D от
связывающего его протеина
Некоторые методы используют сравнительную химическую очистку образца, за которой следует классическое иммунологическое
исследование, в то время как другие методы также химически выделяют 25 (OH)D из связывающего протеина, но сохраняют все
составляющие сыворотки в виде жидкой реакционной смеси до конечного количественного определения, которое проводится
посредством иммунологического исследования
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
-40
+1.96 SD
9.9
Mean
-5.6
-1.96 SD
-21.1
-50
Различие (Elecsys - LC-MS/MS) (мкг/л)
50
Difference (Elecsys - LC-MS/MS) (µg/L)
Различие (Liaison1 - LC-MS/MS) (мкг/л)
50
40
30
20
+1.96 SD
9.2
Mean
10
0
-2.8
-1.96 SD
-14.7
-10
-20
-30
-40
-50
0
20
40
60
80
100
120
AVERAGE
of Liaison1
and LC-MS/MS
(µg/L)
Среднее
значение
Liaison1
и LC-MS/MS)
(мкг/л)
0
20
40
60
80
100
AVERAGE
of
Elecsys
and
LC-MS/MS
(µg/L)
Среднее значение Elecsys и LC-MS/MS) (мкг/л)
120
Процедура является неполной (только 30-50% 25(OH)D освобождается от связывающего протеина) и возможно появление
погрешности с DBP, так как полного химического выделения 25(OH)D от связывающего его протеина и необратимой денатурации
DBP не достигается или если влияют сывороточные матриксные факторы (напр. липиды, др. протеины) в конечной
иммунологической реакции.
Основная задача– освобождение 25(OH)D от
связывающего его протеина
Лучшее решение – полное удаление DBP:
LC-MS/MS и HPLC утилизируют химическое выделение анализируемого вещества из
DBP, которое следует за преципитацией белка перед отделением 25(OH)D с помощью
хроматографии и окончательным подсчетом с помощью масс-спектрометрии или УФ
определения.
Альтернативой является полное разрушение DBP, что
связано с удобством прямого измерения:
Выделите и разрушьте DBP и мешающие белки расщеплением
сывороточных белков с помощью сериновой протеазы с
последующим подавлением протеазной активности перед
конечным количествен-ным анализом.
25 OH Витамин D прямой, ИФА
25 OH Витамин D прямой, ELISA (ИФА)
Оценивание в LimbachLaboratory
 150 сывороточных образцов, отобранных случайным образом
 50 случайно выбранных ЭДТА-плазма образцов
 100 сывороточных образцов полученных от практически здоровых людей
 50 LC-MS/MS заданных сывороточных образцов с D2 пиком
 Применяемые методы
 HPLC
 ID-ELISA
 RE170 D3 ECLIA
 Liaison Общий CLIA
 ISYS Общий CLIA
 Все образцы исследовались параллельно
Точность
LC-MS/MS (метод 1) в сравнении с HPLC n=48
25(OH)D3
Медиана
Median:
27.727.7
µg/Lмкг/л
Медиана : 47 мкг/л
Медиана : 46.1 мкг/л
Median: 2121µg/L
Медиана
мкг/л
Медиана 67.5 мкг/л
Медиана : 75 мкг/л
Различие (HPLC- LC-MS/MS) (мкг/л)
Difference (HPLC - LC-MS/MS) (µg/L)
50
25(OH)D2
40
30
20
10
+1.96 SD
Mean
4.1
-1.96 SD
-0.1
-4.4
0
-10
-20
-30
-40
-50
0
20
40
60
80
100
Среднее значение
и LC-MS/MS)
(мкг/л)
AVERAGE
of HPLCHPLC
and LC-MS/MS
(µg/L)
120
Точность
LC-MS/MS (метод 1 и 2) в сравнении с ELISA
LC-жидкая хроматография
MS-масс спектрометрия
Точность
Общий Витамин D
LC-MS/MS исследованных образцов n = 48 (только полные
случаи; мкг/л)
Точность
HPLC в сравнении с ELISA n = 193
Box&Whisker графики всего n= 345
завершенных случаев (мкг/л)
Метод сравнения
Точность и влияние типа образца
(сыворотка в сравнении с EDTA-плазмой)
Держите метод в уме!
Nichols (Квест) история.
3й квартиль
25(OH)D (нг/мл)
Cal
корректировка
-20%
Завершение
поисков
-22 %
Мин относительный
уровень
Поиски
онлайн
Преимущества начала
рекламой компании в
Европе
Медиана
1й квартиль
Жалобы
клиницистов
Исследование
Последняя поправка
25 OH Витамин D прямой, ELISA
 Применяемая протеазная техника является простым, легким
и удобным способом очистить образец по сравнению с
техниками, применяемыми для HPLC и LC-MS/MS
 ELISA является точным методом, если сравнивать с
достоверными и хорошо проведенными референс методами
 ELISA легко автоматизировать
 Не теряется единство измерений для ваших калибраторов и
эталонного метода.
Огромное спасибо
за ваше внимание!