источников - страница
реклама
На правах рукописи ТОКАРЕВ ОЛЕГ ИГОРЕВИЧ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТИМУСА И СЕЛЕЗЕНКИ КУР ПРИ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ Е 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Воронеж – 2012 Работа выполнена в ГНУ Северо-Кавказский зональный научноисследовательский ветеринарный институт РАСХН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Лапина Татьяна Ивановна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Слободяник Валентина Сергеевна доктор биологических наук, профессор Карташов Сергей Николаевич Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Уральская государственная сельскохозяйственная академия Защита состоится «__» ________ 2012 года в часов на заседании диссертационного совета Д 006.004.03 при Всероссийском научноисследовательском ветеринарном институте патологии, фармакологии и терапии РАСХН (394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б). Автореферат разослан «__» __________ 201_ г. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИВИПФиТ (394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б). Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук 2 В.И. Михалёв 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Птицеводство – одно из ведущих отраслей животноводства в современной России. Продукты производства сельскохозяйственной птицы используются в пищевой и легкой промышленности, – это высококачественные продукты питания (яйцо, мясо) и сырье (пух, перо и др.). Птицеводство отличается высокой рентабельностью, плодовитостью и скороспелостью. Продуктивность птицепоголовья зависит от условий содержания и степени иммунологической защиты, а так же от проводимых профилактических мероприятий, своевременного выявления заболеваний и проводимых мер борьбы с ними. В последнее время птицеводческое хозяйство стало все более подвержено инфекциям, заносимым из стран дальнего и ближнего зарубежья, которые ранее не регистрировались на территории Российской Федерации и, тем самым, вызывают затруднения в диагностике. В частности, серьезной проблемой птицеводческих хозяйств становится вирусный гепатит Е кур. Впервые это заболевание было зарегистрировано в 80-х годах прошлого века на птицефабриках Австралии, Великобритании, Японии и США среди курбройлеров взрослого стада. В России Ибрагим Ел-Морси в 2004 году проводил исследования в Екатеринбурге и у 18,3 % обследуемых кур обнаружил анти-ВГЕ, что свидетельствует о циркуляции ВГЕ на этой территории. Реализация программ по ликвидации инфекционных заболеваний показала, что при их выполнении возрастает роль лабораторной диагностики. Ранняя диагностика первых случаев эпизоотических инфекций позволяет своевременно провести противоэпизоотические мероприятия. Для получения правильного представления о болезни необходимо особенно тщательно изучить местные органные поражения, которые обычно проявляются наиболее ярко. Очень важным является изучение морфогенеза заболевания, – от начала его возникновения до завершения. В связи с этим, изучение патологоанатомической картины при вирусном гепатите Е кур и морфофункциональное состояние органов иммунной защиты считаем актуальным. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось исследование патологоанатомической картины и патогистологических изменений тимуса и селезенки при вирусном гепатите Е кур. Для выполнения поставленной цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить морфофункциональные показатели крови больных вирусным гепатитом Е кур, в том числе и при ассоциативном течении с другими заболеваниями; 2. Описать патологоанатомическую картину при вирусном гепатите Е кур, в том числе и при ассоциативном течении с другими заболеваниями; 3 3. Изучить гистологические изменения тимуса при вирусном гепатите Е кур, в том числе в ассоциации; 4. Изучить гистологические изменения селезенки при вирусном гепатите Е кур, в том числе в ассоциации. Научная новизна. Впервые выявлено, что при вирусном гепатите Е у кур происходят глубокие изменения показателей крови, выражающиеся макроцитарной анемией гиперхромного типа, снижением количества лейкоцитов, лимфоцитопенией, свидетельствующие о снижении иммунной защиты организма. Обнаружены изменения в сыворотке крови, – уменьшение альбуминов, билирубина, увеличение аспартатаминотрансферазы (АсАТ), активность ЛДГ и щелочной фосфатазы увеличиваются более, чем в два раза, характеризующие значительное поражение печени, которые могут быть критериальными для прижизненной диагностики данного заболевания. Впервые описаны центральные и периферические органы иммунной системы (тимус и селезенка) при вирусном гепатите Е кур, в том числе в ассоциации с другими заболеваниями. При вирусном гепатите Е кур в тимусе наблюдается значительная гибель лимфоцитов, некрозы, появление молодых телец Гассаля. В селезенке исчезает белая пульпа, возникают амилоидобласты, синтезирующие амилоид, в красной пульпе появляется много бластных форм клеток лимфоидного ряда, происходит активная плазматизация органа. Практическая значимость и реализация результатов исследований. Исследованы изменения в крови при вирусном гепатите Е кур. Изучены патологоанатомическая картина при вирусном гепатите Е кур и патогистологическая картина тимуса и селезенки. Результаты исследований используются в учебном процессе ряда ВУЗов. По результатам исследований разработаны методические рекомендации "Диагностика вирусного гепатита Е кур", утвержденные НТС МСХиП Ростовской области (Протокол №11 от 14.10.2011 г.) в помощь практикующим ветеринарным врачам птицеводческих хозяйств различных форм собственности, которые приняты к внедрению Министерством сельского хозяйства Республики Северная-Осетия Алания, а также Республиканской ветеринарной лабораторией. Данные, полученные в ходе проведенной работы, могут быть использованы в учебном процессе высших и средних учебных заведений ветеринарного профиля при проведении занятий по эпизоотологии и патологической анатомии, а также при проведении курсов повышения квалификации для преподавателей и ветеринарных врачей, написании учебников и монографий, выполнении научных исследований. Основные результаты научных исследований вошли в отчеты ГНУ СКЗНИВИ РАСХН за 2011г. по теме «Разработать новые 4 высокоэффективные средства и оптимальные способы их применения для диагностики, профилактики и борьбы с инфекционными и паразитарными болезнями, наносящими наибольший ущерб промышленному птицеводству» Государственный регистрационный номер 15070.7823003000.07.7.001.7. Материалы исследований используются как справочный материал в научно-исследовательской работе и на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов, а также при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по дисциплинам болезни птиц, патологическая анатомия и судебно-ветеринарная экспертиза кафедры морфологии и патологии животных ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ»; кафедры анатомии, патологической анатомии, акушерства и хирургии ФГОУ ВПО «Башкирский ГАУ»; кафедры ВСЭ и заразных болезней ФГОУ ВПО «Оренбургский ГАУ»; по курсам патологической физиологии и патологической анатомии животных и гистологии ФГОУ ВПО «Горский ГАУ»; кафедр анатомии, гистологии и патологической анатомии и ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Омский ГАУ»; по курсам анатомия домашних животных, морфология сельскохозяйственных животных, патологическая анатомия, вскрытие, судебная ветеринарная медицина кафедры анатомии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Нижегородская ГСХА»; по курсам вирусологии, эпизоотологии, патологической анатомии на кафедре «Эпизоотологии и зоогигиены» ФГОУ ВПО «Самарская ГСХА»; по дисциплинам патологическая анатомия и патологическая физиология в Институте ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Алтайский ГАУ». Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и получили положительную оценку на 73 и 74 научнопрактических конференциях профессорско-преподавательского состава ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет», г. Ставрополь, 2008-2011гг., VI Всероссийской дистанционной научнопрактической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Современные проблемы устойчивого развития агропромышленного комплекса России», ДонГАУ, пос. Персиановский, 2009; Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного производства», г. Курск, 2010; Международной научнопрактической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки», г. Владикавказ, 2010, 2011; Международной научнопрактической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства», г. Казань, 2010; Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение инновационного развития отечественного животноводства», г. Новочеркасск, 2011; 17-й Всероссийской научно-методической конференции по патологической анатомии животных «Современные проблемы патологической анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных», г. Москва, 2011. 5 Публикации. По результатам исследований опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ, методические положения «Диагностика вирусного гепатита Е кур». Основные положения, выносимые на защиту. 1. Изменения морфофункциональных параметров крови, характерные для вирусного гепатита Е кур. 2. Патоморфологические изменения в тимусе и селезенке кур при вирусном гепатите Е и при его ассоциативном течении с другими заболеваниями. Структура и объём диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и список литературы. Список использованной литературы включает 151 источников, в том числе 70 иностранных авторов. Работа изложена на 125 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 76 микрофотографиями, 6 таблицами, 21 диаграммой. 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа была начата на кафедре анатомии и патологической анатомии ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет», выполнена в период с 2008-2011 гг. в ГНУ Северо-Кавказский зональный научноисследовательский ветеринарный институт РАСХН. Участвовавшие в опыте куры 60-недельного возраста линии кросса РООС-308 находились на предприятии частной фирмы Ставропольского края. Содержались куры напольно, по 5-15 тысяч голов в корпусе. Рацион для кур всех корпусов был одинаковый, поение проводили из автоматических поилок. Для выяснения причины сложившейся ситуации, нами произведено вскрытие павших кур (в количестве 400 голов). Из общего числа вскрытых кур нами были определены три характерные патологоанатомические картины (патологоанатомические признаки, характерные для лейкоза, колибактериоза и кокцидиоза). Манифестирующими признаками при вскрытии трупов кур 2, 3 и 4 групп были значительное увеличение печени и селезенки. Для выяснения нозологической единицы болезни проведены: бактериологические и паразитологические исследования в ФГУ «Ставропольская межобластная лаборатория»; исследования пробы крови на гидроперикардит в ФГУ «Лаборатория по борьбе с болезнями птиц» (г. Пятигорск Ставропольского края); вирусологические исследования трупов кур в ФГУ ВНИИЗЖ (г. Владимир Владимирская область) на лейкоз; вирусологические исследования в Clinic for Avian, Reptile and Fish Medicine (Венгрия). При проведении лабораторных исследований получены следующие результаты: 6 Во всех группах кур получены отрицательные результаты на гидроперикардит и лейкоз. В первой и второй группах кур наличие бактериальной и паразитарной инфекции не выявлено. В третьей группе обнаружен положительный результат на E. coli. В четвертой группе результат положительный на E. coli и кокцидиоз. Во второй, третьей и четвертой группах кур из патологического материала получен положительный результат на BLSD (синдром «большой печени и селезенки» или вирусный гепатит Е). Из общего поголовья нами были отобраны куры с разным клиническим состоянием, в связи с чем, мы их поделили на 4 группы: по 70 голов в каждой; в первой группе находились клинически здоровые куры в количестве 55 голов. В последующих исследованиях они служили контролем. Во второй группе находились куры с признаками сонливости и вялости, в третьей группе – взъерошенные, с испачканными фекалиями перьями вокруг клоаки, четвертая группа состояла из кур ниже средней упитанности с ярко выраженными признаками анемии, – цианоз гребня и сережек. Во всех из перечисленных группах происходил падеж кур, кроме первой – там проводили диагностический убой. С целью выяснения патогенного действия вируса гепатита Е на организм больных кур проводили исследования крови, изучали патологоанатомическую картину и гистологические изменения иммунных органов. На первом этапе опыта проводили исследования крови. Кровь для анализа брали утром, натощак, из подключичной вены. Гематологические исследования показателей проводили на электронном анализаторе Abacus junior vet. Определяли следующие показатели: содержание гемоглобина, гематокрит, количество эритроцитов, средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах, широту распределения популяции эритроцитов, количество тромбоцитов, тромбокрит, средний объем тромбоцитов, широту распределения популяции тромбоцитов, лейкограмму. В сыворотке крови на электронном биохимическом анализаторе BIOCHEM BA с помощью реактивов фирмы Лахема выявляли активность ферментов (АлАТ, АсАТ, ЛДГ, щелочной фосфатазы), количество мочевины, мочевой кислоты, креатинина, содержание общего белка, альбумина, холестерина, билирубина, глюкозы, амилазы. Высчитывали коэффициент Ритиса. На втором этапе опыта проводили патологоанатомическое вскрытие трупов кур второй, третьей и четвертой групп и кур, убитых для диагностического вскрытия, из первой группы. При вскрытии отбирали 7 иммунные органы, – тимус и селезенку, для гистологических, гистохимических и морфометрических исследований. Кусочки органов фиксировали в 10% нейтральном формалине, смеси Карнуа с последующей заливкой в парафин или гистологическую заливочную среду «Histomix®». Парафиновые срезы толщиной 5‒6 мкм изготавливали на санном микротоме, по общепринятым методикам окрашивали гематоксилином и эозином – для обзорных исследований, по Браше – для выявления плазматических клеток, ставили ШИК-реакцию с контролем амилазой, окрашивали Конго красным на амилоид (Р. Лили, 1969; Г.А. Меркулов, 1969). Морфометрические исследования проводили с помощью программы «Видео-ТесТ-Мастер 4.0». В тимусе измеряли средний размер долек, толщину коркового и мозгового слоя. Определяли абсолютное количество и процентное содержание малых, средних и больших лимфоцитов в поле зрения микроскопа в различных зонах тимуса, селезенки и лимфатических узлов. В селезенке определяли процентное соотношение белой и красной пульпы к паренхиме, также измеряли площадь белой пульпы. Вся гистологическая терминология соответствует новой международной номенклатуре (В.В. Баранин, В.Л. Быков, 2009). Полученный цифровой материал обработан методами описательной статистики с помощью программы МS Office Excel 2007, и критерием Стьюдента c помощью программы statplus 2007 professional. Достоверным считали разницу при Р<0,05 (С. Гланц, 1998). Таблица 1. – СХЕМА ОПЫТА И ОБЪЕМ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ № п/п Методы исследований Количество проб 1 ЭТАП 1. Гематологические исследования 265 2. Биохимические исследования сыворотки крови 265 3. Бактериологические исследования 215 4. Паразитологические исследования 299 2 ЭТАП 5. Патологоанатомическое вскрытие 458 6. Патогистологические исследования 533 7. Морфометрические исследования 600 8 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Гематологические показатели при вирусном гепатите Е кур У кур второй группы, больных вирусным гепатитом Е, количество эритроцитов достоверно увеличилось на 32 % (составляет 4,1 1,2 х 1012л) по сравнению с контрольными курами (3,11 0,8 х 1012л). Показатель гематокрита относительно здоровых кур (29,8 ± 4,8%) достоверно увеличился на 31 % (39 ± 3,6%), средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах достоверно снизилась на 14 % (594,6 ± 30,1 г/л), у здоровых кур этот показатель составил 695,8 2,8 г/л. Наблюдается тенденция к увеличению среднего содержания гемоглобина в эритроците на 11 % (74 ± 4,3 пг), у здоровых кур составило 66,5 4,8 пг и уменьшению количества гемоглобина на 13 % (181 46,8 г/л) (у здоровых составило 207 31,5 г/л). По полученным данным мы можем констатировать гиперхромную анемию У кур третьей и четвертой групп (больных вирусным гепатитом Е в ассоциации с колибактериозом и колибактериозом и кокцидиозом, соответственно) количество эритроцитов составило 2,7 ± 0,95 х 1012л и 2,01 ± 1,28 х 1012л, что на 13,2 % и 35,4% меньше, чем у здоровых кур. Достоверно увеличился средний объем эритроцитов у кур третьей и четвертой групп на 31,5 % и 24,2 % (126 ± 1,5 и 119 ± 1,48 фл), соответственно. Показатель гематокрита относительно здоровых кур достоверно уменьшился на 19,1 % (24,1 ± 2,84%) у кур третьей группы и на 31,8 % (20,31 ± 2,9%) у кур четвертой группы. Имеется тенденция к понижению количества гемоглобина на 15 % и 11,1 % (176 ± 18,4 г/л и 184 ± 27,1 г/л). Средняя концентрация гемоглобина достоверно снизилась в эритроцитах кур третьей – на 19,1 % (562 ± 35,6 г/л), четвертой – на 15,8 % (585 ± 28,7 г/л). Среднее содержание гемоглобина в эритроците увеличилось у кур третьей группы – на 25,7 % (83,6 ± 4,7 пг) (р<0,05) и четвертой – на 17,1 % (77,9 ± 3,6 пг) (р<0,05). По полученным данным мы можем констатировать нормохромную анемию и макроцитоз. У больных кур третьей и четвертой групп выявлено достоверное снижение количества тромбоцитов, – на 37,5 % и 58,3 % (0,03 ± 0,02% и 0,02±0,01, соответственно), против данных здоровых кур (0,048 0,03 %), что так же указывает на анемию (И.А. Кассирский, Т.А. Алексеев, 1970; Л.А. Данилова, 1999). Выявлено значительное достоверное снижение количества лейкоцитов у больных кур второй, у третьей и четвертой групп на 28 %, 38% и 36%, что составило (37,4 ± 3,38 х 109л, 32,28 ± 3,42 х 109л и 33,4 ± 3,26 х 109л), соответственно, в сравнении со здоровыми курами, – 52 5,6 х 109л. Обнаружена лимфоцитопения, – количество лимфоцитов у кур второй группы достоверно уменьшено на 43 % и составляет 26,63 ± 2,62 х 109л, у кур третьей группы – на 53%, что составляет 22,14 ± 3,1 х 109л и четвертой – на 61% (18,3 ± 2,75 х 109л) (у здоровых кур показатель составляет 47 6,8 х 109л). Значения показателей достоверны. 9 Достоверно значительно уменьшается у больных кур второй и третьей групп количество моноцитов и эозинофилов, – на 88 % и 84,6%, (0,14 ± 0,02 и 0,18 ± 0,02 х 109 мл), соответственно; у кур четвертой группы этот показатель увеличивается на 28,2 % (1,5 ± 0,02 х 109 мл) (р<0,05). У здоровых кур этот показатель составил (1,17 1,5 х 109 мл). Одновременно у всех больных кур наблюдается гранулоцитоз, – происходит достоверное увеличение гранулоцитов на 91 % (7,22 ± 1,45 х 109л) у кур второй группы, на 30,6% – у кур третьей группы (4,95 ± 2,2 х 109л) и на 40,6% – четвертой (5,33 ± 1,4 х 109л) (р<0,05). У здоровых кур данный показатель составляет 3,79 1,4 х 109л. Резкое снижение числа эозинофилов, наблюдаемое вместе с лейкопенией, указывает, на присутствие в организме интоксикации при вирусном заболевании (И.А. Кассирский, Т.А. Алексеев, 1970; Л.А. Данилова, 1999). Таким образом, у больных кур происходят глубокие изменения показателей крови, выражающиеся в анемии, снижении иммунной защиты при повышенном гранулоцитозе. 3.2. Биохимические показатели сыворотки крови при вирусном гепатите Е кур При оценке биохимических показателей сыворотки крови всех групп кур, больных вирусным гепатитом Е, нами выявлены изменения, в первую очередь характеризующие поражение печени. Биохимическими исследованиями сыворотки крови обнаружено, что активность АсАТ (аспартатаминотрансферазы) здоровых кур составила 217,3 ± 7,64 Е/л. У больных вирусным гепатитом Е кур второй группы выявлено достоверное увеличение активности фермента по сравнению со здоровыми на 25,8 % (172,76 ± 11,89 Е/л), у кур третьей группы (больных вирусным гепатитом Е, осложненным колибактериозом) данный показатель увеличился на 21,8 % (210,4 ± 7,4 Е/л) (р<0,05) и у кур четвертой группы (больных вирусным гепатитом Е, осложненным бактериальной инфекцией и кокцидиозом) на 27,5 % (220,2 ± 7,71 Е/л) (р<0,05). По данным Н.У. Тица (1986), уровень АсАТ возрастает при повреждениях печеночных клеток любого происхождения, что свойственно гепатиту Е. Наблюдается достоверное повышение активности АлАТ (аланинаминотрансферазы) у кур второй группы на 36 %, составила 8,86 ± 1,4 Е/л, у кур третьей группы – на 63 %, составила 10,6 ± 1,6 Е/л, у кур четвертой группы – на 91,7 %, cоответствует 12,5 ± 1,3 Е/л. У здоровых кур активность АлАТ равна 6,52 ± 0,73 Е/л. Увеличение активности АлАТ оказывает влияние на значение коэффициента Ритиса, который на 20 % ниже у кур во второй группе по сравнению с курами первой группы, на 28,5% ниже в третьей и на 36,4% ниже в четвертой, что составляет 22,6 ± 5,24, 19,8 ± 7,4 и 17,6 ± 7,2, соответственно. У здоровых кур коэффициент Ритиса составляет 27,69 ± 1,7. Более низкое значение коэффициент Ритиса 10 свидетельствует о поражении гепатоцитов (A.L.Williams, J.H.Hoofnagle, 1988). Наблюдается увеличение ЛДГ (лактатдегидрогеназы) более, чем в 2 раза (449,04 ± 17,8 Е/л) у больных кур второй и четвертой групп (438,9 ± 17,6 Е/л), у кур третьей группы этот показатель увеличен в 2,5 раза (513,7 ± 19,7 Е/л) (р<0,05). У здоровых кур этот показатель соответствует 201,72 ± 51,13 Е/л. Увеличение ЛДГ более, чем в 2 раза, также свидетельствует о тяжелом поражении печени, вплоть до некроза гепатоцитов, вследствие чего фермент в больших количествах попадает в кровь (Н.У.Тица, 1986). В 2,6 раза увеличилась активность щелочной фосфатазы у больных кур второй группы (208,62 ± 42,7 МЕ/л) и четвертой (212,7 ± 42,7 МЕ/л). У кур третьей группы активность фермента возросла в 3 раза (244,4 ± 59,4 МЕ/л) по сравнению с контролем (79,38 ± 17,05 МЕ/л), что также свидетельствует о поражении печени (Н.У.Тица, 1986). О поражении печени свидетельствуют также достоверное понижение содержания в крови альбуминов на 41 % (10,62 ± 0,72 г/дл) у больных кур второй группы, у кур третьей группы данный показатель понизился на 29,4% (12,7 ± 0,86 г/дл), у кур четвертой группы – на 45,5% (9,8 ± 0,64 г/дл). Данные контрольной группы кур составляют 18 ± 1,31 г/дл. Известно, что альбумины крови образуются в печеночных клетках, поэтому при болезнях печени их количество снижается. Снижение содержания альбумина в сыворотке крови наблюдается при циррозе печени, хроническом нефрите, белковой интоксикации, острых воспалительных процессах, многих инфекционных заболеваниях (И.П.Кондрахин, 1985; Н.У.Тица, 1986). Количество билирубина снижается на 75% у кур второй группы (составляет 6,42 ± 1,81 Мг/дл), у кур третьей группы – на 73% (6,9 ± 1,9 Мг/дл), у кур четвертой группы этот показатель уменьшился на 70% (7,6 ± 2,1 Мг/дл) по сравнению со здоровыми курами – 25,62 ± 4,75 Мг/дл. У больной птицы имеется тенденция понижения количества общего белка, однако разница с показателем здоровой птицы недостоверна. Таким образом, при вирусном гепатите Е обнаружены изменения в сыворотке крови, свидетельствующие о значительном поражении печени, которые могут быть критериальными для прижизненной диагностики данного заболевания. 3.3. Патологоанатомическая картина при вирусном гепатите Е кур С целью диагностического исследования проведено вскрытие убитых кур из контрольной группы и трупов павших кур второй, третьей и четвертой групп и выявлено следующее. У кур ПЕРВОЙ группы (контрольной) изменения обнаружены лишь со стороны печени. Орган увеличен в объеме желто-коричневого цвета, дряблой, слегка тестоватой консистенции. Данные изменения присущи белково-жировой дистрофии, что мы связываем с характером кормления птицы. 11 При вскрытии трупов кур, павших от вирусного гепатита Е, манифестирующими признаками были изменения в печени и селезенке. У всех кур печень была значительно (в 4-6 раз) увеличена в объеме, тестоватой консистенции с очагами уплотнений. Селезенка увеличена в 3-4 раза, на разрезе видны полупрозрачные зерна. Вместе с тем, наряду с обнаруженной схожестью патологоанатомических признаков, имелись значительные отличительные особенности. При вскрытии кур ВТОРОЙ группы (больных вирусным гепатитом Е) обращают на себя внимание следующие патологоанатомические изменения: Цианоз. В подкожной клетчатке, в области клоаки и коронарных сосудов имеется значительное количество жира. Тимус состоит из отдельных небольших фрагментов темно – красного цвета. Печень увеличена в объеме в 4-6 раз, края тупые; консистенция тестоватая, с очагами уплотнений; цвет светло-коричневый с темнокрасными участками (рис.1) – дистрофия печени. Селезенка увеличена, светло-красная с синюшностью. Поверхность разреза зернистая, зернистость блестящая, желтовато-белая – саговая селезенка (рис.2). Почки дряблые, темно-красные – застойная гиперемия и дистрофия почек. Легкие тестоватые, розовые, на разрезе выделяется незначительное количество пенистой жидкости – отек легких. При вскрытии кур, больных вирусным гепатитом Е в ассоциации с колибактериозом (ТРЕТЬЯ группа), выявлено следующее: Перья взъерошены, вымазаны фекалиями возле клоаки. Наблюдается цианоз конъюнктивы и кожи. Большинство кур было средней упитанности – в подкожной клетчатке и в области клоаки имеется жир. Тимус состоит из фрагментов овальной формы. В грудобрюшной полости обнаружено до 150 мл мутной сероватой жидкости иногда с хлопьями серо-белого цвета – серозный или серознофибринозный перитонит. Повсеместно наблюдались отложения фибрина на органах. Слизистая желудка и двенадцатиперстной кишки неравномерно покрасневшая, набухшая, местами с кровоизлияниями, покрыта серо-белой слизью – острый катаральный гастрит и дуоденит. Печень была значительно (4-6 раз) увеличена в объеме, тестоватой консистенции с очагами уплотнений. На фоне темно-красного цвета выделялись обширные светло-желтые очаги. Часто встречалась печень, в которой паренхима была размозжена и отслаивалась от капсулы – дистрофия, некроз. Выявили значительное увеличение селезенки, цвет от темновишневого до черного, соскоб обильный – признаки септической селезенки. 12 Желтки часто деформированы, присутствуют мелкие округлые недоразвитые яйцеклетки, в полости которых находится грязно мутная масса – некроз яйцеклеток. Слизистая яйцевода покрасневшая, местами имеют место обширные кровоизлияния – сальпингит. Почки дряблой консистенции, темно-красные, однородные, границы не выражены – застойная гиперемия и нефроз. При вскрытии кур, больных вирусным гепатитом Е в ассоциации с колибактериозом и кокцидиозом (ЧЕТВЕРТАЯ группа), выявлена следующая патологоанатомическая картина: Перьевой покров скудный, имеются бесперьевые участки. В подкожной клетчатке птица практически не имела жира, в области клоаки присутствовало незначительное количество жира. Тимус состоит из отдельных островков. Мышечная ткань в области грудины представлена скудно, синюшного оттенка. В грудобрюшной полости находится большое (до 180 мл) количество мутноватой жидкости красного цвета – геморрагический перитонит. Печень увеличена, края закруглены во всех долях, цвет темновишневый, имеются обширные, – диаметром до 2 см и больше, пятна неправильной формы светло-желтого цвета. Консистенция дряблая, кашицеобразная, капсула легко отслаивается – дистрофия и некроз. На слизистой оболочке кишечника имеют место точечные кровоизлияниями, в полости тощей кишки обнаружена зеленоватая слизь. Слепые кишки забиты плотной серой массой – фибринозный тифлит – кокцидиоз. Селезенка – темно-красная, на разрезе имелись белые очаги – саговая селезенка. Соскоб умеренный. Почки темно-красные, дряблые – застойная гиперемия и нефроз. В яичниках обнаружены мелкие округлые недоразвитые яйцеклетки, в полости которых находится грязно-мутная масса. Слизистая яйцевода покрасневшая, местами с кровоизлияниями – сальпингит. Легкие темно-красные, на разрезе выделяется пенистая темно-красная жидкость, легко погружаются в воду – застойный отек. Таким образом, при патологоанатомическом вскрытии обнаружено ряд изменений общих для всех кур, больных вирусным гепатитом Е: 1. Цианоз. 2. Гипертрофия печени в 4-6 раз. 3. Гипертрофия селезенки в 3-5 раз. 4. Отек легких. У кур третьей группы имеют место изменения, присущие для колибактериоза. У кур четвертой группы имеют место изменения, присущие для колибактериоза и кокцидиоза. 13 3.4. Патогистологические изменения тимуса кур при вирусном гепатите Е. Гистологическими исследованиями выявлено, что у кур ВТОРОЙ ГРУППЫ (больных вирусным гепатитом Е) дольки тимуса выражены хорошо, часто имеют неправильную форму. Между дольками имеет место значительное количество соединительной ткани. В дольках подкапсулярная зона, преимущественно, отсутствует. Граница между корковым и мозговым веществом выражена нечетко. На долю коркового вещества приходится, в среднем, 65,9% от всей дольки, на долю мозгового – 34,1%. Как в корковом, так и в мозговом веществе лимфоцитов небольшое количество, причем, клетки самых разнообразных форм и размеров. При увеличении 1000 кратном, выявляется некроз (лизис) стромы долек тимуса. Рис.1. Печень курицы с размозженной паренхимой при вирусном гепатите Е кур. Рис.2. Саговая селезенка курицы при вирусном гепатите Е кур. 14 Рис.3. Некрозы в селезенке при вирусном гепатите Е кур. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х100. В корковом веществе лимфоциты не имеют четких границ, находятся в состоянии лизиса, часто встречаются апоптические тела. В мозговом веществе имеет место почти полное отсутствие лимфоцитов, за счет наблюдающегося лизиса. У кур ТРЕТЬЕЙ ГРУППЫ (больных вирусным гепатитом Е и колибактериозом) корковое вещество очень узкое, занимает, в среднем, 17% от всей дольки, иногда и вовсе отсутствует. На долю мозгового вещества приходится 83 %. Субкапсулярная зона отсутствует. Лимфоциты в корковом веществе расположены диффузно, часто находятся в состоянии лизиса, встречаются апоптические тела. На границе с корковым веществом выявляется значительное количество очень крупных клеток с ядром, смещенным к периферии. Предположительно это молодые тельца Гассаля. При окраске по ШИК их цитоплазма дает ШИК-позитивную реакцию. Тельца Гассаля подвергаются некрозу и на их месте выявляются очаги бесструктурной массы – тканевой детрит. Имеет место глубокая васкулопатия, – плазматическое пропитывание, разволокнение и гомогенизация медии и набухание эндотелия стенки артериол. В тимусе кур ЧЕТВЕРТОЙ ГРУППЫ (больных вирусным гепатитом Е в ассоциации с колибактериозм и кокцидиозом) корковое вещество очень узкое, занимает, в среднем, 18 % от всей дольки. На долю мозгового вещества приходится 82 %. Субкапсулярная зона отсутствует. Граница между корковым и мозговым веществом отсутствует. В корковом веществе тимоциты располагаются редко, или слабо обозначенными группами, или рядами. Среди лимфоцитов встречаются апоптические тела. В мозговом веществе имеет место лизис стромы и лимфоцитов. Апоптические тела преобладают над лимфоцитами, они занимают до 80 %. Здесь в значительном количестве встречаются тельца Гассаля, а также гигантские клетки инородных тел. Встречаются тельца Гассаля в состоянии некроза. 15 Наблюдается глубокая патология со стороны сосудистого русла. В артериях имеют место эндоваскулиты и плазматическое пропитывание стенки. Таким образом, при вирусном гепатите Е у кур в тимусе имеет место акцидентальная инволюция тимуса, некроз стромы, апоптоз лимфоцитов. У кур, больных вирусным гепатитом Е в ассоциации с колибактериозом, наряду с изменениями, характерными для кур второй группы, было отмечено появление молодых телец Гассаля и их некроз, большое количество апоптических тел. Для кур, больных вирусным гепатитом Е в ассоциации с колибактериозм и кокцидиозом, характерно почти полное отсутствие коркового вещества, акцидентальная инволюция тимуса, прогрессивное разрушение лимфоцитов, большое количество апоптических тел и молодых телец Гассаля, часто в состоянии некроза, появление гигантских клеток инородных тел. 3.5. Патогистологические изменения селезенки кур при вирусном гепатите Е. При гистологическом исследовании селезенки выявили изменения разной степени поражения. При оценке срезов селезенки кур, больных вирусным гепатитом Е, выявлено, что в капсуле гладкомышечные клетки большей частью гомогенизированы. Под капсулой содержится значительное количество клеток лимфоидного ряда. Это лимфоциты на разных стадиях некроза и незначительное количество плазмоцитов. В красной пульпе выявляется разрушение эритроцитов, здесь присутствуют, преимущественно, ретикулярные клетки, плазмоциты и клетки белой крови большей частью в состоянии дистрофии. Белая пульпа занимает 4,97 % от всей площади среза селезенки. Лимфоидные узелки встречаются редко. На их месте располагаются хромофобные очаги (рис.3), дающие ШИК-положительную реакцию. При окраске Конго красным эти очаги окрашиваются в цвет красного дерева, характеризующий амилоид. Сохранившиеся лимфоидные узелки имеют самую разнообразную форму, – овальную, округлую, неправильно треугольную и др. От красной пульпы лимфоидные узелки отграничены нечетко. Наблюдаются глубокие изменения стенки кровеносных сосудов, – медия центральной артериолы гомогенизирована и частично лизирована. Эндотелий интимы десквамирован. При гистологическом исследовании селезенки кур, больных вирусным гепатитом Е в ассоциации с колибактериозом, выявлена более глубокая патология. Серозная оболочка, покрывающая сверху селезенку, набухшая. Поверх мезотелия обнаружены клетки крови и хлопья фибрина. В капсуле селезенки выявлено набухание коллагеновых волокон и очаговая гомогенизация гладкомышечных клеток. В красной пульпе, под капсулой и в толще селезенки находится значительное количество клеток лимфоидного ряда, 16 плазмобластов и плазмоцитов, большинство из которых находятся в состоянии дистрофии. Белая пульпа практически отсутствует. Здесь на месте белой пульпы располагаются очаги ШИК-позитивного вещества, которое при окраске Конго красным дает позитивное окрашивание – амилоид. Местами заметны остатки лимфоидных узелков, которые занимают 5 ± 0,14% от всей площади среза селезенки. Остальные 94,5 ± 0,21 %. приходятся на красную пульпу. Лимфоидные узелки белой пульпы имеют самую разнообразную форму, от овально-округлых до вытянутых треугольных. Большое увеличение микроскопа выявляет отсутствие зон в лимфоидном узелке и сильное опустошение лимфоцитами. При увеличении кратном 1000 обнаружено, что, наряду с нормальной формы лимфоцитами, здесь присутствуют и деформированные. При окраске по Браше в оставшихся лимфоидных узелках белой пульпы выявляются плазматические клетки в значительном количестве. Со стороны сосудистого русла выявляется васкулопатия: эндотелий центральной артериолы набухший, часто десквамирован, наблюдается гомогенизация медии, в более крупных пульпарных артериях – расслоение мышечных слоев медии, волокна адвентиции набухшие, имеет место периваскулярный отек. В выносящих сосудах имеется агрегация эритроцитов. Обращает на себя внимание кровенаполнение капилляров селезенки. При оценке срезов селезенки кур, больных вирусным гепатитом Е в ассоциации с колибактериозом и кокцидиозом, четвертой группы выявлена глубокая патология органа, – обширные очаги некроза. Белая пульпа занимает 3,5 ± 0,01% от всей площади среза селезенки. При большом увеличении определяется, что очаги некроза находятся в области нахождения лимфоидных узелков белой пульпы. Здесь происходит накопление амилоида. При окраске по Браше в некоторых оставшихся лимфоидных узелках выявляются плазматические клетки. В красной пульпе много клеток лимфоидного ряда особенно бластных форм, некоторые часто находятся в состоянии некроза. При окраске по Браше обнаружены единичные плазматические клетки. В сосудистом русле наблюдается патология, это – отсутствие эндотелия, набухшая, часто гомогенизированная медия, очаговый некроз. Таким образом, у кур второй, третьей и четвертой групп в органах иммунной системы выявлены поражения стенки сосудов, некроз лимфоцитов, появление плазмоцитов и молодых телец Гассаля и их некроз. Мы можем говорить о глубоком влиянии вируса гепатита Е на центральные и периферические органы иммунной системы птиц. 17 ВЫВОДЫ 1. Вирусный гепатит Е кур имеет место быть на территории Российской Федерации. 2. При вирусном гепатите Е происходят глубокие нарушения гематологических показателей, а так же гомеостаза организма: у больных кур увеличилось количество эритроцитов на 32 %, средний объем эритроцитов на 30 %, показатель гематокрита на 31 %, количество гранулоцитов на 91 %; уменьшено количество лимфоцитов на 43 %, средний объем тромбоцитов – на 15 %, понижение моноцитов/эозинофилов – на 88 %. 3. Изменения биохимических показателей сыворотки крови характеризуют глубокое поражение печени, вплоть до некроза гепатоцитов: уменьшение альбуминов на 41 %, билирубина – на 75 %, увеличение аспартатаминотрансферазы (АсАТ) – на 25,8 %. Активность ЛДГ и щелочной фосфатазы увеличиваются более чем в два раза. Уровень креатинина падает в 7 раз, что связано с низким синтезом АТФ в мышцах. 4. При патологоанатомическом вскрытии выявлены следующие изменения, характеризующие вирусный гепатит Е кур: наряду с поражением печени – увеличение печени в 4-6 раз, жировая дистрофия с кровоизлияниями, увеличение селезенки, амилоидоз и инфаркты селезенки. 5. При вирусном гепатите Е, осложненном бактериальной микрофлорой и паразитарной инвазией, наряду с признаками, характерными для данного заболевания присутствуют изменения, присущие сопутствующим болезням. 6. При осложнении вирусного гепатита Е колибактериозом и кокцидиозом наряду со специфическими изменениями присутствуют признаки, характерные для колибактериоза и кокцидиоза (перитонит, некроз яйцеклеток, воспаление органов пищеварения, септическая селезенка, точечные кровоизлияния), 7. Гистологические исследования тимуса кур при вирусном гепатите Е выявили акцидентальную инволюцию тимуса. У кур при неосожненном вирусном гепатите Е имеет место некроз лимфоцитов и почти полное их отсутствие в мозговом веществе. 8. Для вирусного гепатита Е, осложненного колибактериозом, наряду с имеющимися изменениями фиксируется появление молодых телец Гассаля и их некроз. Для вирусного гепатита Е, осложненного колибактериозом и кокцидиозом, характерно почти полное отсутствие коркового вещества, прогрессивное разрушение лимфоцитов, большое количество телец Гассаля, часто в состоянии некроза, и гигантоклеточный метаморфоз, проявляющийся в появлении многоядерных клеток. 9. Гистологическими исследованиями селезенки выявлено, что для вирусного гепатита Е характерны апоптоз лимфоцитов, появление амилоидобластов, амилоидоз и некроз лимфоидных узелков, активная плазматизация красной пульпы, стенка кровеносных сосудов гомогенизирована и частично лизирована. 18 10. Для вирусного гепатита Е, осложненного колибактериозом, наряду с признаками гепатита Е, присутствует разрушение эритроцитов в красной пульпе. Для вирусного гепатита Е, осложненного колибактериозом и кокцидиозом, имеет место наличие всех вышеперечисленных признаков. 11. При осложненном течении вирусного гепатита Е бактериальной и паразитарной инфекцией гистологические изменения имеют ту же направленность с усугублением патогистологической картины. 12. При вирусном гепатите Е кур в органах иммунной системы происходят как разрушительные процессы, – некроз, апоптоз лимфоцитов, так и компенсаторные, – появление молодых телец Гассаля, плазматизация красной пульпы. 13. В морфогенезе вирусного гепатита ведущую играет губительное действие вируса на печень, поражая гепатоциты, а так же на органы иммунной системы, – селезенку и тимус. 6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 1. Разработаны Методические положения по вирусному гепатиту Е, которые предназначены для сотрудников научных учреждений, работников ветеринарных лабораторий, ветеринарных врачей птицеводческих хозяйств, птицеводов, фермеров, могут быть полезны лицам, интересующимся вопросами инфекционной патологии птиц. 2. Совокупность данных гематологических, биохимических показателей сыворотки крови и патологоанатомического вскрытия могут быть использованы в качестве диагностических тестов, предполагающих вирусный гепатит Е кур. 3. Основные положения диссертации могут быть использованы при проведении научных исследований, в учебном процессе вузов и колледжей биологического профиля, а также при составлении монографий, учебных и справочных пособий по диагностике вирусных заболеваний птиц. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Лапина, Т. И. Биохимические показатели сыворотки крови кур при «синдроме большой печени и селезенки» / Т. И. Лапина, О.И. Токарев // «Современные методы диагностики, профилактики и терапии заразных и незаразных болезней животных». Сб науч. ст. по материалам VΙ Международной научно-практ. конф. – Ставрополь: Агрус. – 2009 г. – С.3234. 2. Лапина, Т. И. Патологоанатомические изменения при подозрении на вирусный «синдром большой печени и селезёнки» у кур / Т. И. Лапина, О.И. Токарев // «Современные проблемы устойчивого развития агропромышленного комплекса России» Материалы VI Всероссийской дистанционной научно-практ. конф.студентов, аспирантов и молодых уч. – ДонГАУ, пос. Персиановский . 2009г. – С.59-62. 19 3. Токарев, О.И. Гематологические исследования при вирусном гепатите Е у кур / О.И.Токарев // «Научное обеспечение агропромышленного производства» Материалы Международной науч.-практич. конф., г. Курск. 2010г. – С.127-130. 4. Токарев, О.И. Гистологическая структура селезенки кур при вирусном гепатите Е / О.И.Токарев // «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» Материалы Международной науч.-практич. конф., г. Владикавказ. 2010г.– С.239-242. 5. Лапина, Т.И. Селезенка кур при вирусном гепатите Е / Т. И. Лапина, О.И. Токарев // «Диагностика, лечение и профилактика заболеваний сельскохозяйственных животных» Сборник научных трудов по материалам 74-й науч.-практ. конф., г. Ставрополь – 2010г. – С.61-63. *6. Лапина, Т.И. Исследование и диагностика вирусного гепатита Е / Т. И. Лапина, О.И. Токарев // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. Т.201. Материалы международной научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства» Казань – 2010г. – С.57-62. *7. Лапина, Т. И. Динамика морфологических изменений селезенки кур при вирусном гепатите Е / Т. И. Лапина, О.И. Токарев // Вестник Саратовского госагроуниверситета им.Н.И.Вавилова. 2010г. №9. – С.6-9. *8. Лапина, Т. И. Патогистологическая картина тимуса при вирусном гепатите Е кур / Т. И. Лапина, О.И. Токарев // Журнал «Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И.Вавилова». 2011г. №3. – С.20-22. 9. Лапина, Т.И. Патологоанатомическая картина при вирусном гепатите Е кур / Т. И. Лапина, О.И. Токарев, Е.Н. Юрченко, Н.А. Никулина // «Научное обеспечение инновационного развития отечественного животноводства». Материалы Всероссийской научно-практической конференции Новочеркасск – 2011г. – С.99-100. 10. Токарев, О.И. Открытие вируса гепатита Е кур и дифференциальная диагностика от других похожих заболеваний / О.И. Токарев // «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки». Материалы II-международной научно-практической конференции. Г. Владикавказ, 2011г. – С.448-450. 11. Лапина, Т. И. Патогистологическая картина тимуса и селезенки кур при вирусном гепатите Е / Т.И. Лапина, О.И. Токарев // «Современные проблемы патологической анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных» Сборник научных трудов по материалам 17-й Всероссийской научно- методической конференции по патологической анатомии животных Москва – 2011г. – С.71-74. 12. Диагностика вирусного гепатита Е кур: методические положения. А.И. Клименко, Т.И. Лапина, О.И. Токарев, Е.Е. Штехина, Е.Н. Юрченко, Н.А. Никулина, С.С. Дозорова, г. Новочеркасск, 2011. – 24 с. 20