lekciya_9_molekulyarnaya_radiobiologiya

Лекция № 9
Молекулярная радиобиология
Действие излучений на аминокислоты и белки. Радиационно-химические
превращения жирных кислот и фосфолипидов. Образование липидных перекисей.
Радиационно-химические
превращения
нуклеиновых
кислот.
Действие
ионизирующих излучений на первичную, вторичную и третичную структуры ДНК.
Одиночные и двойные разрывы ДНК. Разрывы водородных связей. Образование
сшивок.
Многочисленные данные свидетельствуют об участии свободных радикалов в
нормальном функционировании живых клеток и тканей, а также в развитии
некоторых патологических состояний. Установлено, что процесс старения
сопровождается появлением и накоплением в тканях аномальных количеств
свободных радикалов и перекисей. Свободные радикалы обладают выраженным
мутагенным эффектом. Предполагают, что свободнорадикальные процессы играют
существенную роль в онкогенезе. Антибактериальное действие некоторых
антибиотиков объясняют их способностью образовывать свободные радикалы
обладающие цитолитическим эффектом в отношении бактериальных клеток.
Существует гипотеза, основанная на теоретических представлениях и
экспериментальных данных, что абиогенными предшественниками белков,
нуклеиновых кислот и других биополимеров на Земле были свободные радикалы,
образовавшиеся из углекислого газа, аммиака, водяного пара, метана и других
простейших соединений первичной атмосферы Земли.
Стабильные свободные радикалы используют в качестве меток и зондов при
изучении конформации белков и нуклеиновых кислот, а также при исследовании
механизма взаимодействия субстрата с ферментом, антигена с антителом, свойств
биологических мембран и т.п.
Свободные радикалы могут быть нейтральными или заряженными частицами –
ионрадикалами, которые в зависимости от знака заряда называют анионрадикалами или катион-радикалами. Обозначают свободные радикалы символом
« », точка указывает на наличие неспаренного электрона. Наиболее простыми по
строению свободные радикалы живой клетки являются анион-радикал супероксида
) и нейтральный радикал гидроксила (ОН) – гидроксильный радикал.
В живых организмах свободные радикалы образуются в результате реакций
одноэлектронного окисления или восстановления молекул соответствующими
донорами или акцепторами электрона, например кислородом или металлами
переменной валентности, а также непосредственно под действием ионизирующего
или ультрафиолетового излучения.
Одноэлектронное восстановление кислорода может происходить в клетках и
тканях при участии ряда ферментов, таких как ксантиноксидаза, глюкозооксидаза и
др. Действие некоторых антибиотиков основано на том, что они обеспечивают
одноэлектронное восстановление молекулярного кислорода, отводя поток
электронов от терминальных оксидаз бактериальной клетки. В результате
образуются супероксидные, а значит, и гидроксильные радикалы, вызывающие в
конечном счете гибель такой клетки.
(
1
При действии ионизирующего и ультрафиолетового излучений на
аминокислоты, белки, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, жирные кислоты и
липиды в результате отрыва электрона или разрыва химической связи образуются
различные свободные радикалы, а также первичные продукты фотолиза –
сольватированный (т.е. захваченный молекулами среды, в основном воды)
электрон, атом водорода и органические радикалы.
При затраченной энергии ионизирующего излучения в 100 эВ образуется 2–4
свободных радикала, при поглощении каждых 100 квантов света возникает всего
несколько свободных радикалов.
В результате реакции с участием свободных радикалов в облученных белках и
нуклеиновых кислотах происходит химическая модификация макромолекул
(разрывы пептидных или нуклеиновых связей, образование «сшивок», химические
изменения различных аминокислотных остатков, нуклеотидов и др.). Химическая
модификация приводит к изменению структуры макромолекулы, ее формы и
биохимических свойств, появлению точковых мутаций, к инактивации ферментов,
разрушению биологических мембран и т.д.
Полагают, что функционально самой важной и универсальной по
распространению группой свободных радикалов в живых клетках являются
семихиноны – анион-радикалы, постоянно образующиеся в ходе обмена веществ и
энергии, а именно при окислительно-восстановительных превращениях
переносчиков
электронов
в
митохондриях,
хлоропластах,
мембранах
бактериальных клеток и внутриклеточных мембранах эукариотов.
Большое значение для нормальной жизнедеятельности клетки, а также при
развитии ряда патологических процессов имеют свободные радикалы,
образующиеся при окислении липидов молекулярным кислородом, в первую
очередь при окислении полиненасыщенных жирных кислот и жирных кислот
фосфолипидов, входящих в состав липопротеидов и биологических мембран.
Как показал Б.Н. Тарусов (1954), механизм свободнорадикального окисления
липидов в тканях и мембранах соответствует общим законам цепного окисления.
Процесс цепного окисления начинается со стадии инициирования, причем в роли
инициатора может выступать ОН-радикал, способный отнимать атом водорода у
органических соединений (RH) с образованием воды и активного органического
свободного радикала, участвующего в цепи последующих реакции.
Методы определения свободных радикалов и процессов, протекающих с их
образованием, различны. Прямое определение свободных радикалов в клетках и
тканях, в растворах и суспензиях клеточных органелл при физиологической
температуре трудно осуществимо из-за высокой реакционной способности
свободных радикалов и малого времени жизни, вследствие чего их стационарная
концентрация в исследуемых объектах очень низка. При замораживании объектов
скорость свободнорадикальных процессов замедляется, а при глубоком
охлаждении она практически равна нулю. В таких образцах свободные радикалы
могут быть зарегистрированы оптическими методами исследования путем
измерения спектров поглощения или с помощью люминесценции. Однако наиболее
объективным прямым методом обнаружения и определения свободных радикалов
является метод электронного парамагнитного резонанса.
Для обнаружения свободных радикалов некоторых типов используется
чувствительный метод – хемолюминесценция. Разработаны химические методы
регистрации свободных радикалов, например метод, основанный на способности
2
свободных радикалов инициировать реакцию сополимеризации с использованием
радиоактивных мономеров и биополимеров. По окончании реакции мономеры, не
включившиеся в сополимер, удаляют и с помощью счетчиков излучения
оценивают степень сополимеризации.
Свободные радикалы участвуют в процессах окисления, окислительного
фосфорилирования и тканевого дыхания. Установлено, что в норме в клетках
постоянно протекают процессы свободнорадикального окисления липидов.
Фагоцитоз
микроорганизмов
и
вирусов
сопровождается
активацией
свободнорадикального окисления.
Важную роль играют свободные радикалы в патологических процессах.
Усиление свободнорадикалького окисления липидов может привести к нарушению
нормальной жизнедеятельности организма и создать условия для развития ряда
заболеваний. Признаками участия свободнорадикального окисления липидов в
развитии того или иного заболевания, помимо активации свободнорадикального
окисления, являются нарастание клинической симптоматики, а также улучшение
состояния больного или его полное излечение в результате торможения
свободнорадикального окисления липидов при терапии антиоксидантами.
Об активации процесса свободнорадикального окисления судят обычно по
увеличению содержания в тканях и крови больных свободных радикалов,
липидных гидроперекисей, альдегидов, в частности малонового диальдегида, а
также по снижению содержания липидных антиоксидантов. Разработан метод
регистрации уровня свободнорадикального окисления в организме больных в
клинических условиях по содержанию пентана в выдыхаемом воздухе.
Большое внимание исследователи уделяют роли свободных радикалов в
онкогенезе. Обнаружена корреляция между способностью ряда онкогенов к
образованию свободных радикалов и их онкогенной активностью. Как правило, по
мере развития опухоли концентрация свободных радикалов в тканях снижается в
2–6 раз по сравнению с контролем, а интенсивность свободнорадикального
окисления в других тканях организма обычно повышается, особенно на
терминальных стадиях болезни, что, возможно, связано с перераспределением
антиоксидантов между тканью злокачественной опухоли и другими тканями.
Окисление перекисное – сложный многостадийный цепной процесс окисления
кислородом липидных субстратов, главным образом полиненасыщенных жирных
кислот, включающий стадии взаимодействия липидов со свободнорадильными
соединениями и образования свободных радикалов липидной природы. Перекисное
окисление фосфолипидов биологических мембран играет важную роль в
жизнедеятельности живых организмов. Усиление процессов перекисного
окисления имеет существенное значение в этиологии и патогенезе многих
заболеваний и развитии последствий различных экстремальных воздействий.
Перекисное окисление является частным случаем жидкофазного окисления
углеводородов. Оно представляет собой типичный цепной процесс с выраженным
разветвлением. Перекисное окисление может включить стадии неферментативного
аутоокисления и ферментативные реакции. Ферментативный и неферментативный
пути перекисного окисления приводят к образованию свободных радикалов
липидов в несколько основных этапов: инициирование (зарождение цепи)
,
,
продолжение
цепи
3
;
разветвление
цепи
; обрыв цепи
молекулярные продукты,
молекулярные продукты,
молекулярные продукты,
где RH – субстрат окисления (полиненасыщенная жирная кислота). В
инициировании перекисного окисления решающую роль играют так называемые
активные формы кислорода, в первую очередь кислородные радикалы, содержащие
неспаренные электроны. В результате одноэлектронного восстановления
молекулярного кислорода О2 в клетках образуется супероксидный анион-радикал
, который возникает в электронпереносящей цепи митохондрий, хлоропластов, в
реакциях, катализируемых некоторыми окислительными ферментами, при
аутоокислении моноаминов и других соединений. При реакции дисмутации двух
супероксидных радикалов образуется молекула перекиси водорода Н2О2. Другими
источниками перекиси водорода являются реакции, катализируемые некоторыми
оксидазами. В клетках существуют специальные системы обезвреживания
токсичных
кислородных
радикалов,
в
частности
ферментные:
супероксиддисмутаза, катализирующая превращение супероксида в перекись
водорода, каталаза и пероксидазы, катализирующие реакции, в которых перекись
водорода восстанавливается до воды. К наиболее реакционноспособным и поэтому
наиболее опасным радикалам кислорода относится гидроксильный радикал ОН• –
один из основных повреждающих факторов при действии на живой организм
ионизирующего излучения. Значительная часть радикалов ОН• в живых организмах
генерируется в результате реакций перекиси водорода и супероксидных радикалов
с каталитическими количествами металлов переменной валентности, в первую
очередь, с ионами железа и меди. Относительно малоактивные и долгоживущие
и Н2О2 могут служить источником взаимодействующего практически со всеми
классами биомолекул радикала ОН• в присутствии микроколичеств свободных
железа или меди. Наряду с радикалом ОН• непосредственными инициаторами
перекисного окисления могут быть и другие свободные радикалы, например
протонированный супероксид-анион
, а также синглетный кислород и ряд
других активных форм кислорода.
Продукты перекисного окисления, в частности перекиси липидов, используются
в организме для синтеза биологически активных веществ – простагландинов,
тромбоксанов, стероидных гормонов и т.д. Интенсивность перекисного окисления
непосредственно связана с процессами обновления состава фосфолипидов
биологических мембран, изменения относительного содержания липидов и белков
4
и как следствие с изменением структуры биологических мембран и их
функционирования. В живых организмах существует сложная система регуляции
интенсивности процесса перекисного окисления. В норме процессы образования и
расходования продуктов перекисного окисления хорошо сбалансированы, что
определяет их относительно низкое содержание в клетках. Скорость перекисного
окисления на уровнях инициирования, продолжения и обрыва цепи в значительной
степени определяется структурной организацией липидов в биологической
мембране. которая влияет на доступность остатков ненасыщенных жирных кислот
для кислорода. Факторы, нарушающие «упаковку» липидов в биологической
мембране, ускоряют, а факторы, поддерживающие структурированность липидов
(например холестерин), тормозят перекисное окисление. Другим регуляторным
компонентом системы перекисного окисления являются ферменты, участвующие в
образовании (например, некоторые оксидазы) или гибели (супероксиддисмутаза)
активных форм кислорода и свободных радикалов, а также в разложении перекисей
без образования свободных радикалов (каталаза, пероксидазы). Активность этих
ферментов также может зависеть от структурированности липидного бислоя
биологической мембраны. Практически на всех стадиях перекисного окисления
существенную модуляторную роль играют факторы, регулирующие обмен
фосфолипидов биологических мембран и влияющие на скорость окисления путем
изменения липидного состава мембран. Чрезвычайно важное значение в регуляции
перекисного окисления имеют многочисленные низкомолекулярные соединения,
выполняющие функции инициаторов, катализаторов, ингибиторов, тушителей,
синергистов этого процесса. К числу важнейших стабилизаторов биологических
мембран относится природный антиоксидант витамин Е; другими природными
антиоксидантами являются гормоны тироксин и кортикостероиды, витамин К,
глутатион. Свойствами прооксидантов обладают ионы металлов переменной
валентности, витамины С, D и др.
При развитии патологического процесса баланс образования и расходования
перекисей и других продуктов перекисного окисления может нарушаться,
метаболиты накапливаются в тканях и биологических жидкостях, что приводит к
серьезным нарушениям, в первую очередь, в биологических мембранах.
Следствием активизации перекисного окисления может быть изменение физикохимических свойств мембранных белков и липидов, изменение активности
мембранно-связанных ферментов, нарушение проницаемости мембран (в т.ч. для
протонов и ионов кальция), ионного транспорта (например, угнетение натриевого
насоса), уменьшение электрической стабильности липидного бислоя мембран.
Активация перекисного окисления приводит к изменению структуры
липопротеинов сыворотки крови и гиперхолестеринемии, нарушает разнообразные
процессы клеточного метаболизма практически на всех уровнях.
Токсичными для организма являются не только образующиеся в результате
перекисного окисления перекиси, но и продукты более глубокого окисления
липидов альдегиды, кетоны, кислоты. Карбонильные продукты перекисного
окисления ингибируют ряд ферментов, подавляют синтез ДНК, увеличивают
проницаемость капилляров, модифицируют агрегацию тромбоцитов и проявляют
ряд других нежелательных эффектов. Инициирующие перекисное окисление и
возникающие в процессе окисления реактивные свободные радикалы вызывают
повреждение структуры нуклеиновых кислот, прежде всего ДНК, деструкцию
нуклеотидных коферментов, нарушения функционирования ферментов (в первую
5
очередь SH-ферментов), ковалентную модификацию различных биомолекул.
Следствием избыточной генерации свободных радикалов могут быть
патологические изменения свойств сосудов.
Рис. 1. Схематическое изображение соединения нуклеотидных звеньев в полинуклеотидную цепь
нуклеиновой кислоты: в молекулах ДНК R-водород, в молекулах РНК — ОН-группа (гидроксильная
группа).
Рис. 2. Схема репликации молекулы ДНК: дочерняя цепь (реплика) строится на каждой из родительских
полинуклеотидных цепей, как на матрице. Стрелкой указано направление движения так называемой вилки
репликации, пунктиром обозначены водородные связи между азотистыми основаниями. А – аденин, Т –
тимин, Г – гуанин, Ц – цитозин.
Повреждения ДНК
1) структурные – разрывы связей в сахаро-фосфатном скелете:
– Однонитиевые (одиночные) разрывы – разрыв связей в сахаро-фосфатном
скелете одной из двух нитей.
– Двунитиевые (двойные) разрывы – разрыв связей в сахаро-фосфатном скелете
6
противоположных нитей. Двунитиевые разрывы возникают как при случайном
пространственном совпадении одиночных разрывов в противоположных нитях, так
и вследствие одновременного повреждения обеих нитей.
– Неправильное воссоединение разрывов ДНК – в результате ферментативной
репарации вместо восстановления разорванной связи может возникнуть связь
между концами двух противоположных нитей молекулы ДНК или разных молекул
ДНК и т.п. – следствие плотной упаковки ДНК (приводят к хромосомным
аберрациям).
– ДНК-белковые сшивки – результат разрывов ДНК и окружающих белков.
2) разрывы связей, не участвующих в построении скелета ДНК
– Повреждение нуклеотида – разрыв связей в молекуле дезоксирибозы.
– Повреждение основания – разрыв связи в пуриновом или пиримидиновом
основании. Последствия: окисление гуанина до 8-осогуанина.
– Присоединение радикалов ОН• – модификация оснований: превращение
тимина в тимингликоль.
– Появление неспаренных оснований – (как результат неверной репарации
оснований и их химической модификации): при репликации к 8-оксогуанину
вместо цитозина присоединится аденин, изменится геометрия ДНК. Пример: при
облучении в дозе 2 Гр в ДНК одной клетки повреждаются около 1000 пар
оснований, образуются 2000 однонитиевых и 80 двунитиевых разрывов,
формируются 300 сшивок с белком.
Репарация ДНК
В клетках имеются энзиматические (ферментативные) системы репарации ДНК,
которые вырезают и заменяют поврежденные основания и нуклеотиды, и
осуществляют репарацию однонитиевых разрывов. Двунитиевые разрывы
репарируются менее эффективно и с большим числом ошибок.
Активация перекисного окисления (так называемый синдром липидной
пероксидации) является общим ключевым фактором, опосредующим повреждение
мембранных структур органов и тканей при многих заболеваниях (за рубежом для
таких заболеваний принят термин «свободнорадикальная патология»).
Для профилактики и терапии состояний, связанных с чрезмерной активацией
перекисного окисления, могут быть использованы антиоксиданты, вещества,
специфически реагирующие с определенными свободными радикалами (ловушки
или перехватчики), специфические вещества, образующие комплексные
соединения с металлами переменной валентности, а также различные пути
активации эндогенных систем антирадикальной защиты организма (например,
постепенная адаптация к гипоксии или другим факторам).
7
8