ЭУ- И ГЕТЕРОХРОМАТИН РАЗЛИЧАЮТСЯ ТОПОЛОГИЕЙ ДНК
реклама
ЭУ- И ГЕТЕРОХРОМАТИН РАЗЛИЧАЮТСЯ ТОПОЛОГИЕЙ ДНК А.Д.Груздев Сектор генетики клеточного цикла Институт цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, просп. ак. Лаврентьева, 10 тел.: (3832) 33–23–27, факс: (3832) 33–12–78 еmail: [email protected] Изложена гипотеза, объясняющая известные свойства гетерохроматина: плотную упаковку ДНК, транскрипционную неактивность, склонность к агрегации (липкость), эффект положения гена. В основе гипотезы лежит предположение о том, что молекулы ДНК в гетерохроматине топологически разомкнуты и содержат однонитевые разрывы в участках с одинаковой или близкой последовательностью оснований. Введение Предположение Хайтца о том [1], что введенные им термины «эухроматин» и «гетерохроматин» обозначающие генетически активный и, соответственно, генетически неактивный компонент клеточного ядра подтверждено 70-летним развитием науки. При этом изучение эухроматина сопровождалось не только быстрым накоплением новых фактов, но и формированием новых парадигм о структуре и механизмах функционирования генов. Изучение гетерохроматина, напротив, практически свелось к накоплению огромного фактического материала, который не удалось упорядочить в рамках одной или небольшого числа гипотез. Для подробного ознакомления с ним отсылаем читателя к превосходной, хотя немного устаревшей книге Прокофьевой-Бельговской [2], а также к энциклопедически полной, к сожалению, тоже устаревшей книге Жимулева [3]. В данной статье излагается гипотеза, которая основана на предположении, что основные различия между эу- и гетерохроматином обусловлены различиями в топологии составляющих их молекул ДНК. Эта гипотеза не противоречит значительной части экспериментальных данных и объясняет их с единой точки зрения. Для большей ясности ее изложения напомним основные понятия и факты о топологии ДНК. Двунитевые молекулы ДНК могут существовать в двух топологически различных состояниях: в замкнутом и разомкнутом. Топологически замкнуты, например, кольцевые молекулы плазмид или петли ДНК эукариот, основания которых прочно связаны с ядерным матриксом (или скэффолдом метафазных хромосом). Топологически замкнутые ДНК становятся разомкнутыми, если хотя бы в одной из цепей появляется разрыв. Качественное различие между этими двумя состояниями заключается в том, что замкнутая ДНК может находиться в торсионно напряженном состоянии, т.е. быть недокрученной или перекрученной по сравнению с В-формой, тогда как разомкнутая ДНК всегда остается релаксированной, ненапряженной потому, что разорванная нить может свободно вращаться вокруг другой, целой, нити. Для определения топологического состояния ДНК в ядрах и хромосомах эукариот обычно используют вещества, способные интеркалировать между парами оснований (псорален, бромистый этидий). Связываясь с ДНК, они раздвигают соседние пары оснований и уменьшают угол вращения между ними. Эти локальные изме- нения структуры в топологически замкнутой ДНК приводят к появлению положительного торсионного напряжения, которое увеличивает закрученность всей двунитевой молекулы и сближает в ней пары оснований. Такая ДНК с уплотненной вторичной структурой хуже связывает следующие порции интеркалятора. (Лучше всего интеркалятор связывается с отрицательно напряженной, недокрученной ДНК). Что же касается связывания интеркалятора с топологически разомкнутой ДНК, то в ней торсионное напряжение не возникает, и ее вторичная структура остается неизменной. Следовательно, если изменить топологическое состояние замкнутой ДНК, введя в нее разрывы радиацией, нуклеазами или каким-либо другим способом, то ее сродство к интеркалятору станет одинаковым со сродством разомкнутой ДНК. Таким образом, измеряя количество связанного интеркалятора в хромосомах или ядрах до и после их обработки, определяют топологическое состояние ДНК в них. К настоящему времени четко показано in vivo [4–6] и in situ [7, 8], что ДНК транскрипционно активных генов торсионно напряжена. Что же касается ДНК транскрипционно неактивных генов, то, хотя было известно, что она торсионно не напряжена [9], но долго оставалось неясным, разомкнута она топологически или замкнута. На политенных ядрах хирономуса нами установлено, что ДНК неактивных локусов, как и ожидалось, практически не напряжена, но топологически замкнута [10]. Приведенные выше, а также многие другие факты дают основания считать, что петли ДНК в ядрах эукариот обычно топологически замкнуты и приобретают торсионное напряжение во время транскрипции. При этом, однако, возникает вопрос о том, существует ли в ядрах и хромосомах топологически разомкнутая ДНК и в какой форме она проявляется. Нам показалось естественным предположить, что если замкнутая ДНК соответствует эухроматину, то разомкнутая ДНК может соответствовать гетерохроматину. Каким же образом топологическая разомкнутость ДНК гетерохроматина приводит ко многим отличиям между ним и эухроматином? Напомним, что гетерохроматин отличается от эухроматина тем, что у него: 1) плотная упаковка ДНК (деконденсируется холодом и колцемидом); 2) поздняя репликация ДНК; 3) подавлена транскрипция (инактивация Х хромосомы?); 4) он вызывает эффект положения гена; 5) склонность к агрегации (липкость); 6) высокая частота локализации концов перестроек хромосом; 7) вариабельность количества ДНК; 8) формируется в онтогенезе через разрывы ДНК; 9) он обогащен повторами и МГЭ; 10) подавлена рекомбинация в мейозе. Ниже дано обсуждение перечисленных свойств (из него исключены последние два. Первое – за кажущуюся очевидность причин обогащенности повторами и МГЭ, второе – в связи с отсутствием однозначной интерпретации, связанной, может быть, с недостаточным знакомством автора с проблемой мейоза). Обсуждение не претендует на полноту и доказательность аргументации, а лишь на изложение фактов и соображений в пользу предложенной гипотезы. По нашему мнению, доказательством любой гипотезы может служить только экспериментальное подтверждение предположения или постулата, лежащего в ее основе. Согласие между наблюдаемыми фактами и следствиями из гипотезы, конечно, необходимо, но недостаточно. Отметим еще то обстоятельство, что при обсуждении гипотезы нами намеренно не затрагиваются вопросы о специфических белках гетерохроматина, о химических модификациях ДНК и ядерных белков, о так называемых сайленсерах и многие другие, которые неизбежно возникают при чтении работы. Это обстоятельство продиктовано необходимостью по возможности ясно изложить новую точку зрения. 1. Плотная упаковка ДНК Первое из отличий гетерохроматина от эухроматина – это более плотная укладка ДНК в гетерохроматиновых районах метафазных хромосом и в хромоцентрах интерфазных ядер. Причина его становится понятной, если обратиться к механизму компактизации хромосом в профазе митоза. Известно, что укладка ДНК в митотическую хромосому производится комплексом белков, называемым 13S конденсином. Комплекс обладает АТФазной активностью, способен связываться с ДНК и сверхспирализовать ее [11]. Исследовали, в частности, взаимодействие конденсинов с кольцевыми молекулами ДНК in vitro в присутствии топоизомеразы I, поддерживающей свободную ДНК в релаксированном состоянии за счет введения временных однонитевых разрывов. После удаления связанных белков молекулы ДНК оказались положительно сверхспирализованными (т.е. закрученными в обратном, по сравнению с нуклеосомами направлении). Полученный результат позволил авторам предположить, что при укладке в профазе митоза свободная, не связавшаяся с конденсинами ДНК метафазных хромосом, может быть сверхспирализована отрицательно. Недавно нами было определено топологическое состояние ДНК метафазных хромосом мыши и показано, что большая часть (около 85%) молекул действительно сверхспирализована отрицательно [12]. Остальная ДНК хромосом была либо топологически разомкнута, либо так плотно упакована, что недоступна ДНКазе I, использованной в наших опытах для индукции в ней однонитевых разрывов. Полученный результат можно интерпретировать так: сверхспирализованная ДНК есть ДНК эухроматина. Именно она составляет большую часть объема хромосом и наиболее чувствительна к нуклеазам. ДНК, занимающая малую часть объема хромосом, находящаяся в плотно упакованном и/или разомкнутом состоянии, является ДНК гетерохроматина. Сомнение в выборе между «и/или» легко разрешается в пользу «и», потому что только разомкнутая, содержащая по меньшей мере один однонитевой разрыв, ДНК может быть предельно плотно упакована конденсинами. Это утверждение вполне очевидно, поскольку «конденсиновый мотор» развивает конечное усилие и останавливается, встречая сопротивление, превышающее его возможности. В замкнутых петлях ДНК предельное для конденсинов усилие достигается при некотором уровне торсионного напряжения, возникающего в сверхспирализуемой ими ДНК. В разомкнутой ДНК торсионное напряжение появиться не может, поскольку концы разрыва свободно проворачиваются вокруг целой цепи (см. рис.). Именно по этой причине разомкнутая ДНК может быть предельно плотно упакована в профазе митоза, что, как мы полагаем, и происходит с ДНК гетерохроматиновых районов хромосом. Напомним, что различия в упаковке эу- и гетерохроматиновых блоков метафазных хромосом выявляются не только при окраске по Гимза (G- и С-полосы), но также при использовании электронного [13] или фазовоконтрастного микроскопа [14]. По завершении митоза компактное состояние ДНК частично сохраняется [15] и проявляется в виде хромоцентров интерфазного ядра. ДНК закрыта ДНК открыта а б Рис. Схематическое изображение появления торсионного напряжения в топологически замкнутой ДНК, препятствующей ее укладке в правильную спираль (а); напряжение не появляется в топологически разомкнутой ДНК (б). В пользу подобного механизма компактизации гетерохроматина свидетельствуют результаты исследования процесса генетически запрограммированной гибели клеток – апоптоза. Как известно, характерными признаками вступления клетки в апоптоз являются: 1) растворение ядрышка; 2) плотная конденсация хроматина на внутренней поверхности ядерной оболочки [16], сопровождаемая 3) крупноблочной (порядка 50 т.п.о.) фрагментацией ДНК [17]. Растворение ядрышка и компактизация хроматина ядра – типичные признаки профазы митоза. Однако, как показано в последней работе, апоптоз может начаться в S-фазе клеточного цикла, когда значительная часть ДНК ядра клетки содержит разрывы, т.е. топологически разомкнута. Ясно также, что в кариоплазме такой клетки нет факторов, необходимых для нормального течения митоза. Поэтому преждевременное начало митоза не может завершиться благополучно для клетки. Топологически разомкнутая ДНК сначала будет плотно упакована, а затем переварена нуклеазами [18]. Несмотря на предполагаемую общность механизмов укладки ДНК эу- и гетерохроматина в митотическую хромосому, между этими хроматинами обнаруживаются различия не только в плотности укладки, но и в способе стабилизации, закрепления укладки, который выявляется при действии на клетки пониженной температурой в виде резкой декомпактизации гетерохроматиновых районов хромосом, легко заметной на фоне остающихся плотными эухроматиновых районов [19, 20]. Деконденсация гетерохроматиновых районов обнаружена также при действии колхицина или колцемида [21, 22]. Как известно, единственное, что присуще обоим агентам: пониженной температуре и колцемиду, при их действии на клетку, – это свойство дестабилизировать митотическое веретено. Поэтому напрашивается предположение об участии в стабилизации гетерохроматиновых районов метафазных хромосом белков, подобных тубулинам. В пользу этого предположения говорят следующие факты. Первоначальная интерпретация эффекта охлаждения клеток Дарлингтоном и Ла Куром [20] сводилась к тому, что рыхлая укладка гетерохроматина связана с недорепликацией ДНК. Однако позже в результате детального изучения влияния охлаждения на митотический цикл и хромосомы растений было установлено, что выявляемые полосы декомпактизованного гетерохроматина не являются ни следствием локальной недоредупликации ДНК, ни следствием локальной недоспирализации хроматид, а возникают в уже полностью сформированных метафазных хромосомах [23, 24]. Поэтому отличие реакций гетеро- и эухроматиновых районов на холодовой шок говорит о различиях в способах закрепления, стабилизации укладки ДНК в них. Строго не доказано, что другой деконденсирующий агент, колхицин, не влияет на упаковку гетерохроматина каким-либо опосредованным способом. Установлено, однако, что подавление синтеза ДНК колхицином происходит лишь после длительного (в течение нескольких дней) его действия [25, 26], тогда как для деконденсации гетерохроматина требуется лишь несколько часов. Что же касается длительных эффектов последействия колхицина, приводящих к возникновению хромосомных мутаций, то, как показано на корешках Crepis capillaris [27], они, несомненно, связаны с нарушениями функции веретена. Приведенные выше факты свидетельствуют в пользу нашего предположения о прямом действии низкой температуры и колхицина на упаковку гетерохроматина и, тем самым, в пользу его стабилизации тубулиноподобными белками. 2. Поздняя репликация ДНК Другую особенность гетерохроматина, а именно его позднюю репликацию, обычно объясняют предельно плотной укладкой ДНК, которая способна затормозить как инициацию, так и элонгацию репликации. Свидетельством в пользу этого может служить практическая недоступность ДНК гетерохроматина не только многим сайтспецифическим рестрикционным ферментам [28], но и неспецифичной ДНКазе I [29, 30]. Для большей наглядности напомним, что ДНКаза I является не очень большим белком. Ее размеры около 30 Å, а молекулярная масса всего лишь 30,4 кД [31], тогда как молекулярная масса ДНК полимеразы I из E.coli втрое больше – 109 кД. Сомнения в справедливости такого объяснения вызывают, однако, явные исключения из общего правила. Так, например, подробное исследование хромосом у двух видов кенгуровых крыс не выявило сколько-нибудь четких закономерностей репликации их гетерохроматиновых районов [32, 33]. Но самые яркие примеры исключений из общего правила – это случаи репликации гетерохроматина в начале Sпериода у орхидеи [34] и у печеночного мха [35]. Поэтому следует искать не столько причину запаздывания репликации ДНК гетерохроматина в S-периоде клеточного цикла, сколько причину иного расписания его репликации. С учетом топологической разомкнутости ДНК гетерохроматина эта причина довольно очевидна. Действительно, поскольку в разомкнутой ДНК не может существовать торсионного напряжения, расплавляющего двойную спираль ДНК в сайте инициации репликации, то возникает необходимость в залечивании разрыва ДНК. Возможен и другой способ, при котором с помощью прочно связанных белков топологически замыкается не весь домен ДНК, а только небольшой участок, содержащий сайт инициации. В этом случае мы имеем дело с альтернативным механизмом инициации репликации, несколько вариантов которого описаны Люиным [36]. Из сказанного выше ясно, что механизмы инициации репликации ДНК в эу- и гетерохроматине должны быть различны и следовательно, допускают независимое регулирование. Отсюда же, кстати говоря, становится понятной возможная причина недорепликации гетерохроматина в политенных хромосомах многих видов двукрылых [3]. Можно полагать, что альтернативный механизм инициации репликации ДНК более управляемый и, в частности, позволяет не включать процесс репликации в некоторых гетерохроматиновых локусах политенных хромосом. 3. Подавление транскрипции Важнейшим следствием топологической разомкнутости ДНК гетерохроматина является его транскрипционная пассивность. Как упоминалось выше, в топологически разомкнутой ДНК не может существовать торсионное напряжение. Но для инициации транскрипции так же, как для инициации репликации, необходимо наличие в ДНК торсионного напряжения для образования открытого комплекса РНК полимеразы с промотором. Кроме того, транскрипция РНК, как правило, также протекает на торсионно напряженной (сверхспирализованной) матрице. Этот факт был четко доказан для нескольких исследованных генов в экспериментах in vivo [4–6] и in situ [7]. Более того, было показано, что интенсивность транскрипции РНК заметно уменьшается после индукции разрывов ДНК в клетке рентгеновским излучением и возобновляется после их репарации [37]. Иными словами, наличие разрывов в ДНК обычно несовместимо с транскрипцией. В качестве примера напомним, что ядра покоящихся лимфоцитов периферической крови почти полностью гетерохроматизированы и транскрипционно неактивны. Согласно нашим предположениям в них обнаружены разрывы ДНК: около 3000 разрывов на диплоидный геном мыши [38]. Более того, выяснено, что после активации лимфоцитов к пролиферации разрывы репарируются и даже сравнительно ясен механизм репарации [39, 40]. Очень плотно упакованная и полностью неактивная ДНК в ядрах сперматозоидов содержит рекордное число (от 106 до 107 на геном) разрывов ДНК [41]. В заключение темы о связи транскрипции с топологией ДНК напомним, что инактивация Х-хромосомы в клетках самок млекопитающих приводит к увеличению степени ее гетерохроматичности по сравнению с гомологом и чрезвычайно плотной упаковке в интерфазном ядре (тельце Барра). У мыши инактивация Х хро-мосомы [42, 43] и ее гетерохроматинизация происходят одновременно с гетерохро- матинизацией аутосом в раннем эмбриональном развитии, завершаясь к стадии бластоцисты [44]. Следует, однако, отметить особый статус тельца Барра среди других видов или форм гетерохроматина. Известно, что в инактивации Х-хромосомы принимает участие расположенный на ней ген Xist (X inactive specific transcript). С него считывается специфическая нетранслируемая Xist РНК, которая остается связанной с инактивированной Хi хромосомой. Брокдорфф и Дути [45] полагают, что активность гена Xist не только необходима, но и достаточна для инактивации Х-хромосомы. Однако четко показано, что Xist РНК не нужна для поддержания инактивированного состояния Х хромосомы [46, 47]. Поэтому нам кажется справедливой более осторожная точка зрения, сводящаяся к тому, что Xist РНК выполняет некоторые дополнительные функции, специфические для механизма дозовой инактивации. Не исключено, например, что она требуется для инициации инактивации или же для подсчета отношения Х к аутосомам. Не исключена даже предельно крайняя точка зрения, полностью противоположная мнению Брокдорффа и Дути, а именно, что Xist РНК служит не столько для инактивации генов в Хi хромосоме, сколько для сохранения активности тех ее генов, которые по неизвестным пока причинам транскрибируются в ней. Именно так можно трактовать функциональную роль скоплений Xist РНК над эухроматиновыми районами Х хромосомы полевки [48]. 4. Эффект положения гена Особого обсуждения заслуживает эффект положения гена, т.е. изменение (variegation) активности гена при его перемещении к гетерохроматиновому району при том условии [49], что разрыв произошел именно в этом районе. В рамках обсуждаемой гипотезы можно утверждать, что ген, попавший в блок гетерохроматина, должен быть инактивирован, потому что разрывы в его ДНК будут индуцированы одновременно с индукцией разрывов в молекулах ДНК всего блока в процессе его гетерохроматинизации. Так, по-видимому, и происходит. Судя по морфологическим критериям, гетерохроматин формируется в раннем развитии. Хорошо известно, что в самом начале развития дрозофилы, а именно во время первых синхронных делений, хроматин в ядрах тонко диспергирован, а митотические хромосомы имеют вид тонких, слабо конденсированных нитей. К стадии бластодермы (около 3 часов развития) в ядрах уже видны хромоцентры и ядрышки [50], а хромосомы дифференциально окрашиваются [51]. Эффект положения гена чаще всего также детерминируется на этой стадии. Так, при исследовании влияния температуры на выраженность эффекта положения и на формирование блоков гетерохроматина в политенных хромосомах дрозофилы было показано, что оба процесса чувствительны к низкой температуре в течение первых 3–6 часов раннего эмбрионального развития [52–54]. Иными словами, детерминация эффекта положения гена преимущественно происходит в раннем развитии животных во время формирования гетерохроматина. Варьирующее проявление эффекта положения связано, на наш взгляд, с вариациями в размере гетерохроматизируемого участка или, иными словами, в числе топологически замкнутых доменов ДНК, получивших однонитевые разрывы. Данное предположение основано на факте существования еще двух периодов в онтогенезе дрозофилы, когда в ткани возникает мозаичность проявления признака. Это период формирования соответствующего имагинального диска в личиночном возрасте и период начала формирования из диска собственно ткани или органа. Бейкер [49] указывал на то обстоятельство, что в эти периоды происходят многочисленные митозы, приводящие к росту ткани, но их связь с мозаичным проявлением признака оставалась неясной. К настоящему времени на многих примерах показано, что во время клеточной дифференцировки в ДНК возникают разрывы, большинство из которых позже репарируется. (Наиболее интенсивно процесс их образования идет в раннем эмбриональном развитии животного, когда происходит формирование гете- рохроматина (см. раздел 8. Формирование гетерохроматина в онтогенезе через разрывы ДНК)). Не исключено, что ошибки или вариации каких-то этапов разрезания и репарации приводят к вариациям положения границ гетерохроматизируемого участка. Поэтому активность гена, расположенного рядом с гетерохроматином, оказывается зависимой от того, гетерохроматинизирован он или нет в процессе конечной дифференцировки ткани. 5. Склонность к агрегации (липкость) Теперь напомним различные проявления липкости гетерохроматиновых районов. В интерфазе липкость проявляется в вариабельности числа наблюдаемых хромоцентров: часть хромоцентров «слипается» друг с другом [55]. Неоднократно отмечалась упорядоченность хромосом в митозе, приписываемая «притяжению» между гетерохроматиновыми районами гомологов. Описана конъюгация гетерохроматиновых районов сестринских хроматид [56, 57]. В политенных ядрах нередко образуются эктопические контакты между блоками интеркалярного гетерохроматина разных хромосом [58]. Перечисленные выше и другие проявления липкости могут быть следствием образования гибридных ДНК, включающих в себя однонитевые участки двух разных блоков гетерохроматина. Для этого взаимодействующие однонитевые участки должны быть хотя бы частично комплементарны друг другу и сближены в пространстве. Для хромосом в митозе эти условия, очевидно, соблюдаются всегда, но развитию эктопических контактов между ними препятствует расхождение в анафазе. Для дисков интеркалярного хроматина политенных хромосом указанные условия выполняются реже, но эктопические контакты обнаруживаются легче из-за репликации ДНК в эктопических тяжах. Среди существующих гипотез о механизмах образования эктопических тяжей (см. [3]) нашей точке зрения наиболее близка гипотеза «липких концов», возникающих из-за недорепликации ДНК гетерохроматиновых локусов [59]. В этой гипотезе так же, как и в нашей, предполагается близость последовательностей оснований только у взаимодействующих «липких концов», а не у всей ДНК тех дисков интеркалярного гетерохроматина, которые соединены эктопическими тяжами. Однако сомнительно, чтобы политенные хромосомы могли взаимодействовать «липкими концами» недореплицированной ДНК своих дисков, которые все дальше и дальше удаляются друг от друга с ростом степени политении. Более вероятно, что контакты «липких концов» происходят в малом объеме ядра диплоидной клетки, т.е. до начала политенизации хромосом. 6. Локализация концов хромосомных перестроек Первые сведения о повышенной частоте концов перестроек в гетерохроматиновых районах хромосом дрозофилы были получены, по-видимому, в 1939 г. [60, 61]. Представительная сводка экспериментальных данных, свидетельствующая о неслучайности этого феномена, имеется в монографии Жимулева [3]. Несомненно, справедливо его мнение о том, что «разрывы в участках повторов не так сильно нарушают жизнеспособность, как повреждения уникальных фрагментов ДНК. Поэтому перестройки в районах интеркалярного гетерохроматина легче выявляются» [3, С. 177]. В то же время не вызывает сомнений, что наличие предполагаемых нами липких концов у ДНК гетерохроматиновых блоков способствует образованию связей между ними. Когда эти связи сохраняются и политенизируются вместе с хромосомами, то они образуют видимые эктопические контакты. В других случаях могут образоваться перестройки. Общепринято, что хромосомная перестройка получается после разрыва пары внутри- или межхромосомных связей, инверсии концов и их последующего восстановления. Нам кажется, что наличие однонитевых разрывов с «липкими» концами в гетерохроматиновой ДНК заметно облегчает образование гибридных участков и тем самым увеличивает частоту перестроек, концы которых оказываются локализованными в блоках гетерохроматина. 7. Вариабельность количества ДНК Едва ли требует объяснения факт вариабельности количества гетерохроматина на популяционном или видовом уровнях. Общепринято, что основным его механизмом является неравный митотический кроссинговер, впервые предложенный Курнитом [62]. Это мнение только усиливают факты неучастия гетерохроматина в мейотической рекомбинации и одинаковой частоты сестринских хроматидных обменов в эу- и гетерохроматине [63]. Требуют, скорее, объяснения многочисленные факты, свидетельствующие об адаптивном значении гетерохроматина, но они лежат вне рамок данной работы. 8. Формирование гетерохроматина в онтогенезе через разрывы ДНК Выше говорилось о том, что появление, точнее, формирование гетерохроматина в изначально однородных «ювенильных» хромосомах дрозофилы происходит в первые часы развития оплодотворенного яйца. Однако нам не удалось найти сведений о разрывах в ДНК развивающегося зародыша дрозофилы. Значительно больше сведений имеется о формировании гетерохроматина в раннем эмбриональном развитии мыши. Морфологическая картина такова. В самом начале развития (2–4 бластомера) интерфазные ядра однородны, хотя АТ-богатые хромоцентры выявляются при окраске Хехстом [44]. Метафазные хромосомы выглядят тонкими однородными нитями. Однако уже к стадии бластоцисты G-полосы выявляются в хромосомах так же четко, как и в поздних эмбриональных фибробластах [64]. Гетерохроматинизация половой Х-хромосомы у самок мышей также завершается в бластоцисте. Ее полная инактивация происходит приблизительно в это же время [42, 43], но с тканевыми вариациями [65]. У мыши довольно хорошо исследована также динамика разрывов ДНК. Их выявляли на фиксированных препаратах ранних эмбрионов методом ник-трансляции без добавления никующих агентов. Биотин-стрептовидиновая метка была обнаружена на всех стадиях преимплантационного развития с пиком мечения на стадии четырех клеток. В постимплантационном эмбрионе и костном мозге животного метку не наблюдали [66]. Метились не только интерфазные ядра, но и метафазные хромосомы. Авторы [67, 68] видят их «равномерно окрашенными, с ярко выраженными 'точками'", без метки в центромерных районах. На наш взгляд, распределение метки в хромосомах явно неоднородное и напоминает G-окраску. О структуре разрывов в ДНК, содержащих однонитевые участки, можно судить по тому факту, что включение метки производилось как полным ферментом (ДНК полимераза I), так и фрагментом Кленова, способным лишь достраивать комплементарную цепь к однонитевой матрице. Масштабность феномена разрывов была наиболее ярко продемонстрирована методом щелочного микроэлектрофореза ДНК одиночных клеток тератокарциномы эмбриональных стволовых клеток в агарозном геле [69]. Большие длины «хвостов» позади ядер и неравномерное распределение ДНК в них свидетельствовали о (квази) случайных позициях разрывов, возникающих приблизительно в половине ядерной ДНК. По мнению многих исследователей, разрывы ДНК появляются не только в раннем эмбриональном развитии, но и во время любой дифференцировки клеток. Мы уже упоминали о разрывах ДНК при созревании спермиев [41] и лимфоцитов [39, 40]. Добавим еще два примера дифференцировки эритролейкемических клеток Фрэнда [70, 71] и миобластов цыпленка [72]. Из сказанного выше можно заключить, что процесс формирования гетерохроматина в раннем развитии животных достаточно продолжителен и сопряжен с разрывами ДНК. У самок мышей и, по-видимому, у всех млекопитающих гетерохрома- тинизация Х-хромосомы происходит в те же сроки, и тем же механизмом, что и формирование гетерохроматина. Заключение Мы предполагаем, что наблюдаемые в раннем развитии разрывы во всей или преобладающей части неактивной ДНК ядра залечиваются лишь частично, тогда как разрывы в ДНК транскрипционно активных генов если и возникают, то быстро и полностью залечиваются. Многое еще остается неясным в происхождении и свойствах предполагаемых нами разрывов ДНК: почему они не репарируются в клеточном цикле, как они воспроизводятся с нарушенной матрицы при репликации, сохраняются ли они между раундами репликации и т.д. Еще меньше ясны механизмы эффектов, возникающих при взаимодействии гетерохроматина с активными генами: как возникает модифицирующее действие Y-хромосомы на проявление эффекта положения гена у дрозофилы [73], для чего необходим синтез Xist РНК при инактивации Х-хромосомы у млекопитающих и т.д. К счастью, эти проблемы сейчас активно изучаются. Несмотря на эти неясности, нам кажется, что результаты проведенного выше обсуждения свидетельствуют, скорее, в пользу предложенной гипотезы, чем против нее. Не исключено, однако, что убедиться в справедливости ее основных положений будет непросто. Во-первых, малое число предполагаемых разрывов ДНК может потребовать применения очень чувствительных методов их обнаружения, и, вовторых, высокая плотность упаковки ДНК в гетерохроматине может затруднить использование молекулярно-биологических подходов. Автор благодарит всех коллег, принимавших участие в работах по изучению топологии ДНК в ядрах эукариот: М.А.Шурдова, Ф.Э.Кузина, Н.В.Павлова, Э.Р.Галиеву, Т.Д.Дубатолову, С.А.Трунову, В.Г.Левицкого, Н.М.Матвееву и А.Г.Шилова. Автор благодарен также С.В.Павловой, И.Ф.Жимулеву, Л.В.Высоцкой, Л.В.Омельянчуку и Б.Ф.Чадову за критический анализ рукописи и высказанные ими замечания. Список литературы 1. Heitz E. Das Heterochromatin der Moose // Jb. wiss. Bot. 1928. V. 69. P. 762–818. 2. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. М.: Наука, 1986. 431 с. 3. Жимулев И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена. Новосибирск: Наука, 1993. 490 с. 4. Ljungman M., Hanawalt P.C. Localized torsional tension in the DNA of human cells // Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 1992. V. 89. P. 6055–6059. 5. Jupe E.R., Sinden R.R., Cartwright I.L. Stably maintained domain of localized unrestrained supercoiling at Drosophila heat shock locus // EMBO J. 1993. V. 12. P. 1067–1075. 6. Jupe E.R., Sinden R.R., Cartwright I.L. Specialized chromatin structure domain boundary elements flanking a Drosophila heat shock locus are under torsional strain in vivo // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 2628–2633. 7. Gruzdev A.D., Lezzi M. The torsional state of DNA in a transcriptionally hyperactive puff of polytene chromosomes // Chromosome Res. 1998. V. 6. P. 367–378. 8. Кузин Ф.Э., Шилова И.Э., Бугреев Д.В. и др. Стабильное торсионное напряжение в ДНК политенных хромосом Chironomus thummi // Биополимеры и клетка. 1999. Т. 15, № 6. (В печати). 9. Sinden R.R., Carlson J.O., Pettijohn D.E. Torsional tension in the DNA double helix measured with trimethylpsoralen in living E. coli cells: analogous measurement in insect and human cells // Cell. 1980. V. 21. P. 773–783. 10. Груздев А.Д., Лецци М. ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена // Биополимеры и клетка. 1997. Т.13. № 6. С. 460–462. 11. Kimura K., Hirano T. ATP-dependent positive supercoiling of DNA by 13S condensin; a biochemical implication for chromosome condensation // Cell. 1997. V. 90. P. 625–634. 12. Груздев А.Д., Кузин Ф.Э., Галиева Э.Р. и др. Торсионное напряжение в ДНК метафазных хромосом // Биофизика. 1999. Т. 44, № 4. С. 688–693. 13. Comings D.E., Avelino E., Okada T.A., Wyandt H.E. The mechanism of C- and G-banding of chromosomes // Exptl. Cell Res. 1973. V. 77. P. 538–564. 14. McKay R.D.G. The mechanism of G- and C-banding in mammalian metaphase chromosomes // Chromosoma. 1973. V. 44. P. 1–14. 15. Смарагдов М.Г., Смирнов А.Ф., Родионов А.В. Исследование конденсации эу- и гетерохроматина в хромосомах дрозофилы, окрашенных флуорохромом Hoechst 33258 // Цитология. 1980. T. 22, № 7. C. 751–757. 16. Wyllie A.H., Beattie G.J., Hargreaves A.D. Chromatin changes in apoptosis // Histochemical J. 1981. V. 13. P. 681–692. 17. Oberhammer F.A., Hochegger K., Froeschl G. et al. Chromatin condensation during apoptosis is accompanied by degradation of lamin A+B, without enhanced activation of cdc2 kinase // J. Cell Biol. 1994. V. 126. P. 827–837. 18. Sit K.H., Yin L., Paramananthan R. Apoptotic condensations in M-phase cells // Anat. Rec. 1997. V. 248, № 2. P. 159–158. 19. Darlington C.D., La Cour L.F. Nucleic acids starvation of chromosomes in Trillium // J. Genet. 1940. V. 40. P. 185–213. 20. Darlington C.D., La Cour L. F. The detection of inert genes // J. Heredity. 1941. V. 32. P. 115–121. 21. Stubblefield E. DNA synthesis and chromosomal morphology of Chinese hamster cells cultured in media containing N-deacetyl-N-methylcolhicine (colcemid) // Symp. Int. Soc. Cell Biology. V. 3. Cytogenetics of cells in culture / R.J.C.Harris (ed.). N.-Y.: Academic Press. 1964. P. 223–248. 22. Захаров А.Ф., Еголина Н.А. Функциональная морфология хромосом культивируемых клеток млекопитающих. Сообщение 1. О происхождении дополнительных, позднореплицирующихся районов хромосом в гиподиплоидных клетках китайского хомячка // Генетика. 1969. T. 5, № 6. C. 90–103. 23. Гриф В.Г. Действие низких температур на митоз и хромосомы растений // Цитология. 1963. T. 5, № 4. C. 404–413. 24. Гриф В.Г. О гетерохроматине у растений // Цитология. 1963. T. 5, № 6. C. 615–622. 25. Ilan J., Quastel J.H. Effects of colchicine on nucleic acid metabolism during metamorphosis of Tenebrio molitor L. and in some mammalian tissues // Biochem. J. 1966. V. 100. P. 448–457. 26. Hotta Y., Sheppard J. Biochemical aspects of colchicine action on meiotic cells // Mol. General Genet. 1973. V. 122. P. 243–260. 27. Платонова Р.Н., Сахаров В.В., Катрыш Л.И., Ольхоненко В.П. Мутационное последействие колхицина (цитологическое исследование). Сообщение I // Генетика. 1968. T. 4, № 10. C. 5–13. 28. Burkholder G.D. Morphological and biochemical effects of endonucleases on isolated mammalian chromosomes in vitro // Chromosoma. 1989. V. 97. P. 347–355. 29. Kerem B.-S., Goitein R., Diamond G. et al. Mapping of DNase I sensitive regions of mitotic chromosomes // Cell. 1984. V. 38. P. 493–499. 30. Hutchison N., Weintraub H. Localization of DNase I-sensitive sequences to specific regions of interphase nuclei // Cell. 1985. V. 43. P. 471–482. 31. Suck D., Oefner C. Structure of DNAase I at 2.0 Å resolution suggest a mechanism for binding to and cutting DNA // Nature. 1986. V. 231. P. 620–625. 32. Bostock C.J., Christie S. Chromosome banding and DNA replication studies on a cell line of Dipodomys merriami // Chromosoma. 1974. V. 48. P. 73–87. 33. Bostock C.J., Christie S. Chromosomes of a cell line of Dipodomys panamintinus (Kangaroo rat): a banding and autoradiographic study // Chromosoma. 1975. V. 51. P. 25–34. 34. Tanaka R..3H-thymidine autoradiographic studies on the heteropycnosis, heterochromatin and euchromatin in Spiranthes sinensis // Bot. Mag. 1965. V. 78. P. 50–62. 35. Tatuno S., Tanaka R., Masubuchi M. Early DNA synthesis in the X-chromosome of Pellium neesiana // Cytologia. 1970. V. 35. P. 220–226. 36. Lewin B. Genes. Oxford, a.o.: Oxford Univ. Press, 1997. 1260 p 37. Luchnik A.N., Hismatdinov T.A., Georgiev G.P. Inhibition of transcription in eukaryotic cells by X-irradiation: relation to the loss of topological constraint in closed DNA loops // Nucl. Acids Res. 1988. V. 16. P. 5175–5190. 38. Greer W.L., Kaplan J.C. DNA strand breaks in murine lymphocytes: induction by purine and pyrimidine analogues // Biophys. biochem. Res. Comm. 1983. V. 115. P. 834–840. 39. Johnstone A.P., Williams G.T. Role of DNA breaks and ADP-ribosyl transferase activity in eukaryotic differentiation demonsrated in human lymphocytes // Nature. 1982. V. 300. P. 368–370. 40. Greer W.L., Kaplan J.C. Regulation of repair of naturally occurring DNA strand breaks in lymphocytes // Biophys. Biochem. Res. Comm. 1984. V. 122. P. 366–372. 41. Singh N.P., Danner D.B., Tice R.R. et al. Abundant alkali-sensitive sites in DNA of human and mouse sperm // Exper. Cell Res. 1989. V. 184. P. 461–470. 42. Lyon M. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.) // Nature. 1961. V. 190. P. 372–374. 43. Lyon M.F. Some milestones in the history of X-chromosome inactivation // Ann. Rev. Genet. 1992. V. 26. P. 16–18. 44. Паткин Е. А. Исследование структурного гетерохроматина на начальных стадиях развития зародышей мышей // Онтогенез. 1980. Т. 11, № 1. С. 49–53 45. Brockdorff N., Duthie S.M. X-chromosome inactivation and the Xist gene // Cell. Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 104–112. 46. Brown C.I., Willard H.F. The human X inactivation center is not required for maintenance of chromosome inactivation // Nature. 1994. V. 368. P. 154–156. 47. Rack R.A., Chelly J., Gibbons R.J. et al. Absence of the XIST gene from latereplicating isodicentric X chromosomes in leukemia // Human Molecular Genetics. 1994. V. 3. P. 1053–1059. 48. Duthie S.M., Nesterova T.B., Formstone E.J. et al. Xist RNA exhibits a banded localization on the inactive X chromosome and is excluded from autosomal material in cis // Human Mol. Genet. 1999. V. 8. P. 195–204. 49. Baker W.K. Position effect variegation // Adv. Genet. 1968. V. 14. P. 133–169. 50. Mahowald A.P. Ultrastructural differentiations during formation of the blastoderm in the Drosophila melanogaster embryo // Developm. Biol. 1963. V.8. P. 186–204. 51. Vlassova I.E., Graphodatsky A.S., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Constitutive heterochro matin in early embryogenesis of Drosophila melanogaser // Mol. Gen. Genet. 1991. V. 229. P. 316–318. 52. Hartman-Goldstein I.J. On the relationship between heterochromatinization and variegation in Drosophila, with special reference to temperature sensitive periods // Genet. Res. (Camb.). 1967. V. 10. P. 143–159. 53. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Bgatov A.V. et al. Cytogenetics and molecular aspects of position effect variegation in Drosophila melanogaster. II. Peculiarities of morphology and genetic activity of the 2B region in the T(1;2)dorpar7 chromosome in males // Chromosoma. 1988. V. 96. P. 255–261. 54. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Bolshakov V.N., Mal'ceva N.I. Position effect variegation and intercalary heterochromatin: a comparative study // Chromosoma. 1989. V. 98. P. 378–387. 55. Смарагдов М.Г., Смирнов А.Ф., Родионов А.В. Агрегация гетерохроматиновых районов хромосом в нейробластах Drosophila melanogaster // Цитология и генетика. 1980. Т. 14, № 3. С. 37–42. 56. Paika I.J., Miller D.D. Distribution of heterochromatin in type III Y and other chromosomes of Drosophila athabaska // J. Heredity. 1974. V. 65. P. 238-240. 57. Lakhotia S.C., Kumar M. Heterochromatin in mitotic chromosomes of Drosophila nasuta // Cytobios. 1978. V. 21. P. 79–89. 58. Barr H.J., Ellison J.R. Ectopic pairing of chromosome regions containing chemically similar DNA // Chromosoma. 1972. V. 39. P. 53–61. 59. Zhimulev I.F., Semeshin V.F., Kulichkov V.A., Belyaeva E.S. Intercalary heterochromatin in Drosophila. I. Localization and general characteristics // Chromosoma. 1982. V. 87. P. 197–228. 60. Прокофьева-Бельговская А.А., Хвостова В.В. Распределение разрывов в Х-хромосоме Drosophila melanogaster // Докл. АН. 1939. T. 23. C. 269–271. 61. Kaufmann B.P. Distribution of induced breaks along the X-chromosome of Drosophila melanogaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1939. V. 25. P. 571–577. 62. Kurnit D.M. Satellite DNA and heterochromatin variants: the case for unequal crossing over // Human Genet. 1979. V. 47. P. 169–186. 63. Ладыгина Т.Ю., Горлов И.П., Бородин П.М. Позиционный контроль распределения спонтанных сестринских хроматидных обменов по хромосомам мыши // Генетика. 1991. T. 27, № 8. C. 1366–1371. 64. Burkholder G.D., Comings D.E. Do the Giemsa-banding patterns of chromosomes change during embryonic development? // Exptl. Cell Res. 1972. V. 75. P. 268–271. 65. Tan S.S., Williams E.A., Tam an P.P.L. X-chromosome inactivation occurs at different times in different tissues of the post-implantation embryo // Nature Genet. 1993. V. 3. P. 170–174. 66. Паткин Е.Л., Кустова М.Е., Нониашвили Е.М. Одноцепочечные разрывы ДНК в хромосомах ранних зародышей мышей // Цитология. 1995. Т. 37, № 5–6. С. 458– 464. 67. Patkin E.L., Kustova M.E., Noniashvili E.M. Single-strand DNA breaks in nuclei of early mouse embryos detected by in situ nick translation // Cytobios. 1994. V. 79. P. 235–240. 68. Patkin E.L., Kustova M.E., Noniashvili E.M. DNA-strand breaks in chromosomes of early mouse embryos as detected by in situ nick translation and gap filling // Genome. 1995. V. 38. P. 381–384. 69. Vatolin S.Y., Okhapkina E.V., Matveeva N.M. et al. Scheduled perturbation in DNA during in vitro differentiation of mouse embryo-derived cells // Mol. Repr. and Developm. 1997. V. 47. P. 1–10. 70. Terada M., Nudet U., Fibach E. et al. Changes in DNA associated with induction of erythroid differentiation by dimethylsulfoxide in murine erythroleukemic cells // Cancer Res. 1978. V. 38. P. 835–840. 71. Sher W., Friend C. Breakage of DNA and alteration in folded genome by inducers of differentiation in Friend erythroleukemic cells // Cancer Res. 1978. V. 38. P. 841–849. 72. Farzaneh F., Zalin R., Brill D., Shall S. DNA strand breaks and ADP-ribosyl transferase activation during cell differentiation // Nature. 1982. V. 300. P. 362–366. 73. Becker H.J., Janning W. Heterochromatin of the Drosophila melanogaster Y chromosome as modifier of position effect variegation: the time of its action // Mol. Gen. Genet. 1977. V. 151. P. 111–114.
