М.И. Душкин МАКРОФАГИ И АТЕРОСКЛЕРОЗ
advertisement
УДК 616.12 М.И. Душкин МАКРОФАГИ И АТЕРОСКЛЕРОЗ: ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГУ НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск Обобщены данные исследования группы экспериментальных моделей атеросклероза последних 10 лет о роли макрофагов в развитии атеросклероза. Описаны 2 пути трансформации макрофагов в пенистые клетки: зависимый от модификации ЛНП и связанный с вовлечением провоспалительных цитокинов в повышении внутриклеточного синтеза липидов. Обсуждаются результаты изучения влияния оксистеролов in vivo и in vitro на накопление липидов и на изменение иммунных функций макрофагов. Кратко рассмотрены данные о фармакологических и иммунных подходах антиатерогенной терапии, направленной на изменение функциональной активности макрофагов. Ключевые слова: макрофаги, пенистые клетки, воспаление, оксистеролы, антиатерогенная терапия Введение По современным данным ВОЗ, ежегодно в мире от атеросклероза умирает около 50 млн человек. И это несмотря на широкое применение гиполипидемических, антиатерогенных препаратов и средств профилактики гипертонии. К 2015 году прогнозируется увеличение смертности от атеросклероза еще на 10%. ВОЗ определяет атеросклероз как «вариабельную комбинацию изменений внутренней оболочки (интимы) артерий, включающих накопление липидов, в основном холестерина и его эфиров, сложных углеводов, фиброзной ткани, компонентов крови, кальцификацию и сопутствующие изменения средней оболочки (медии)». Такое определение, к сожалению, односторонне. Оно описывает морфологическое строение зрелой бляшки и не соответствует современным представлениям о воспалительной и иммунной природе этого заболевания. Обзор литературы последнего десятилетия позволяет считать, что атеросклероз представляет собой разновидность хронического воспалительного или иммунного процесса в сосудистой стенке, ключевую роль в котором играют макрофаги, трансформированные из мигрирующих в субэндотелиальное пространство моноцитов крови [25]. Ведущую роль макрофагов демонстрируют эксперименты по развитию резистентности к атеросклерозу у мышей-накаутах по моноцитарному колониестимулирующему фактору и макрофагхемоаттрактантному фактору-1. Несмотря на выраженную гетерогенность по биохимическим, морфологическим и функциональным признакам стенозирующей бляшки, клеточный сценарий и стадии ее развития в доБЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №2 (120), 2006 г. статочной степени известны. На раннем этапе атерогенеза происходит активация эндотелия, который экспрессирует на своей поверхности адгезионные молекулы для моноцитов, нейтрофилов и лейкоцитов крови (т.к. ICAM, VCAM, ILAM) и продуцирует хемоаттрактанты (т.к. MCP-1 и др.), привлекающие моноциты в интиму сосудов. Вероятной причиной активации, морфологического и функционального изменений эндотелия считают различные атерогенные формы ЛНП, появление окисленных фосфолипидов, холестерина и жирных кислот, бактериальные и вирусные инфекции, сосудистые токсины, стимулирующие образование радикалов кислорода, апоптоз, и факторы, снижающие зависимую от эндотелия релаксацию. Моноциты, мигрирующие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги при участии многих транскрипционных факторов, среди которых ведущим считается ядерный каппа-В и AP-1. Литературные данные показывают, что дифференцировку и активацию макрофагов в сосудистой стенке при развитии атеросклероза могут осуществлять целый ряд соединений, обнаруженных в атеросклеротических бляшках. К ним относят иммунные стимуляторы (т.к. ЛПС, иммунокомплексы, белки теплового шока, факторы системы комплемента, лектины, вирусы), факторы роста, цитокины, окисленные липиды и липопротеины, тромбоцитарные факторы, активные радикалы кислорода, экосаноиды и некоторые белки. В свою очередь, активированные макрофаги интимы секретируют в субэндотелиальное пространство более ста активных молекул (факторы комплемента, коагуляционные факторы, простагландины, лейкотри47 Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты / с. 47-55 Прибор — «Милихром-2» Колонка — Nucleosil PR-18 Элюент — градиент концентрации — Н2О:метанол Скорость — 100 мкл/мин. Длина волн (нм) — 210, 220, 230, 240, 250 Рис. 1. Жидкостная хроматография высокого давления оксистеролов, экстрагированных из атеросклеротических коронарных сосудов человека ены, цитокины, оксигенные радикалы, хемокины, протеолитические энзимы). Показано, что макрофаги выступают как катализаторы образования окисленных ЛНП, миграции и пролиферации гладкомышечных клеток из мышечной оболочки в интиму. Частицы модифицированных ЛНП предпочтительно захватываются с помощью специфических рецепторов макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки—маркеры атеросклеротического повреждения. Причем фагоцитоз сопровождается активной презентацией новых антигенов, и клетки, работающие в режиме презентации новых антигенов, активно вырабатывают ИЛ-1-бета, ИЛ-6 и ТНФ-альфа и другие цитокины. Активированные макрофаги, продуцирующие металлопротеиназы и коллагеназу, в определенных ситуациях способствуют распаду коллагена в бляшке и возникновению такого грозного осложнения, как разрыв бляшки, образование тромба и развитие инфаркта миокарда. Таким образом, обосновано, что макрофаги играют ключевую роль в развитии атеросклеротических повреждений, а образование пенистых клеток позволяет воедино связать морфологические и биохимические признаки этого заболевания. Два пути накопления липидов в макрофагах Аккумуляция СХС и ЭХС в МФ является ключевым событием образования пенистых клеток. Исследование скорости эстерификации ХС и накопления СХС и ЭХС в перитонеальных МФ мыши при их инкубации с модифицированными по апоВ ацетилированными (Ац) ЛНП и окисленными (Ок) ЛНП, которые характеризуются модификацией как липидного, так и белкового компонентов ЛНП, позволило выявить различия в метаболизме этих двух видов модифицированных ЛНП. Инкубация МФ с АцЛНП приводила к быстрому (в течение 4-10 ч) увеличению включения С14-олеата в ЭХС и росту концентрации ЭХС в клетках. Известный лиганд скэвинджер рецепторов (СР) класса А декстран сульфат полностью блокировал стимулирующую способность АцЛНП, что демонстрирует доминирующую роль этих рецепторов в накоплении ЭХС при метаболизме модифицированных только по белку ЛНП. При инкубации МФ с эквивалентными количествами ОкЛНП наблюдалась менее значительная стимуляция синтеза ЭХС и их накопления, но более значительное увеличение содержания СХС. При этом декстран сульфат лишь частично (на 30-50%) препятствовал индукции синтеза ЭХС, что свидетельствует о включении в метаболизм ОкЛНП рецепторов, отличных от СР класса А. В настоящее время известно 6 белковых рецепторов, через которые идет нерегулируемый захват ХС в макрофаги (Таблица 1). Как видно из таблицы, АцЛНП проявляют аффинность к СР класса А и СР эндотелиальных клеток, в то время как ОкЛНП способны связываться не только со СР, но и другими рецепторами. Другой альтернативный путь накопления липидов в МФ связан с реакцией этих клеток на Таблица 1 Макрофагальные и эндотелиальные рецепторы, связывающие модифицированные ЛНП Рецепторы СР класса А, типа I и II CD36 CD68 Лектин-подобные Р для ОкЛНП СРЭК СР-PSOX 48 Лиганды Клетки, экспрессирующие рецепторы ОкЛНП, АцЛНП, длинноцепочные жирные МФ, гладкомышечные клетки кислоты ОкЛНП, длинно- цепочные жирные кислоты МФ, моноциты, тромбоциты, гладкомышечные клетки ОкЛНП МФ, нейтрофилы, тучные клетки ОкЛНП МФ, гладкомышечные клетки АцЛНП эндотелиальные клетки ОкЛНП МФ БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №2 (120), 2006 г. Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты / с. 47-55 Таблица 2 Влияние нативных и АцЛНП на включение С14-олеата в ЭХС, ТГ и ФЛ МФ мышей, полученных через 24 ч после в/б введения зимозана (M±m) Условия эксперимента Контроль Зимозан Контроль Зимозан Контроль Зимозан Условия инкубации Без липопротеинов ЛНП АцЛНП Включение меченого олеата в ЭХС в нМ эстерифицированного олеата/мг белка/4 ч ЭХС ТГ ФЛ 1,43±0,13 7,9±0,54 3,27±0,17 14,8±2,1* 92,6±9 2,07* 6,37±0,32 2,54±0,18 7,87±0,11 3,61±0,46 22,2±2,3* 62,1±0,24 7,03±0,91* 23,7±0,17 6,43±1,64 4,62±0,39 48,3±4,24* 48,2±2,1* 7,39±0,91* Примечание. * — различия по сравнению с контролем достоверны (р < 0,01) различные воспалительные стимулы. Известно, что воспаление вызывает специфические изменения метаболизма липидов и ХС в различных тканях и клетках, включая МФ [26]. Нами впервые на оригинальной модели асептического воспаления в брюшной полости мышей, вызванного введением зимозана, было показано образование пенистых клеток из ПМФ независимо от присутствия модифицированных ЛНП [11]. В результате исследования было обнаружено, что через 18-24 ч после введения зимозана в МФ наблюдалось драматическое увеличение (в 10-13 раз!) включения С14-олеата в ЭХС и ТГ и 5-кратное увеличение синтеза ФЛ. Через 72 и 120 ч выявлено снижение этих показателей, величина которых, однако, в 3-4 раза превышала контрольный уровень. Окраска МФ жировым красным показала наличие многочисленных липидных включений, характерных для пенистых клеток. Инкубация МФ, полученных через 24 ч после введения зимозана, с АцЛНП или нативных ЛНП приводила к дополнительному 2-кратному увеличению синтеза ЭХС, но не ТГ, и к 2-кратному увеличению синтеза ФЛ (Таблица 2). Полученные результаты свидетельствуют, что в активированных in vivo МФ происходит значительное увеличение синтеза липидов в отсутствие липопротеинов, и дальнейший рост накопления ЭХС может происходить в присутствии не только модифицированных, но и нативных ЛНП. Полученные нами данные согласуются с недавно опубликованным сообщением [27] об экспрессии рецепторов к ЛНП при инкубации МФ с бактериальным ЛПС. Наши дальнейшие исследования [5, 18] показали, что преинкубация резидентных неактивированных МФ с перитонеальным экссудатом и сывороткой крови, полученных через 24 ч после введения зимозана, вызывает, хотя и менее выраженную в количественном отношении, активацию включения С14-олеата в ЭХС и ТГ, что позволило предполагать участие воспалительных медиаторов в активации синтеза липидов. Стимулирующий дозозависимый эффект на синБЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №2 (120), 2006 г. тез ЭХС и ТГ в МФ наблюдался также после 24 ч преинкубации клеток с рекомбинантными ФНО-α и ИЛ-1β, а также с кондиционными средами, полученными от активированных бактериальным ЛПС и митогенами МФ и лимфоцитов соответственно. Подобные данные о усилении синтеза и накопления липидов в клетках были получены зарубежными исследователями на культуре моноцитарных линий в присутствии ЛПС [28, 30]. Таким образом, трансформация макрофагов в пенистые клетки может включать по меньшей мере два механизма. Один из них связан с окислительной модификацией ЛНП, а другой — с действием провоспалительных цитокинов. В активной атеросклеротической бляшке, по-видимому, реализуются оба механизма образования пенистых клеток, так как оба они зависят от степени выраженности воспалительного процесса. Необходимо добавить, что в настоящее время молекулярные механизмы изменения липидного метаболизма при действии провоспалительных медиаторов рассматриваются с участием ядерных гормональных рецепторов (PPAR, LXR, RAR и др.), от активности которых зависят одновременно и изменения метаболизма липидов, и иммунный статус клеток [29]. Участие оксистеролов в накоплении липидов в МФ Известно, что окисление ЛНП сопровождается образованием аутоокисленных форм холестерина (оксистеролов). Наши исследования методом ЖХВД стероидного состава ОкЛНП выявили присутствие оксистеролов (7-кетоХС, 7β-гидроксиХС и 5,6-эпоксиХС), среди которых доминирующим оказался 7-кетоХС (75-80% от общих оксистеролов), что согласуется с литературными данными. В АцЛНП детектируемых концентраций оксистеролов не было обнаружено. Инкубация ПМФ со стероидной фракцией, экстрагированной из ОкЛНП, но не из АцЛНП, подобно самим ОкЛНП, приводила не только к повышению концентрации ЭХС, но и СХС и сфингомиелина (СМ). При добавлении в среду 49 Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты / с. 47-55 инкубации, содержащую АцЛНП, коммерческих 7-кетоХС, 7β-оксиХС, 5,6-эпоксиХС или 25-гидроксиХС сопровождалось увеличением концентрации СМ и СХС в МФ. В то же время 7-кетоХС и в меньшей мере 25-гидроксиХС ингибировали деградацию I125-АцЛНП, но оба стерола не оказывали влияния на активность лизосомной ХЭазы в МФ. Т.к. известно, что мембранный СМ препятствует освобождению СХС в цитоплазму, полученные результаты позволяют предполагать, что повышение уровня оксистеролов при метаболизме ОкЛНП обусловлено их ингибирующим действием на Смазу по аналогии с болезнью Нимана-Пика (врожденный дефицит Смазы), при которой происходят накопление уровня СХС и СМ и снижение скорости эстерификации ХС в клетках. Общий механизм этого феномена может быть представлен следующим образом: а) захват и транспорт ОкЛНП в лизосомы; б) ингибирование Смазы оксистеролами ОкЛНП в) накопление СМ , который связывает СХС г) повышение уровня СХС в лизосомах, нарушение его транспорта в цитоплазму, и, как следствие, снижение скорости его эстерификации. Результаты наших исследований [9] влияния коммерческих оксистеролов на скорость образования ЭХС и ТГ в отсутствие липопротеинов в культивируемых макрофагах показали, что по своей способности к индукции оксистеролы располагаются в следующей последовательности: 27-ОНХС = 25-ОНХС > 7β-ОНХС > 7кетоХС = 22-кетоХС > 5,6-эпоксиХС. Добавление АцЛНП в среду, содержащую оксистеролы, не приводило к добавочному увеличению скорости эстерификации ХС. 7-кетоХС и 5,6-эпоксиХС (аутоокисленные формы стеролов), но не 25-ОНХС и 27-ОНХС (присутствующие in situ), стимулировали включение олеата в ТГ МФ, в то время как ингибитор АХАТ 22(R)-ОНХС снижал включение олеата в ЭХС и повышал его включение в ТГ. Способность некоторых оксистеролов, таких, как 25- и 27-ОН, которые присутствуют в макрофаг/пенистых клетках и являются продуктами митохондриальной 27-гидроксилазы, наиболее эффективно стимулировать синтез ЭХС приводит к мысли о их участии в регуляции активности АХАТ. Для проверки этого предположения исследовано влияние кетоконазола, ингибитора монооксигеназ, и в том числе 27-гидроксилазы, на скорость эстерификации ХС в присутствии АцЛНП или 25-ОНХС[3]. Результаты исследований на культуре МФ показали, что кетоконазол дозозависимо ингибирует стимулированную АцЛНП эстерификацию ХС. Однако при инкубации клеток с 25-ОНХС кетоконазол не оказывал влияния на синтез ЭХС. Эти данные позволили предполагать, что сам ХС 50 не является стимулятором АХАТ, а его активирующее действие на фермент реализуется после его гидроксилирования в положении 25, 26 или 27 в митохондриях. Участие оксистеролов в накоплении ХС в МФ продемонстрировано нами в экспериментах in vivo на крысах и кроликах [10, 11], кормленных диетой, включающей окисленный при термической обработке ХС (содержание оксистеролов около 13%). Результаты исследований показали, что перитонеальные МФ, полученные у животных, кормленных окисленным ХС, обладали значительно более высокой скоростью эстерификации ХС и содержали более высокие концентрации ЭХС и СХС, чем МФ животных, получавших перекристаллизованный ХС. Хотя окисленный ХС не вызывал существенных различий в уровне ХС и ЛП в крови по сравнению с чистым ХС, инкубация резидентных МФ с ЛОНП и ЛНП, выделенными из крови животных, кормленных окисленным ХС в значительно большей степени стимулировала синтез ЭХС и вызывала повышение внутриклеточного уровня ХС. Полученные результаты свидетельствуют, что присутствие оксистеролов в диете является проатерогенным фактором, стимулирующим образование макрофаг/пенистых клеток. Изменение количественного и качественного состава оксистеролов в динамике развития атеросклеротических бляшек Показано, что в макрофаг/пенистых клетках, выделенных из атеросклеротических бляшек человека и кролика, присутствуют высокие концентрации оксистеролов [7]. С целью изучения накопления различных оксистеролов и определения их роли в последовательных стадиях развития атеросклероза было исследовано 16 образцов атеросклеротической и нормальной ткани коронарных артерий, полученных во время операции аорто-коронарного шунтирования у пациентов с коронарным атеросклерозом. Образцы, согласно гистологическим исследованиям, проведенным в НИИПК им. Е.Н. Мешалкина, классифицировали на 3 типа: 1) без признаков атеросклероза; 2) атеросклероз на стадии «липидного пятна»; 3) атеросклеротические фиброзные бляшки. Результаты исследования липидного состава представлены в таблице 2. Они свидетельствуют, что в нормальной ткани коронарной артерии наблюдается низкий уровень свободного ХС (9,5±0,8 мкг/мг белка) и практически отсутствуют эфиры ХС (ЭХС). В образцах на стадии «липидного пятна» и фиброзной бляшки отмечается прогрессивный рост уровня СХС в 2,5 и 6,6 раза соответственно в сравнении с нормальной тканью. Содержание эфиров ХС на стадии липидного пятна сразу БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №2 (120), 2006 г. Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты / с. 47-55 Таблица 3 Содержание оксистеролов, ХС и его эфиров на разных стадиях развития атеросклеротического поражения Наименование образцов Нормальная ткань (n=5) Липидное пятно (n=5) Фиброзная бляшка (n=6) Содержание ХС, мкг/мг белка СХС ЭХС 9,5±0,8 н.д. 24,0±6,3 163,0±24,0 63,0±9,9* 449,0±79,0* Содержание оксистеролов, мкг/мг ХС 7-кето-ХС 27-ОН-ХС н.д. 0,06±0,0 0,4±0,04 1,3±0,2 2,4±0,40* 2,6±0,3* Примечание: * — достоверность различий по сравнению с липидным пятном, (p<0,05), н.д. — не детектировались. БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №2 (120), 2006 г. продукта ферментативного гидроксилирования — на иммунные функции МФ. Результаты, представленные на рисунке 2, показывают, что преинкубация макрофагов с ХС, оксистеролами или аторвастатином в течение 24 ч снижала ЛПС-индуцируемую секрецию ФНО-α в отсутствие мевалоновой кислоты. Наибольшую способность к ингибированию ЛПС-индуцируемой секреции ФНО-α проявлял 25-гидроксиХС, который снижал уровень ФНО до 13%. 27-гидроксиХС и ХС в этих условиях снижали секрецию ФНО-α до 61 и 64,5% соответственно. 7-кетоХС оказывал наименьший эффект на ЛПС-индуцированную секрецию ФНО-α, снижая этот показатель до 82% (р=0,05). Селективный ингибитор ГМГ КоА редуктазы аторвастатин в концентрации 5 мкМ в 5 раз ингибировал секрецию ФНО-α в присутствии ЛПС. Присутствие мевалоновой кислоты в концентрации 1 мМ в среде преинкубации макрофагов отменяло ингибирующий эффект аторвастатина, возвращая ЛПС-индуцируемую секрецию ФНО-α до контрольного уровня. Так как известно, что исследуемые нами оксистеролы в концентрации 5 мкг/мл способны значительно ингибировать синтез ХС за счет снижения экспрессии без мевалоната с мевалонатом 140 120 100 80 60 40 20 О РВ А Н АТ 25 -О Н -О 27 ет о 7к ХС ЛП ЛП бе з С 0 С Продукция TNF-alfa, в % от контроля очень высокое и увеличивается в процессе развития фиброзной бляшки еще в 2,8 раз (p<0,05). В образцах нормальной ткани было обнаружено присутствие только 27-ОН-ХС в низкой концентрации (Таблица 2), в то время как другие оксистеролы не детектировались. На стадии «липидного пятна» отмечался 22-кратный рост концентрации 27-ОН-ХС в ткани и появление относительно низких концентраций 7-кето-ХС. На стадии фиброзной бляшки наблюдалось дальнейшее повышение в 2 раза концентрации 27-ОНХС и появление значительной концентрации 7кето-ХС (2,4±0,4), в 6 раз превышающей таковую на стадии «липидного пятна». Различия между стадиями липидного пятна и фиброзной бляшки были статистически достоверны (p<0,05). Таким образом, в процессе развития атеросклеротического поражения от липидного пятна к фиброзной бляшке уровень 27-ОН-ХС увеличивается в 2 раза, а содержание 7-кето-ХС повышается в 6 раз, что свидетельствует об изменении отношения между этими оксистеролами. Так, на ранних стадиях развития атеросклеротического очага наблюдается более низкое содержание аутоокисленных форм холестерина по отношению к продуктам ферментативного гидроксилирования холестерина (27-ОН-ХС:7-кето-ХС=3:1). На поздних стадиях развития атеросклеротического очага соотношение этих оксистеролов выравнивается (27-ОН-ХС:7-кето-ХС=1:1). Полученные данные позволяют предполагать, что на ранних стадиях развития атеросклеротической бляшки в основном происходит образование внутриклеточных форм гидроксилированного ХС, тогда как на более поздних стадиях образуются как аутоокисленные, так и энзиматически гидроксилированные формы оксистеролов. Влияние оксистеролов на иммунные функции МФ Поскольку оксистеролы проявляют широкий спектр биологической активности и некоторые из них (22-, 25-, 27-ОН ХС) являются лигандами яденого фактора LXR, принимающего участие в регуляции и липидного метаболизма, и иммунных функций, мы исследовали влияние двух представителей оксистеролов — 7-кетоХС — как продукта аутоокисления ХС и 25-ОНХС — как Рис. 2. Влияние оксистеролов и аторвастатина на ЛПС-индуцированную секрецию ФНО-α перитонеальными мышиными макрофагами, инкубированными в присутствии и отсутствие 1 мМ мевалоновой кислоты (М±m, n=6). Черные столбцы — клетки, инкубированные в отсутствие мевалоновой кислоты. Полые столбцы — клетки, инкубированные в присутствии 1 мМ мевалоной кислоты 51 Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты / с. 47-55 гена ГМГ КоА редуктазы, мы также исследовали влияние мевалоновой кислоты на способность оксистеролов подавлять секрецию ФНО-α (Рис. 2, полые столбцы). Оказалось, что мевалоновая кислота отменяет ингибирующий эффект ХС и 7-кетоХС. В то же время 25-гидроксиХС и 27-гидроксиХС сохраняли способность снижать ЛПС-индуцированную секрецию ФНО-α при добавлении мевалоновой кислоты в среду преинкубации макрофагов, достоверно снижая уровень ФНО-α до 13,5 и 62,2% соответственно. Данные экспериментов, демонстрирующие влияние оксистеролов и аторвастатина на ЛПСиндуцированную секрецию ИЛ-10 макрофагами, представлены на рис. 3. В условиях отсутствия мевалоновой кислоты аторвастатин достоверно повышал секрецию ИЛ-10 на 41%, и росту уровня ИЛ-10 не препятствовало добавление в среду преинкубации мевалоновой кислоты. Оксистеролы и ХС оказывали ингибирующее действие на секрецию ИЛ-10 в отсутствие в среде инкубации мевалоновой кислоты. 25-гидроксиХС и 7-кетоХС снижали уровень ИЛ-10 в среде до 48 и 55% соответственно. Значимый ингибирующий эффект на ИЛ-10 выявлялся в присутствии ХС (снижение на 40%), в то время как 27-гидроксиХС оказывал относительно слабое влияние, снижая секрецию ИЛ-10 на 35%. Добавление мевалоновой кислоты приводило к подъему уровня ИЛ-10 в среде инкубации макрофагов с 25-гидроксиХС и ХС на 22 и 15% соответственно, но не оказывало влияния на ингибирующий эффект 7-кетоХС и 27-гидроксиХС. Повышение уровня ИЛ-10 рассматривается в литературе как антиатерогенный фактор, спобез мевалоната с мевалонатом 180 Продукция ИЛ-10, в % от контроля 160 140 120 100 80 60 40 20 Н РВ А АТ О -О 25 Н 27 -О о ке т ХС С ЛП 7- бе з ЛП С 0 Рис. 3. Влияние оксистеролов и аторвастатина на ЛПС-индуцированную секрецию ИЛ-10 перитонеальными мышиными макрофагами, инкубированными в присутствии и отсутствие 1 мМ мевалоновой кислоты (М±m, n=6). Черные столбцы — клетки, инкубированные в отсутствие мевалоновой кислоты. Полые столбцы — клетки, инкубированные в присутствии 1 мМ мевалоновой кислоты. 52 собствующий стабилизации атеросклеротической бляшки. Недавно было показано, что симвастатин повышает уровень антивоспалительного цитокина ИЛ-10 в крови у пациентов с нестабильной стенокардией. Вместе с тем для оценки активности макрофагов при развитии атеросклероза важно определить, как изменяется баланс про- и антивоспалительных цитокинов. Как видно из таблицы, аторвастатин вызывал повышение отношения ИЛ-10/ФНО-α в 13,5 раза в условиях активации макрофагов ЛПС, и это повышение нивелировалось мевалоновой кислотой. Полученные данные свидетельствуют, что 25-гидроксиХС повышает отношения ИЛ-10/ФНО-α в 3,7 и 4,45 раза как в присутствии, так и в отсутствие мевалоновой кислоты. Атерогенный продукт аутоокисления ХС окисленных липопротеинов низкой плотности 7-кетоХС снижал данное соотношение на 30%, и мевалоновая кислота также не оказывала влияния на величину этого показателя. Таким образом, можно заключить, что 25-гидроксиХС проявляет способность смещать баланс про-/антивоспалительные цитокины в сторону последних, в то время как 7-кетоХС оказывает противоположный эффект при активации макрофагов ЛПС. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что механизмы влияния 7-кетоХС и 25-гидроксиХС на секрецию цитокинов макрофагами не связаны с ингибированием ГМГ КоА редуктазы. Так как 25-гидроксиХС является природным лигандом ядерных печеночных Х рецепторов (LXR), активация которых приводит к ингибированию экспрессии генов воспалительных цитокинов [29], можно предполагать, что антивоспалительный эффект 25-гидроксиХС реализуется через активацию LXR макрофагов. Исследования влияния оксистеролов на ЛПСстимулированную экспрессию мРНК цитокинов в культуре МФ показали, что 25-ОНХС ингибирует экспрессию ИЛ-1β и ФНО-α, в то время как 7-кетоХС проявляет противоположный стимулирующий эффект [16]. Более того, нами было обнаружено, что толерантные по отношению к ЛПС макрофаги содержат повышенное внутриклеточное содержание 25- и 27-гидроксиХС-7-кетоХС, но не 25-ОНХС, снижая ЛПС-индуцированную генерацию активных метаболитов кислорода в МФ [15, 24]. Оба оксистерола в равной степени подавляли активность Fc-рецепторов и связанных с ними фагоцитоз-опсонизированных эритроцитов барана. В результате наших исследований было также обнаружено, что оксистеролы подавляют некоторые функции лимфоцитов [4, 15, 24], связанные с МФ-лимфоцитарными взаимодействиями при воспалении. 25-ОНХС уже в концентрации 0,5 мкг/мл и 7-кетоХС в более выБЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №2 (120), 2006 г. Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты / с. 47-55 соких концентрациях (2 мкг/мл) ингибировали продукцию γ-интерферона в кон-А-активированных спленоцитах мыши. Оба эти стерола ингибировали пролиферацию лимфоцитов и продукцию Iа-индуцирующего фактора в смешанной культуре лимфоцитов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что оксистеролы могут выступать как медиаторы иммунных функций МФ и лимфоцитов в атеросклеротических бляшках, оказывая влияние и на хронизацию, и на обострение воспалительного процесса. Фармакологические и иммуннотерапевтические подходы регрессии атеросклероза и обратного развития пенистых клеток На основании патофизиологических механизмов можно предложить комплексный подход протекции образования и регрессии пенистых клеток. Исследования показали, что этот подход включает: а) стимуляцию выведения избыточного холестерина из макрофагов антагонистами кальция (верапамил, нифедипин) [6, 8, 22], стимуляторами аденилатциклазной системы различными формами цАМФ, ингибиторами АХАТ , б) снижение реактивности макрофагов при действии статинов, стимуляторов ядерного фактора LXR (некоторых оксистеролов) и природными монотерпенами [в печати] и в) протекцию образованию макрофагзависимого окисления ЛНП природными и синтетическими антиоксидантами [1, 2, 13, 14, 17, 19, 20, 23]. Принципы фармакологической и нефармакологической коррекции атеросклероза, связанной с функциями МФ, представлены в таблице 4. В цикле работ на моделях окисления ЛНП, культуры макрофагов и CCL4-гепатита у мышей были изучены около 30 различных фенольных соединений, синтезированных на кафедре химии Государственного педагогического университета. Важно подчеркнуть, что эти соединения содержали помимо пространственно затрудненных фенольных групп атомы двухвалентной серы, которые значительно усиливали антиоксидантный эффект. При этом соединения были растворимы в воде, что значительно повышало их фармакологическую ценность. Среди этих соединений были отобраны наиболее эффективные и малотоксичные, что позволило их рекомендовать для клинических испытаний. При исследовании в клинике природных антиоксидантов и фармакологических гиполипидемических препаратов был разработан адаптированный для клинических лабораторий тест определения резистентности ЛНП к окислению. Используя этот тест, в отдельном цикле работ установлены новые свойства фармакологических препаратов и биологически активных добавок. Исследования антиатерогенной активности четырех природных монотерпенов и синтетического производного резорцина кариофиллена, синтезированного в Новосибирском Институте органической химии СО РАН, показали, что эти соединения обладают подобным статинам плейотропным эффектом, то есть ингибируют синтез ХС на посттранскрипционном уровне и одновременно снижают продукцию провоспалительных цитокинов активированными моноцитами и пролиферацию Т-лимфоцитов. Новым подходом в профилактике и лечении атеросклероза является создание рекомбинантной комбинированной Таблица 4 Фармакологические и нефармакологические подходы коррекции атеросклероза, направленные на модификацию функций МФ Антиатерогенные препараты Стимуляторы цАМФ-системы Антагонисты кальция Механизмы действия, связанные с функциями МФ Активация цитоплазматической ХЭазы, снижение ЭХС и повышение выхода ХС из МФ Ингибирование синтеза ЭХС, генерации активных форм кислорода, активация цитоплазматической ХЭазы, усиление вывода ХС из МФ Протекция окисления ЛНП МФ Природные и синтетические фенольные соединения Лиганды к ядерным гормональным рецепторам: Нормализация липидного обмена, повышение вывода ХС из МФ, снижение Агонисты cемейства LXR, PPAR и RXR продукции провоспалительных медиаторов МФ Статины Прямое ингибирование ГМГ КоА редуктазы, снижение пула изопреноидов, снижение продукции провоспалительных медиаторов МФ Природные и синтетические монотерпеноиды Снижение активности ГМГ КоА редуктазы на посттранскрипционном уровне, снижение пула изопреноидов, снижение продукции провоспалительных медиаторов МФ, отмена вызываемой статинами экспрессии мРНК и белка ГМГ КоА редуктазы Вакцина к ЭХС-переносящему белку Окисленному апо В Снижение уровня ЛНП в крови Белкам теплового шока Снижение окислительной модификации ЛНП Макрофаг-хемоаттрактантному фактору-1 Снижение продукции провоспалительных и повышение антивоспалительных медиаторов МФ Снижение миграции моноцитов в субэндотелиальное пространство пораженных атеросклерозом сосудов БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №2 (120), 2006 г. 53 Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты / с. 47-55 вакцины к белкам, играющим ключевую роль в атерогенезе. В настоящее время совместно с ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН и ГНЦ Вектор (п. Кольцово) начата работа над созданием вакцины, которая содержит фрагменты модифицированного апопротеина В, эфирпереносящего белка, белка теплового шока-65 и хемоаттрактанта MCP-1. В настоящее время изучение антиатерогенных свойств подобных вакцин проводится только в США, и это направление лечения атеросклероза представляется многообещающим для клинической практики. MACROPHAGE AND ATHEROSCLEROSIS: PATHOPHYSIOLOGICAL AND THERAPEUTIC ASPECTS M.I. Dushkin The 10-year data of investigations of the laboratory of atherosclerosis experimental models concerning the macrophage role in atherosclerosis development are summarized. 2 pathways of transformation of macrophage into foam cells are described: a) modified LDL-dependent and b) binding with involvement of in intracellular lipid synthesis increase. The results of the study in vivo and in vitro of oxysterol influence on lipid accumulation and immune function changes of macrophages are discussed. The date of drug and immune macrophage-target anti-atherogenic therapy is reviewed in brief. Литература 1. Антиокислительная и гепатопротекторная активность водорастворимых 4-пропилфенолов, содержащих гидрофильные группы в алкильной цепи / Н.В. Кандалинцева, О.И. Дюбченко, Е.И. Терах и др. // Хим.-фарм. журн. — 2002 — Т. 36. — № 4. — С. 13-15 2. Влияние антиоксиданта «тиофан» на параметры окислительного стресса при ишемической болезни сердца / И.А. Бахтина, Е.В. Антипьева, А.Е. Просенко и др. // Бюллетень СО РАМН. — 2000. — № 3-4. — С. 24-29 3. Влияние ингибитора монооксигеназ кетоконазола на эстерификацию холестерина в перитонеальных макрофагах / М.И Душкин, А.В. Долгов, Е.В. Мандрикова и др. // Биохимия. — 1990. — Т. 55. — № 9 — С. 1607-1614. 4. Влияние окисленных производных холестерина на лимфокинстимулированную дифференцировнку макрофагов и первичную аллогенную смешанную культуру лимфоцитов человека / М.И Мусатов., М.И. Душкин., Н.Н Вольский и др. // Бюлл. эксперим. биол. мед. — 1997. — Т. 124. — № 12. — С. 655-657. 5. Влияние цитокинов на синтез липидов в макрофагах / М.И. Душкин, О.М. Перминова, А.Ф. Сафина, Н.Н. Вольский // Журнал микробиол. эпидимиол. иммунол. — 2000. — № 6. — С. 52-56. 6. Душкин М.И. Влияние дибутирил циклического АМФ, верапамила и адреналина на мобилизацию холестерина из макрофагов / М.И. Душкин, Е.В. Мандрикова, А.В. Долгов // Фармакол. и токсикол. — 1990. 54 — Т. 53. — № 4. — С. 44-46. 7. Душкин М.И. Биологическая роль окисленных производных холестерина в клетках млекопитающих / М.И. Душкин // Успехи совр. биологии. — 1991. — Т. 111. — № 6. — С. 845-857. 8. Душкин М.И. Метаболизм эфиров холестерина в макрофагах при воздействии антагонистов кальция верапамила и нифедипина / М.И Душкин., М.В. Иванова // Биохимия. — 1991. — Т. 56. — № 5. — С. 812-819. 9. Душкин М.И. Эстерификация окисленных продуктов холестерина и их влияние на скорость эстерификации холестерина в макрофагах / М.И. Душкин, Е.В. Мандрикова, А.В. Долгов // Вопр. мед. химии. — 1991. — Т. 37. — № 3. — С. 2-5. 10. Душкин М.И. Эстерификация холестерина в тканях и изменение апопротеидного спектра в плазме крыс при воздействии автоокисленного холестерина / М.И. Душкин, Л.М. Поляков, А.В. Долгов // Вопр. мед. химии. — 1991. — Т. 37. — № 5. — С. 9-12. 11. Душкин М.И. Биосинтез липидов и метаболизм нативных и ацетилированных липопротеидов низкой плотности в макрофагах, стимулированных зимозана in vivo и in vitro / М.И. Душкин., Е.Н.,Корнюш, Л.М. Поляков и др. //Биохимия. — 1992. — Т. 57. — № 8. — С. 1181-1191. 12. Душкин М.И. Влияние кетоконазола на активность ключевых ферментов биосинтеза холестерина и его эфиров в печени крыс, содержащихся на холестериновой диете / М.И. Душкин, М.В. Иванова // Украинский биохим. журнал. — 1992. — Т. 64. — № 3. — С. 73-76. 13. Душкин М.И. Влияние природных полифенольных соединений на окислительную модификацию липопротеидов низкой плотности / М.И. Душкин, А.А. Зыков, Е.Н. Пивоварова // Бюлл. экспер. биол. мед. — 1993. — Т. 116. — № 10. — С. 1251-1253. 14. Душкин М.И. Влияние ингибиторов цитохрома Р450 на окислительную модификацию липопротеидов низкой плотности в макрофагах / М.И. Душкин, Н.К. Зенков, Е.Б. Меншикова и др. // Вопр. мед. химии. — 1996 — Т. 42. — № 1. — С. 23-29. 15. Душкин М.И. Иммунодепрессивный эффект оксистеролов / М.И Душкин., Я.Ш. Шварц, Н.Н. Вольский и др. // Иммунология. — 1998 — № 1. — С. 21-24. 16. Душкин М.И. Влияние оксистеролов на экспрессию генов воспалительных цитокинов и их содержание в макрофагах, толерантных к эндотоксину / М.И. Душкин, Е.Е. Верещагин, А.Ю. Гребенщиков и др. // Бюлл. экперим. биол. мед. — 1999. — Т. 127. — № 1. — С. 71-74. 17. Ингибирование мелатонином окисления липопротеидов низкой плотности / Н.К Зенков., М.И. Душкин, Е.Б. Меньщикова и др. // Бюллетень экспер. биол. мед. — 1996 — Т. 122. — № 10. — C. 399-402. 18. Перминова О.М. Влияние цитокинов на метаболизм холестерина в макрофагах / О.М Перминова, Н.Н. Вольский, М.И. Душкин // Система цитокинов: теоретические и клинические аспекты / Под ред. В.А. Козлова, С.В. Сенникова. — Новосибирск, 2004 — С. 109-121. 19. Синтез и антиокислительная активность новых водорастворимых солей 3-(4-оксифенил)пропил-изотиурония и -аммония / Н.В. Кандалинцева, О.И. ДюбБЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №2 (120), 2006 г. Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты / с. 47-55 ченко, А.Е. Просенко и др. // Хим.-фарм. журн. — 2001. — Т. 35. — № 3. — С. 22-25. 20. Синтез и исследование антиокидантных свойств новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений / А.Е. Просенко, С.Ю. Клепикова, Н.В. Кандалинцева и др. // Бюллетень СО РАМН. — 2001. — № 1. — С. 114-119. 21. Carboxymethylated beta-1,3-glucan inhibits the binding and degradation of acetylated low density lipoproteins in macrophages in vitro and modulates their plasma clearence in vivo / M.I. Dushkin, A.F. Safina, E.I. Vereshagin, Y.Sh. Shwartz // Cell Biochemistry and Function. — 1996. — Vol. 14. — P. 209-217. 22. Dushkin M.I. Effect of verapamil and nifedipine on cholesteryl ester metabolism and low density lipoprotein oxidation in macrophages / M.I. Dushkin, Y.Sh. Schwartz // Biochem.Pharmacol. — 1995. — Vol. 49. — № 3. — P. 389-397. 23. Dushkin M.I. Ketoconazole inhibits oxidative modification of low density lipoprotein / M.I. Dushkin, N.K Zenkov, E.B. Menshikova, et al. // Atherosclerosis. — 1995. — Vol. 114. — P. 9-18. 24. Dushkin M.I. Effects of oxysterols upon macrophage and limphocyte function in vitro / M.I. Dushkin, Ya.Sh. Schwartz, E.I. Vereschagin et al. // Prostaglandins and other lipid mediators. — 1998. — Vol. 55. — № 4. — P. 219-239. БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №2 (120), 2006 г. 25. Getz G.S. Thematic review series: the immune system and atherogenesis. Immune function in atherogenesis / G.S. Getz // J. Lipid Res. — 2005. — Vol. 46. — P. 1-10. 26. Khovidhunkit W. Effects of infection and inflammation on lipid and lipoprotein metabolism: mechanisms and consequences to the host / W Khovidhunkit., M.-S. Kim, R.A. Memon // J. Lipid Res. — 2004. — Vol. 45. — P. 11691196. 27. Kruth H.S. Macrophage foam cell formation with native LDL / H.S. Kruth, W. Huang, I. Ishii // J. Biol. Chem. — 2005 — Vol. 277. — P. 34573-34580. 28. Lipopolysaccharide stimulation of RAW 264.7 macrophages induces lipid accumulation and foam cell formation / J.L Funk, K.R Feingold, A.H. Moser, C. Grunfeld // Atherosclerosis. — 1993. — Vol. 98. — P. 67-82. 29. Nuclear receptors and lipid physiology: opening the X-files/ A. Chawla, J.J. Repa, R.M. Evans, D.J. Mangelsdorf // Science. — 2001. — Vol. 294. — P. 1866-1870. 30. Oiknine J. Increased susceptibility to activation and increased uptake of low density lipoprotein by cholesterolloaded macrophages / J. Oiknine, M. Aviram // Arterioscler. Thromb. — 1992. — Vol. 12. — P. 745-753. 31. Vereschagin E.I. Soluble glucan protects against endotoxin shock in the rat: the role of the scavenger receptors / E.I. Vereschagin, A.A. van Lambalden, M.I. Dushkin, et al. / /Schok. — 1998. — Vol. 9. — № 3. — P. 193-198. 55
