Исследование крыс oxys как модели болезни
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК» На правах рукописи СТЕФАНОВА Наталья Анатольевна ИССЛЕДОВАНИЕ КРЫС OXYS КАК МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ 14.03.03 – патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Наталия Гориславовна Колосова Новосибирск –2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕЙМЕРА (БА) 1.1.1. Наследственная и спорадическая формы развития БА 1.1.2. Генетические факторы риска БА 1.1.3. Патогенез БА 1.1.3.1. Нарушение процессинга белка предшественника амилоида бета (Aβ) и накопление Aβ как центральное событие в патогенезе БА 1.1.3.2. Токсическое накопление Aβ как инициирующий фактор развития БА: аргументы за и против 1.1.4. Окислительный стресс и дисфункция митохондрий в патогенезе БА 1.2. ПОТЕНЦИАЛ АНТИОКСИДАНТОВ В ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ БА 1.2.1. Адресованные в митохондрии антиоксиданты - новый класс биологически активных молекул 1.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ БА 1.3.1. Геномодифицированные модели БА 1.3.2. «Естественные» модели БА 1.4. КРЫСЫ ЛИНИИ OXYS КАК МОДЕЛЬ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОГО СТАРЕНИЯ И СВЯЗАННЫХ С НИМ ЗАБОЛЕВАНИЙ Заключение к Главе 1 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Материалы, использованные в работе 2.2. Животные и препараты 2.3. Исследование поведения животных 2.3.1. Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» 2.3.2. Тест «открытое поле» 2.3.3. Тест «восьмирукавный радиальный лабиринт» 2.3.4. Тест «водный лабиринт Морриса» 2.4. Забор и хранение образцов 2.5. Выделение белка 2.5.1. Выделение общего белка 2.5.2. Выделение саркозил-растворимой и нерастворимой фракций белка 2.5.3. Выделение митохондриальной фракции белка 2.6. Морфологический и морфометрический анализ методами световой и электронной микроскопии 2.6.1. Забор образцов и приготовление препаратов 2.6.2. Анализ и обработка изображений 2.7. Иммуногистохимический анализ 2.7.1. Приготовление препаратов 5 6 14 14 15 17 21 21 25 35 44 49 52 52 54 57 62 65 65 66 67 67 67 68 68 69 70 70 70 70 71 71 72 72 72 3 2.7.2. Анализ и обработка изображений 2.8. Вестерн блот и Дот блот анализы 2.9. Иммуноферментный анализ ELISA 2.10. Активность фермента цитохром с оксидазы 2.11. Массовое параллельное секвенирование (RNA-seq) 2.11.1. Секвенирование на платформе Illumina 2.11.2. Картирование и анализ дифференциальной экспрессии 2.12. Статистический анализ Глава 3. РАЗВИТИЕ КЛЮЧЕВЫХ ПРИЗНАКОВ БА У КРЫС OXYS 3.1. НАРУШЕНИЯ ПОВЕДЕНИЯ И ПАМЯТИ У КРЫС OXYS 3.1.1. Сниженная моторно-исследовательская активность и повышенная тревожность 3.1.2. Нарушение способности к обучению и памяти 3.2. СИНАПТИЧЕСКАЯ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ И НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В МОЗГЕ КРЫС OXYS ПРИ РАЗВИТИИ ПРИЗНАКОВ БА 3.2.1. Изменение с возрастом популяции нейронов гиппокампа крыс OXYS и Вистар 3.2.2. Деструктивные изменения пирамидных нейронов гиппокампа и префронтальной коры головного мозга крыс OXYS при развитии признаков БА 3.2.3. Возрастные структурно-функциональные изменения синапсов в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга крыс OXYS и Вистар 3.3. НАКОПЛЕНИЕ AΒ ПЕПТИДА С ВОЗРАСТОМ И ЕГО ЛОКАЛИЗАЦИЯ В МОЗГЕ КРЫС OXYS 3.4. ГИПЕРФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ТАУ-БЕЛКА В ГИППОКАМПЕ И ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС OXYS 3.5. ДИСФУНКЦИЯ МИТОХОНДРИЙ В МОЗГЕ КРЫС OXYS ПРИ РАЗВИТИИ ПРИЗНАКОВ БА 3.5.1. Ультраструктурные изменения митохондрий гиппокампа крыс OXYS и Вистар разного возраста 3.5.2. Возрастные изменения активности фермента цитохрома с оксидазы комплекса IV дыхательной цепи митохондрий в мозге крыс OXYS и Вистар Заключение к Главе 3. Глава 4. АНАЛИЗ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ТРАНСКРИПТОМА ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ КРЫС OXYS И ВИСТАР 4.1. Анализ данных секвенирования транскриптома (RNA-seq) 4.2. Функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов Заключение к Главе 4. 73 74 74 75 75 75 76 77 78 78 78 81 84 84 86 92 98 104 108 109 110 112 114 114 120 131 4 Глава 5. ВЛИЯНИЕ НА МАНИФЕСТАЦИЮ И ПРОГРЕССИЮ ПРИЗНАКОВ БА МИТОХОНДРИАЛЬНОГО АНТИОКСИДАНТА SkQ1 5.1. ВЛИЯНИЕ SKQ1 НА РАЗВИТИЕ ПРИЗНАКОВ БА У КРЫС OXYS 5.1.1. Влияние приема SkQ1 на моторно-исследовательскую активность, тревожность, способность к обучению и память крыс OXYS и Вистар 5.1.2. Влияние приема SkQ1 на развитие деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS 5.1.3. Влияние приема SkQ1 на содержание соматотропного гормона и инсулиноподобного фактора роста-I в крови крыс Вистар и OXYS 5.1.4. Влияние приема SkQ1 на содержание AβPP и Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар 5.1.5. Влияние приема SkQ1 на содержание тау-белка и его фосфорилированной формы в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар 5.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ SKQ1 НА ПРОГРЕССИЮ ПРИЗНАКОВ БА У КРЫС OXYS 5.2.1. Влияние приема SkQ1 на поведение, способность к обучению и память крыс OXYS и Вистар 5.2.2. Влияние приема SkQ1 на деструктивные изменения нейронов и плотность синапсов в гиппокампе крыс OXYS при прогрессии признаков БА 5.2.3 Влияние приема SkQ1 на содержание Aβ1-40 и Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар Заключение к Главе 5 Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 6.1. Анализ связи механизмов ускоренного старения мозга крыс OXYS с патогенезом БА 6.2. Анализ связи нейропротекторных эффектов митохондриального антиоксиданта SkQ1 со способностью влиять на развитие и прогрессию ключевых признаков БА у крыс OXYS ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ ПО ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЕ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Приложение 1 Приложение 2 132 132 132 139 142 144 146 148 148 153 164 166 167 168 186 194 196 199 257 260 5 Список сокращений АФК – активные формы кислорода БА – болезнь Альцгеймера БХ – поправка Бенжамини-Хохберга ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ДЭ – дифференциально экспрессирующиеся (гены) ИФА – иммуноферментный анализ мРНК – матричная РНК МРТ – магниторезонансная томография НФБА – наследственная форма болезни Альцгеймера ПОЛ – продукты перекисного окисления липидов СПБА – спорадическая форма болезни Альцгеймера ЦНС – центральная нервная система ЭПР – эндоплазматический ретикулум Aβ – бета-амилоид АРР – белок предшественник Aβ KEGG – Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes RNA-seq – метод массового паралелльного секвенирования SkQ1 – пластохинонил-децил-трифенилфосфоний 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Болезнь Альцгеймера (БА) – самое распространенное нейродегенеративное заболевание, которое становится причиной деменции на фоне атрофических изменений мозга и, в конечном счете, смерти в течение 3-9 лет после установления диагноза (Querfurth, LaFerla, 2010). Эффективных способов профилактики и лечения БА нет, заболеваемость растет по мере увеличения продолжительности жизни и постарения населения развитых и развивающихся стран. По данным ВОЗ, в мире более 35 миллионов человек страдают БА, а к 2050 году, по прогнозам, таких больных будет >115 миллионов (Morley et al., 2012). В этой связи исследования фундаментальных механизмов БА и разработка основанных на их знании способов профилактики и лечения заболевания приобрели особую актуальность. Согласно доминирующей гипотезе «амилоидного каскада» центральным событием в патогенезе БА становится накопление нейротоксических форм пептида амилоида-β (Аβ), приводящее к образованию амилоидных бляшек, гиперфосфорилированию тау-белка и формированию нейрофибриллярных клубков, синаптической недостаточности, гибели нейронов, воспалению, митохондриальной дисфункции и окислительному стрессу (Morley et al., 2012). Однако в последние годы растет количество аргументов в пользу того, что в патогенезе наиболее распространенной спорадической формы БА (~95% всех случаев заболевания) гиперпродукция Аβ не выступает в роли инициирующего фактора (Krstic, Knuesel, 2013). Более того, приводятся убедительные доказательства того, что механизмы патогенеза ранней - наследственной формы - и поздней - спорадической формы БА могут быть различными (Shinohara et al., 2014). Так, если причиной токсического накопления Аβ в мозге больных наследственной формой БА становится нарушение процессинга белка предшественника амилоида-β (AРР), то у больных спорадической формой БА накопление Аβ может быть опосредовано синаптическими процессами. Механизмы старения и патогенез нейродегенеративных заболеваний, в том числе БА, тесно связаны с митохондриальной дисфункцией и окислительным стрессом – нарушением баланса в системах генерации и детоксикации активных форм кислорода (АФК). Более того, дисфункция митохондрий рассматривается как один из ключевых 7 факторов, инициирующих развитие БА. Согласно гипотезе «митохондриального каскада» (Swerdlow, Kahn, 2004), снижение синтеза АТФ и окислительный стресс приводят к чрезмерной продукции Aβ, который, в свою очередь, может напрямую оказывать токсическое действие на митохондрии, усугубляя нейродегенеративные процессы. Запуск «порочного круга» нейродегенерации приводит к гиперфосфорилированию тау-белка, дисфункции синапсов, воспалению, апоптозу и становится маркерным, финальным событием в патогенезе БА. Снижение клеточных функций при старении и развитии БА сопряжено с изменением экспрессии многочисленных генов. Обнаружение мутаций генов APP, PSEN1 и PSEN2 определило значительный успех в изучении патогенеза наследственной формы БА, на которую приходится около 5% всех случаев заболевания. Несмотря на выявленные ассоциации с полиморфизмами в ряде генов, конкретные молекулярногенетические механизмы развития спорадической формы БА, перехода физиологических возрастных изменений мозга в патологический процесс, остаются не ясными. Такая ситуация обусловлена невозможностью исследовать эти вопросы на людях, тем более – ранние доклинические стадии развития БА, а также отсутствием адекватных биологических моделей заболевания. Лавинообразно нарастает количество генетических моделей БА, среди которых доминируют моногенные: это или трансгенные, или животные с нокаутом генов, или животные с определенными мутациями. Такой подход приближает к пониманию вклада конкретного гена в развитие наследственной формы БА, но не воспроизводит все фенотипические проявления спорадической формы БА - комплексного заболевания полигенной природы. Уникальной генетической моделью преждевременного старения и связанных с ним заболеваний является линия крыс OXYS, созданная в ИЦиГ СО РАН селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы. В 5ти первых поколениях развитие катаракты провоцировали нагрузкой галактозой, в дальнейшем отбор вели по ранней спонтанной катаракте, сцепленно с которой животные унаследовали комплекс признаков преждевременного старения, в том числе ускоренное старение мозга (Kolosova et al., 2009; Колосова и др., 2014; Stefanova et al., 2010). На фенотипическом уровне оно проявляется формированием уже к возрасту 3 мес. пассивного типа поведения, повышенной тревожности, нарушением способности к обучению на фоне нейродегенеративных изменений, выявленных методами 8 магниторезонансной томографии (Колосова и др., 2011). О снижении когнитивных функций у молодых крыс OXYS свидетельствует и нарушение формирования длительной посттетанической потенциации (Береговой и др., 2011). Механизмы ускоренного старения мозга крыс OXYS остаются неясными, но комплексное проявление признаков преждевременного старения и развитие возрастзависимых заболеваний уже в молодом возрасте предполагает общие молекулярно-генетические основы. Методом QTL-анализа были выявлены локусы, ассоциированные с развитием у крыс OXYS катаракты, ретинопатии и особенностей поведения (Korbolina et al., 2012). Функциональная аннотация локусов выявила «обогащение» района генами, связанными с нейродегенерацией, в том числе – с метаболическим путем БА. Это обстоятельство наряду с характерными для крыс OXYS фенотипическими проявлениями послужило основанием для изучения в настоящей работе механизмов ускоренного старения мозга этих животных и анализа возможной их связи с патогенезом БА. Их знание является необходимым условием доказательства соответствия линии критериям модели спорадической формы БА и перспективности ее использования для исследования патогенеза заболевания и поиска новых терапевтических мишеней для профилактики БА. Как перспективный нейропротектор, потенциально способный влиять на «горячие точки» патогенеза БА, нами был исследован антиоксидант пластохинонил-децилтрифенилфосфоний (SkQ1, «ионы Скулачева»), эффективность которого доказана в профилактике и лечении целого ряда ассоциированных со старением заболеваний (Бакеева и др., 2008; Нероев и др., 2008; Vays et al., 2014). Цель исследования – изучить механизмы ускоренного старения мозга крыс OXYS, их возможную связь с патогенезом болезни Альцгеймера и оценить эффекты антиоксиданта SkQ1 на некоторые функции мозга у этих животных. Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи: 1. Изучить связь манифестации фенотипических проявлений ускоренного старения мозга крыс OXYS (поведенческих, нарушения способности к обучению и памяти) с изменениями структурно-функциональных параметров пирамидных нейронов и синапсов гиппокампа и префронтальной коры головного мозга. 2. Определить уровень и локализацию маркеров болезни Альцгеймера в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар (контроль) разного возраста: 9 Aβ пептида, его предшественника белка АРР, тау-белка и его фосфорилированной формы. 3. Провести сравнительное ультраструктурное исследование гиппокампа крыс OXYS и Вистар разного возраста, определить активность цитохром с оксидазы как маркера активности IV комплекса дыхательной цепи для оценки вклада изменений структурно-функционального состояния митохондрий мозга в развитие нейродегенеративных изменений. 4. Исследовать методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq) изменения транскриптома префронтальной коры мозга крыс OXYS и Вистар с возрастом и определить межлинейные различия в экспрессии генов. 5. Провести функциональную аннотацию дифференциально экспрессирующихся генов и выявить вероятные метаболические пути, с изменениями которых ассоциировано ускоренное старение мозга крыс OXYS. 6. Исследовать влияние приема антиоксиданта SkQ1 на развитие и прогрессию нейродегенеративных процессов у крыс OXYS. Научная новизна Впервые установлено, что ускоренное старение мозга крыс OXYS ассоциировано с развитием ключевых патогенетических и «клинических» признаков спорадической формы БА. Показано, что формирование пассивного типа поведения, повышенной тревожности и снижение способности к обучению у крыс OXYS к возрасту 3-4 мес. по времени совпадает с развитием в гиппокампе и префронтальной коре деструктивных изменений нейронов, синаптической недостаточности, дисфункции митохондрий и гиперфосфорилирования тау-белка. Нарушения поведения и когнитивных способностей у крыс OXYS с возрастом усиливаются на фоне прогрессии деструктивных изменений нейронов и их гибели, снижения плотности синапсов и активных зон их контактов, дисфункции митохондрий, гиперфосфорилирования тау-белка, повышения к возрасту 12 мес. уровня Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре и образования амилоидных бляшек в мозге. При этом усиленное накопление Aβ в мозге с возрастом становится вторичным событием при развитии у крыс OXYS признаков БА. Впервые методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq) исследован профиль экспрессии генов в префронтальной коре крыс OXYS. На 10 основании сравнения транскриптома коры мозга крыс Вистар и OXYS разного возраста определены гены, экспрессия которых изменяется с возрастом и при развитии признаков БА у крыс OXYS. Установлено, что развитие признаков БА у крыс OXYS происходит на фоне изменения уровня мРНК более 900 генов, их прогрессия – более 2000 генов, основная часть которых связана с нейрональной пластичностью, фосфорилированием белка, Са2+ гомеостазом, гипоксией, иммунными процессами и апоптозом. С возрастом в префронтальной коре крыс Вистар изменяется экспрессия 499 генов, в то время как у крыс OXYS – более чем 5500 генов, включая 333 гена, общих для крыс OXYS и Вистар. Функциональная аннотация изменения экспрессии генов в префронтальной коре крыс OXYS с возрастом выявила их «обогащение» 85 генами из метаболического пути БА, связанными с процессингом АРР, агрегацией и деградацией Aβ, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий, синаптическими процессами. Впервые установлено, что способность антиоксиданта SkQ1 не только предупреждать и замедлять формирование фенотипических проявлений ускоренного старения мозга (нарушения поведения и снижение когнитивных функций), но и снижать их выраженность на стадии активной прогрессии у крыс OXYS связана с его влиянием на ключевые признаки БА. Показано, что SkQ1 предупреждает и/или замедляет деструктивные изменения нейронов, снижение плотности синапсов, гиперфосфорилирование тау-белка и усиленное накопление Aβ в мозге крыс OXYS, существенно улучшая структурно-функциональные параметры митохондрий. Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая и практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс OXYS критериям модели спорадической формы болезни Альцгеймера, возможности её использования для исследования этиологии и патогенеза связанных с заболеванием нейродегенеративных процессов, в том числе на ранних доклинических стадиях их развития, а также для корректной оценки эффективности терапевтических воздействий, направленных на лечение и профилактику возрастных нарушений функций мозга и развития БА. Выявленные в работе эффекты SkQ1 на крысах OXYS и Вистар демонстрируют высокий нейропротекторный потенциал антиоксиданта, перспективность его использования в профилактике старения мозга и развития характерных для болезни Альцгеймера нейродегенеративных процессов. 11 Положения, выносимые на защиту 1. Линия крыс OXYS соответствует основным критериям модели спорадической формы болезни Альцгеймера и может быть рекомендована для исследований этиологии и патогенеза этого заболевания, а также для изучения эффективности терапевтических воздействий, направленных на его лечение и профилактику. 2. Развитие патогенетических признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS происходит на фоне изменения уровня мРНК более 900 генов, их прогрессия - более чем 2000 генов, основная часть которых связана с нейрональной пластичностью, фосфорилированием белка, Са2+ гомеостазом, гипоксией, иммунными процессами и апоптозом. Как и у людей с болезни Альцгеймера, развитие признаков заболевания у крыс OXYS ассоциировано с изменением в префронтальной коре мозга активности метаболического пути болезни Альцгеймера – экспрессии 85 вовлеченных в него генов. 3. Антиоксидант SkQ1 способен замедлять развитие и снижать выраженность ключевых признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS, существенно снижая выраженность деструктивных изменений митохондрий мозга. Апробация результатов Результаты, полученные при выполнении диссертационного исследования, представлены и обсуждены на: 2-ой Международной конференции «Homo sapiens liberatus» (Москва, 2015), 9th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/System Biology (BGRS\SB-2014: Новосибирск, 2014), Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2014), 11th International Conference AD/PD (Флоренция, Италия, 2013), FENS Featured Regional Meeting (Прага, Чехия, 2013), FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013), «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2012, 2013), 2nd international conference «Genetics of Aging and Longevity» (Москва, 2012), 7-м Сибирском физиологическом съезде (Красноярск, 2012), III съезде геронтологов и гериатров России (Новосибирск, 2012), III международной научнопрактической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Postgenome-2012: Казань, 2012), 8th FENS Forum of Neuroscience (Барселона, Испания, 2012). 12 Публикации По материалам диссертации опубликовано 19 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации результатов диссертационных исследований. Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащей 534 источника (из них 29 отечественных и 505 иностранных). Работа изложена на 262 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 59 рисунков и 2 приложения. Личный вклад автора В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов, в анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования – от постановки задачи и проведения экспериментов, до анализа, обсуждения и оформления всех полученных результатов. Благодарности Автор выражает глубокую признательность научному консультанту проф., д.б.н. Н.Г. Колосовой за поддержку и обсуждение научных результатов. С особой признательностью автор благодарит сотрудников ИЦиГ СО РАН за плодотворную совместную работу: к.б.н. Н.А. Муралеву – за проведение исследований методами вестерн-блот и дот-блот анализов, ИФА; к.б.н. Н.И. Ершова – за первичную обработку полученных результатов методом массового параллельного секвенирования, к.б.н. О.С. Кожевникову и Е.Е. Корболину – за обсуждение научных результатов, к.б.н. Е.В. Киселеву – за проведение исследования методом электронной микроскопии, а также сотрудницу ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России К.Ю. Максимову – за проведение исследований методами световой и электронной микроскопии. 13 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Болезнь Альцгеймера (БА) Болезнь Альцгеймера (БА) – самое распространенное нейродегенеративное заболевание, которое становится причиной деменции на фоне атрофических изменений мозга, приводящих к нарушению внимания, памяти, работоспособности и, в конечном счете, к смерти в течение 3-9 лет после постановки диагноза. Заболеваемость БА растет по мере увеличения продолжительности жизни и постарения населения развитых стран. Так, по данным Всемирной организации здравоохранения, в мире более 35 миллионов человек страдают БА, а к 2050 году, по прогнозам, таких больных будет больше 115 миллионов (Querfurth and LaFerla, 2010; Morley et al., 2012). Принципиальным фактором риска развития БА является пожилой возраст. Более того, случаи заболеваемости БА удваиваются каждые 5 лет после 65 лет и увеличиваются с возрастом (Feng and Wang, 2012). В такой ситуации исследования фундаментальных механизмов БА и разработка основанных на их знании патогенетически обоснованных способов профилактики и лечения приобрели особую актуальность. Принципиально важно, что в отличие от многих других нейродегенеративных заболеваний, проблемы раннего диагностирования БА обусловлены, прежде всего, сходством проявлений снижения когнитивных способностей у больных БА и у людей при нормальном старении. Так, незначительные нарушения памяти на недавние события, трудности симптоматическими в запоминании проявлениями БА. новой информации Прогрессирующее являются ранними ухудшение памяти, интеллекта в течение всего нескольких последующих лет, протекающее на фоне атрофии мозга, приводят к полному распаду личности и фатальному исходу, как правило, от различного рода осложнений, например, легочной пневмонии (Drachman, 2014). В целом, необходимым условием существенного продления периода здоровой жизни человека является выяснение фундаментальных механизмов старения мозга и раскрытие молекулярно-генетических предпосылок развития нейродегенеративных заболеваний, таких как БА. 14 1.1.1. Наследственная и спорадическая формы развития БА В 1907 г. Алоис Альцгеймер – немецкий невропатолог и психиатр – выступил со знаменитой лекцией о «необычном заболевании коры головного мозга» 51-летней женщины, развитие которого сопровождалось потерей памяти, дезориентацией, галлюцинациями и, в конечном счете, привело к смерти в возрасте 55 лет (Bick, 1999). В последующих работах А. Альцгеймер описал характерные морфологические особенности, обнаруженные при постмортальном исследовании мозга этой пациентки – наличие «особенной субстанции» в виде бляшек и нейрофибриллярных клубков. В 1910 г. авторитетный психиатр Э. Крэпелин в своей книге назвал эту пресенильную деменцию «Болезнь Альцгеймера» (Schwab et al., 2004). Несмотря на то, что церебральные бляшки были обнаружены пятнадцатью годами ранее, а нейрофибриллярные клубки – в 1907 г., название заболевания, данное в честь А. Альцгеймера, сохранилось (Duff and Suleman, 2004). В течение 70 лет диагноз БА ставили больным только с пресенильной деменцией (возраст до 65 лет, чаще до 40-50 лет), случаи заболеваемости, которой были крайне редки. Больных сенильной деменцией (возраст старше 65 лет) было существенно больше. Из-за сходности клинических и нейропатологических проявлений в 1976 г. Р. Катзманом было предложено объединить пресенильную и сенильную деменции и диагностировать их как БА (Katzman, 1976). О накоплении «особенной субстанции» в мозге, в частности, на стенках церебральных сосудов больных деменцией было известно с конца 20-х гг. XX века (Divry, 1927), однако вплоть до 80-х гг. неизвестному пептиду отводили роль лишь как вторичного продукта при нарушениях функций иммуноглобулинов (Glenner, 1975). Только в 1984 г. было обнаружено, что основными в составе «особенной субстанции» становятся маленькие пептиды массой 4.2-кДт, длиной, преимущественно, 40 или 42 аминокислоты (Glenner and Wong, 1984). Ученые предположили, что пептид, названный амилоид-β (Aβ), является продуктом большого белка предшественника (Glenner and Wong, 1984), который вскоре был идентифицирован (amyloid precursor protein, АРР) (Kang et al. 1987). Было обнаружено, что уровень и молекулярный состав Aβ пептидов в мозге больных БА и когнитивно здоровых людей различен. На основании этого было выдвинуто предположение, что изменение содержания Aβ в мозге может быть ассоциировано с БА (Glenner and Wong, 1984). 15 Прорывом в понимании этиологии БА явилось использование генетических подходов. В 1991 г. было обнаружено, что раннее, наследственное развитие БА у пациентов из шести семей характеризуется наличием мутации гена на хромосоме 21 (Goate et al., 1991; Chartier-Harlin et al., 1991). Было выявлено, что этот ген кодирует белок АРР, маленькие белки которого (Aβ40, Aβ42) составляют основу сенильных бляшек. Не менее значительным событием в начале 90-х годов стало обнаружение также у больных с ранним началом, аутосомно-доминантного характера наследования – наследственной формы БА (НФБА) – мутаций на хромосоме 14 или на хромосоме 1 (St George-Hyslop et al., 1992; Sherrington et al., 1995). Эти мутации вызывали нарушение структуры фермента комплекса γ-секретазы, участвующей в синтезе АРР. Более 180 мутаций обнаружено в генах, получивших название гены-пресенелины, PSENs, которые становятся причиной увеличения продукции Aβ42 и развития НФБА (Rogaev et al., 1997; Hardy and Selkoe, 2002; Areza-Fegyveres et al., 2007). На основании выявленных генетических факторов БА для раскрытия молекулярно-генетических механизмов заболевания в течение 90-х годов начали интенсивно создаваться линии трансгенных мышей – моделей НФБА – с мутациями человеческого АРР и/или PSENs (Hsiao et al., 1996). У этих животных развивались амилоидные бляшки в мозге, нарастающие с возрастом нарушения поведения и снижение нейрональной и синаптической популяции в гиппокампе (West et al., 2009). В связи с обнаруженными амилоид-зависимыми генетическими мутациями в случаях НФБА, было предположено, что Aβ может являться причиной и позднего развития заболевания – спорадической формы БА (СПБА). В поддержку амилоидной концепции свидетельствовали результаты клинических исследований с использованием амилоид-связывающих радиоизотопных лигандов: в мозге больных БА было обнаружено повышенное содержание Aβ пептида (Klunk et al., 2004; Fleisher et al., 2011). В этой связи масштабные экспериментальные и клинические испытания фармакологических препаратов были направлены, в первую очередь, на поиск способных вызывать снижение уровня Aβ и содержания амилоидных бляшек в мозге. Однако, несмотря на то, что испытания ряда препаратов в экспериментальных условиях продемонстрировали способность не только снижать уровень Aβ в мозге, но и замедлять нарушения когнитивных функций при прогрессии заболевания, количество препаратов, успешно прошедших клинические испытания, крайне ограничено. Можно полагать, 16 обусловлено это в значительной мере тем, что оценка эффективности препаратов была выполнена на биологических моделях БА, среди которых доминируют моногенные: это или трансгенные, или животные с нокаутом генов, или животные с определенными мутациями. Использование таких моделей приближает к пониманию вклада конкретных генов в развитие НФБА, случаи заболеваемости, которой составляют около 5%. Адекватных «естественных» биологических моделей такого комплексного мультифакторного заболевания полигенной природы как СФБА, на которую приходится около 95% случаев заболевания БА, практически нет. Сочетанное развитие БА с другими возраст-зависимыми заболеваниями, в том числе диабетом, сердечнососудистыми заболеваниями, артритом, остеопорозом, а также ассоциация её развития с травмами головы, курением, депрессией осложняют поиск молекулярных мишеней и генов, вовлеченных в этиологию и патогенез заболевания. 1.1.2. Генетические факторы риска БА Генетическая предрасположенность является четко установленным фактором риска БА (Ridge et al., 2013; Guerreiro et al., 2015). Причиной или фактором риска развития БА становятся мутации или полиморфизмы в ряде генов. Наследственная форма БА. Случаи заболеваемости НФБА составляют по одним данным ~ 1% (Blennow et al., 2006), по другим ~ 6-7% (Patterson et al., 2008) всех случаев БА. Хотя НФБА является доминантно наследуемым заболеванием, только для ~13% случаев заболевания проявляется полная пенетрантность аутосомно-доминантного наследования (Patterson et al., 2008). Причинами развития НФБА становятся мутации трех генов: АРР (Goate et al., 1991), PSEN1 (Sherrington et al., 1995) и РSEN2 (Levy-Lahad et al., 1995). Как отмечалось выше, первым выявленным геном, ассоциированным с БА, стал кодирующий белок предшественник амилоида-β АРР в локусах 21q21.2 - 21q21.3. Существует 10 изоформ АРР, 3 из которых наиболее распространены: изоформа АРР длиной 695 аминокислоты, доминирующая в нейронах центральной нервной системы (ЦНС), и изоформы АРР-751 и АРР-770, которые в ЦНС присутствуют в следовых количествах (Bayer et al. 1999). Белки семейства АРР (695-770) состоят из гидрофильного N-концевого внеклеточного домена, гидрофобного трансмембранного домена и С-концевого цитоплазматического домена (O’Brien and Wong, 2011). 17 Физиологические функции АРР до сих пор остаются недостаточно изученными, однако считается, что АРР вовлечен в аксональный транспорт, он необходим для нормального развития нервной системы млекопитающих (Hardy and Selkoe, 2002), выживания и восстановления нейронов после повреждений (Turner et al., 2003). В мембраносвязанном состоянии АРР может выполнять сигнальную рецепторную функцию в процессе нейрогенеза (de Strooper and Annaert, 2001; Wilquet and de Strooper, 2004), принимать участие в регуляции синаптогенеза и нейрональной трансмиссии (Moya et al., 1994; Roch et al., 1994; Meziane et al., 1998), а также участвовать в процессах внеклеточной адгезии (Priller et al., 2006). Обнаружено 25 патогенетических мутаций АРР, ассоциированных с БА (http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations) (Cruts and Van Broeckhoven, 1998; Thinakaran and Koo, 2008), с которыми связано около 13-16% всех случаев заболеваемости НФБА (Janssen et al., 2003). Дупликации АРР, которые становятся причиной НФБА, обнаружены и у людей с синдромом Дауна (Geller and Potter, 1999; Raux et al., 2005), у которых после 40 лет развивается также и характерная для БА деменция. В зависимости от локализации в гене мутации АРР может быть повышен уровень только Aβ42 или Aβ40 и Aβ42, но существуют варианты, при которых общая продукция Aβ может быть снижена (Citron et al., 1992, 1994; Nilsberth et al., 2001). Большинство случаев НФБА (по разным данным от 18% до 70%) связано с мутацией в локусе 14q24.3 гена PSEN1 (Hutton et al., 1996), кодирующего белок пресенелин-1, компонента γ-секретазы, участвующей в синтезе АРР (Steiner et al., 2002). Обусловленное мутацией гена PSEN1 заболевание характеризуется более ранним началом (в среднем в возрасте 45 лет) и более быстрым прогрессированием (в среднем 6-7 лет после постановки диагноза). На сегодня известно 185 мутаций PSEN1 (http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations) (Ridge et al., 2013), следствием которых становится изменение активности γ-секретазы, увеличение продукции Aβ42 (Schellenberg et al., 1992; Citron et al., 1997). У больных НФБА с мутациями PSEN2 в локусах 1q31-q42 заболевание развивается позже (в среднем в 54 года), такие больные живут дольше (в среднем 11 лет после постановки диагноза) и заболевание проявляется более вариабельной пенетрантностью (Sherrington et al., 1996; Jayadev et al., 2010). На сегодня известно 12 мутаций PSEN2 (Cruts and Van Broeckhoven, 1998), следствием которых становится 18 увеличение продукции Aβ42 (Steiner et al., 2002), что предполагает связь между пресенилинами и АРР. Белки PSEN1 и PSEN2 экспрессируются в нейронах и широко распространены в ЦНС. Функции PSEN2 в норме и в результате мутации кодирующего его гена неизвестны, однако предполагается, что они сходны с функциями PSEN1 (Kovacs et al., 1996). Спорадическая форма БА. Важной вехой в исследовании патогенеза СФБА стало открытие роли гена, кодирующего аполипротеин Е (АроЕ). Ген APOE, расположенный на 19-й хромосоме, имеет три аллеля: 𝜀2, 𝜀3 и 𝜀4. Было установлено, что среди больных СФБА распространенность аллеля 𝜀4 существенно выше, чем среди здоровых людей, что позволило рассматривать его присутствие как значимый фактор риска заболевания (Andreasson et al., 2014). В то же время у многих больных аллель 𝜀4 отсутствует и, напротив, имеется у многих здоровых. Соответственно, его наличие не является ни необходимым, ни достаточным условием БА, но служит важным фактором риска развития заболевания. Полагают, что APOE 𝜀2 снижает риск развития БА (Corder et al., 1994). Помимо своей главной функции – транспорта холестерина в ЦНС – АроЕ также участвует в метаболизме Aβ, его агрегации и накоплении. Нарушение функций АроЕ приводит к повышению в плазме уровня холестерина и триглециридов (Mahley, 1988). Недавно обнаружено, что в крайне редких случаях развитие СФБА может быть ассоциировано с мутацией APP (rs63750847) (Jonsson et al., 2012), а также PSEN1, PSEN2 (Kauwe et al., 2007; Cruchaga et al., 2012). Также в ряду крайне редких вариантов выделяют недавно идентифицированный вариант rs75932628 в гене TREM2 (Guerreiro et al., 2013; Jonsson et al., 2013), участвующем в регуляции фагоцитарной активности и/или воспалительного ответа (Guerreiro et al., 2013). Согласно последним данным полногеномного анализа ассоциаций (Genome-wide association studies, GWAS), идентифицированные генетические факторы риска СФБА функционально можно разделить на три перекрывающиеся группы/пути: (i) клеточносинаптическое функционирование (BIN1, PICALM, CD33 и SORL1), (ii) иммунная система (TREM2, CR1, CD33 и CLU) и (iii) гены, связанные с метаболизмом липидов (APOE, ABCA7, CLU) (Jones et al., 2010). Непосредственную связь между этими путями или их связь с Aβ определить достаточно трудно. Однако недавние данные свидетельствуют о связи между Aβ патологией и/или БА и уровнями белков, связанных 19 с эндосомально/лизосомальной активностью, микроглиальной активацией, функциями синапсов (Mattsson et al., 2011, 2013; Daborg et al., 2012; Armstrong et al., 2013). В другой международной базе данных ALZGENE (см. http://www.alzgene.org/) представлен «топ-лист» десяти локусов, изменения экспрессии генов в которых ассоциировано с СФБА (Bertram et al., 2007). В зависимости от функций, сигнальных путей или семейства гены можно разделить на следующие функциональные группы: аполипротеины и липидный гомеостаз; гены, вовлеченные в процессы эндоцитоза; белки семейства MS4. Так, среди аполипротеинов, помимо АРОЕ, фактором риска рассматривается кластерин (CLU) в локусах 8p21-p12. CLU участвует в процессе клиренса Aβ (DeMattos et al., 2004; Bell et al., 2007), а также может повышать токсичность Aβ42 (DeMattos et al., 2002). Выявлена корреляция между повышением уровня CLU и скоростью снижения когнитивных способностей (Thambisetty et al., 2010; Schrijvers et al., 2011; Thambisetty et al., 2012). Кроме того, Aβ сам повышает экспрессию CLU (LaDu et al., 2000), что может быть связано с взаимодействием между Aβ40 и CLU (Matsubara et al., 1996; Zlokovic et al., 1996; Trougakos and Gonos, 2006). Другим геномкандидатом, ассоциированным с БА, рассматривается ABCA7 (Hollingworth et al., 2011; Naj et al., 2011). ABCA7 - АТФ-связанный переносчик участвует в липидном транспорте через клеточную мембрану и может подавлять фагоцитоз (Tanaka et al., 2010). Важная группа генов, ассоциированных с СФБА, вовлечена в процесс эндоцитоза: BIN1, PICALM, CR1 и CD2AP (Ridge et al., 2013). Так, ген BIN1, локализованный в локусе 2q14, осуществляет ряд функций. Во-первых, BIN1 участвует в эндоцитозе синаптических везикул (Cousin and Robinson, 2001; Seshadri et al., 2010) и, таким образом, также как при клатрин-опосредованном эндоцитозе, участвует в процессинге АРР (Wu and Yao, 2009). Во-вторых, BIN1 ингибирует формирование клатринсодержащих везикул – важного этапа в клатрин-опосредованном эндоцитозе (Simpson et al., 1999). Соответственно, снижение уровня BIN1 может, по-видимому, приводить к усиленному синтезу АРР и повышению продукции Aβ42 (Ridge et al., 2013). Для гена PICALM в локусе 11q14 изменение варианта rs3851179 повышает риск развития БА (Harold et al., 2009). PICALM участвует в транспорте белков и в эндоцитозе синаптических везикул, может контролировать GluR2 и VAMP2 (Cousin and Robinson, 2001; Harel et al., 2008, 2011). 20 Таким образом, обнаружение генов-кандидатов, ответственных за развитие БА, создает основу для развития представлений о биологических основах этого заболевания, однако функциональная роль выявленных мутаций и полиморфизмов в развитии БА для большинства генов остается неисследованной. 1.1.3. Патогенез БА 1.1.3.1. Нарушение процессинга белка предшественника амилоида бета (Aβ) и накопление Aβ как центральное событие в патогенезе БА На основании исследований генетических форм БА и синдрома Дауна (Busciglio et al., 2002), а также выявленных нейротоксических эффектов Aβ42 (Selkoe, 2001), в 1991-95 годах была предложена гипотеза «амилоидного каскада». Согласно этой доминирующей на сегодня гипотезе, в результате нарушения процессинга АРР, токсический Aβ пептид напрямую или опосредованно запускает каскад патологических процессов и становится центральным событием в патогенезе БА (рис. 1.1). Рис. 1.1. Гипотеза «амилоидного каскада» патогенеза БА. Согласно классической теории, инициирующим фактором развития НФБА и СФБА становится увеличение продукции токсического Aβ42. Накопление и олигомеризация Aβ42 запускает каскад патологических событий, конечным из которых, становится развитие деменции (по http://www.alzforum.org/images/res/adh/cur/sequence2005.gif с дополнениями). 21 Его следствием становится нарушение функций синапсов и клеточной коммуникации (Lacor et al., 2004, 2007), активация микроглии и астроцитов (CandelarioJalil, 2009; Choi and Bosetti, 2009), нарушение ионного гомеостаза, окислительные повреждения (Pratico and Delanty, 2000), дисфункция митохондрий (Massaad et al., 2009), нарушение киназной/фосфатазной активности, гиперфосфорилирование тау-белка, образование нейрофибриллярных клубков (Hardy and Selkoe, 2002) и, в конечном счете, развитие деменции (рис. 1.1). Aβ пептиды длиной 36-43 аминокислоты – естественные продукты метаболизма АРР, входящего в семейство крупных трансмембранных белков. В отличие от АРР, остальные в высокой степени гомологичные с АРР представители этого семейства белков – APLP1 и APLP2 – не содержат последовательности Aβ (Wasco et al., 1993). В нейронах АРР секретируется в больших количествах и метаболизируется крайне быстро. Протеолиз АРР осуществляется по двум альтернативным путям, по одному из которых осуществляется генерация Aβ (рис. 1.2). Рис. 1.2. Процессинг АРР. Не амилоидный путь инициируется α-секретазой, которая расщепляет АРР на большой внеклеточный домен АРР (sAPPα) и концевой фрагмент С83, который затем γ-секретазой расщепляется на внеклеточный белок р3 и амилоидный внутриклеточный домен (AICD). Амилоидный путь инициируется β-секретазой, которая расщепляет АРР на короткий внеклеточный домен sAPPβ и концевой фрагмент С99, который также под воздействием γ-секретазы образует Aβ и AICD. Процесс расщепления γ-секретазой в межмембранном пространстве получил название «регулируемый межмембранный протеолиз». После расщепления α- и β-секретазами sAPPα и sAPPβ, соответственно, секретируются фрагменты АРР. AICD-остаток (длиной около 50 аминокислот) направляется к ядру, где участвует в инициации транскрипционной активности генов (по Querfurth and LaFerla, 2010). 22 АРР синтезируется и гликолизируется в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР; рис. 1.3), затем переносится в комплекс Гольджи для созревания перед транспортом к клеточной поверхности (Molinari et al., 2004). Молекула АРР сразу после синтеза может активно фосфорилироваться (Tarr et al., 2002). После этого процессинг АРР переключается на амилоидный путь (с участием β-секретазы). Фосфорилированный АРР продвигается к мембране, где от него отщепляются Aβ пептиды (O’Brien and Wong, 2011), среди которых преобладают мономеры Aβ40. Предполагается, что в физиологических условиях Aβ участвует в модуляции ионных каналов (Kerrigan et al., 2008), активации киназ (Tabaton et al., 2010), регуляции транспорта холестерина (Yao and Papadopoulos, 2002). Также Aβ защищает другие белки от окислительных повреждений (Zou et al., 2002), участвует в процессах обучения и памяти (Morley et al., 2010), регуляции транскрипции ассоциированных с БА генов (Bailey et al., 2011). Рис. 1.3. Транспорт APP в нейронах. Синтезированный в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) APP (сиреневый) переносится в аппарат Гольджи для созревания и далее транспортируется в аксон (1) или в компартменты эндосом (2). После достижения АРР клеточной поверхности, часть APP расщепляется α-секретазой (6), генерируя sAPPα фрагменты, которые диффундируют во внеклеточное пространство (зеленый). Другая часть АРР, возвращается в эндосомы (3), где происходит генерация Aβ (синий). После протеолиза эндосомы перемещаются к клеточной поверхности (4), высвобождая Aβ (синий) и sAPPβ фрагменты. Транспорт эндосом к аппарату Гольджи (5) до расщепления АРР может быть опосредован ретромерами (по O’Brien and Wong, 2011). 23 Нарушение баланса между продукцией и клиренсом Aβ приводит к его усиленному накоплению в мозге. Aβ спонтанно агрегируется в несколько физических форм. Одна из них состоит из олигомеров (от 2 до 6 пептидов), которые объединяются в промежуточные группы (Klein et al., 2001; Kayed et al., 2003). Показано, что для синапсов токсичными становятся димеры и тримеры Aβ пептида (Walsh et al., 2005; Klyubin et al., 2008). Также Aβ может образовывать фибриллы, которые собираются в βлисты, состоящие из нерастворимых тяжей, и накапливаться, формируя бляшки, на стенках церебральных сосудов и в паренхиме головного мозга. В настоящее время растворимые олигомеры и промежуточные амилоиды рассматриваются как наиболее нейротоксические формы Aβ (Walsh and Selkoe, 2007). Впервые в работах in vitro было показано, что Aβ чрезвычайно токсичен для нейронов; его результатом становится гибель всех клеток в течение 24 часов (Yankner et al., 1989). Механизм гибели клеток обусловлен окислительными эффектами Aβ (Deshpande et al., 2006), при этом мутация одной аминокислоты Aβ пептида (метионин 35) элиминирует его способность генерировать АФК (Kanski et al., 2002). Токсическое действие Aβ было подтверждено в исследованиях in vivo (Yankner et al., 1990; Frautschy et al., 1991; Tanzi and Bertram, 2005). Так, у мышей с гиперэкспрессией мутантного человеческого АРР развитие деструктивных изменений нейронов к возрасту 4-6 месяцев протекает на фоне накопления Aβ пептида. Также для этих животных характерными оказались проявления нарушения пространственной памяти (Chen et al. 2000), снижение плотности синаптических терминалей (Irizarry et al. 1997, Spires et al. 2005), дисфункция синапсов (Kamenetz et al. 2003, Shankar et al. 2008), нейровоспаление (El Khoury et al. 2007). Регуляция уровня Aβ осуществляется неприлизин-подобной протеазой и инсулиновой протеазой. Неприлизин - заякоренная в мембране эндопептидаза цинка участвует в процессах деградации мономеров и олигомеров Aβ (Kanemitsu et al., 2003). Снижение уровня неприлизина становится причиной накопления Aβ в мозге (Iwata et al., 2001). Инсулиновая протеаза участвует в процессах деградации маленьких пептидов, таких как инсулин и мономеры Aβ пептида (Qiu et al., 1998). Так, ингибирование инсулиновой протеазы снизило деградацию Aβ более чем на 50% в мозге трансгенных мышей (Farris et al., 2003) и, напротив, гиперэкспрессия неприлизина и инсулиновой протеазы предупредила формирование бляшек (Leissring et al., 2003). 24 Накопление Aβ приводит к гибели нейронов, находящихся рядом с бляшками. Предполагается, что этот феномен связан с активацией олигомерными формами Aβ кальциевых каналов и облегченным входом Са2+ в нейроны через NMDA-рецепторы и, соответственно, развитием свободнорадикального окисления липидов мембран нейронов (Kowaltowski et al., 2001; Wilkinson, 2001; Szabò et al., 2012). По другим данным, гибель нейронов может становиться следствием активации АРР и Aβ пептидами экспрессии генов-индукторов апоптоза (Anderson et al., 1995). Доказательства нейротоксического действия Aβ, обусловленные его способностью напрямую или опосредованно запускать различные внутриклеточные сигнальные каскады (Moreira et al., 2005; Chaturvedi and Flint Beal, 2013), послужили весомым основанием считать накопление Aβ центральным событием в патогенезе БА. 1.1.3.2. Токсическое накопление Aβ как инициирующий фактор развития БА: аргументы за и против Основанные на амилоидной концепции интенсивные исследования роли Aβ в патогенезе БА в последние 20 лет существенно расширили представления о молекулярно-генетических механизмах заболевания. Однако вопрос о том, является ли накопление Aβ инициирующим фактором развития БА, остается открытым. Более того, в последние годы растет количество аргументов в пользу того, что гиперпродукция Аβ не становится пусковым моментом в развитии наиболее распространенной СФБА (Pimplikar, 2009; Pimplikar et al., 2010; Herrup, 2010; Armstrong, 2011; Fjell and Walhovd, 2012; Reitz, 2012; Krstic and Knuesel, 2013; Drachman, 2014). В этой связи в данном разделе будут представления рассмотрены об Aβ как результаты исследований инициирующем факторе как поддерживающих развития БА, так и свидетельствующие о возможности других патологических сценариев БА. Тау-белок, Aβ и гибель нейронов. БА характеризуется двумя основными нейропатологическими проявлениями: диффузными и фибриллярными бляшками, состоящими, в основном, из Aβ пептида, а также нейрофибриллярными клубками – конечными продуктами гиперфосфорилирования тау-белка (Lee et al., 2001; Selkoe, 2002). Их роль в патогенезе БА широко обсуждается (Spires-Jones et al., 2009). В ранних работах показана корреляция между наличием амилоидных бляшек и когнитивными нарушениями (Roth et al., 1966). Однако позднее было показано, что снижение 25 когнитивных способностей высоко коррелирует с увеличением количества нейрофибриллярных клубков, уменьшением плотности синапсов и гибелью нейронов (Terry et al., 1991; Arriagada et al., 1992; Gomez-Isla et al., 1997). Действительно, токсические эффекты агрегированных форм тау, а также олигомерных форм тау-белка на нейроны продемонстрированы в исследованиях in vitro (Khlistunova et al., 2006). В то же время накапливается все больше свидетельств того, что образование нейрофибриллярных клубков в нейронах становится лишь маркерным событием в нейродегенеративных процессах (Katsuse et al., 2006; Spires-Jones et al., 2008). Примечательно, что также все больше подтверждений находит представление о том, что амилоидные бляшки не являются причиной гибели нейронов и синапсов (Karran et al., 2011; Drachman, 2014), как это считалось ранее (Terry et al., 1999). Гибель нейронов, как правило, инициируется в гиппокампе и энторинальной коре, тогда как первые бляшки появляются во фронтальной коре, базальных ганглиях мозга. Как амилоидные бляшки могут дистанционно способствовать гибели нейронов и синапсов, остается неясным (Drachman, 2014). В пользу этих заключений свидетельствуют и результаты исследования 97 пожилых людей без клинических симптомов БА (средний возраст 84 года) (Price et al., 2009). В зависимости от использованного критерия у 20-40% когнитивно нормальных пожилых людей были выявлены нейропатологические проявления БА: наличие бляшек и нейрофибриллярных клубков (Price et al., 2009). При этом с возрастом у них отмечалось увеличение количества нейрофибриллярных клубков, но связи между формированием бляшек и возрастом выявлено не было. Не обнаружено также и корреляции между наличием нейрофибриллярных клубков, и амилоидных бляшек. Несмотря на то, что формирование нейрофибриллярных клубков характерно для других типов таупатии, принято считать, что их формирование вкупе с амилоидными бляшками является обязательным нейропатологическим условием БА (Braak et al., 2011). При этом опосредованная амилоидом патология по времени предшествует развитию тау-ассоциированной нейропатологии (Hardy and Higgins, 1992). Как доказательство, рассматриваются результаты многочисленных экспериментальных исследований, свидетельствующих о том, что при БА агрегация гиперфосфорилированного тау-белка опосредована эффектами Aβ пептида (Gotz et al., 2001; Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2003). Aβ может контролировать расщепление, 26 фосфорилирование тау-белка и, соответственно, принимать непосредственное участие в генерации нейрофибриллярных клубков. Фосфорилирование тау регулируется рядом киназ, включая циклинзависимую киназу 5 (Cdk5) и изоформу киназы гликогенсинтазуb (GSK3b), при этом обе киназы могут быть активированы Aβ пептидом (Lee et al., 2000; Hernandez and Avila, 2008). Кроме того, опосредованное стимулирование расщепления тау растворимыми формами Aβ пептида может происходить путем активации каспазы 3, каспазы 9 и кальпаина (Chung et al., 2001; Cho and Johnson, 2004). Эти результаты послужили основанием считать тау-белок важным медиатором нейротоксических эффектов Aβ. Аргументом в поддержку гипотезы «амилоидного каскада» явились и результаты исследований на животных с мутациями АРР, у которых развитие амилоидной патологии по времени предшествует формированию нейрофибриллярных клубков (Oddo et al., 2003). Следует отметить, что в отличие от других типов деменций, у пациентов с БА не выявлено мутаций тау (Gómez-Isla et al., 1997; Goedert and Jakes, 2005). Так, причиной аутосомно-доминантной фронто-темпоральной деменции становится мутация на хромосоме 17 (Hutton et al., 1998), которая вызывает сходную с БА таупатию, но без развития амилоидной патологии. Следовательно, причиной гибели нейронов могут становиться мутации тау в отсутствии токсического действия Aβ (Karran et al., 2011; Teich and Arancio, 2012). В норме тау-белок обеспечивает стабильность микротрубочек (Biernat et al., 1993), участвует в транспорте клеточных органелл и везикул (Probst et al., 2000), регулирует рост аксонов и дендритов (Dawson et al., 2001). N-концевой фрагмент тау-белка взаимодействует с плазматической мембраной и цитоскелетными белками нейрона, принимает участие в сигнальной трансдукции (Chen et al., 1992; Brandt et al., 1995). Фосфорилирование и гиперфосфорилирование тау-белков тесно связано с защитными механизмами клеток и процессами эвакуации фосфатов, других энергоемких продуктов метаболизма из зоны синтеза белка. Отмечается, что при продолжительной высокой интенсивности синтеза белка происходит перегрузка защитных механизмов и нарушается сопряжённость метаболических процессов (Мальцев и др., 2013). Высокие концентрации фосфатов в зоне синтеза белка в свою очередь способствуют фосфорилированию АРР, активации β-секретазы и переключению процессинга АРР на 27 амилоидный путь (Walter et al., 1997). Таким образом, механизм фосфорилирования транспортных белков играет в клетке как физиологическую, так и патологическую роль. Подобно олигомерам Aβ пептида, нерастворимые формы гиперфосфорилированного тау-белка агрегируются и становятся токсичными для клетки (Khlistunova et al., 2006). Так, гиперфосфорилирование тау-белка по аномальным сайтам приводит к образованию токсичных олигомеров и их агрегации (Abraha et al., 2000), структурному нарушению микротрубочек и их дезорганизации (Lu and Wood, 1993). Следствием этого становится развитие транспортного коллапса, блокада транспортных путей в нейроне, и, в конечном счете, гибель клетки (Ebneth et al., 1998). Недавно на культурах нейронов мышей, нокаутных по тау-белку (Tau-/-) и нейронах мышей дикого типа (Tau+/+) при исследовании транспорта митохондрий и TrkA-рецепторов в аксонах установлено, что добавление Aβ вызывает транспортный коллапс у Tau+/+ нейронов дикого типа, но не у Tau-/- нейронов (Vossel et al., 2010). Поскольку Aβ не участвует в процессах фосфорилирования белков, его добавление может вызывать интенсивный синтез белка в нейронах (Мальцев и др., 2013), что приводит к активному фосфорилированию тау-белка, а при длительном воздействии Aβ – к гиперфосфорилированию тау-белка и затем – к транспортному коллапсу. Окислительный стресс, нарушение фолдинга белков, снижение функций деградации поврежденных белков, нарушение регуляции клеточного цикла – характерные процессы при старении мозга – способствуют усиленному накоплению Aβ и тау-белка при БА (López Salon et al., 2000; Hoozemans et al., 2005; Bellettato and Scarpa, 2010). Так, у трансгенных мышей развитие таупатии сопровождается повышением уровня белков, участвующих в регуляции клеточного цикла (Andorfer et al., 2005), что авторы связывают с развитием у них нейродегенеративных изменений. Напротив, у другой модели таупатии, нейродегенеративные изменения связаны с ингибированием процессов клеточного цикла (Delobel et al., 2006). Значительный интерес вызывает роль каспаз как ключевого фактора в запуске апоптоза, в развитии БА и других нейродегенеративных заболеваний. Развитие амилоидной патологии и таупатии сопровождается активацией ряда каспаз, включая каспазу 3, 6, 7, 8 и 9, и расщеплением каспазами актина, фодрина и субъединицы p97 протеасомы (Rissman et al., 2004; Rohn et al., 2008; Rohn and Head, 2009; Halawani et al., 2010). Как отмечалось выше, стимулирование расщепления тау-белка путем активации 28 каспаз осуществляется растворимыми формами Aβ пептида (Chung et al., 2001; Cho and Johnson, 2004). В то же время, предполагается, что активация каспаз может быть ответной реакцией на токсические уровни гиперфосфорилированного тау-белка, обусловленные мутациями тау или спорадическими возраст-зависимыми процессами (Spires-Jones et al., 2009). Пытаясь предотвратить агрегацию токсических форм таубелка, каспазы расщепляют тау, тем самым замедляя гибель клетки. Однако при этом блокируется транспорт белков в аксонах, снижается деградация отработавших белков, нарушается биохимическая передача сигналов между клетками, что в конечном итоге приводит к гибели нейронов. Показано, что ингибирование каспаз (Rohn et al., 2009) и гиперэкспрессия антиапоптотического белка Bcl-2 (Rohn et al., 2008) снижают уровень фосфорилированного тау-белка и токсических форм Aβ пептида, формирование бляшек и нейрофибриллярных клубков, что способствует улучшению когнитивных способностей. В связи с этим одним из наиболее интересных аспектов, опосредованных каспазами клеточных повреждений, становится выяснение вопроса о том, является ли АРР мишенью для каспаз (Gervais et al., 1999; Galvan et al., 2006; O’Brien and Wong, 2011). Примечательно, что обусловленные каспазами повреждения при БА могут быть не связаны с апоптозом (Hyman, 2011), к которому зрелые нейроны резистентны. Aβ, синаптическая недостаточность и гибель нейронов. Синаптическая недостаточность и гибель нейронов становятся одними из наиболее ранних событий при развитии БА (Selkoe, 2002; de Calignon et al., 2012). При этом обнаружено, что сохранившаяся популяция синапсов демонстрирует компенсаторное повышение активности (Scheff et al., 2007), которая, парадоксально, увеличивает продукцию Aβ (Kamenetz et al., 2003; Cirrito et al., 2005; Gouras et al., 2010; Crimins et al., 2013). По мере прогрессирования БА плотность синапсов диспропорционально снижается относительно нейронов и её снижение высоко коррелирует с развитием деменции (Davies et al., 1987; De Kosky and Scheff, 1990; Terry et al., 1991). Как отмечалось выше, не обнаружено корреляции между наличием амилоидных бляшек в мозге и снижением плотности синапсов, а также с прогрессией деменции (Ingelsson et al., 2004). В то же время доказано, что растворимые олигомеры Aβ оказывают токсическое действие на синапсы и, соответственно, на развитие когнитивных нарушений (Selkoe, 2008; Crews and Masliah, 2010; Koffie et al., 2011; Sheng et al., 2012). В нано- и микромолярных концентрациях олигомеры Aβ вызывают 29 нарушение возбуждающей синаптической передачи сигнала, ингибируют долговременную потенциацию (Spires et al., 2005; Haass and Selkoe, 2007; Shankar et al., 2007, 2008; Li et al., 2009, 2011). Кроме того, недавно обнаружено, что накопление олигомерных форм Aβ в дендритных шипиках нейронов мозга больных БА коррелирует с деструктивными шипиками и их плотностью (Koffie et al., 2009, 2012). Наиболее вероятные потенциальные молекулярные механизмы эффектов олигомерного Aβ представлены на рис. 1.4 из работы Querfurth и LaFerla (2010). Вопервых, эффекты Aβ могут быть обусловлены его токсическим действием на рецепторы глутаматергических нейромедиаторов. Aβ облегчает эндоцитоз рецепторов N-метил-Dаспартата (NMDAr) и α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол пропионовой кислоты (AMPAr), что приводит к нарушению баланса между долговременной потенциацией (Roselli et al., 2005; Shankar et al., 2007) и долговременной депрессией (Snyder et al., 2005; Hsieh et al., 2006). Нарушение активности рецепторов глутамата приводит к увеличению концентрации внутриклеточного кальция, который в свою очередь активирует кальцинейрин (Kuchibhotla et al., 2008; Wu et al., 2010). На биологических моделях - животных с гиперэкспрессией АРР - обнаружено, что синаптическая дисфункция и снижение плотности синапсов могут быть обусловлены нарушением динамики митохондрий в синапсах, их транспорта и функций (Leuner et al., 2012; Balietti et al., 2013). Примечательно, что эти механизмы - кальциевая дисрегуляция, нарушения синаптических митохондрий, регуляция Cdk5 киназы (Qu et al., 2011) и активация каспаз (D’Amelio et al., 2011) - физиологически взаимосвязаны и могут быть опосредованы эффектами тау-белка. Совсем недавно в работе Shinohara и соавт. (2014) были приведены убедительные доказательства того, что механизмы патогенеза НФБА и СФБА могут быть различны. Так, подтверждено, что следствием токсического накопления Аβ в мозге больных НФБА становится нарушение процессинга АРР, тогда как у больных СФБА накопление Аβ опосредовано синаптическими процессами. Очевидно, что транссинаптическая миграция токсического Аβ в условиях реорганизации межнейронных связей может иметь решающее значение в патогенезе БА (Spires-Jones and Hyman, 2014). В пользу этого свидетельствуют и данные Ball и соавт. (2013): «распространение» таупатии из аксонов в сомато-дендритные компартменты нейронов и, более того, – из энторинальной коры в регионы гиппокампа при развитии признаков БА у трансгенных 30 Рис. 1.4. Дисфункция синапсов при БА. При развитии БА снижение плотности синапсов высоко коррелирует со снижением когнитивных способностей. В верхней части рисунка показан функционирующий синапс в норме; в нижней части – синапс с характерными для БА процессами. Гиперэкспрессия Aβ, особенно олигомерных форм Aβ, приводит к нарушению баланса между долговременной потенциацией (ДП) и долговременной депрессией (ДД), снижает число дендритных шипиков, что становится причиной нарушения синаптической пластичности. В высоких концентрациях олигомеры могут подавлять базальную синаптическую трансмиссию. Aβ облегчает эндоцитоз рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDAr) и α-амино-3-гидрокси-5-метил-4изоксазол пропионовой кислоты (AMPAr). Также Aβ связывается с рецептором нейротрофина p75 (p75NTr) и рецептором мозгового нейротрофического фактора (BDNF) – тирозин киназой В (TrkBr), усиливая снижение уровня BDNF и фактора роста нервов (NGF). Aβ нарушает сигнальную передачу рецептора никотин ацетилхолина (nAChr) и ацетилхолин (ACh) высвобождается из пресинаптической терминали. При умеренных когнитивных нарушениях сохранившийся синаптический профиль в гиппокампе демонстрирует компенсаторное увеличение размеров синаптических терминалей (по Querfurth and LaFerla, 2010). 31 мышей поддерживает гипотезу о роли синапсов в патогенезе БА. Результатом транссинаптической миграции токсичных пептидов в условиях реорганизации межнейронных связей при развитии БА, можно полагать, становится формирование независимых патологических систем мозга, которые могут интегрировать в функциональные системы мозга и, в конечном счете, вытеснять их. Стоит отметить исследования, направленные на оценку влияния обогащения среды и физических нагрузок на продукцию АРР и элиминацию Aβ в мозге. Так, на трансгенных мышах показано, что обогащение среды не только снижает уровень Aβ, но также стимулирует синаптические процессы и факторы роста (Yuede et al., 2009). Исследования на людях также показали, что стимулирование интеллектуальной деятельности, а также занятия физическими упражнениями оказывают протекторное действие в отношении деменции (Rovio et al., 2005, Verghese et al., 2006). Свидетельство того, что синаптическая активность регулирует продукцию Aβ в нейронах (Cirrito et al., 2008) послужило мощным толчком к дальнейшим исследованиям в этой области. Таким образом, исследования роли синапсов в патогенезе БА и поиск путей коррекции синаптической дисфункции как потенциальной терапевтической мишени, приобрели в последние годы особую актуальность. Aβ, воспаление и гибель нейронов. В последние годы стало очевидным, что одним из основных факторов, способствующих развитию БА, является старение иммунной системы ЦНС (Krstic and Knuesel, 2012). В исследованиях роли в патогенезе БА микроглии – ключевого клеточного элемента иммунной системы мозга – показано, что на ранних стадиях развития БА, до образования амилоидных бляшек, активация пролиферации микроглии содействует клиренсу Aβ (рис. 1.5). При активации микроглии изменяется паттерн экспрессии генов и соответствующих белков, что приводит к увеличению уровня цитокинов (TNFα, IL-1β, IL-6 и др.), хемокинов (CCL2, CCL5, CXCL10 и др.) и их рецепторов, компонентов системы комплемента (C1q, C3b), матриксных металлопротеиназ (MMP2, MMP3, MMP9), рецепторов опознавания паттерна: толл-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR7, TLR9), NOD-подобных рецепторов (NOD1, NOD2, NLRP3), рецепторов системы комплемента (CR1, CR3) (Barger and Basile, 2001; Shin et al., 2004; Park et al., 2005; Wu and Tsirka, 2009). Непосредственное взаимодействие микроглии с Aβ происходит через ансамбль рецепторов клеточной поверхности, в том числе, рецепторов опознавания паттерна, и в 32 Рис. 1.5. Воспаление и механизмы клиренса Aβ. Aβ формируется во внутриклеточных компартментах (эндоплазматическом ретикулуме, аппарате Гольджи и эндосомах) и может проникать в клетки с помощью связанных с липопротеином низкой плотности рецепторов (LRP-1). АРОЕ и α2-макроглобулины (α2М) выступают в этом процессе как шапероны и участвуют в формировании внеклеточных бляшек. Микроглия фагоцитирует Aβ. Астроциты также принимают участие в клиренсе Aβ. При БА микроглия и астроциты стимулируют экспрессию провоспалительных цитокинов. С помощью рецепторов к молекулам продуктов конечного гликирования (RAGE) токсические формы Aβ проникают в клетку из внеклеточного пространства и кровеносных сосудов. В условиях хронического нейровоспаления длительная активация микроглии способствует дегенеративным изменениям и нарушению целостности гематоэнцефалического барьера. Кроме того, клиренс Aβ осуществляется, преимущественно, протеазой неприлизин и ферментом инсулина (IDE). Олигомеры Aβ блокируют функцию протеасом, что способствует накоплению тау и агрегации Aβ (по Querfurth and LaFerla, 2010). 33 первую очередь, толл-подобных рецепторов. После связывания с Aβ толл-подобные рецепторы (TLR2, TLR4, TLR7, TLR9) инициируют активацию внутриклеточных сигнальных каскадов, приводящих к индукции фагоцитарной активности микроглии. В то же время активация толл-подобных рецепторов в нейронах повышает их уязвимость к токсическому действию Aβ. Роль сигналинга толл-подобных рецепторов в процессах нейрональной пластичности, их непосредственного воздействия на нейроны и глияопосредованным воздействием остается невыясненным. В процесс фагоцитоза Aβ также вовлечены компоненты системы комплемента, матриксных металлопротеиназ. Однако в условиях хронического нейровоспаления, сопровождающего БА, длительная активация микроглии может способствовать гибели нейронов (Querfurth and LaFerla, 2010). Отдельного внимания заслуживает недавно сформулированная гипотеза воспаления (Krstic and Knuesel, 2012), описывающая потенциальный сценарий патологических процессов при развитии СФБА. Методами 3D электронной микроскопии при исследовании мозга старых мышей дикого типа авторами было обнаружено, что связанные со старением внеклеточные накопления белков образуются из внутриклеточных «варикозных капсул» сферической формы (Doehner et al., 2012), которые иммуннореактивны с N-концевыми и Aβ-содержащими фрагментами АРР (Doehner et al., 2010). Некоторые из этих структур имели почковидную морфологию и содержали органеллы, при этом «варикозные капсулы» локализовались, в основном, непосредственно с клетками микроглии и астроцитов, которые, следовательно, обеспечивали консервативное нейропротекторное действие. Известно, что в результате снижения с возрастом функций иммунной системы и адаптивной реакции на стресс риск развития различного рода инфекций и возраст-зависимых заболеваний растет (Querfurth and LaFerla, 2010). Хроническое воспаление и клеточный стресс способствуют гиперфосфорилированию тау-белка (Krstic et al., 2012), следствием которого становится дестабилизация микротрубочек и нарушение аксонального транспорта (Kanaan et al., 2011). Эти изменения могут становиться причиной деструктивных изменений аксонов, накопления в них митохондрий и других органелл (Shemesh et al., 2008; Shahpasand et al., 2012). Как отмечалось выше, в условиях нарушения энергетического метаболизма фосфорилирование тау-белка может ещё больше усиливаться (Iijima-Ando et al., 2012) и приводить к формированию парных филаментов, предшественников нейрофибриллярных клубков (Krstic et al., 2012). В дальнейшем эти процессы приводят 34 к блокированию транспорта в аксонах, нарушению целостности и, в конечном счете, необратимой деструкции аксонов и гибели нейронов (Xiao et al., 2011). Таким образом, снижение синаптических контактов и снижение когнитивных способностей становятся следствием структурно-функционального нарушения аксонального транспорта, обусловленного гиперфосфорилированием тау-белка (Hoover et al., 2010; Krstic et al., 2012). При продолжительном повышении интенсивности синтеза белка и высокой концентрации фосфатов стимулируется фосфорилирование АРР, активация β-секретазы и переключение процессинга АРР на амилоидный путь (Walter et al., 1997; Xiao et al., 2011; Мальцев и др., 2013). Параллельно с патологическими процессами внутри нейронов системное воспаление вызывает пролиферацию клеток микроглии и астроцитов (Krstic et al., 2012). Длительная активация микроглии, как отмечалось выше, в свою очередь, способствует гибели нейронов. Кроме того, появились данные, указывающие на то, что нейродегенеративные изменения при БА являются результатом связанного со старением постепенно прогрессирующего снижения функций врожденного иммунитета ЦНС и потери нейропротекторных свойств микроглии, т. е. протекают на фоне её деструктивных изменений (Streit et al., 2009). Изменения с возрастом структуры клеток микроглии отражают утрату ею регуляторных функций, связанных с миграцией, клиренсом и, в конечном счете, выживанием нейронов. Соответственно, вопрос о причинноследственной связи между потерей микроглией нейропротекторных функций и накоплением Aβ, приводящим к гибели нейронов, остается открытым. 1.1.4. Окислительный стресс и дисфункция митохондрий в патогенезе БА На сегодня общепризнано, что окислительный стресс – нарушение баланса в системах генерации и детоксикации АФК – один из фундаментальных молекулярных механизмов патогенеза возрастзависимых заболеваний, в том числе БА. Однако до сих пор остается не ясным, является накопление окислительных повреждений причиной или следствием возрастных изменений организма. Мозг – метаболически активный орган, соответственно, в нейронах высока продукция АФК. Её чрезмерное усиление ведет к снижению эффективности когнитивных функций, но при физиологических концентрациях АФК участвуют в функциональных изменениях, необходимых для синаптической пластичности и, 35 следовательно, для нормальных когнитивных функций. Тонкая грань в переходе АФК от роли «хороших» молекул к роли «плохих» находится в центре внимания исследователей в последние годы, но далеко не полностью изучена (Watson et. al., 2006). Важно, что вызываемые окислительным стрессом изменения транскриптома в характерном для старения направлении по времени опережают фенотипические проявления возрастных изменений мозга, в частности, изменения памяти, способности к обучению (Blalock et. al., 2003; Burger et. al., 2008). АФК постоянно образуются в клетках живых организмов в процессе нормальной жизнедеятельности (энергетического метаболизма, метаболизма моноаминов и др.). Основным источником АФК в соматических клетках являются митохондрии, которые и становятся центральным звеном в цепи событий, приводящих к запуску окислительного стресса. Образуются АФК также в микросомальной электронно-транспортной системе при биотрансформации эндогенных и чужеродных химических соединений (Ahmed et al.,1995), в процессах фагоцитоза (Kinnula et al., 2002). Важна роль и системы цитохрома Р-450, локализованной в эндоплазматической сети (Gottlieb et al., 2003). Образованию АФК способствуют нарушения активности дыхательных ферментов и специальной группы соединений, депонирующих избыточный кислород, поддерживающих внутри клетки стационарное напряжение кислорода (Scialo et al., 2013; Zorov et al., 2014; Reczek and Chandel, 2014; Dai et al., 2014). Вероятность развития окислительного стресса в клетках мозга с возрастом растет. Происходящее при этом ухудшение памяти коррелирует с уменьшением в мозге и плазме крови содержания антиоксидантов (Dröge and Schipper, 2007). Соответственно, увеличивается уровень продуктов окислительного повреждения макромолекул: ДНК, белков, липидов (Bishop et. al., 2010; Witte et al., 2010). Причиной этого, по одним данным, становится постепенное усиление генерации АФК с возрастом, по другим – снижение функциональных резервов систем антиоксидантной защиты, ферментов репарации и деградации, агрегированных в результате окислительного повреждения белков (Lindner and Demarez, 2009; Witte et al., 2010). Очевидно, эти процессы развиваются параллельно. Стрессы, неблагоприятные факторы сpеды, неполноценное питание, заболевания, ведущие к активации свободнорадикальных процессов, способствуют раннему старению организма. Развивающийся при этом хронический окислительный стресс может приводить к деполяризации мембран нейронов, 36 изменению порога их чувствительности, к нарушению оптимальных условий функционирования рецепторов и каналов, транспортных систем, ферментов, сигнальной трансдукции и, как следствие, к нарушению функций мозга и риску развития нейродегенеративных заболеваний (Liu et al., 2002; Droge, 2002; Witte et al., 2010). Более того, в последние годы становится очевидным, что дисфункция митохондрий может быть одним из ключевых факторов, инициирующих развитие БА. Согласно гипотезе «митохондриального каскада» (Swerdlow and Kahn, 2004; Swerdlow et al., 2014), снижение синтеза АТФ, нарушение баланса генерации и детоксикации АФК приводят к чрезмерной продукции Aβ который в свою очередь, может напрямую оказывать токсическое действие на митохондрии, усугубляя нейродегенеративные процессы (рис. 1.6). Запуск «порочного круга» нейродегенерации способствует гиперфосфорилированию тау-белка, дисфункции синапсов, апоптозу и становится центральным, финальным событием в патогенезе БА. Следствием митохондриальной дисфункции становится подавление энергоемких процессов в нейронах, повреждение свободными радикалами мембранных структур клеток, нейровоспаление, нарушение синаптической передачи сигналов, увеличение высвобождения глутамата из пресинаптических терминалей, снижение пластичности синаптических контактов и, в конечном счете, гибель нейронов (Sierra et al., 2007; Kilbride et al., 2008). Способность Aβ запускать различные внутриклеточные сигнальные каскады усугубляет нейродегенеративные процессы. Установлено, что в мозге больных БА Aβ способен накапливаться в митохондриях и нарушать активность ферментов гликолиза и цикла Кребса, активизировать продукцию АФК (Chaturvedi and Flint Beal, 2013). При этом, как предполагается, на начальных стадиях развития БА накопление Aβ и гиперфосфорилирование тау-белка может быть вызвано защитной реакцией клетки на окислительный стресс (Moreira et al., 2005). По аналогии со стрессом по Селье – механизмом включения неспецифических адаптивных реакций организма в ответ на воздействие неблагоприятных факторов (Селье, 1979), АФК запускают каскады типовых защитных реакций на уровне клетки. Они активируют определенные факторы транскрипции, усиливают экспрессию ранних генов, синтез факторов антиоксидантной защиты, ферментов репарации, активируют белки теплового шока и усиливают экспрессию их генов. Одновременно подавляются процессы, сопряженные с генерацией активированных кислородных метаболитов – снижается скорость переноса электронов в 37 Рис. 1.6. Окислительный стресс и митохондриальная дисфункция. Aβ способствует продукции АФК и активных форм азота (АФА). Окислительные повреждения мембраны, ион-специфичные АТФазы и стимуляция механизмов входа Ca2+ (NMDA рецепторы (NMDAr), мембрано-атакующий комплекс (MAC) системы комплемента) приводят к избыточной концентрации Ca2+ в цитозоле и митохондриальном матриксе. Aβ активизирует высвобождение цитохрома с оксидазы (комплекс IV) из митохондрий, ключевые ферменты цикла Кребса (α-кетоглутарат и пируват дегидрогеназу) и повреждает митохондриальную ДНК (mtDNA). Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) также стимулируют фосфорилирование и агрегацию тау-белка, который в свою очередь ингибирует комплекс I. Вследствие снижения митохондриального мембранного потенциала (МРР) и открытия пор (ψm) происходит активация каспаз. Также Aβ активирует протеин киназу p38, c-jun N-концевую киназу (JNK) и ключевой белок сигнального пути апоптоза - p53. Увеличение интенсивности воздействия суицидных сигналов на митохондрии способствует снижению митохондриального трансмембранного потенциала, гиперпродукции АФК и высвобождению из митохондрий факторов, инициирующих механизмы реализации апоптоза (по Querfurth and LaFerla, 2010). 38 дыхательной цепи, развивается каскад событий, направленных на подавление процессов окислительного метаболизма, сопряженных с генерацией кислородных радикалов. Таким образом, АФК «работают» как сенсоры высокого напряжения кислорода. В результате кратковременные субтоксические повышения уровня АФК индуцируют формирование защитных механизмов, которые в дальнейшем ослабляют негативные эффекты последующего окислительного стресса, повышают адаптивные резервы организма (Starkov, 2008; Ristow and Zarse, 2010). Примечательно, что в определенных условиях снижение эффективности работы митохондрий способно увеличивать продолжительность жизни и повышать устойчивость нейронов мозга мутантных и трансгенных мышей к гибели (Liu et al., 2005; Dell’agnello et al., 2007). Механизмы этого феномена не вполне ясны, но возможно при умеренном повышении концентрации АФК выступают в роли сигнальных молекул, запускающих механизмы выживания клеток. Предполагается, что снижение экспрессии митохондриальных генов в клетках стареющего мозга может быть частью активного компенсаторного механизма повышения устойчивости к стрессу и эффективным ответом на кратковременный стресс. Однако ассоциированный с БА хронический стресс может подавлять нейродегенерации. активность митохондрий Возможность повысить и запускать «порочный жизнеспособность круг» и даже продолжительность жизни в условиях некоторого снижения эффективности работы митохондрий связано с описанным В.П.Скулачевым феноменом «мягкого разобщения», при котором небольшое снижение трансмембранного потенциала митохондрий и усиление нефосфорилирующего дыхания позволяют поддерживать концентрации О 2 и его одноэлектронных восстановителей на безопасно низком уровне, снижающем вероятность образования супероксид анионрадикалов (Papa and Skulachev, 1997; Skulachev, 1998). В результате происходящее при естественном старении повышение протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий становится, по образному выражению Brand (2000), «разобщением ради спасения». В нормально функционирующем организме концентрация кислородных радикалов находится под жестким контролем антиоксидантной защиты – специфических ферментативных и неферментативных механизмов, предупреждающих и устраняющих последствия повреждений, вызванных неизбежно протекающими в нём свободнорадикальными окислительными процессами (Меньщикова и др., 2008; Romano 39 et al., 2010). Как сигнальные молекулы, АФК вовлечены в регуляцию физиологических процессов на всех уровнях – от активности внутриклеточных ферментов до нервной регуляции и регуляции сосудистого тонуса, от пролиферации и клеточной дифференцировки до апоптоза и экспрессии генов, запускают воспалительный ответ и обеспечивают микробицидность фагоцитирующих клеток, участвуют в синаптической пластичности – способности к обучению и памяти (Dröge, 2002; Hidalgo et. al., 2007). Существуют убедительные доказательства участия низкомолекулярных АФК в межклеточных коммуникациях. Обеспечивая передачу внешнего сигнала к ядру, они, таким образом, влияют на экспрессию генов, изменяя её в том числе и при многих заболеваниях, включая БА (Bishop et. al., 2010). АФК участвуют в передаче сигнала при взаимодействии с клетками цитокинов, ряда гормонов и нейромедиаторов, в большинстве случаев они генерируются расположенной в плазматической мембране НАДФН-оксидазой дыхательной цепи митохондрий (Brown and Griendling, 2009; Forman et al., 2014; Reczek and Chandel, 2015). Следствием окислительного стресса становится изменение профиля экспрессии генов: усиление генерации АФК и NO приводит к активации путей внутриклеточной передачи сигналов, ответственных за запуск программы адаптивного ответа клетки, который обеспечивается через индукцию или репрессию разных сочетаний редоксзависимых генов (Hemish еt. al, 2003; Kregel and Zhang, 2007). Накапливается всё больше данных, свидетельствующих о том, что, изменения в редокс-зависимых сигнальных путях могут вносить больший вклад в старение, чем накопление окислительных повреждений макромолекул (Blagosklonny, 2008; Upham and Trosko, 2009). В основе их развития лежат изменения экспрессии генов, связанные с нарушением координации в клеточных сигнальных системах, обеспечивающих тканевой гомеостаз (Lambeth, 2007). Примечательно, что тау-белок и Aβ оказывают синергетическое действие, приводя к нарушению окислительного фосфорилирования, при этом на регуляцию активности комплекса I влияет тау-белок, а комплекса IV – Aβ (Rhein et al., 2009). Следствием прямого связывания фибрилл Aβ и АPP с митохондриальной мембраной становится нарушение энергетического метаболизма (Anandatheerthavarada et al., 2003; Reddy and Beal, 2008). При этом АРР накапливается, преимущественно, на каналах импорта белков из цитозоля в митохондриальный матрикс. Взаимодействуя с митохондриальной мембраной, АРР формирует стабильные комплексы с транслоказой 40 TOM40 и комплексы с TOM40/TIM23 (транслоказ внешней и внутренней митохондриальных мембран) (Devi et al., 2006; Chacinska et al., 2010; Lionaki and Tavernarakis, 2013). Это обуславливает подавление импорта в митохондрии кодируемых ядерным геномом белков: субъединиц IV и Vb цитохром-оксидазы, что приводит к увеличению продукции митохондриями перекиси водорода (Devi et al., 2006). Связывание гема Aβ пептидом приводит к его дефициту в клетке, что способствует развитию нарушений в гем-содержащем IV комплексе дыхательной цепи митохондрий (Atamna and Boyle, 2006). Кроме того, накопление Aβ в митохондриях способствует снижению ферментативной активности комплексов III и IV и снижению дыхания митохондрий (Manczak et al., 2006). Следует отметить, что в основе нарушений окислительного метаболизма при развитии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона также лежат нарушения функций митохондрий. Так, при болезни Хантингтона подавление аксонального транспорта митохондрий происходит под влиянием дефектных форм тау-белка и хантингтина, что приводит к нарушению обеспечения энергией отростков нервных клеток, основным следствием чего является нарушение синаптической передачи и дегенерация синапсов (Trushina et al., 2004; Thies and Mandeikow, 2007). Нарушение дыхательной функции митохондрий за счет блокирования митохондриального комплекса I играет важную роль в патогенезе болезни Паркинсона. Таким образом, нарушение транспорта, дыхательных функций и распределения митохондрий в нейронах является фактором, способствующим развитию дегенеративных процессов в нервной ткани. Окислительные повреждения, а также изменения структуры митохондриальных белков в результате накопления с возрастом и при развитии БА мутаций в мтДНК приводят к существенному снижению эффективности переноса электронов по дыхательной цепи и синтеза АТФ, к увеличению вероятности образования АФК, энергетическому дефициту (Batabyal et al., 2010). В условиях энергетического дефицита и усиленной генерации АФК интенсифицируются процессы ПОЛ, ведущие к нарушению структурной организации липидного бислоя и дальнейшему нарушению важнейших клеточных функций (Aragno et. al., 2006; Shibata et. al., 2006), росту внутриклеточной концентрации ионов кальция (Nilius and Droogmans, 2001; Smith and Pilati, 2002), активации протеолитических ферментов, вызывающих деградацию белков 41 цитоскелета (Mattson et al., 2000). Все это способствует запуску апоптоза и постепенному снижению плотности нейронов. Активации высвобождения митохондриальных апоптотических факторов способствует и Aβ за счет прямого или опосредованного воздействия на регуляторные белки: p53, Akt, Bad, Bax, Bcl-x(L) и др. Так, Aβ активизирует высвобождение цитохрома с из митохондрий за счет дефосфорилирования Bad под воздействием кальцинейрина (Cardoso and Oliveira, 2005). Показано, что Aβ индуцирует апоптоз цереброваскулярных клеток эндотелия за счет инактивации протеинкиназы Akt, препятствующей активизации сигналов апоптоза с участием Bad (Yin et al., 2005). Увеличение интенсивности воздействия суицидных сигналов на митохондрии трансмембранного потенциала, способствует гиперпродукции снижению АФК и митохондриального высвобождению из митохондрий факторов, инициирующих механизмы реализации апоптоза (рис. 1.6). Негативный эффект на функции митохондрий также оказывают нарушения внутриклеточной динамики митохондрий, процессов их деления и слияния. В тканях мозга больных БА обнаружено, что олигомерные формы Aβ взаимодействуют с динамин-подобным белком-1 (Drp1), ключевым белком, участвующим в процессе деления митохондрий (Manczak et al., 2011). Исследование на фибробластах больных СФБА показало снижение уровня Drp1, что может приводить к нарушению распределения и изменению ультраструктуры митохондрий (Wang et al., 2008a). В мозге больных БА выявлены изменения экспрессии генов, вовлеченных в процессы деления митохондрий (DRP1 и FIS1) и их слияния (MFN1, MFN2, OPA1 и TOM40) (Manczak et al., 2011). Кроме того, нарушение системы слияния/деления митохондрий сопровождается повышением экспрессии АРР: значительно снижаются уровни Drp1 и OPA-1, в то время как уровень Fis-1 существенно возрастает (Wang et al., 2008b). Накопление Aβ приводит к снижению скорости перемещения митохондрий, их размеров и численной плотности (Calkins and Reddy, 2011). Функциональная недостаточность системы деления и слияния митохондрий, ассоциированная с развитием БА, приводит к формированию митохондриальной дисфункции и активации процессов апоптоза. Высокая активность в нейронах митофагии, как и ослабление элиминации митохондрий со структурно-функциональными нарушениями, способствует смещению баланса между функционально полноценными и дефектными митохондриями (Sullivan et al., 2004; Lee et al., 2005; Sierra et al., 2007; Navarro and Boveris, 2009). 42 Механизмы, инициирующие нарушение функций митохондрий, причинноследственная связь между дисфункцией митохондрий и активацией токсического Aβ при развитии БА остаются недостаточно изученными. Такая ситуация обусловлена невозможностью исследовать эти вопросы на людях, тем более – на ранних доклинических стадиях развития у них БА. В этой связи становится очевидной необходимость создания адекватных биологических моделей для изучения механизмов заболевания и объективной оценки эффективности патогенетически обоснованных способов профилактики и лечения БА. В качестве таких потенциальных терапевтических агентов в течение многих лет активно исследуются вещества, обладающие антиоксидантными свойствами. 43 1.2. Потенциал антиоксидантов в профилактике и лечении БА Закономерно, что стратегия терапии БА определяется после постановки диагноза и на основании оценки тяжести заболевания и индивидуальных особенностей его течения. При этом поиск потенциальных терапевтических агентов направлен преимущественно на подавление специфических симптомов БА. Наиболее важным в этом отношении направлением становится поиск препаратов, способных ингибировать активность вовлеченных в холинергическую нейротрансмиссию, холинестеразы и ацетилхолинестеразы, и подавлять деградацию ацетилхолина в синаптических терминалях. В качестве потенциальных терапевтических агентов и стратегий рассматриваются нейротрофины, противовоспалительные препараты, антиоксиданты, статины, нестероидные гормональная терапия, блокирование эксайтотоксичности, вакцинация Aβ, иммунотерапия, эффекторы секретаз. Тем не менее, результаты экспериментальных и клинических исследований их эффективности противоречивы (Cummings et al., 2015). Возможности антиоксидантной терапии как одной из потенциальных терапевтических стратегий в профилактике и лечении БА исследуется на протяжении многих лет. На первый взгляд, целесообразность такой стратегии очевидна: она прямо вытекает из несомненной связи механизмов старения и патогенеза связанных с ним заболеваний с окислительным стрессом. В значительном количестве работ оценивалась перспективность применения липоевой кислоты, витамина Е (α-токоферола), витамина С и β-каротина как продуктов нормального функционирования клеток и внутриклеточных посредников (Grundman, 2000; Staehelin, 2005). В нормальных условиях жизнедеятельности расход антиоксидантов в результате прооксидантных воздействий компенсируется собственным синтезом и поступлением с пищей. Однако с возрастом и при различных заболеваниях, включая БА, усиление образования АФК и/или снижение способности клеток к их нейтрализации вследствие ограничения резервов систем антиоксидантной защиты приводят к нарушению баланса и развитию окислительного стресса (Droge, 2002; Valko et al., 2007; Gerich et al., 2009). В экспериментальных исследованиях подтверждена способность витамина Е подавлять токсические эффекты Aβ и улучшать когнитивные способности (Montiel et al., 2006; Devore et al., 2010). Однако вопрос о том, с какого возраста, в каких дозах и кому 44 следует начинать прием антиоксидантов, оказался принципиальным и непростым. Принято считать, что эффективность приёма антиоксидантов снижается по мере увеличения возраста, с которого было начато их применение. Поэтому антиоксиданты предлагается назначать при начальных проявлениях когнитивного старения с целью ограничения темпа старения и его перехода в патологический, ускоренный вариант развития (Анисимов, 2003, 2008; Коркушко и Шатило, 2008). В пользу этого свидетельствуют данные о том, что профилактические эффекты витамин Е, очевидно, может оказывать только на начальных стадиях БА до значительного повышения уровня Aβ и формирования амилоидных бляшек в мозге трансгенных мышей линии Tg2576 (Sung et al., 2004), по мере прогрессии нейродегенеративных изменений витамин Е не влиял на амилоидную патологию. Показано, что прием витамина Е значительно снижает опосредованную тау-белком нейротоксичность у дрозофил (Dias-Santagata et al., 2007) и тау патологию у трансгенных мышей – моделей таупатии и БА (Nakashima et al., 2004). Приводятся данные, свидетельствующие о том, что прием витамина Е предотвращал окислительные нарушения в мозге и когнитивные дефициты, вызванные окислительным стрессом, во время старения (Fikui et al., 2005; Kobayashi et al., 2009; Takatsu et al., 2009). Пероральное введение α-токоферола мышам увеличивало активность глутатионпероксидазы и глутатион-редуктазы в гиппокампе и префронтальной коре (Lobato et al., 2010). В 2009 г. опубликованы результаты пятнадцатилетних исследований влияния приема витамина Е на продолжительность жизни больных БА (Pavlik et al., 2009). Авторы сообщают, что при приеме антиоксиданта наблюдалась лишь тенденция к увеличению продолжительности их жизни, однако при приеме в высоких дозах витамина Е не отмечалось его влияния и на продолжительность жизни. В то же время важно отметить, что недавние результаты масштабных эпидемиологических исследований показали, что если недостаток антиоксидантов в рационе действительно может способствовать раннему развитию ассоциированных со старением заболеваний, то, оказалось, что их избыток не только не приносит пользы, но и приводит к негативным последствиям. Клинические испытания, выполненные на десятках тысяч людей, показали, что необоснованные добавки витамина Е приносят больше вреда, чем пользы: его длительный приём в дозах Е >400 у.е. в день повышает смертность, в том числе – от сердечно-сосудистых заболеваний (Greenberg, 2005; Dotan et. al., 2009). 45 Масштабное специализированное исследование (Age-Related Eye Disease Study) показало, что приём антиоксидантов: комплекса из витаминов C, E, бета-каротина, цинка и меди – снижают на 25% риск прогрессии возрастной макулярной дегенерации – нейродегенеративного заболевания глаз, но при этом повышают риск развития других заболеваний: бета-каротин – рака легких у курильщиков, витамин Е – сердечной недостаточности у людей, страдающих сосудистыми заболеваниями и сахарным диабетом, цинк – заболеваемость мочеполовой системы (Krishnadev et al., 2010). Более того, показано, что избыточный приём бета-каротина и витамина Е повышает риск развития возрастной макулярной дегенерации (Johnson, 2010). В многочисленных работах показано, что витамин С – водорастворимый антиоксидант, участвующий в синтезе различных медиаторов (норадреналина, серотонина и др.), проявляет антиоксидантную активность в предотвращении окислительных повреждений, вызванных окислительным стрессом, восстанавливает активность систем антиоксидантной защиты, улучшает когнитивные способности (Upritchard et al., 2003; Fusco et al., 2007; Li and Schellhorn, 2007; Feng and Wang, 2012). Однократное внутрибрюшинное введение аскорбиновой кислоты (125 мг/кг) трансгенным мышам линии APP/PSEN1, модели БА, а также мышам дикого типа в возрасте 12 и 24 месяцев улучшало память и способность к обучению в Y-лабиринте и в водном тесте Морриса у животных обеих линий и возраста, особенно молодых. Тем не менее, введение аскорбиновой кислоты мышам APP/PSEN1 не влияло на нейропатологические особенности мозга животных (Harrison et al., 2009). Как потенциальные агенты для профилактики и лечения БА рассматриваются флавоноиды. Их эффекты, как правило, связывают с антиоксидантным и антирадикальным эффектами, однако новые данные указывают на то, что механизм их действия может выходить за рамки этих свойств. Полагают, что мишенью флавоноидов в мозге являются астроциты, обеспечивающие структурную, метаболическую и трофическую поддержку нейронов. Как отмечалось выше, изменениям функций глиальных клеток в течение последних нескольких лет отводится ключевая роль в патогенезе БА (Nones et al., 2010). Флавоноиды могут не только связывать, но и восстанавливать или окислять ионы металлов переменной валентности и таким образом стимулировать или ингибировать свободнорадикальные процессы. Кроме того, они, аналогично α-токоферолу, стабилизируют мембраны и выступают в качестве 46 структурных антиоксидантов. Также как токоферолы и убихиноны, флавоноиды взаимодействуют с другими антиоксидантами (аскорбиновая кислота, глутатион или мочевая кислота). Во многих исследованиях in vitro показано, что флавоноиды могут оказывать как антиоксидантный, так и прооксидантный эффект, особенно в присутствии ионов металлов переменной валентности (Shukitt-Hale еt al., 2009). Многочисленные экспериментальные и клинические исследования свидетельствуют о большей терапевтической эффективности комплексного применения нескольких антиоксидантов с разными механизмами действия (Frank and Gupta, 2005; Fusco et al., 2007). Комплексный прием витамина С, витамина Е и каротиноидов оказывает синергетическое действие против окислительных повреждений (Niki et al., 1995; Fusco et al., 2007). Мышам APP/PSEN1 добавляли в рацион витамин С (1 г/кг корма) или в сочетании с витамином Е (400 или 750 МЕ/кг корма). Показано, что влияние комбинации витаминов С и Е в большой дозе на процессы перекисного окисления липидов в мозге было менее эффективным, чем одного витамина C или в комбинации с более низкой дозой витамина Е. Более того, эта комбинация витаминов снижала способность к обучению животных в водном тесте Морриса. Авторы отмечают высокую эффективность именно комбинации витаминов С (1 г/кг корма) и Е (400 МЕ/кг корма) в повышении способности к обучению не только у мышей дикого типа, но и у мышей линии APP/PSEN1 (Harrison et al., 2009). Однако вопрос о том, является нутриентная терапия эффективной в случаях БА, остается открытым. Клиническое исследование показало, что прием витамина Е не влиял на показатели окислительных повреждений у половины группы больных БА (Lloret et al., 2009). Кроме того, в ряде работ показано, что потенциал приема витамина С, витамина Е и каротинов может быть оправдан только в продромальный период (исследования на животных), но слабо подтвержден в клинических исследованиях (Kamat et al., 2008). Более того, приводятся данные, что дополнительный прием витамина Е снижает риск развития деменции и БА только в когорте людей с аллелью APOEε4 (Morris et al., 2002) и не обнаружено ассоциаций между риском развития БА и приемом витамина С, β-каротина и флавоноидов (Brewer, 2010). Как отмечалось выше, снижение функциональных резервов митохондрий, снижение активности митохондриальных ферментов являются критическими проявлениями процесса старения и становятся ключевым фактором риска развития БА 47 (Wang et al., 2008). В этой связи при разработке и поиске потенциальных препаратов особое внимание уделено митохондриальным антиоксидантам. Перспективными в этом отношении антиоксидантами, учитывая важность состоятельности биоэнергетических процессов, являются L-карнитин/ацетил-L-карнитин, α-липоевая кислота, CoQ10, MitoQ. Введение 400 мг/кг ацетил-L-карнитина ускоренно стареющим мышам линии SAMP8 три раза в неделю до достижения ими 4-месячного возраста значительно снижало уровень гидроперекисей липидов в мозге. При этом у животных значительно снижалась выраженность нарушений когнитивных функций – способности к обучению и памяти (Yasui et al., 2002; Haripriya et al., 2005). α-Липоевая кислота, кофактор митохондриальной пируват дегидрогеназы и αкетоглутарат дегидрогеназы, может повышать продукцию ацетилхолина или, как хелатор редокс-активных металлов, α-липоевая кислота может блокировать накопление продуктов ПОЛ (Siedlak et al., 2009). В пользу этого свидетельствуют данные о нейропротекторных свойствах α-липоевой кислоты в комбинации с ацетил карнитином через механизмы клеточного сигналинга, включая некоторые внеклеточные киназные сигнальные пути, нарушение регуляции которых характерно для БА (Zhu et al., 2004). При длительном приеме α-липоевой кислоты показано снижение маркеров окислительных повреждений, но не повышенного уровня Aβ в мозге трансгенных мышей линии Tg2576, модели БА. Примечательно, что антиоксидант при этом улучшил способность к обучению мышей Tg2576 в водном тесте Морриса и не повлиял на нее в Y-лабиринте (Quinn et al., 2007). Показано, что α-липоевая кислота не только обладает высоким антиоксидантным потенциалом, но и может регенерировать другие экзо- и эндогенные антиоксиданты, такие как витамины С и Е, CoQ10 и глутатион (Kraemer et al., 2001; Bast and Haenen, 2003). Потенциальным (убихинон), важный антиоксидантом элемент в терапии митохондриальной БА рассматривается электрон-транспортной CoQ10 цепи, обеспечивающий перенос электронов с комплекса I в комплекс II. CoQ10 обеспечивает сохранность митохондриального мембранного потенциала при развитии окислительного стресса и способствует выживанию клеток, замедляя гиперпродуцию Aβ и внутриклеточное накопление Aβ (Feng and Wang, 2012). Можно отметить, что адекватная оценка CoQ10 на грызунах затруднена тем, что в организме мышей и крыс CoQ9 встречается в больших количествах, чем CoQ10 (Bhagavan and Chopra, 2006). Тем 48 не менее, результаты исследований свидетельствуют о том, что CoQ10 способен ослаблять действие некоторых нейротоксинов в мозге животных (Beal, 2003) и выступать в качестве нейропротектора (Ren et al., 1994; Piotrowski et al., 2001). В то же время вопреки тому, что дефицит CoQ10 доказан при нейродегенеративных заболеваниях, прием CoQ10 больными болезнью Паркинсона и болезнью Хантингтона приводит лишь к незначительному улучшению неврологических симптомов (Gruber et al., 2008). Другим потенциальным адресованным в митохондрии антиоксидантом является MitoQ (Murphy and Smith, 2000). Показано, что прием MitoQ снижает выраженность окислительных повреждений, восстанавливает функции митохондрий (Lu et al., 2008), предупреждает токсичность Aβ в нейронах мышей Tg2576 и клетках нейробластомы (N2a) (Manczak et al., 2010). Более подробно о MitoQ см. в следующем разделе. Таким образом, в настоящее время идет интенсивное накопление экспериментальных данных по биологическому действию различных природных и синтетических антиоксидантов. Одно из перспективных направлений – разработка новых соединений с заданными свойствами. 1.2.1. Адресованные в митохондрии антиоксиданты - новый класс биологически активных молекул На рубеже 1960 - 70-х гг. В.П. Скулачев и его коллеги из МГУ совместно с группой профессора Е.М. Либермана из Академии Наук СССР показали, что некоторые соединения – липофильные катионы (например, ионы фосфония), способны адресно проникать в митохондрии, движимые электрическим полем на митохондриальной мембране (знак «минус» внутри митохондрии). Используя эти катионы, исследователи измерили разность электрических потенциалов на мембране митохондрий (Liberman et al., 1969; Liberman and Skulachev, 1970), подтвердив хемиосмотическую гипотезу сопряжения П. Митчелла (Нобелевская премия по химии за 1978 г.). Такие соединения известный американский биохимик Д. Грин назвал в 1974 г. «ионами Скулачева». Ещё в начале 70-х гг. В.П. Скулачев, профессор Л.С. Ягужинский и академик С.Е. Северин высказали предположение, что проникающие катионы могут использоваться митохондрией как «молекулы-электровозы» для накопления в них незаряженных веществ, присоединенных к этим катионам. 49 В конце 90-х гг. этот принцип был использован британским биохимиком М.П. Мерфи и сотр. (James et al., 2005) для адресной доставки в митохондрии антиоксидантов – витамина Е (Smith et al., 1999) и убихинона (Kelso et al., 2001), а также вещества, названного MitoQ и представляющего собой соединение убихинона и катиона трифенилдецилфосфония. Очевидное преимущество MitoQ перед пальмитоилкарнитином или катионным производным витамина Е состоит в том, что восстановленная форма MitoQ, окисляющаяся при выполнении своей антиоксидантной функции, способна регенерировать за счет присоединения электронов, поставляемых дыхательной цепью (Murphy and Smith, 2007). Действительно, MitoQ оказался способным накапливаться и восстанавливаться в митохондриях, защищая их, а также культуры клеток, от окислительного стресса (Smith et al., 1999; Kelso et al., 2001; James et al., 2005). Однако оказалось, что эта активность быстро переходит в прооксидантную при повышении концентрации MitoQ (Скулачев, 2007). Перспективность всего подхода оказалась под сомнением, однако в 2003 г. под руководством В.П. Скулачева был разработан новый митоходриально-адресованный антиоксидант, в котором для достижения максимальной эффективности был использован пластохинон – вещество из самого насыщенного кислородом места в живой природе – хлоропластов растений. Было сконструировано и синтезировано вещество SkQ1, эффективность которого оказалась выше предыдущих аналогов в сотни раз (Скулачев, 2007; Skulachev et al., 2009): SkQ1 Доказано, что SkQ1 быстро восстанавливается комплексами I и II дыхательной цепи митохондрий, т.е. является регенерируемым антиоксидантом многократного действия (Скулачев, 2007). Катионные производные пластохинона (SkQ) свободно проникают через бислойные липидные мембраны с образованием диффузионного потенциала расчетной величины (Антоненко и др. 2008); проявляют как анти-, так и прооксидантные свойства в изолированных митохондриях, однако интервал концентраций, в которых антиоксидантная активность преобладает над прооксидантной, очень велик, он существенно выше, чем у MitoQ (Антоненко и др. 2008). 50 Показано, что SkQ1 накапливается в митохондриях клеток и защищает их от апоптоза и некроза, вызванных АФК (Антоненко и др. 2008); снижает уровень перекисного окисления липидов и белков в тканях стареющих животных (Нероев и др., 2008); оказывает положительный терапевтический эффект при различных возрастных заболеваниях, таких как инфаркты сердца и почек, сердечная аритмия, инсульт (Бакеева и др., 2008), некоторые формы рака (Агапова и др., 2008). Исследования, выполненные на грибе подоспора, на беспозвоночных (дрозофиле и рачке дафнии), на млекопитающих: крысах и мышах, продемонстрировали способность SkQ1 увеличивать продолжительность жизни (Анисимов и др., 2008). Так, антиоксидант резко изменил картину причин смертности: SkQ1 сильно уменьшал смертность мышей от инфекций, которая обычно растет с возрастом в связи с ослаблением иммунитета, но не повлиял на смертность, вызванную раком молочной железы, ставшей главной причиной гибели животных, получавших SkQ1. В ряде работ на моделях нейродегенеративных состояний в опытах in vitro продемонстрирована способность адресованных в митохондрии антиоксидантов защищать нейроны от окислительного стресса, и высказано предположение об их высокой эффективности как нейропротекторов (Reddy, 2007; Reddy and Beal, 2008; Chaturvedi and Beal, 2008). Однако, судя по доступной нам литературе, данных об использовании этих антиоксидантов для лечения нейродегенеративных заболеваний, в том числе БА, для профилактики возрастных изменений мозга, на сегодня не существует. В то же время перспективность использования адресованных в митохондрии антиоксидантов в лечении ассоциированных со старением заболеваний очевидна. В такой ситуации необходимым, но не достаточным условием остается проведение всесторонних фундаментальных исследований, для которых необходимы биологические модели. 51 1.3. Биологические модели БА Создание и характеристика биологических моделей социально значимых заболеваний человека – один из подходов к выяснению их этиологии и патогенеза, к разработке новых способов лечения и профилактики. 1.3.1. Геномодифицированные модели БА На основании выявленных генетических факторов БА в течение 90-х годов начали интенсивно создавать модели НФБА – линии трансгенных мышей (Hsiao et al., 1996; Bilkei-Gorzo, 2013; Laurijssens et al., 2013) как наиболее удобный объект для исследований молекулярно-генетических механизмов заболевания. Трансгенные модели БА с гиперэкспрессией АРР. Первой созданной моделью БА были мыши линии PDAPP, экспрессирующие V717F вариант АРР (Games et al., 1995). У этих животных формируются тиофлавин-С-позитивные фибриллярные бляшки на фоне снижения синаптической плотности, активации клеток микроглии и астроцитов (Yamada and Nabeshima, 2000). Наиболее широко используемой моделью БА стала линия мышей Tg2576 с двойной мутацией K670N/M671L вариантов изоформы АРР695, для которых характерны деструктивные изменения нейронов и их гибель в поле СА1 гиппокампа, глиоз, когнитивные нарушения, формирование амилоидных бляшек и двукратное повышение уровня АРР к возрасту 8 месяцев (Hsiao et al., 1996). В то же время, можно отметить, что проявления признаков БА у мышей Tg2576 не в полной мере сходны с БА у человека. Так, у больных БА обнаружено снижение метаболизма глюкозы на ранних стадиях заболевания, тогда как у мышей Tg2576 показано его повышение, которое нормализуется с возрастом (Luo et al., 2012). Тем не менее, с помощью этой линии получены новые сведения о механизмах БА. Так, обнаружено, что гиперпродукция Aβ при нормальном уровне тау-белка вызывает нарушения памяти (Ohno et al., 2006); количество бляшек, но не их размеры, увеличивается с прогрессией патологии (Christie et al., 2001); растворимый Aβ пептид подавляет активность протеасом (Oh et al., 2005), что может способствовать увеличению убиквинирования белка (Yang et al., 2000). Кроме того, было обнаружено, что на ранних стадиях развития патологии у мышей Tg2576 синаптическая недостаточность связана с дисфункцией митохондрий (Lee et al., 2012) и активацией каспазы-3 (D'Amelio et al., 2011). 52 Обнаружено, что ишемическая травма головы, а также стресс ускоряют накопление Aβ (Lee et al., 2009), развитие окислительного стресса и нейродегенеративных изменений через активацию рецепторов кортикотропин-релизинг гормона (Carroll et al., 2011) в мозге мышей Tg2576. У аналогичной модели АРР23 с двойной мутацией изоформы АРР751 под контролем Thy-1 промотора, полученной Sturchler-Pierrat и Staufenbiel (2000), обнаружено формирование фибриллярных амилоидных бляшек в неокортексе и гиппокампе к возрасту 6 месяцев. При этом, по сравнению с линиями PDAPP и Tg2576, у мышей линии АРР23 значительное снижение плотности пирамидных нейронов в поле СА1 коррелирует с формированием бляшек (Calhoun et al., 1998). Трансгенные модели БА с гиперэкспрессией тау-белка. После выявления ассоциации развития БА с мутацией тау в позиции R406W (Lindquist et al., 2008) была создана линия мышей R406W, с экспрессией R406W под контролем кальцийкальмодулин-зависимой киназы II промотора. Для этих животных характерными оказались гиперфосфорилирование тау-белка на фоне нарушения ассоциативной памяти (Kemper et al., 2011). Другой популярной моделью стала созданная в 2003 году линия мышей 3×Tg-AD с тройной мутацией, экспрессирующие PS1M146V, APPSwe и TauP301L (Oddo et al., 2003а, b). Динамика патологических изменений у мышей 3×TgAD во многом сходна с процессами у больных БА. Обнаружено, что формирование внеклеточных амилоидных бляшек к возрасту 6 месяцев и развитие тау патологии к возрасту 10-12 месяцев происходит в гиппокампе и затем распространяется в кору головного мозга (Oddo et al., 2003; Wisniewski and Siggurdsson, 2010). При этом, как показано, ингибируя активность протеасом, Aβ способствует гиперфосфорилированию тау-белка, тогда как сам тау не влияет на амилоидную патологию (Oddo et al., 2007; Tseng et al., 2008). Гиперфосфорилирование тау-белка приводит к запуску апоптотических процессов и, в конечном счете, к гибели нейронов (Rohn et al., 2008). Примечательно, что в отличие от больных БА, у мышей 3×Tg-AD не выявлено гибели нейронов в гипокампе (Manaye et al., 2013). Трансгенные модели БА нокаутные по АроЕ. Для изучения механизмов действия АроЕ, участвующего в процессах агрегации и клиренса Aβ, были созданы модели нокаутные по АроЕ (Sadowski et al., 2006; Mahley and Huang, 2009). У трансгенных мышей линий Tg2576 и Pdapp с нокаутом по АроЕ (Tg2576 × ApoE и Pdapp 53 × ApoE, соответственно) обнаружено формирование бляшек во фронтальной коре и паренхиме мозга (Bales et al., 1999, 2009; Kuo et al., 2000; Fryer and Holtzman, 2005). Трансгенные модели БА с нарушениями активности секретаз. Для изучения молекулярных механизмов синтеза АРР были созданы трансгенные животные с нарушениями активности β- и γ-секратаз, следствием которых становится накопление Aβ и когнитивные нарушения (Gotz and Ittner, 2008). Так, экспрессия M146L варианта PSEN1 вызывает нарушение активности γ-секратазы и приводит к накоплению Aβ (Schmitz et al., 2004). Выключение фермента β-секратазы (ВАСЕ) у трансгеных животных BACE−/− снижает формирование бляшек и, напротив, гиперэкспрессия ВАСЕ становится причиной усиленного накопления Aβ и формирования бляшек в мозге мышей линии АРР/ВАСЕ (Willem et al., 2004). Трансгенные модели БА с мутациями пресенилинов. Для изучения механизмов патогенеза при мутации генов пресенилинов, которые становятся причиной НФБА (Ertekin-Taner, 2007), созданы трансгенные модели животных, для которых характерными оказались формирование бляшек, синаптическая дисфункция, снижение способности к обучению и памяти (Parent and Thinakaran, 2010) Таким образом, в последние годы лавинообразно нарастает количество генетических моделей, среди которых доминируют моногенные: это или трансгенные, или животные с нокаутом генов, или животные с определенными мутациями. Такой подход позволяет приблизиться к пониманию вклада конкретного гена в развитие признака, но не воспроизводит фенотипические проявления такого заболевания полигенной природы как БА. Более того, все эти модели отличают повышение экспрессии генов и мутации, характерные для НФБА, на которую приходится лишь около 5% всех случаев заболевания, в то время как в ~95% случаев люди страдают СФБА. Создание новых моделей, воспроизводящих наиболее распространенную форму БА – сложная задача, но именно такой подход представляется оптимальным для поиска и испытания новых способов терапии и профилактики. 1.3.2. «Естественные» модели БА У ряда видов животных, включая собак, кошек, овец, свиней и некоторых видов приматов обнаружено спонтанное развитие некоторых нейропатологических проявлений БА (Van Dam and De Deyn, 2011). Так, в мозге старых собак обнаружено 54 накопление Aβ и диффузные бляшки (Johnstone et al., 1991). Среди приматов лемуры рассматриваются как потенциальная модель БА, у которых развиваются амилоидные бляшки, нейрофибриллярные клубки и некоторые другие патологические проявления (Languille et al., 2012). Обычно продолжительность жизни лемуров составляет 8-10 лет, при этом около 20% животных живут в среднем 5 лет (Languille et al., 2012). Примечательно, что у этой группы животных ускоренное старение мозга сопровождается его атрофией (Dhenain et al., 2003; Kraska et al., 2011) на фоне накопления Aβ, нейродегенеративных изменений (Bons et al., 2006) и/или снижения плотности холинергических нейронов (Mestre and Bons, 1993), нарушения способности к обучению и памяти (Picq, 2007; Picq et al., 2012). Наиболее подходящей моделью возраст-зависимых заболеваний среди приматов рассматриваются резус макаки. Так, в возрасте 19 лет у макак резус обнаружены сходные с амилоидными бляшками скопления в структурах мозга ответственных за когнитивные функции (Buccafusco, 2008). Тем не менее, у этих приматов не выявлены симптомы когнитивных нарушений характерных для БА. Кроме того, потенциал использования резус макак как модель БА лимитирован их длительной продолжительностью жизни и медленным воспроизведением потомства (De Magalhaes and Costa, 2009). Недавно обнаружено, что у грызунов из Южной Америки − дэгу − спонтанно развиваются нейропатологические признаки БА (Inestrosa et al., 2005; Braidy et al., 2012). Так, у старых животных были выявлены внутриклеточные и внеклеточные амилоидные накопления и сходные с нейрофибриллярными клубками агрегации в гиппокампе и в коре головного мозга. Также для дегу характерными оказались связанные с возрастом нарушения когнитивных функций и деструктивные изменения холинергических нейронов на фоне увеличения плотности глиальных клеток. Предполагается, что такие сходные с человеком патологические процессы могут быть связаны с высокой гомологией (97.5%) аминокислотной последовательности АРР. Тем не менее, перспективность использования этих грызунов также лимитирована их длительной продолжительностью жизни (Inestrosa et al., 2005; Braidy et al., 2012). Примечательно, что среди грызунов использование крыс в качестве моделей БА ограничено. В мире существует всего несколько малоизвестных линий крыс − моделей СФБА. Стоит отметить, что недавно появился цикл работ о создании новой линии крыс 55 AAV1-I2NTF-CTF, которою авторы позиционируют как модель СФБА (Iqbal et al., 2013). Созданные внутрицеребральным введением AAV вектора плазмиды новорожденным крысятам Wistar крысы AAV1-I2NTF-CTF экспрессируют I2NTF и I2CTF (Wang et al., 2010; Iqbal et al., 2011; Bolognin et al., 2012). Для этих животных оказались характерными возраст-зависимое снижение нейрональной пластичности, рост когнитивных нарушений, внутринейрональное накопление Aβ, гиперфосфорилирование тау-белка, а также формирование амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков к возрасту 13 месяцев. Подобно больным БА и трансгенным линиям мышей − моделям СФБА (Terry et al., 1991; Arendt, 2009; Oddo et al., 2004; Yoshiyama et al., 2007) − у крыс AAV1-I2NTF-CTF снижение нейрональной пластичности и нарушение когнитивных способностей по времени опережают развитие Aβ и тау патологии (Iqbal et al., 2013). На сегодня только одна общепризнанная модель со спонтанно развивающимися признаками преждевременного старения - созданная в 80-е годы японскими учеными линия мышей SAM (senescence-accelerated mouse) (Takeda, 1999; 2009) - рассматривается как модель спорадической формы БА (Morley et al., 2012; Neha et al., 2014). Коллекция представлена 9 ускоренно стареющими сублиниями SAMP (senescence-accelerated mice prone), различающимися по характеру возрастных изменений, и 3 контрольными сублиниями SAMR (senescence-accelerated mice resistant) с нормальным темпом старения. Потребность в моделях преждевременного старения с комплексной манифестацией его признаков растет. В этом убеждает востребованность мышей SAM: количество выполненных с их использованием работ в последние три года резко возросло. Среди сублиний мышей SAM наиболее подходящей в качестве модели БА является сублиния SAMP8 (Chen et al., 2014), у которой уже в молодом возрасте развиваются нарушения поведения, способности к обучению и памяти (Flood and Morley, 1998; Wu et al., 2014). С возрастом эти нарушения прогрессируют на фоне накопления Aβ, гиперфосфорилирования тау-белка. Ускоренное старение мозга мышей SAMP8 связано с изменениями экспрессии генов и уровня белков, связанных с продукцией АФК, нейропротекцией, сигнальной трансдукцией, иммунным ответом, фолдингом и деградацией белков (Poon et al., 2004a,b; Hu et al., 2012). Первой отечественной моделью для комплексного исследования связанных со старением заболеваний являются преждевременно характеристике которых посвящен следующий раздел. стареющие крысы OXYS, 56 1.4. Крысы линии OXYS как модель преждевременного старения и связанных с ним заболеваний Уникальной генетической моделью преждевременного старения и связанных с ним заболеваний является созданная в ИЦиГ СО РАН линия крыс OXYS. Её история берет начало в 70-е годы ХХ века, когда селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы (Соловьева и др., 1975), была создана сублиния W/SSM (Вистар Салганик-Соловьева-Морозкова), которую авторы позиционировали как модель наследственной галактоземии. В пяти первых поколениях развитие катаракты вызывали обогащенной галактозой диетой. В дальнейшем уже без нагрузки галактозой, сыгравшей, по-видимому, роль мутагена, у крыс помимо катаракты спонтанно развивались кардиомиопатия, сколиоз, эмфиземы, предраковые состояния и некоторые биохимические признаки галактоземии (Salganik et al., 1994). Но следует отметить, что анализ развития этих признаков был выполнен в основном на фоне нагрузки галактозой либо в ближайших последующих поколениях животных. Интерес к линии возрос после выявления методом электронного парамагнитного резонанса повышенной способности гомогенатов печени и миокарда генерировать АФК в ответ на добавление перекиси водорода (Salganik et al., 1994). На основании этих результатов крысы были зарегистрированы Р.И. Салгаником в международной базе RGD (Rat genome database) как линия OXYS с ключевой характеристикой «врожденная гиперпродукция радикалов кислорода». Тогда же были выявлены нарастающие с возрастом дисфункции митохондрий, которые рассматривались как одна из наиболее вероятных причин гиперпродукции радикалов кислорода и преждевременного старения крыс OXYS (Шабалина и др., 1995). Действительно, митохондрии − основной источник АФК в клетках, но оценка их генерации в митохондриях печени методами хемилюминесцентного анализа показала, что у крыс OXYS она даже ниже, чем у контрольных крыс Вистар (Меньщикова и др., 2002). В дальнейшем также оказалось, что не все заявленные ранее свойства у крыс OXYS проявляются. Так, не было обнаружено признаков галактоземии, достаточно поздно развивалась катаракта. Для установления инбредного статуса и стабилизации фенотипических признаков нами в 5863 поколениях крыс OXYS было проведено усиление отбора по признаку ранней спонтанной катаракты, что привело к её развитию уже в молодом возрасте (Колосова и 57 др., 2003). Результатом усиления отбора явилось устойчивое спонтанное проявление комплекса признаков преждевременного старения в последующих поколениях. Сегодня мы имеем 106-е поколение крыс OXYS, у которых уже в молодом возрасте помимо катаракты развиваются ретинопатия, аналогичная возрастной макулярной дегенерации у людей (Markovets et al., 2011), остеопороз (Muraleva et al., 2012), артериальная гипертензия (Bobko et al., 2005), ускоренная инволюция тимуса (Obukhova et al., 2009), саркопения (Vays et al., 2014) и ускоренное старение мозга (Стефанова, Автореферат канд.; Колосова и др., 2011; Stefanova et al., 2010). Проявлениями преждевременного старения крыс OXYS становятся патологические состояния, патогенез которых традиционно связывают с окислительным стрессом – нарушением баланса в системах генерации и детоксикации АФК. Однако повышенный уровень окислительных повреждений липидов, белков и ДНК регистрируется в тканях крыс OXYS позже, чем происходит манифестация признаков преждевременного старения (Kolosova et al., 2006). Принципиально важно также, что исследование энергетического метаболизма методами P31ЯМР-спектроскопии не выявило признаков дефицита высокоэнергетических фосфатов в мозге молодых крыс OXYS (Sergeeva et al., 2006). При этом в ранний постнатальный период в мозге крыс OXYS присутствуют изменения, типичные для адаптации к гипоксии: усилены накопление фосфокреатина и его расход на синтез АТФ (Sergeeva et al., 2006). Проявлением истощения адаптивных резервов становятся характерные для хронической ишемии изменения церебрального кровотока и реактивности сосудов в мозге годовалых крыс OXYS, зарегистрированные методами МРТ (Колосова и др., 2011; Stefanova et al., 2014b). Признаки тканевой гипоксии и ишемии выявлены также в сосудистой оболочке глаз животных, в миокарде, функциональные изменения которого (нарушения ЭКГ) регистрируются уже в 3 месяца и к 12 месяцам нарастают на фоне склеротических изменений коронарных сосудов. Анализ изменений транскриптома, предшествующих и сопутствующих фенотипическим проявлениям старения и развитию связанных с ним заболеваний, в том числе БА, − на сегодня общепринятый подход к поиску молекулярных мишеней − генов, вовлеченных в их этиологию и патогенез. С его помощью можно выявлять группы дифференциально экспрессирующихся (ДЭ) генов, соответствующие определенным клиническим стадиям заболевания. Выявление ДЭ генов и метаболических путей 58 способствует лучшему пониманию механизмов развития заболевания, а также созданию новых методов его диагностики, профилактики и лечения. Так, выясняя механизмы развития у крыс OXYS ретинопатии, аналогичной возрастной макуклярной дегенерации у людей, О.С.Кожевникова и соавт. исследовали транскриптом сетчатки крыс Вистар и крыс OXYS на разных стадиях заболевания (в возрасте 3 и 18 месяцев) методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq на платформе Illumina). Анализ результатов показал (Kozhevnikova et al., 2013), что с возрастом у крыс обеих линий изменяется экспрессия более 100 генов. Большинство из них связано с организацией внеклеточного матрикса, клеточной адгезией и иммунной системой. Несмотря на то, что эти гены принадлежат к одним и тем же категориям генных онтологий и представляют общие метаболические пути, только 24 из них оказались общими для крыс Вистар и OXYS. Важно, что у крыс Вистар в 18 месяцев уровень мРНК многих генов становился таким, как у крыс OXYS в 3 месяца, что указывает на ускоренное старение последних. Развитие ретинопатии у крыс OXYS ассоциировано с изменением уровней мРНК более 600 генов. Подавляющее большинство этих генов имели у крыс OXYS сниженный уровень мРНК. Их основная часть связана с иммунным ответом, воспалением, ответом на окислительный стресс, Са2+-гомеостазом, апоптозом, клеточной адгезией и метаболизмом ретиноевой кислоты. Уровень мРНК генов из функциональных категорий «дыхательная цепь митохондрий» и «митохондрия» в сетчатке крыс OXYS и Вистар в возрасте 3 месяцев не различался, а в возрасте 18 месяцев эти категории были представлены небольшим количеством дифференциально экспрессирующихся генов. Только в возрасте 18 месяцев у крыс OXYS выявлен сниженный уровень мРНК генов, регулирующих окислительно-восстановительный гомеостаз и защищающих клетки от окислительного стресса: ферментов, катализирующих реакции с глутатионом (Gpx2 и Gstm4), и оксиредуктаз тиоредоксинового семейства (Glrx1 и Txn1). Такие результаты укладываются в современные представления о том, что окислительный стресс в большей степени не причина, а следствие старения. Изменения активности АФКзависимых сигнальных путей вносят более существенный вклад в снижение функциональных возможностей организма и развитие патологических процессов, чем накопление окислительных повреждений макромолекул. Как и другие признаки преждевременного старения, ретинопатия развивается в период, когда завершается половое созревание и начинается инволюция тимуса, у крыс OXYS − ускоренная. Это 59 обстоятельство в комплексе с результатами анализа транскриптома позволяет рассматривать ускоренное иммуностарение как одну из вероятных причин преждевременного старения крыс OXYS. Для определения характера наследования признаков преждевременного старения были проведены гибридологические скрещивания. Анализ популяции гибридов от скрещиваний крыс OXYS с крысами инбредной линии WAG показал, что ретинопатия и катаракта развивается лишь у части гибридов F1 (у самок в большей степени, чем у самцов). Картина заболеваемости в поколении гибридов F2 не соответствовала расщеплению по схемам моногенного аутосомно-доминантного и рецессивного наследования (Korbolina et al., 2012), что закономерно для заболеваний полигенной и мультифакторной природы. Последующий QTL-анализ (quantitative trait loci - локусы количественного признака) показал, что локусы, соответствующие интервалам между микросателлитными маркерами D1Rat30 и D1Rat219 (100,6–188,0 Mb) и D1Rat219 и D1Rat81 (188,0–250,4 Mb) 1-й хромосомы, ассоциированы с развитием катаракты, ретинопатии и одновременно - признаков ускоренного старения мозга у крыс OXYS. Для доказательства существования в найденных локусах гена (генов), влияющих на развитие фенотипических признаков крыс OXYS, выявленные локусы, маркированные микросателлитами крыс OXYS, были перенесены возвратными скрещиваниями в геном крыс WAG (Korbolina et al., 2012). У крыс каждой из полученных конгенных линий WAG/OXYS-1.1 и WAG/OXYS-1.2 развиваются и катаракта, и ретинопатия, что свидетельствует в пользу влияния генов-кандидатов из установленных QTL на развитие этих признаков у крыс родительской линии OXYS. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) первой хромосомы конгенных животных и крыс родительских линий OXYS и WAG (выполнен методом RNA-Seq) подтвердил, что животные обеих конгенных линий действительно несут локусы, перенесенные от крыс OXYS. Однако катаракта и ретинопатия проявляются у них с более низкой пенетрантностью и менее выраженной прогрессией с возрастом, чем у крыс OXYS, линии-донора QTL (Korbolina et al., 2012), при этом у крыс WAG/OXYS-1.2 заболеваемость выше, чем у WAG/OXYS1.1. Так, в возрасте 1,5-2 месяцев признаки 1 стадии ретинопатии были выявлены в 11% глаз крыс конгенной линии WAG/OXYS-1.1, к 3 месяцам заболеваемость достигала 55%, что вдвое ниже, чем у крыс OXYS. У крыс WAG/OXYS-1.2 в возрасте 1,5-2 месяцев ретинопатия 1 стадии была выявлена в 41% глаз, к 3-4 месяцам ею были 60 поражены 97% глаз. Для сравнения, у крыс OXYS к возрасту 3 месяцам заболеваемость достигает 100%, в 30-50% глаз регистрируются изменения сетчатки, соответствующие 2 стадии ВМД у людей. При этом клиническая картина изменений глазного дна, согласно офтальмоскопическим осмотрам, у животных конгенных линий отлична от таковой у крыс OXYS. Гистологическое исследование показало, что в отличие от крыс OXYS, у крыс WAG/OXYS-1.2 развитие ретинопатии начинается не с поражения клеток ретинального пигментного эпителия и сосудов хориоидеи, а с повреждения ганглионарного и внутреннего ядерного слоев, т.е. с нейродегенеративных изменений. Также поражаются интраретинальные сосуды: в которых выявлены признаки нарушения микроциркуляции. Дистрофические изменения сетчатки происходят на фоне массовой миграции во внутренний сетчатый и ганглионарный слои мононуклеарных фагоцитов, что свидетельствует о развитии воспалительного процесса. Это отличает крыс WAG/OXYS-1.2 от крыс OXYS, у которых признаки полноценного воспалительного ответа не наблюдаются. Тем не менее, проявление признаков ретинопатии у конгенных животных свидетельствует в пользу участия выявленных QTL в развитии заболевания. В целом, можно заключить, что нами получен уникальный инструмент для исследования механизмов участия представленных в перенесенных локусах генов в развитии дистрофии сетчатки в условиях отличного от материнской линии генетического окружения. Функциональная аннотация локусов выявила обогащение района генами, связанными с нейродегенерацией, в том числе – с метаболическим путем БА. После анализа литературы были отобраны из этих локусов гены-кандидаты и разработан для них целевой олигонуклеотидный ДНК-микрочип. Исследование с его помощью уровня мРНК генов-кандидатов в сетчатке выявило различия между крысами Вистар и OXYS в уровнях мРНК генов Picalm и Apba2, продукты которых связаны с процессингом АРР (Kozhevnikova et al., 2013). Ранее показано (Стефанова, Автореферат канд.), что у крыс OXYS повышенный уровень тревожности и сниженная двигательная и исследовательская активность развиваются к возрасту 3 месяцев, нарушения пространственной памяти – к возрасту 1214 месяцев на фоне нейродегенеративных изменений мозга, выявленных нами методами МРТ, механизмы которых остаются не ясными. Было установлено, что развитие катаракты и ретинопатии оказывают влияние на поведение крыс OXYS, но его характер 61 зависит от возраста и выраженности патологических изменений. Так, в возрасте 3 месяцев, в период манифестации у крыс OXYS признаков катаракты, ретинопатии и нарушений поведения, отсутствует связь между поисково-исследовательской активностью и выраженностью патологических изменений сетчатки и хрусталиков. Начиная с возраста 12 месяцев, напротив, крысы OXYS с выраженными патологическими изменениями, предполагающими нарушение зрительной функции, демонстрируют более высокую тревожность и пассивный характер поведения. Таким образом, уникальность созданной модели определяет комплексность проявлений признаков уже в молодом возрасте. Это позволяет использовать крыс OXYS как для исследования молекулярно-генетических механизмов старения и развития, связанных с ним заболеваний, так и для объективной оценки новых способов их лечения и профилактики. Пример успешного использования крыс OXYS - выявление терапевтического потенциала митохондриального антиоксиданта пластохинонил-децилтрифенилфосфония (SkQ1, «ионы Скулачева»). Установлено, что он способен не только замедлять развитие катаракты и ретинопатии, но и снижать выраженность патологических изменений хрусталиков и сетчатки (Stefanova et al., 2010; Markovets et al., 2011) и ряда других признаков ускоренного старения (Kolosova et al., 2012). Использование крыс OXYS позволило сократить до 7 лет путь от синтеза SkQ1 до создания на его основе лекарственного препарата – глазных капель Визомитин. В отношении фенотипических проявлений ускоренного старения мозга крыс OXYS, также нами впервые была выявлена способность SkQ1 (прием с 1,5 до 12 мес.) замедлять снижение способности к обучению крыс OXYS и повышать до уровня молодых животных (приём с 12 до 15 мес.) моторно-исследовательскую активность, снижать тревожность как крыс Вистар, так и крыс OXYS с выраженными возрастными изменениями поведения. Однако механизмы действия SkQ1 остаются мало изученными. Заключение к Главе 1 В условиях прогрессирующего увеличения продолжительности жизни и связанного с ним роста количества людей, страдающих БА, выяснение молекулярногенетических механизмов заболевания и разработка способов его коррекции приобрели особую актуальность. Выявление генетических детерминант развития НФБА, 62 доказательства нейротоксического действия Aβ, обусловленные его способностью напрямую или опосредованно запускать различные внутриклеточные сигнальные каскады, существенно механизмах заболевания. расширили Однако представления о молекулярно-генетических сегодня, после интенсивных двадцатилетних исследований патогенеза БА, вопрос о том, является ли накопление Aβ инициирующим фактором развития наиболее распространенной СФБА, остается открытым. Более того, в последние годы растет количество аргументов в пользу того, что гиперпродукция Аβ, очевидно, становится вторичным, сопутствующим событием патологических процессов СФБА. В пользу этого свидетельствуют результаты ряда исследований: отсутствие корреляции между наличием амилоидных бляшек в мозге и снижением плотности синапсов – одного из наиболее ранних событий при развитии БА. Новые данные о том, что при развитии СФБА решающее значение может иметь транссинаптическая миграция токсических пептидов, свидетельствуют о необходимости изучения роли дисфункции синапсов в патогенезе БА. Как один из инициирующих факторов риска развития БА рассматривается митохондриальная дисфункция, следствием которой становится снижение синтеза АТФ, развитие окислительного стресса. Нарушение функций митохондрий – характерный процесс при старении мозга – способствует чрезмерной продукции Aβ и гиперфосфорилированию тау-белка при развитии БА, которые в свою очередь, могут напрямую оказывать токсическое действие на митохондрии, усугубляя нейродегенеративные процессы. Однако механизмы, инициирующие нарушение функций митохондрий, причинно-следственная связь между дисфункцией митохондрий и активацией токсического Aβ, гиперфосфорилированием тау-белка остаются недостаточно изученными. Такая ситуация обусловлена невозможностью исследовать эти вопросы на людях, тем более – на ранних доклинических стадиях развития у них БА, а также отсутствием адекватных биологических моделей для изучения механизмов заболевания и объективной оценки эффективности патогенетически обоснованных способов профилактики и лечения БА. Перспективными в этом направлении представляются исследования потенциала веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, способность которых не только ингибировать генерацию Аβ, но и замедлять развитие ряда других нейропатологических процессов в мозге животных, моделей БА, показана в многочисленных исследованиях. 63 Однако такие исследования выполнены, преимущественно, на трансгенных и нокаутных животных с изменениями экспрессии генов и мутациями, характерными для НФБА, на которую приходится лишь около 5% всех случаев заболевания. Адекватных «естественных» биологических моделей такого комплексного заболевания полигенной природы как СФБА, случаи заболеваемости, которой составляют около 95%, практически нет. Создание моделей, воспроизводящих эту форму БА – сложная задача, но именно такой подход представляется оптимальным для поиска и испытания новых способов терапии и профилактики. Достоинство крыс OXYS как модели преждевременного старения состоит в том, что у них развитие признаков ускоренного старения мозга протекает на фоне манифестации целого комплекса возраст-зависимых заболеваний (катаракты, ретинопатии, остеопороза), приближаясь к реальной ситуации, наблюдаемой у человека. Ранее нами показано (Стефанова, Автореферат канд.; Kolosova et al., 2009; Stefanova et al., 2010), что проявлениями ускоренного старения мозга крыс OXYS становится раннее развитие характерных для стареющих людей и животных изменений поведения на фоне развития зарегистрированных методами МРТ нейродегенеративных изменений (Колосова и др., 2011; Stefanova et al., 2010), механизмы которых остаются не ясными. Это обстоятельство наряду с выявленными в сетчатке крыс OXYS локусами, изменения экспрессии мРНК генов в которых ассоциированы с активностью метаболического путем БА, легло в основу изучения в настоящей работе механизмов ускоренного старения мозга этих животных и анализа возможной их связи с патогенезом БА. В случае выявления этой связи, линия крыс OXYS может служить уникальным инструментом для изучения молекулярно-генетических основ её развития и исследования потенциальных терапевтических агентов в профилактике и лечении БА. Перспективным в этом отношении представляется исследование митохондриального антиоксиданта SkQ1, терапевтическая эффективность которого как нейропротектора была впервые была показана нами ранее (Stefanova et al., 2010). Таким образом, цель и задачи настоящего исследования - изучить механизмы ускоренного старения мозга крыс OXYS, их возможную связь с патогенезом БА и оценить нейропротекторный потенциал митохондриального антиоксиданта SkQ1 представляются вполне актуальными. 64 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Материалы, использованные в работе В работе были использованы следующие реактивы и материалы: N,N-, аммония персульфат, бромистый этидий, борная кислота, трис, глицин, ЭДТА, MgCl2, NaCl, NaOH, сахароза, фосфатно-солевой буфер (PBS) (Медиген, Россия); натрия додецилсульфат (SDS), акриламид, метиленбисакриламид (Applichem, Германия); хлороформ, этанол, изопрапонол, бромфеноловый синий, ацетон, цитрат свинца, глицерин, четырехокись осмия, пропиленоксид (реактивы отечественного производства марки х.ч.); парафин (McCormic Scintific, Канада); ингибиторы протеаз P8340, какодилат натрия, ЭГТА, MES, N-Lauroylsarcosine sodium (саркозил), альбумин бычий сывороточный (БСА), Tween20, Конго красный, Сириус красный, Тиофлавин-С, монтирующая среда CC/Mount (Sigma-Aldrich, США); β-меркаптоэтанол Tритон x-100, дезоксихолат натрия, дитиотреитол, толуидиновый синий, NP-40 (Хеликон, Россия); эпон-812 (Electron Microscopy Sciences, США); реактивы для определения содержания белка (Bio-Rad Laboratories Kit, США); human/rat Aβ (1-42), human/rat Aβ (1-40) ELISA kit Wako (Wako Pure Chemical Industries, Япония); Rat GH ELISA kit (Creative Diagnostics, США); IGF-1 ELISA kit (ALPCO Diagnostics, США); нитроцеллюлозная мембрана Hybond-CExtra; Fluoroshield с красителем DAPI (Amersham, США); стекла с полилизиновым покрытием (Thermo Scientific, США); Killik (Bio-Optica, Италия); парафармальдегид (Panreac, Испания); крезиловый фиолетовый (Вектон, Россия); глютаральдегид, уранилацетат (Fluka Chemika, Швейцария); Complex IV Rodent Enzyme Activity Microplate Assay Kit (ab109911), первичные антитела к Aβ1-42, Aβ1-40, Tau, фосфо-Тау [T181], PSD-95, Synapsin1, бета-актину, АРР (ab10148, ab10148, ab75714, ab75679, ab12093, ab64581, ab1801, ab15272, Abcam, США), MOAB-2 (#MABN254, Millipore, США); вторичные антитела коньюгированные к HRP, DyLight® 650, FITC, Alexa Fluor 488 (ab96886, ab6721, ab12093, ab97135, ab6728, ab150129, ab96886, 150170, ab6785, Abcam, США) и к Texas Red (PAB10737, Abnova, USA). 65 2.2. Животные и препараты Работа выполнена на крысах-самцах линий OXYS и Вистар (контрольная линия) на базе Центра коллективного пользования «Генофонды лабораторных животных» Института цитологии и генетики СО РАН. С возраста 4 недель животных содержали группами по 5 особей в клетках размером 57×36×20 см при температуре 22±20 °С в условиях фиксированного режима освещения (12 ч свет /12 ч темнота) при свободном доступе к воде и пище - стандартному гранулированному корму для лабораторных животных (Чара, ЗАО «Ассортимент-Агро», Россия). Для оценки эффектов длительного профилактического приема SkQ1 опытные группы, начиная с возраста 1,5 до 23 мес., 6 раз в неделю получали с кормом SkQ1 по 250 нмоль/кг массы тела. Крысы опытной группы (n=30) получали стандартный рацион + сухарик с добавлением препарата; крысы контрольной группы (n=30) получали стандартный рацион + сухарик. Масса тела регистрировалась по мере роста животных с последней её регистрацией в день забоя. После 1,5 месяцев приема SkQ1 (в возрасте 3 месяцев) проведено тестирование поведения на фоне приёма препарата. В возрасте 4 месяцев, после исследования поведения, часть животных (n=15) была забита декапитацией. Плазма крови, структуры мозга животных были забраны для молекулярно-генетических исследований в жидкий азот и хранились при -70оС. Для гистологического исследования у части животных (n=6) выделяли мозг после прижизненной перфузии PBS и затем 4% забуференном парафармальдегидом. После 11,5 месяцев приема SkQ1 (в возрасте 13 месяцев) проведено тестирование поведения на фоне приёма препарата. После 21,5 месяцев приема SkQ1 (в возрасте 23 месяцев) оставшихся животных (n=12-15) были ингаляционно анестезировали СО2 и декапитировали. Плазма крови, структуры мозга животных были забраны для молекулярных исследований в жидкий азот и хранились при -70оС. Для оценки эффектов лечебного приема SkQ1 опытные группы, начиная с возраста 12 до 18 месяцев, 6 раз в неделю получали с кормом SkQ1 по 250 нмоль/кг массы тела. Крысы опытной группы (n=20-25) получали стандартный рацион + сухарик с добавлением препарата; крысы контрольной группы (n=20-25) получали стандартный рацион + сухарик. В возрасте 17 месяцев начиналось тестирование поведения на фоне приёма препарата. Масса тела регистрировалась по мере роста животных с последней её 66 регистрацией в день забоя. После исследования поведения животные были забиты декапитацией. Структуры мозга животных были забраны для молекулярно-генетических исследований в жидкий азот и хранились при -70оС. Для гистологического исследования у части животных (n=6) выделяли мозг после прижизненной перфузии PBS и затем 4% забуференным парафармальдегидом. Для электронно-микроскопического исследования у части животных (n=4) забирали кусочек гиппокампа с фиксацией в растворе забуференного параформальдегида (4%) и глютаральдегида (0,5%). 2.3. Исследование поведения животных 2.3.1. Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» Уровень тревожности определяли в приподнятом крестообразном лабиринте. Метод основан на страхе открытого пространства и падения с высоты. Установка представляет собой 4 рукава, скрепленных друг с другом под прямым углом – два противоположных рукава закрыты, два других открыты. Лабиринт поднят над уровнем пола на высоту 0.5 м. Животных помещали на центральную площадку лабиринта и в течение 5 мин наблюдали их поведение. Оценивали латентный период начала движения, время нахождения в открытом пространстве – центре и открытых рукавах, в закрытых рукавах, количество выходов в открытые рукава, в центр и заходов в закрытые рукава, а также количество вертикальных стоек, выглядываний, реакций груминга. 2.3.2. Тест «открытое поле» Для исследования поведения животных в тесте «открытое поле» использовали квадратную камеру (100 100 см) с пластмассовыми стенками высотой 40 см. Освещение обеспечивалось бестеневой лампой мощностью 100 Вт, расположенной на высоте 100 см над центром поля. Животное помещалось в угол камеры, после чего регистрировали его двигательную активность в течение 5 минут. Подсчитывали количество пересеченных квадратов, вертикальных стоек, груминговых реакций, фиксировали латентный период выхода в центр. Для определения эмоционального напряжения регистрировали количество фекальных болюсов. степени 67 2.3.3. Тест «восьмирукавный радиальный лабиринт» Для оценки пространственной рабочей и референтной памяти крыс использовали установку «радиальный восьмирукавный лабиринт» (НПК Открытая Наука, Москва, Россия). В течение десяти последовательных дней обучали крыс поиску пищи в лабиринте (Manahan-Vaughan and Schwegler, 2011). В качестве пищевого подкрепления использовались сухие зерновые шарики массой ~ 5 г. (ОАО Любятово, Россия). За три дня до обучения снижали количество корма в домашних клетках на 15% от суточной нормы потребности в корме крыс и давали по одному шарику каждой крысе. За день до обучения проводили габитуацию (привыкание) крыс к лабиринту дважды в течение 10 мин. с интервалом между сессиями 2 ч., при этом корм был рассыпан во всех рукавах. Во время обучения пищевое подкрепление предъявляли в 4 из 8 рукавов лабиринта. Для этого в конце каждого из 4-х рукавов устанавливали кормушку с зерновым шариком. В каждой сессии крысу помещали в центр установки с закрытыми перегородками рукавами, давали ей освоиться в течение 20 с., затем перегородки убирали и наблюдали поведение животных в течение 10 мин. или пока крыса не войдет во все подкрепляемые кормом рукава. В каждом сеансе обучения подсчитывали число ошибок референтной памяти (входы в неподкрепляемые рукава), число ошибок рабочей памяти (повторные входы в подкрепляемые рукава в течение одного сеанса), общее число входов в рукава (моторно-исследовательская активность). Для оценки референтной памяти данные считали по следующей формуле: RME (%) = RME / TN * 100%, где RME (%) – процент ошибки референтной памяти, RME – число входов в неподкрепляемые рукава, TN – общее число входов в рукава. За исключением первого дня обучения, показатели рабочей и референтной памяти были объединены по три сессии (дня) для каждой крысы (Manahan-Vaughan and Schwegler, 2011). 2.3.4. Тест «водный лабиринт Морриса» Водный тест Морриса (Morris, 1984) используется для исследования обучения, долговременной пространственной памяти. Лабиринт представлял собой круглый бассейн из нержавеющей стали (диаметром 2 м, с высотой стенок 0,6 м), расположенный на опорах на высоте 0,7 м над уровнем пола. Установка помещалась в комнате (размерами 3×3 м), содержащей инвариантные пространственные стимулы, а именно: дверь, шкаф. Бассейн был условно поделен на четыре равных сектора при 68 помощи четырех различных крупных меток, нанесенных на его стенки изнутри; сектора получили условную нумерацию (№ 1, 2, 3, 4 по часовой стрелке). В середине четвёртого сектора помещалась квадратная платформа из оргстекла с размером площадки 0,13×0,13 м и высотой 0,4 м. Бассейн заполнялся водой с температурой 26±2оС так, чтобы платформа была погружена на 3 см. В воде растворялась навеска сухого молока с тем, чтобы среда стала непрозрачной. Таким образом, платформа оставалась невидимой для животного. При постоянном положении платформы животные научались находить цель в пространстве, используя ориентиры внелабиринтного расположения и/или нанесенные на края бассейна-лабиринта. Запись и оцифровка видеоизображения проводилась при помощи компьютера, снабженного внутренней платой видеозахвата. Исследование проводилось в одно и то же время суток, с 11 до 14 часов. Каждая крыса выполняла ежедневно по четыре попытки в течение пяти дней. Животное помещали в лабиринт у его стенки в середине сектора, соответствующего номеру попытки. Далее животному давалось 70 секунд для того, чтобы отыскать погруженную платформу, потраченное на это время фиксировалось при помощи секундомера («латентный период нахождения платформы»). Отыскав платформу, крыса находилась на ней в течение 20 секунд, вынималась из установки и помещалась в сухую обогреваемую клетку до следующей попытки (на 12 минут). В случае если животное не отыскивало платформу самостоятельно, по истечении отведенного на попытку времени крысу помещали на платформу, где она находилась в течение 20 секунд, в протоколе фиксировался латентный период 70 секунд. По истечении четырех попыток крысы помещались обратно в их «жилые» клетки до следующего дня. Показателем способности к обучению и пространственной памяти животных в водном тесте Морриса являлся латентный период нахождения невидимой платформы. На шестой день (оценка референтной памяти) платформа убиралась, животных сажали в бассейн в первом месте выпуска, давая им по одной попытке длительностью 70 секунд. При этом регистрировали время, проведённое в секторе, где ранее находилась платформа. 2.4. Забор и хранение образцов Крыс ингаляционно анестезировали СО2 и декапитировали. Гиппокампы и префронтальную кору мозга выделяли на льду, помещали в RNAse-free пробирки и замораживали в жидком азоте. Образцы хранили при температуре -70°С до момента 69 использования. Кровь собирали в чистые пробирки, центрифугировали при 3000 × g в течении 30 минут, надосадочную часть собирали и хранили при -70оС. 2.5. Выделение белка 2.5.1. Выделение общего белка Белок выделяли с помощью лизирующего буфера (50 мM трис-HCl pH 7.4; 150 мM NaCl; 1% тритон x-100; 1% дезоксихолат натрия; 0,1% SDS; 1 мM ЭДТА) в соотношении 1/4 с добавлением смеси ингибиторов протеаз. Концентрацию общего белка определяли по методу Бредфорда. 2.5.2. Выделение саркозил-растворимой и нерастворимой фракций белка Образцы префронтальной коры и гиппокампов крыс гомогенизировали в буфере (100 мМ MES pH 6,8; 750 мМ NaCl; 1 мМ ЭГТА; 0,5 мМ MgSO4; 1 М дитиотреитола и ингибиторы протеаз). Гомогенаты инкубировали на снегу в течение 20 мин, центрифугировали при 11000 × g - 20 мин. Далее супернатант центрифугировали при 100000 × g (60 мин) при + 4 оС. Осадок инкубировали в 1% растворе саркозила при комнатной температуре 30 мин, затем центрифугировали при 100000 × g (30 мин) при + 4 о С. Супернатант (саркозил-растворимая фракция) собирали и хранили при температуре - 70оС. Нерастворимый осадок ресуспензировали в буфере для экстракции (10 мМ трис-HCl pH 7,4; 10% сахарозы; 850 мМ NaCl; 1 мМ ЭГТА) в соотношении 1/10 и центрифугировали при 15000 × g - 20 мин при 4 °С. Супернатанты инкубировали в 1% растворе саркозила в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном ротаторе. Затем образцы центрифугировали при 100000 × g в течение 45 мин при + 4 °С. Осадки (саркозил-нерастворимые белки) ресуспендировали в 50 мМ трис-HCl рН 7,4. Образцы использовали для определения содержания белков тау и фосфорилированного тау [T181] в саркозил-растворимой и нерастворимых фракциях. 2.5.3. Выделение митохондриальной фракции белка Образцы гиппокампов и префронтальной коры помещали в буфер (250 мМ сахарозы, 1мМ ЭДТА, 70мМ KCl в PBS с добавлением ингибиторов протеаз) в соотношении 1:10, измельчали ножницами и гомогенизировали электрическим 70 гомогенизатором (#Z359971, Sigma, США) 3 мин. Гомогенаты центрифугировали на скорости 800 х g - 10 мин. Супернатант отделяли и центрифугировали при 15000 g - 20 мин. Осадок (митохондриальная фракция) ресуспензировали в 120 мкл лизирующего буфера (50 мМ трис-HCI рН 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭГТА, 0,2% Tритон-X, 0,3% NP40), 30 мин инкубировали на льду и хранили при температуре -700С до проведения исследования. 2.6. Морфологический и морфометрический анализ методами световой и электронной микроскопии 2.6.1. Забор образцов и приготовление препаратов Для светомикроскопического исследования крысы Вистар и OXYS (n=5) разного возраста ингаляционно анестезировали СО2 и транскардиально перфузировали 10 % раствором забуференного формалина (рН 7,4). Мозг извлекали и дополнительно фиксировали в том же растворе в течение суток. После фиксации материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин по стандартной методике. С помощью санного микротома готовили сагиттальные срезы головного мозга толщиной 5 мкм и монтировали на предметные стекла. Для выявления хроматофильного вещества в перикарионах нейронов гиппокампа срезы окрашивали 0,1% крезиловым фиолетовым по Нисслю. Для электронномикроскопического исследования кусочки гиппокампов (2×2×2 мм) крыс Вистар и OXYS (n=4) разного возраста фиксировали путем транскардиальной перфузии раствором, содержащем смесь параформальдегида (4%) и глютаральдегида (0,5%), приготовленном на основе 0,2 М какодилатного буфера (рН 7,4). Материал постфиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия на холоде в течение 3-х часов, дегидратировали в спиртах восходящей концентрации, ацетоне, пропиленоксиде и заливали в эпон-812. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме “Leica EM UC7” (“Leicamicrosystems”, Австрия). Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие серебристые и бледно-золотистые срезы наносили на сеткиподложки, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. 71 2.6.2. Анализ и обработка изображений При световом микроскопировании СА1, СА3, зубчатой извилины гиппокампа подсчитывали количество нейронов на 1 мм2 среза (n=5 по пять последовательных срезов) разного возраста, а также нейронов с очаговым, тотальным хроматолизом, гиперхромные сморщенные нейроны, гиперхромные без сморщивания. На фото снимках при помощи программы Carl Zeiss Axio Vision 8.0 при увеличении 10х100 определяли среднюю площадь тел и ядер нейронов (мкм2). При электронномикроскопическом исследовании органеллы пирамидных нейронов СА1 поля гиппокампа изучали и фотографировали в электронном микроскопе JEM-7A. С помощью сетки Автандилова, при увеличении 10000, определяли удельную площадь органелл в пирамидных нейронах (в % от общей площади цитоплазмы). Для оценки изменений синаптоархитектоники фотографировали по 15 случайно выбранных полей зрения пирамидного слоя СА1 региона гиппокампа с 5 срезов при стандартном увеличении 10000. Определяли количество межнейрональных контактов (площадь поля зрения – 50 мкм2) и высчитывали численную плотность синапсов на 100 мкм2. Подсчитывали количество определенных контактов с ассиметричной и симметричной организацией системы субсинаптических единиц (ССЕ). Подразделяли синапсы по протяженности активной зоны контакта (АЗК) на мелкие (100-200 нм), малые (200-300 нм), средние (300-500 нм), крупные (500-700 нм) и очень крупные (> 700 нм). 2.7. Иммуногистохимический анализ 2.7.1. Приготовление препаратов После декапитации животных извлекали левую полусферу мозга и фиксировали материал в 4% забуференном парафармальдегиде (pH 7.4) в течение 48 ч, затем образцы фиксировали в 30% растворе сахарозы в течение 48 ч. при температуре + 4°C. На образцы наносили среду для замораживания Killik и хранили при температуре −70°C. Серийные сагиттальные срезы мозга толщиной 20 µm изготавливали в криостате Microm HM-505N (Microm, Germany) при температуре -20°C. Срезы монтировали на предметные стекла Polysine® (Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany) и хранили при температуре −20°C. Для получения флуоресценции срезы инкубировали в течение 1 ч в 72 5% БСА на PBS с 0.3% nритонх-100 (PBSТ). Затем срезы инкубировали с первичными антителами к амилоиду бета (1-42), МОАВ-2, АРР, тау, тау [T181], PSD95, synapsin1 (1:250) при температуре +4°C в течение 16 часов. После промывки в PBST секции инкубировали с соответствующими вторичными антителами (1:250) в течение часа при комнатной температуре. В качестве негативного контроля первичные антитела заменяли буфером. Секции промывали в PBS, наносили монтирующую среду с добавлением DAPI для окрашивания ядер. Для получения изображений в проходящем свете срезы инкубировали 15 мин в 0,3% растворе Н2О2 на PBS и 1 ч в 5% БСА на PBST. Затем срезы инкубировали с первичными антителами к амилоиду бета (1-42), МОАВ-2 (1:250) при температуре +4°C в течение 16 часов. После промывки в PBS секции инкубировали с соответствующими вторичными антителами (1:250) в течение часа при комнатной температуре. В качестве негативного контроля первичные антитела заменяли буфером. Секции промывали и окрашивали 0,1% крезиловым фиолетовым по Нисслю для окрашивания ядер. Для визуализации морфологии амилоидных бляшек препараты мозга окрашивали Конго красным или Сириусом красным согласно стандартному протоколу. Секции промывали и окрашивали 0,1% крезиловым фиолетовым по Нисслю для окрашивания ядер. Для визуализации морфологии амилоидных бляшек секции промывали 10 мин в PBS и инкубировали 8 мин в 1% Тиофлавине-С. Секции промывали, наносили монтирующую среду CC/Mount. 2.7.2. Анализ и обработка изображений Препараты анализировали с помощью оптического микроскопа AXIOPLAN 2 (Zeiss, Германия). Для количественной оценки плотности пре- и пост-синаптических белков анализировали фотографии (24.4 × 28.8 μm, площадью 4216.3 μm2) одной и той же области молекулярного слоя префронтальной коры и пирамидального слоя СА1 поля гиппокампа крыс (n = 3-5 по 4-6 последовательных срезов) и высчитывали численную плотность белковых кластеров на 100 мкм2. Данные анализировали с помощью программы ImageJ (NIH, Bethesda, MD). 73 2.8. Вестерн блот и дот блот анализы Для вестерн блот анализа образцы белка смешивали с 5Х буфером для загрузки (10% SDS; 15% β-меркаптоэтанол; 50% глицерин; 0.3М трис-HCl pH 6.8; бромфеноловый синий), нагревали 5 минут при + 95°C и наносили по 25 мкг общего белка на дорожки полиакриламидного геля (12% разделяющий, 5% концентрирующий) в трисглициновом буфере (25 мM трис-HCI; 190 мM глицин; 0,1% SDS). После переноса на нитроцеллюлозную мембрану блокировали 5% БСА в PBST (0,01 М фосфатно-солевой буфер с 0,1% Tween20). Далее мембраны инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с первичными поликлональными антителами против synapsin1, PCD95, бета-актина или в течение 16 часов при +40С с первичными поликлональными антителами против тау, тау фосфорилированного [T181], бета-амилоида 1-42, АРР в 5% БСА в PBST. После 2-х отмывок по 15 минут в PBST проводили инкубацию со вторичными антителами (1:2000) в 5% БСА в PBST в течение 30 минут при комнатной температуре. После 3-х отмывок на мембраны наносился ECL-реагент. Хемифлуоресцентное излучение детектировали с использованием рентгеновской плёнки. Интенсивность свечения бендов измеряли с помощью программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Для дот блот анализа образцы белка наносили на нитроцелюлозную мембрану, блокировали 5% БСА в PBST. Далее мембраны инкубировали в течение 1 часа с первичными моноликлональными антителами против белка MOAB-2 (1:1000) в 5% БСА в растворе PBST при комнатной температуре. После 2-х отмывок по 15 минут в PBST проводили инкубацию со вторичными антителами (1:2000) в 5% БСА в PBST в течение 30 минут при комнатной температуре. После 3-х отмывок на мембраны наносился ECLреагент. Хемифлуоресцентное излучение детектировали с использованием рентгеновской плёнки. Интенсивность свечения бендов измерялась с помощью программы ImageJ. 2.9. Иммуноферментный анализ ELISA Содержание бета-амилоида в мозге, соматотропного гормона и IGF-1 в крови оценивали иммуноферментным анализом (ИФА), используя наборы human/rat Aβ (1-42) 74 и Aβ (1-40) ELISA kit, Rat GH ELISA kit и IGF-1 ELISA kit согласно протоколу производителя. 2.10. Активность фермента цитохром с оксидазы Активность фермента цитохром с оксидазы определяли набором реактивов Complex IV Rodent Enzyme Activity Microplate Assay Kit в соответствии с инструкциями изготовителя, для этого в каждую лунку 96-луночного планшета с нанесенными антителами помещали 200 мкл гомогената, содержащего 50 мкг общего белка и инкубировали при комнатной температуре 3 ч. Лунки промывали буфером дважды и добавляли 200 мкл реагента. Методом дифференциальной абсорбционной спектрофотометрии на приборе CLARIO star (BMGLabtech, San-Diego, USA) оценивали активность фермента на основании снижения оптической плотности на 550 нм в течение 2 часов. 2.11. Массовое параллельное секвенирование (RNA-seq) RNA-seq проводили на крысах OXYS и Вистар в возрасте 5 и 18 месяцев (n = 3). 2.11.1. Секвенирование на платформе Illumina Выделенные образцы префронтальной коры от каждого животного помещались в 1.5 мл RNAlater (Ambion) и замораживались при -20°С. Образцы были переданы в ОАО «Геноаналитика» для выделения тотальной РНК и выполнения секвенирования на платформе Illumina Genome Analyzer IIx в соответствии с протоколами секвенирования Illumina (mRNA-Seq Sample Prep Kit, Cat. 1004816). Поли-А фракция РНК (мРНК) была очищена от остальной РНК при помощи магнитных шариков (Sera-Mag Magnetic Oligo (dT) beads) и фрагментирована. В реакции обратной транскрипции с использованием Random праймеров была синтезирована кДНК. Смесь кДНК затем была обработана T4 ДНК полимеразой и ДНК полимеразой Кленова для получения тупых концов. Основание аденина было добавлено к 3’ тупому концу фосфорилированного ДНК фрагмента, после чего к нему лигировали адаптор Illumina с довеском одиночного тимина на 3’ конце. После реакции лигирования адаптеров полученные библиотеки 75 кДНК были амплифицированы и секвенированы на приборе Genome Analyzer IIx с использованием реактивов Single-Read Cluster Generation Kit v2 Sequencing by synthesis (SBS) (Illumina, Cat. FC-940-4001). Каждый образец был просеквенирован на отдельной дорожке ячейки. Для каждого образца было получено около 40 млн. прочтений (ридов) длиной 50 нуклеотидов. 2.11.2. Картирование и анализ дифференциальной экспрессии FastQC. RGSC 3.4 (Ensemble release 69) с помощью программы TopHat (v2.0.4) в режиме “b2-sensitive” (Trapnell et al. 2009). Количество картированных на участки генов ридов было посчитано с помощью программ HTseq–count и Cufflinks. Оценку качества секвенирования проводили с использованием программы Trimmomatic для удаления адаптерных последовательностей и нуклеотидов низкого качества. Риды картировали на референсный геном Rattus norvegicus (Rnor, v5.0.76) с помощью программы TopHat (v2.0.10). Картированные последовательности были использованы для сборки транскриптома по референсному геному с помощью Cufflinks (v2.2.1). Полученная аннотация транскриптов была объединена с известными аннотациями ENSEMBL (Rnor, v5.0.76) и RefSeq (Rnor, v5.0) и использована совместно с данными картирования для составления таблиц числа ридов на ген (HTSeq2, с параметром MAQ>10). Различия в экспрессии оценивали с помощью программных пакетов DESeq и DESeq2, использующих статистическую модель отрицательного биномиального распределения (Anders and Huber, 2010). Одновременно, такой же анализ выполнялся и для картирований, прошедших через удаление потенциальных ПЦР-дупликатов с помощью программы PicardTools, с целью отследить и исключить возможную систематическую погрешность, привнесенную на этапе амплификации библиотек. Уровень значимости изменения экспрессии рассчитывали с учетом поправки для множественных сравнений Бенжамини-Хохберга (БХ p-value, DESeq). При создании объединенного списка ДЭ генов учитывали гены без поправки на множественные сравнения с p < 0.01. Функциональную аннотацию групп дифференциально экспрессирующихся генов проводили с помощью биоинформатических систем DAVID и WebGestalt при порогах значимости обогащения (EASE) p < 0.05. 76 2.12. Статистический анализ Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ STATISTICA (версия 6.0). Использовали факторный ANOVA-анализ с последующим сравнением межгрупповых различий по критерию Newman-Keuls test. Зависимые парные сравнения использовали при оценке параметров поведения и способности к обучению. Различия считались достоверными при р<0.05. Данные представлены как M±S.E.M. 77 Глава 3. РАЗВИТИЕ КЛЮЧЕВЫХ ПРИЗНАКОВ БА У КРЫС OXYS 3.1. Старение Нарушения поведения и памяти у крыс OXYS человека и в отсутствии нейродегенеративных расстройств сопровождается изменениями поведения и снижением когнитивных функций разной степени. Ранние фенотипические проявления БА: изменение эмоционального состояния, незначительные нарушения памяти на недавние события, трудности в запоминании новой информации, – по сути не отличаются от характерных для стареющих людей и животных изменений (de Calignon et al., 2012). Прогрессия заболевания сопровождается двигательными нарушениями, апатией, значительным ухудшением памяти. Ранее мы показали (Kolosova et al., 2009; Stefanova et al., 2010; 2011; Стефанова, автореферат канд.), что проявлениями ускоренного старения мозга крыс OXYS становится раннее формирование пассивного типа поведения на фоне роста тревожности и нарушений способности к обучению и памяти. Эти изменения происходят на фоне развития зарегистрированных методами МРТ нейродегенеративных изменений (Stefanova et al., 2010, Колосова и др., 2011), механизмы которых остаются не ясными. Для их выяснения в настоящей диссертационной работе были использованы крысы OXYS разного возраста, которые предварительно были охарактеризованы по поведению и когнитивным способностям в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт», в восьмирукавном радиальном лабиринте и водном тесте Морриса. 3.1.1. Сниженная моторно-исследовательская активность и повышенная тревожность Исследование моторно-исследовательской активности и уровня тревожности крыс Вистар и OXYS выполнено на животных в возрасте 1, 4 и 18 месяцев. Тест «открытое поле». Согласно результатам дисперсионного ANOVA анализа, с возрастом поведение крыс OXYS и Вистар в тесте «открытое поле» менялось: количество пересеченных квадратов (F2,117 = 47, p < 0.001) и вертикальных стоек (F2,117 = 11, p < 0.00) с возрастом уменьшалось, что указывает на снижение моторноисследовательской активности (рис. 3.1.). Однако скорость этих изменений была выше у крыс OXYS: количество пересеченных квадратов и вертикальных стоек (F1,117 = 53, p < 78 0.001 и F1,117 = 18, p < 0.001, соответственно) было меньше, чем у крыс Вистар. Так, к возрасту 4 месяцев горизонтальная активность у крыс OXYS становилась в четыре раза меньше, чем у месячных (p < 0.05), в то время как у крыс Вистар за этот период горизонтальная активность не менялась и только к 18 месяцам снижалась вдвое (p < 0.05). В результате, если в возрасте 1 месяца межлинейные различия отсутствовали, то в 4 и 18 месяцев количество пересеченных квадратов у крыс OXYS было в 3,5 и 3 раза, соответственно, меньше, чем у крыс Вистар, что указывает на более высокий темп снижения двигательной активности крыс OXYS с возрастом. Вертикальная активность у крыс OXYS в возрасте 4 и 18 месяцев была втрое ниже, чем в возрасте 1 месяца (p < 0.05), у крыс Вистар с возрастом достоверно не менялась, поэтому исследовательская активность крыс OXYS уже в возрасте 4 месяцев была снижена по сравнению с крысами Вистар (рис. 3.1.). Рис. 3.1. Сниженная моторно-исследовательская активность крыс OXYS. Количество пересеченных квадратов (А) и вертикальных стоек (Б) значительно меньше у 4- и 18-месячных крыс OXYS по сравнению с показателями крыс Вистар. Различия достоверны: * - по сравнению с показателем предыдущего возраста, + - по сравнению с показателем крыс в возрасте 1 месяца одной линии, # - по сравнению с показателем крыс Вистар соответствующего возраста. Показатели тревожности в тесте «открытое поле» - латентный период выхода в центр и количество дефекаций – зависели только от генотипа животных и были больше у крыс OXYS (F1,117 = 14, p < 0.001 и F1,117 = 4, p < 0.02, соответственно). Тест «приподнятый крестообразный лабиринт». В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» активность крыс OXYS и Вистар с возрастом снижалась, что проявилось в уменьшении количества выходов в центр (F2,117 = 7, p < 0.001), 79 вертикальных стоек (F2,117 = 6, p < 0.005) и заходов в закрытые рукава (F2,117 = 8, p < 0.00; рис. 3.2.А). Уровень тревожности, напротив, увеличивался, на что указывало снижение количества выходов в открытые рукава (F2,117 = 18, p < 0.001; рис. 3.2.Б), время, проведенное в них (F2,117 = 14, p < 0.001; рис. 3.2.Г) и в центре приподнятого крестообразного лабиринта (F2,117 = 3, p < 0.02). В возрасте 18 месяцев крысы OXYS проводили в 5,5 раза (p < 0.01), а Вистар – в 2,5 раза (p < 0.0001) меньше времени в открытых рукавах, чем в возрасте 4 месяцев, а время, проведенное в закрытых рукавах, росло (F2,117 = 16, p < 0.0001; рис. 3.2.В). С возрастом увеличивалось и количество дефекаций (F2,117 = 8, p < 0.001). Рис. 3.2. Повышенная тревожность крыс OXYS. Количество заходов в закрытые рукава (А) и выходов в открытые рукава (Б) меньше у крыс OXYS по сравнению с показателями крыс Вистар. Время, проведенное в закрытых рукавах, выше (В) и, проведенное в открытых рукавах, ниже (Г) у 18-месячных крыс OXYS, чем у крыс Вистар. Различия достоверны: * - по сравнению с показателем предыдущего возраста, + - по сравнению с показателем крыс в возрасте 1 месяца одной линии, # - по сравнению с показателем крыс Вистар соответствующего возраста. 80 Фактор «генотип» влиял на количество выходов в центр приподнятого крестообразного лабиринта (F1,117 = 4, p < 0.04), заходов в закрытые (F1,117 = 13, p < 0.001) и выходов в открытые рукава (F1,117 = 4, p < 0.05), вертикальных стоек (F1,117 = 75, p < 0.001) и выглядываний (F1,117 = 34, p < 0.001). Все эти показатели были выше у крыс Вистар, что свидетельствует о более высоком уровне тревожности и сниженной двигательной активности крыс OXYS. Количество заходов в закрытые рукава у крыс Вистар снижалось к 18 месяцам (p < 0.05), тогда как у крыс OXYS этот показатель в возрасте 4 месяцев был меньше, чем у месячных крыс этой линии (p < 0.05) и у 4месячных крыс Вистар (p < 0.001). Количество вертикальных стоек у крыс OXYS было меньше, чем у крыс Вистар во всех возрастных периодах (p < 0.05), что указывает на их сниженный уровень исследовательской активности. С возрастом снижение количества вертикальных стоек было достоверным только у крыс OXYS: в возрасте 18 месяцев он был меньше, чем в 1 и 4 месяца (p < 0.05). 3.1.2. Нарушение способности к обучению и памяти Восьмирукавный радиальный лабиринт. Состояние пространственной рабочей и референтной памяти оценивали, обучая крыс в восьмирукавном радиальном лабиринте в возрасте 4 и 18 месяцев. Однако оказалось, что оценить рабочую память (повторные входы в подкрепляемые пищей рукава в течение одного сеанса) в данном тесте у крыс OXYS невозможно, вследствие их сниженной двигательной активности по сравнению с крысами Вистар. Аналогичной ситуация была и при оценке референтной памяти (входы в неподкрепляемые рукава). Поэтому ошибку референтной памяти подсчитывали в процентах с учетом общей двигательной активности (число всех входов в рукава). Анализ результатов показал, что процент ошибки референтной памяти о местоположении целевого объекта (пищи), выраженный в отношении числа входов в неподкрепляемые рукава к общему числу посещенных рукавов в процентах, в 1-й, 2-4 и 5-7 дни тестирования был больше у 4-месячных крыс OXYS (p < 0.05 для всех дней; рис. 3.3.), что свидетельствует о сниженной способности к обучению и памяти. Однако к 810 дню обучения у крыс OXYS процент ошибки референтной памяти уже не различался достоверно от показателя крыс Вистар (p = 0.2), животные запоминали рукава с кормом и меньше входили в рукава без него. С возрастом нарушение способности к обучению у 81 Рис. 3.3. Нарушение способности к обучению и памяти крыс OXYS в восьмирукавном радиальном лабиринте. Процент ошибки референтной памяти (А) достоверно выше у 4-месячных крыс OXYS в 1-й, 2-4 и 5-7 дни, а возрасте 18 месяцев – во все дни тестирования, чем у одновозрастных крыс Вистар. Моторноисследовательская активность (Б) значительно меньше у 4- и 18-месячных крыс OXYS во все дни обучения. Различия достоверны: * - по сравнению с показателем крыс Вистар соответствующего возраста. крыс OXYS росло: в возрасте 18 месяцев процент ошибки референтной памяти во все дни тестирования у них был больше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; рис. 3.3.А). При зависимых парных сравнениях, процент ошибки референтной памяти у 4- и 18-месячных крыс OXYS достоверно не различался ни по одному из десяти дней (p > 0.05), что указывает на значительные нарушения в способности к обучению и памяти. У 4-месячных крыс Вистар процент ошибки снижался к 2-4 дням (p < 0.05) обучения и достоверно не изменялся за время обучения в возрасте 18 месяцев. Общее число входов в рукава – показатель моторно-исследовательской активности – было значительно меньше у 4- и 18-месячных крыс OXYS во все дни обучения (p < 0.05; рис. 3.3.Б). Водный тест Морриса. Исследование пространственной памяти в водном тесте Морриса крыс OXYS и Вистар выполнено на животных в возрасте 4, 12 и 18 месяцев. Как показал анализ результатов, у крыс Вистар способность к обучению в возрасте 4, 12 и 18 месяцев достоверно не различалась (рис. 3.4.А), в то время как у крыс OXYS снижалась с возрастом (p < 0.05), что отражает постепенное ухудшение когнитивных функций мозга (рис. 3.4.Б). Однако только в возрасте 18 месяцев крысы OXYS обучались достоверно хуже, чем крысы Вистар. При этом только в первые три дня на нахождение невидимой платформы крысы OXYS затрачивали больше времени (p < 0.05), чем крысы Вистар, а на 4-й и 5-й день обучения они уже не отличались от крыс 82 Вистар по такому показателю, как латентный период нахождения невидимой платформы. Рис. 3.4. Нарушение способности к обучению и памяти крыс OXYS в водном тесте Морриса. Изменение с возрастом латентного периода (ЛП) нахождения невидимой платформы крысами Вистар (А) и OXYS (Б) в водном тесте Морриса. Различия достоверны: *- по сравнению с показателем 4-месячных крыс одной линии, # - по сравнению с показателем крыс Вистар соответствующего возраста. Полученные результаты свидетельствуют о том, что способность к обучению и память зависят не только от генотипа и возраста животных, но и от используемого для их оценки поведенческого теста. Ранее показано, что способность к обучению условной реакции пассивного избегания при её однократном предъявлении – снижена у крыс OXYS по сравнению с крысами Вистар уже в возрасте 3 месяцев (Лоскутова и Колосова, 2000). Выявленные нами в настоящем исследовании различия в возрастных проявлениях нарушения способности к обучению в восьмирукавном радиальном лабиринте и водном тесте Морриса крыс OXYS и Вистар могут быть связаны с неодинаковой «жесткостью» тестов, поскольку, известно, что на процессы обучения и памяти влияют эмоциональный фон и тревожность. Таким образом, с возрастом моторно-исследовательская активность снижается, а уровень тревожности растет у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами. Различия между крысами OXYS и Вистар появились к возрасту 4 месяцев, а к возрасту 18 месяцев усилились. Нарушения способности к обучению и памяти у крыс OXYS также развиваются уже к возрасту 4 месяцев и прогрессируют с возрастом. Причиной таких изменений становятся нейродегенеративные изменения мозга, которые ранее были выявлены нами методами МРТ (Колосова и др., 2011) и исследовались на следующем этапе работы с применением различных методов и подходов. 83 Синаптическая недостаточность и нейродегенеративные изменения в мозге крыс OXYS при развитии признаков БА 3.2. Одними из наиболее ранних событий при развитии БА становятся синаптическая недостаточность и гибель нейронов. По мере прогрессирования заболевания усиление когнитивных нарушений высоко коррелирует со снижением плотности синапсов (de Calignon et al., 2012). Дисфункция синапсов неизбежно приводит к прогрессии нейродегенеративных процессов и снижению межнейронных связей. Поэтому на следующем этапе работы проведена оценка структурно-функционального состояния нейронов и синапсов гиппокампа и префронтальной коры крыс OXYS и Вистар разного возраста методами световой и электронной микроскопии, вестерн-блота и иммуногистохимии. 3.2.1. Изменение с возрастом популяции нейронов гиппокампа крыс OXYS и Вистар Оценка изменения с возрастом популяции нейронов гиппокампа крыс OXYS и Вистар проведена в возрасте 20 дней, 5 и 15 месяцев. По данным светомикроскопического исследования популяция нейронов СА1 и СА3 полей гиппокампа и зубчатой извилины с возрастом снижалась у крыс обеих линий (Табл. 3.1 и рис. 3.5), однако её динамика была различной у крыс OXYS и Вистар. Таблица 3.1 Количество нейронов на 1 мм среза СА1 и СА3 полей гиппокампа и зубчатой извилины крыс OXYS и Вистар в возрасте 20 дней, 5 и 15 месяцев Возраст 20 дней (n=5) 5 месяцев (n=5) 15 месяцев (n=5) Вистар OXYS Вистар OXYS Вистар OXYS Регион 2 СА1 6051±213 6492±127 3680±119# 4480±114*# 4350±126#+ 3330±169*#+ СА3 5942±132 6176±170 3869±113# 4877±158*# 3074±110#+ 2501±110*#+ ЗИ 9855±412 10596±510 8326±309# 10059±158* 9969±192# 7909±195*#+ Различия достоверны: * - по сравнению с крысами Вистар одного возраста, # - по сравнению с предыдущим возрастом одной линии, + - по сравнению с 20-дневными крысами одной линии. ЗИ – зубчатая извилина. Максимальной популяция нейронов гиппокампа крыс OXYS и Вистар была в возрасте 20 дней, и численная плотность нейронов достоверно не различалась между линиями. К возрасту 5 месяцев количество нейронов в СА1 и СА3 полях примерно 84 втрое снижалось у крыс обеих линий (p < 0.05), в зубчатой извилине – достоверно снижалось только у крыс Вистар (на 15%; p < 0.05). Однако в этом возрасте численная плотность нейронов во всех регионах гиппокампа крыс OXYS была выше, чем у крыс Вистар (p < 0.05). К возрасту 15 месяцев у крыс OXYS популяция нейронов прогрессивно снижалась: в поле СА1 – на 26%, в СА3 – на 49% и в зубчатой извилине – на 21% (p < 0.05), и была значительно ниже, чем у крыс Вистар (p < 0.05). Неожиданными оказались результаты, полученные при анализе динамики популяции нейронов у крыс Вистар: с возраста 5 до 15 месяцев численная плотность нейронов снижалась только в поле СА3 (на 20%; p < 0.05). В поле СА1 и в зубчатой извилине популяция нейронов, напротив, увеличилась на 18% и 20%, соответственно (p < 0.05). Можно предположить, что усиленный нейрогенез в гиппокампе крыс OXYS в возрасте 5 месяцев, а у крыс Вистар – в 15 месяцев, носит компенсаторно-восстановительный характер. Следует отметить, что на фенотипическом уровне именно в эти возрастные периоды у крыс OXYS и Вистар (см. раздел 3.1.2.) выявляются признаки умеренных когнитивных нарушений. Увеличение популяции нейронов может быть также обусловлено увеличением продукции незрелых нейронов в гиппокампе крыс. Рис. 3.5. Изменения с возрастом популяции нейронов СА1 (А) и СА3 (Б) полей гиппокампа крыс OXYS и Вистар (n=10, по три серийных среза с каждого образца). Различия достоверны: * - по сравнению с крысами Вистар одного возраста, # - по сравнению с предыдущим возрастом одной линии, + - по сравнению с 20-дневными крысами одной линии. В любом случае, дисфункциональный нейрогенез может приводить впоследствии к дегенеративным изменениям, которые в свою очередь, способствуют ухудшению памяти при старении и развитии признаков БА у крыс OXYS. Подтверждением этого стали результаты свето- и электронно-микроскопического исследования возрастных изменений цито- и синаптоархитектоники нейронов гиппокампа крыс OXYS и Вистар. 85 3.2.2. Деструктивные изменения пирамидных нейронов гиппокампа и префронтальной коры головного мозга крыс OXYS при развитии признаков БА Исследование возрастных изменений цитоархитектоники нейронов гиппокампа и префронтальной коры головного мозга крыс OXYS и Вистар проведено в возрасте 1, 4 и 18 месяцев на животных, охарактеризованных по поведению. По данным светомикроскопического исследования в префронтальной коре, СА1 и СА3 полях гиппокампа и зубчатой извилине крыс OXYS и Вистар в возрасте 1 месяца отсутствовали межлинейные различия по количеству неизмененных нейронов, пирамидных нейронов с признаками очагового хроматолиза и гиперхромных нейронов без сморщивания (обратимо измененные нейроны), нейронов с признаками тотального хроматолиза и гиперхромных сморщенных нейронов (необратимо измененные нейроны; Табл. 3.2). СА1 СА3 ЗИ ПФ Нейроны, 1 месяц 4 месяца 18 месяцев OXYS Вистар OXYS Вистар OXYS Вистар (n=5) (n=5) (n=5) (n=5) (n=5) (n=5) Н 96,45 ± 2,2 98,74 ± 1,5 85,62 ± 5,9*# 92,06 ± 2,2# 62,81 ± 9,2*# 80,27 ± 6,8# ОИ 2,68 ± 1,4 1,76 ± 0,6 12,21 ± 6,3# 7,27 ± 2,2# 19,94 ± 6,1* 10,96 ± 3,6 НИ 0,63 ± 0,2 0,17 ± 0,2 2,27 ± 1,7 0,65 ± 0,7 17,25 ± 3,3*# 8,76 ± 3,6# Н 97,15 ± 1,5 98,95 ± 0,8 81,92 ± 8,1*# 92,21 ± 4,0# 54,61 ± 9,2*# 74,28 ± 6,8# ОИ 2,13 ± 1,2 0,91 ± 0,8 16,41 ± 8,1*# 7,48 ± 3,7# 24,57 ± 7, 1* 15,32 ± 4,5# НИ 0,68 ± 0,6 0,48 ± 0,3 2,31 ± 0,9*# 0,76 ± 0,3 22,36 ± 8,2*# 10,38 ± 3,4# Н 97,35 ± 3,9 99,45 ± 0,1 96,76 ± 0,9# 95,58 ± 1,1# 68,88 ± 6,7*# 81,91 ± 4,2# ОИ 0,78 ± 0,2 0,48 ± 0,2 3,64 ± 0,7*# 2,49 ± 0,5# 18,79 ± 4,9*# 11,16 ± 3,1# НИ 0,15 ± 0,1 0,14 ± 0,1 0,81 ± 0,3# 0,47 ± 0,3# 12,31 ± 2,6*# 6,93 ± 2,0# Н 93.00±0.6 93.16±0.6 71.51±3.2*# 84.95±1.6# 68.47±2.8 77.28±2.2# ОИ 5.54±0.5 5.50±0.5 19.61±3.8# 11.39±1.7# 26.44±3.0* 15.79±1.4 НИ 1.45±0.2 1.34±0.2 8.87±1.2*# 3.66±0.5# 12.04±1.0* 6.93±1.0# % Регион Таблица 3.2 Морфологическая характеристика деструктивных изменений нейронов полей СА1, СА3 гиппокампа и зубчатой извилины крыс OXYS и Вистар. Данные представлены в процентах от общего количества нейронов на 1мм2 Примечания: * - значимые межлинейные различия, # - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом одной линии. N=5, по три серийных среза с каждого образца. ЗИ – зубчатая извилина, ПФ – префронтальная кора, Н – неизмененные нейроны, ОИ – обратимо измененные нейроны, НИ – необратимо измененные нейроны. 86 В возрасте 4 и 18 месяцев выявлены значительные изменения структурной организации пирамидных нейронов полей СА1 и СА3 гиппокампа, зубчатой извилины и префронтальной коры крыс OXYS по сравнению с крысами Вистар. Морфологические изменения пирамидных нейронов мозга крыс OXYS характеризовались мозаичностью проявлений дистрофических, некротических и компенсаторно-восстановительных процессов с очагами тотального повреждения (рис. 3.6А) и очагами очень низкой плотности нейронов (рис. 3.6Б). Выявлялось острое набухание нейронов, очаговый и тотальный хроматолиз, гомогенизация ядра и цитоплазмы, распад ядра и ядрышка, клетки-тени, гиперхромные несморщенные и сморщенные клетки (рис. 3.6Б-Е, рис. 3.7). Рис. 3.6. Очаги тотального изменения пирамидных нейронов по гиперхромному типу (А) и низкой плотности нейронов (Б) в гиппокампе 18-месячной крысы OXYS. Окраска крезиловым фиолетовым по Нисслю. Масштаб – 20 μм. Количественно удельное содержание неизмененных нейронов всех изучаемых регионов гиппокампа и префронтальной коры крыс OXYS в возрасте 4 и 18 месяцев меньше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; Табл. 3.2). Уже в возрасте 4 месяцев у крыс OXYS в регионе СА1 отчетливо выделяются клетки с признаками тотального хроматолиза – измельчением и растворением глыбок хроматофильной субстанции равномерно по всему перикариону и в дендритах, резким уменьшением или исчезновением ядрышек. Деструктивные изменения, в разной степени выраженные, прогрессируют с возрастом у крыс обеих линий, но у крыс OXYS – усиленными темпами. Так, к возрасту 18 месяцев содержание необратимо измененных нейронов, характеризующихся гидропической дистрофией с выраженной вакуолизацией цитоплазмы, распадом ядра и ядрышка (гиперхромные сморщенные клетки с вакуолизацией и без таковой), резко 87 Рис. 3.7. Неизмененные нейроны гиппокампа 4-месячной крысы Вистар (А) и различные варианты деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS в возрасте 4 месяцев (Б-Е). Острое набухание нейронов (стрелки) (Б), гиперхромные несморщенные нейроны (стрелки) (В), гиперхромные сморщенные нейроны (стрелки) (Г), гиперхромные сморщенные нейроны с выраженным перинейрональным отеком (стрелки), тотальное сморщивание гиперхромных нейронов (Е). Окраска крезиловым фиолетовым по Нисслю. Масштаб – 20 μм. увеличивается у крыс обеих линий, но у крыс OXYS во всех регионах гиппокампа и префронтальной коры доля таких клеток больше (p < 0.05; рис. 3.8, Табл. 3.2). Доля обратимо измененных нейронов, характеризующихся периферическим или сегментарным растворением хроматофильной субстанции (очаговый хроматолиз) также увеличивается с возрастом у крыс обеих линий. При этом их удельное содержание во всех изучаемых регионах гиппокампа и префронтальной коры крыс OXYS в возрасте 4 и 18 месяцев выше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; Табл. 3.2). Так, в возрасте 4 месяцев у крыс OXYS отчетливо выделяются нейроны с признаками очагового хроматолиза, наблюдается гиперхромия нейронов без признаков сморщивания (рис. 3.8Б), морфологически характеризующихся увеличением степени базофилии перикариона, укрупнением глыбок хроматофильного вещества с образованием конгломератов. При электронномикроскопическом исследовании пирамидных нейронов СА1 региона гиппокампа 4-месячных крыс OXYS выявлены значительные изменения 88 Рис. 3.8. (А) Удельное содержание нейронов с дегенеративными изменениями в префронтальной коре, СА1 и СА3 полях гиппокампа и зубчатой извилины крыс Вистар и OXYS в возрасте 4 и 18 месяцев. ЗИ – зубчатая извилина. (Б) Примеры пирамидных нейронов префронтальной коры крыс Вистар и OXYS в возрасте 4 и 18 месяцев (стрелками указаны гиперхромные нейроны). Окраска крезиловым фиолетовым по Нисслю. Увеличение - об. 100, ок. 10. * - достоверные межлинейные различия. структурной организации органелл клетки. Митохондрии имеют светлый обводненный матрикс и округлую форму – признаки, указывающие на их набухание, иногда выявляются митохондрии гантелевидной или сферической формы с частичной фрагментацией крист. Цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума (ЭПР) утрачивают характерную для нормы правильную параллельную ориентацию, изогнуты, фрагментированы. Выявляются участки ЭПР с расширенными цистернами, лишенными свободных единичных рибосом и полисом, что создает типичную картину тотального хроматолиза. В отдельных областях ядерной мембраны встречается увеличение числа ядерных пор, перинуклеарное пространство местами расширено. В цитоплазме некоторых нейронов определяются участки скопления гранул липофусцина (рис. 3.9В). К возрасту 18 месяцев изменения структурной организации клеточных органелл крыс OXYS прогрессируют. Оболочка ядра многих нейронов образует глубокие складки, в некоторых участках она становится размытой и нечеткой, увеличивается число ядерных пор, отек ядерной мембраны. В некоторых клетках встречается гипертрофия ядрышек, увеличение в них гранулярного компонента, при этом ядрышки могут находиться на периферии ядра, у его оболочки. 89 Рис. 3.9. Пирамидные нейроны гиппокампа крысы Вистар (А) и крыс OXYS (Б, В) в возрасте 4 месяцев. (Б) Смещение ядрышка на периферию ядра (1). (В) Скопление липофусциновых гранул (1). Местами митохондрии располагаются вблизи оболочки ядра, наблюдаются контакты с ЭПР, комплексом Гольджи. В комплексе Гольджи отмечается расширение и фрагментация цистерн. Лизосомы имеют различную величину, интенсивно и гомогенно прокрашены. Во многих нейронах отмечаются многочисленные вакуоли, фаголизосомы различных размеров и формы (рис. 3.10). Рис. 3.10. Пирамидные нейроны гиппокампа крысы Вистар (А) и крыс OXYS (Б, В) в возрасте 18 месяцев. (Б) Гипертрофия и усложнение формы ядра с инвагинацией ядерной оболочки (1), смещение ядрышка на периферию ядра (2). (В) Высокое содержание липофусциновых гранул (1). 90 Морфометрический анализ пирамидных нейронов СА1 региона гиппокампа 4месячных крыс OXYS показал снижение удельной площади митохондрий и ЭПР, увеличение удельной площади вакуолей и лизосом по сравнению с показателями крыс Вистар (p < 0.05; Табл. 3.3). К возрасту 18 месяцев эти изменения прогрессируют: удельная площадь митохондрий у крыс OXYS снижена втрое, ЭПР – в 2,5 раза, удельная площадь лизосом увеличена в 1,4 раза, вакуолей - вдвое по сравнению с показателями крыс Вистар (p < 0.05). Удельная площадь комплекса Гольджи с возрастом у крыс снижается у крыс обеих линий (p < 0.05), но у крыс OXYS эти изменения становятся более существенными. Таблица 3.3 Удельная площадь органелл в цитоплазме пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа крыс OXYS и Вистар в возрасте 4 и 18 месяцев Линия Возраст, Митохондрии Лизосомы Комплекс г-ЭПР (%) Вакуоли мес. (%) (%) Гольджи (%) (%) Вистар 4 12,6±0,3 8,6±0,21 1,86±0,1 38,6±1,13 2,77±0,12 OXYS 4 11,0±0,31# 11,1±0,3# 2,08±0,1 27,4±0,96# 4,87±0,17# Вистар 18 10,3±0,16+ 8,3±0,19 1,05±0,04+ 27,4±0,51+ 3,97±0,34+ OXYS 18 3,1±0,1#+ 11,9±0,39# 1,20±0,04#+ 11,2±0,33#+ 8,23±0,4#+ Примечание: г-ЭПР - гранулярный эндоплазматический ретикулум; # - достоверные межлинейные различия, + - достоверные изменения показателей с возрастом. Таким образом, оценка состояния цитоархитектоники пирамидных нейронов гиппокампа и префронтальной коры крыс OXYS и Вистар разного возраста показала развитие уже к возрасту 4 месяцев нейродегенеративных изменений в мозге крыс OXYS, что по времени совпадает с формированием у них пассивного типа поведения и повышенной тревожности, снижения способности к обучению. С возрастом деструктивные изменения и гибель нейронов в мозге крыс OXYS усиливаются, что, очевидно, приводит способностей. к значительным нарушениям поведения и когнитивных 91 3.2.3. Возрастные структурно-функциональные изменения синапсов в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга крыс OXYS и Вистар Закономерности изменения синаптоархитектоники с возрастом у крыс OXYS и Вистар изучали на синаптической популяции СА1 поля гиппокампа животных в возрасте 4 и 18 месяцев. Электронномикроскопическое исследование показало, что у крыс обеих линий неперфорированные среди синаптической аксошипиковые и популяции аксодендритные преобладали синапсы. По простые степени выраженности плотных проекций число ассиметричных (функционально зрелых) контактов составило от 78% до 93% в зависимости от возраста и генотипа (Табл. 3.4). Среди них, плоские контакты на поперечных срезах имели прямые профили, положительно искривленные контакты – изгиб в сторону пресинаптической части, отрицательно искривленные – изгиб в сторону постсинаптической части. Морфометрический анализ показал, что в возрасте 4 месяцев общая численная плотность синаптических терминалей была на 21% выше у крыс OXYS (p < 0.05) по сравнению с показателем крыс Вистар (Табл. 3.4). Очевидно, что такие результаты могут быть обусловлены увеличением в этот возрастной период популяции нейронов (см. раздел 3.2.1) в условиях адаптивно-компенсаторной реакции на развитие нейродегенеративных процессов в гиппокампе крыс OXYS. Анализ структурнофункционального состояния синаптических терминалей 4-месячных крыс OXYS и Вистар стал этому подтверждением. Таблица 3.4 Возраст, мес. Крысы Численная плотность межнейронных синапсов поля СА1 гиппокампа (на 100 мкм2) Численная Симметричные плотность, синапсы всего Ассиметричные синапсы Всего Плоские + иск - иск Вистар 4 7.95±0.31 0.54±0.12 7.41±0.30 3.18±0.45 3.10±0.31 1.13±0.18 OXYS 4 9.62±0.39# 1.67±0.21# 7.95±0.30 2.79±0.34 4.73±0.35# 0.43±0.11# Вистар 18 9.16±0.47* 1.28±0.23* 7.88±0.45 2.44±0.33 4.50±0.35* 0.93±0.19 OXYS 18 5.82±0.44#* 1.29±0.18 4.53±0.46#* 1.98±0.31 1.74±0.26#* 0.81±0.20 Примечание: + иск и – иск – положительно и отрицательно искривленные синапсы; # достоверные межлинейные различия, * - достоверные изменения показателей с возрастом. 92 Повышение численной плотности синапсов у крыс OXYS обусловлено увеличением доли симметричных (функционально незрелых) синапсов (p < 0.05; Табл. 3.4). Кроме того, различным у крыс Вистар и OXYS было структурно-функциональное состояние ассиметричных, зрелых, синапсов. Так, у крыс Вистар в возрасте 4 месяцев преобладали неперфорированные плоские (40%) и положительно искривленные (39%) синапсы (Табл. 3.4). Среди перфорированных синапсов (4,5%) преобладали простые синаптические устройства без мембранных инвагинаций. Следовательно, основная популяция синапсов имела умеренную эффективность передачи импульса. Структурные проявления механизмов реорганизации синапсов, такие как гипертрофия, расщепление активной зоны контакта, инвагинация синаптической мембраны, а также содержание деструктивно измененных по светлому типу синапсов у 4-месячных крыс Вистар встречались редко. В отличие от крыс Вистар, у крыс OXYS отмечались проявления реорганизации межнейронных взаимоотношений и гиперактивного функционального состояния синапсов. Об этом свидетельствует увеличение доли синаптических контактов в фазе экзоцитоза (положительно искривленные; Табл. 3.4), вдвое перфорированных (рис. 3.12А) и высокоактивных, гипертрофированных, контактов (рис. 3.12Б) и снижение, более чем вдвое, плотности отрицательно искривленных контактов, характеризующих состояние синапсов в стадии торможения (p < 0.05 для 0.9 # Вистар OXYS 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 4 месяца 18 месяцев Б Гипертрофированные контакты А Перфорированные контакты всех). 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 + 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 4 месяца 18 месяцев Рис. 3.12. Численная плотность перфорированных (А) и гипертрофированных контактов (Б) крыс OXYS и Вистар в возрасте 4 и 18 месяцев. # - достоверные межлинейные различия, + - достоверные изменения показателя с возрастом одной линии. 93 Кроме того, у крыс OXYS выявлено увеличение общего числа активных зон синаптического контакта у крыс OXYS (p < 0.05, Табл. 3.5), прежде всего, за счет увеличения доли наиболее функционально активных зон среднего размера (300-500 нм; p < 0.05). При этом у крыс OXYS наблюдаются признаки деструктивных изменений: появляются синаптические терминали, измененные по светлому типу. Для поврежденных синапсов характерно просветление и набухание цитоплазмы, изменение размеров и формы синаптических пузырьков, появление различных вакуолей, увеличение размеров митохондрий. Таблица 3.5 Число АЗК, всего Вистар 4 7.80±0.31 1.00±0.74 19.7±2.69 27.0±4.21 44.5±3.89 7.8±1.69 OXYS 4 9.62±0.39# 0 26.0±3.71 46.3±3.52# 14.9±2.30# 12.8±3.39 Вистар 18 9.54±0.44 0 16.7±2.54 58.4±3.28 17.9±2.37 7.0±2.90 OXYS 18 6.02±0.40# 0 9.4±3.05 54.1±4.45 30.7±4.69# 5.8±1.97 Крысы Возраст, мес. Число активных зон синаптического контакта с различной длиной (на 100 мкм2) 100-200 нм, % 200-300 нм, % 300-500 нм, % 500-700 нм, % > 700 нм, % Примечание: АЗК – активные зоны контакта; # - достоверные межлинейные различия. С возрастом выявляются значительные изменения синаптоархитектоники в гиппокампе крыс OXYS. Увеличивается доля синаптических терминалей, измененных по светлому типу с выраженной деструкцией: просветление и набухание цитоплазмы, «размытость» контуров мембраны, деструкция синаптических пузырьков и их исчезновение, разрушение митохондрий (рис. 3.13б). У крыс Вистар в возрасте 18 месяцев общая картина состояния ультраструктуры синапсов была во многом сходной с той, что мы наблюдали у 4-месячных крыс OXYS. Содержание деструктивно измененных по светлому типу синапсов у крыс Вистар увеличилось (рис. 3.13А). Примечательно, что количественно популяция синаптических терминалей у 18-месячных крыс Вистар была выше, чем в возрасте 4 месяцев (p < 0.05; Табл. 3.4). При этом, как и в случае 4-месячных крыс OXYS, её увеличение происходило исключительно за счет доли симметричных (функционально незрелых) синапсов (p < 0.05). Очевидно, что такие результаты становятся следствием усиленного нейрогенеза в 94 гиппокампе крыс Вистар в этот возрастной период (см. раздел 3.2.1) и могут носить компенсаторно-восстановительный характер на развивающиеся при старении деструктивные процессы в мозге. Кроме того, у 18-месячных крыс Вистар меняется и характер эффективности передачи импульса: увеличение среди функционально зрелых синапсов доли положительно искривленных контактов (p < 0.05) свидетельствует об устойчивом активном состоянии синапсов. Рис. 3.13. Умеренные проявления деструкции синаптических терминалей по светлому типу (СТ) в нейропиле гиппокампа 18-месячной крысы Вистар (а). Выраженная деструкция синаптических терминалей по светлому типу в нейропиле гиппокампа 18месячной крысы OXYS (б). Ув. 40000. В отличие от крыс Вистар, у крыс OXYS к возрасту 18 месяцев плотность синапсов снижается на 40% (p < 0.05). Происходит это исключительно за счет уменьшения доли ассиметричных, функционально зрелых синапсов: количество отрицательно и положительно искривленных синаптических контактов снижается у крыс OXYS с возрастом почти вдвое и втрое, соответственно (p < 0.05, Табл. 3.4). О снижении эффективности передачи сигнала свидетельствует и снижение общего числа активных зон синаптического контакта (p < 0.05, Табл. 3.5). Анализ активной зоны синапсов животных показал, что с возрастом у крыс OXYS она претерпевает 95 выраженные изменения: уменьшение числа синаптических пузырьков, стыкованных с пресинаптической мембраной, появлением «размытости» контура их мембран, дезорганизацией синаптических везикул (рис. 3.14Б). Происходит потеря пузырьками обычной для них округлой или овальной формы. Наблюдаются характерные признаки дезорганизации синаптических везикул: в большинстве контактов пузырьки образуют лишь скопления у пресинаптической мембраны или располагаются группами вблизи от нее. Такие прогрессивные изменения с возрастом синаптоархитектоники нейронов гиппокампа крыс OXYS свидетельствуют о нарушении синаптической пластичности. Рис. 3.14. Примеры активных зон синаптического контакта в гиппокампе 18-месячных крыс Вистар (А) и различные варианты признаков дезорганизации синаптических везикул в гиппокампе 18-месячных крыс OXYS (Б): уменьшение числа синаптических пузырьков, стыкованных с пресинаптической мембраной, скопления большими группами вблизи от пресинаптической мембраны. Масштаб – 1 µm. Важным звеном регуляции синаптической пластичности являются PSD-95 (postsynaptic density protein 95) – основной белок постсинаптического уплотнения и синапсин I – фибриллярный фосфопротеин, участвующий в регуляции процесса выброса нейромедиаторов в синапсах. В многочисленных работах показано, что снижение уровня ряда пре- и постсинаптических белков ассоциировано с БА (Scheff et al., 2014). Среди них, снижение уровня синапсина I и PSD-95 в мозге больных БА рассматривается как маркерное событие (Gylys et al., 2004). В связи с этим, нами проведена оценка изменения с возрастом уровня данных пре- и постсинаптических белков в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар (исследование в возрасте 3, 12 и 24 месяцев методом вестерн-блот и иммуногистохимии). Анализ результатов показал, что с возрастом уровень синапсина I и PSD-95 в гиппокампе снижался у крыс обеих линий (F2,36 = 334.2, p < 0.0001 и F2,36 = 227.1, p < 0.0001, соответственно; рис. 3.15А, Б), но у крыс OXYS их уровень был значительно ниже (F1,36 = 338.0, p < 0.0001 и F1,36 = 93.7, p < 0.0001, соответственно). В префронтальной коре уровень синапсина I и PSD-95 также снижался с возрастом у крыс 96 обеих линий (F2,36 = 263.2, p < 0.0001 и F2,36 = 248.1, p < 0.0001, соответственно; рис. 3.15В, Г). При этом, как показал факторный анализ, уровень синапсина I и PSD-95 в префронтальной коре был меньше у крыс OXYS (F1,36 = 51.0, p < 0.0001 и F1,36 = 189.9, p < 0.0001, соответственно). Далее нами была проведена оценка изменения содержания синапсина I и PSD-95 с возрастом в гиппокампе и префронтальной коре 4 и 18-месячных крыс OXYS и Вистар методами иммуногистохимии. Количественный анализ показал снижение с возрастом пре- и постсинаптической плотности в гиппокампе и префронтальной коре крыс обеих линий (F1,48 = 8.7, p < 0.005 и F1,48 = 31.9, p < 0.0001, соответственно, для гиппокампа; F1,48 = 154.2, p < 0.0001 и F1,54 = 40.2, p < 0.0001, соответственно, для коры; рис. 3.15Б, В). Рис. 3.15. Сниженный уровень PSD-95 и синапсина I в мозге крыс OXYS. (A) Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга 18-месячных крыс OXYS и Вистар специфичными антителами к PSD-95 (зеленый) и синапсину I (Syn 1; красный). Масштаб – 5 μm. (B, C) Количественная оценка плотности PSD-95 и синапсина I в поле CA1 гиппокампа (B) и префронтальной коре (C) 4- и 18-месячных крыс OXYS и Вистар. Данные представлены в процентах от данных 4-месячных крыс Вистар. (D, E) Уровень PSD-95 и синапсина I в гиппокампе (D) и префронтальной коре (E) 3-, 12- и 24месячных крыс OXYS и Вистар методом вестерн-блот анализа. Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: * - между линиями одного возраста, # - по сравнению с предыдущим возрастом одной линии. 97 Однако у крыс OXYS и в возрасте 4 месяцев, и в 18 месяцев содержание синапсина I и PSD-95 в гиппокампе значительно ниже, чем у крыс Вистар (p < 0.0001 для всех, рис. 3.15Б). В префронтальной коре плотность PSD-95 также снижена у 4 и 18-месячных крыс OXYS (p < 0.0001 для обоих возрастов, рис. 3.15В). Плотность синапсина I в коре головного мозга крыс OXYS достоверно ниже только в возрасте 18 месяцев (p < 0.0001). Таким образом, анализ структурно-функционального состояния нейронов и синапсов в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар разного возраста свидетельствует о развитии нейродегенеративных изменений и нарушении функциональной активности синапсов с возрастом у крыс обеих линий. Однако интенсивность таких изменений и скорость их прогрессии выше у крыс OXYS. На основании характерных для крыс OXYS поведенческих и когнитивных нарушений, обнаруженных деструктивных изменений нейронов и синаптической недостаточности, а также выявленных в сетчатке различий между крысами Вистар и OXYS в уровнях мРНК генов Picalm и Apba2 (Kozhevnikova et al., 2013), продукты которых связаны с процессингом АРР, мы предположили, что механизмы ускоренного старения мозга крыс OXYS могут быть связаны с нарушением процессинга АРР. 3.3. Накопление Aβ пептида с возрастом и его локализация в мозге крыс OXYS Повышенное содержание белка АРР в мозге крыс OXYS. Патологическое накопление Aβ обусловлено нарушением баланса между его секрецией и клиренсом в результате изменения процессинга АРР (Mawuenyega et al., 2010). Поэтому на первом этапе исследования развития возможной амилоидной патологии у крыс OXYS нами была проведена оценка динамики возрастных изменений уровня АРР в гиппокампе и профронтальной коре 3-, 13- и 23-месячных крыс Вистар и OXYS методами вестернблота (рис. 3.16). Анализ результатов показал, что уровень АРР в коре и гиппокампе крыс Вистар и OXYS зависел от фактора «возраст» (F1,46 = 33.1, p < 0.001 и F1,46 = 30.7, p < 0.001, соответственно), фактора «генотип» (F1,46 = 17.6, p < 0.001 и F1,46 = 17.5, p < 0.001, соответственно) и взаимодействия этих факторов (F1,46 = 4.6, p < 0.014 и F1,46 = 3.7, p < 0.03, соответственно). Сравнение групповых средних показало, что в возрасте 3 месяцев уровень АРР в гиппокампе и коре головного мозга был на одном уровне у крыс Вистар и OXYS. С возрастом уровень АРР увеличивался у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами (рис. 3.16А). В результате у 13- и 23-месячных крыс 98 OXYS его уровень в гиппокампе и префронтальной коре был значительно выше, чем у крыс Вистар (p < 0.05). Рис. 3.16. Повышенное содержание АРР в мозге крыс OXYS. (А) Уровень АРР в префронтальной коре и гиппокампе крыс Вистар (в) и крыс OXYS (о) в возрасте 3, 13 и 23 месяца согласно данным вестерн-блот анализа. (Б) Относительный уровень АРР в коре и гиппокампе крыс Вистар и OXYS согласно количественному анализу результатов вестерн-блота Данные представлены как mean±S.E.M. Различия достоверны: # - по сравнению с крысами Вистар одного возраста, *- по сравнению с предыдущим возрастом одной линии. Накопление растворимого Aβ1–42 в мозге крыс OXYS. В результате расщепления APP β- и γ-секретазами образуются естественные продукты метаболизма АРР – Aβ пептиды длиной 36-43 аминокислоты (Querfurth and LaFerla, 2010). Среди них преобладают пептиды длиной 40 аминокислот (Aβ1–40); доля наиболее токсичного Aβ длиной 42 аминокислоты (Aβ1–42) составляет около 5–10% всей продукции Aβ пептида. Считается, что повышенное отношение Aβ42/Aβ40 является объективным показателем при диагностике БА (Wolfe, 2007). Основываясь на полученных результатах, свидетельствующих о гиперпродукции АРР, мы провели оценку возрастных изменений уровня Aβ1-40 и Aβ1-42 в мозге крыс Вистар и OXYS. Для этого с помощью наборов ELISA специфичных к человеку/крысе антителам Aβ1–42 и Aβ1–40 методами ИФА было определено содержание растворимой фракции Aβ в гиппокампе и префронтальной коре крыс обеих линий в возрасте 3, 12 и 24 месяцев. Полученные данные представлены в 99 Таблице 3.6. Согласно результатам ANOVA-анализа, уровень Aβ1–42 в префронтальной коре и гиппокампе зависел от возраста (F2,42 = 58.7, p = 0.001 и F2,42 = 48.6, p = 0.001, соответственно) и генотипа (F1,42 = 36.5, p = 0.001 и F1,42 = 45.5, p = 0.001, соответственно). Сравнение групповых средних показало, что, как и в случае с АРР, уровень Aβ1–42 в мозге 3-месячных крыс Вистар и OXYS не различался, но в возрасте 12 и 24 месяцев его уровень был значительно выше у крыс OXYS (p < 0.05; Табл. 3.6). Таблица 3.6 Содержание Aβ1-40 и Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре 3, 12 и 24-месячных крыс OXYS и Вистар Префронтальная кора Возраст, мес. OXYS Вистар Линия Гиппокамп Aβ1-40 (пг/мг ткани) 3 32,4±2,4 27,5±3,4 0,8±0,1 45,3±2,7 30,7±3,9 0,7±0,1 12 62,3±2,8# 47,2±6,9# 0,7±0,1 69,5±5,1# 56,6±5,7# 0,8±0,1 24 68,9±4,6+ 75,1±12,1ˆ+ 1,1±0,3 65,4±3,5+ 72,5±3,6+ 1,1±0,1 3 25,1±1,8* 32,9±4,5 1,3±0,2* 43,3±1,1 33,6±5,4 0,8±0,1 12 48,6±4,5*# 79,6±7,0*# 1,7±0,1* 52,0±7,2 103,5±9,1*# 2,1±0,1*# 24 72,9±4,0ˆ+ 142,4±10,0ˆ*+ 2,0±0,2*+ 77,6±4,6ˆ+ 176,9±12,5*ˆ+ 2,3±0,3*+ Aβ1-42 (пг/мг ткани) Aβ42:Aβ40 Aβ1-40 (пг/мг ткани) Aβ1-42 (пг/мг ткани) Aβ42:Aβ40 Данные представлены как mean±SEM; n=6-8. Различия достоверны: *– по сравнению с крысами Вистар одного возраста; # – между возрастом 3 и 12 мес. одной линии; ˆ – между возрастом 12 и 24 мес. одной линии; + – между возрастом 3 и 24 мес. одной линии. Уровень Aβ1–40 в префронтальной коре и гиппокампе также зависел от возраста (F2,42 = 19.0, p = 0.001 и F2,42 = 85.1, p = 0.001, соответственно) и генотипа только в гиппокампе (F1,42 = 4.5, p = 0.045). Действительно, как показало сравнение групповых средних уровень Aβ1–40 в гиппокампе 3- и 12-месячных крыс OXYS был достоверно ниже, чем у крыс Вистар (p < 0.05) и не обнаружено статистически значимых различий в его уровне в коре головного мозга крыс обеих линий (Табл. 3.6). Кроме того, как видно из Таблицы 3.6 отношение Aβ1–42/Aβ1–40 в гиппокампе и префронтальной коре достоверно увеличивалось с возрастом только у крыс OXYS (p < 0.05) и было достоверно выше, чем у крыс Вистар, в возрасте 12 и 24 месяцев (p < 0.05). 100 Примечательно, что в гиппокампе этот показатель был выше у крыс OXYS уже в возрасте 3 месяцев (p < 0.05). Агрегация Аβ и его локализация в мозге крыс OXYS. Для определения локализации Aβ пептида и характера его накопления с возрастом в мозге крыс OXYS мы провели иммуногистохимическое и гистохимическое окрашивание препаратов мозга крыс обеих линий несколькими специфичными антителами к Aβ пептиду в возрасте 3, 7, 15–18 и месяцев. Результаты исследования показали, что в возрасте 3 месяцев интенсивность сигналов Aβ в мозге крыс Вистар и OXYS была на одном уровне. С возрастом внутриклеточное содержание Aβ в гиппокампе и коре головного мозга крыс обеих линий росло, но у крыс OXYS ускоренными темпами. Кроме того, в отличие от крыс OXYS, у крыс Вистар ни в одной из возрастных точек не обнаружена внеклеточная агрегация Aβ пептида. Примечательно, что при окрашивании препаратов мозга крыс OXYS специфичными антителами к Aβ (Aβ1–42 и MOAB-2) и классическими гистологическими красками, детектирующими амилоид (Congo Red и Sirius Red), в редких случаях мы наблюдали внеклеточную агрегацию Aβ в коре мозга животных уже в возрасте 3-7 месяцев. Значительная внеклеточная агрегация Aβ в мозге крыс OXYS обнаружена в возрасте 15–18 и 24 месяцев. Амилоидные бляшки детектировались в коре, гиппокампе, таламусе, гипоталамусе и стволе головного мозга и не обнаружены в мозжечке. При этом максимальной агрегация внеклеточного Aβ пептида была в коре головного мозга. Большинство агрегатов имело форму диффузных бляшек, которые были иммунореактивны с антителами к Aβ (рис. 3.17А, Б, Е-З, К и М), Конго красным (рис. 3.17В), Сириусом красным (рис. 3.17Г). Существенно меньше было количество фибриллярных амилоидных бляшек, для окрашивания которых применяли Тиофлавин-С (рис. 3.17 И-Л). Кроме того, в возрасте 15–18 и 24 месяцев мы наблюдали накопление Aβ на стенках сосудов головного мозга крыс OXYS (рис. 3.17Н). Таким образом, иммуногистохимическое исследование не только подтвердило результаты, полученные нами методами ИФА, но и определило появление в редких случаях внеклеточной агрегации Aβ в мозге молодых крыс OXYS. 101 Рис. 3.17. Агрегация Aβ в мозге крыс OXYS. (A, Б, E–З, К) и (М) Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга крыс OXYS специфичными антителами к Aβ (Aβ1–42 и MOAB-2). (В, Г) Примеры амилоидных бляшек в мозге крыс OXYS, окрашенных Конго красный (Kongo Red) и Сириус красный (Sirius Red). (И–Л) Примеры агрегации фибриллярной формы Aβ, детектированные Тиофлавином-С (ThioS). (Н) Пример накопления Aβ в кровеносном сосуде головного мозга крыс OXYS; окрашивание Тиофлавином-С (Thio-S). Ядра окрашены DAPI (синий, М). Масштаб - 50 μm для (Д-Ж); 20 μm для (A, В) и (З-К); 10 μm для (Б, Г, Л, М). 102 Накопление растворимой олигомерной формы Aβ1–42 в мозге крыс OXYS. Далее мы провели исследование специфичности накопления Aβ1–42 в мозге крыс OXYS методом дот-блот, используя моноклональные антитела к MOAB-2, которые иммунореактивны с конформационными разновидностями Aβ1–42 и не детектируют APP. Показано, что антитела к MOAB-2 селективны для более токсического Aβ1–42 по сравнению с Aβ1–40 (Youmans et al., 2012). Результаты исследования подтвердили полученные нами ранее данные об усиленном накоплении Aβ1–42 в гиппокампе 3-, 12- и 24-месячных крыс OXYS (рис. 3.18A). Рис. 3.18. Усиленное накопление Aβ1–42 с возрастом в гиппокампе крыс OXYS. (A) Дот-блот анализ Aβ1–42 с использованием антител MOAB-2 в гиппокампе 3-, 12- и 24месячных крыс OXYS и Вистар. (Б, В) Вестерн-блот анализ TBS-растворимого олигомерного Aβ1–42: уровень Aβ1–42 в гиппокампе 7-, 12- и 24-месячных крыс OXYS достоверно выше, чем у крыс Вистар. * - статистически значимые различия между линиями одного возраста. (Г) Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга 3-, 7-, 12- и 24-месячных крыс OXYS и Вистар специфичными антителами к Aβ1–42. Усиленное накопление Aβ1–42 с возрастом в гиппокампе крыс OXYS. Масштаб - 10 μm. В следующем эксперименте нами была проведена оценка уровня растворимого олигомерного Aβ1–42 в гиппокампе крыс OXYS в возрасте 12, 24 месяцев, а также 7 103 месяцев, опираясь на тот факт, что при иммуногистохимическом исследовании мы наблюдали накопление Aβ в мозге животных к возрасту 7 месяцев. Для этого мы использовали антитела иммунореактивные с Aβ1–42, но не с Aβ1–40, APP или с sAPPα и sAPPβ концевыми доменами. Обнаружено, что уровень Aβ1–42 в гиппокампе 7-, 12- и 24месячных крыс OXYS значительно выше, чем у крыс (F1,36 = 570.4, p = 0.0001; рис. 3.18Б, В) и с возрастом растет у крыс обеих линий (F2,36 = 456.9, p = 0.0001). Результаты вестерн-блота были подтверждены иммуногистохимическими методами: интенсивность сигнала Aβ1–42 в гиппокампе 7-, 12- и 24-месячных крыс OXYS была значительна выше, чем у одновозрастных крыс Вистар, и увеличивалась с возрастом (рис. 3.18Г). Таким образом, было установлено, что в возрасте 3 месяцев уровень АРР и Aβ1-42 в мозге крыс OXYS и Вистар не различается и с возрастом повышается у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами. Важно, что повышение уровня АРР, усиленное накопление Аβ и образование амилоидных бляшек в мозге крыс OXYS к возрасту 12 месяцев по времени происходит позже, чем выявляются первые признаки деструктивных изменений нейронов, синаптической недостаточности и снижения когнитивных способностей. 3.4. Гиперфосфорилирование тау-белка в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга крыс OXYS Повышенный уровень тау-белка и его фосфорилированной формы в мозге крыс OXYS. Не менее важным, чем накопление Aβ, маркером БА является повышение уровня тау-белка и его усиленное фосфорилирование. Поэтому на следующем этапе работы методом вестерн-блот анализа нами была проведена оценка уровня тау-белка и его фосфорилированной формы Т181 (фосфо-T181) в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар в возрасте 3, 13 и 23 месяцев. Как показал ANOVA-анализ уровень тау-белка в коре и гиппокампе крыс обеих линий зависел от возраста (F1,51 = 6.9, p < 0.002 и F1,51 = 6.8, p < 0.002, соответственно) и генотипа (F1,51 = 23.8, p < 0.001 и F1,51 = 24.5, p < 0.001, соответственно). Уровень фосфо-T181 в коре и гиппокампе крыс OXYS и Вистар также зависел от возраста (F1,51 = 8.7, p < 0.05 и F1,51 = 8.8, p < 0.001, соответственно) и генотипа (F1,51 = 22.3, p < 0.001 и F1,51 = 22.5, p < 0.001, соответственно). Сравнение групповых средних показало, что у крыс OXYS уровень тау-белка и фосфо-T181 в коре и гиппокампе было достоверно выше в возрасте 3, 13 и 104 23 месяцев, чем у крыс Вистар (p < 0.05) и с возрастом увеличивался (p < 0.05; рис. 3.19). У крыс Вистар уровень обоих белков в коре и гиппокампе увеличивался к возрасту 13 месяцев (p < 0.05) и оставался на одном уровне вплоть до возраста 23 месяцев (рис. 3.19). Рис. 3.19. Повышенный уровень тау-белка и его фосфорилированной формы в мозге крыс OXYS. Уровень тау-белка и фосфо-Т181 в гиппокампе и (A) префронтальной коре (Б) крыс Вистар (в) и крыс OXYS (о) в возрасте 3, 13 и 23 месяцев. Уровень тау-белка и фосфо-Т181 (нормированы на уровень β-актина) в гиппокампе (В, Д) и коре (Г, Е) достоверно выше у крыс OXYS. Данные представлены как mean±S.E.M. # - достоверные межлинейные различия, ^ - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом одной линии. Повышенный уровень саркозил-нерастворимой фракции тау-белка в гиппокампе крыс OXYS. Далее нами была проведена оценка уровня саркозилрастворимой и саркозил-нерастворимой фракции тау-белка в гиппокампе 3-, 12- и 24месячных крыс OXYS и Вистар. Согласно количественной оценке результатов вестернблот анализа общее содержание тау-белка в гиппокампе крыс зависело от возраста (F2,52 105 = 7.3, p < 0.002) и генотипа (F1,52 = 26.4, p < 0.0001). Эти результаты подтвердили полученные нами ранее данные: уровень тау-белка в гиппокампе 3-, 12- и 24-месячных крыс OXYS был значительно выше, чем у крыс Вистар (рис. 3.20). Кроме того, уровень тау-белка у крыс OXYS прогрессивно увеличивался с возрастом (p < 0.05), у крыс Вистар его уровень достоверно повышался к возрасту 12 месяцев (p < 0.05) и оставался на том же уровне в возрасте 24 месяцев (рис. 3.20). Анализ отношения уровня саркозилнерастворимой к уровню саркозил-растворимой фракции тау-белка в гиппокампе крыс обеих линий. Анализ результатов показал, что пропорция саркозил-нерастворимой фракции тау-белка была значительно выше в гиппокампе 3-, 12- и 24-месячных крыс OXYS по сравнению с показателями крыс Вистар (p < 0.05; рис. 3.20). С возрастом пропорция нерастворимой фракции тау-белка в гиппокампе крыс Вистар увеличивалась постепенно (p < 0.05), у крыс OXYS этот показатель значительно увеличивался к возрасту 12 месяцев (p < 0.05) и оставался на высоком уровне до возраста 24 месяцев (p < 0.05). Рис. 3.20. Повышенное содержание саркозил-нерастворимой фракции тау-белка в гиппокампе крыс OXYS. (A, В) Уровень общего тау-белка (нормирован на уровень βактина) в гиппокампе 3-, 12- и 24-месячных крыс OXYS достоверно выше, чем у крыс Вистар. (Б, Г) Отношение уровня саркозил-нерастворимой фракции тау-белка к уровню саркозил-растворимой фракции тау-белка (нормирован на уровень GAPDH и β-актина, соответственно) в гиппокампе 3-, 12- и 24-месячных крыс OXYS достоверно выше, чем у крыс Вистар. Данные представлены как mean ± SEM. * - достоверные различия между линиями одного возраста, # - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом одной линии. 106 Гиперфосфорилирование нерастворимого тау-белка в гиппокампе крыс OXYS. Далее оценка уровня фосфорилирования саркозил-растворимой фракции таубелка (уровень фосфо-Т181 нормирован на уровень общего тау-белка) показала его достоверное снижение только у 3-месячных крыс OXYS (p < 0.05) по сравнению с показателем одновозрастных фосфорилирования крыс Вистар саркозил-нерастворимой (рис. 3.21А). фракции При оценке тау-белка уровня выявлено его значительное повышение у 3-, 12- и 24-месячных крыс OXYS по сравнению с показателями крыс Вистар (p < 0.05; рис. 3.21Б). Кроме того, анализ отношения нерастворимой фракции фосфо-Т181 к растворимой фракции фосфо-Т181 показал, что пропорция саркозил-нерастворимой фракции фосфорилированного тау-белка в гиппокампе 3-, 12- и 24-месячных крыс OXYS была значительно выше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; рис. 3.21Г). С возрастом этот показатель увеличивался у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами (p < 0.05). Таким образом, было установлено, что уже в возрасте 3 месяцев уровень таубелка и его фосфорилированной формы в мозге крыс OXYS достоверно выше, чем у крыс Вистар, что по времени совпадает с формированием у крыс OXYS пассивного типа поведения, повышенной тревожности, снижения способности к обучению на фоне развития у них нейродегенеративных изменений и нарушения синаптической пластичности. Принципиально важно, что повышение уровня АРР и накопление Аβ в мозге крыс OXYS по времени происходит позже, чем повышение уровня тау-белка и его фосфорилированной формы. 107 Рис. 3.21. Повышенное содержание саркозил-нерастворимой фракции фосфорилированного тау-белка в гиппокампе крыс OXYS. (A, В) Уровень саркозилрастворимой фракции фосфо-Т181 (нормализован на уровень β-актина) достоверно ниже у крыс OXYS только в возрасте 3 месяцев, чем у крыс Вистар. (Б, В) Уровень саркозил-нерастворимой фракции фосфо-Т181 (нормализован на уровень GAPDH) достоверно выше 3-, 12- и 24-месячных крыс OXYS. (Г) Отношение уровня саркозилнерастворимой фракции фосфорилированного тау-белка к уровню саркозилрастворимой фракции фосфорилированного тау-белка в гиппокампе крыс OXYS достоверно выше в возрасте 3, 12 и 24 месяцев, чем у крыс Вистар. Данные представлены как mean ± SEM. * - достоверные различия между линиями одного возраста, # - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом одной линии. 3.5. Дисфункция митохондрий в мозге крыс OXYS при развитии признаков БА В последние годы становится очевидным, что дисфункция митохондрий может быть одним из ключевых факторов, инициирующих развитие БА (Swerdlow et al., 2014). Нарастающие с возрастом структурно-функциональные изменения митохондрий рассматриваются как один из ключевых факторов преждевременного старения крыс OXYS. Ранее они были выявлены в тканях сетчатки, в печени и мышцах крыс OXYS (Шабалина И.Г. и др., 1995; Колосова и др., 2001; 2014; Saprunova et al., 2012; Vays et al., 2014). Эти данные, а также выявленные нами деструктивные изменения нейронов и синапсов в мозге крыс OXYS (см. раздел 3.2) определили следующую задачу 108 настоящего исследования – оценку вклада структурно-функциональных изменений митохондрий в развитие у крыс OXYS признаков БА. Для ее решения были исследованы структурно-функцинальные параметры митохондрий гиппокампа и префронтальной коры мозга крыс OXYS и Вистар методами электронной микроскопии и дифференциальной абсорбционной спектрофотометрии 3.5.1. Ультраструктурные изменения митохондрий гиппокампа крыс OXYS и Вистар разного возраста В настоящей работе установлено, что уже в возрасте 4 месяцев в нейронах СА1 поля гиппокампа крыс OXYS присутствуют признаки изменения структурной организации митохондриального аппарата: снижена удельная площадь митохондрий (рис. 3.22Б), часть из них имеет светлый обводненный матрикс и округлую форму – признаки набухания, выявляются митохондрии гантелевидной или сферической формы с частичной фрагментацией крист (рис. 3.22А). К возрасту 18 месяцев эти изменения прогрессируют: площадь митохондрий у крыс OXYS снижена втрое, на ультраструктурном уровне в отдельных митохондриях матрикс электронно-плотный, гомогенный, контур наружной и внутренней мембран неровный, кристы выявляются только по периферии (рис. 3.22). Рис. 3.22. Примеры структурного состояния митохондрий (А) и их удельная площадь (Б) в нейронах СА1 поля гиппокампа крыс Вистар и OXYS в возрасте 4 и 18 месяцев. 109 В синаптических терминалях у крыс OXYS существенно чаще, чем у крыс Вистар отмечалось накопление очень крупных (рис. 3.23) или с деструктивными изменениями (набухание и разрушение) митохондрий. Рис. 3.23. Примеры структурного состояния митохондрий в синаптических терминалях нейронов СА1 поля 18-мес. крыс Вистар и OXYS. Очень крупные митохондрии (стрелки) в аксонах нейронов крыс OXYS. 3.5.2. Возрастные изменения активности фермента цитохрома с оксидазы комплекса IV дыхательной цепи митохондрий в мозге крыс OXYS и Вистар Снижение активности фермента комплекса IV дыхательной цепи митохондрий цитохром с оксидазы – один из ключевых показателей нарушения функциональной активности митохондрий в мозге при БА. Оценка изменения с возрастом активности фермента цитохром с оксидазы в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга крыс OXYS и Вистар проведена в возрасте 20 дней, 4 и 24 месяцев. Как показал ANOVAанализ, её активность в гиппокампе и коре мозга крыс OXYS и Вистар зависела от генотипа (F1,23 = 36.5, p < 0.0001 и F1,23 = 9.8, p < 0.005, соответственно) и была существенно ниже у крыс OXYS. С возрастом её активность в гиппокампе снижалась у крыс обеих линий (F2,23 = 4.8, p < 0.02), в префронтальной коре – на уровне тенденции 110 (F2,23 = 3.2, p = 0.061). Действительно, сравнение групповых средних показало, что в коре крыс OXYS активность цитохром с оксидазы была достоверно ниже, чем у крыс Вистар только в возрасте 24 месяцев (p < 0.01; рис. 3.24). С возрастом её активность в коре мозга крыс Вистар достоверно не изменялась, у 24-месячных крыс OXYS – была существенно ниже, чем в возрасте 20 дней и 4 месяцев (p < 0.001 и p < 0.02, соответственно). В гиппокампе активность цитохром с оксидазы у крыс OXYS была снижена уже в возрасте 20 дней (p < 0.002) и оставалась на низком уровне в возрасте 4 и 24 месяцев (p < 0.002 и p = 0.08, соответственно) по сравнению с показателями крыс Вистар (рис. 3.24). С возрастом активность цитохром с оксидазы в гиппокампе снижалась у крыс обеих линий, но достоверными её изменения были между 20-дневными и 24-месячными животными (p < 0.05). Таким образом, развитие нейродегенеративных изменений в мозге крыс OXYS сопряжено со структурно-функциональными изменениями митохондрий. Рис. 3.24. Активность фермента цитохром с оксидазы в мозге крыс Вистар и OXYS. ОП – оптическая плотность Различия достоверны: * межлинейные различия; # между 20дневными и 24-месячными крысами одной линии; + между 4- и 24-месячными крысами одной линии. Заключение к Главе 3 Проведенное исследование показало, что ускоренное старение мозга крыс OXYS ассоциировано с патогенезом спорадической формы БА - развитием ключевых признаков заболевания. На первом этапе работы при оценке связи фенотипических 111 проявлений ускоренного старения мозга крыс OXYS со структурно-функциональными изменениями нейронов и синапсов в мозге, во-первых, были подтверждены данные, полученные нами ранее (Stefanova et al., 2010): развитие к возрасту 4 месяцев и прогрессия с возрастом нарушения поведения и когнитивных способностей у крыс OXYS по сравнению с показателями крыс Вистар. Эти результаты стали свидетельством устойчивых фенотипических признаков ускоренного старения мозга крыс OXYS. Вовторых, установлено, что манифестация этих нарушений у крыс OXYS происходит на фоне развития первых признаков деструктивных изменений нейронов и синапсов в гиппокампе и префронтальной коре и увеличения их популяции как, очевидно, компенсаторно-адаптивной реакции на развитие нейродегенеративных процессов. Их развитие сопряжено со структурно-функциональными изменениями митохондрий, повышением уровня тау-белка и усилением его фосфорилирования в гиппокампе и префронтальной коре мозга крыс OXYS. Нарастающие с возрастом нарушения поведения и снижение когнитивных способностей на фоне прогрессии деструктивных изменений нейронов и их гибели, снижения плотности синапсов и их структурно-функциональных изменений, гиперфосфорилирования тау-белка, митохондриальной дисфункции сопряжены с повышением уровня АРР, усиленным накоплением токсических форм Aβ в гиппокампе и префронтальной коре и образованием амилоидных бляшек в мозге крыс OXYS. В целом результаты наших исследований свидетельствуют о том, что ускоренное старение мозга крыс OXYS связано с развитием характерных для БА изменений. Последовательность их развития у крыс OXYS: дисфункция митохондрий и гиперфосфорилирование тау-белка, синаптическая недостаточность, деструктивные изменения нейронов на ранних стадиях и их прогрессия на фоне развития амилоидной патологии - соответствует современным представлениям о патогенезе наиболее распространенной спорадической формы заболевания у людей, генетические факторы риска которой, остаются мало изученными. В этой связи, для выяснения генетических основ развития и усиленной прогрессии характерных для БА признаков у крыс OXYS, на следующем этапе работы был проведен сравнительный анализ изменений транскриптома префронтальной коры крыс OXYS и Вистар разного возраста методом массового параллельного секвенирования. 112 Глава 4. АНАЛИЗ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ТРАНСКРИПТОМА ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ КРЫС OXYS И ВИСТАР 4.1. Анализ данных секвенирования транскриптома (RNA-seq) Анализ изменений транскриптома, предшествующих и сопутствующих фенотипическим проявлениям старения и развитию связанных с ним заболеваний, продуктивный подход к поиску молекулярных мишеней - генов, вовлеченных в их этиологию и патогенез. Выясняя природу развития признаков БА у крыс OXYS, мы исследовали транскриптом префронтальной коры их мозга в возрасте 5 и 18 месяцев, в период активной манифестации и усиленной прогрессии признаков БА, методом массового параллельного секвенирования. Для оценки количества картированных дифференциальной экспрессии было прочтений использовано два (ридов) и анализа программных пакета: HTSeq/DESeq и HTSeq/DESeq2. Для DESeq количественной мерой экспрессии гена является сумма всех однозначно выравненных прочтений, которые пересекаются с геном. Для оценки параметра дисперсии методом DESeq используют отрицательное биномиальное распределение. При заданной глубине секвенирования установлено, что в префронтальной коре крыс OXYS и Вистар экспрессируется около 15 200 генов методом DESeq и около 21 200 генов - DESeq2. Учитывая тот факт, что перекрытие списков экспрессирующихся генов методами DESeq и DESeq2 составило 100%, для дальнейшего анализа данных секвенирования транскриптома префронтальной коры крыс использовали данные DESeq2. Установлено, что максимальное количество ридов было 2 687 083. Среднее значение уровня экспрессии по всем детектированным генам было 1 422 рида. В Таблице 4.1 представлены 30 генов с наиболее высокой экспрессией в префронтальной коре крыс. 113 Таблица 4.1 Гены с наиболее высоким уровнем экспрессии в префронтальной коре крыс Ген ND5 Trnw Trnt ENSEMBL ID ENSRNOG0 0000029971 ENSRNOG0 0000029677 ENSRNOG0 0000030339 REFSEQ ID Название гена Число ридов Функция 26202 NADH dehydrogenase subunit 5 2687083 Окислительное фосфорилирование 170608 tRNA-Trp 1186464 Трансляционный посредник 170620 tRNA-Thr 280584 Трансляционный посредник Calm1 ENSRNOG0 0000004060 24242 calmodulin 1 160924 GO:0005509~calcium ion binding / связывание ионов кальция Camk2a ENSRNOG0 0000018712 25400 calcium/calmodulindependent protein kinase II alpha 131236 GO:0005524~ATP binding / связывание АТФ Snap25 ENSRNOG0 0000006037 25012 synaptosomal-associated protein 25 82906 Scd ENSRNOG0 0000046005 83792 stearoyl-CoA desaturase 82750 Camk2n1 ENSRNOG0 0000016322 287005 calcium/calmodulindependent protein kinase II inhibitor 1 78087 Trne ENSRNOG0 0000032997 170619 tRNA-Glu 73661 Zwint ENSRNOG0 0000048682 257644 ZW10 interacting kinetochore protein 69032 Bc1 NA 29294 brain cytoplasmic RNA 1 67692 Map1b ENSRNOG0 0000017428 29456 microtubule-associated protein 1B 62387 59888 Slc1a2 ENSRNOG0 0000005479 29482 solute carrier family 1(glial high affinity glutamate transporter), member 2 Sparcl1 ENSRNOG0 0000015093 25434 SPARC-like 1 58972 Map2 ENSRNOG0 0000011841 25595 microtubule-associated protein 2 58664 Map1a ENSRNOG0 0000014230 25152 microtubule-associated protein 1A 54512 Ywhaz ENSRNOG0 0000008195 25578 tyrosine 3monooxygenase 53288 GO:0007268~synaptic transmission / синаптическая передача GO:0019226~transmission of nerve impulse / передача нервного импульса GO:0007268~synaptic transmission / синаптическая передача Трансляционный посредник GO:0016192~vesicle-mediated transport / везикулярный транспорт GO:0007626~locomotory behavior / локомоторное поведение GO:0031114~regulation of microtubule depolymerization / регуляция деполимеризации микротрубочек GO:0006836~neurotransmitter transport / транспорт нейромедиаторов GO:0005509~calcium ion binding / связывание ионов кальция GO:0031114~regulation of microtubule depolymerization / регуляция деполимеризации микротрубочек GO:0031114~regulation of microtubule depolymerization / регуляция деполимеризации микротрубочек GO:0006839~mitochondrial transport / транспорт в митохондрии 114 Продолжение Таблицы 4.1 Tomm40 ENSRNOG0 0000018556 308416 translocase of outer mitochondrial membrane 40 homolog 51104 GO:0006839~mitochondrial transport / транспорт в митохондрии GO:0005509~calcium ion binding / связывание ионов кальция GO:0019226~transmission of nerve impulse / передача нервного импульса Clstn1 ENSRNOG0 0000016398 313717 calsyntenin 1 50877 Sptbn2 ENSRNOG0 0000019564 29211 spectrin beta2 50181 Atp1a2 ENSRNOG0 0000007290 24212 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 2 polypeptide 49041 Kif5a ENSRNOG0 0000005299 314906 kinesin family member 5A 49028 Nptxr ENSRNOG0 0000016156 81005 neuronal pentraxin receptor 47960 Glul ENSRNOG0 0000049560 24957 glutamate-ammonia ligase 46614 Kif1a ENSRNOG0 0000023993 363288 kinesin family member 1A 45762 Actb ENSRNOG0 0000034254 81822 actin beta 45335 Sptan1 ENSRNOG0 0000015396 64159 spectrin alpha 1 45315 Calm3 ENSRNOG0 0000016770 24244 calmodulin 3 44529 Atp1a3 ENSRNOG0 0000020263 24213 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 3 polypeptide 43669 GO:0005524~ATP binding/ Связывание АТФ Prkcb ENSRNOG0 0000012061 25023 protein kinase C, beta 43361 GO:0005524~ATP binding / связывание АТФ GO:0005524~ATP binding / связывание АТФ GO:0015630~microtubule cytoskeleton / формирование микротрубочек GO:0005509~calcium ion binding / связывание ионов кальция GO:0005524~ATP binding / связывание АТФ GO:0015630~microtubule cytoskeleton / формирование микротрубочек GO:0005524~ATP binding / связывание АТФ Arrangement of transmembrane proteins, and organization of organelles / организация трансмембранных белков, органелл. GO:0005509~calcium ion binding / связывание ионов кальция Функциональный анализ обогащения терминами генных онтологий (Gene Ontology) транскриптома префронтальной коры крыс показал, что среди генов с самой высокой экспрессией представлены гены, ассоциированные с окислительным фосфорилированием, синтезом АТФ и белка, что связано с высоким уровнем метаболизма в мозге, как наиболее активной и энергоемкой ткани в организме. Закономерно, что на высоком уровне экспрессируются гены, ассоциированные с обеспечением нейрональной пластичности и формирования межнейронных связей в мозге: передача нервного импульса, синаптическая передача, транспорт белков, регуляция формирования микротрубочек (Табл. 4.1). 115 Межлинейные различия. Анализ результатов показал межлинейные различия в экспрессии более двух тысяч генов (при уровне значимости р < 0.01; Табл. 4.2). Было выявлено 923 гена, экспрессия которых была изменена у крыс OXYS в 5 месяцев по сравнению с одновозрастными крысами Вистар, из них 537 с повышенной и 386 со сниженной экспрессией. В приложении 1 представлен топ-список генов с экспрессией, измененной у крыс OXYS более чем в 2 раза по log2 отношению. С возрастом количество дифференциально экспрессирующихся (ДЭ) генов в префронтальной коре крыс OXYS и Вистар, увеличилось более чем вдвое. Так, в возрасте 18 месяцев выявлено 2103 генов с измененной экспрессий, из них 1156 с повышенной и 947 со сниженной экспрессией. Как видно на диаграмме Венна (рис. 4.1А) и в 5, и в 18 месяцев для генов с измененной экспрессией в префронтальной коре крыс OXYS характерно небольшое повышение уровня мРНК (58 и 55% генов, соответственно). Таблица 4.2 Количество генов, дифференциально экспрессирующихся в префронтальной коре крыс OXYS по сравнению с крысами Вистар в возрасте 5 и 18 месяцев (р < 0.01). Стрелки обозначают повышение (↑) и снижение (↓) уровня мРНК. Возраст Количество ДЭ генов между крысами OXYS и Вистар (межлинейные различия) Линия Количество ДЭ генов с возрастом, между 5 и 18 месяцами 5 мес. 923 (537↑, 386↓) OXYS 5606 (2985↑, 2621↓) 18 мес. 2103 (1156↑, 947↓) Вистар 499 (293↑, 206↓) Следует подчеркнуть, что 309 генов с межлинейной разницей по экспрессии перекрываются между возрастными группами: 168 из них повышено и 141 - снижено. Функциональный анализ обогащения терминами генных онтологий транскриптома префронтальной коры показал, что в возрасте и 5, и 18 месяцев у крыс OXYS повышенный уровень экспрессии генов по сравнению с крысами Вистар ассоциирован с изменениями генов, участвующих в ответе на циклические органические соединения, регуляции размера кровеносных сосудов и вазодилатации, ответе на эндогенные стимулы, аутофагии (<10-5; Табл. 4.3). Среди генов со сниженным уровнем экспрессии в возрасте и 5, и 18 месяцев в префронтальной коре крыс OXYS выявлены ассоциации с изменениями процессинга фагосомы, эндоцитоза, клеточной адгезии, главного комплекса гистосовместимости (<10-4), каталитической активности, иммунного ответа (р<0.0042) и структурной организации миелиновых волокон (р=0.0003; Табл. 4.3). 116 Рис. 4.1. Диаграммы Венна для ДЭ генов. (А) Количество генов в префронтальной коре крыс OXYS со сниженным и повышенным, по сравнению с крысами Вистар, уровнем мРНК в возрасте 5 и 18 месяцев и пересечения между группами генов. (Б) Количество генов, снизивших и повысивших уровень мРНК с возрастом у крыс OXYS и Вистар, и пересечения между группами генов. Таблица 4.3 Обогащение по терминам генных онтологий для групп генов с повышенным и сниженным уровнем экспрессии в префронтальной коре 5- и 18-месячных крыс OXYS. В скобках указан уровень значимости с поправкой БХ Уровень экспрессии повышенный WP1305~ Senescence and Autophagy KEGG-, / старение и аутофагия (<10-5) Wikirno01110~ Metabolic pathways / pathways метаболические пути (р=0.0024) GO:0014070~ response to organic cyclic compound / ответ на органические составляющие (<10-8) GO:0050880~ regulation of blood vessel size / регуляция размера GO: кровеносных сосудов (<10-6) biological GO:0042311~ vasodilation / process вазодилатация (<10-6) GO:0009719~ response to endogenous stimulus / ответ на эндогенные стимулы (<10-5) Таким образом, с использованием сниженный rno04145: Phagosome / фагосома (<10-7) rno04144:Endocytosis / эндоцитоз (<10-6) rno04514:Cell adhesion molecules (CAMs) / молекулы клеточной адгезии (<10-6) GO:0019882~antigen processing and presentation / антиген процессинг и представление (<10-4) GO:0042611~MHC protein complex / главный комплекс гистосовместимости (<10-4) GO:0003824~ catalytic activity / каталитическая активность (р=0.0005) GO:0019911~ structural constituent of myelin sheath / структурные составляющие миелиновых волокон (р=0.0003) GO:0006955~immune response / иммунный ответ (р=0.0042) метода RNA-seq были определены дифференциально экспрессирующиеся гены в префронтальной коре крыс OXYS при развитии признаков БА (возраст 5 месяцев) и их активной прогрессии (возраст 18 месяцев) по сравнению с одновозрастными крысами Вистар. 117 Возрастные различия. Всего с возрастом - с 5 до 18 месяцев - у крыс Вистар изменилась экспрессия 499 генов, из них у 293 экспрессия повысилась, у 206 - снизилась (Табл. 4.2 и рис. 4.1Б). У крыс OXYS с возрастом на фоне прогрессирования нейродегенеративных процессов изменилась экспрессия 5606 генов, из которых 2985 повысили экспрессию и 2621 – понизили. В приложении 1 представлен список генов с экспрессией, измененной у крыс OXYS и Вистар с возрастом более чем вдвое по log2 отношению. Сравнение списка генов, однонаправлено изменяющих экспрессию в префронтальной коре крыс обеих линий с возрастом, показал, что у 191 генов экспрессия повысилась, у 142 - снизилась (рис. 4.1Б). Таким образом, выявленные нами изменения экспрессии генов с возрастом в префронтальной коре крыс OXYS по сравнению с крысами Вистар свидетельствуют о различиях в механизмах и скорости изменений при нормальном темпе старения мозга и при развитии нейродегенеративных процессов, характерных для БА. В пользу этого свидетельствуют и результаты сравнения списков генов, дифференциально экспрессирующихся у 18-месячных крыс Вистар и 5-месячных крыс OXYS. Установлено, что уже в 5 мес. у крыс OXYS уровень мРНК 39 генов в префронтальной коре соответствовал уровню ДЭГ с возрастом у 18месячных крыс Вистар, что свидетельствует об ускоренном старении мозга крыс OXYS. На рис. 4.2 представлены 15 из 39 генов с наиболее измененной по уровню значимости экспрессией с возрастом у крыс Вистар. 17412 16000 14000 12000 Вистар 5 мес. Вистар 18 мес. OXYS 5 мес. OXYS 18 мес. Количество прочтений 10000 2500 2000 1500 1000 500 260 1 t 2l ep3 nm fm3 na ox9 enk er2 215 dbp yab 02 dh td2 aox m v l y i N S P Ac m rkc Cr Cd3 Ha Ts P S O Pg H e Tm P Рис. 4.2. Гены, уровень мРНК которых у крыс OXYS в возрасте 5 месяцев соответствует уровню 18-месячных крыс Вистар. 118 4.2. Функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов С помощью терминов Gene Ontology была проведена функциональная аннотация групп ДЭ генов в префронтальной коре крыс с возрастом (возрастные различия) и между крысами OXYS и Вистар (межлинейные различия). Возрастные различия. На рисунке 4.3 и 4.4 представлены основные биологические процессы (термины генных онтологий, Gene Ontology), для которых выявлены значимые изменения экспрессии генов в префронтальной коре с возрастом у крыс OXYS и Вистар, соответственно. Несмотря на то, что набор генов, экспрессия которых изменяется с возрастом, у крыс Вистар и OXYS значительно различается, они объединяются в сходные категории генных онтологий. Так, с возрастом в префронтальной коре крыс обеих линий изменяется экспрессия генов, связанных с фосфорилированием, активностью протеинкиназ, нейрогенезом, синаптической пластичностью, воспалением. У крыс Вистар с возрастом снижается экспрессия генов, участвующих в развитии нейрона (Nrep, Slitrk3, Lppr4, Pvrl1, Robo2, Jak2, Robo3, Sema3a, Olfm3 и Lamb1), активности протеинкиназ (Met, Kit, Trib2, Epha3, Acvr1c, Ntrk3, Epha5, Epha6, Camk4, Pak3, Mapk14, Jak2, Prkaa2, Camk2a и Kcnh5). К возрасту 18 месяцев у крыс Вистар повышается экспрессия генов, связанных с воспалительным ответом (C1qa, Cyba, Tf, Ass1, Fcgr2b, C4b, C3, Itgb2 и Mif), глиогенезом (Sox10, Gsn, Nkx6-2, Nab2, Cspg4 и Olig2), ответом на повреждение (Tf, Gfap, Ass1, Plek, C4b, C3, Cst3, Itgb2, Sparc, Mif, C1qa, Cyba, Apod, Fcgr2b и Gsn). По мере прогрессирования признаков БА у крыс OXYS изменяется экспрессия 122 генов, связанных с развитием нейрона (Nrtn, Uchl1, Cspg4, Pip5k1c, L1cam, Cnp, Apod, Htra2 и др.), 81 гена - с регуляцией нейрогенеза (Ache, Lzts1, Efna3, Cspg4, Timp2, Mif и др.), 64 генов - с аксоногенезом (Cck, Stk11, Uchl1, Ephb3, Unc5b, Unc5a и др.), 84 генов - с синаптической трансмиссией (Cltb, Cplx1, Adora2a, Clstn3, Syt3, Grik4 и др.). Так, в модулировании синаптической пластичности участвуют гепарансульфаты (Maeda et al., 2011) и гепарансульфатпротеогликаны (Bernfield et al., 1999). Ранее нами установлено (Рыкова и др., 2011), что завершение формирования мозга в ранний постнатальный период (оно завершается к возрасту 20 дней) у крыс OXYS происходит на фоне изменения состава и содержания протеогликанов – гепарансульфатов и 119 хондроитин-сульфатов. С возрастом уровень протеогликанов в мозге крыс OXYS и Вистар закономерно снижался и межлинейные различия нивелировались. Также сообщалось о значительном повышении в мозге крыс OXYS в ранний постнатальный период экспрессии генов ферментов синтеза (Ext1 и Ext2) и деградации (Hpse гепараназы) протеогликанов (Шевелев и др., 2012). Анализ результатов исследования транскриптома не выявил межлинейных различий в уровне мРНК генов Ext1, Ext2, а также их лигандов Extl1 и Extl2 в возрасте 5 месяцев в префронтальной коре мозга. К возрасту 18 месяцев уровень мРНК гена Extl2 снизился у крыс обеих линий, а уровень мРНК генов Ext1, Ext2 и Extl1 напротив, повысился, но только у крыс OXYS. При этом и в 5, и в 18 месяцев в коре мозга крыс OXYS практически вдвое был снижен уровень мРНК гена Hpse, фермента деградации гепарансульфатов. Рис. 4.3. Значимые термины генных онтологий (Gene Ontology), объединяющие гены, экспрессия которых изменяется с возрастом в коре мозга крыс OXYS (p < 0.05). 120 Кроме того, изменения экспрессии 220 генов в префронтальной коре крыс OXYS с возрастом ассоциированы с процессами фосфорилирования (Cspg4, Adora1, Map3k4, Map3k9 Prkaca, Map2k7, Matk и др.), 180 генов - с активностью протеинкиназ (Itpka, Maged1, Mark4, Grk6, Mtor, Tnk2, Gsk3a и др.), 110 генов, связанных с внутриклеточным транспортом белков (Clta, Cltb, Ap1b1, Ap2s1, Hps4 и др.), 128 генов - с цитоскелетным связыванием белков (Maea, Hip1r, Crocc, Vapb, Mtss1l, Pacsin1 и др.), 50 генов - с организацией митохондрий (Sept4, Oxa1l, Timm50, Timm13, Fis1, Mrpl12, Sharpin, Tomm40 и др.), 71 гена - с убихинон-связанными катаболическими процессами (Uchl1, Ube2g2, Man1b1, Bap1, Usp19 и др.). Рис. 4.4. Значимые термины генных онтологий (Gene Ontology), объединяющие гены, экспрессия которых изменяется с возрастом в коре мозга крыс Вистар (p < 0.05). Экспрессия генов, участвующих в делении органелл (Sept2, Pds5b, Dnm1l, Pds5a, Tmem215, Katna1, Usp16 и др.) и слиянии органелл (Mfn1, Cav2, Vav3, Gnai3, Cyp26c1, Gnai1, Vamp7, Uso1, Eea1 и Vcpip1), снижается. Повышается экспрессия 35 генов, участвующих в процессах организации микротрубочек (Kifc2, Kif22, Spg7, Crocc, Uchl1, Tubb5, Tubg1, Tubb3 и др.), 39 генов - в олигомеризации белка (Prkcz, Traf2, Ache, 121 Kcnab2, Stk11, Aldoc, Prkcsh, Lnx1, Mif и др.), 17 генов - в глиогенезе (Sox10, Adora2a, Cspg4, Hdac11, Sod1 и др.). Также повышается экспрессия 72 генов, связанных с апоптозом (Ppard, Dedd, Fastk, Eif5a, Casp9, Bag3, и др.). Далее с помощью базы данных KEGG pathway и Wikipathways был проведен анализ групп ДЭ генов в префронтальной коре крыс OXYS и Вистар с возрастом, ассоциированных с сигнальными путями. Анализ результатов выявил ассоциации с сигнальными путями, контролирующими транскрипцию генов, метаболизм, пролиферацию и подвижность клеток, воспаление, апоптоз и другие процессы (Табл. 4.4). У крыс Вистар наиболее значимые изменения экспрессии генов с возрастом связаны с активацией сигнального пути рецептора В-клеток (Rps6ka1, Card11, Zap70, Blnk, Rps6, Fcgr2b) и Т-клеток (Cd4, Card11, Zap70), IL-5 сигнального пути (Itgam, Rps6ka1, Itgb2), системы комплемента. У крыс OXYS наиболее значимые изменения экспрессии генов с возрастом в коре мозга ассоциированы с G Protein-, EGFR1-, Chemokine-, ErbB-, Wnt- и Calcium-зависимыми сигнальными путями (Табл. 4.4), что характерно и для больных БА (Winkler and Fox, 2013). Общими для крыс обеих линий были изменения экспрессии генов, связанных с MAPK-, Инсулин- Нейротрофин-, EGFR1- и mTOR-сигнальными путями, однако представленность генов и значимость их изменений выше у крыс OXYS (Табл. 4.4). Так, с возрастом у крыс OXYS увеличивалась экспрессия серин-треониновой протеинкиназы (Stk11) – ключевого компонента эволюционно консервативного mTOR-сигнального пути (mammalian target of rapamycin – мишень рапамицина млекопитающих), который играет ключевую роль в регуляции клеточной пролиферации и метаболизма, отвечая на воздействие митогенов, инсулина и нутриентов. mTOR-сигнальный путь контролирует продолжительность жизни, интегрируя множество сигнальных путей, и функционирует как сенсор уровня питательных веществ и энергии в клетке (Johnson et al., 2013) и рассматривается как потенциальная мишень для профилактики старения. Многочисленными исследованиями доказано, что рапамицин (антибиотик со свойствами иммунодепрессанта) специфически ингибируя mTOR-путь моделирует эффекты снижения калорийности диеты единственного надежно доказанного способа увеличения продолжительности жизни. Показано влияние рапамицина на старение дрожжей и беспозвоночных, он продлевает жизнь мышей, оказывая влияние на течение возрастзависимых заболеваний (Blagosklonny, 2008). На культуре фибробластов детей с прогерией выявлена 122 способность рапамицина снижать проявления преждевременного старения (Cao et al., 2011). Связь преждевременного старения крыс OXYS с изменением активности mTORсигнального пути подтвердили наши исследования. Мы показали, что прием рапамицина в период манифестации его признаков снизил уровень фосфорилированной формы рибосомального белка S6 – маркера активности mTOR-пути в мозге и сетчатке крыс OXYS, предупредил развитие у них ретинопатии, нарушений поведения, нейродегенеративных изменений в мозге (данные МРТ) и снизил уровень фосфорилирования тау белка в коре и гиппокампе (Kolosova et al., 2012, 2013). 123 Таблица 4.4 Сигнальные пути с наиболее значимыми изменениями экспрессии генов с возрастом в коре мозга крыс OXYS и Вистар, согласно базам данных KEGG pathway и Wikipathways База данных Сигнальный путь Число генов БХ pvalue adjP Крысы OXYS rno04010 MAPK signaling pathway / МАРК сигнальный путь 98 5.45e-30 5.83e-28 WP439 Insulin Signaling / Инсулин сигнальный путь 63 3.21e-22 4.37e-20 54 2.01e-20 4.78e-19 45 4.23e-20 1.44e-18 rno04722 WP73 Neurotrophin signaling pathway / Нейротрофин сигнальный путь G Protein Signaling Pathways / G протеин сигнальные пути WP5 EGFR1 Signaling Pathway / EGFR1 сигнальный путь 70 5.58e-19 1.08e-17 rno04062 Chemokine signaling pathway / Хемокин сигнальный путь 57 3.58e-15 5.47e-14 rno04150 mTOR- signaling pathway / mTOR-сигнальный путь 27 5.19e-14 6.17e-13 rno04012 ErbB- signaling pathway / ErbB-сигнальный путь 35 1.68e-13 1.89e-12 rno04310 Wnt signaling pathway / Wnt-сигнальный путь 46 1.43e-11 1.02e-10 rno04020 Calcium signaling pathway / Са-сигнальнальный путь 52 1.58e-11 1.09e-10 Крысы Вистар WP285 B cell receptor signaling pathway / B Cell Receptor сигнальный путь 9 0.0001 0.0009 rno04115 p53 signaling pathway / p53 сигнальный путь 5 0.0007 0.0055 rno04660 T cell receptor signaling pathway / T cell receptor сигнальный путь 6 0.0007 0.0055 WP44 IL-5 Signaling Pathway / IL-5 сигнальный путь 5 0.0010 0.0061 rno04150 mTOR- signaling pathway / mTOR-сигнальный путь 4 0.0014 0.0094 WP5 EGFR1 Signaling Pathway / EGFR1 сигнальный путь 7 0.0046 0.0195 rno04010 MAPK signaling pathway / MAPK-сигнальный путь 8 0.0046 0.0224 rno04722 Neurotrophin signaling pathway / Нейротрофин сигнальный путь 5 0.0082 0.0310 rno04910 Insulin Signaling / Инсулин сигнальный путь 5 0.0087 0.0311 WP81 Complement Activation, Classical Pathway / Активация системы комплемента, классический путь 2 0.0100 0.0351 124 Более того, с помощью биоинформатической системы WebGestalt функциональная аннотация ДЭГ генов (при уровне значимости р < 0.01) в префронтальной коре крыс OXYS показала представленность 62 генов из пути БА (pvalue = 2.58e-14; adjP = 3.25e-13). Для более полной оценки вклада изменения экспрессии генов при прогрессии у крыс OXYS признаков БА, была проведена функциональная аннотация ДЭГ при уровне значимости р <0.05 с поправкой на множественные сравнения. Согласно базе данных KEGG pathway, значимые изменения экспрессии 85 генов в префронтальной коре крыс OXYS с возрастом связаны с метаболическим путем БА (p-value = 6.39e-18; adjP = 8.27e-17; рис. 4.5), из них экспрессия 27 генов снижается и 58 генов повышается (приложение 2). Рис. 4.5. Согласно базе данных KEGG pathway, 85 дифференциально экспрессирующихся генов (красные звездочки) в префронтальной коре крыс OXYS вовлечены в путь БА. 125 Далее с помощью базы данных DAVID была проведена функциональная аннотация групп ДЭ генов в префронтальной коре крыс OXYS ассоциированных с метаболическим путем БА. В Таблице 4.5 представлены основные биологические процессы (термины генных онтологий, Gene Ontology), для которых выявлены значимые изменения экспрессии 85 генов. Как показал анализ результатов, прогрессия признаков БА у крыс OXYS происходит на фоне, связанного с процессингом бета-амилоида, повышения экспрессии генов β- и γ-секретаз и Арр. С возрастом изменятся экспрессия генов, ассоциированных с высоко консервативным Notch-сигнальным путем, играющим важную роль в нейропластичности. Кроме того, изменения экспрессии генов, вовлеченных в метаболический путь БА, у крыс OXYS к возрасту 18 месяцев группируются в следующие категории (термины генных онтологий): клеточный цикл, внутриклеточный транспорт, ответ на гипоксию, клеточный ответ на стресс, ответ на гормональные и эндогенные стимулы. Значительные изменения экспрессии генов связаны с функциями митохондрий и синаптической пластичностью. Развитие с возрастом признаков БА у крыс OXYS происходит на фоне повышения экспрессии генов, связанных с фосфорилированием, и изменения экспрессии генов, вовлеченных в регуляцию каспаз и киназной активности. Повышается и экспрессия генов-индукторов апоптоза (Табл. 4.5). Примечательно что, как и у больных БА (Winkler and Fox, 2013), у крыс OXYS значимое изменение экспрессии генов с возрастом ассоциировано с другими нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (Табл. 4.6), что предполагает общие механизмы развития нейродегенеративных процессов. Таблица 4.6 Нейродегенеративные заболевания, с которыми ассоциировано изменение экспрессии генов с возрастом в префронтальной коре крыс OXYS, согласно базе данных KEGG pathway Число генов БХ p-value adjP Болезнь Альцгеймера 85 6.39e-18 8.27e-17 Болезнь Хантингтона 83 2.34e-16 2.23e-15 Болезнь Паркинсона 63 5.50e-13 3.18e-12 Боковой амиотрофический склероз 24 2.31e-05 5.22e-05 126 Таблица 4.5 Значимые термины генных онтологий, объединяющие 85 генов, изменение экспрессии которых в коре мозга крыс OXYS ассоциировано с путем болезни Альцгеймера Повышение Gene Ontology (GO) GO:0050435~бета-амилоид метаболический процесс GO:0007219~Notch сигнальный путь GO:0006119~окислительное фосфорилирование GO:0022900~электрон-транспортная цепь GO:0045333~клеточное дыхание GO:0003954~активность NADH дегидрогеназы GO:0004129~активность цитохром с оксидазы GO:0070482~ответ на окислительные уровни GO:0006979~ответ на окислительный стресс Снижение Bace1, Psen2 App, Aph1a, Psen2, Psenen Atp5d, Atp5e, Uqcrc1, Ndufb8, Atp5b, Ndufa7, Atp5f1, Atp5g2, Atp5g1, Atp5o, Atp5a1 Uqcrc1, Ndufb8, Ndufa9, Ndufa7, Ndufa10, Uqcrq, Ndufa11, Ndufv3, Sdhb, Ndufs2 Sdhb, Uqcrc1, Ndufb8, Sdhc, Ndufa7 Ndufs7, Ndufa9, Ndufb8, Ndufv1, Ndufa7, Ndufs2 Loc688869, Cox8a, Cox4i2, Cox6a1, Cox4i1, Cox5b Nos1, Psen2, Adam17, Bad Bad, Ndufs2, Ndufa12 Adam10, Adam17 Atp5c1, Atp5j, Cycs Ndufa5, Cycs, Ndufs4 Ndufa5, Cycs Ndufs4 Ndufs4 Cox5a, Cox7b GO:0005509~связывание ионов кальция Atp5b, Grin1, Itpr3, Cacna1s, Capn1, Grin2d, Calm3 GO:0006816~транспорт ионов кальция GO:0016595~связывание глутамата GO:0005234~активность глутаматергического Grin1, Psen2, Itpr3, Cacna1s Casp12, Casp3 Cycs,Casp3 Calm2, Calm1, Grin2a, Plcb1, Plcb4, Ppp3cb, Ppp3r1 Grin2a, Ppp3ca Grin2d, Grin1 Grin2a GO:0016310~фосфорилирование Atp5d, Atp5e, Uqcrc1, Ndufb8, Atp5b, Ndufa7, Atp5f1, Atp5g2, Atp5g1, Cdk5, App, Mapk3, Ern1, Atp5o, Atp5a1 Adam10, Atp5c1, Atp5j Cycs, Gsk3b, Mapk1 GO:0042325~регуляция фосфорилирования App, Lrp1, Psen2, Ern1, Cdk5 GO:0046907~внутриклеточный транспорт GO:0060078~регуляция постсинаптического App, Mapk3, Atp5o, Cdk5 Adam17, Casp3, Gsk3b, Ndufs4 Mapk1,Gsk3b, Ppp3ca потенциала Grin1, Cdk5 Grin2a, Ppp3ca пластичности GO:0007268~синаптическая трансмиссия GO:0030424~аксон Grin1, Psen2, Cdk5 Gsk3b,Grin2a, Ppp3ca App, Grin2d, Grin1, Cdk5 App, Mapt, Bace1, Cdk5 GO:0007049~клеточный цикл Cdk5, App, Mapk3, Ern1, Calm3, Apbb1 GO:0001666~ответ на гипоксию Nos1, Psen2, Bad GO:0009719~ответ на эндогенные стимулы GO:0009725~ответ на гормональные стимулы Nos1, Cyc1, Grin1, Bad, Cox5b, Casp9 GO:0033554~клеточный ответ на стресс GO:0006974~ответ на стимулы ДНК Casp9, Mapk3, Ern1, Apbb1 Grin2a, Ppp3ca Mapk1 Adam17, Calm1, Calm2, Gsk3b, Mapk1, Nae1, Ppp3ca Adam17, Casp3 Adam17, Casp3,Casp12, Grin2a, Mapk1, Ppp3ca Ppp3cb Casp3, Casp12, Gsk3b, Mapk1, Nae1 канала GO:0048167~регуляция синаптической повреждений GO:0034976~ответ на ЭПР стресс Ern1 GO:0045859~регуляция киназной активности App, Lrp1, Psen2, Ern1, Cdk5 GO:0050321~тау-протеин киназная активность GO:0043281~регуляция каспаз Cdk5 Casp9, Bad App, Aph1a, Casp9, Psen2, Ern1, Psenen, Bad Aph1a, Bad, Cdk5, App, Casp9, Mapt, Psen2, Ppp3cc, Psenen, Apbb1, Gapdh GO:0006917~индукция к апоптозу GO:0006915~апоптоз Casp12, Gsk3b Gsk3b, Adam17, Casp3 Gsk3b Casp12, Cycs Gsk3b,Casp3, Nae1 Cycs, Casp3, Casp12, Nae1, Ppp3r1 127 Действительно, анализ списка ДЭ генов, вовлеченных в метаболические пути БА, болезни Хантингтона и болезни Паркинсона, выявил 47 генов общих для этих заболеваний (рис. 4.6). Подавляющее большинство этих генов связано с комплексами дыхательной цепи митохондрий, дисфункция которых рассматривается как один из ключевых факторов риска развития нейродегенеративных заболеваний (Witte et al., 2010). Также, общими для БА, болезни Хантингтона, болезни Паркинсона и бокового амиотрофического склероза были гены регуляторы апоптоза - Casp3, Casp9 и Cycs. Кроме того, для БА и болезни Хантингтона общими были транскрипты фосфолипазы С (Plcb1 и Plcb4), ген Gnaq, участвующий в регуляции ядерных метаболических процессов, и рецептор глутамата Grin1. Рис. 4.6. Список общих генов, изменение экспрессии которых с возрастом в префронтальной коре крыс OXYS ассоциировано с нейродегенеративными заболеваниями, согласно базе данных KEGG pathway. Таким образом, результаты функционального анализа свидетельствуют о значительных различиях в возрастных изменениях экспрессии генов в префронтальной коре крыс OXYS и Вистар. Впервые нами показано, что у крыс OXYS прогрессия с возрастом признаков БА происходит на фоне изменения экспрессии генов, связанных с процессингом АРР, регуляцией тау-белка, нейрональной пластичностью, функциями митохондрий, апоптотическими процессами. 128 Межлинейные различия. На рисунке 4.7 и 4.8 представлены основные биологические процессы (термины генных онтологий, Gene Ontology), для которых выявлены значимые изменения экспрессии генов в префронтальной коре в период развития у крыс OXYS признаков БА (возраст 5 месяцев) и в период их активной прогрессии (возраст 18 месяцев) по сравнению с крысами Вистар. Анализ специфичных для возраста 5 месяцев ДЭ генов, показал, что на ранней стадии развития признаков БА у крыс OXYS изменена относительно крыс Вистар экспрессия генов, участвующих в регуляции клеточной пролиферации, внутриклеточном сигнальном каскаде. Экспрессия генов Wnt-зависимого сигнального пути, ответа окислительный на внеклеточный стресс, стимул, фосфатазной регуляции активности, фосфорилирования ответа на аминокислот, дефосфорилирования, транспорта анионов и ионов калия, дифференциации миелоидных клеток, регуляции иммунных процессов повышена. Структурная организация миелиновых оболочек MHC class I белковый комплекс Регуляция Wnt сигнального пути Формирование нервных трубочек Аксон Регуляция дифференциации миелоидных клеток Регуляция иммунных процессов Транспорт анионов Дефосфорилирование Транспорт ионов калия Регуляция фосфорилирования аминокислот Ответ на окислительный стресс Ответ на гипоксию Позитивная регуляция иммунных процессов Активность фосфатазы Ответ на внеклеточный стимул Клеточная адгезия Ответ на гормональный стимул Связывание ионов кальция Внутриклеточный сигнальный каскад Регуляция клеточной пролиферации Снижение Повышение 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Число генов Рис. 4.7. Значимые термины генных онтологий (Gene Ontology), объединяющие межлинейные различия в экспрессии генов в префронтальной коре крыс Вистар и OXYS в возрасте 5 месяцев (p < 0.05). 50 5 129 В возрасте 5 месяцев у крыс OXYS снижена экспрессия генов, участвующих в организации миелиновых оболочек (Crocc, Haus1, Nefh, Cnp, Tubgcp2), при этом повышена регуляция формирования микротрубочек (P2rx4, Adora2b, Agt, Pde5a, Gucy1a3) И в 5, и в 18 месяцев у крыс OXYS повышена экспрессия генов ответа на гипоксию, клеточной адгезии, связывания ионов кальция, ответа на гормональный стимул. Изменение экспрессии генов, ассоциированных с аксоногенезом, также характерно для крыс OXYS обеих возрастных периодов. Морфогенез митохондрий Регуляция синаптической пластичности Связывание микротрубочек Глиогенез Связывание нейромедиаторов Аксоногенез Регуляция синаптической трансмиссии Ответ на гипоксию Синаптическая трансмиссия Миграция клеток Внутриклеточный транспорт белков Организация цитоскелета Клеточная гибель Развитие нейрона Цитоскелетное связывание белков Клеточная адгезия Клеточный цикл Ответ на гормональный стимул Протеин киназа активность Связывание ионов кальция Фосфорилирование Снижение Повышение 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Число генов Рис. 4.8. Значимые термины генных онтологий (Gene Ontology), объединяющие межлинейные различия в экспрессии генов в префронтальной коре крыс Вистар и OXYS в возрасте 18 месяцев (p < 0.05). В возрасте 18 месяцев гены со повышенной экспрессией у крыс OXYS группируются в категории (термины генных онтологий): развитие нейрона (Fgfr1, 90 130 Pip5k1c, Grin3a, Ephb2, Lingo1 и др.), организация цитоскелета (Fgd1, Ablim2, Pdlim7, Bcar1, Srf, Ptk2b, Obsl1 и др.), внутриклеточный транспорт белков (Ramp3, Aspscr1, Ap1m1, Ipo13, Hps4, Pml, Cacnb1 и др.), миграция клеток (Plat, Ppard, Efnb1, Bcar1, Itga3, Pf4, Kit, Mmp14 и др.), регуляция синаптической трансмиссии (Plat, Sncg, Ncdn, Gnai2, Grik5 и др.), связывание нейромедиаторов (Kiss1r, Chrm4, Grin2b, Chrm3, Chrm1, Chrnb2, Grin3b, Grin3a и др.), глиогенез (Ascl1, Ptk2b, Agt, Nab2, Phgdh, Reln, C1s, Mmp14, Eif2b1 и Smarca4). Изменена экспрессия генов, участвующих в фосфорилировании, цитоскелетном связывании белков, апоптозе. Экспрессия генов, связанных с клеточным циклом (Nbn, Tmem215, Haus1, Cdc73, Ccng1, Zkscan5, Katna1, Npm1, Usp16 и др.), морфогенезом митохондрий (Mfn2, Mfn1 и Col4a3bp) снижена. 131 Заключение к Главе 4 Впервые методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq) были определены дифференциально экспрессирующиеся гены в префронтальной коре крыс OXYS при развитии признаков БА (возраст 5 месяцев) и их активной прогрессии (возраст 18 месяцев) по сравнению с одновозрастными крысами Вистар. Показано, что с возрастом в префронтальной коре крыс OXYS изменяется экспрессия более 5500 генов, у крыс Вистар - 499 генов. Из них только 333 гена были общими для крыс OXYS и Вистар, что свидетельствует о различиях в механизмах и скорости возрастных изменений мозга при нормальном темпе старения и при развитии характерных для БА нейродегенеративных процессов. Подтверждением этому стало выявление 39 генов, уровень мРНК которых у крыс OXYS в возрасте 5 месяцев и у крыс Вистар в возрасте 18 месяцев был на одном уровне. Манифестация и развитие признаков БА у крыс OXYS происходит на фоне изменения экспрессии более 900 генов, продукты которых участвуют в процессах нейрональной пластичности, иммунной системы и апоптоза, ассоциированы с фосфорилированием белков, гипоксией, Са2+ гомеостазом. Прогрессия с возрастом признаков БА у крыс OXYS, как и у людей с этим заболеванием, происходит на фоне изменения в коре мозга метаболического пути БА – экспрессии 85 генов, связанных с процессингом АРР, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий, синаптическими процессами. Как и у больных БА, у крыс OXYS с возрастом изменяется экспрессия генов, ассоциированных с другими нейродегенеративными заболеваниями: болезнью Хантингтона, болезнью Паркинсона и боковым амиотрофическим склерозом. Подавляющее большинство из них связаны с комплексами дыхательной цепи митохондрий, дисфункция которых рассматривается как один из ключевых факторов риска нейродегенеративных заболеваний. 132 Глава 5. ВЛИЯНИЕ НА МАНИФЕСТАЦИЮ И ПРОГРЕССИЮ ПРИЗНАКОВ БА МИТОХОНДРИАЛЬНОГО АНТИОКСИДАНТА SkQ1 Для проверки связи механизмов ускоренного старения мозга крыс OXYS с патогенезом БА, на следующем этапе работы проведено исследование влияния на развитие и прогрессию признаков БА митохондриального антиоксиданта SkQ1, терапевтическая эффективность которого как нейропротектора была впервые доказана нами ранее (Stefanova et al., 2010) и подтверждена коллегами (Kapay et al., 2013). 5.1. Влияние SkQ1 на развитие признаков БА у крыс OXYS Для оценки профилактических эффектов SkQ1, его способности предупреждать и/или замедлять у крыс OXYS развитие и прогрессирование признаков БА, крысы OXYS и Вистар (как контроль) (n=30) с возраста 1,5 до 23 месяцев получали ежедневно SkQ1 в дозе 250 нмоль/кг массы тела животных. При этом на промежуточном этапе исследования (после 1,5 месяцев приема антиоксиданта) была проведена оценка способности SkQ1 предупреждать формирование пассивного типа поведения, рост тревожности, снижение когнитивных способностей и развитие нейродегенеративных изменений в мозге крыс OXYS в критический период манифестации у них первых признаков БА. Для этого было проведено исследование поведения крыс обеих линий в возрасте 3 месяцев, а в возрасте 4 месяцев часть животных (n=15) была забита для гистологических и молекулярных исследований. Далее была проведена оценка влияния приема SkQ1 на моторно-исследовательскую активность, тревожность (после 11,5 месяцев приема) и способность к обучению (после 13,5 месяцев приема) животных в период активной прогрессии признаков БА у крыс OXYS. В возрасте 23 месяцев (после 21,5 месяцев приема), когда признаки БА у крыс OXYS ярко выражены, оставшиеся животные (n=12-15) были забиты для молекулярных исследований. 5.1.1. Влияние приема SkQ1 на моторно-исследовательскую активность, тревожность, способность к обучению и память крыс OXYS и Вистар Поведение – комплексный признак, который интегрирует все свойства организма. Настоящее исследование (см. раздел 3.1.) подтвердило полученные нами ранее результаты (Kolosova et al., 2009; Stefanova et al., 2010): в возрасте 1 месяца крысы 133 OXYS не отличаются от крыс Вистар по уровню тревожности и моторноисследовательской активности. Различия по этим параметрам формируются к возрасту 3 месяцев, а ряд препаратов со свойствами антиоксидантов (Sergeeva et al., 2006), в том числе - SkQ1 (Stefanova et al., 2010; автореферат канд. Стефанова, 2011), способны замедлять формирование характерного для крыс OXYS пассивного типа поведения, повышенной тревожности и снижения когнитивных способностей. Сам факт изменения поведения в результате воздействия того или иного препарата указывает на его системное воздействие на гомеостатические системы организма. В этой связи была проведена оценка связи способности SkQ1 предупреждать и/или замедлять развитие нарушения поведения и снижение когнитивных способностей в критический период инициации у крыс OXYS признаков БА и в период их активной прогрессии, результаты которой затем были сопоставлены с влиянием препарата на ключевые маркеры этого заболевания. Для этого оценка влияния приема SkQ1 на уровень тревожности и моторно-исследовательскую активность крыс OXYS и Вистар в тестах «приподнятый крестообразный лабиринт» и «открытое поле» проведена в возрасте 3 и 13 месяцев. Влияние SkQ1 на способность к обучению и память крыс оценивали в возрасте 3 месяцев в восьмирукавном радиальном лабиринте и в возрасте 16 месяцев – в водном лабиринте Морриса. Тест «приподнятый крестообразный лабиринт». Как показал ANOVA-анализ, в возрасте 3 месяцев количество выходов в открытые рукава (F1,52 = 6.2, p < 0.02) и время, проведенное в них (F1,52 = 6.3, p < 0.02), – наиболее демонстративных показателей тревожности в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» – было значительно меньше у крыс OXYS (рис. 5.1А, Б). Показатель двигательной активности животных – количество заходов в закрытые рукава (F1,52 = 15.2, p < 0.0004) было меньше, а время, проведенное в них (F1,52 = 4.2, p < 0.048) – больше у 3-месячных крыс OXYS по сравнению с показателями крыс Вистар (рис. 5.1В, Г). С возрастом тревожность крыс обеих линий росла: 13-месячные крысы Вистар и OXYS проводили меньше времени в открытых рукавах (p < 0.0001 и p < 0.013, соответственно) и больше времени – в закрытых рукавах (p < 0.0001 и p < 0.013, соответственно) по сравнению с показателями 3-месячных животных. Примечательно, что в данном исследовании не было выявлено достоверных межлинейных различий по этим показателям у крыс в возрасте 13 месяцев 134 (F1,52 = 4.0, p = 0.052 для количества выходов в открытые рукава и F1,52 = 1.0, p = 0.32 для времени, проведенном в них; F1,52 = 3.1, p = 0.08 для количества заходов в закрытые рукава и F1,52 = 0.9, p = 0.35 для времени, проведенном в них). Анализ результатов показал, что отсутствие статистически значимых различий между линиями по этим показателям связано с высоким уровнем (86%) случаев фризинга (замирания) у крыс OXYS, типичного неспецифического поведения у этих животных в ответ на стрессассоциативную ситуацию при тестировании поведения [Kolosova et al., 2009; Stefanova et al., 2010]. Рис. 5.1. Влияние профилактического приема SkQ1 (с возраста 1,5 до 23 месяцев) на поведение крыс OXYS и Вистар в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». Исследование поведения после 1,5 и 11,5 месяцев приема SkQ1. (А) Количество выходов в открытые рукава и (Б) время, проведенное в них, (В) количество заходов в закрытые рукава и (Г) время, проведенное в них. Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: # - между контрольными крысами Вистар и OXYS, * - по сравнению с контрольными крысами OXYS (значимый эффект препарата). 135 После 1,5 месяцев приема SkQ1 у крыс OXYS количество выходов в открытые рукава и время, проведенное в них, было больше, чем у крыс OXYS контрольной группы, но различия не были статистически достоверными (рис. 5.1А, Б). Также, у принимавших SkQ1 крыс OXYS количество заходов в закрытые рукава было больше, а время, проведенное в них, – меньше (на уровне тенденции), чем у крыс OXYS контрольной группы (рис. 5.1В, Г). Как показал анализ результатов, прием SkQ1 не повлиял на эти показатели 3-месячных крыс Вистар. Длительный прием SkQ1 замедлил возраст-зависимые изменения поведения крыс обеих линий. В результате у принимавших SkQ1 с возраста 1,5 до 13 месяцев крыс Вистар время, проведенное в открытых рукавах, было в 4,4 раза (p < 0.03), а у крыс OXYS – втрое больше, чем у крыс контрольных групп соответствующей линии (рис. 5.1Б). Кроме того, у принимавших SkQ1 крыс Вистар время, проведенное в закрытых рукавах, было меньше, чем у контрольной группы (p < 0.04). Таким образом, анализ результатов поведения крыс OXYS и Вистар в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» выявил способность SkQ1 замедлять рост тревожности у крыс OXYS в критический период их развития и, что важно, не влиять на эти параметры молодых крыс Вистар. При длительном приеме антиоксиданта выявлена способность SkQ1 замедлять рост тревожности с возрастом у крыс обеих линий. Тест «открытое поле». Как показал ANOVA-анализ, моторно-исследовательская активность у 3- и 13-месячных крыс OXYS была значительно ниже, чем у одновозрастных крыс Вистар. Так, в возрасте 3 и 13 месяцев у крыс OXYS количество пересеченных квадратов (F1,52 = 59.4, p < 0.001 и F1,48 = 92.2, p < 0.0001, соответственно; рис. 5.2А) и количество вертикальных стоек (F1,52 = 82.6, p < 0.001 и F1,48 = 52.1, p < 0.001, соответственно; рис. 5.2.Б) было меньше, чем у одновозрастных крыс Вистар. Зависимые парные сравнения показали, что с возрастом моторно- исследовательская активность снижалась у крыс обеих линий. В результате, в возрасте 13 месяцев количество пересеченных квадратов у крыс Вистар и OXYS (p < 0.002 и p < 0.0013, соответственно) и вертикальных стоек (p < 0.002 и p < 0.0009, соответственно) было значительно меньше, чем у 3-месячных крыс обеих линий (рис. 5.2). 136 Как показал анализ результатов, у крыс OXYS после 1,5 месяцев приема SkQ1 количество пересеченных квадратов было значительно больше, чем у крыс OXYS контрольной группы (p < 0.0001; рис. 5.2А). На моторно-исследовательскую активность 3-месячных крыс Вистар прием SkQ1 не повлиял. Длительный прием SkQ1 замедлил снижение с возрастом двигательной активности крыс обеих линий: количество пересеченных квадратов у принимавших антиоксидант крыс Вистар и OXYS было больше, чем у крыс контрольных групп соответствующей линии (p < 0.0001 для обеих линий, рис. 5.2А). Только у 13-месячных крыс Вистар, принимавших SkQ1, количество вертикальных стоек было достоверно больше, чем у крыс Вистар контрольной группы (p < 0.03; рис. 5.2.Б). Рис. 5.2. Влияние профилактического приема SkQ1 (с возраста 1,5 до 23 месяцев) на поведение крыс OXYS и Вистар в тесте «открытое поле». Исследование поведения после 1,5 и 11,5 месяцев приема SkQ1. (А) Количество пересеченных квадратов и (Б) вертикальных стоек. Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: # - между контрольными крысами Вистар и OXYS, * - по сравнению с контрольными крысами OXYS (значимый эффект препарата). Таким образом, анализ результатов поведения крыс OXYS и Вистар в тесте «открытое поле» выявил способность SkQ1 предупреждать снижение с возрастом двигательной и исследовательской активности, рост тревожности у крыс OXYS и, что важно, не влиять на эти параметры молодых крыс Вистар. Тест «восьмирукавный радиальный лабиринт». Состояние пространственной рабочей и референтной памяти оценивали, обучая крыс в восьмирукавном радиальном лабиринте в возрасте 3 месяцев после 1,5 месяцев приема SkQ1. 137 Анализ результатов показал, что процент ошибки референтной памяти о местоположении целевого объекта (пищи), выраженный в отношении числа входов в неподкрепляемые рукава к общему числу посещенных рукавов в процентах, в 1-й , 2-4-й и 5-7-й дни тестирования был больше у 3-месячных крыс OXYS (p < 0.05 для всех дней), что свидетельствует о сниженной способности к обучению и памяти. Однако к 8-10 дню обучения у крыс OXYS процент ошибки референтной памяти уже не различался достоверно от показателя крыс Вистар (p = 0.2), животные запоминали рукава с кормом и меньше входили в рукава без него. Сравнение групповых средних показало отсутствие эффектов препарата на процент ошибки референтной памяти у крыс OXYS и Вистар, однако стоит отметить, что у принимавших SkQ1 крыс OXYS, этот показатель достоверно не отличался от значений крыс Вистар, начиная со второго дня обучения (рис. 5.3А). Рис. 5.3. Влияние профилактического приема SkQ1 с возраста 1,5 до 3 месяцев на способность к обучению и память крыс OXYS и Вистар в восьмирукавном радиальном лабиринте. (А) Ошибка референтной памяти (%) и (Б) общее число входов в рукава. Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: * - между контрольными крысами Вистар и OXYS. При зависимых парных сравнениях, процент ошибки референтной памяти у контрольных крыс OXYS достоверно не различался ни по одному из десяти дней (p > 0.05), что указывает на значительные нарушения в способности к обучению и памяти. Тогда как у контрольных крыс Вистар и у принимавших SkQ1 крыс процент ошибки 138 достоверно снижался к 2-4 дням обучения. У крыс OXYS, принимавших SkQ1, процент ошибки референтной памяти также снижался уже к 2-4 дням обучения (p < 0.05). Общее число входов в рукава – показатель двигательной и исследовательской активности – было значительно меньше у крыс OXYS во все дни обучения (p < 0.05) Прием SkQ1 не влиял на этот показатель ни у крыс Вистар, ни у OXYS (p > 0.05, рис. 5.3Б). Таким образом, прием SkQ1 не влиял на способность к обучению молодых крыс Вистар и замедлил её снижение у крыс OXYS. Водный тест Морриса. В настоящей работе (см. раздел 3.1.) и ранее (Stefanova et al., 2010, 2011; автореф. канд. Стефанова, 2011) нами показано, что способность к обучению в водном лабиринте Морриса у 3-месячных крыс OXYS не отличается от таковой у крыс Вистар. Нарушения пространственной референтной памяти в данном тесте у крыс OXYS развиваются к возрасту 12 месяцев, а значительные нарушения формируются к возрасту 16-18 месяцев. Поэтому в рамках настоящего исследования способность к обучению крыс в водном тесте Морриса оценивали в возрасте 16 месяцев после 14,5 месяцев приема SkQ1. На рис. 5.4 представлены результаты исследования. Рис. 5.4. Влияние профилактического приема SkQ1 с возраста 1,5 до 16 месяцев на способность к обучению крыс OXYS и Вистар в водном тесте Морриса. Латентный период (ЛП) нахождения невидимой платформы крыс Вистар (А) и крыс OXYS (Б). Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: # - между контрольными крысами Вистар и OXYS. 139 Как показал анализ результатов, 16-месячные крысы OXYS обучались достоверно хуже, чем крысы Вистар (рис. 5.4А, Б). Но при этом только в первые три дня на нахождение невидимой платформы – показатель пространственной памяти – крысы OXYS затрачивали больше времени (p < 0.01, p < 0.02 и p < 0.004, соответственно), чем крысы Вистар, а на 4-й и 5-й день обучения они уже не отличались от крыс Вистар по данному показателю. Длительный прием SkQ1 не влиял на способность к обучению крыс Вистар, которая была у них на уровне 3-месячных животных (см. раздел 3.1). У крыс OXYS прием SkQ1 не влиял на способность к обучению, но следует отметить, что на фоне приема антиоксиданты латентный период нахождения невидимой платформы у этих животных достоверно не различался от показателя крыс Вистар (рис. 5.4А, Б). Таким образом, оценка профилактического приема SkQ1 показала способность антиоксиданта замедлять рост тревожности, снижение моторно-исследовательской активности с возрастом у крыс обеих линий. Важно, что прием SkQ1 не влиял на поведение молодых крыс Вистар. Кроме того, прием SkQ1 не влиял на когнитивные способности крыс Вистар, параметры которых в данных тестах были на уровне молодых животных. При этом SkQ1 существенно замедлил снижение с возрастом способности к обучению и памяти крыс OXYS, причиной которых становятся нейродегенеративные изменения мозга. В этой связи на следующем этапе работы была проведена оценка влияния SkQ1 на развитие деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS. 5.1.2. Влияние приема SkQ1 на развитие деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS Оценка влияния профилактического приема SkQ1 (с возраста 1,5 месяцев) на структурное состояние пирамидных нейронов гиппокампа крыс OXYS проведена в возрасте 4 месяцев. По данным светомикроскопического исследования в СА1 и СА3 полях гиппокампа и зубчатой извилине контрольных крыс OXYS присутствуют клетки с признаками очагового хроматолиза и гиперхромных нейронов без сморщивания (обратимо измененные нейроны), нейроны с признаками тотального хроматолиза и гиперхромные сморщенные (необратимо измененные) нейроны. Количественно удельное содержание неизмененных нейронов в СА1 и СА3 полях гиппокампа контрольных крыс OXYS меньше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; Табл. 5.1). Прием SkQ1 предупредил развитие деструктивных изменений нейронов в гиппокампе крыс OXYS. В 140 результате у принимавших SkQ1 крыс OXYS удельное содержание неизмененных нейронов в СА1 и СА3 полях гиппокампа было значительно больше, чем у контрольных крыс OXYS (p < 0.05; Табл. 5.1). Соответственно, удельное содержание обратимо измененных нейронов и необратимо измененных нейронов всех изучаемых регионов гиппокампа у принимавших SkQ1 крыс OXYS было меньше, чем у контрольных крыс OXYS и достоверно не отличалось от показателей крыс Вистар (p < 0.05; Табл. 5.1). Кроме того, морфометрический анализ средней площади тел и ядер нейронов СА1 и СА3 полей гиппокампа и зубчатой извилины контрольных крыс OXYS и Вистар и принимавших SkQ1 крыс OXYS показал, что уже в возрасте 4 месяцев у крыс OXYS средняя площадь тел и ядер нейронов поля СА1 была на 25% и 38%, соответственно, меньше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; рис. 5.5Б, В). Прием SkQ1 предупредил развитие деструктивных изменений нейронов в поле СА1: средняя площадь тел и ядер нейронов была значительно больше, чем у контрольных крыс OXYS (p < 0.05; рис. 5.5Б, В) и достоверно не отличалась от характерных для крыс Вистар значений. Таблица 5.1 Морфологическая характеристика пирамидных нейронов полей СА1, СА3 гиппокампа и зубчатой извилины крыс Вистар и OXYS и крыс OXYS, получавших SkQ1 с возраста 1,5 до 4 месяцев Вистар OXYS OXYS + SkQ1 Регион Нейроны, % (n=5) (n=5) (n=5) СА1 СА3 Зубчатая извилина Н 94,3±3,3 87,5±1,6# 96,3±0,3* ОИ 4,9±0,5 9,9±1,5# 3,2±0,3* НИ 0,8±0,1 2,6±0,4# 0,5±0,1* Н 92,1±1,1 84,6±0,8# 95,2±0,4* ОИ 6,5±1,1 11,2±0,8# 3,9±0,4* НИ 1,4±0,3 4,1±0,5# 0,9±0,2* Н 96,2±2,2 94,6±1,2 96,7±4,3 ОИ 3,0±0,2 4,2±0,2# 2,5±0,1* НИ 0,8±0,15 1,2±0,1# 0,8±0,1* Примечания: Н – неизмененные нейроны, ОИ – обратимо измененные нейроны, НИ – необратимо измененные нейроны. N=5, по три серийных среза с каждого образца. Различия достоверны: # - между контрольными крысами Вистар и OXYS, * - по сравнению с контрольными крысами OXYS (эффект препарата). 141 Рис. 5.5. Прием SkQ1 с возраста 1,5 до 4 месяцев замедлил деструктивные изменения пирамидных нейронов гиппокампа крыс OXYS. (А) Примеры пирамидных нейронов гиппокампа 4-месячных крыс Вистар и OXYS и принимавших SkQ1 крыс OXYS. Стрелкой указан гиперхромный несморщенный нейрон, звездочками - гиперхромные сморщенные нейроны, наконечником - нейрон с очаговым хроматолизом. Окраска крезиловым фиолетовым по Нисслю. Увеличение - об. 100, ок. 10. Средняя площадь (Б) тела и (В) ядра нейронов СА1 и СА3 полей гиппокампа и зубчатой извилины (ЗИ) 4-месячных крыс Вистар и OXYS и принимавших SkQ1 крыс OXYS. Данные представлены в процентах от крыс Вистар. Различия достоверны: # между крысами Вистар и OXYS, * - по сравнению с контрольными крысами OXYS (эффект препарата). Таким образом, прием SkQ1 с возраста 1,5 до 4 месяцев значительно замедлил развитие деструктивных изменений пирамидных нейронов гиппокампа крыс OXYS в критический период развития у них признаков БА. 5.1.3. Влияние приема SkQ1 на содержание соматотропного гормона и инсулиноподобного фактора роста-I в крови крыс Вистар и OXYS С возрастом изменяется уровень ряда гормонов, в том числе соматотропного гормона и его важнейшего эндокринного посредника инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), обеспечивающего практически все физиологические эффекты соматотропного гормона. Соматотропин оказывает модулирующее действие на некоторые функции ЦНС, являясь не только эндокринным гормоном, но и нейропептидом, принимающим участие в регуляции деятельности ЦНС. Изменения с возрастом функциональной активности медиаторных систем мозга способствуют снижению когнитивных функций и риску развития нейродегенеративных заболеваний. В этой связи, в рамках настоящей работы для оценки системных эффектов SkQ1 нами было проведено исследование влияния его приема с возраста 1,5 до 4 месяцев на содержание соматотропного гормона и IGF-1 в крови крыс OXYS и Вистар методами ИФА. Как показал ANOVA-анализ, уровень соматотропного гормона в сыворотке крови крыс OXYS в возрасте 4 месяцев был достоверно ниже, чем у крыс Вистар (F1,39 = 27.4, p <0.001; Таблица 5.2). Прием SkQ1 повлиял на содержание соматотропного гормона (F1,39 = 10.3, p < 0.0002), повысив его уровень и у крыс Вистар (p < 0.03), и у крыс OXYS (p < 0.008). Уровень IGF-1 не зависел от генотипа животных (F1,39 = 3.2, p = 0.08), однако сравнение групповых средних показало, что у крыс OXYS в возрасте 4 месяцев содержание IGF-1 было достоверно ниже, чем у крыс Вистар (p < 0.048; Таблица 5.2). Прием SkQ1 достоверно не повлиял на уровень IGF-1 в крови крыс Вистар и OXYS, можно лишь отметить, что у принимавших антиоксидант крыс OXYS, его уровень был несколько выше, чем у крыс контрольной группы. Таблица 5.2 Влияние приема SkQ1 с возраста 1,5 до 4 мес. на уровень соматотропного гормона и IGF-1 в сыворотке крови крыс OXYS и Вистар (n=10) Крысы Вистар Крысы OXYS контроль SkQ1 контроль SkQ1 Соматотропный гормон, нг/мл 8,7±0,6 10,9±0,6* 6,2±0,4# 8,2±0,6* IGF-1, нг/мл 548±26 528±11 472±23# 508±18 Примечание: данные представлены как mean ± SEM. # - достоверные различия между контрольными крысами OXYS и Вистар, * - достоверный эффект препарата. 143 Базовый уровень соматотропного гормона максимален в ранний постнатальный период, амплитуда пиков секреции максимальна в пубертатный период и прогрессивно снижается с возрастом. В этой связи мы провели дополнительное исследование изменения с возрастом содержания соматотропного гормона и IGF-1 в сыворотке крови 1-, 3- 19- и 23-месячных крыс Вистар и OXYS. Кроме того, для оценки эффектов SkQ1 при лечебном приеме мы провели исследование его влияния на уровень соматотропного гормона и IGF-1 в сыворотке крови крыс Вистар и OXYS, принимавших антиоксидант с возраста 19 до 23 месяцев (250 нмоль/кг массы тела животного). Анализ результатов показал, что у крыс Вистар и OXYS уровень соматотропного гормона (рис. 5.6А) максимален в возрасте 3 месяцев, а IGF-1 – в возрасте 1 месяца (рис. 5.6Б), при этом в возрасте 1 месяца их уровень у крыс Вистар и OXYS не различался. Рис. 5.6. Содержание (А) соматотропного гормона роста (СТГ) и (Б) IGF-1 в крови интактных крыс OXYS и Вистар в возрасте 1, 3, 19 и 23 месяцев и принимавших SkQ1 с возраста 19 до 23 месяцев крыс OXYS и Вистар. Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: * - между крысами Вистар и OXYS одного возраста, # достоверный эффект препарата. С возрастом уровень соматотропного гормона и IGF-1 закономерно снижался у крыс обеих линий, однако в возрасте 3, 19 и 23 месяцев их содержание у крыс OXYS было достоверно меньше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; рис.5.6). Прием SkQ1 с возраста 19 до 23 месяцев не только предупредил снижение с возрастом концентрации соматотропного гормона и IGF-1 в крови крыс Вистар и OXYS, но и повысил её до уровня более молодых животных (рис.5.6). 144 Таким образом, с возрастом уровень соматотропного гормона и IGF-1 в крови снижается у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами. Прием SkQ1 с возраста 1,5 до 4 месяцев предупредил снижение с возрастом уровня соматотропного гормона у крыс OXYS и не влиял на уровень IGF-1. У крыс Вистар антиоксидант увеличил содержание соматотропного гормона. Прием SkQ1 с возраста 19 до 23 месяцев не только предупредил снижение с возрастом содержания соматотропного гормона и IGF-1 в крови крыс Вистар и OXYS, но и повысил его до уровня более молодых животных. 5.1.4. Влияние приема SkQ1 на содержание AβPP и Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар Далее нами была проведена оценка способности SkQ1 при длительном приеме (с возраста 1,5 до 23 месяцев) замедлять усиленное накопление AβРР и Aβ 1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS при прогрессии у них признаков БА. По данным вестерн-блот анализа уровень AβPP в гиппокампе и префронтальной коре 23-месячных крыс OXYS был значительно выше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; рис.5.7А, Б). Длительный прием SkQ1 замедлил увеличение с возрастом содержания AβРР в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS (p < 0.05) до уровня контрольных крыс Вистар (рис.5.7А, Б) и статистически значимо не влиял на его уровень в мозге крыс Вистар. С помощью набора ELISA, специфичными антителами к Aβ1–42, методами ИФА было определено содержание растворимой фракции Aβ1-42 в мозге крыс OXYS и Вистар. Анализ результатов показал, что уровень Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре 23-месячных крыс OXYS был значительно выше, чем у крыс Вистар (F1,32 = 11.3, p < 0.002 и F1,32 = 7.6, p < 0.01, соответственно; рис.5.7В, Г). Прием SkQ1 с возраста 1,5 до 23 месяцев значительно замедлил накопление с возрастом Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс обеих линий (F1,40 = 11.5, p < 0.002 и F1,40 = 13.7, p < 0.001, соответственно). В результате уровень Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре принимавших SkQ1 крыс OXYS был том же уровне, что и у контрольных крыс Вистар (рис.5.7В, Г). 145 Рис. 5.7. Прием SkQ1 с возраста 1,5 до 23 месяцев замедлил накопление с возрастом AβРР и Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар. Уровень AβРР в гиппокампе (А) и префронтальной коре (Б) 23-месячных контрольных и получавших SkQ1 крыс OXYS и Вистар (n= 6) по данным вестерн-блот анализа. Уровень Aβ1-42 в гиппокампе (В) и префронтальной коре (Г) 23-месячных контрольных и получавших SkQ1 крыс OXYS и Вистар (n= 10) по данным ИФА. Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: # - между контрольными крысами Вистар и OXYS, * - по сравнению с крысами контрольной группы соответствующей линии (эффеки препарата). Таким образом, нами впервые показана способность SkQ1 при длительном профилактическом приеме существенно замедлять накопление с возрастом AβРР и Aβ142 в мозге крыс не только с нормальным, но и с ускоренным темпом старения и развитием характерных для БА признаков у крыс OXYS. 146 5.1.5. Влияние приема SkQ1 на содержание тау-белка и его фосфорилированной формы в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар Поскольку уровень тау-белка и его фосфорилированной формы повышен в мозге крыс OXYS (см. раздел 3.4), нами была проведена оценка способности SkQ1 при длительном приеме замедлять гиперфосфорилирование тау-белка в гиппокампе и префронтальной коре в период развития у крыс OXYS признаков БА. Для этого методом вестерн-блот анализа была проведена оценка уровня тау-белка и его фосфорилированной формы Т181 (фосфо-T181) в гиппокампе и префронтальной коре 23-месячных контрольных и принимавших SkQ1 крыс OXYS и Вистар. Как показал ANOVA-анализ уровень тау-белка в гиппокампе и префронтальной коре (рис.5.8) был значительно выше у крыс OXYS (F1,27 = 19.7, p < 0.001 и F1,27 = 19.8, p < 0.001, соответственно) и на него влиял фактор «препарат» (F1,27 = 9.4, p < 0.005 и F1,27 = 10.3, p < 0.004, соответственно). Уровень фосфо-T181 в гиппокампе и префронтальной коре был также значительно выше у крыс OXYS (F1,26 = 19, p < 0.001 и F1,26 = 18.8, p < 0.0002, соответственно) и на него влиял фактор «препарат» (F1,26 = 10.1, p < 0.004 и F1,26= 10.3, p < 0.004, соответственно). Прием SkQ1 с возраста 1,5 до 23 месяцев существенно замедлил повышение с возрастом уровня тау-белка и фосфо-T181 в гиппокампе (p < 0.01 и p < 0.008, соответственно) и префронтальной коре (p < 0.006 и p < 0.004, соответственно) крыс OXYS. В результате, уровень тау-белка и фосфо-T181 в гиппокампе и префронтальной коре принимавших SkQ1 крыс OXYS был на одном уровне, что и у контрольных крыс Вистар (рис.5.8). Прием SkQ1 не влиял на уровень тау-белка и фосфо-T181 в мозге крыс Вистар. Таким образом, длительный профилактический прием SkQ1 значительно замедлил усиленное фосфорилирование тау-белка в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS в период развития и прогрессии у них признаков БА. 147 Рис. 5.8. Прием SkQ1 с возраста 1,5 до 23 месяцев замедлил усиленное фосфорилирование тау-белка в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS. Уровень тау-белка и фосфо-Т181 в гиппокампе (A) и префронтальной коре (Б) 23месячных контрольных крыс Вистар и OXYS и принимавших SkQ1 крыс Вистар и крыс OXYS. Относительный уровень тау-белка и фосфо-Т181 (нормированы на уровень βактина) в гиппокампе (В, Д) и префронтальной коре (Г, Е) контрольных и принимавших SkQ1 крыс Вистар и OXYS. Данные представлены как mean±S.E.M. Различия достоверны: # - между контрольными крысами Вистар и OXYS, * - по сравнению с крысами контрольной группы соответствующей линии. 148 5.2. Исследование влияния SkQ1 на прогрессию признаков БА у крыс OXYS Для оценки лечебного потенциала митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 исследовали его способность замедлять или снижать выраженность признаков БА у крыс OXYS в период их активной прогрессии. Для этого крысы OXYS и Вистар (как контроль) (n=20-25) с возраста 12 до 18 месяцев получали ежедневно SkQ1 в дозе 250 нмоль/кг массы тела животных. 5.2.1. Влияние приема SkQ1 на поведение, способность к обучению и память крыс OXYS и Вистар Влияние SkQ1 на моторно-исследовательскую активность, тревожность, способность к обучению и память животных оценивали, начиная с возраста 17 месяцев. Использовали тесты «приподнятый крестообразный лабиринт», «открытое поле», «восьмирукавный радиальный лабиринт» и водный тест Морриса. Тест «приподнятый крестообразный лабиринт». Как показал ANOVA-анализ, наиболее демонстративные показатели тревожности в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» - количество выходов в открытые рукава и время, проведенное в них, - не зависело от генотипа (F1,88 = 1.3, p = 0.25 и F1,88 = 1.2, p = 0.28, соответственно) и препарата (F1,88 = 0.1, p = 0.8 и F1,88 = 0.5, p = 0.48, соответственно). Однако сравнение групповых средних свидетельствовало о более высоком уровне тревожности 17-месячных контрольных крыс OXYS: количество выходов в открытые рукава у них было вдвое меньше, чем у контрольных крыс Вистар (недостоверно), а время, проведенное в них, было более чем втрое меньше (p < 0.02; рис. 5.9А, Б). Прием SkQ1 не повлиял на количество выходов в открытые рукава и время, проведенное в них, у крыс Вистар, но у принимавших антиоксидант крыс OXYS, показатели были на уровне крыс Вистар. Количество заходов в закрытые рукава – показатель двигательной активности животных – не зависело от генотипа (F1,88 = 0.0й, p = 0.9) и препарата (F1,88 = 0.1, p = 0.9). При этом факторы взаимодействовали (F1,88 = 7.1, p = 0.009). Сравнение групповых средних показало, что у контрольных крыс OXYS количество заходов в закрытые рукава 149 было меньше, чем у крыс Вистар (p < 0.05). Только у принимавших SkQ1 крыс OXYS этот показатель был выше, чем у контрольных крыс OXYS (p < 0.05; рис. 5.9В). Время, проведенное в закрытых рукавах (рис. 5.9Г), не зависело от генотипа (F1,88 = 0.36, p = 0.54) и препарата (F1,88 = 1.2, p = 0.27). Рис. 5.9. Эффекты лечебного приема SkQ1 (с возраста 12 до 18 мес.) на поведение крыс OXYS и Вистар в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». Исследование поведения после 5 месяцев приема SkQ1. (А) Количество выходов в открытые рукава и (Б) время, проведенное в них, (В) количество заходов в закрытые рукава и (Г) время, проведенное в них. Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: # - между контрольными крысами Вистар и OXYS, * - по сравнению с контрольными крысами OXYS (значимый эффект препарата). Таким образом, анализ результатов поведения крыс OXYS и Вистар в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» не выявил существенного влияния SkQ1 на уровень тревожности 17-месячных животных. 150 Тест «открытое поле». ANOVA-анализ показал, что количество пересеченных квадратов (рис. 5.10А) – показатель двигательной активности животных – в возрасте 17 месяцев зависело от генотипа (F1,91 = 18, p < 0.0001), и было меньше у крыс OXYS. Вертикальная двигательная активность – количество вертикальных стоек (рис. 5.12Б) – отражает как двигательную, так и исследовательскую активность животных. Этот показатель был у крыс OXYS меньше, чем у Вистар (F1,91 = 44.5, p < 0.0001). Антиоксидант не влиял на двигательную (F1,91 = 0.2, p = 0.7) и вертикальную активность животных (F1,91 = 0.7, p = 0.4). Рис. 5.10. Эффекты лечебного приема SkQ1 (с возраста 12 до 18 мес.) на поведение крыс OXYS и Вистар в тесте «открытое поле». Исследование поведения после 5 месяцев приема SkQ1. (А) Количество пересеченных квадратов и (Б) вертикальных стоек. Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: # - между контрольными крысами Вистар и OXYS. Таким образом, анализ результатов поведения крыс OXYS и Вистар в тесте «открытое поле» показал отсутствие существенных эффектов SkQ1. Тест «восьмирукавный радиальный лабиринт». Состояние пространственной рабочей и референтной памяти оценивали, обучая крыс в восьмирукавном радиальном лабиринте в возрасте 17 месяцев после 5 месяцев приема SkQ1. Анализ результатов показал, что процент ошибки референтной памяти о местоположении целевого объекта (пищи), выраженный в отношении числа входов в неподкрепляемые рукава к общему числу посещенных рукавов в процентах, во все дни тестирования был больше у 17месячных крыс OXYS (p < 0.05; рис. 5.11А), что свидетельствует о снижении 151 способности к обучению и памяти. Прием SkQ1 не влиял на способность к обучению крыс OXYS и улучшил ее у крыс Вистар: у принимавших антиоксидант крыс Вистар процент ошибок референтной памяти во 2-4 и 8-10 дни был меньше, чем у контрольных крыс Вистар (p < 0.05; рис. 5.11А). Рис. 5.11. Влияние приема SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев на способность к обучению и память крыс OXYS и Вистар в восьмирукавном радиальном лабиринте. Исследование способности к обучению крыс проведено в возрасте 17 месяцев. (А) Ошибка референтной памяти (%) и (Б) общее число заходов в рукава крыс OXYS и Вистар в восьмирукавном радиальном лабиринте. Различия достоверны: # между контрольными крысами OXYS и Вистар, *- достоверный эффект препарата. При зависимых парных сравнениях процент ошибки референтной памяти у контрольных и принимавших SkQ1 крыс OXYS достоверно не различался ни по одному из десяти дней (p > 0.05), что указывает на значительные нарушения в формировании долговременной памяти. Действительно, при оценке эффективности профилактического приема SkQ1 (с 1,5 до 23 месяцев) мы показали, что способность к обучению в данном тесте у крыс OXYS снижена по сравнению с крысами Вистар уже в возрасте 3 месяцев (рис. 5.3). При этом прием SkQ1 замедлил её снижение у крыс OXYS и не повлиял на этот показатель у 3-месячных крыс Вистар. Важно, что в настоящем исследовании у 17-месячных контрольных крыс Вистар процент ошибки референтной памяти достоверно не изменялся за время обучения, тогда как у принимавших с возраста 12 месяцев SkQ1 крыс Вистар процент ошибки достоверно снижался уже к 2-4 дням обучения. 152 Общее число входов в рукава – показатель двигательной и исследовательской активности – было значительно меньше у крыс OXYS во все дни обучения (p < 0.05). Прием SkQ1 не влиял на этот показатель ни у крыс Вистар, ни OXYS (p > 0.05, рис. 5.11Б). Таким образом, прием SkQ1 не повлиял на способность к обучению 17-месячных крыс OXYS и замедлил её снижение у крыс Вистар. Водный тест Морриса. Способность к обучению и память крыс в водном тесте Морриса оценивали в возрасте 17,5 месяцев после 5,5 месяцев приема SkQ1. Анализ результатов показал, что латентный период нахождения невидимой платформы во время обучения был больше у крыс OXYS во все пять дней обучения (p < 0.05, рис. 5.12А). Прием SkQ1 не повлиял на способность к обучению крыс Вистар и улучшил её у крыс OXYS. Так, у принимавших SkQ1 крыс OXYS латентный период нахождения невидимой платформы был достоверно меньше на 3-й и 4-й день обучения. Проверка долговременной памяти (6-день обучения) показала, что крысы OXYS, принимавшие SkQ1, проводили значительно больше времени в секторе, в котором ранее в течение пяти последовательных дней находилась платформа (p < 0.05, рис. 5.12Б). У крыс Вистар, получавших SkQ1, этот показатель достоверно не изменился. Рис. 5.12. Влияние приема SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев на способность к обучению и память в водном тесте Морриса. Оценка влияния SkQ1 на (А) способность к обучению (латентный период нахождения невидимой платформы) и (Б) память (время, проведенное в секторе без платформы) крыс Вистар и OXYS в возрасте 17,5 месяцев. Различия достоверны: # - по сравнению с показателем крыс Вистар, * - по сравнению с контролем. 153 Полученные результаты свидетельствуют о том, что способность к обучению и память зависят не только от генотипа и возраста животных, но и от используемого для их оценки поведенческого теста. Выявленные нами различия в возрастных проявлениях нарушения способности к обучению в восьмирукавном радиальном лабиринте и водном тесте Морриса крыс OXYS и Вистар могут быть связаны с неодинаковой «жесткостью» тестов, поскольку, известно, что на процессы обучения и памяти влияют эмоциональный фон и тревожность. 5.2.2. Влияние приема SkQ1 на деструктивные изменения нейронов и плотность синапсов в гиппокампе крыс OXYS при прогрессии признаков БА Оценка влияния шестимесячного приема SkQ1 на структурно-функциональное состояние нейронов и синапсов гиппокампа крыс OXYS проведена в возрасте 18 месяцев. Эффекты SkQ1 на структурно-функциональное состояние пирамидных нейронов гиппокампа крыс OXYS. Светомикроскопическое исследование выявило значительные нарушения структурной организации пирамидных нейронов полей СА1 и СА3 гиппокампа и зубчатой извилины у 18-месячных крыс OXYS. Морфологически эти нарушения характеризовались набуханием нейронов, очаговым и тотальным хроматолизом, гомогенизацией ядра и цитоплазмы, распадом ядра и ядрышка, выявлялись клетки-тени, гиперхромные несморщенные и сморщенные клетки. Количественная оценка показала, что удельное содержание неизмененных нейронов полей СА1, СА3 и зубчатой извилины гиппокампа крыс OXYS в возрасте 18 месяцев было меньше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; табл. 5.3). Содержание необратимо измененных нейронов (нейроны с признаками тотального хроматолиза и гиперхромные сморщенные нейроны), напротив, было значительно больше у крыс OXYS во всех регионах гиппокампа (p < 0.05; табл. 5.3). Доля обратимо измененных нейронов гиперхромных нейронов без сморщивания и нейронов с признаками очагового хроматолиза - также больше у крыс OXYS (p < 0.05; табл. 5.3). Прием SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев замедлил прогрессирование с возрастом деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS (рис. 5.13В). Количественно удельное содержание имеющих признаки деструкции нейронов всех изучаемых регионов гиппокампа крыс 154 OXYS, принимавших SkQ1, было значительно меньше, чем у крыс OXYS контрольной группы (p < 0.05; табл. 5.3), и не отличалось от показателей крыс Вистар. Таблица 5.3 Влияние приема SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев на деструктивные изменения пирамидных нейронов полей СА1, СА3 гиппокампа и зубчатой извилины крыс OXYS Вистар OXYS OXYS + SkQ1 Регион Нейроны, % (n=5) (n=5) (n=5) СА1 СА3 Зубчатая извилина Н 80,4±1,6 64,1±1,7# 85,8±0,7* ОИ 10,1±0,8 19,6±0,9# 8,3±0,6* НИ 9,5±1,0 16,4±0,9# 5,9±0,4* Н 80,2±1,9 70,6±1,4# 84,4±0,8* ОИ 11,1±1,1 15,6±0,5# 8,9±0,6* НИ 8,6±0,9 13,9±1,2# 6,8±0,4* Н 82,3±1,1 72,6±2,0# 80,9±0,6* ОИ 10,5±0,9 16,8±1,6# 12,8±0,8 НИ 7,2±0,2 10,6±0,7# 6,3±0,6* Примечания: Н – неизмененные нейроны, ОИ – обратимо измененные нейроны, НИ – необратимо измененные нейроны. N=5, по три серийных среза с каждого образца. Различия достоверны: # - между контрольными крысами Вистар и OXYS, * - по сравнению с крысами контрольной группы соответствующей линии. Рис. 5.13. Прием SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев замедлил прогрессирование деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS. Примеры состояния нейронов СА1 поля гиппокампа крыс Вистар (А), контрольных крыс OXYS (Б) и принимавших SkQ1 крыс OXYS (В). Стрелками указаны деструктивные нейроны. Окраска крезиловым фиолетовым по Нисслю. Увеличение - об. 100, ок. 10. 155 Соответственно, удельное содержание неизменных нейронов во всех регионах гиппокампа крыс OXYS, принимавших SkQ1, было на уровне крыс Вистар и больше, чем у контрольных крыс OXYS (p < 0.05; табл. 5.3, рис. 5.13Б). На рис. 5.13В приведены иллюстрации состояния нейронов СА1 поля гиппокампа крыс обеих линий и принимавших SkQ1 крыс OXYS. Кроме того, была проведена количественная оценка средней площади тел и ядер пирамидных нейронов поля СА1, СА3 гиппокампа и зубчатой извилины контрольных крыс OXYS и Вистар и принимавших SkQ1 крыс OXYS. Как показали результаты, средняя площадь тел и ядер нейронов поля СА1 у 18-месячных контрольных крыс OXYS была на 8% и 15%, соответственно, меньше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; рис. 5.14). Также обнаружено, что площадь тел нейронов поля СА3 была на 24% меньше у контрольных крыс OXYS (p < 0.05) по сравнению с крысами Вистар. Прием SkQ1 увеличил площадь тел нейронов в поле СА3 и зубчатой извилине гиппокампа крыс OXYS (p < 0.05; рис. 5.14А). Кроме того, у принимавших SkQ1 крыс OXYS площадь ядра СА1 и СА3 полей была больше, чем у контрольных крыс OXYS (p < 0.05; рис. 5.14Б). Рис. 5.14. Прием SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев замедлил деструктивные изменения пирамидных нейронов гиппокампа крыс OXYS. Средняя площадь (А) тела и (Б) ядра нейронов СА1 и СА3 полей гиппокампа и зубчатой извилины (ЗИ) 18месячных крыс Вистар и OXYS и принимавших SkQ1 крыс OXYS. Данные представлены в процентах от крыс Вистар. Различия достоверны: # - между крысами Вистар и OXYS, * - по сравнению с контрольными крысами OXYS (эффект препарата). 156 Далее мы провели оценку влияния приема SkQ1 на состояние ультраструктуры пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа крыс OXYS. В возрасте 18 месяцев у контрольных крыс OXYS выявлены значительные изменения структурной организации органелл клетки по сравнению с крысами Вистар. Оболочка ядер многих нейронов образует глубокие складки, в некоторых участках она становится размытой и нечеткой, увеличивается число ядерных пор, наблюдается отек ядерной мембраны. В некоторых клетках встречается гипертрофия ядрышек, увеличение в них гранулярного компонента, при этом ядрышки могут находиться на периферии ядра, у его оболочки. В комплексе Гольджи наблдюдаются расширение и фрагментация цистерн. Во многих нейронах присутствуют многочисленные вакуоли, фаголизосомы различных размеров и формы. Выявлены значительные изменения структурной организации митохондриального аппарата. В цитоплазме митохондрии имеют светлый обводненный матрикс и округлую форму – признаки, указывающие на их набухание, часто выявляются митохондрии с частичной фрагментацией крист (рис. 5.15Д). Выявляются участки гранулярного эндоплазматического ретикулума с расширенными цистернами, лишенными свободных единичных рибосом и полисом, что создает типичную картину тотального хроматолиза. В цитоплазме некоторых нейронов определяются участки скопления гранул липофусцина (рис. 5.15Б). Прием SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев существенно замедлил прогрессию деструктивных изменений нейронов. В результате, у получавших SkQ1 крыс OXYS отмечено значительное улучшение ультраструктуры ядра, структурной организации комплекса Гольджи, митохондриального аппарата (рис. 5.15В, Е). Цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума приобретают характерную для нормы правильную параллельную ориентацию. Морфометрический анализ пирамидных нейронов СА1 региона гиппокампа 18месячных крыс OXYS показал, что удельная площадь митохондрий у крыс OXYS снижена втрое, эндоплазматического ретикулума – в 2,5 раза, удельная площадь лизосом больше в 1,4 раза, вакуолей - вдвое по сравнению с показателями крыс Вистар (p < 0.05). Удельная площадь комплекса Гольджи у крыс OXYS больше, чем у крыс Вистар (p < 0.05; табл. 5.4). 157 Рис. 5.15. Прием SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев замедлил деструктивные изменения пирамидных нейронов гиппокампа крыс OXYS. Пирамидные нейроны гиппокампа крыс Вистар (А, Г), контрольных крыс OXYS (Б, Д) и принимавших SkQ1 крыс OXYS (В, Е) в возрасте 18 месяцев (n=4). Высокое содержание липофусциновых гранул (стрелки) (Б), усложнение формы ядра с инвагинацией ядерной оболочки (стрелка), митохондрии (м) с признаками набухания и частичной фрагментацией крист (Д) в цитоплазме нейронов поля СА1 гиппокампа контрольных крыс OXYS. Масштаб – 0.2 µm для А-В и 1.4 µm для Г-Е. Таблица 5.4 Влияние приема SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев на удельную площадь органелл в цитоплазме пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа крыс OXYS Линия Митохонд- Лизосомы Комплекс г-ЭПР Вакуоли рии (%) (%) Гольджи (%) Вистар 10,3±0,16 8,3±0,19 1,05±0,04 27,4±0,51 3,97±0,34 OXYS 3,1±0,1# 11,9±0,39# 1,20±0,04# 11,2±0,33# 8,23±0,4# OXYS+SkQ1 7,8±0,16* 9,4±0,25* 1,08±0,05 18,1±0,42* 6,81±0,38* (%) (%) Примечание: г-ЭПР - гранулярный эндоплазматический ретикулум; # - достоверные межлинейные различия, * - достоверный эффект препарата. МТ – мелатонин. 158 Прием SkQ1 замедлил снижение удельной площади митохондрий и гранулярного эндоплазматического ретикулума (p < 0.05; табл. 5.4). В результате, у крыс OXYS, принимавших SkQ1, удельная площадь митохондрий была в 2,5 раза больше, чем у крыс OXYS контрольной группы (p < 0.05; табл. 5.4). Кроме того, удельная площадь лизосом и вакуолей у принимавших SkQ1 крыс OXYS была меньше, чем у контрольных крыс OXYS. Таким образом, прием SkQ1 существенно замедлил развитие деструктивных изменений нейронов в гиппокампе крыс OXYS в период активной прогрессии у них признаков БА. Эффекты SkQ1 на структурно-функциональное состояние синапсов гиппокампа крыс OXYS. При развитии БА наиболее уязвимым регионом гиппокампа – ключевой структуры мозга, участвующей в механизмах консолидации памяти – становится поле СА1 (Brun and Englund, 1981; Wright et al., 2013). В настоящей работе оценка структурно-функционального состояния пирамидных нейронов гиппокампа крыс OXYS при развитии и прогрессии у них признаков БА также выявила более значительные деструктивные изменения поля СА1 (см. раздел 3.3). Поэтому оценку влияния приема SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев на структурно-функциональное состояние синапсов проводили, анализируя на первом этапе работы синаптоархитектонику поля СА1 гиппокампа контрольных крыс OXYS и Вистар и крыс OXYS, принимавших антиоксидант. Электронномикроскопическое исследование показало, что у крыс обеих линий в синаптической популяции преобладали простые неперфорированные аксошипиковые и аксодендритные синапсы (рис. 5.16). Преобладали ассиметричные, функционально зрелые, синапсы. Морфометрический анализ показал, что общая численная плотность аксонных терминалей была на 36% ниже у контрольных крыс OXYS (p < 0.05) по сравнению с показателем крыс Вистар (Табл. 5.5). При этом доля ассиметричных синапсов была на 42% меньше у крыс OXYS (p < 0.05), а количество среди них высокоактивных синаптических контактов в стадии экзоцитоза (положительно искривленные) – в 2,6 раза меньше (p < 0.05). О снижении уровня секреции медиаторов свидетельствует уменьшение общего числа активных зон синаптического контакта у крыс OXYS (p < 0.05; Табл. 5.5). При этом увеличение у крыс OXYS доли крупных 159 активных зон (p < 0.05) может отражать процессы пластических перестроек, направленных на компенсацию регрессивных изменений синаптических связей. Рис. 5.16. Прием SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев улучшил состояние ультраструктуры синаптических терминалей гиппокампа крыс OXYS. Типичныый нейропиль поля СА1 крыс Вистар (А, Б), контрольных крыс OXYS (В, Г) и принимавших SkQ1 крыс OXYS (Д, Е) в возрасте 18 месяцев (n=4). Ассиметричные синапсы (стрелки) в поле СА1 крыс Вистар (Б) и принимавших SkQ1 крыс OXYS (Е). Аксодендритный синапс контрольной крысы OXYS (Г); в дендрите видны очень крупные митохондрии. Масштаб – 2 µm. 160 В отличие от крыс Вистар и крыс OXYS, принимавших SkQ1, у контрольных крыс OXYS существенно чаще встречались синаптические терминали, измененные по светлому типу деструкции, с характерным просветлением и набуханием цитоплазмы, деструкцией синаптических пузырьков, увеличением количества различных вакуолей, набуханием и разрушением митохондрий, а также с переходом в практически пустую полость и разрушением терминали – для необратимо измененных. Морфометрический анализ показал, что у крыс OXYS, принимавших SkQ1, численная плотность синапсов была на 17% больше, чем у крыс OXYS контрольной группы (недостоверно). Однако количество функционально зрелых - ассиметричных синапсов - у принимавших SkQ1 крыс OXYS было на 42% больше, чем у контроля (p < 0.05; табл. 5.5). Таблица 5.5 Влияние приема SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев на численную плотность межнейронных синапсов поля СА1 гиппокампа крыс OXYS Ассиметричные синапсы (на 100 мкм2) Крысы Численная Симметричные плотность синапсы Всего Плоские + иск - иск (на 100 мкм2) (на 100 мкм2) Вистар 9.16±0.47 1.28±0.23 7.88±0.45 2.44±0.33 4.50±0.35 0.93±0.19 OXYS 5.82±0.44# 1.29±0.18 4.53±0.46# 1.98±0.31 1.74±0.26# 0.81±0.20 OXYS, 6.83±0.42 0.39±0.11* 6.44±0.43* 2.87±0.35 3.22±0.30* 0.35±0.11* SkQ1 Примечание: + иск и – иск – положительно и отрицательно искривленные синапсы; # достоверные межлинейные различия, * - статистически значимый эффект препарата. Кроме того, анализ результатов показал, что у принимавших SkQ1 крыс OXYS доля ассиметричных синапсов составила 94% от общего количества синапсов, у контрольных крыс OXYS - 78%, а у крыс Вистар - 86%. Среди ассиметричных синапсов доля положительно искривленных (в стадии экзоцитоза) синапсов у принимавших SkQ1 крыс OXYS была на 85% больше, чем у контрольных крыс OXYS (p < 0.05). За счет этого значительно увеличилось число активных зон синаптического контакта (p < 0.05; табл. 5.6), преимущественно, за счет популяции мелких контактов (200-300 нм, p < 0.05) как механизма пластической реорганизации синапсов (Семченко и др., 2014). 161 По сравнению с крысами Вистар и крысами OXYS, принимавшими SkQ1, общая картина состояния ультраструктуры синаптических терминалей гиппокампа крыс OXYS контрольной группы характеризовалась снижением общего числа синаптических везикул, а также признаками их дезорганизации: скоплением всех пузырьков у пресинаптической мембраны или группированиями вблизи от нее (рис. 5.17). Таблица 5.6 Активные зоны синаптического контакта поля СА1 гиппокампа контрольных крыс Вистар и OXYS и принимавших SkQ1 крыс OXYS Крысы Число АЗК < 200-300 нм, % 300-500 нм, % 500-700 нм, % > 700 нм, % Вистар 9.54±0.44 16.7±2.54 58.4±3.28 17.9±2.37 7.0±2.90 OXYS 6.02±0.40# 9.4±3.05 54.1±4.45 30.7±4.69# 5.8±1.97 8.50±0.37* 20.6±2.98* 56.6±4.20 20.6±3.40 2.1±0.83 OXYS, SkQ1 Примечание: АЗК – активные зоны контакта; # - достоверные межлинейные различия, * - статистически значимый эффект препарата. Рис. 5.17. Прием SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев улучшил состояние ультраструктуры синаптических терминалей гиппокампа крыс OXYS. Примеры ультраструктуры пре- и постсинаптических терминалей поля СА1 крыс Вистар, контрольных крыс OXYS и принимавших SkQ1 крыс OXYS в возрасте 18 месяцев (n=4). Масштаб – 1 µm. Нередко встречались синаптические терминали с выраженными деструктивными изменениями - появлением в пресинаптическом отростке лизосом и липидных включений в сочетании с гранулярным и фибриллярным материалом. У принимавших SkQ1 крыс OXYS результатом реорганизации синаптических устройств в гиппокампе 162 стало увеличение числа синаптических пузырьков, стыкованных с пресинаптической мембраной и исчезновением «размытости» их контура. Синаптические пузырьки приобретали обычную для них округлую или овальную форму (рис. 5.17). Выводы морфометрических оценок состояния синапсов были подтверждены результатами оценки влияния SkQ1 на содержание белков-маркеров пре- и постсинаптической плотности: синапсина I, участвующего в регуляции процесса выброса нейромедиаторов в синапсах, и PSD-95 - основного белка постсинаптического уплотнения в гиппокампе. По данным вестерн-блот анализа, уровень обоих белков в гиппокампе и префронтальной коре 18-месячных контрольных крыс OXYS был значительно ниже (p < 0.05), чем у крыс Вистар (рис. 5.18). Длительный прием SkQ1 значительно повысил уровень синапсина I в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS (p < 0.05; рис. 5.18В-Е), также как и уровень. PSD-95 в обеих структурах мозга (p < 0.05; рис. 5.18А,Б,Д,Е). В результате, уровень обоих белков в гиппокампе и префронтальной коре принимавших SkQ1 крыс OXYS статистически значимо не отличался от уровня синапсина I и PSD-95 в обеих структурах мозга крыс Вистар. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга 18-месячных крыс OXYS и Вистар антителами к синапсину I и PSD-95 подтвердило результаты вестерн-блот анализа. Как видно на рис. 5.18И, сигналы синапсина I и PSD-95 детектируются в гиппокампе крыс обеих линий, однако по сравнению с крысами Вистар у контрольных крыс OXYS сигналы обоих белков значительно слабее. У принимавших SkQ1 крыс OXYS интенсивность сигналов синапсина I и PSD-95 значительно выше, чем у крыс OXYS контрольной группы (рис. 5.18И). Таким образом, прием SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев существенно замедлил структурно-функциональные изменения межнейронных синапсов крыс OXYS в период активной прогрессии у них признаков БА. Можно полагать, что прием SkQ1 обеспечил не только сохранность существующих функциональных систем и снизил вероятность дальнейшего формирования патологических нейронных сетей, но и способствовал формированию новых функционально-активных нейронных отношений. 163 Рис. 5.18. Прием SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев повысил уровень пре-и постсинаптческих белков в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS. Уровень PSD-95 (А, Б, Д) и синапсина I (В, Г, Е) в гиппокампе и префронтальной коре 18-месячных крыс Вистар, контрольных крыс OXYS и принимавших SkQ1 крыс OXYS по данным вестерн-блот анализа. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга контрольных крыс Вистар и OXYS и принимавших SkQ1 крыс OXYS (И), антителами к синапсину I (красный) и PSD-95 (зеленый). Ядра окрашены DAPI (синий). Син I - синапсин I. Масштаб – 5 мкм. Данные представлены как mean ± SEM. Различия достоверны: # - между линиями одного возраста, * - эффект препарата. 164 5.2.3 Влияние приема SkQ1 на содержание Aβ1-40 и Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар В настоящем эксперименте исследовалось влияние SkQ1 на содержание Аβ в мозге крыс OXYS в период его активного накопления в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга животных и прогрессии других признаков БА: с возраста 12 до 18 месяцев. Содержание Аβ1-40 и Аβ1-42 в гиппокампе и коре головного мозга контрольных и получавших антиоксидант крыс OXYS и Вистар исследовали в возрасте 18 месяцев методами ИФА. Как показал ANOVA-анализ (табл. 5.7), содержание Аβ1-40 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар не зависело от генотипа (F1,30 = 3.4, p = 0.08 и F1,30 = 2.1, p = 0.16, соответственно) и препарата в префронтальной коре (F1,30 = 0.5, p = 0.48). При этом содержание Аβ1-40 в гиппокампе зависело от препарата (F1,30 = 6.2, p = 0.02) и взаимодействия факторов (F1,30 = 4.7, p = 0.04). Действительно, как показало сравнение групповых средних, прием SkQ1 не влиял на содержание Аβ1-40 в гиппокампе крыс Вистар и снизил его у крыс OXYS до уровня контрольных крыс Вистар (табл. 5.7). Таблица 5.7 Влияние приема SkQ1 с возраста 12 до 18 мес. на содержание Aβ1-42 и Aβ1-40 в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга крыс OXYS и Вистар Линия крыс Вистар OXYS Гиппокамп (n=6-8) Фронтальная кора (n=6-8) Воздействие Aβ1-40 (пг/мг) Aβ1-42 (пг/мг) Aβ1-40 (пг/мг) Aβ1-42 (пг/мг) контроль 43,8±1,9 94,8±5,3 64±2,9 123,8±7,4 SkQ1 43,2±1,6 76,4±5,0# 69,3±2,6 101,4±5,3# контроль 51,7±2,4* 147±9,3* 77±2,7* 172±13,9* SkQ1 42,5±2,0# 111±5,4# 66,6±5,1 142,9±7,5 Примечание: данные представлены как mean ± SEM. * - достоверные различия между контрольными крысами OXYS и Вистар, # - достоверный эффект препарата. Содержание Аβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS было больше (F1,30 = 48.0, p < 0.001 и F1,30 = 25.9, p < 0.0001, соответственно) и на него влиял фактор «препарат» (F1,30 = 18.8, p < 0.0003 и F1,30 = 8.5, p < 0.007, соответственно). Сравнение групповых средних показало, что у крыс Вистар, принимавших SkQ1, содержание Аβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре было меньше, чем у крыс контрольной группы (p < 0.05). У крыс OXYS прием SkQ1 также снизил содержание 165 Аβ1-42 в гиппокампе (p < 0.005) и префронтальной коре, но в последней - на уровне тенденции (p = 0,082). Результаты ИФА были подтверждены методами иммуногистохимии: интенсивность сигнала специфичными антителами к Aβ1–42 в гиппокампе принимавших SkQ1 18-месячных крыс OXYS и Вистар была значительна ниже, чем у контрольных крыс соответствующей линии (рис. 5.19). Рис. 5.19. Прием SkQ1 с возраста 12 до 18 мес. снизил содержание Aβ1–42 в гиппокампе крыс OXYS и Вистар. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга контрольных и принимавших SkQ1 крыс OXYS и Вистар специфичными антителами к Aβ1–42 (красный). Ядра окрашены DAPI (синий). Масштаб: 20 μm. Таким образом, прием SkQ1, начатый в возрасте 12 месяцев, снизил содержание Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга 18-месячных крыс OXYS и Вистар. 166 Заключение к Главе 5 Сходство механизмов ускоренного старения мозга крыс OXYS с патогенезом БА подтвердили результаты исследования влияния на них митохондриального антиоксиданта SkQ1: доказана связь его нейропротекторных эффектов со способностью предупреждать и/или задерживать развитие ключевых признаков БА. При оценке профилактической эффективности SkQ1 (прием с возраста 1,5 до 4 месяцев) выявлена способность антиоксиданта замедлять рост тревожности, снижение моторно- исследовательской активности и способность к обучению крыс OXYS в критический период их развития, и, что важно, не влиять на эти параметры молодых крыс Вистар. Впервые нами выявлена эффективность SkQ1 существенно замедлять развитие деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS. Кроме того, оценка системных эффектов SkQ1 выявила его способность предупреждать снижение уровня соматотропного гормона, участвующего, в том числе, в регуляции деятельности ЦНС, и уровня IGF-1, важнейшего эндокринного посредника соматотропного гормона, в крови крыс OXYS в критический период их развития. Следует отметить, что при оценке влияния SkQ1 на уровень соматотропного гормона и IGF-1 в крови крыс OXYS в период усиленной прогрессии у них признаков БА (прием с возраста 19 до 23 месяцев) обнаружено, что SkQ1 не только предупредил снижение их уровня с возрастом у крыс OXYS и Вистар, но и повысил их содержание до уровня более молодых животных. Также нами показано, что прием SkQ1 (с возраста 1,5 до 13-16 месяцев) замедлил рост тревожности и снижение моторно-исследовательской активности, снижение когнитивных способностей с возрастом у крыс обеих линий. Более того, длительный прием SkQ1 (с возраста 1,5 до 23 месяцев) существенно замедлил накопление с возрастом AРР и Aβ1-42 в гиппокампе и коре не только крыс Вистар, но и крыс OXYS в период усиленной прогрессии у них признаков БА. Также у крыс OXYS прием SkQ1 замедлил усиленное фосфорилирование тау-белка в гиппокампе и префронтальной коре с возрастом. При оценке влияния лечебного приема SkQ1 (с возраста 12 до 18 месяцев) на поведение не обнаружено существенных эффектов антиоксиданта на уровень тревожности и моторно-исследовательскую активность крыс OXYS, но выявлена его способность замедлять снижение когнитивных способностей и прогрессию ключевых признаков БА: структурно-функциональных изменений нейронов и синапсов, снижать содержание Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга. 167 Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Усиленные исследования патогенеза БА в последние 20 лет значительно расширили представления распространенного в мире о молекулярно-генетических нейродегенеративного механизмах заболевания. В самого ходе этих исследований было предложено несколько гипотез этиологии и патогенеза БА, доминирующей среди них стала гипотеза «амилоидного каскада», основанная на исследованиях генетических форм БА (Busciglio et al., 2002) и выявленных нейротоксических эффектах Aβ42 (Selkoe, 2001) как центрального события в каскаде патологических процессов. Однако в последние годы растет число убедительных аргументов в пользу того, что гипотеза «амилоидного каскада» оправдана, скорее всего, только для НФБА, на заболеваемость которой приходится лишь около 5 % случаев. Недавние исследования свидетельствуют о том, что накопление токсических форм Aβ и тау-белка при развитии СФБА может быть опосредовано синаптическими процессами (Shinohara et al., 2014; Spires-Jones and Hyman, 2014). Как наиболее вероятный инициирующий фактор развития БА сегодня рассматривается митохондриальная дисфункция (Swerdlow, 2014). Однако вопрос о ключевом факторе риска БА остается не ясным. Ответ на него, как и разработка основанных на знании патогенеза заболевания эффективных способов профилактики и лечения БА, невозможны без проведения фундаментальных исследований на адекватных биологических моделях. Настоящее исследование выполнено на уникальной линии крыс OXYS генетической модели преждевременного старения. Его проявлениями становятся развитие уже в молодом возрасте комплекса ассоциированных со старением заболеваний и ускоренное старение мозга (Kolosova et al., 2009; Колосова и др., 2014). Комплексное развитие этих признаков предполагает общие молекулярно-генетические основы. Действительно, методом QTL-анализа нами были выявлены локусы, ассоциированные с развитием у крыс OXYS катаракты, ретинопатии и нарушения поведения, которые оказались обогащёнными генами, связанными с нейродегенерацией, в том числе – с метаболическим путем БА (Korbolina et al., 2012). Об общности механизмов развития нейродегенеративных процессов в мозге и в сетчатке указывает и тот факт, что развитие у крыс OXYS ретинопатии, аналогичной возрастной макулярной дегенерации у людей, сопряжено с накоплением в сетчатке пептида Aβ - одного из 168 ключевых маркеров БА (Kozhevnikova et al., 2013b). Эти данные и полученные нами ранее доказательства способностей у связи крыс нарушений OXYS с поведения и снижения зарегистрированными когнитивных методами МРТ нейродегенеративными изменениями в мозге (Колосова и др., 2011; Стефанова, Автореферат канд.), легли в основу настоящего исследования, основной целью которого явилось изучение механизмов ускоренного старения мозга крыс OXYS и его возможной связи с патогенезом БА. Опираясь на классические представления о патогенезе БА, а также на литературу последних лет, мы сопоставили динамику развития у крыс OXYS изменений в когнитивной и эмоциональной сфере с состоянием ключевых признаков БА: повышением уровня АРР, накоплением токсических форм Aβ, образованием амилоидных бляшек, гиперфосфорилированием тау-белка, митохондриальной дисфункцией, синаптической недостаточностью и гибелью нейронов. Общность механизмов ускоренного старения мозга крыс OXYS с патогенезом БА подтвердило исследование влияния на развитие и прогрессию признаков заболевания у крыс OXYS митохондриального антиоксиданта SkQ1, терапевтическая эффективность которого как нейропротектора была впервые доказана нами ранее (Stefanova et al., 2010) и подтверждена в настоящей работе. 6.1. Анализ связи механизмов ускоренного старения мозга крыс OXYS с патогенезом БА Снижение когнитивных функций разной степени, изменение эмоционального состояния - неизбежные проявления старения, возраст манифестации и масштабы которых существенно различаются (Jaszberenyi et al., 2012; Tanisawa et al., 2013). Сходство выраженности нарушений когнитивных функций у больных БА на ранних стадиях заболевания с обычными для старения умеренными когнитивными расстройствами (de Calignon et al., 2012) в значительной степени осложняет своевременную постановку диагноза. Прогрессивное ухудшение памяти, интеллекта по мере развития БА приводит к полному распаду личности в течение всего нескольких последующих лет. Как показали результаты настоящего исследования, поведение молодых крыс OXYS сходно с поведением старых крыс Вистар. В возрасте 4 месяцев для крыс OXYS характерны пассивный тип поведения, повышенная тревожность, 169 снижение способности к обучению и памяти, которые с возрастом значительно усиливаются. При этом в возрасте 1 месяца межлинейные различия в моторноисследовательской активности и уровне тревожности крыс Вистар и OXYS отсутствовали. Эти результаты полностью подтвердили полученные нами ранее данные (Kolosova et al., 2009; Stefanova et al., 2010; Стефанова, Автореферат канд.) и стали свидетельством устойчивого проявления у крыс OXYS фенотипических признаков ускоренного старения мозга. В настоящей работе впервые показано, что их формирование у крыс OXYS (возраст 3-5 месяцев) по времени совпадает с развитием признаков БА: структурно-функциональных изменений нейронов и синапсов, митохондриальной дисфункции и гиперфосфорилирования тау-белка. Нарастающие с возрастом изменения поведения и когнитивных функций у крыс OXYS (возраст 12-18 месяцев) происходят на фоне прогрессирующих структурно-функциональных изменений нейронов и синапсов, гибели нейронов и снижения плотности синапсов, митохондриальной дисфункции, гиперфосфорилирования тау-белка, гиперпродукции АРР, усиленного накопления токсических форм Aβ и образования амилоидных бляшек в мозге. Снижение нейрональной пластичности и прогрессивная гибель нейронов мозга – характерные проявления БА (Brun and Englund, 1981). Гиппокамп, участвующий в механизмах обучения и консолидации памяти, становится одной из первых структур головного мозга, которая поражается БА (Mu and Gage, 2011). При анализе возрастных изменений популяции нейронов в СА1 и СА3 полях гиппокампа и зубчатой извилины крыс Вистар и OXYS выявлено прогрессирующее снижение её плотности с возрастом у крыс OXYS (Stefanova et al., 2014b). При этом обнаружено, что в возрасте 5 месяцев плотность нейронов во всех исследуемых регионах была выше у крыс OXYS, что очевидно, продукцией обусловлено незрелых компенсаторно-восстановительными нейронов. Нарушение процессов процессами нейрогенеза либо может способствовать впоследствии повышенной уязвимости нейронов к патологическим изменениям при БА (Jin et al., 2004; Song et al., 2011). В пользу этого свидетельствуют результаты морфологической оценки состояния пирамидных нейронов гиппокампа крыс Вистар и OXYS. Значительные изменения в структурной организации нейронов гиппокампа 4-месячных крыс OXYS в первую очередь затрагивают поле СА1 (Максимова и др., 2014а; Stefanova et al., 2014b, 2015a) как наиболее уязвимый регион 170 гиппокампа при развитии характерных для БА нейродегенеративных процессов (Brun and Englund, 1981; Wright et al., 2013). Первые признаки деструктивных изменений пирамидных нейронов в этом возрасте обнаружены и в префронтальной коре крыс OXYS. Преобладание сморщивания среди функционально измененных клеток гиперхромных нейронов может быть интерпретировано как без «реактивное заторможенное состояние нейрона». Кроме того, увеличение количества нейронов с признаками очагового хроматолиза и гиперхромии, можно полагать, становится результатом длительного раздражения и функционального напряжения нейронов и их истощения. О наличии деструктивных изменений нейронов поля СА1 крыс OXYS в этот возрастной период свидетельствует и снижение средней площади их тел и ядер (Максимова и др., 2014а). С возрастом эти изменения усиливаются и у 18-месячных крыс OXYS средняя площадь тел и ядер нейронов поля СА1, СА3 гиппокампа и зубчатой извилины значительно меньше, чем у крыс Вистар. Более того, количество деструктивно измененных нейронов во всех регионах гиппокампа старых крыс OXYS почти вдвое, а в префронтальной коре - на 41% выше, чем у крыс Вистар. На развитие нейродегенеративных процессов указывают и выявленные нами прогрессирующие с возрастом изменения структурной организации клеточных органелл в поле СА1 гиппокампа крыс OXYS (Максимова и др., 2014а). Так, наблюдаемые в нейронах тесные контакты митохондрий с ядром и органеллами могут отражать их повышенную потребность в энергии в связи с усиленным функционированием. При этом наряду с деструктивными изменениями, в нейронах наблюдаются отчетливо выраженные адаптивные и компенсаторные процессы: увеличение складчатости оболочки ядра и числа ядерных пор, гипертрофия ядрышек, смещение их на периферию ядра. Кроме того, увеличение у крыс OXYS относительной доли лизосом можно рассматривать как проявление усиленной аутофагии - критического регулятора процессов старения (Juhasz et al., 2007; Hansen et al., 2008), направленного на удаление повреждённых мембран и органелл. Снижение плотности синапсов, нарушения транссинаптической передачи характерные признаки БА - неизбежно приводят к прогрессии нейродегенеративных процессов и снижению межнейронных связей (de Calignon et al., 2012). Развитие у крыс OXYS признаков начальной стадии БА происходит на фоне повышения плотности синапсов в гиппокампе (поле СА1; Максимова и др., 2014б), обусловленного, прежде 171 всего, увеличением доли функционально незрелых (симметричных) синапсов, которое мы рассматриваем как компенсаторную реакцию в условиях развития нейродегенеративных процессов. При этом у крыс OXYS происходит реорганизация межнейронных взаимоотношений, наблюдаются признаки гиперактивного функционального состояния синапсов: увеличены доля синаптических контактов в фазе экзоцитоза (положительно искривленные), количество перфорированных и высокоактивных гипертрофированных контактов, в том числе доля наиболее активных зон синаптических контактов (среднего размера), снижена более чем вдвое плотность отрицательно искривленных контактов, которые характерны для синапсов в состоянии торможения. В то же время в нейронах гиппокампа крыс OXYS выявляются признаки деструктивных изменений синапсов: терминали, измененные по светлому типу, для которых характерно просветление и набухание цитоплазмы, изменение размеров и формы синаптических пузырьков, их дезорганизация в пресинаптических терминалях. Важно, что уже в этом возрасте наблюдаются признаки нарушения аксонного транспорта: увеличение размеров митохондрий и их скопление и агрегация с транспортными везикулами, появление различных вакуолей в терминалях. Прогрессия признаков БА у крыс OXYS к возрасту 18 месяцев сопровождается значительными изменениями синаптоархитектоники поля СА1 и снижением плотности синапсов за счет уменьшения почти вдвое доли функционально зрелых (ассиметричных) синапсов, что свидетельствует о нарушениях эффективности передачи сигнала. На это указывает и снижение с возрастом количества активных зон синаптического контакта. В целом можно заключить, что характер прогрессирующих с возрастом структурнофункциональных изменений нейронов и синапсов в мозге крыс OXYS свидетельствует о нарушениях нейрональной пластичности. В пользу такого заключения свидетельствуют и результаты анализа изменений транскриптома префронтальной коры. Выясняя природу развития признаков БА у крыс OXYS, мы исследовали транскриптом префронтальной коры в возрасте 5 и 18 месяцев, в период активной манифестации и усиленной прогрессии признаков, методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq на платформе Illumina). Анализ результатов показал, что в возрасте 5 месяцев в префронтальной коре крыс OXYS изменен уровень мРНК более 900 генов, а в 18 месяцев - уже более 2000 генов по сравнению с одновозрастными крысами Вистар (Стефанова и др., 2015). Их основная часть и в 5, и в 18 месяцев связана 172 с изменениями экспрессии генов, продукты которых участвуют в процессах нейрональной пластичности, иммунной системы и апоптоза, ассоциированы с фосфорилированием белков, гипоксией, Са2+ гомеостазом. Уровень мРНК генов из функциональных категорий «синапс», «синаптическая трансмиссия», «аксоногенез», «регуляция синаптической пластичности» в префронтальной коре крыс OXYS в возрасте 5 месяцев был снижен, а в возрасте 18 месяцев – повышен. Прогрессирующее снижение уровня синапсина I, участвующего в регуляции процесса выброса нейромедиаторов в синапсах, и PSD-95, важного звена в регуляции синаптической пластичности, в мозге больных БА рассматриваются как маркерные события (Gylys et al., 2004; Scheff et al., 2014). Как показали наши результаты, уровень мРНК Dlg4, кодирующего PSD-95, и Syn1, кодирующего синапсин I, не различался между крысами Вистар и OXYS в возрасте 5 месяцев. С возрастом уровень мРНК генов Dlg4 и Syn1 у крыс OXYS увеличивался и был выше по сравнению с показателями 18-месячных крыс Вистар. Однако уровень белковых продуктов этих генов - PSD-95 и синапсина I - в префронтальной коре 4-месячных крыс OXYS и Вистар не различался, а в гиппокампе крыс OXYS уже был снижен. С возрастом уровень пре- и постсинаптических белков закономерно снижался в мозге крыс обеих линий, но у крыс OXYS - ускоренными темпами. В результате у 18-месячных крыс OXYS уровень PSD-95 и синапсина I был ниже в обеих структурах мозга (Stefanova et al., 2015а). С возрастом у крыс OXYS изменяется экспрессия более 5500 генов, у крыс Вистар – только 499 генов (Стефанова и др., 2015). Большинство из них связано с фосфорилированием, активностью протеинкиназ, нейрогенезом, синаптической пластичностью и иммунной системой. Несмотря на то, что эти гены принадлежат к одним и тем же категориям генных онтологий и представляют общие метаболические пути, только 335 из них оказались общими для крыс Вистар и OXYS. Важно, что у крыс Вистар в 18 месяцев уровень мРНК многих генов становился таким, каким он был у крыс OXYS в возрасте 5 месяцев, что подтверждает феномен ускоренного старения последних. Уровень мРНК более 120 генов из функциональных категорий «нейрон», «развитие нейрона» и «регуляция нейрогенеза» в префронтальной коре крыс OXYS изменялся с возрастом. Важную роль в развитии мозга играют протеогликаны гепарансульфаты и гепарансульфатпротеогликаны (Bernfield et al., 1999). 173 Гепарансульфаты участвуют в модулировании синаптической пластичности (Maeda et al., 2011), влияют на формирование структур мозга и его размеры (Jen et al., 2009). Экспрессия гепарансульфатпротеогликанов динамично регулируется различными физиологическими стимулами, в том числе - нейрональной активностью. Нами установлено, что окончание формирования мозга крыс OXYS в ранний постнатальный период происходит на фоне изменения состава и содержания протеогликанов (Rykova et al., 2011). Также обнаружено, что становление и окончание формирования мозга (оно завершается к возрасту 20 дней) крыс OXYS происходит на фоне значительного повышения, по сравнению с крысами Вистар, экспрессии генов ферментов синтеза (Ext1 и Ext2) и деградации (Hpse - гепараназы) протеогликанов (Шевелев и др., 2012). С возрастом их уровень в мозге крыс OXYS и Вистар закономерно снижался и межлинейные различия нивелировались. Анализ результатов исследования транскриптома не выявил межлинейных различий в уровне мРНК генов Ext1, Ext2, а также их лигандов Extl1 и Extl2 в возрасте 5 месяцев в префронтальной коре мозга. К возрасту 18 месяцев уровень мРНК гена Extl2 снизился у крыс обеих линий, а уровень мРНК генов Ext1, Ext2 и Extl1 напротив, повысился, но только у крыс OXYS. При этом и в 5, и в 18 месяцев в коре мозга крыс OXYS практически вдвое был снижен уровень мРНК гена Hpse, фермента деградации гепарансульфатов. В литературе неоднократно сообщалось как об усилении, так и о снижении нейрогенеза в головном мозге трансгенных животных – моделей БА (Yu et al., 2009; Perry et al., 2012). светомикроскопическом Можно уровне предположить, повышенная что плотность выявленная пирамидных нами на нейронов гиппокампа крыс OXYS в возрасте 5 месяцев (Stefanova et al., 2015a) отражает механизм, направленный на регенерацию поврежденных нейрональных структур, образование и дифференциацию новых нейронов взамен погибших или поврежденных нейронов. Косвенным подтверждением этого могут служить результаты исследования транскриптома коры мозга крыс OXYS: уровень мРНК гена BDNF, важнейшего регулятора процессов нейрогенеза, повышен в возрасте 5 месяцев. Отсутствие межлинейных различий по уровню его белкового продукта в гиппокампе 20-дневных крыс, повышение его уровня к возрасту 3 месяцев и прогрессивное снижение с возрастом также являются подтверждением обнаруженного нами усиления нейрогенеза в критический период манифестации признаков ускоренного старения мозга крыс OXYS 174 (Rudnitskaya et al., 2015а). Ограниченность потенциала регенерации поврежденных нейрональных структур обусловлена, очевидно, несколькими возможными причинами (Rapoport et al., 2002; Jin et al., 2004; Song et al., 2011). Во-первых, процессы пролиферации и дифференциации новых нейронов могут протекать медленнее, чем это необходимо для замены погибших и поврежденных нейронов. Во-вторых, новые нейроны могут оказаться нефункциональными, т.е. новообразованные нейроны не дифференцируются до зрелых нейронов и, соответственно, не способны интегрироваться в существующие нейрональные сети и образовывать новые. В-третьих, микроокружение в мозге больных БА может быть токсичным для новых нейронов. Можно полагать, с этими факторами непосредственно связано развитие у крыс OXYS к возрасту 5 месяцев деструктивных изменений нейронов, их прогрессия и гибель с возрастом на фоне гиперфосфорилирования тау-белка, митохондриальной дисфункции и усиленного накопления токсических форм Aβ. Прогрессия с возрастом признаков БА у крыс OXYS, как и у людей с этим заболеванием, происходит на фоне изменения в коре мозга метаболического пути БА – экспрессии 85 генов, связанных с процессингом АРР, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий, синаптическими процессами. На рис. 6.1 представлены обобщенные результаты функционального анализа (согласно базам данных DAVID, KEGG pathway и Wikipathways) этих генов в коре крыс OXYS. Как видим, прогрессия у крыс OXYS признаков БА происходит на фоне, связанного с процессингом бета-амилоида, повышения экспрессии генов β- и γ-секретаз (Bace1, Psen2) и Арр. Принципиально важно, что повышение уровня АРР, усиленное накопление токсических форм Aβ и образование амилоидных бляшек в мозге к возрасту 12 месяцев (Stefanova et al., 2014a,b; Колосова и др., 2014), а по последним данным – уже к 7 месяцам (Stefanova et al., 2015a), по времени происходит позже, чем выявленные нами в настоящей работе (Максимова и др., 2014а,б; Stefanova et al., 2011, 2014a,b, 2015a,b) и ранее (Stefanova et al., 2010; Колосова и др., 2011) нейродегенеративные изменения и снижение когнитивных функций у крыс OXYS. На некоторых моделях БА также показано, что накопление Aβ в мозге по времени происходит позже, чем выявляются первые признаки нарушения поведения (Van Dam et al., 2003; Capetillo-Zarate et al., 2006; Rijal Upadhaya et al., 2012) и деструктивных изменений нейронов и их гибели (Wright et al., 2013). 175 Рис. 6.1. Обобщение анализа результатов 85 дифференциально экспрессирующихся генов в префронтальной коре крыс OXYS вовлеченных в путь БА, согласно базам данных DAVID, KEGG pathway и Wikipathways. 176 Физиологическая роль Aβ в ЦНС достаточно хорошо изучена (Parihar et al., 2010; Stanga et al., 2010). Aβ участвует в регуляции транспорта холестерина, модуляции активности ионных каналов, активации киназ, синаптической пластичности, регуляции транскрипции ассоциированных с БА генов. Согласно современным представлениям, патологическое накопление Aβ, очевидно, обусловлено не столько гиперпродукцией АРР, сколько дисбалансом между продукцией и клиренсом Aβ (Mawuenyega et al., 2010). Как показали результаты нашего исследования, усиленное накопление с возрастом Aβ в мозге крыс OXYS наряду с повышением уровня мРНК Арр и содержания АРР, вероятно, связано с нарушением процессов деградации (рис. 4.5). Косвенно на это указывают изменения экспрессии генов, участвующих в процессах деградации (Mme) и агрегации Aβ (Lpl, Lrp1). Снижение уровня неприлизина – мембранной металлоэндопептидазы (ММЕ) – фермента, кодируемого ММЕ, становится причиной накопления Aβ в мозге (Iwata et al., 2001; Kanemitsu et al., 2003). Как показали результаты исследования транскриптома, уровень мРНК гена Mme в префронтальной коре мозга крыс OXYS и Вистар не различался между линиями в возрасте 5 месяцев и снижался в 1,6 раза с возрастом у крыс OXYS. При этом анализ динамики развития у крыс OXYS характерных для БА признаков (рис. 6.2) показал, что содержание Aβ в их гиппокампе с возраста 3 до 23 месяцев увеличивается втрое (Stefanova et al., 2015a). Принципиально важно, что анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) не выявил (Stefanova et al., 2015a) в геноме крыс OXYS мутаций, обнаруженных при развитии аутосомно-доминатной формы БА: в генах APP, PSEN1 и PSEN2 (Krstic and Knuesel, 2013). Для этого анализа было отобрано 35 генов, мутации в которых, по последним данным полногеномного анализа ассоциаций (Genome-wide association studies, GWAS), связаны с риском развития как НФБА, так и СФБА: APOE, PICALM, BIN1, CD33, CD2AP, CLU, CR1, EPHA1, ABCA7 и гены кластера MS4A (Kamboh et al., 2012; Shi et al., 2012; Tan et al., 2013). Продукты этих генов участвуют в метаболизме холестерина, связаны с иммунной системой и синаптическими процессами. Из выбранного нами списка генов у крыс OXYS были обнаружены (Stefanova et al., 2015a) только три несинонимичные SNPs в генах Casp3 (1) и Sorl1 (2), участвующих в регуляции продукции Aβ (Jarero-Basulto et al., 2013; Yin et al., 2014). Таким образом, отсутствие в геноме характерных для ранней формы заболевания мутаций в генах App, 177 Psen1 и Psen2 наряду со спонтанным развитием у крыс OXYS ключевых признаков БА позволяет рассматривать эту линию как перспективную модель СФБА. БА - комплексное полигенное возраст-зависимое заболевание и его развитие, как правило, сопряжено с развитием других связанных со старением заболеваний, в том числе - возрастной макулярной дегенерации: нейродегенеративного заболевания сетчатки, которое становится основной причиной потери зрения людьми пожилого возраста в мире (Kaarniranta et al., 2011). Накапливается все больше свидетельств того, что в основе их развития лежат общие метаболические пути (Dasari et al., 2011; Chiu et al., 2012). Действительно, методом QTL-анализа у крыс OXYS нами были выявлены локусы, ассоциированные с развитием у них катаракты, ретинопатии и нарушения поведения (Korbolina et al., 2012), что предполагает общие молекулярно-генетические основы. Возрастная макулярная дегенерация характеризуется накоплением внеклеточных отложений, т.н. друз, в которых Aβ является ключевым компонентом. Эти отложения приводят к дисфункции гематоретинального барьера, атрофии клеток ретинального пигментного эпителия и последующей дегенерации сетчатки. Мы показали, что динамика накопления Aβ1-42 в мозге крыс OXYS по времени совпадает с его накоплением в сетчатке: увеличение уровня Aβ1-42 обнаружено у животных с тяжелыми стадиями ретинопатии с ярко выраженными нейродегенеративными изменениями в сетчатке на фоне прогрессирующей гибели фоторецепторов (Kozhevnikova et al., 2013b). Исследование с помощью целевого олигонуклеотидного ДНК-микрочипа выявило различия между крысами Вистар и OXYS в уровнях мРНК генов Picalm и Apba2, продукты которых связаны с процессингом АРР (Kozhevnikova et al., 2013b). PICALM (phosphatidylinositol clathrin assembly lymphoid–myeloid leukemia) играет ключевую роль в клатрин-опосредованном эндоцитозе. Поэтому как избыточная, так и недостаточная экспрессия PICALM приводит к нарушению процессов эндоцитоза (Baig et al., 2010). APBA1, APBA2 и APBA3 кодируют белки семейства APBA – нейрональные адаптерные белки, которые непосредственно взаимодействуют с АРР и участвуют в его стабилизации и ингибировании продукции протеолитических фрагментов (Saito et al. 2008). Как показали наши результаты, уровень мРНК генов Picalm, Apba1, Apba2 и Apba3 в префронтальной коре не различался между крысами Вистар и OXYS в возрасте 5 месяцев. С возрастом у крыс OXYS уровень мРНК гена Picalm снижался, а Apba1, Apba2 и Apba3, напротив, повышался, в результате 178 выявлялись различия между 18-месячными крысами Вистар и OXYS в уровнях мРНК этих генов (кроме гена Apba3). Рис. 6.2. Динамика прогрессии с возрастом признаков БА у крыс OXYS. Данные представлены в процентах от 20-дневных или 3-месячных крыс OXYS. (A) Популяция пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа крыс OXYS с возраста 20 дней до 12 месяцев снижается на 47%. Уровень фосфорилированной формы тау-белка (Т181) в гиппокампе крыс OXYS с возраста 3 до 23 месяцев увеличился на 102%, а Aβ1-42 - на 333%. (Б) Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга 18-месячных крыс OXYS и Вистар специфичными антителами к тау-белку (зеленый) и фосфорилированной форме тау белка, Т181 (красный). Ядра окрашены DAPI (синий). Стрелками указана колоколизация тау и Т181 в префронтальной коре крыс Вистар и OXYS. Наконечником указана агрегация Т181 в коре крыс OXYS. Масштаб - 20 μm. (В) Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга 3-, 12- и 23-месячных крыс OXYS и Вистар специфичными антителами к Aβ1–42 (красный). Ядра окрашены DAPI (синий). Усиленное накопление Aβ1–42 с возрастом в гиппокампе крыс OXYS. Масштаб 20 μm. (Г) Примеры пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа крыс Вистар без изменений и крыс OXYS с признаками деструктивных изменений нейронов. Окраска крезиловым фиолетовым (По Максимова и др., 2014а; Stefanova et al., 2014b, 2015a). 179 Не менее важным, чем накопление Aβ, признаком развития БА у крыс OXYS становятся повышение уровня тау-белка и его усиленное фосфорилирование (Stefanova et al., 2014a,b, 2015a). Патофизиологическая роль гиперфосфорилированного тау-белка при развитии БА по-прежнему остается недостаточно изученной (Kumar and Walter, 2011). По мнению одних авторов, нейротоксическое действие тау-белка опосредовано Aβ, который стимулирует его к усиленному фосфорилированию и, соответственно, образованию нейрофибриллярных клубков через активацию киназ Cdk5 и GSK3b (Lee et al., 2000; Hernandez and Avila, 2008; Spires-Jones et al., 2009), а также путем активации каспазы 3, каспазы 9 и кальпаина (Chung et al., 2001; Cho and Johnson, 2004). Эти результаты послужили нейротоксических основанием эффектов Aβ. считать тау-белок важным медиатором По мнению других авторов, патологическое накопление Aβ приводит к дисфункции митохондрий и чрезмерной продукции АФК, которые, в свою очередь, стимулируют фосфорилирование тау-белка (Morley et al., 2012). Мы показали, что в мозге крыс OXYS гиперфосфорилирование тау-белка по времени значительно опережает повышение уровня АРР и накопление токсических форм Aβ (Stefanova et al., 2014a,b, 2015a). Уже в возрасте 3 месяцев уровень тау-белка и его фосфорилированной формы в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS выше, чем у крыс Вистар. С возрастом уровень фосфорилированной формы тау-белка (Т181) растет у крыс обеих линий, но у крыс OXYS - ускоренными темпами. На рис. 6.2 видно, что за период с возраста 3 до 23 месяцев его уровень в гиппокампе крыс OXYS увеличился вдвое (Stefanova et al., 2014b). Также мы показали, что при прогрессии признаков БА у крыс OXYS усиление фосфорилирования тау-белка в префронтальной коре происходит на фоне снижения уровня мРНК гена Gsk3b и повышения уровня мРНК генов Cdk5, Casp9 и Capn1 (рис. 4.5, Табл. 4.5), которое могло быть следствием активации токсическими формами Aβ нейродегенеративных процессов. Непосредственная физиологическая роль тау-белка - обеспечение стабильности микротрубочек (Biernat et al., 1993), участие в транспорте клеточных органелл и везикул (Probst et al., 2000), регуляции роста аксонов и дендритов (Dawson et al., 2001). При развитии патологических процессов усиленное фосфорилирование тау-белка, агрегация нерастворимых форм гиперфосфорилированного тау-белка, подобно олигомерам Aβ пептида, приводит к структурному нарушению микротрубочек и их дезорганизации (Lu 180 and Wood, 1993), развитию транспортного коллапса, блокаде транспортных путей в нейроне, и, в конечном счете, гибели клетки (Khlistunova et al., 2006). Манифестация фенотипических признаков ускоренного старения мозга крыс OXYS происходит на фоне выявленных нами методами МРТ в гиппокампе очагов демиелинизации - разрушения или нарушения формирования миелиновых оболочек нервных волокон, количество которых резко увеличивается с возрастом (Колосова и др., 2011; Стефанова, Автореферат канд.). Убедительным подтверждением этих результатов стали выявленные нами в настоящей работе уже в возрасте 4 месяцев признаки ультраструктурных нарушений миелиновых волокон аксонов в гиппокампе крыс OXYS. Нарастающие с возрастом ярко выраженные признаки структурных изменений микротрубочек и их дезорганизация, скопление в аксонах органелл, гигантских митохондрий (Stefanova et al., 2015b) указывают на нарушения аксонального транспорта в гиппокампе крыс OXYS (Kanaan et al., 2011; Shahpasand et al., 2012), которые в значительной мере могли быть следствием гиперфосфорилирования тау-белка (Stefanova et al., 2014a,b; 2015а). В условиях нарушения энергетического метаболизма (Iijima-Ando et al., 2012), хронического воспаления и клеточного стресса (Krstic et al., 2012) фосфорилирование тау-белка может ещё больше усиливаться и приводить к блокированию транспорта в аксонах, нарушению целостности, беспрепятственному выходу токсических форм Aβ (Shemesh et al., 2008) и, в конечном счете, гибели нейронов (Xiao et al., 2011). Параллельно с патологическими процессами внутри нейронов в мозге при БА развивается системное воспаление, которое вызывает пролиферацию клеток микроглии и астроцитов (Krstic et al., 2012). Недавно мы показали, что прогрессия признаков БА у крыс OXYS сопровождается увеличением плотности глиальных клеток в регионах СА1 и СА3 гиппокампа и зубчатой извилине (Stefanova et al., 2015b). Изменения в префронтальной коре крыс OXYS экспрессии генов, участвующих в глиогенезе, также свидетельствует в пользу усиления пролиферации глиальных клеток с возрастом. При этом принципиально важно, что в гиппокампе 18-месячных крыс OXYS (Stefanova et al., 2015b) были обнаружены признаки деструктивных изменений в астроцитах, олигодендроцитах и клетках микроглии: низкая электронная плотность гиалоплазмы, крупные митохондрии с частичной или полной деструкцией крист, многочисленные вакуоли, мембранные комплексы, а также включения липофусцина. Такие результаты 181 могут свидетельствовать о том, что на фоне хронической активации пролиферации глии происходят деструктивные изменения ее клеток, указывающие на потерю клетками глии нейропротекторных функций. Они согласуются с данными о том, что нейродегенеративные изменения при БА являются результатом связанного со старением постепенно прогрессирующего снижения функций врожденного иммунитета ЦНС и потери нейропротекторных свойств микроглии, т. е. протекают на фоне её деструктивных изменений (Streit et al., 2009, 2012). Характерные для старения изменения структуры клеток микроглии отражают утрату ею регуляторных функций, связанных с миграцией, клиренсом и, в конечном счете, выживанием нейронов. Предполагается, что системный иммунный дисбаланс может создавать определенный метаболический фон для развития и прогрессии многих проявлений преждевременного старения крыс OXYS, включая признаки БА. Состояние, которое отражают отличия профиля экспрессии генов иммунной системы как в префронтальной коре, так и в сетчатке (Kozhevnikova et al., 2013a) крыс OXYS от крыс Вистар, можно охарактеризовать как неполноценное воспаление. Манифестация первых признаков БА, как и других проявлений преждевременного старения, происходит у крыс OXYS в период завершения полового созревания и начала инволюции тимуса (Obukhova et al., 2009; Обухова и др., 2013). При этом ускоренная инволюция тимуса крыс OXYS, очевидно, становится причиной снижения активности Т-клеточного звена иммунной системы (Markova et al., 2003) на фоне глубоких изменений функционального состояния гемопоэтических стволовых клеток (Орловская и др., 2007). В комплексе с результатами анализа транскриптома это позволяет рассматривать ускоренное иммуностарение как одну из вероятных причин преждевременного старения крыс OXYS, механизмы которого еще предстоит изучить. Как один из ключевых факторов, инициирующих развитие БА, рассматривается дисфункция митохондрий (Bishop et. al., 2010). Данные о том, что накопление окислительных повреждений мтДНК – типичное проявление старения и развития связанных с ним нейродегенеративных заболеваний, в том числе БА, являются убедительным аргументом в пользу гипотезы «митохондриальной дисфункции» (Swerdlow et al., 2004). Согласно этой гипотезе снижение синтеза АТФ и окислительный стресс приводят к чрезмерной продукции Aβ, который в свою очередь, может напрямую оказывать токсическое действие на митохондрии, усугубляя нейродегенеративные 182 процессы. Следствием митохондриальной дисфункции становится подавление энергоемких процессов в нейронах, повреждение свободными радикалами мембранных структур клеток, нейровоспаление, нарушение синаптической пластичности и, в конечном счете, гибель нейронов (Sierra et al., 2007; Kilbride et al., 2008). Нарастающие с возрастом дисфункции митохондрий впервые были выявлены в печени крыс OXYS и рассматриваются в качестве одной из возможных причин их преждевременного старения (Шабалина и др., 1995; Колосова и др., 2001). В дальнейшем структурнофункциональные нарушения митохондрий были обнаружены в мышцах, сетчатке (Шабалина И.Г. и др., 1995; Колосова и др., 2001; 2014; Saprunova et al., 2012; Vays et al., 2014), а в настоящей работе – и в гиппокампе (Stefanova et al., 2015a,b). Они проявляются как деструкция крист, лизис матрикса, снижение объемной и поверхностной плотности митохондрий, которые выявляются уже у 3-4-месячных крыс OXYS и с возрастом нарастают. Мы показали, что эти изменения происходят на фоне прогрессирующего с возрастом снижения удельной площади митохондрий в нейронах гиппокампа крыс OXYS. При этом, как отмечалось выше, уже у молодых крыс OXYS в синаптических терминалях гиппокампа наблюдается накопление очень крупных или с деструктивными изменениями (набухание и разрушение) митохондрий. Как показал анализ транскриптома префронтальной коры крыс OXYS и Вистар, уровень мРНК генов из функциональных категорий «дыхательная цепь митохондрий» и «митохондрия» в возрасте 5 месяцев не различался, а в возрасте 18 месяцев эти категории были представлены более чем 100 дифференциально экспрессирующимися генами. Количество дифференциально экспрессирующихся генов из функциональной категории «ответ на окислительный стресс» было незначительным в возрасте 5 и 18 месяцев. Такие результаты укладываются в современные представления о том, что окислительный стресс не столько причина, сколько следствие старения. Изменения активности АФК-зависимых сигнальных путей вносят более существенный вклад в снижение функциональных возможностей организма и развитие патологических процессов, чем накопление окислительных повреждений макромолекул. Ранее при оценке маркеров окислительного стресса – уровня окислительных повреждений белков и липидов в гомогенатах мозга молодых крыс OXYS – отличий от контрольных крыс Вистар не было выявлено (Kolosova et al., 2006). В то же время дифференциальная оценка активности свободнорадикальных процессов в различных 183 структурах мозга по уровню продуктов ПОЛ показала, что в гиппокампе 2- и 18месячных крыс OXYS она выше, чем у крыс Вистар (Kolosova et al., 2003). Активация процессов ПОЛ приводит к нарушению структурной организации липидного бислоя мембран и дальнейшему нарушению важнейших клеточных функций (Aragno et. al., 2006; Shibata et. al., 2006), росту внутриклеточной концентрации ионов кальция (Nilius et al., 2001; Smith and Pilati, 2002), активации протеолитических ферментов, вызывающих деградацию белков цитоскелета (Mattson et al., 2000). В пользу активации этих процессов в мозге крыс OXYS свидетельствует то, что в числе генов с измененной экспрессией в их префронтальной коре широко представлены категории, связанные с сигнальными путями (Табл. 4.4), изменения которых ассоциированы с БА (Winkler and Fox, 2013). Так, с возрастом в префронтальной коре крыс OXYS изменяется экспрессия 46 генов из сигнального пути Wnt, одной из функций которого является регуляция уровня свободного кальция в цитоплазме. Такие изменения могут приводить к нарушению регуляции экспрессии генов Ca2+-связывающих белков, следствием которого становится нарушение кальциевого гомеостаза. Примечательно, что, как и у больных БА, у крыс OXYS с возрастом изменяется экспрессия генов, ассоциированных с другими нейродегенеративными заболеваниями: болезнью Хантингтона, болезнью Паркинсона и боковым амиотрофическим склерозом (рис. 6.1). Подавляющее большинство из них связаны с комплексами дыхательной цепи митохондрий, нарушение регуляции которых приводит к нарушению баланса между поглощением субстратов окисления, их превращением в АТФ и контролем генерации АФК и, как следствие, развитию нейродегенеративных процессов. Полученные нами результаты укладываются в современные представления об общности механизмов нейродегенеративных заболеваний, в основе которых лежат нарушения функций митохондрий. Среди 47 общих генов, изменение экспрессии которых с возрастом в префронтальной коре крыс OXYS ассоциировано с нейродегенеративными заболеваниями основная часть генов связана с изменением уровня мРНК комплексов I и IV дыхательной цепи митохондрий, при этом для подавляющего большинства дифференциально экспрессирующихся у крыс OXYS и Вистар генов было характерно повышение уровня мРНК. Однако непосредственное исследование функциональной активности фермента комплекса IV дыхательной цепи митохондрий цитохром с оксидазы, снижение которой 184 рассматривается как один из ключевых показателей нарушения функциональной активности митохондрий в мозге при БА, выявило её снижение в гиппокампе крыс OXYS уже в возрасте 20 дней. При этом с возрастом активность фермента цитохром с оксидазы в гиппокампе крыс OXYS так и оставалась на низком уровне, в префронтальной коре - снижалась постепенно, но уже в возрасте 4 месяцев её активность была ниже, чем у крыс Вистар. Такие результаты могут свидетельствовать о том, что, во-первых, дисфункция митохондрий становится, очевидно, одним из наиболее ранних событий при развитии признаков БА, во-вторых, развитие этих признаков, очевидно, инициируется в гиппокампе раньше, чем в префронтальной коре. На развитие ранних нарушений функций митохондрий указывает и выявленное нами недавно значительное накопление делеций мтДНК в гиппокампе крыс OXYS в ранний постнатальный период (Лощенова и др., 2015). Накопление делеций мтДНК рассматривается как одна из причин снижения эффективности окислительного фосфорилирования при старении и развитии связанных с ним нейродегенеративных заболеваний, в т.ч. болезни Паркинсона (Zhang et al., 2002) и БА (Krishnan et al., 2012). В свою очередь снижение эффективности работы дыхательной цепи приводит к усиленному накоплению окислительных повреждений мтДНК и делеций в результате окислительного стресса. При оценке уровня делетированной мтДНК в гиппокампе крыс OXYS и Вистар разного возраста установлено, что у крыс OXYS её уровень повышен, по сравнению с крысами Вистар, наиболее существенно - в период завершения формирования мозга в постнатальный период и остается повышенным как на стадиях, предшествующих развитию признаков БА, так и в период их прогрессии (Лощенова и др., 2015). Примечательно, что уровень делетированной мтДНК был максимальным в возрасте 10 дней - в период адаптации к условиям внеутробной жизни. У человека он длится 28 дней после рождения, у крыс — 14 дней. В этот период в головном мозге млекопитающих происходит ряд процессов (пролиферация, дифференцировка, миграция и др.), определяющих окончательное созревание нервной системы. После рождения во многих регионах мозга, включая гиппокамп, продолжаются развитие и гистогенез, связанный с формированием межнейронных контактов и устранением «переходных» клеточных популяций путем апоптоза (Kim and Sun, 2011). Высокая активность апоптоза, а по последним данным и нейрогенеза, предполагает усиление генерации АФК (Walton et al., 2012). Именно в этом возрасте уровень делетированной 185 мтДНК в гиппокампе крыс OXYS был наиболее существенно (в 3,5 раза) выше, чем у крыс Вистар, что косвенно указывает на то, что развитие мозга крыс OXYS в ранний постнатальный период протекает на фоне усиленного окислительного стресса. Возможно, он связан с гипоксией, обусловленной задержкой формирования микроциркуляторного русла, признаки адаптации к которой, ранее были выявлены в мозге 2-3-недельных крыс OXYS при исследовании энергетического метаболизма: усилены накопление фосфокреатина и его расход на синтез АТФ (Sergeeva et al., 2006). С возрастом адаптивные резервы истощаются, и у годовалых крыс OXYS методами МРТ выявляются признаки хронической гипоксии, характерные для ишемии изменения церебрального кровотока (Агафонова и др., 2007). Следует отметить, что именно к этому возрасту в мозге крыс OXYS происходит повышение продукции АРР и накопление токсических форм Aβ (Stefanova et al., 2014a, 2015a), которое может быть также сопряжено с цереброваскулярными дисфункцими: ишемия мозга активирует расщепление β- и γ-секретазами АРР (Pluta et al., 2013). Признаки тканевой гипоксии и ишемии выявлены также в сосудистой оболочке глаз крыс OXYS, в миокарде, функциональные изменения которого (нарушения ЭКГ) регистрируются уже в 3 месяцев и к 12 месяцам нарастают на фоне склеротических изменений коронарных сосудов (Колосова и др., 2014). Как показали результаты настоящего исследования, и в 5, и в 18 месяцев в префронтальной коре крыс OXYS повышена экспрессия генов ответа на гипоксию, а также генов, участвующих в регуляции размера кровеносных сосудов и вазодилатации. Сторонники «сосудистой гипотезы» ключевую роль в инициации БА отводят цереброваскулярным дисфункциям, развитие которых предшествует и способствует запуску нейродегенеративного процесса, а хроническая ишемия неизбежно способствует прогрессированию нейродегенеративных изменений (Canobbio et al., 2015). Таким образом, проведенное нами исследование показало, что ускоренное старение мозга крыс OXYS связано с развитием характерных для спорадической формы БА изменений. Подтверждением этому стали результаты исследования влияния на них митохондриального антиоксиданта SkQ1: доказана связь его нейропротекторных эффектов со способностью предупреждать и/или задерживать развитие ключевых признаков БА. 186 6.2. Анализ связи нейропротекторных эффектов митохондриального антиоксиданта SkQ1 со способностью влиять на развитие и прогрессию ключевых признаков БА у крыс OXYS Патогенез нейродегенеративных заболеваний, включая БА, тесно связан с митохондриальной дисфункцией и окислительным стрессом (Bishop et. al., 2010; Querfurth and LaFerla, 2010). Закономерно, что в течение многих лет предпринимаются попытки использовать антиоксиданты в профилактике и лечении БА. Достигнуты определенные успехи – в экспериментальных исследованиях доказана способность антиоксидантов подавлять обусловленный токсическими формами Aβ окислительный стресс in vivo и in vitro (Facecchia et al., 2011; Palacios et al., 2011). Однако клинические испытания и эпидемиологические исследования не дали убедительных доказательств способности антиоксидантов подавлять развитие БА. В то же время в случае справедливости «митохондриальной гипотезы», отводящей роль «инициатора» БА дисфункциям митохондрий, эффективными нейропротекторами, способными замедлять прогрессию заболевания, должны быть митохондриальные антиоксиданты. Примером таких соединений является исследованный нами митохондриальный антиоксидант SkQ1, способность которого подавлять развитие ассоциированных со старением заболеваний, в том числе – фенотипические проявления ускоренного старения мозга, впервые была доказана в наших исследованиях (Нероев и др., 2008; Снытникова и др., 2012; Колосова и др., 2014; Kolosova et al., 2012; Muraleva et al., 2014; Stefanova 2010, 2014a). В настоящей работе нами впервые установлено, что SkQ1 при профилактическом и лечебном приеме (в дозе 250 нмоль/кг массы тела животного) замедляет развитие и прогрессию характерных для БА проявлений у крыс OXYS. При оценке профилактической эффективности SkQ1 (прием с возраста 1,5 до 4 месяцев) выявлена способность антиоксиданта замедлять рост тревожности, снижение моторно- исследовательской активности, способности к обучению и памяти крыс OXYS (Stefanova et al., 2014a), причиной которых становятся нейродегенеративные изменения мозга. Мы показали, что прием SkQ1 существенно замедлил развитие деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS в критический период их развития. По данным светомикроскопического исследования удельное содержание обратимо измененных нейронов и необратимо измененных нейронов всех изучаемых регионов 187 (поле СА1, СА3, зубчатая извилина) гиппокампа у принимавших SkQ1 крыс OXYS было меньше, чем у контрольных крыс OXYS и не отличалось от показателей крыс Вистар. Кроме того, прием SkQ1 предупредил характерное для 4-месячных крыс OXYS развитие деструктивных изменений пирамидных нейронов в наиболее уязвимом при развитии нейродегенеративных процессов (Wright et al., 2013) регионе гиппокампа - поле СА1: средняя площадь тел и ядер клеток была значительно больше, чем у контрольных крыс OXYS и не отличалась от значений у крыс Вистар. Очевидно, что выявленная нами способность SkQ1 (прием с возраста 1,5 до 13-16 месяцев) замедлять рост тревожности и снижение моторно-исследовательской активности, снижение когнитивных способностей с возрастом у крыс OXYS также связана с нейропротекторным действием антиоксиданта (Stefanova et al., 2014a). В пользу этого свидетельствуют результаты оценки лечебного отенциала SkQ1: его прием с возраста 12 до 18 месяцев существенно замедлил прогрессию всех ключевых признаков БА у крыс OXYS. В этом эксперименте мы не выявили существенного влияния приема SkQ1 на уровень тревожности и моторно-исследовательскую активность крыс OXYS, в то же время антиоксидант существенно замедлил снижение когнитивных способностей и прогрессию нейродегенеративных изменений. По данным светомикроскопического исследования удельное содержание имеющих признаки деструкции нейронов всех изучаемых регионов гиппокампа 18-месячных крыс OXYS, принимавших SkQ1, было значительно меньше, чем у крыс OXYS контрольной группы, и не отличалось от показателей крыс Вистар. Кроме того, у принимавших SkQ1 крыс OXYS в поле СА3 гиппокампа средняя площадь тел и ядер пирамидных нейронов, а в поле СА1 только ядер нейронов была значительно больше, чем у контрольных крыс OXYS и не отличалась от значений у крыс Вистар. При этом, как показал анализ состояния ультраструктуры пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа, у принимавших SkQ1 крыс OXYS наблюдалось значительное улучшение структурной организации органелл. Более того, прием SkQ1 значительно увеличил удельную площадь митохондрий, ЭПР и снизил удельную площадь лизосом и вакуолей. Прогрессия у крыс OXYS характерных для БА нейродегенеративных процессов связана со значительными структурно-функциональными изменениями синапсов и снижением их плотности (Максимова и др., 2014б; Stefanova et al., 2015b). Лечебный прием SkQ1 не только обеспечил сохранность численной плотности синапсов в 188 гиппокампе крыс сохранившихся OXYS, но и, неповрежденных можно полагать, нейронов и способствовал синапсов, активации улучшению внутринейрональных процессов, аксонального транспорта. Как показали результаты наших исследований, антиоксидант улучшил ультраструктуру синапсов и, можно полагать, восстановил их функциональную активность: доля ассиметричных синапсов, а также количество активных зон синаптического контакта была значительно выше у принимавших SkQ1 крыс OXYS. В пользу этого свидетельствует и повышение уровня пре- и постсинаптических белков синапсина I и PSD-95 у принимавших SkQ1 крыс OXYS, снижение которых рассматривается как маркерное событие при БА (Gylys et al., 2004; Scheff et al., 2014). Как мы показали в настоящем исследовании, уровень синапсина I и PSD-95 в мозге крыс OXYS снижен уже в молодом возрасте и прогрессивно снижается с возрастом по сравнению с крысами Вистар (Stefanova et al., 2015а). Таким образом, прием SkQ1 существенно замедлил снижение когнитивных способностей у крыс OXYS при прогрессии признаков БА, что, вероятно, стало следствием не столько снижения уровня Аβ, сколько его уникальной способности восстанавливать процессы синаптической пластичности в мозге 18-месячных крыс OXYS, выявленной нами в настоящей работе. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что при развитии БА сохранившийся синаптический профиль демонстрирует компенсаторное повышение активности синапсов (Scheff et al., 2007), которая, парадоксально, увеличивает продукцию Aβ (Kamenetz et al., 2003; Cirrito et al., 2005; Gouras et al., 2010; Crimins et al., 2013). SkQ1, можно полагать, обеспечил не только сохранность существующих функциональных систем и снизил вероятность дальнейшего формирования патологических нейронных сетей, но и способствовал формированию новых функционально-активных нейронных отношений. Основываясь на результатах, полученных в настоящей работе, мы полагаем, что нарушение эффективности синапсов в условиях адаптивно-компенсаторной реорганизации нейронных сетей при развитии патологии способствует «распространению» и прогрессии в мозге больных БА амилоидной патологии, которая становится только финальным, маркерным событием в патогенезе заболевания. Изменения с возрастом функциональной активности медиаторных систем мозга способствуют снижению когнитивных функций и риску развития нейродегенеративных заболеваний (Li et al., 2011). Модулирующее действие на некоторые функции ЦНС 189 оказывает соматотропин, являясь не только эндокринным гормоном, но и нейропептидом, принимающим участие в регуляции деятельности ЦНС (Aleman et al., 2009; Conrad et al., 2010; Li E et al., 2011). Продуцируемый соматотропными клетками гипофиза гормон роста стимулирует мобилизацию жирных кислот, захват аминокислот, синтез ДНК, РНК и белков, участвует в регуляции деления клетки и тканевой гипертрофии, оказывает мощное анаболическое и антикатаболическое действие. Активация его рецепторов в печени и в других тканях ведет к стимуляции и секреции его важнейшего эндокринного посредника - IGF-1. Циркулируя в крови в высокой концентрации, IGF-1 стимулирует синтез ДНК, РНК и белков и пролиферацию многих тканей. Соматотропин и IGF-1 проявляют нейротрофические и нейропротекторные свойства (Li et al., 2011), способствуют репарации нервной ткани, стимулируют образование нейритов, пролиферацию олигодендроцитов, поддерживают жизнеспособность нейронов и глии, участвуют в синаптической пластичности. Базовый уровень соматотропного гормона максимален в ранний постнатальный период, амплитуда пиков секреции максимальна в пубертатный период. С возрастом уровень соматотропного гормона, как и его важнейшего эндокринного посредника IGF-1, обеспечивающего практически все физиологические эффекты соматотропного гормона, прогрессивно снижается (Dorshkind et al., 2009; Taub et al., 2010). Нами показано, что с возрастом уровень соматотропного гормона и IGF-1 в крови снижается у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами (Kolosova et al., 2012). Снижение активности соматотропной оси GH/IGF-I играет важную роль в старении мозга (Aleman et al., 2009; Conrad et al., 2010) и может оказывать влияние на функции стареющего мозга (Li E et al., 2011). Поэтому в рамках настоящей работы для оценки системных эффектов SkQ1 мы провели исследование влияния его профилактического и лечебного приема на содержание соматотропного гормона и IGF-1 в крови крыс OXYS и Вистар. Как показал анализ результатов, прием SkQ1 с возраста 1,5 до 4 месяцев предупредил снижение с возрастом уровня соматотропного гормона у крыс OXYS и не влиял на уровень IGF-1. У крыс Вистар антиоксидант увеличил содержание соматотропного гормона. Прием SkQ1 с возраста 19 до 23 месяцев не только предупредил снижение с возрастом содержания соматотропного гормона и IGF-1 в крови крыс Вистар и OXYS, но и повысил его до уровня более молодых животных (Kolosova et al., 2012). 190 Способность митохондриальных антиоксидантов предупреждать и замедлять обусловленное Aβ повышение генерации АФК, митохондриальные нарушения и нарушения длительной посттетанической потенциации, гибель нейронов продемонстрирована в ряде работ in vitro и in vivo (Manczak et al., 2010; Ma et al., 2011; Calkins et al., 2012). Недавно коллегами была показана способность SkQ1 снижать токсическое действие Aβ на формирование длительной посттетанической потенциации в гиппокампе в условиях in vitro и in vivo (Kapay et al., 2013). В настоящей работе нами впервые выявлена способность SkQ1 замедлять усиленное накопление токсических форм Aβ в мозге крыс OXYS при развитии и прогрессии признаков БА. Длительный профилактический прием SkQ1 (с возраста 1,5 до 23 месяцев) существенно замедлил увеличение с возрастом уровня АРР и Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS. В результате у принимавших SkQ1 крыс OXYS уровень АРР и Aβ1-42 не отличался от уровня этих белков в мозге крыс Вистар, у которых антиоксидант также снизил содержание Aβ1-42 в гиппокампе и коре мозга (Stefanova et al., 2014a). Более того, прием SkQ1 с возраста 12 до 18 месяцев, в период усиленного накопления Aβ в мозге крыс OXYS, снизил уровень Aβ1-42 в гиппокампе и коре мозга крыс обеих линий. Эти результаты стали убедительным подтверждением связи ускоренного старения мозга крыс OXYS с патогенезом БА. В пользу этого могут также свидетельствовать полученные нами недавно результаты оценки вклада изменения секреции с возрастом гормона мелатонина в преждевременное старение крыс OXYS. Снижение секреции и ритмов выработки мелатонина рассматривается как один из ключевых механизмов старения и риска развития возрастзависимых заболеваний, включая БА (Bubenik G.A. and Konturek S.J., 2011, Hardeland R., 2012). В этой связи перспективность использования мелатонина, широко применяемого во всем мире для замедления процессов старения и возрастзависимых заболеваний, в терапии БА активно обсуждается. Показано, что мелатонин способен не только ингибировать генерацию Аβ, но и задерживать формирование амилоидных фибрилл в мозге животных, моделей БА (Cheng et al., 2005; Lin et al., 2013). Нами показано, что развитие признаков БА у крыс OXYS протекает на фоне нарушения секреции мелатонина, которые развиваются уже к возрасту 3 месяцев и с возрастом усиливаются (Rudnitskaya et al., 2015а). Прием мелатонина в период манифестации признаков БА у крыс OXYS предупредил развитие нарушения секреции 191 мелатонина (Rudnitskaya et al., 2015а), но не влиял на нее в период активной прогрессии характерных для БА проявлений (неопубликованные данные). В то же время мелатонин оказал мощное, сопоставимое с SkQ1, нейропротекторное действие при профилактическом (Rudnitskaya et al., 2015а) и лечебном приеме (Rudnitskaya et al., 2015b; Stefanova et al., 2015b): антиоксидант замедлил развитие и прогрессию признаков БА у крыс OXYS. Эффективность мелатонина может быть обусловлена как его уникальными антиоксидантыми свойствами, так и противовоспалительным, нейропротекторным, анти-амилоидным действием. Мелатонин может участвовать в регуляции метаболизма АРР и взаимодействовать с Аβ пептидом, подавляя его генерацию (Wang J and Wang Z, 2006). Сообщается о позитивном влиянии мелатонина на уровень нейротрофического фактора BDNF (Sarlak et al., 2013), участвующего в регуляции медиаторных процессов, а также репаративных процессов, связанных с нейрогенезом и образованием новых клеточных структур. Способность мелатонина (Rudnitskaya et al., 2015а), а также SkQ1 (неопубликованные данные) при профилактическом приеме предупреждать компенсаторное повышение уровня BDNF в мозге в критический период манифестации признаков БА у крыс OXYS становится убедительным подтверждением высокого нейропротекторного потенциала этих антиоксидантов. Также нами показано, что прием мелатонина способен замедлять у крыс OXYS развитие катаракты и ретинопатии аналогичной возрастной макулярной дегенерации у людей (Стефанова и др., 2013; Перепечаева и др., 2014). Несомненную актуальность имеет поиск путей выявления предпосылок преждевременного старения и развития ассоциированных с ним заболеваний уже в молодом возрасте, а также разработка способов их коррекции в направлении успешного старения (Niccoli, Partridge, 2012). Активно обсуждается перспективность использования с этой целью рапамицина – антибиотика со свойствами иммунодепрессанта, способного увеличивать продолжительность жизни различных организмов - от дрожжей до млекопитающих (Blagosklonny, 2008). Его эффекты опосредуются белком mTOR (mammalian target of rapamycin) – серин-треониновой киназой, ключевым компонентом эволюционно древнего TOR-сигнального пути, который функционирует как сенсор уровня питательных веществ и энергии в клетке, регулирует рост клеток и аутофагию, интегрируя множество сигнальных путей, в том числе – инсулина, ростовых факторов и митогенов. 192 Нарушения регуляции mTOR выявлены при ряде ассоциированных со старением патологий, в том числе - при различных типах рака и нейродегенеративных заболеваниях. Специфически ингибируя mTOR-путь, рапамицин, моделирует эффекты снижения калорийности диеты - единственного надежно доказанного способа увеличения продолжительности жизни. Доказана его способность продлевать жизнь дрожжей, червей, мух и млекопитающих. Тем не менее, данные о влиянии рапамицина на начало и прогрессию «болезней старения» неоднозначны (Johnson et al., 2013). Экспериментальные исследования и клинические наблюдения свидетельствуют о том, что подавление mTORC1 в одних случаях дает позитивный эффект (сердечнососудистые заболевания, аутоиммунные, рак и др.), в других – негативный (ухудшение заживления ран у людей, диабет 2 типа, экспериментальная катаракта у мышей). На модели БА показана способность рапамицина снижать количество βамилоида, восстанавливать синаптическую пластичность и смягчать когнитивные расстройства (Spilman et al., 2010). Рапамицин, ингибируя mTOR, усиливает аутофагию, снижение которой с возрастом рассматривается как важное звено патогенеза нейродегенеративных заболеваний, прежде всего – БА. Умеренное подавление mTORпути повышало способность к обучению и память у взрослых и сохраняло – у старых мышей (Halloran et al., 2012). Однако его чрезмерное угнетение в нейронах опасно: mTOR-путь обеспечивает нормальное функционирование мозга, в частности, регулируя время и место синтеза белков, обеспечивает формирование долгосрочной памяти (Yang et al., 2014). Рапамицин – фармацевтический препарат, однако для оценки возможных побочных эффектов и расширения показаний к его применению необходимы экспериментальные исследования. Как показали результаты наших исследований прием рапамицина предупредил развитие у крыс OXYS ретинопатии, нарушений поведения и нейродегенеративных изменений в мозге (Kolosova et al., 2012, 2013). Важно, что при оценке эффективности исследованных нами геропротекторов (SkQ1, мелатонин, рапамицин, а также Cistanche deserticola – растение из семейства Заразиховые – обладающее иммуномоделирующим, антиоксидантным и рядом других лечебных свойств) доказана их способность предупреждать и замедлять развитие многих признаков преждевременного старения крыс OXYS, включая ретинопатию и характерные для БА проявления (Стефанова и др., 2013; Лощенова и др., 2015; Stefanova et al., 2011, 2014a, 2015; Kolosova et al., 2012a,b; 2013; Rudnitskaya et al., 2015a,b). 193 Принципиально важно, что накопление Aβ в мозге крыс OXYS становится вторичным событием при развитии у них признаков БА (Stefanova et al., 2015а). Развитие нарушений поведения, снижения когнитивных способностей у крыс OXYS происходит на фоне митохондриальной дисфункции и гиперфосфорилирования таубелка (Stefanova et al., 2014a,b; 2015a,b). Окислительный стресс, хроническое воспаление и клеточный стресс способствуют гиперфосфорилированию тау-белка (Zhu et al., 2000; Gomez-Ramos et al., 2003; Lovell MA, et al., 2004; Krstic et al., 2012), следствием которого становится нарушение аксонального транспорта (Kanaan et al., 2011). Эти изменения могут становиться причиной деструктивных изменений аксонов, накопления в них митохондрий и других органелл (Shemesh et al., 2008; Shahpasand et al., 2012), которые мы часто наблюдали в гиппокампе 18-месячных контрольных крыс OXYS и в редких случаях - у крыс Вистар и принимавших SkQ1 крыс OXYS. Как отмечалось выше в гиппокампе крыс OXYS выявлены нарастающие с возрастом признаки структурных нарушений миелиновых волокон аксонов, структурных изменений микротрубочек и их дезорганизация (Stefanova et al., 2015b), которые в значительной мере могут быть, следствием гиперфосфорилирования тау-белка (Stefanova et al., 2014a,b; 2015а). Как показали результаты наших исследований, прием SkQ1 замедлил усиление с возрастом фосфорилирования тау-белка в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS. У принимавших SkQ1 с возраста 1,5 до 23 месяцев крыс OXYS уровень тау-белка и фосфо-T181 в гиппокампе и префронтальной коре был на одном уровне, что и у контрольных крыс Вистар (Stefanova et al., 2014a). Основываясь на полученных результатах, можно предположить, что отмеченное нами значительное улучшение структуры миелиновых волокон, структуры и организации микротрубочек у принимавших SkQ1 крыс OXYS связано со способностью антиоксиданта снижать усиление с возрастом фосфорилирования тау-белка, что, очевидно, приводило к нормализации транспортных путей в нейронах мозга. Окислительные повреждения, а также изменения структуры митохондриальных белков в результате накопления с возрастом и при развитии БА мутаций в мтДНК приводят к существенному снижению эффективности переноса электронов по дыхательной цепи и синтеза АТФ, к увеличению вероятности образования АФК, энергетическому дефициту (Batabyal et al., 2010). Как отмечалось выше, у крыс OXYS уровень делетированной мтДНК в гиппокампе повышен, по сравнению с крысами 194 Вистар, как на стадиях, предшествующих развитию признаков БА, так и в период их прогрессии (Лощенова и др., 2015). Нами показано, что профилактический прием SkQ1 в период манифестации признаков БА у крыс OXYS снизил уровень делетированной мтДНК в гиппокампе и замедлил формирование пассивного поведения (Лощенова и др., 2015). Снижение накопления делетированной мтДНК на фоне приема SkQ1 могло быть обусловлено как его прямым антиоксидантным действием (Skulachev V. et al., 2010), так и способностью подавлять генерацию АФК в митохондриях, потенцируя вызываемое жирными кислотами мягкое разобщение окисления и фосфорилирования (Plotnikov et al., 2012). В заключение следует отметить, что в настоящее время большинство клинических испытаний потенциальных агентов в терапии БА, которые находятся на стадии разработок или планирования, направлены на снижение в мозге уровня Аβ как ключевого события патологического процесса. Результаты настоящего исследования свидетельствуют об уникальном нейропротекторном действии SkQ1: его способности тормозить структурно-функциональные патологические изменения синапсов, нейронов, митохондрий, замедлять накопление Аβ и усиление фосфорилирования тау-белка в мозге при манифестации и прогрессии признаков БА у крыс OXYS. Результаты нашего исследования способности SkQ1 замедлять развитие и прогрессию ключевых патологических проявлений БА у крыс OXYS, обнадеживают и позволяют уже сегодня рассматривать митохондриальный антиоксидант SkQ1 в качестве потенциального агента в профилактике и лечении спорадической формы БА. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенное исследование показало, что ускоренное старение мозга крыс OXYS связано с развитием характерных для БА изменений. Их последовательность: дисфункция митохондрий, гиперфосфорилирование тау-белка, синаптическая недостаточность и деструктивные изменения нейронов на ранних стадиях и их прогрессия на фоне повышения уровня АРР, усиленного накопления Aβ и образования амилоидных бляшек в мозге, - соответствует современным представлениям о патогенезе спорадической формы заболевания у людей. 195 Развитию признаков БА предшествуют и сопутствуют изменения транскриптома префронтальной коры крыс OXYS - экспрессии генов, продукты которых участвуют в процессах нейрональной пластичности, иммунной системы и апоптоза, ассоциированы с фосфорилированием белков, гипоксией, Са2+ гомеостазом. Прогрессия признаков заболевания с возрастом у крыс OXYS, как и у людей, происходит на фоне изменения в коре мозга метаболического пути БА – экспрессии генов, связанных с процессингом АРР, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий, синаптическими процессами. Сходство механизмов ускоренного старения мозга крыс OXYS с патогенезом БА подтвердили результаты исследования влияния на них митохондриального антиоксиданта SkQ1: доказана связь его нейропротекторных эффектов со способностью предупреждать и/или задерживать развитие ключевых признаков БА. Отсутствие в геноме крыс OXYS характерных для ранней формы заболевания мутаций в генах App, Psen1 и Psen2 (Stefanova et al., 2015) позволяет заключить, что линия крыс OXYS - перспективная модель спорадической формы БА, исследования на которой позволят получать новые фундаментальные знания о молекулярно- генетических предпосылках развития заболевания, выявлять его предикторы и проводить поиск новых потенциальных молекулярных мишеней для терапевтических воздействий, направленных на профилактику и, возможно, лечение заболевания. 196 ВЫВОДЫ ПО ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЕ 1. Формирование пассивного типа поведения, повышенной тревожности и нарушение способности к обучению и памяти у крыс OXYS (к возрасту 3-4 месяцев) по времени совпадают с развитием в гиппокампе и префронтальной коре мозга умеренных деструктивных изменений нейронов и синапсов и увеличением их плотности. Повышение плотности синапсов в гиппокампе происходит за счет увеличения доли симметричных синапсов и может рассматриваться как проявление компенсаторной реакции в ответ на развитие нейродегенеративных процессов. 2. С возрастом нарушения поведения и снижение когнитивных функций у крыс OXYS усиливаются на фоне прогрессии деструктивных изменений и снижения плотности нейронов и синапсов, снижения уровня пре- и постсинаптического белков синапсина I и PSD-95 в гиппокампе и префронтальной коре. Снижение плотности синапсов в гиппокампе крыс OXYS происходит в основном за счет снижения доли асимметричных синапсов и активных зон их контактов. 3. Структурные изменения митохондрий (деструкция крист, лизис матрикса, снижение удельной площади) в нейронах гиппокампа крыс OXYS выявляются в возрасте 4 месяцев и усиливаются с возрастом. Активность фермента цитохром с оксидазы комплекса IV дыхательной цепи, характеризующая функциональную активность митохондрий, в гиппокампе крыс OXYS снижена, по сравнению с таковой у крыс Вистар, уже с возраста 20 дней, в префронтальной коре – с возраста 4 месяцев, что сопряжено с умеренными деструктивными изменениями нейронов и синапсов, и как следствие, нарушениями поведения и снижением когнитивных функций. 4. Ускоренное старение мозга крыс OXYS связано с развитием ключевых признаков болезни Альцгеймера – гиперфосфорилированием тау-белка, повышением уровня АРР белка-предшественника Aβ, усиленным накоплением Aβ пептида в гиппокампе и префронтальной коре и формированием амилоидных бляшек в мозге. Повышение уровня тау-белка и его фосфорилированной формы в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS выявляются с возраста 3 месяцев и нарастает с возрастом на фоне повышения уровня АРР и Aβ1-42. 5. Усиленному накоплению Aβ пептида в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS к возрасту 12 месяцев предшествуют деструктивные изменения нейронов и 197 синапсов, структурно-функциональные изменения митохондрий, повышение уровня тау-белка и его фосфорилированной формы. 6. Сравнительный анализ транскриптома префронтальной коры крыс OXYS и Вистар методом RNA-seq выявил межлинейные различия в уровне экспрессии генов: в возрасте 5 мес. на ранней стадии развития признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS изменены уровни мРНК более 900 генов, в период их активной прогрессии в возрасте 18 мес. – более 2000 генов. Большинство из них связано с нейрональной пластичностью, фосфорилированием белка, Са2+ гомеостазом, гипоксией, иммунными процессами и апоптозом. 7. С возрастом в префронтальной коре крыс OXYS изменяется экспрессия более 5500 генов, у крыс Вистар с возрастом изменяется экспрессия 499 генов, из которых 333 – общие для них и крыс OXYS. Прогрессия с возрастом признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS, как и у людей с этим заболеванием, происходит на фоне изменения в коре мозга метаболического пути болезни Альцгеймера – экспрессии 85 генов, связанных с процессингом АРР, агрегацией и деградацией Aβ, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий, синаптическими процессами. 8. Прием антиоксиданта SkQ1 (с возраста 1,5 до 23 мес.) замедлил развитие фенотипических проявлений ускоренного старения мозга у крыс OXYS (рост тревожности, снижение моторно-исследовательской активности, способности к обучению и памяти), подавляя развитие ключевых признаков болезни Альцгеймера: деструктивных изменений нейронов, повышение уровня AРР и Aβ1-42, тау-белка и его фосфорилированной формы в гиппокампе и префронтальной коре, что в совокупности может свидетельствовать об улучшении нейрональной пластичности мозга и улучшении когнитивных функций. Как у крыс OXYS, так и у крыс Вистар прием SkQ1 замедлил снижение с возрастом системных маркеров старения – уровня в крови соматотропного гормона и IGF-1. 9. Прием SkQ1 (с возраста 12 до 18 мес.) замедлил как у крыс OXYS, так и у крыс Вистар снижение с возрастом способности к обучению и памяти, снизил уровень Aβ1-42 в гиппокампе и префронтальной коре, но не повлиял на уровень тревожности и моторноисследовательскую активность. У крыс OXYS, принимавших SkQ1, в отличие от контрольных крыс повышение уровня пре- и постсинаптического белков синапсина I и PSD-95 в гиппокампе и префронтальной коре, снижение деструктивно измененных 198 нейронов наряду с ультраструктурным состоянием нейронов, синапсов и митохондрий в гиппокампе отражают улучшение внутринейрональных процессов и аксонального транспорта. 199 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Агапова Л.С., Черняк Б.В., Домнина Л.В., Дугина В.Б., Ефименко А.Ю., Фетисова Е.К., Иванова О.Ю., Калинина Н.И., Хромова Н.В., Копнин, Б.П., Копнин П.Б., Коротецкая, М.В., Личенницер М.Р., Лукашев А.Н., Плетюшкина, О.Ю., Попова Е.Н., Скулачев М.В., Шагиева Г.С., Степанова Е.В., Титова Е.В., Ткачук В.А., Васильев Ю.М., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. SKQ1 подавляет развитие опухолей из P53-дефицитных клеток // Биохимия. – 2008. – Т.73. – №12. – С.1622–1640. 2. Влияние Агафонова И.Г., Колосова Н.Г., Мищенко Н.П., Чайкина Е.Л., Стоник В.А. гистохрома исследовательскую на состояние активность сосудов головного преждевременно мозга стареющих и поисково- крыс OXYS. Магниторезонансная томография в диагностике хронической ишемии // Бюллетень экспериментальной биологии. – 2007. – Т.143. – №4. – С.446–450. 3. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. – СПб.: Наука. – 2003. – Т.1. – 672 с. 4. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения в 2 т. – 2-е изд., перераб. и доп. – СПб.: Наука. – 2008. – Т.1. – 481 с. 5. Антоненко Ю.Н., Аветисян А.В., Бакеева Л.Е., Черняк Б.В., Чертков В.А., Домнина Л.В., Иванова О.Ю., Изюмов Д.С., Хайлова Л.С., Клишин С.С., Коршунов С.С., Коршунова Г.А., Лямзаев К.Г., Мунтян М.С., Непряхина О.К., Пашковская А.А., Плетюшкина О.Ю., Пустовидко А.В., Рогинский В.А., Рокитская Т.И., Рууге, Э.К., Сапрунова, В.Б., Северина И.И.,Симонян Р.А., Скулачев И.В., Скулачев М.В., Сумбатян Н.В., Свиряева И.В., Ташлицкий В.Н., Васильев Ю.М., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С., Замятнин А.А.(мл), Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Катионные производные пластохинона: синтез и исследование in vitro // Биохимия. – 2008. – Т.73. – №12. – С.1589–1606. 6. Бакеева Л.Е., Барсков И.В., Егоров М.В., Исаев Н.К., Капелько В.И., Казаченко А.В., Кирпатовский В.Л., Козловский С.В, Лакомкин В.Л., Левина С.В., Писаренко О.И., Плотников Е.Ю., Сапрунова В.Б., Серебрякова Л.И., Скулачев М.В., Стельмашук Е.В., Студнева И.М., Цкитишвили О.В., Васильева А.К., Викторов И.В., 200 Зоров Д.Б., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных АФК (сердечной аритмии, инфарктов сердца и почки и инсульта головного мозга) // Биохимия. – 2008. – Т.73. – №12. – С.1607–1621. 7. Береговой Н.А., Сорокина Н.С., Старостина М.В., Колосова Н.Г. Возрастные особенности формирования длительной посттетанической потенциации у крыс линии OXYS // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2011. – Т.151. – №1. – С.82–86. 8. Колосова Н.Г., Айдагулова С.В., Непомнящих Г.И. Динамика структурно- функциональных изменений митохондрий гепатоцитов преждевременно стареющих крыс линии OXYS // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2001. – Т.132. – №8. – С.235–240. 9. Колосова Н.Г., Лебедев П.А., Фурсова А.Ж., Морозкова Т.С., Гусаревич О.Г. Преждевременно стареющие крысы OXYS как модель сенильной катаракты человека // Успехи геронтологии. – 2003. – T.12. – С.143–148. 10. Колосова Н.Г., Акулов А.Е., Стефанова Н.А., Мошкин М.П., Савелов А.А., Коптюг И.В., Панов А.В., Вавилин В.А. Влияние малата на развитие индуцированных ротеноном изменений мозга у крыс Вистар и OXYS: МРТ исследование // Доклады Академии Наук. – 2011. – Т.437. – №2. – С.273–276. 11. Колосова Н.Г., Стефанова Н.А., Корболина Е.Е., Фурсова А. Ж., Кожевникова О.С. Крысы OXYS — генетическая модель преждевременного старения и связанных с ним заболеваний // Успехи геронтологии. – 2014. – Т.27. – №2. – С.336–340. 12. Коркушко О.B., Шатило B.Б. Факторы риска и подходы к профилактике ускоренного старения // Проблемы старения и долголетия. – 2008. – Т.17. – №4. – С.378–398. 13. Лощенова П.С., Синицына О.И., Федосеева Л.А., Стефанова Н.А., Колосова Н.Г. Накопление делеций в ДНК митохондрий гиппокампа преждевременно стареющих крыс OXYS и влияние на него антиоксиданта SkQ1 // Biochemistry-Moscow. – 2015. – Т.80. – № 5. – С.707 – 715. 14. Максимова К.Ю., Стефанова Н.А., Логвинов С.В. Морфологические изменения нейронов в гиппокампе крыс при преждевременном старении // Бюллетень Сибирской Медицины. – 2014а. – Т.13. – №1. – С.56–61. 201 15. Максимова К.Ю., Стефанова Н.А., Логвинов С.В. Ультраструктура синапсов в гиппокампе крыс в процессе старения // Бюллетень сибирской медицины. – 2014б. - Т. 13. № 5. С. 49–54. 16. Максимова К.Ю., Логвинов С.В., Стефанова Н.А. Морфологическая характеристика гиппокампа крыс линии OXYS и Вистар в процессе старения // Морфология. – 2015. – Т. 147. – № 3. – С. 11—16. 17. Мальцев А.В., Довидченко Н.В., Утешев В.К., Соколик В.В., Штанг О.М., Якушин М.А., Соколова Н.М., Сурин А.К., Галзитская О.В. Интенсивный синтез белка в нейронах и фосфорилирование белка предшественника бета-амилоида и тау-белка являются пусковыми факторами амилоидоза нейронов и болезни Альцгеймера // Биомедицинская химия. – 2013. – Т.59. – №2. – С.144–170. 18. Меньщикова Е.Б., Шабалина И.Г., Зенков Н.К., Колосова Н.Г. Генерация активированных кислородных метаболитов митохондриями преждевременно стареющих крыс OXYS // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2002. – T.133. – №2. – С.207–210. 19. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Труфакин В.А. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания. – Новосибирск: АРТА. – 2008. – 284 с. 20. Нероев В.В., Архипова М.М., Бакеев Л.Е., Фурсова А.Ж., Григорян Э.Н., Гришанова А.Ю., Иомдина Е.Н., Иващенко Ж.Н., Катаргина Л.А., Хорошилова-Маслова И.П., Килина О.В., Колосова Н.Г., Копенкин Е.П., Коршунов С.С., Ковалева Н.А., Новикова Ю.П., Филиппов П.П., Пилипенко Д.И., Робустова О.В., Сапрунова В.Б., Сенин И.И., Скулачев М.В., Сотникова Л.Ф., Стефанова Н.А., Тихомирова Н.К., Цапенко И.В., Щипанова А.И., Зиновкин Р.А., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Связанные с возрастом заболевания глаз. 1. SkQ возвращает зрение слепым животным // Биохимия. – 2008. – Т.73. – №12. – С.1641–1654. 21. Обухова Л.А., Вайс В.Б., Бакеева Л.Е., Сергеева С.В., Колосова Н.Г. Структурно-функциональные основы ускоренной инволюции тимуса у крыс OXYS // Успехи Геронтологии. – 2013. – Т.26. – №2. – С.229–235. 202 22. Орловская И.А., Топоркова Л.Б., Феофанова Н.А., Колосова Н.Г. Особенности костномозгового гемопоэза у преждевременно стареющих крыс OXYS // Бюллетень экспериментальной биологии. – 2007. – Т.144. – №4. – С.96–99. 23. Селье Г. Стресс без дистресса. – М: Прогресс. – 1979. – 123 с. 24. Семченко В.В., Степанов С.С., Боголепов Н.Н. Синаптическая пластичность головного мозга (фундаментальные и прикладные аспекты). – М: Директ-Медиа. – 2014. – 499 с. 25. Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения // Биохимия. – 2007. – №72. – С.85–96. 26. Соловьева Н.А., Морозкова Т.С., Салганик Р.И. Получение сублинии крыс с признаками наследственной галактоземии и исследование их биохимических особенностей // Генетика. – 1975. – Т.18. – №5. – С.63–71. 27. Стефанова Н.А., Корболина Е.Е., Ершов Н.И., Рогаев Е.И., Колосова Н.Г. Изменения транскриптома префронтальной коры мозга при развитии признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS. // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2015. – Т. 19, № 4. – С. 74—82. 28. Шабалина И.Г., Колосова Н.Г., Гришанова А.Ю., Соловьева Н.А., Соловьев В.Н., Салганик Р.И. Активность окислительного фосфорилирования, F0F1-АТФ-азы и содержание цитохромов митохондрий печени крыс с врожденным повышением способности радикалообразования // Биохимия. – 1995. – Т.60. – №12. – С.45–52. 29. Шевелев О.Б., Рыкова В.И., Федосеева Л.А., Леберфарб Е.Ю., Дымшиц Г.М., Колосова Н.Г. Экспрессия Ext1, Ext2 и гепараназы в мозге преждевременно стареющих крыс OXYS в период раннего онтогенеза и развития нейродегенеративных изменений // Biochemistry-Moscow. – 2012. – T.77. – №1. – С.71–78. 30. Abraha A., Ghoshal N., Gamblin T.C., Cryns V., Berry R.W., Kuret J., Binder L.I. C-terminal inhibition of tau assembly in vitro and in Alzheimer's disease // J Cell Sci. – 2000. – V.113. – Pt.21. – P.3737–3745. 31. Ahmed S.P., Ahmad M., Ahmed S.I., Najam R., Khurshid S.J. Effect of some psychoactive drugs on stress induced alteration in plasma corticosterone level // J Pak Med Assoc. – 1995. – V.45. – N.6. – Р.153–155. 32. Aleman A., Torres-Alemán I. Circulating insulin-like growth factor I and cognitive function: neuromodulation throughout the lifespan // Prog Neurobiol. – 2009. – V.89. – N.3. – P.256–265. 203 33. Anandatheerthavarada H.K., Biswas G., Robin M.A., Avadhani N.G. Mitochondrial targeting and a novel transmembrane arrest of Alzheimer's amyloid precursor protein impairs mitochondrial function in neuronal cells // J Cell Biol. – 2003. – V.161. – N.1. – P.41–54. 34. Anders S., Huber W. Differential expression analysis for sequence count data // Genome Biol. – 2010. – V.11. – N.10. – R106. – P.1–12. 35. Anderson A.J., Pike C.J., Cotman C.W. Differential induction of immediate early gene proteins in cultured neurons by beta-amyloid (Aβ): association of c-Jun with Aβ-induced apoptosis // J Neurochem. – 1995. – V.65. – N.4. – P.1487–1498. 36. Andorfer C., Acker C.M., Kress Y., Hof P.R., Duff K., Davies P. Cell-cycle reentry and cell death in transgenic mice expressing nonmutant human tau isoform // J Neurosci. – 2005. – V.25. – N.22. – P.5446–5454. 37. Andreasson U., Lautner R., Schott J.M., Mattsson N., Hansson O., Herukka S.K., Helisalmi S., Ewers M., Hampel H., Wallin A., Minthon L., Hardy J., Blennow K., Zetterberg H. CSF biomarkers for Alzheimer’s pathology and the effect size of APOE ε4 // Mol Psychiatry. – 2014. – V.19. – N.2. – P.148–149. 38. Andrews Z.B. Uncoupling protein-2 and the potential link between metabolism and longevity // Curr Aging Sci. – 2010. – V.3. – N.2. – Р.102–112. 39. Aragno M., Mastrocola R., Medana C., Catalano M.G., Vercellinatto I., Danni O., Boccuzzi G. Oxidative stress-dependent impairment of cardiac-specific transcription factors in experimental diabetes // Endocrinology. – 2006. – V.147. – N.12. – Р.5967–5974. 40. Arendt T. Synaptic degeneration in Alzheimer’s disease // Acta Neuropathol. – 2009. – V.118. – N.1. – P.167–179. 41. Areza-Fegyveres R., Rosemberg S., Castro R.M., Porto C.S., Bahia V.S., Caramelli P., Nitrini R. Dementia pugilistica with clinical features of Alzheimer’s disease // Arq Neuropsiquiatr. – 2007. – V.65. – N.3B. – P.830–833. 42. Armstrong A., Mattsson N., Appelqvist H., Janefjord C., Sandin L., Agholme L., Olsson B., Svensson S., Blennow K., Zetterberg H., Kågedal K. Lysosomal network proteins as potential novel CSF biomarkers for Alzheimer’s disease // Neuromol Med. – 2013. – V.16. – N.1. – P.150–160. 204 43. Armstrong R.A. The pathogenesis of Alzheimer’s disease: a reevaluation of the “amyloid cascade hypothesis.” // Int J Alzheimers Dis. – 2011. – V.2011. – P.1–6. – Article ID: 630865. 44. Arriagada P.V., Growdon J.H., Hedley-Whyte E.T., Hyman B.T. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimer’s disease // Neurology. – 1992. – V.42. – N.3. – Pt.1. – P.631–639. 45. Atamna H., Boyle K. Amyloid-beta peptide binds with heme to form a peroxidase: Relationship to the cytopathologies of Alzheimer’s disease // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2006. – V.103. – N.9. – P.3381–3338. 46. Baig S., Joseph S.A., Tayler H., Abraham R., Owen M.J., Williams J., Kehoe P.G., Love S. Distribution and expression of picalm in Alzheimer disease // J Neuropathol Exp Neurol. – 2010. – V.69. – N.10. – P.1071–1077. 47. Bailey J.A., Maloney B., Ge Y.W., Lahiri D.K. Functional activity of the novel Alzheimer's amyloid β-peptide interacting domain (AβID) in the APP and BACE1 promoter sequences and implications in activating apoptotic genes and in amyloidogenesis // Gene. – 2011. – V.488. – N.1-2. – P.13–22. 48. Bales K.R., Verina T., Cummins D.J., Du Y., Dodel R.C., Saura J., Fishman C.E., DeLong C.A., Piccardo P., Petegnief V., Ghetti B., Paul S.M. Apolipoprotein E is essential for amyloid deposition in the APPV717F transgenic mousemodel of Alzheimer's disease // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1999. – V.96. – N.26. – P.15233–15238. 49. Bales K.R., Liu F., Wu S., Lin S., Koger D., DeLong C., Hansen J.C., Sullivan P.M., Paul S.M. Human APOE isoform-dependent effects on brain betaamyloid levels in PDAPP transgenic mice // J Neurosci. – 2009. – V.29. – N.21. – P.6771–6779. 50. Balietti M., Giorgetti B., Casoli T., Solazzi M., Tamagnini F., Burattini C., Aicardi G., Fattoretti P. Early Selective Vulnerability of Synapses and Synaptic Mitochondria in the Hippocampal CA1 Region of the Tg2576 Mouse Model of Alzheimer’s Disease // J Alzheimers Dis. – 2013. – V.34. – N.4. – P.887–896. 51. Ball M.J., Lukiw W.J., Kammerman E.M., Hill J.M. Intracerebral propagation of Alzheimer's disease: strengthening evidence of a herpes simplex virus etiology // Alzheimers Dement. – 2013. – V.9. – N.2. – P.169–175. 205 52. Barger S.W., Basile A.S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function // J Neurochem. – 2001. – V.76. – N.3. – P.846–854. 53. Bast A., Haenen G.R. Lipoic acid: A multifunctional antioxidant // Biofactors. – 2003. – V.17. – N.1-4. – Р.207–213. 54. Batabyal D., McKenzie J.L., Johnson K.A. Role of histidine 932 of the human mitochondrial DNA polymerase in nucleotide discrimination and inherited disease // J Biol Chem. – 2010. – V.285. – N.44. – Р.191–201. 55. Bayer T.A., Cappai R., Masters C.L., Beyreuther K., Multhaup G. It all sticks together—the APP-related family of proteins and Alzheimer’s disease // Mol Psychiatry. – 1999. – V.4. – N.6. – P.524–528. 56. Beal M. Bioenergetic approaches for neuroprotection in Parkinson's disease // Ann Neurol. – 2003. – V.53. – S.3. – Р.39–48. 57. Bell R.D., Sagare A.P., Friedman A.E., Bedi G.S., Holtzman D.M., Deane R., Zlokovic B.V. Transport pathways for clearance of human Alzheimer’s amyloid β-peptide and apolipoproteins E and J in the mouse central nervous system // J Cereb Blood Flow Metab. – 2007. – V.27. – N.5. – P.909–918. 58. Bellettato C.M., Scarpa M. Pathophysiology of neuropathic lysosomal storage disorders // J Inherit Metab Dis. – 2010. – V.33. – N.4. – P.347–362. 59. Bernfield M., Götte M., Park P.W., Reizes O., Fitzgerald M.L., Lincecum J., Zako M. Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans // Annu Rev Biochem. – 1999. – V.68. – P.729–777. 60. Bertram L., McQueen M.B., Mullin K., Blacker D., Tanzi R.E. Systematic meta- analyses of Alzheimer disease genetic association studies: the AlzGene database // Nat Genet. – 2007. – V.39. – N.1. – P.17–23. 61. Bhagavan H.N., Chopra R.K. Coenzyme Q10: absorption, tissue uptake, metabolism and pharmacokinetics // Free Radic Res. – 2006. – V.40. – N.5. – Р.445–453. 62. Biernat J., Gustke N., Drewes G., Mandelkow E.M., Mandelkow E. Phosphorylation of Ser262 strongly reduces binding of tau to microtubules: distinction between PHF-like immunoreactivity and microtubule binding // Neuron. – 1993. – V.11. – N.1. – P.153–163. 206 63. Bick K.L. The early story of Alzheimer disease. In: Terry R.D., Katzman R., Bick K.L., Sisodia S.S., eds. Alzheimer disease. – 2nd ed. – Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. – 1999. – pp.1–9. 64. Bilkei-Gorzo A. Genetic mouse models of brain ageing and Alzheimer's disease // Pharmacol Ther. – 2013. – V.142. – N.2. – P.244–257. 65. Bishop N.A., Lu T., Yankner B.A. Neural mechanisms of ageing and cognitive decline // Nature. – 2010. – V.464. – N.7288. – Р.529–535. 66. Blagosklonny M.V. Aging: ROS or TOR // Cell Cycle. – 2008. – V.7. – N.21. – Р.3344–3354. 67. Blalock E.M., Chen K.C., Sharrow K., Herman J.P., Porter N.M., Foster T.C., Landfield P.W. Gene microarrays in hippocampal aging: statistical profiling identifies novel processes correlated with cognitive impairment // J Neurosci. – 2003. – V.23. – N.9. – Р.3807– 3819. 68. Blennow K., de Leon M.J., Zetterberg H. Alzheimer’s disease // Lancet. – 2006. – V.368. – N.9533. – P.387–403. 69. Bobko А.А., Sergeeva S.V., Bagryanskaya E.G., Markel A.L., Khramtsov V.V., Reznikov V.A., Kolosova N.G. 19F NMR measurements of NO production in hypertensive ISIAH and OXYS rats // Biochem Biophys Res Commun. – 2005. – V.330. – N.2. – P.367–370. 70. Bolognin S., Blanchard J.,Wang X., Basurto-Islas G., Tung Y.C., Kohlbrenner E., Grundke-Iqbal I., Iqbal K. An experimental rat model of sporadic Alzheimer’s disease and rescue of cognitive impairment with a neurotrophic peptide // Acta Neuropathol. – 2012. – V.123. – N.1. – P.133–151. 71. Bons N., Rieger F., Prudhomme D., Fisher A., Krause K.H. Microcebus murinus: a useful primate model for human cerebral aging and Alzheimer’s disease? // Genes Brain Behav. – 2006. – V.5. – N.2. – P.120–130. 72. Braak H., Thal D.R., Ghebremedhin E., Del Tredici K. Stages of the pathologic process in Alzheimer disease: age categories from 1 to 100 years // J Neuropathol Exp Neurol. – 2011. – V.70. – N.11. – P.960–969. 73. Brand M.D. Uncoupling to survive? The role of mitochondrial inefficiency in ageing // Exp Gerontol. – 2000. – V.35. – N.6-7. – Р.11–20. 207 74. Brandt R., Léger J., Lee G. Interaction of tau with the neural plasma membrane mediated by tau's amino-terminal projection domain // J Cell Biol. – 1995. – V.131. – N.5. – P.1327–1340. 75. Brewer G.J. Why vitamin e therapy fails for treatment of Alzheimer’s disease // J Alzheimers Dis. – 2010. – V.19. – N.1. – P.27–30. 76. Braidy N., Muñoz P., Palacios A.G., Castellano-Gonzalez G., Inestrosa N.C., Chung R.S., Sachdev P., Guillemin G.J. Recent rodent models for Alzheimer’s disease: clinical implications and basic research // J Neural Transm. – 2012. – V.119. – N.2. – P.173– 195. 77. Brown D.I., Griendling K.K. Nox proteins in signal transduction // Free Radic Biol Med. – 2009. – V.47. – N.9. – Р.39–53. 78. Brun A, Englund E. Regional pattern of degeneration in Alzheimer's disease: neuronal loss and histopathological grading // Histopathology. – 1981. – V.5. – N.5. – P.549– 564. 79. Buccafusco J.J. Estimation of working memory in macaques for studying drugs for the treatment of cognitive disorders // J Alzheimers Dis. – 2008. – V.15. – N.4. – P.709–720. 80. Burger C., Lopez M.C., Baker H.V., Mandel R.J., Muzyczka N. Genome-wide analysis of aging and learning-related genes in the hippocampal dentate gyrus // Neurobiol Learn Mem. – 2008. – V.89. – N.4. – Р.379–396. 81. Busciglio J., Pelsman A., Wong C., Pigino G., Yuan m., Mori H., Yankner B.A. Altered metabolism of the amyloid beta precursor protein is associated with mitochondrial dysfunction in Down’s syndrome // Neuron. – 2002. – V.33. – N.5. – P.677–688. 82. Calhoun M.E., Wiederhold K.H., Abramowski D., Phinney A.L., Probst A., Sturchler-Pierrat C., Staufenbiel M., Sommer B., Jucker M. Neuron loss in APP transgenic mice // Nature. – 1998. – V.395. – N.6704. – P.755–756. 83. Calkins M.J., Reddy P.H. Amyloid beta impairs mitochondrial anterograde transport and degenerates synapses in Alzheimer's disease neurons // Biochim Biophys Acta. – 2011. – V.1812. – N.4. – P.507–513. 84. Calkins M.J., Manczak M., Reddy P.H. Mitochondria-targeted antioxidant SS31 prevents amyloid beta-induced mitochondrial abnormalities and synaptic degeneration in Alzheimer’s disease // Pharmaceuticals (Basel). – 2012. – V.5. – N.10. – P.1103–1119. 208 85. Candelario-Jalil E. A role for cyclooxygenase-1 in beta-amyloid-induced neuroinflammation // Aging (Albany NY). – 2009. – V.1. – N.4. – P.350–353. 86. Canobbio I., Abubaker A.A., Visconte C., Torti M., Pula G. Role of amyloid peptides in vascular dysfunction and platelet dysregulation in Alzheimer's disease // Front Cell Neurosci. – 2015. – V.9. – N.65. – P.1–15. 87. Cao K., Graziotto J.J., Blair C.D., Mazzulli J.R., Erdos M.R., Krainc D., Collins F.S. Rapamycin reverses cellular phenotypes and enhances mutant protein clearance in Hutchinson-Gilford progeria syndrome cells // Sci Transl Med. – 2011. – V.3. – N.89. – P.89ra58. doi: 10.1126/scitranslmed.3002346. 88. Capetillo-Zarate E., Staufenbiel M., Abramowski D., Haass C., Escher A., Stadelmann C., Yamaguchi H., Wiestler O.D., Thal D.R. Selective vulnerability of different types of commissural neurons for amyloid beta-protein-induced neurodegeneration in APP23 mice correlates with dendritic tree morphology // Brain. – 2006. – V.129. – Pt.11. – P.2992– 3005. 89. Cardoso S.M., Oliveira C.R. The role of calcineurin in amyloid-β-peptides - mediated cell death // Brain Res. – 2005. – V.1050. – N.1-2. – P.1–7. 90. Carroll J.C., Iba M., Bangasser D.A., Valentino R.J., James M.J., Brunden K.R., Lee V.M., Trojanowski J.Q. Chronic stress exacerbates tau pathology, neurodegeneration, and cognitive performance through a corticotropin-releasing factor receptor-dependent mechanism in a transgenic mouse model of tauopathy // J Neurosci. – 2011. – V.31. – N.40. – P.14436– 14449. 91. Chacinska A., van der Laan M., Mehnert C.S., Guiard B., Mick D.U., Hutu D.P., Truscott K.N., Wiedemann N., Meisinger C., Pfanner N., Rehling P. Distinct forms of mitochondrial TOM-TIM supercomplexes define signal-dependent states of preprotein sorting // Mol Cell Biol. – 2010. – V.30. – N.1. – P.307–318. 92. Chartier-Harlin M.C., Crawford F., Houlden H., Warren A., Hughes D., Fidani L., Goate A., Rossor M., Roques P., Hardy J., Mullan M. Early-onset Alzheimer’s disease caused by mutations at codon 717 of the beta-amyloid precursor protein gene // Nature. – 1991. – V.353. – N.6347. – P.844–846. 93. Chaturvedi R.K., Beal M.F. Mitochondrial approaches for neuroprotection // Ann N Y Acad Sci. – 2008. – V.47. – Р.395–412. 209 94. Chaturvedi R.K., Beal M.F. Mitochondrial diseases of the brain // Free Radic Biol Med. – 2013. – V.63. – P.1–29. 95. Chen G., Chen K.S., Knox J., Inglis J., Bernard A., Martin S.J., Justice A., McConlogue L., Games D., Freedman S.B., Morris R.G. A learning deficit related to age and beta-amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease // Nature. – 2000. – V.408. – N.6815. – P.975–979. 96. Chen J., Kanai Y., Cowan N., Hirokawa N. Projection domains of MAP2 and tau determine spacings between microtubules in dendrites and axons // Nature. – 1992. – V.360. – N.6405. – P.674–677. 97. Chen Y., Wei G., Nie H., Lin Y., Tian H., Liu Y., Yu X., Cheng S., Yan R., Wang Q., Liu D.H., Deng W., Lai Y., Zhou J.H., Zhang S.X., Lin W.W., Chen D.F. β-Asarone prevents autophagy and synaptic loss by reducing ROCK expression in asenescenceaccelerated prone 8 mice // Brain Res. – 2014. – V.1552. – P.41–54. 98. Chiu C., Miller M.C., Caralopoulos I.N., Worden M.S., Brinker T., Gordon Z.N., Johanson C.E., Silverberg G.D. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months // Fluids Barriers CNS. – 2012. – V.9. – N.3. – P.1–8. 99. Cho J.H., Johnson G.V. Glycogen synthase kinase 3 beta induces caspase-cleaved tau aggregation in situ // J Biol Chem. – 2004. – V.279. – N.52. – P.54716–54723. 100. Choi S.H., Bosetti F. Cyclooxygenase-1 null mice show reduced neuroinflammation in response to beta-amyloid // Aging (Albany NY). – 2009. – V.1. – N.2. – P.234–244. 101. Christie R.H., Bacskai B.J., Zipfel W.R., Williams R.M., Kajdasz S.T., Webb W.W., Hyman B.T. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy // J Neurosci. – 2001. – V.21. – N.3. – P.858–864. 102. Chung C.W., Song Y.H., Kim I.K., Yoon W.J., Ryu B.R., Jo D.G., Woo H.N., Kwon Y.K., Kim H.H., Gwag B.J., Mook-Jung I.H., Jung Y.K. Proapoptotic effects of tau cleavage product generated by caspase-3 // Neurobiol Dis. – 2001. – V.8. – N.1. – P.162–172. 103. Cirrito J.R., Yamada K.A., Finn M.B., Sloviter R.S., Bales K.R., May P.C., Schoepp D.D., Paul S.M., Mennerick S., Holtzman D.M. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo // Neuron. – 2005. – V.48. – N.6. – P.913–922. 210 104. Cirrito J.R., Kang J.E., Lee J., Stewart F.R., Verges D.K., Silverio L.M., Bu G., Mennerick S., Holtzman D.M. Endocytosis is required for synaptic activity-dependent release of amyloid-β in vivo // Neuron. – 2008. – V.58. – N.1. – P.42–51. 105. Citron M., Oltersdorf T., Haass C., McConlogue L., Hung A.Y., Seubert P., Vigo- Pelfrey C., Lieberburg I., Selkoe D.J. Mutation of the β-amyloid precursor protein in familial Alzheimer’s disease increases β-protein production // Nature. – 1992. – V.360. – N.6405. – P.672–674. 106. Citron M., Vigo-Pelfrey C., Teplow D.B., Miller C., Schenk D., Johnston J., Winblad B., Venizelos N., lannfelt L., Selkoe D.J. Excessive production of amyloid β-protein by peripheral cells of symptomatic and presymptomatic patients carrying the Swedish familial Alzheimer disease mutation // Proc Natl Acad Sci USA. – 1994. – V.91. – N.25. – P.11993– 11997. 107. Citron M., Westaway D., Xia W., Carlson G., Diehl T., Levesque G., Johnson- Wood K., Lee M., Seubert P., Davis A., Kholodenko D., Motter R., Sherrington R., Perry B., Yao H., Strome R., Lieberburg I., Rommens J., Kim S., Schenk D., Fraser P., St George Hyslop P., Selkoe D.J. Mutant presenilins of Alzheimer’s disease increase production of 42residue amyloid β-protein in both transfected cells and transgenic mice // Nat Med. – 1997. – V.3. – N.1. – P.67–72. 108. Conrad C.D., Bimonte-Nelson H.A. Impact of the hypothalamic-pituitary- adrenal/gonadal axes on trajectory of age-related cognitive decline // Prog Brain Res. – 2010. – V.182. – P.31–76. 109. Corder E.H., Saunders A.M., Risch N.J., Strittmatter W.J., Schmechel1 D.E., Gaskell Jr. P.C., Rimmler J.B., Locke P.A., Conneally P.M., Schmader K.E., Small G.W., Roses A.D., Haines J.L., Pericak-Vance M.A. Protective effect of apolipoprotein E type 2 allele for late onset Alzheimer disease // Nat Gen. – 1994. – V.7. – N.2. – P.180–184. 110. Cousin M.A., Robinson P.J. The dephosphins: dephosphorylation by calcineurin triggers synaptic vesicle endocytosis // Trends Neurosci. – 2001. – V.24. – N.11. – P.659–665. 111. Crews L., Masliah E. Molecular mechanisms of neurodegeneration in Alzheimer’s disease // Hum Mol Genet. – 2010. – V.19. – N.R1. – P.R12–20. 112. Crimins J.L., Pooler A., Polydoro M., Luebke J.I., Spires-Jones T.L. The intersection of amyloid β and tau in glutamatergic synaptic dysfunction and collapse in Alzheimer’s disease // Ageing Res Rev. – 2013. – V.12. – N.3. – P.757–763. 211 113. Cruchaga C., Haller G., Chakraverty S., Mayo K., Vallania F.L., Mitra R.D., Faber K., Williamson J., Bird T., Diaz-Arrastia R., Foroud T.M., Boeve B.F., Graff-Radford N.F., St Jean P., Lawson M., Ehm M.G., Mayeux R., Goate A.M.; NIA-LOAD/NCRAD Family Study Consortium. Rare variants in APP, PSEN1 and PSEN2 increase risk for AD in late-onset Alzheimer’s disease families // PLoS One. – 2012. – V.7. – N.2. – P.1–10. – Article ID: e31039. 114. Cruts M., Van Broeckhoven C. Presenilin mutations in Alzheimer’s disease // Hum Mutat. – 1998. – V.11. – N.3. – P.183–190. 115. Cummings J.L., Isaacson R.S., Schmitt F.A., Velting D.M. A practical algorithm for managing Alzheimer's disease: what, when, and why? // Ann Clin Transl Neurol. – 2015. – V.2. – N.3. – P.307–323. 116. Daborg J., Andreasson U., Pekna M., Lautner R., Hanse E., Minthon L., Blennow K., Hansson O., Zetterberg H. Cerebrospinal fluid levels of complement proteins C3, C4 and CR1 in Alzheimer’s disease // J Neural Transm. – 2012. – V.119. – N.7. – P.789–797. 117. Dai D.F., Chiao Y.A., Marcinek D.J., Szeto H.H., Rabinovitch P.S. Mitochondrial oxidative stress in aging and healthspan // Longev Healthspan. – 2014. – V.3. – N.6. – P.1–22. 118. D’Amelio M., Cavallucci V., Middei S., Marchetti C., Pacioni S., Ferri A., Diamantini A., De Zio D., Carrara P., Battistini L., Moreno S., Bacci A., Ammassari-Teule M., Marie H., Cecconi F. Caspase-3 triggers early synaptic dysfunction in a mouse model of Alzheimer’s disease // Nat Neurosci. – 2011. – V.14. – N.1. – P.69–76. 119. Dasari B., Prasanthi J.R., Marwarha G., Singh B.B., Ghribi O. Cholesterol- enriched diet causes age-related macular degeneration-like pathology in rabbit retina // BMC Ophthalmol. – 2011. – V.11. – N.22. – P.1–11. 120. Davies C.A., Mann D.M., Sumpter P.Q., Yates P.O. A quantitative morphometric analysis of the neuronal and synaptic content of the frontal and temporal cortex in patients with Alzheimer’s disease // J Neurol Sci. – 1987. – V.78. – N.2. – P.151–64. 121. Dawson H.N., Ferreira A., Eyster M.V., Ghoshal N., Binder L.I., Vitek M.P. Inhibition of neuronal maturation in primary hippocampal neurons from tau deficient mice // J Cell Sci. – 2001. – V.114. – Pt.6. – P.1179–1187. 122. De Calignon A., Polydoro M., Suárez-Calvet M., William C., Adamowicz D.H., Kopeikina K.J., Pitstick R., Sahara N., Ashe K.H., Carlson G.A., Spires-Jones T.L., Hyman 212 B.T. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease // Neuron. – 2012. – V.73. – N.4. – P.685–697. 123. DeKosky S.T., Scheff S.W. Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer’s disease: correlation with cognitive severity // Ann Neurol. – 1990. – V.27. – N.5. – P.457–464. 124. Dell'agnello C., Leo S., Agostino A., Szabadkai G., Tiveron C., Zulian A., Prelle A.,Roubertoux P., Rizzuto R., Zeviani M. Increased longevity and refractoriness to Ca(2+)dependent neurodegeneration in Surf1 knockout mice // Hum Mol Genet. – 2007. – V.16. – N.4. – Р.431–444. 125. Delobel P., Lavenir I., Ghetti B., Holzer M., Goedert M. Cell-cycle markers in a transgenic mouse model of human tauopathy: increased levels of cyclin-dependent kinase inhibitors p21Cip1 and p27Kip1 // Am J Pathol. – 2006. – V.168. – N.3. – P.878–887. 126. De Magalhaes J., Costa J. A database of vertebrate longevity records and their relation to other life-history traits // J Evol Biol. – 2009. – V.22. – N.8. – P.1770–1774. 127. DeMattos R.B., O’Dell M.A., Parsadanian M., Taylor J.W., Harmony J.A., Bales K.R., Paul S.M., Aronow B.J., Holtzman D.M. Clusterin promotes amyloid plaque formation and is critical for neuritic toxicity in amouse model ofAlzheimer’s disease // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2002. – V.99. – N.16. – P.10843–10848. 128. DeMattos R.B., Cirrito J.R., Parsadanian M., May P.C., O’Dell M.A., Taylor J.W., Harmony J.A., Aronow B.J., Bales K.R., Paul S.M., Holtzman D.M. ApoE and clusterin cooperatively suppress Abeta levels and deposition: evidence that ApoE regulates extracellular Abeta metabolism in vivo // Neuron. – 2004. – V.41. – N.2. – P.193–202. 129. Deshpande A., Mina E., Glabe C., Busciglio J. Different conformations of amyloid beta induce neurotoxicity by distinct mechanisms in human cortical neurons // J Neurosci. – 2006. – V.26. – N.22. – P.6011–6018. 130. De Strooper B., Annaert W. Where Notch and Wnt signaling meet. The presenilin hub // J Cell Biol. – 2001. – V.152. – N.4. – F.17–20. 131. Devi L., Prabhu B.M., Galati D.F., Avadhani N.G., Anandatheerthavarada H. K. Accumulation of amyloid precursor protein in the mitochondrial import channels of human Alzheimer's disease brain is associated with mitochondrial dysfunction // J Neurosci. – 2006. – V.26. – N.35. – P.9057–9068. 213 132. Devore E.E., Grodstein F., van Rooij F.J.A., Hofman A., Stampfer M.J., Witteman J.C., Breteler M.M. Dietary antioxidants and long-term risk of dementia // Arch Neurol. – 2010. – V.67. – N.7. – P.819–825. 133. Dhenain M., Chenu E., Hisley C.K., Aujard F., Volk A. Regional atrophy in the brain of lissencephalic mouse lemur primates: measurement by automatic histogram-based segmentation of MR images // Magn Reson Med. – 2003. – V.50. – N.5. – P.984–992. 134. Dias-Santagata D., Fulga T.A., Duttaroy A., Feany M.B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila // J Clin Invest. – 2007. – V.117. – N.1. – P.236– 245. 135. Dietrich M.O., Horvath T.L. The role of mitochondrial uncoupling proteins in lifespan // Pflugers Arch. – 2010. – V.459. – N.2. – Р.269–275. 136. Divry P. Etude histo-clinique des plaques seniles // J Belg Neurol Psychiat. – 1927. – V.27. – P.643–657. 137. Doehner J., Madhusudan A., Konietzko U., Fritschy J.M., Knuesel I. Co- localization of Reelin and proteolytic AβPP fragments in hippocampal plaques in aged wildtype mice // J Alzheimers Dis. – 2010. – V.19. – N.4. – P.1339–1357. 138. Doehner J., Genoud C., Imhof C., Krstic D., Knuesel I. Extrusion of misfolded and aggregated proteins – a protective strategy of aging neurons? // Eur J Neurosci. – 2012. – V.35. – N.12. – P.1938–1950. 139. Dorshkind K., Montecino-Rodriguez E., Signer R.A. The ageing immune system: is it ever too old to become young again? // Nat Rev Immunol. – 2009. – V.9. – N.1. – P.57–62. 140. Dotan Y., Pinchuk I., Lichtenberg D., Leshno M. Decision analysis supports the paradigm that indiscriminate supplementation of vitamin E does more harm than good // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2009. – V.29. – N.9. – Р.1304–1309. 141. Drachman D.A. The amyloid hypothesis, time to move on: Amyloid is the downstream result, not cause, of Alzheimer’s disease // Alzheimers Dement. – 2014. – V.10. – N.3. – P.372–380. 142. Dröge W. Free radicals in the physiological control of cell function // Physiol Rev. – 2002. – V.82. – N.1. – Р.47–95. 143. Dröge W., Schipper H.M. Oxidative stress and aberrant signaling in aging and cognitive decline // Aging Cell. – 2007. – V.6. – N.3. – Р.361–370. 214 144. Duff K., Suleman F. Transgenic mouse models of Alzheimer’s disease: how useful have they been for therapeutic development? // Brief Funct Genomic Proteomic. – 2004. – V.3. – N.1. – P.47–59. 145. Ebneth A., Godemann R., Stamer K., Illenberger S., Trinczek B., Mandelkow E.M., Mandelkow E. Overexpression of Tau Protein Inhibits Kinesin-dependent Trafficking of Vesicles, Mitochondria, and Endoplasmic Reticulum: Implications for Alzheimer's Disease // J Cell Biol. – 1998. – V.143. – N.3. – P.777–794. 146. El Khoury J., Toft M., Hickman S.E., Means T.K., Terada K., Geula C., Luster A.D. Ccr2 deficiency impairs microglial accumulation and accelerates progression of Alzheimer-like disease // Nat Med. – 2007. – V.13. – N.4. – P.432–438. 147. Ertekin-Taner N. Genetics of Alzheimer's disease: a centennial review // Neurol Clin. – 2007. – V.25. – N.3. – P.611–667. 148. Facecchia K., Fochesato L.A., Ray S.D., Stohs S.J., Pandey S. Oxidative toxicity in neurodegenerative diseases: Role of mitochondrial dysfunction and therapeutic strategies // J Toxicol. – 2011. – V.2011. – P.1–12. – Article ID: 683728. 149. Farris W., Mansourian S., Chang Y., Lindsley L., Eckman E.A., Frosch M.P., Eckman C.B., Tanzi R.E., Selkoe D.J., Guenette S. Insulin-degrading enzyme regulates the levels of insulin, amyloid beta-protein, and the beta-amyloid precursor protein intracellular domain in vivo // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2003. – V.100. – N.7. – P.4162–4167. 150. Feng Y., Wang X. Antioxidant Therapies for Alzheimer’s Disease // Oxid med Cell Longev. – 2012. – V.2012. – P.1–17. – Article ID: 472932. 151. Fikui K., Takatsu H., Shinkai T., Suzuki S., Abe K., Urano S. Appearance of amyloid beta-like substances and delayed-type apoptosis in rat hippocampus CA1 region through aging and oxidative stress // J Alzheimers Dis. – 2005. – V.8. – N.3. – Р.299–309. 152. Fjell A.M., Walhovd K.B. Neuroimaging results impose new views on Alzheimer’s disease – the role of amyloid revised // Mol Neurobiol. – 2012. – V.45. – N.1. – P.153–172. 153. Fleisher A.S., Chen K., Liu X., Roontiva A., Thiyyagura P., Ayutyanont N., Joshi A.D., Clark C.M., Mintun M.A., Pontecorvo M.J., Doraiswamy P.M., Johnson K.A., Skovronsky D.M., Reiman E.M. Using positron emission tomography and florbetapir F18 to image cortical amyloid in patients with mild cognitive impairment or dementia due to Alzheimer disease // Arch Neurol. – 2011. – V.68. – N.11. – P.1404–1411. 215 154. Flood J.F, Morley J.E. Learning and memory in the SAMP8 mouse // Neurosci Biobehav Rev. – 1998. – V.22. – N.1. – P.1–20. 155. Forman H.J., Ursini F., Maiorino M. An overview of mechanisms of redox signaling // J Mol Cell Cardiol. – 2014. – V.73. – P.2–9. 156. Frank B., Gupta S. A review of antioxidants and Alzheimer’s disease // Ann Clin Psychiatry. – 2005. – V.17. – N.4. – Р.269–286. 157. Frautschy S.A., Baird A., Cole G.M. Effects of injected Alzheimer β-amyloid cores in rat brain // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1991. – V.88. – N.19. – P.8362–8366. 158. Fryer J.D., Holtzman D.M. The bad seed in Alzheimer's disease // Neuron. – 2005. – V.47. – N.2. – P.167–168. 159. Fusco D., Colloca G., Lo Monaco M.R., Cesari M. Effects of antioxidant supplementation on the aging process // Clin Interv Aging. – 2007. – V.2. – N.3. – P.377–387. 160. Galvan V., Gorostiza O.F., Banwait S., Ataie M., Logvinova A.V., Sitaraman S., Carlson E., Sagi S.A., Chevallier N., Jin K., Greenberg D.A., Bredesen D.E. Reversal of Alzheimer’s-like pathology and behavior in human APP transgenic mice by mutation of Asp664 // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2006. – V.103. – N.16. – P.7130–7135. 161. Games D., Adams D., Alessandrini R., Barbour R., Berthelette P., Blackwell C., Carr T., Clemens J., Donaldson T., Gillespie F., Guido T., Hagopian S., Johnson-Wood K., Khan K., Lee M., Leibowitz P., Lieberburg I., Little S., Masliah E., McConlogue L., MontoyaZavala M., Mucke L., Paganini L., Penniman E., Power M., Schenk D., Seubert P., Snyder B., Soriano F., Tan H., Vitale J., Wadsworth S., Wolozin B., Zhao J. Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F b-amyloid precursor protein // Nature. – 1995. – V.373. – N.6514. – P.523–527. 162. Geller L.N., Potter H. Chromosome missegregation and trisomy 21 mosaicism in Alzheimer’s disease // Neurobiol Dis. – 1999. – V.6. – N.3. – P.167–179. 163. Gerich F.J., Funke F., Hildebrandt B., Fasshauer M., Müller M. H 2O2-mediated modulation of cytosolic signaling and organelle function in rat hippocampus // Pflugers Arch. – 2009. – V.458. – N.5. – Р.937–952. 164. Gervais F.G., Xu D., Robertson G.S., Vaillancourt J.P., Zhu Y., Huang J., LeBlanc A., Smith D., Rigby M., Shearman M.S., Clarke E.E., Zheng H., Van Der Ploeg L.H., Ruffolo S.C., Thornberry N.A., Xanthoudakis S., Zamboni R.J., Roy S., Nicholson D.W. Involvement 216 of caspases in proteolytic cleavage of Alzheimer’s amyloid-beta precursor protein and amyloidogenic A beta peptide formation // Cell. – 1999. – V.97. – N.3. – P.395–406. 165. Glenner G.G. Current concepts of the formation and composition of amyloid // Ann Clin Lab Sci. – 1975. – V.5. – N.4. – P.257–263. 166. Glenner G.G., Wong C.W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein // Biochem Biophys Res Commun. – 1984. – V.120. – N.3. – P.885–890. 167. Goate A., Chartier-Harlin M.C., Mullan M., Brown J., Crawford F., Fidani L., Giuffra L., Haynes A., Irving N., James L., Mant R., Newton P., Rooke K., Roques P., Talbot C., Pericak-Vance M., Roses A., Williamson R., Rossor M., Owen M., Hardy J. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer’s disease // Nature. – 1991. – V.349. – N.6311. – P.704–706. 168. Goedert M., Jakes R. Mutations causing neurodegenerative tauopathies // Biochim Biophys Acta. – 2005. – V.1739. – N.2-3. – P.240–250. 169. Gómez-Isla T., Hollister R., West H., Mui S., Growdon J.H., Petersen R.C., Parisi J.E., Hyman B.T. Neuronal loss correlates with but exceeds neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease // Ann Neurol. – 1997. – V.41. – N.1. – P.17–24. 170. Gottlieb E., Armour S.M., Harris M.H., Thompson C.B. Mitochondrial membrane potential regulates matrix configuration and cytochrome c release during apoptosis // Cell Death Differ. – 2003. – V.10. – N.6. – Р.709–717. 171. Götz J., Chen F., van Dorpe J., Nitsch R.M. Formation of neurofibrillary tangles in P301l tau transgenic mice induced by Abeta 42 fibrils // Science. – 2001. – V.293. – N.5534. – P.1491–1495. 172. Götz J., Ittner L.M. Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia // Nat Rev Neurosci. – 2008. – V.9. – N.7. – P.532–544. 173. Gouras G.K., Tampellini D., Takahashi R.H., Capetillo-Zarate E. Intraneuronal beta-amyloid accumulation and synapse pathology in Alzheimer’s disease // Acta Neuropathol. – 2010. – V.119. – N.5. – P.523–541. 174. Greenberg E.R. Vitamin E supplements: good in theory, but is the theory good? // Ann Intern Med. – 2005. – V.142. – N.1. – Р.75–76. 175. Gruber J., Schaffer S., Halliwell B. The mitochondrial free radical theory of ageing – where do we stand? // Front Biosci. – 2008. – V.13. – Р.6554–6579. 217 176. Grundman M. Vitamin E and Alzheimer’s disease: the basis for additional clinical trials // Am J Clin Nutr. – 2000. – V.71. – N.2. – P.630–636. 177. Guerreiro R., Wojtas A., Bras J., Carrasquillo M., Rogaeva E., Majounie E., Cruchaga C., Sassi C., Kauwe J.S., Younkin S., Hazrati L., Collinge J., Pocock J., Lashley T., Williams J., Lambert J.C., Amouyel P., Goate A., Rademakers R., Morgan K., Powell J., St George-Hyslop P., Singleton A., Hardy J.; Alzheimer Genetic Analysis Group. TREM2 variants in Alzheimer’s disease // N Engl J Med. – 2013. – V.368. – N.2. – P.117–127. 178. Guerreiro R., Bras J., Toombs J., Heslegrave J., Zetterberg H. Genetic Variants and Related Biomarkers in Sporadic Alzheimer's Disease // Curr Genet Med Rep. – 2015. – V.3. – P.19–25. 179. Gylys K.H., Fein J.A., Yang F., Wiley D.J., Miller C.A., Cole G.M. Synaptic changes in Alzheimer's disease: increased amyloid-beta and gliosis in surviving terminals is accompanied by decreased PSD-95 fluorescence // Am J Pathol. – 2004. – V.165. – N.5. – P.1809–1817. 180. Haass C., Selkoe D.J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide // Nat Rev Mol Cell Biol. – 2007. – V.8. – N.2. – P.101–112. 181. Halawani D., Tessier S., Anzellotti D., Bennett D.A., Latterich M., LeBlanc A.C. Identification of Caspase-6-mediated processing of the valosin containing protein (p97) in Alzheimer’s disease: a novel link to dysfunction in ubiquitin proteasome system-mediated protein degradation // J Neurosci. – 2010. – V.30. – N.17. – P.6132–6142. 182.Halloran J., Hussong S.A., Burbank R., Podlutskaya N., Fischer K.E., Sloane L.B., Austad S.N., Strong R., Richardson A., Hart M.J., Galvan V. Chronic inhibition of mammalian target of rapamycin by rapamycin modulates cognitive and non-cognitive components of behavior throughout lifespan in mice // Neuroscience. – 2012. – V.223. – P.102–113. 183. Hansen M., Chandra A., Mitic L.L., Onken B., Driscoll M., Kenyon C. A role for autophagy in the extension of lifespan by dietary restriction in C. elegans // PLoS Genet. – 2008. – V.4. – N.2. – Р. 24–28. 184. Hardy J.A., Higgins G.A. Alzheimer’s disease: the amyloid cascade hypothesis // Science. – 1992. – V.256. – N.5054. – P.184–185. 185. Hardy J., Selkoe D.J. The Amyloid Hypothesis of Alzheimer's Disease: Progress and Problems on the Road to Therapeutics // Science. – 2002. – V.297. – N.5580. – P.353–356. 218 186. Harel A., Wu F., Mattson M.P., Morris C.M., Yao P.J. Evidence for CALM in directing VAMP2 trafficking // Traffic. – 2008. – V.9. – N.3. – P.417–429. 187. Harel A., Mattson M.P., Yao P. J. CALM, a clathrin assembly protein, influences cell surface GluR2 abundance // Neuromolecular Med. – 2011. – V.13. – N.1. – P.88–90. 188. Haripriya D., Sangeetha P., Kanchana A., Balu M., Panneerselvam C. Modulation of age-associated oxidative DNA damage in rat brain cerebral cortex, striatum and hippocampus by L-carnitine // Exp Gerontol. – 2005. – V.40. – N.3. – Р.129–135. 189. Harold D., Abraham R., Hollingworth P., Sims R., Gerrish A., Hamshere M.L., Pahwa J.S., Moskvina V., Dowzell K., Williams A., Jones N., Thomas C., Stretton A., Morgan A.R., Lovestone S., Powell J., Proitsi P., Lupton M.K., Brayne C., Rubinsztein D.C., Gill M., Lawlor B., Lynch A., Morgan K., Brown K.S., Passmore P.A., Craig D., McGuinness B., Todd S., Holmes C., Mann D., Smith A.D., Love S., Kehoe P.G., Hardy J., Mead S., Fox N., Rossor M., Collinge J., Maier W., Jessen F., Schürmann B., Heun R., van den Bussche H., Heuser I., Kornhuber J., Wiltfang J., Dichgans M., Frölich L., Hampel H., Hüll M., Rujescu D., Goate A.M., Kauwe J.S., Cruchaga C., Nowotny P., Morris J.C., Mayo K., Sleegers K., Bettens K., Engelborghs S., De Deyn P.P., Van Broeckhoven C., Livingston G., Bass N.J., Gurling H., McQuillin A., Gwilliam R., Deloukas P., Al-Chalabi A., Shaw C.E., Tsolaki M., Singleton A.B., Guerreiro R., Mühleisen T.W., Nöthen M.M., Moebus S., Jöckel K.H., Klopp N., Wichmann H.E., Carrasquillo M.M., Pankratz V.S., Younkin S.G., Holmans P.A., O'Donovan M., Owen M.J., Williams J. Genome-wide association study identifies variants at CLU and PICALM associated with Alzheimer’s disease // Nat Genet. – 2009. – V.41. – N.10. – P.1088– 1093. 190. Harrison D.E., Strong R., Sharp Z.D., Nelson J.F., Astle C.M., Flurkey K., Nadon N.L., Wilkinson J.E., Frenkel K., Carter C.S., Pahor M., Javors M.A., Fernandez E., Miller R.A. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice // Nature. – 2009. – V.460. – N.7253. – Р.392–395. 191. Hemish J., Nakaya N., Mittal V., Enikolopov G. Nitric oxide activates diverse signaling pathways to regulate gene expression // J Biol Chem. – 2003. – V.278. – N.43. – Р.321–329. 192. Hernandez F., Avila J. The role of glycogen synthase kinase 3 in the early stages of Alzheimers’ disease // FEBS Lett. – 2008. – V.582. – N.28. – P.3848–3854. 219 193. Herrup K. Re-imagining Alzheimer’s disease – an age-based hypothesis // J Neurosci. – 2010. – V.30. – N.50. – P.16755–16762. 194. Hidalgo C., Carrasco M.A., Muñoz P., Núñez M.T. A role for reactive oxygen/nitrogen species and iron on neuronal synaptic plasticity // Antioxid Redox Signal. – 2007. – V.9. – N.2. – Р.245–255. 195. Hollingworth P., Harold D., Sims R., Gerrish A., Lambert J.C., Carrasquillo M.M., Abraham R., Hamshere M.L., Pahwa J.S., Moskvina V., Dowzell K., Jones N., Stretton A., Thomas C., Richards A., Ivanov D., Widdowson C., Chapman J., Lovestone S., Powell J., Proitsi P., Lupton M.K., Brayne C., Rubinsztein D.C., Gill M., Lawlor B., Lynch A., Brown K.S., Passmore P.A., Craig D., McGuinness B., Todd S., Holmes C., Mann D., Smith A.D., Beaumont H., Warden D., Wilcock G., Love S., Kehoe P.G., Hooper N.M., Vardy E.R., Hardy J., Mead S., Fox N.C., Rossor M., Collinge J., Maier W., Jessen F., Rüther E., Schürmann B., Heun R., Kölsch H., van den Bussche H., Heuser I., Kornhuber J., Wiltfang J., Dichgans M., Frölich L., Hampel H., Gallacher J., Hüll M., Rujescu D., Giegling I., Goate A.M., Kauwe J.S., Cruchaga C., Nowotny P., Morris J.C., Mayo K., Sleegers K., Bettens K., Engelborghs S., De Deyn P.P., Van Broeckhoven C., Livingston G., Bass N.J., Gurling H., McQuillin A., Gwilliam R., Deloukas P., Al-Chalabi A., Shaw C.E., Tsolaki M., Singleton A.B., Guerreiro R., Mühleisen T.W., Nöthen M.M., Moebus S., Jöckel K.H., Klopp N., Wichmann H.E., Pankratz V.S., Sando S.B., Aasly J.O., Barcikowska M., Wszolek Z.K., Dickson D.W., GraffRadford N.R., Petersen R.C.; Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative, van Duijn C.M., Breteler M.M., Ikram M.A., DeStefano A.L., Fitzpatrick A.L., Lopez O., Launer L.J., Seshadri S.; CHARGE consortium, Berr C., Campion D., Epelbaum J., Dartigues J.F., Tzourio C., Alpérovitch A., Lathrop M.; EADI1 consortium, Feulner T.M., Friedrich P., Riehle C., Krawczak M., Schreiber S., Mayhaus M., Nicolhaus S., Wagenpfeil S., Steinberg S., Stefansson H., Stefansson K., Snaedal J., Björnsson S., Jonsson P.V., Chouraki V., GenierBoley B., Hiltunen M., Soininen H., Combarros O., Zelenika D., Delepine M., Bullido M.J., Pasquier F., Mateo I., Frank-Garcia A., Porcellini E., Hanon O., Coto E., Alvarez V., Bosco P., Siciliano G., Mancuso M., Panza F., Solfrizzi V., Nacmias B., Sorbi S., Bossù P., Piccardi P., Arosio B., Annoni G., Seripa D., Pilotto A., Scarpini E., Galimberti D., Brice A., Hannequin D., Licastro F., Jones L., Holmans P.A., Jonsson T., Riemenschneider M., Morgan K., Younkin S.G., Owen M.J., O'Donovan M., Amouyel P., Williams J. Common variants at 220 ABCA7, MS4A6A/MS4A4E, EPHA1, CD33 and CD2AP are associated with Alzheimer’s disease // Nat Genet. – 2011. – V.43. – N.5. – P.429–435. 196. Hoozemans J.J., Veerhuis R., Van Haastert E.S., Rosemuller J.M., Baas F., Eikelenboom P., Scheper W. The unfolded protein response is activated in Alzheimer’s disease // Acta Neuropathol. – 2005. – V.110. – N.2. – P.165–172. 197. Hsiao K., Chapman P., Nilsen S., Eckman C., Harigaya Y., Younkin S., Yang F., Cole G. Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice // Science. – 1996. – V.274. – N.5284. – P.99–102. 198. Hsieh H., Boehm J., Sato C., Iwatsubo T., Tomita T., Sisodia S., Malinow R. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss // Neuron. – 2006. – V.52. – N.5. – P.831–843. 199. Hu Z.Y., Liu G., Cheng X.R, Huang Y., Yang S., Qiao S.Y., Sun L., Zhou W.X., Zhang Y.X. JD-30, an active fraction extracted from Danggui–Shaoyao–San, decreases βamyloid content and deposition, improves LTP reduction and prevents spatial cognition impairment in SAMP8 mice // Exp Gerontol. – 2012. – V.47. – N.1. – P.14–22. 200. Hutton M., Busfield F., Wragg M., Crook R., Perez-Tur J., Clark R.F., Prihar G., Talbot C., Philips H., Wright K., Baker M., Lendon C., Duff K., Martinez A., Houlden H., Nichols A., Karran E., Roberts G., Roques P., Rossor M., Venter J.C., Adams M.D., Cline R.T., Philips C.A., Fuldner R.A., hardy J., Goate A. Complete analysis of the presenilin 1 gene in early onset Alzheimer’s disease // Neuroreport. – 1996. – V.7. – N.3. – P.801–805. 201. Hutton M., Lendon C.L., Rizzu P., Baker M., Froelich S., Houlden H., Pickering- Brown S., Chakraverty S., Isaacs A., Grover A., Hackett J., Adamson J., Lincoln S., Dickson D., Davies P., Petersen R.C., Stevens M., de Graaff E., Wauters E., van Baren J., Hillebrand M., Joosse M., Kwon J.M., Nowotny P., Che L.K., Norton J., Morris J.C., Reed L.A., Trojanowski J., Basun H., Lannfelt L., Neystat M., Fahn S., Dark F., Tannenberg T., Dodd P.R., Hayward N., Kwok J.B., Schofield P.R., Andreadis A., Snowden J., Craufurd D., Neary D., Owen F., Oostra B.A., Hardy J., Goate A., van Swieten J., Mann D., Lynch T., Heutink P. Association of missense and 5′-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17 // Nature. – 1998. – V.393. – N.6686. – P.702–705. 202. Hyman B.T. Caspase activation without apoptosis: insight into Abeta initiation of neurodegeneration // Nat Neurosci. – 2011. – V.14. – N.1. – P.5–6. 221 203. Iijima-Ando K., Sekiya M., Maruko-Otake A., Ohtake Y., Suzuki E., Lu B., Iijima K.M. Loss of axonal mitochondria promotes tau-mediated neurodegeneration and Alzheimer’s disease-related tau phosphorylation via PAR-1 // PLoS Genet. – 2012. – V.8. – N.8. – P.1–15. – Article ID: e1002918. 204. Inestrosa N.C., Reyes A.E., Chacón M.A., Cerpa W., Villalón A., Montiel J., Merabachvili G., Aldunate R., Bozinovic F., Aboitiz F. Human-like rodent amyloid-b-peptide determines Alzheimer pathology in aged wild-type Octodon degu // Neurobiol Aging. – 2005. – V.26. – N.7. – P.1023–1028 205. Ingelsson M., Fukumoto H., Newell K.L., Growdon J.H., Hedley-Whyte E.T., Frosch M.P., Albert M.S., Hyman B.T., Irizarry M.C. Early Abeta accumulation and progressive synaptic loss, gliosis, and tangle formation in AD brain // Neurology. – 2004. – V.62. – N.6. – P.925–931. 206. Iqbal K., Wang X., Blanchard J., Grundke-Iqbal I. A non-transgenic rat model of sporadic Alzheimer’s disease. In: Avila J., Lucas J., Hernandez F., eds. Animal Models for Neurodegenerative Disease. – Royal Society of Chemistry. – 2011. – pp.274–283. 207. Iqbal K., Bolognin S., Wang X., Basurto-Islas G., Blanchard J., TungY.C. Animal models of the sporadic form of Alzheimer’s disease: focus on the disease and not just the lesions // J Alzheimers Dis. – 2013. – V.37. – N.3. – P.469–474. 208. Irizarry M.C., Soriano F., McNamara M., Page K.J., Schenk D., Games D., Human B.T. Abeta deposition is associated with neuropil changes, but not with overt neuronal loss in the human amyloid precursor protein V717F (PDAPP) transgenic mouse // J Neurosci. – 1997. – V.17. – N.18. – P.7053–7059. 209. Iwata N., Tsubuki S., Takaki Y., Shirotani K., Lu B., Gerard N.P., Gerard C., Hama E., Lee H.J., Saido T.C. Metabolic regulation of brain Abeta by neprilysin // Science. – 2001. – V.292. – N.5521. – P.1550–1552. 210. James A.M., Cocheme H.M., Smith R.A., Murphy M.P. Interactions of mitochondria-targeted and untargeted ubiquinones with the mitochondrial respiratory chain and reactive oxygen species. Implications for the use of exogenous ubiquinones as therapies and experimental tools // J Biol Chem. – 2005. – V.280. – N.22. – Р.21295–21312. 211. Janssen J.C., Beck J.A., Campbell T.A., Dickinson A., Fox N.C., Harvey R.J., Houlden H., Rossor M.N., Collinge J. Early onset familial Alzheimer’s disease:mutation frequency in 31 families // Neurology. - 2003. – V.60. – N.2. – P.235–239. 222 212. Jarero-Basulto J.J., Luna-Muñoz J., Mena R., Kristofikova Z., Ripova D., Perry G., Binder L.I., Garcia-Sierra F. Proteolytic cleavage of polymeric tau protein by caspase-3: implications for Alzheimer disease // J Neuropathol Exp Neurol. – 2013. – V.72. – N.12. – P.1145–1161. 213. Jayadev S., Leverenz J.B., Steinbart E., Stahl J., Klunk W., Yu C.E., Bird T.D. Alzheimer’s disease phenotypes and genotypes associated with mutations in presenilin 2 // Brain. – 2010. – V.133. – N.4. – P.1143–1154. 214. Jaszberenyi M., Rick F.G., Szalontay L., Block N.L., Zarandi M., Cai R.Z., Schally A.V. Beneficial effects of novel antagonists of GHRH in different models of Alzheimer's disease // Aging. – 2012. – V.4. – N.11. – P.755–767. 215. Jen Y.L., Musacchio M., Lander A.D. Glypican-1 controls brain size through regulation of fibroblast growth factor signaling in early neurogenesis // Neural Dev. – 2009. – V.4. – N.33. – P.1–19. 216. Jin K.L., Peel A.L., Mao X.O., Xie L., Cottrell B.A., Henshall D.C., Greenberg D.A. Increased hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2004. – V.101. – N.1. – P.343–347. 217. Johnson E.J. Age-related macular degeneration and antioxidant vitamins: recent findings // Curr Opin Clin Nutr Metab Care. – 2010. – V.13. – N.1. – Р.28-33. 218. Johnson S.C., Rabinovitch P.S., Kaeberlein M. mTOR is a key modulator of ageing and age-related disease // Nature. – 2013. – V.493. – N.7432. – Р.338-345. 219. Johnstone E., Chaney M.O., Norris F.H., Pascual R., Little S.P. Conservation of the sequence of the Alzheimer’s disease amyloid peptide in dog, polar bear and five other mammals by cross-species polymerase chain reaction analysis // Mol Brain Res. – 1991. – V.10. – N.4. – P.299–305. 220. Jones L., Holmans P.A., Hamshere M.L., Harold D., Moskvina V., Ivanov D., Pocklington A., Abraham R., Hollingworth P., Sims R., Gerrish A., Pahwa J.S., Jones N., Stretton A., Morgan A.R., Lovestone S., Powell J., Proitsi P., Lupton M.K., Brayne C., Rubinsztein D.C., Gill M., Lawlor B., Lynch A., Morgan K., Brown K.S., Passmore P.A., Craig D., McGuinness B., Todd S., Holmes C., Mann D., Smith A.D., Love S., Kehoe P.G., Mead S., Fox N., Rossor M., Collinge J., Maier W., Jessen F., Schürmann B., Heun R., Kölsch H., van den Bussche H., Heuser I., Peters O., Kornhuber J., Wiltfang J., Dichgans M., Frölich L., Hampel H., Hüll M., Rujescu D., Goate A.M., Kauwe J.S., Cruchaga C., Nowotny P., 223 Morris J.C., Mayo K., Livingston G., Bass N.J., Gurling H., McQuillin A., Gwilliam R., Deloukas P., Al-Chalabi A., Shaw C.E., Singleton A.B., Guerreiro R., Mühleisen T.W., Nöthen M.M., Moebus S., Jöckel K.H., Klopp N., Wichmann H.E., Rüther E., Carrasquillo M.M., Pankratz V.S., Younkin S.G., Hardy J., O'Donovan M.C., Owen M.J., Williams J. Genetic evidence implicates the immune system and cholesterol metabolism in the aetiology of Alzheimer’s disease // PLoS One. – 2010. – V.5. – N.11. – P.1–11. – Article ID: e13950. 221. Jonsson T., Atwal J.K., Steinberg S., Snaedal J., Jonsson P.V., Bjornsson S., Stefansson H., Sulem P., Gudbjardsson D., Maloney J., Hoyte K., Gustafson A., Liu Y., Lu Y., Bhangale T., Graham R.R., Huttenlocher J., Bjornsdottir G., Andreassen O.A., Jönsson E.G., Palotie A., Behrens T.W., Magnusson O.T., Kong A., Thorsteinsdottir U., Watts R.J., Stefansson K. A mutation in APP protects against Alzheimer’s disease and age-related cognitive decline // Nature. – 2012. – V.488. – N.7409. – P.96–99. 222. Jonsson T., Stefansson H., Steinberg S., Jonsdottir I., JonssonP.V., Snaedal J., Bjornsson S., Huttenlocher J., Levey A.I., Lah J.J., Rujescu D., Hampel H., Giegling I., Andreassen O.A., Engedal K., Ulstein I., Djurovic S., Ibrahim-Verbaas C., Hofman A., Ikram M.A., van Duijn C.M., Thorsteinsdottir U., Kong A., Stefansson K. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer’s disease // N Engl J Med. – 2013. – V.368. – N.2. – P.107–116. 223. Juhász G., Erdi B., Sass M., Neufeld T.P. Atg7-dependent autophagy promotes neuronal health, stress tolerance, and longevity but is dispensable for metamorphosis in Drosophila // Genes Dev. – 2007. – V.21. – N.23. – Р.3061–3066. 224. Kaarniranta K., Salminen A., Haapasalo A., Soininen H., Hiltunen M. Age-related macular degeneration (AMD): Alzheimer’s disease in the eye? // J Alzheimers Dis. – 2011. – V.24. – N.4. – P.615–631. 225. Kamat C.D., Gadal S., Mhatre M., Williamson K.S., Pye Q.N., Hensley K. Antioxidants in central nervous system diseases: preclinical promise and translational challenges // J Alzheimers Dis. – 2008. – V.15. – N.3. – P.473–493. 226. Kamboh M.I., Demirci F.Y., Wang X., Minster R.L., Carrasquillo M.M., Pankratz V.S., Younkin S.G., Saykin A.J.; Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative, Jun G., Baldwin C., Logue M.W., Buros J., Farrer L., Pericak-Vance M.A., Haines J.L., Sweet R.A., Ganguli M., Feingold E., Dekosky S.T., Lopez O.L., Barmada M.M. Genome-wide association 224 study of Alzheimer's disease // Transl Psychiatry. – 2012. – V.2. – N.5. – P.1–7. – Article ID: e117. 227. Kamenetz F., Tomita T., Hsieh H., Seabrook G., Borchelt D., Iwatsubo T., Sisodia S., Malinow R. APP processing and synaptic function // Neuron. – 2003. – V.37. – N.6. – P.925–937. 228. Kanaan N.M., Morfini G.A., LaPointe N.E., Pigino G.F., Patterson K.R., Song Y., Andreadis A., Fu Y., Brady S.T., Binder L.I. Pathogenic forms of tau inhibit kinesindependent axonal transport through a mechanism involving activation of axonal phosphotransferases // J Neurosci. – 2011. – V.31. – N.27. – P.9858–9868. 229. Kanemitsu H., Tomiyama T., Mori H. Human neprilysin is capable of degrading amyloid beta peptide not only in the monomeric form but also the pathological oligomeric form // Neurosci Lett. – 2003. – V.350. – N.2. – P.113–116. 230. Kang J., Lemaire H.G., Unterbeck A., Salbaum J.M., Masters C.L., Grzeschik K.H., Multhaup G., Beyreuther K., Müller-Hill B. The precursor of Alzheimer’s disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor // Nature. – 1987. – V.325. – N.6106. – P.733–736. 231. Kanski J., Aksenova M., Butterfield D.A. The hydrophobic environment of Met35 of Alzheimer’s Abeta(1–42) is important for the neurotoxic and oxidative properties of the peptide // Neurotox Res. – 2002. – V.4. – N.3. – P.219–223. 232. Kapay N.A., Popova O.V., Isaev N.K., Stelmashook E.V., Kondratenko R.V., Zorov D.B., Skrebitsky V.G., Skulachev V.P. Mitochondria-targeted plastoquinone antioxidant SkQ1 prevents amyloid-β-induced impairment of long-term potentiation in rat hippocampal slices // J Alzheimers Dis. – 2013. – V.36. – N.2. – P.377–383. 233. Karran E., Mercken M., De Strooper B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics // Nat Rev Drug Discov. – 2011. – V.10. – N.9. – P.698–712. 234. Katsuse O., Lin W.L., Lewis J., Hutton M.L., Dickson D.W. Neurofibrillary tangle-related synaptic alterations of spinal motor neurons of P301L tau transgenic mice // Neurosci Lett. – 2006. – V.409. – N.2. – P.95–99. 235. Katzman R. The prevalence and malignancy of Alzheimer disease: a major killer // Arch Neurol. – 1976. – V.33. – N.4. – P.217–218. 225 236. Kauwe J.S., Jacquart S., Chakraverty S., Wang J., Mayo K., Fagan A.M., Holtzman D.M., Morris J.C., Goate A.M. Extreme cerebrospinal fluid amyloid beta levels identify family with late-onset Alzheimer’s disease presenilin 1 mutation // Ann Neurol. – 2007. – V.61. – N.5. – P.446–453. 237. Kayed R., Head E., Thompson J.L., McIntire T.M., Milton S.C., Cotman C.W., Glabe C.G. Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis // Science. – 2003. – V.300. – N.5618. – P.486–489. 238. Kelso G.F., Porteous C.M., Coulter C.V., Hughes G., Porteous W.K., Ledgerwood E.C., Smith R.A., Murphy M.P. Selective targeting of a redox-active ubiquinone to mitochondria within cells: antioxidant and antiapoptotic properties // J Biol Chem. – 2001. – V.276. – N.7. – Р.4588–4596. 239. Kemper A.G., Weissmann C., Golovyashkina N., Sebö-Lemke Z., Drewes G., Gerke V., Heinisch J.J., Brandt R. The frontotemporal dementia mutation R406W blocks tau's interaction with the membrane in an annexin A2-dependent manner // J Cell Biol. – 2011. – V.192. – N.4. – P.647–661. 240. Kerrigan T.L., Atkinson L., Peers C., Pearson H.A. Modulation of 'A'-type K+ current by rodent and human forms of amyloid beta protein // Neuroreport. – 2008. – V.19. – N.8. – P.839–843. 241. Khlistunova I., Biernat J., Wang Y., Pickhardt M., von Bergen M., Gazova Z., Mandelkow E., Mandelkow E.M. Inducible expression of Tau repeat domain in cell models of tauopathy: aggregation is toxic to cells but can be reversed by inhibitor drugs // J Biol Chem. – 2006. – V.281. – N.2. – P.1205–1214. 242. Kilbride S.M., Telford J.E., Tipton K.F., Dave G.P. Partial inhibition of complex I activity increases Ca-independent glutamate release rates from depolarized synaptosomes // J Neuroehem. – 2008. – V.106. – N.2. – Р.826–834. 243. Kim W.R., Sun W. Programmed cell death during postnatal development of the rodent nervous system // Dev Growth Differ. – 2011. – V.53. – N.2. – P.225–235. 244. Kinnula V.L., Soini Y., Kvist-Mäkelä K., Savolainen E.R., Koistinen P. Antioxidant defense mechanisms in human neutrophils // Antioxid Redox Signal. – 2002. – V.4. – N.1. – Р.27–34. 245. Klein W.L., Krafft G.A., Finch C.E. Targeting small Abeta oligomers: the solution to an Alzheimer’s disease conundrum? // Trends Neurosci. – 2001. V.24. – N.4. – P.219–224. 226 246. Klunk W.E., Engler H., Nordberg A., Wang Y., Blomqvist G., Holt D.P., Bergström M., Savitcheva I., Huang G.F., Estrada S., Ausén B., Debnath M.L., Barletta J., Price J.C., Sandell J., Lopresti B.J., Wall A., Koivisto P., Antoni G., Mathis S.A., Långström B. Imaging brain amyloid in Alzheimer’s disease with Pittsburgh compound-B // Ann Neurol. – 2004. – V.55. – N.3. – P.306–319. 247. Klyubin I., Betts V., Welzel A.T., Blennow K., Zetterberg H., Wallin A., Lemere C.A., Cullen W.K., Peng Y., Wisniewski T., Selkoe D.J., Anwyl R., Walsh D.M., Rowan M.J. Amyloid beta protein dimer-containing human CSF disrupts synaptic plasticity: prevention by systemic passive immunization // J Neurosci. – 2008. – V.28. – N.16. – P.4231–4237. 248. Kobayashi N., Machida T., Takahashi T., Takatsu H., Shinkai T., Abe K. Urano S. Elevation by oxidative stress and aging of hypothalamic-pituitary-adrenal activity in rats and its prevention by vitamin E // J Clin Biochem Nutr. – 2009. – V.45. – N.2. – Р.207–213. 249. Koffie R.M., Meyer-Luehmann M., Hashimoto T., Adams K.W., Mielke M.L., Garcia-Alloza M., Micheva K.D., Smith S.J., Kim M.L., Lee V.M., Hyman B.T., Spires-Jones T.L. Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2009. – V.106. – N.10. – P.4012–4017. 250. Koffie R.M., Hyman B.T., Spires-Jones T.L. Alzheimer’s disease: synapses gone cold // Mol Neurodegener. – 2011. – V.6. – N.1. – P.63. 251. Koffie R.M., Hashimoto T., Tai H.C., Kay K.R., Serrano-Pozo A., Joyner D., Hou S., Kopeikina K.J., Frosch M.P., Lee V.M., Holtzman D.M., Hyman B.T., Spires-Jones T.L. Apolipoprotein E4 effects in Alzheimer’s disease are mediated by synaptotoxic oligomeric amyloid-β // Brain. – 2012. – V.135. – Pt.7. – P.2155–2168. 252. Kolosova N.G., Shcheglova T.V., Amstislavskaya T.G., Loskutova L.V. Comparative analysis of LPO products in brain structures of Wistar and OXYS rats of different age // Bull Exp Biol Med. – 2003. – V.135. – N.6. – P.593–596. 253. Kolosova N.G., Shcheglova T.V., Sergeeva S.V., Loskutova L.V. Long-term antioxidant supplementation attenuates oxidative stress markers and cognitive deficits in senescent-accelerated OXYS rats // Neurobiol Aging. – 2006. – V.27. – N.9. – Р.1289–1297. 254. Kolosova N.G., Stefanova N.A., Sergeeva S.V. OXYS rats: a prospective model for evaluation of antioxidant availability in prevention and therapy of accelerated aging and 227 age-related cognitive decline. In: Gariépy Q. and Ménard R., eds. – Handbook of Cognitive Aging: Causes, Processes. – NY: Nova Science Publishers. – 2009. – P.472. – pp.47–82. 255. Kolosova N.G., Muraleva N.A., Zhdankina A.A., Stefanova N.A., Fursova A.Z., Blagosklonny M.V. Prevention of age-related macular degeneration-like retinopathy by rapamycin in rats // Am J Pathol. – 2012. – V.181. – N.2. – P.472–477. 256. Korbolina E.E., Kozhevnikova O.S., Stefanova N.A., Kolosova N.G. Quantitative trait loci on chromosome 1 for cataract and AMD-like retinopathy in senescence-accelerated OXYS rats // Aging (Albany NY). – 2012. – V.4. – N.1. – P.49–59. 257. Kovacs D.M., Fausett H.J., Page K.J., Kim T.W., Moir R.D., Merriam D.E., Hollister R.D., Hallmark O.G., Mancini R., Felsenstein K.M., Hyman B.T., Tanzi R.E., Wasco W. Alzheimer-associated presenilins 1 and 2: neuronal expression in brain and localization to intracellular membranes in mammalian cells // Nat Med. – 1996. – V.2. – N.2. – P.224–229. 258. Kowaltowski A.J., Castilho R.F., Vercesi A.E. Mitochondrial permeability transition and oxidative stress // FEBS Lett. – 2001. – V.495. – N.1-2. – P.12–15. 259. Kozhevnikova O.S., Korbolina E.E., Ershov N.I., Kolosova N.G. Rat retinal transcriptome: effects of aging and AMD-like retinopathy // Cell Cycle. – 2013a. – V.12. – N.11. – P.1745–1761. 260. Kozhevnikova O.S., Korbolina E.E., Stefanova N.A., Muraleva N.A., Orlov Y.L., Kolosova N.G. Association of AMD-like retinopathy development with an Alzheimer’s disease metabolic pathway in OXYS rats // Biogerontology. – 2013b. – V.14. – N.6. – P.753– 762. 261. Kraemer K., Packer L., Rimbach G. Molecular aspects of lipoic acid in the prevention of diabetes complications // Nutrition. – 2001. – V.17. – N.10. – Р.888–895. 262. Kraska A., Dorieux O., Picq J.L., Petit F., Bourrin E., Chenu E., Volk A., Perret M., Hantraye P., Mestre-Frances N., Aujard F., Dhenain M. Age-associated cerebral atrophy in mouse lemur primates // Neurobiol Aging. – 2011. – V.32. – N.5. – P.894–906. 263. Kregel K.C., Zhang H.J. An integrated view of oxidative stress in aging: basic mechanisms, functional effects, and pathological considerations // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. – 2007. – V.292. – N.1. – Р.18–36. 264. Krishnadev N., Meleth A.D., Chew E.Y. Nutritional supplements for age-related macular degeneration // Curr Opin Ophthalmol. – 2010. – V.21. – N.3. – Р.184–189. 228 265. Krishnan K., Ratnaike T., De Gruyter H., Jaros E., Turnbull D. Mitochondrial DNA deletions cause the biochemical defect observed in Alzheimer’s disease // Neurobiol Aging. – 2012. – V.33. – N.9. – P.2210–2214. 266. Krstic D., Madhusudan A., Doehner J., Vogel P., Notter T., Imhof C., Manalastas A., Hilfiker M., Pfister S., Schwerdel C., Riether C., Meyer U., Knuesel I. Systemic immune challenges trigger and drive Alzheimer-like neuropathology in mice // J Neuroinflammation. – 2012. – V.9. – P.151. 267. Krstic D., Knuesel I. Deciphering the mechanism underlying late-onset Alzheimer disease // Nat Rev Neurol. – 2013. – V.9. – N.1. – P.25–34. 268. Kuchibhotla K.V., Goldman S.T., Lattarulo C.R., Wu H.Y., Hyman B.T., Bacskai B.J. Abeta plaques lead to aberrant regulation of calcium homeostasis in vivo resulting in structural and functional disruption of neuronal networks // Neuron. – 2008. – V.59. – N.2. – P.214–225. 269. Kumar S., Walter J. Phosphorylation of amyloid beta (Aβ) peptides – a trigger for formation of toxic aggregates in Alzheimer’s disease // Aging (Albany NY). – 2011. – V.3. – N.8. – P.803–812. 270. Kuo Y.M., Crawford F., Mullan M., Kokjohn T.A., Emmerling M.R., Weller R.O., Roher A.E. Elevated A beta and apolipoprotein E in A betaPP transgenic mice and its relationship to amyloid accumulation in Alzheimer's disease // Mol Med. – 2000. – V.6. – N.5. – P.430–439. 271. Lacor P.N., Buniel M.C., Chang L., Fernandez S.J., Gong Y., Viola K.L., Lambert M.P., Velasco P.T., Bigio E.H., Finch C.E., Krafft G.A., Klein W.L. Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid beta oligomers // J Neurosci. – 2004. – V.24. – N.45. – P.10191– 10200. 272. Lacor P.N., Buniel M.C., Furlow P.W., Clemente A.S., Velasco P.T., Wood M., Viola K.L., Klein W.L. Abeta oligomer-induced aberrations in synapse composition, shape, and density provide a molecular basis for loss of connectivity in Alzheimer's disease // J Neurosci. – 2007. – V.27. – N.4. – P.796–807. 273. LaDu M.J., Shah J.A., Reardon C.A., Getz G.S., Bu G., Hu J., Guo L., van Eldik L.J. Apolipoprotein E receptors mediate the effects of beta-amyloid on astrocyte cultures // J Biol Chem. – 2000. – V.275. – N.43. – P.33974–33980. 229 274. Lambeth J.D. Nox enzymes, ROS, and chronic disease: an example of antagonistic pleiotropy // Free Radic Biol Med. – 2007. – V.43. – N.3. – Р.332–347. 275. Languille S., Blanc S., Blin O., Canale C.I., Dal-Pan A., Devau G., Dhenain M., Dorieux O., Epelbaum J., Gomez D., Hardy I., Henry P.Y., Irving E.A., Marchal J., MestreFrancés N., Perret M., Picq J.L., Pifferi F., Rahman A., Schenker E., Terrien J., Théry M., Verdier J.M., Aujard F. The grey mouse lemur: a non human primate model for ageing studies // Ageing Res Rev. – 2012. – V.11. – N.1. – P.150–162. 276. Laurijssens B., Aujard F., Rahman A. Animal models of Alzheimer’s disease and drug development // Drug Discov Today Technol. – 2013. – V.10. – N.3. – P.e319–e327. 277. Lee C.S., Han E.S., Han Y.S., Bang H. Differential effect of calmodulin antagonists on MG132-induced mitochondrial dysfunction and cell death in PC 12 cells // Brain Res Bull. – 2005. – V.67. – N.3. – Р.225–234. 278. Lee K.W., Kim J.B., Seo J.S., Kim T.K., Im J.Y., Baek I.S., Kim K.S., Lee J.K., Han P.L. Behavioral stress accelerates plaque pathogenesis in the brain of Tg2576 mice via generation of metabolic oxidative stress // J Neurochem. – 2009. – V.108. – N.1. – P.165–175. 279. Lee M.S., Kwon Y.T., Li M., Peng J., Friedlander R.M., Tsai L.H. Neurotoxicity induces cleavage of p35 to p25 by calpain // Nature. – 2000. – V.405. – N.6784. – P.360–364. 280. Lee S.H., Kim K.R., Ryu S.Y., Son S., Hong H.S., Mook-Jung I., Lee S.H., Ho W.K. Impaired short-term plasticity in mossy fiber synapses caused by mitochondrial dysfunction of dentate granule cells is the earliest synaptic deficit in a mouse model of Alzheimer's disease // J Neurosci. – 2012. – V.32. – N.17. – P.5953–5963. 281. Lee V.M., Goedert M., Trojanowski J.Q. Neurodegenerative tauopathies // Annu Rev Neurosci. – 2001. – V.24. – P.1121–1159. 282. Leissring M.A., Farris W., Chang A.Y., Walsh D.M., Wu X., Sun X., Frosch M.P., Selkoe D.J. Enhanced proteolysis of beta-amyloid in APP transgenic mice prevents plaque formation, secondary pathology, and premature death // Neuron. – 2003. – V.40. – N.6. – P.1087–1093. 283. Leuner K., Müller W., Reichert A. From mitochondrial dysfunction to amyloid beta formation: novel insights into the pathogenesis of Alzheimer’s disease // Mol Neurobiol. – 2012. – V.46. – N.1. – P.186–193. 284. Levy-Lahad E., Wasco W., Poorkaj P., Romano D.M., Oshima J., Pettingell W.H., Yu C.E., Jondro P.D., Schmidt S.D., Wang K., Crowley A.C., Fu Y.H., Guenette S.Y., Galas 230 D., Nemens E., Wijsman E.M., Bird T.D., Schellenberg G.D., Tanzi R.E. Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimer’s disease locus // Science. – 1995. – V.269. – N.5226. – P.973–977. 285. Lewis J., Dickson D.W., Lin W.L., Chisholm L., Corral A., Jones G., Yen S.H., Sahara N., Skipper L., Yager D., Eckman C., Hardy J., Hutton M., McGowan E. Enhanced neurofibrillary degeneration in transgenic mice expressing mutant tau and APP // Science. – 2001. – V.293. – N.5534. – P.1487–1491. 286. Li E., Kim D.H., Cai M., Lee S., Kim Y., Lim E., Ryu J.H., Unterman T.G., Park S. Hippocampus-dependent spatial learning and memory are impaired in growth hormonedeficient spontaneous dwarf rats // Endocr J. – 2011. – V.58. – N.4. – P.257–267. 287. Li S., Hong S., Shepardson N.E., Walsh D.M., Shankar G.M., Selkoe D. Soluble oligomers of amyloid Beta protein facilitate hippocampal long-term depression by disrupting neuronal glutamate uptake // Neuron. – 2009. – V.62. – N.6. – P.788–801. 288. Li S., Jin M., Koeglsperger T., Shepardson N.E., Shankar G.M., Selkoe D.J. Soluble Abeta oligomers inhibit long-term potentiation through a mechanism involving excessive activation of extrasynaptic NR2B-containing NMDA receptors // J Neurosci. – 2011. – V.31. – N.18. – P.6627–6638. 289. Li Y., Schellhorn H.E. Can ageing-related degenerative diseases be ameliorated through administration of vitamin C at pharmacological levels? // Med Hypotheses. – 2007. – V.68. – N.6. – Р.1315–1317. 290. Liberman E.A., Topali V.P., Tsofina L.M., Jasaitis A.A., Skulachev V.P. Ion transport and electrical potential of mitochondrial membranes // Biokhimia. – 1969. – V.34. – N.5. – Р.1083–1087. 291. Liberman E.A., Skulachev V.P. Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. IV. General discussion // Biochim Biophys Acta. – 1970. – V.216. – N.1. – Р.30– 42. 292. Lindner A.B., Demarez A. Protein aggregation as a paradigm of aging // Biochim Biophys Acta. – 2009. – V.90. – N.10. – Р.980–996. 293. Lindquist S.G., Holm I.E., Schwartz M., Law I., Stokholm J., Batbayli M., Waldemar G., Nielsen J.E. Alzheimer disease-like clinical phenotype in a family with FTDP17 caused by a MAPT R406W mutation // Eur J Neurol. – 2008. – V.15. – N.4. – P.377–385. 231 294. Lionaki E., Tavernarakis N. Oxidative stress and mitochondrial protein quality control in aging // J Proteomics. – 2013. – V.92. – P.181–194. 295. Liu J., Head E., Gharib A.M., Yuan W., Ingersoll R.T., Hagen T.M. Cotman C.W., Ames B.N. Memory loss in old rats is associated with brain mitochondrial decay and RNA/DNA oxidation: partial reversal by feeding acetyl-L-carnitine and/or R-α-lipoic acid // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2002. – V.99. – N.4. – Р.2356–2361. 296. Liu X., Jiang N., Hughes B., Bigras E., Shoubridge E., Hekimi S. Evolutionary conservation of the clk-1-dependent mechanism of longevity: loss of mclk1 increases cellular fitness and lifespan in mice // Genes Dev. – 2005. – V.19. – N.20. – Р.2424–2434. 297. Lloret A., Badía M.C., Mora N.J., Pallardó F.V., Alonso M.D., Viña J. Vitamin E paradox in alzheimer’s disease: it does not prevent loss of cognition and may even be detrimental // J Alzheimers Dis. – 2009. – V.17. – N.1. – P.143–149. 298. Lobato K.R., Cardoso C.C., Binfaré R.W., Budni J., Wagner C.L., Brocardo P.S., de Souza L.F., Brocardo C., Flesch S., Freitas A.E., Dafré A.L., Rodrigues A.L. АlphaTocopherol administration produces an antidepressant-like effect in predictive animal models of depression // Behav Brain Res. – 2010. – V.209. – N.2. – Р.249–259. 299. López Salon M., Morelli L., Castano E.M., Soto E.F., Pasquini J.M. Defective ubiquitination of cerebral proteins in Alzheimer’s disease // J Neurosci Res. – 2000. – V.62. – N.2. – P.302–310. 300. Lu C., Zhang D., Whiteman M., Armstrong J.S. Is antioxidant potential of the mitochondrial targeted ubiquinone derivative MitoQ conserved in cells lacking mtDNA? // Antioxid Redox Signal. – 2008. – V.10. – N.3. – P.651–660. 301. Lu Q., Wood J.G. Functional studies of Alzheimer’s disease tau proteins // J Neurosci. – 1993. – V.13. – N.2. – P.508–515. 302. Luo F., Rustay N.R., Ebert U., Hradil V.P., Cole T.B., Llano D.A., Mudd S.R., Zhang Y., Fox G.B., Day M. Characterization of 7- and 19-month-old Tg2576 mice using multimodal in vivo imaging: limitations as a translatable model of Alzheimer's disease // Neurobiol Aging. – 2012. – V.33. – N.5. – P.933–944. 303. Ma T., Hoeffer C.A., Wong H., Massaad C.A., Zhou P., Iadecola C., Murphy M.P., Pautler R.G., Klann E. Amyloid β-induced impairments in hippocampal synaptic plasticity are rescued by decreasing mitochondrial superoxide // J Neurosci. – 2011. – V.31. – N.15. – P.5589–5595. 232 304. Maeda N., Ishii M., Nishimura K., Kamimura K. Functions of chondroitin sulfate and heparan sulfate in the developing brain // Neurochem. Res. – 2011. – V.36. – N.7. – P.1228–1240. 305. Mahley R.W. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology // Science. – 1988. – V.240. – N.4852. – P.622–630. 306. Mahley R.W., Huang Y. Alzheimer disease: multiple causes, multiple effects of apolipoprotein E4, and multiple therapeutic approaches // Ann Neurol. – 2009. – V.65. – N.6. – P.623–625. 307. Manahan-Vaughan D., Schwegler H. Strain-dependent variations in spatial learning and in hippocampal synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely behaving rats // Front Behav Neurosci. – 2011. – V.5. – N.7. – P.1–9. 308. Manaye K.F., Mouton P.R., Xu G., Drew A., Lei D.L., Sharma Y., Rebeck G.W, Turner S. Age-related loss of noradrenergic neurons in the brains of triple transgenic mice // Age (Dordr). – 2013. – V.35. – N.1. – P.139–147. 309. Manczak M., Anekonda T.S., Henson E., Park B.S., Quinn J., Reddy P.H. Mitochondria are a direct site of A beta accumulation in Alzheimer's disease neurons: implications for free radical generation and oxidative damage in disease progression // Hum Mol Genet. – 2006. – V.15. – N.9. – P.1437–1449. 310. Manczak M., Mao P., Calkins M., Cornea A., Reddy A.P., Murphy M.P., Szeto H.H., Park B., Reddy P.H. Mitochondria-targeted antioxidants protects against Abeta toxicity in Alzheimer’s disease neurons // J Alzheimers Dis. – 2010. – V.20. – S.2. – P.S609–S631. 311. Manczak M., Calkins M.J., Reddy P.H. Impaired mitochondrial dynamics and abnormal interaction of amyloid beta with mitochondrial protein Drp1 in neurons from patients with Alzheimer's disease: implications for neuronal damage // Hum Mol Genet. – 2011. – V.20. – N.13. – P.2495–2509. 312. Markova E.V., Obukhova L.A., Kolosova N.G. Parameters of cell immune response in Wistar and OXYS rats and their behavior in the open field test // Bull Exp Biol Med. – 2003. – V.136. – N.3. – P.588–590. 313. Markovets A.M., Fursova A.Z., Kolosova N.G. Therapeutic action of the mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 on retinopathy in OXYS rats linked with improvement of VEGF and PEDF gene expression // PLoS One. – 2011. – V.6. – N.7. – P.1–8. – Article ID: e21682. 233 314. Massaad C.A., Pautler R.G., Klann E. Mitochondrial superoxide: a key player in Alzheimer's disease // Aging (Albany NY). – 2009. – V.1. – N.9. – P.758–761. 315. Matsubara E., Soto C., Governale S., Frangione B., Ghiso J. Apolipoprotein J and Alzheimer’s amyloid beta solubility // Biochem J. – 1996. – V.316. – N.2. – P.671–679. 316. Mattson M.P., LaFerla P.M., Chan S.L., Leissring M., Shepel P.N., Geiger J.D. Calcium signaling in the ER: its role in neuronal plasticity and neurodegenerative disorders // Trends Neurosci. – 2000. – V.23. – N.5. – Р.222–229. 317. Mattsson N., Tabatabaei S., Johansson P., Hansson O., Andreasson U., Mansson J.E., Johansson J.O., Olsson B., Wallin A., Svensson J., Blennow K., Zetterberg H. Cerebrospinal fluid microglial markers in Alzheimer’s disease: elevated chitotriosidase activity but lack of diagnostic utility // Neuromolecular Med. – 2011. – V.13. – N.2. – P.151–159. 318. Mattsson N., Insel P., Nosheny R., Zetterberg H., Trojanowski J.Q., Shaw L.M., Tosun D., Weiner M. CSF protein biomarkers predicting longitudinal reduction of CSF βamyloid42 in cognitively healthy elders // Transl Psychiatry. – 2013. – V.3. – P.1–8. – Article ID: e293. 319. Mawuenyega K.G., Sigurdson W., Ovod V., Munsell L., Kasten T., Morris J.C., Yarasheski K.E., Bateman R.J. Decreased Clearance of CNS beta-Amyloid in Alzheimer's Disease // Science. – 2010. – V.330. – N.6012. – P.1–4. – Article ID: 1774. 320. forebrain Mestre N., Bons N. Age-related cytological changes and neuronal loss in basal cholinergic neurons in Microcebus murinus (Lemurian, Primate) // Neurodegeneration. – 1993. – V.2. – P.25–32. 321. Meziane H., Dodart J.C., Mathis C., Little S., Clemens J., Paul S.M., Ungerer A. Memory-enhancing effects of secreted forms of the beta-amyloid precursor protein in normal and amnestic mice // Proc Natl Acad Sci USA. – 1998. – V.95. – N.21. – P.12683–12688. 322. Molinari M., Eriksson K.K., Ca-lanca V., Galli C., Cresswell P., Michalak M., Helenius A. Contrasting functions of calreticulin and calnexin in glycoprotein folding and ER quality control // Mol Cell. – 2004. – V.13. – N.1. – P.125–135. 323. Montiel T., Quiroz-Baez R., Massieu L., Arias C. Role of oxidative stress on β- amyloid neurotoxicity elicited during impairment of energy metabolism in the hippocampus: protection by antioxidants // Exp Neurol. – 2006. – V.200. – N.2. – P.496–508. 234 324. Moreira P.I., Honda K., Liu Q., Santos M.S., Oliveira C.R., Aliev G., Nunomura A., Zhu X., Smith M.A., Perry G. Oxidative stress: the old enemy in Alzheimer’s disease pathophysiology // Curr Alzheimer Res. – 2005. – V.2. – N.4. – P.403–408. 325. Morley J.E., Farr S.A., Banks W.A., Johnson S.N., Yamada K.A., Xu L. A physiological role for amyloid-beta protein:enhancement of learning and memory // J Alzheimers Dis. – 2010. – V.19. – N.2. – P.441–449. 326. Morley J.E., Armbrecht H.J., Farr S.A., Kumar V.B. The senescence accelerated mouse (SAMP8) as a model for oxidative stress and Alzheimer's disease // Biochim Biophys Acta. – 2012. – V.1822. – N.5. – P.650–656. 327. Morris M.C., Evans D.A., Bienias J.L., Tangney C.C., Bennett D.A., Aggarwal N., Wilson R.S., Scherr P.A. Dietary intake of antioxidant nutrients and the risk of incident Alzheimer disease in a biracial community study // JAMA. – 2002. – V.287. – N.24. – P.3230– 3237. 328. Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat // J Neurosci Methods. – 1948. – V.11. – N.1. – P.47–60. 329. Moya K.L., Benowitz L.I., Schneider E., Allinquant B. The amyloid precursor protein is developmentally regulated and correlated with synaptogenesis // Dev Biol. – 1994. – V.161. – N.2. – P.597–603. 330. Mu Y.L., Gage F.H. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease // Mol Neurodegener. – 2011. – V.6. – N.85. – P.1–9. 331. Muraleva N.A., Ofitserov E.N., Tikhonov V.P., Kolosova N.G. Efficacy of glucosamine alendronate alone & in combination with dihydroquercetin for treatment of osteoporosis in animal model // Indian J Med Res. – 2012. – V.135. – P.221–227. 332. Murphy M.P., Smith R.A. Drug delivery to mitochondria: the key to mitochondrial medicine // Adv Drug Deliv Rev. – 2000. – V.41. – N.2. – P.235–250. 333. Murphy M.P., Smith R.A. Targeting antioxidants to mitochondria by conjugation to lipophilic cations // Annu Rev Pharmacol Toxicol. – 2007. – V.47. – Р.629–656. 334. Naj A.C., Jun G., Beecham G.W., Wang L.S., Vardarajan B.N., Buros J., Gallins P.J., Buxbaum J.D., Jarvik G.P., Crane P.K., Larson E.B., Bird T.D., Boeve B.F., GraffRadford N.R., De Jager P.L., Evans D., Schneider J.A., Carrasquillo M.M., Ertekin-Taner N., Younkin S.G., Cruchaga C., Kauwe J.S., Nowotny P., Kramer P., Hardy J., Huentelman M.J., Myers A.J., Barmada M.M., Demirci F.Y., Baldwin C.T., Green R.C., Rogaeva E., St George- 235 Hyslop P., Arnold S.E., Barber R., Beach T., Bigio E.H., Bowen J.D., Boxer A., Burke J.R., Cairns N.J., Carlson C.S., Carney R.M., Carroll S.L., Chui H.C., Clark D.G., Corneveaux J., Cotman C.W., Cummings J.L., DeCarli C., DeKosky S.T., Diaz-Arrastia R., Dick M., Dickson D.W., Ellis W.G., Faber K.M., Fallon K.B., Farlow M.R., Ferris S., Frosch M.P., Galasko D.R., Ganguli M., Gearing M., Geschwind D.H., Ghetti B., Gilbert J.R., Gilman S., Giordani B., Glass J.D., Growdon J.H., Hamilton R.L., Harrell L.E., Head E., Honig L.S., Hulette C.M., Hyman B.T., Jicha G.A., Jin L.W., Johnson N., Karlawish J., Karydas A., Kaye J.A., Kim R., Koo E.H., Kowall N.W., Lah J.J., Levey A.I., Lieberman A.P., Lopez O.L., Mack W.J., Marson D.C., Martiniuk F., Mash D.C., Masliah E., McCormick W.C., McCurry S.M., McDavid A.N., McKee A.C., Mesulam M., Miller B.L., Miller C.A., Miller J.W., Parisi J.E., Perl D.P., Peskind E., Petersen R.C., Poon W.W., Quinn J.F., Rajbhandary R.A., Raskind M., Reisberg B., Ringman J.M., Roberson E.D., Rosenberg R.N., Sano M., Schneider L.S., Seeley W., Shelanski M.L., Slifer M.A., Smith C.D., Sonnen J.A., Spina S., Stern R.A., Tanzi R.E., Trojanowski J.Q., Troncoso J.C., Van Deerlin V.M., Vinters H.V., Vonsattel J.P., Weintraub S., Welsh-Bohmer K.A., Williamson J., Woltjer R.L., Cantwell L.B., Dombroski B.A., Beekly D., Lunetta K.L., Martin E.R., Kamboh M.I., Saykin A.J., Reiman E.M., Bennett D.A., Morris J.C., Montine T.J., Goate A.M., Blacker D., Tsuang D.W., Hakonarson H., Kukull W.A., Foroud T.M., Haines J.L., Mayeux R., Pericak-Vance M.A., Farrer L.A., Schellenberg G.D. Common variants at MS4A4/MS4A6E, CD2AP, CD33 and EPHA1 are associated with lateonset Alzheimer’s disease // Nat Genet. – 2011. – V.43. – N.5. – P.436–441. 335. Nakashima H., Ishihara T., Yokota O., Terada S., Trojanowski J.Q., Lee V.M., Kuroda S. Effects of alpha-tocopherol on an animal model of tauopathies // Free Rad Biol Med. – 2004. – V.37. – N.2. – P.176–186. 336. Navarro A., Boveris A. Brain mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Parkinson's disease // J Bioenerg Biomembr. – 2009. – V.41. – N.6. – Р.517–521. 337. Neha, Sodhi R.K., Jaggi A.S., Singh N. Animal models of dementia and cognitive dysfunction // Life Sci. – 2014. – V.109. – N.2. – P.73–86. 338.Niccoli T., Partridge L. Ageing as a risk factor for disease // Curr Biol. – 2012. – V.22. – N.17. – R741-52. doi: 10.1016/j.cub.2012.07.024. 339. Niki E., Noguchi N., Tsuchihashi H., Gotoh N. Interaction among vitamin C, vitamin E, and β-carotene // Am J Clin Nutr. – 1995. – V.62. – N.6. – P.1322S–1326S. 236 340. Nilius B., Droogmans G. Ion channels and their functional role in vascular endothelium // Physiol Rev. – 2001. – V.81. – N.4. – Р.1415–1459. 341. Nilsberth C., Westlind-Danielsson A., Eckman C.B., Condron M.M., Axelman K., Forsell C., Stenh C., Luthman J., Teplow D.B., Younkin S.G., Näslund J., Lannfelt L. The “Arctic” APP mutation (E693G) causes Alzheimer’s disease by enhanced Aβ protofibril formation // Nat Neurosci. – 2001. – V.4. – N.9. – P.887–893. 342. Nones J., Stipursky J., Costa S.L., Gomes F.C. Flavonoids and astrocytes crosstalking: implications for brain development and pathology // Neurochem Res. – 2010. – V.35. – N.7. – Р.955–966. 343. O’Brien R., Wong P.C. Amyloid Precursor Protein Processing and Alzheimer’s Disease // Annu Rev Neurosci. – 2011. – V.34. – P.185–204. 344. Obukhova L.A., Skulachev V.P., Kolosova N.G. Mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 inhibits age-dependent involution of the thymus in normal and senescenceprone rats // Aging (Albany NY). – 2009. – V.1. – N.4. – Р.389–401. 345. Oddo S., Caccamo A., Kitazawa M., Tseng B.P., LaFerla F.M. Amyloid deposition precedes tangle formation in a triple transgenic model of Alzheimer’s disease // Neurobiol Aging. – 2003a. – V.24. – N.8. – P.1063–1070. 346. Oddo S., Caccamo A., Shepherd J.D., Murphy M.P., Golde T.E., Kayed R., Metherate R., Mattson M.P., Akbari Y., LaFerla F.M. Triple-transgenic model of Alzheimer’s disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction // Neuron. – 2003b. – V.39. – N.3. – P.409–421. 347. Oddo S., Billings L., Kesslak J.P., Cribbs D.H., LaFerla F.M. Abeta immunotherapy leads to clearance of early, but not late, hyperphosphorylated tau aggregates via the proteasome // Neuron. – 2004. – V.43. – N.3. – P.321–332. 348. Oddo S., Caccamo A., Cheng D., Jouleh B., Torp R., LaFerla F.M. Genetically augmenting tau levels does not modulate the onset or progression of Abeta pathology in transgenic mice // J Neurochem. – 2007. – V.102. – N.4. – P.1053–1063. 349. Oh S., Hong H.S., Hwang E., Sim H.J., Lee W., Shin S.J., Mook-Jung I. Amyloid peptide attenuates the proteasome activity in neuronal cells // Mech Ageing Dev. – 2005. – V.126. – N.12. – P.1292–1299. 237 350. Ohno M., Chang L., Tseng W., Oakley H., Citron M., Klein W.L., Vassar R., Disterhoft J.F. Temporal memory deficits in Alzheimer's mouse models: rescue by genetic deletion of BACE1 // Eur J Neurosci. – 2006. – V.23. – N.1. – P.251–260. 351. Palacios H.H., Yendluri B.B., Parvathaneni K., Shadlinski V.B., Obrenovich M.E., Leszek J., Gokhman D., Gąsiorowski K., Bragin V., Aliev G. Mitochondrion-specific antioxidants as drug treatments for Alzheimer disease // CNS Neurol Disord Drug Targets. – 2011. – V.10. – N.2. – P.149–162. 352. Papa S., Skulachev V.P. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging // Mol Cell Biochem. – 1997. – V.174. – N.1-2. – Р.305–319. 353. Parent A.T., Thinakaran G. Modeling presenilin-dependent familial Alzheimer's disease: emphasis on presenilin substrate-mediated signaling and synaptic function // Int J Alzheimers Dis. – 2010. – V.2010. – P.1–11. – Article ID: 825918. 354. Parihar M.S., Brewer G.J. Amyloid-β as a modulator of synaptic plasticity // J Alzheimers Dis. – 2010. – V.22. – N.3. – P.741–763. 355. Park K.W., Lee D.Y., Joe E.H., Kim S.U., Jin B.K. Neuroprotective role of microglia expressing interleukin-4 // J Neurosci Res. – 2005. – V.81. – N.3. – P.397–402. 356. Patterson C., Feightner J.W., Garcia A., Hsiung G.Y.R., MacKnight C., Sadovnick A.D. Diagnosis and treatment of dementia: 1. Risk assessment and primary prevention of Alzheimer disease // CMAJ. – 2008. – V.178. – N.5. – P.548–556. 357. Pavlik V.N., Doody R.S., Rountree S.D., Darby E.J. Vitamin E use is associated with improved survival in an Alzheimer’s disease cohort // Dement Geriatr Cogn Disord. – 2009. – V.28. – N.6. – P.536–540. 358. Perry E.K., Johnson M., Ekonomou A., Perry R.H., Ballard C., Attems J. Neurogenic abnormalities in Alzheimer's disease differ between stages of neurogenesis and are partly related to cholinergic pathology // Neurobiol Dis. – 2012. – V.47. – N.2. – P.155–162. 359. Picq J.L. Aging affects executive functions and memory in mouse lemur primates // Exp Gerontol. – 2007. – V.42. – N.3. – P.223–232. 360. Picq J.L., Aujard F., Volk A., Dhenain M. Age-related cerebral atrophy in nonhuman primates predicts cognitive impairments // Neurobiol Aging. – 2012. – V.33. – N.6. – P.1096–1109 361. Pimplikar S.W. Reassessing the amyloid cascade hypothesis of Alzheimer’s disease // Int J Biochem Cell Biol. – 2009. – V.41. – N.6. – P.1261–1268. 238 362. Pimplikar S.W., Nixon R.A., Robakis N.K., Shen J., Tsai L.H. Amyloid- independent mechanisms in Alzheimer’s disease pathogenesis // J Neurosci. – 2010. – V.30. – N.45. – P.14946–14954. 363. Piotrowski P., Wierzbicka K., Smialek M. Neuronal death in the rat hippocampus in experimental diabetes and cerebral ischaemia treated with antioxidants // Folia Neuropathol. – 2001. – V.39. – N.3. – Р.147–154. 364. Plotnikov E.Y., Silachev D.N., Jankauskas S.S., Rokitskaya T.I., Chupyrkina A.A., Pevzner I.B., Zorova L.D., Isaev N.K., Antonenko Y.N., Skulachev V.P., Zorov D.B. Mild uncoupling of respiration and phosphorylation as a mechanism providing nephro- and neuroprotective effects of penetrating cations of the SkQ family // Biochemistry (Mosc). – 2012. – V.77. – N.9. – P.1029–1037. 365. Pluta R., Furmaga-Jabłońska W., Maciejewski R., Ułamek-Kozioł M., Jabłoński M. Brain ischemia activates β- and γ-secretase cleavage of amyloid precursor protein: Significance in sporadic Alzheimer’s disease // Mol Neurobiol. – 2013. – V.47. – N.1. – P.425–434. 366. Poon H.F., Calabrese V., Scapagnini G., Butterfield D.A. Free radicals: key to brain aging and heme oxygenase as a cellular response to oxidative stress // J Gerontol A Biol Sci Med Sci. – 2004a. – V.59. – N.5. – P.478–493. 367. Poon H.F., Calabrese V., Scapagnini G., Butterfield D.A. Free radicals and brain aging // Clin Geriatr Med. – 2004b. – V.20. – N.2. – P.329–359. 368. Pratico D., Delanty N. Oxidative injury in diseases of the central nervous system: focus on Alzheimer's disease // Am J Med. – 2000. – V.109. – N.7. – P.577–585. 369. Price J.L., McKeel D.W. Jr, Buckles V.D., Roe C.M., Xiong C., Grundman M., Hansen L.A., Petersen R.C., Parisi J.E., Dickson D.W., Smith C.D., Davis D.G., Schmitt F.A., Markesbery W.R., Kaye J., Kurlan R., Hulette C., Kurland B.F., Higdon R., Kukull W., Morris J.C. Neuropathology of nondemented aging: presumptive evidence for preclinical Alzheimer disease // Neurobiol Aging. – 2009. – V.30. – N.7. – P.1026–1036. 370. Priller C., Bauer T., Mitteregger G., Krebs B., Kretzschmar H.A., Herms J. Synapse formation and function is modulated by the amyloid precursor protein // J Neurosci. – 2006. – V.26. – N.27. – P.7212–7221. 371. Probst A., Götz J., Wiederhold K.H., Tolnay M., Mistl C., Jaton A.L., Hong M., Ishihara T., Lee V.M., Trojanowski J.Q., Jakes R., Crowther R.A., Spillantini M.G., Bürki K., 239 Goedert M. Axonopathy and amyotrophy in mice transgenic for human four-repeat tau protein // Acta Neuropathol. – 2000. – V.99. – N.5. – P.469–481. 372. Qiu W.Q., Walsh D.M., Ye Z., Vekrellis K., Zhang J., Podlisny M.B., Rosner M.R., Safavi A., Hersh L.B., Selkoe D.J. Insulin-degrading enzyme regulates extracellular levels of amyloid beta-protein by degradation // J Biol Chem. – 1998. – V.273. – N.49. – P.32730–32738. 373. Qu J., Nakamura T., Cao G., Holland E., McKercher S., Lipton S. S-Nitrosylation activates Cdk5 and contributes to synaptic spine loss induced by beta-amyloid peptide // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2011. – V.108. – N.34. – P.14330–14335. 374. Querfurth H.W., LaFerla F.M. Alzheimer's disease // N Engl J Med. – 2010. – V.362. – N.4. – P.329–344. 375. Quinn J.F., Bussiere J.R., Hammond R.S., Montine T.J., Henson E., Jones R.E., Stackman R.W. Jr. Chronic dietary α-lipoic acid reduces deficits in hippocampal memory of aged Tg2576 mice // Neurobiol Aging. – 2007. – V.28. – N.2. – P.213–225. 376. Rapoport M., Dawson H.N., Binder L.I., Vitek M.P., Ferreira A. Tau is essential to beta-amyloid-induced neurotoxicity // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2002. – V.99. – N.9. – P.6364–6369. 377. Raux G., Guyant-Marґechal L., Martin C., Bou J., Penet C., Brice A., Hannequin D., Frebourg T., Campion D. Molecular diagnosis of autosomal dominant early onset Alzheimer’s disease: an update // J Med Genet. – 2005. – V.42. – N.10. – P.793–795. 378. Reczek C.R., Chandel N.S. ROS-dependent signal transduction // Curr Opin Cell Biol. – 2014. – V.33. – P.8–13. 379. Reddy P.H. Mitochondrial dysfunction in aging and Alzheimer’s disease: strategies to protect neurons // Antioxid Redox Signal. – 2007. – V.9. – N.16. – Р.1647–1658. 380. Reddy P.H., Beal M.F. Amyloid beta, mitochondrial dysfunction and synaptic damage: implications for cognitive decline in aging and Alzheimer's disease // Trends Mol Med. – 2008. – V.14. – N.2. – P.45–53. 381. Reitz C. Alzheimer’s disease and the amyloid cascade hypothesis: a critical review // Int J Alzheimers Dis. – 2012. – V.2012. – P.1–11. – Article ID: 369808. 382. Ren Z., Ding W., Su Z., Gu X., Huang H., Liu J., Yan Q., Zhang W., Yu X. Mechanisms of brain injury with deep hypothermic circulatory arrest and protective effects of coenzyme Q10 // J Thorac Cardiovasc Surg. – 1994. – V.108. – N.1. – Р.126–133. 240 383. Rhein V., Song X., Wiesner A., Ittner L.M., Baysang G., Meier F., Ozmen L., Bluethmann H., Drose S., Brandt U., Savaskan E., Czech C., Gotz J., Eckert A. Amyloid-β and tau synergistically impair the oxidative phosphorylation system in triple transgenic Alzheimer's disease mice // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2009. – V.106. – N.47. – P.20057– 20062. 384. Ridge P.G., Ebbert M.T., Kauwe J.S. Genetics of Alzheimer’s disease // Biomed Res Int. – 2013. – V.2013. – P.1-13. – Article ID: 254954. 385. Rijal Upadhaya A., Capetillo-Zarate E., Kosterin I., Abramowski D., Kumar S., Yamaguchi H., Walter J., Fändrich M., Staufenbiel M., Thal D.R. // Dispersible amyloid βprotein oligomers, protofibrils, and fibrils represent diffusible but not soluble aggregates: their role in neurodegeneration in amyloid precursor protein (APP) transgenic mice // Neurobiol Aging. – 2012. – V.33. – N.11. – P.2641–2660. 386. Rissman R.A., Poon W.W., Blurton-Jones M., Oddo S., Torp R., Vitek M.P., LaFerla F.M., Rohn T.T., Cotman C.V. Caspase-cleavage of tau is an early event in Alzheimer disease tangle pathology // J Clin Invest. – 2004. – V.114. – N.1. – P.121–130. 387. Ristow M., Zarse K. How increased oxidative stress promotes longevity and metabolic health: The concept of mitochondrial hormesis (mitohormesis) // Exp Gerontol. – 2010. – V.45. – N.6. – Р.410–418. 388. Roch J.M., Masliah E., Roch-Levecq A.C., Sundsmo M.P., Otero D.A., Veinbergs I., Saitoh T. Increase of synaptic density and memory retention by a peptide representing the trophic domain of the amyloid beta/A4 protein precursor // Proc Natl Acad Sci USA. – 1994. – V.91. – N.16. – P.7450–7454. 389. Rogaev E.I., Sherrington R., Wu C., Levesque G., Liang Y., Rogaeva E.A., Ikeda M., Holman K., Lin C., Lukiw W.J., de Jong P.J., Fraser P.E., Rommens J.M., St GeorgeHyslop P. Analysis of the 5' sequence, genomic structure, and alternative splicing of the presenilin-1 gene (PSEN1) associated with early onset Alzheimer disease // Genomics. – 1997. – V.40. – N.3. – P.415–424. 390. Rohn T.T., Vyas V., Hernandez-Estrada T., Nichol K.E., Christie L.A., Head E. Lack of pathology in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease after overexpression of the anti-apoptotic protein Bcl-2 // J Neurosci. – 2008. – V.28. – N.12. – P.3051–3059. 241 391. Rohn T.T., Head E. Caspases as therapeutic targets in Alzheimer’s disease: Is it time to “cut” to the chase? // Int J Clin Exp Pathol. – 2009. – V.2. – N.2. – P.108–18. 392. Rohn T.T., Kokoulina P., Eaton C.R., Poon W.W. Caspase activation in transgenic mice with Alzheimer-like pathology: results from a pilot study utilizing the caspase inhibitor, Q-VD-OPh // Int J Clin Exp Med. – 2009. – V.2. – N.4. – P.300–308. 393. Romano A.D., Serviddio G., de Matthaeis A., Bellanti F., Vendemiale G. Oxidative stress and aging // J Nephrol. – 2010. – V.15. – Р.29–36. 394. Roselli F., Tirard M., Lu J., Hutzler P., Lamberti P., Livrea P., Morabito M., Almeida O.F. Soluble beta-amyloid1-40 induces NMDA-dependent degradation of postsynaptic density-95 at glutamatergic synapses // J Neurosci. – 2005. – V.25. – N.48. – P.11061–11070. 395. Roth M., Tomlinson B.E., Blessed G. Correlation between scores for dementia and counts of 'senile plaques' in cerebral grey matter of elderly subjects // Nature. – 1966. – V.209. – N.5018. – P.109–110. 396. Rovio S., Kåreholt I., Helkala E.L., Viitanen M., Winblad B., Tuomilehto J., Soininen H., Nissinen A., Kivipelto M. Leisure-time physical activity at midlife and the risk of dementia and Alzheimer’s disease // Lancet Neurol. – 2005. – V.4. – N.11. – P.705–711. 397. Rudnitskaya E.A., Maksimova K.Y., Muraleva N.A., Logvinov S.V., Yanshole L.V., Kolosova N.G, Stefanova N.A. Beneficial effects of melatonin in a rat model of sporadic Alzheimer’s disease // Biogerontology. – 2015a. – V.16. – N.3. – P.303–316. 398. Rudnitskaya E.A., Muraleva N.A., Maksimova K.Y., Kiseleva E., Kolosova N.G, Stefanova N.A. Melatonin attenuates memory impairment, amyloid-β accumulation, and neurodegeneration in a rat model of sporadic Alzheimer’s disease // J Alzheimers Dis. – 2015b. – DOI: 10.3233/JAD-150161. 399. Rykova V.I., Leberfarb E.Y., Stefanova N.A., Shevelev O.B., Dymshits G.M., Kolosova N.G. Brain proteoglycans in postnatal development and during behavior decline in senescence-accelerated OXYS rats // Adv Gerontol. – 2011. – V.24. – N.2. – P.234–243. 400. Sadowski M., Pankiewicz J., Scholtzova H., Mehta P.D., Prelli F., Quartermain D., Wisniewski T. Blocking the apolipoprotein E/amyloid-beta interaction as a potential therapeutic approach for Alzheimer's disease // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2006. – V.103. – N.49. – P.18787–18792. 242 401. Saito Y., Sano Y., Vassar R., Gandy S., Nakaya T., Yamamoto T., Suzuki T. X11 proteins regulate the translocation of amyloid beta-protein precursor (APP) into detergentresistant membrane and suppress the amyloidogenic cleavage of APP by beta-site-cleaving enzyme in brain // J Biol Chem. – 2008. – V.283. – N.51. – P.35763–35771. 402. Salganik R.I., Solovyova N.A., Dikalov S.I., Grishaeva O.N., Semenova L.A., Popovsky A.V. Inherited enhancement of hydroxyl radical generation and lipid peroxidation in the S strain rats results in DNA rearrangements, degenerative diseases, and premature aging // Biochem Biophys Res Commun. – 1994. – V.199. – N.2. – P.726–733. 403. Saprunova V.B., Lelekova M.A., Kolosova N.G., Bakeeva L.E. SkQ1 slows development of age-dependent destructive processes in retina and vascular layer of eyes of Wistar and OXYS rats // Biochemistry (Mosc). – 2012. – V.77. – N.6. – P.648–658. 404. Scheff S.W., Price D.A., Schmitt F.A., DeKosky S.T., Mufson E.J. Synaptic alterations in CA1 in mild Alzheimer disease and mild cognitive impairment // Neurology. – 2007. – V.68. – N.18. – P.1501–1508. 405. Scheff S.W., Neltner J.H., Nelson P.T. Is synaptic loss a unique hallmark of Alzheimer's disease? // Biochem Pharmacol. – 2014. – V.88. – N.4. – P.517–528. 406. Schellenberg G.D., Bird T.D., Wijsman E.M., Orr H.T., Anderson L., Nemens E., White J.A., Bonnycastle L., Weber J.L., Alonso M.E., Potter H., Heston L.L., Martin G.M. Genetic linkage evidence for a familial Alzheimer’s disease locus on chromosome 14 // Science. – 1992. – V.258. – N.5082. – P.668–671. 407. Schmitz C., Rutten B.P., Pielen A., Schäfer S., Wirths O., Tremp G., Czech C., Blanchard V., Multhaup G., Rezaie P., Korr H., Steinbusch H.W., Pradier L., Bayer T.A. Hippocampal neuron loss exceeds amyloid plaque load in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease // Am J Pathol. – 2004. – V.164. – N.4. – P.1495–1502. 408. Schrijvers E.M.C., Koudstaal P.J., Hofman A., Breteler M.M.B. Plasma clusterin and the risk of Alzheimer disease // JAMA. – 2011. – V.305. – N.13. – P.1322–1326. 409. Schwab C., Hosokawa M., McGeer P.L. Transgenic mice overexpressing amyloid beta protein are an incomplete model of Alzheimer disease // Exp Neurol. – 2004. – V.188. – N.1. – P.52–64. 410. Scialo F., Mallikarjun V., Stefanatos R., Sanz A. Regulation of lifespan by the mitochondrial electron transport chain: reactive oxygen species-dependent and reactive oxygen 243 species-independent mechanisms // Antioxid Redox Signal. – 2013. – V.19. – N.16. – P.1953– 1969. 411. Selkoe D.J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy // Physiol Rev. – 2001. – V.81. – N.2. – P.741–766. 412. Selkoe D.J. Alzheimer's disease is a synaptic failure // Science. – 2002. – V.298. – N.5594. – P.789–791. 413. Selkoe D.J. Soluble oligomers of the amyloid beta-protein impair synaptic plasticity and behavior // Behav Brain Res. – 2008. – V.192. – N.1. – P.106–113. 414. Sergeeva S., Bagryanskaya E., Korbolina E., Kolosova N. Development of behavioural dysfunctions in accelerated-senescence OXYS rats is associated with early postnatal alterations in brain phosphate metabolism // Exp Gerontol. – 2006. – V.41. – N.2. – P.141–150. 415. Seshadri S., Fitzpatrick A.L., Ikram M.A., DeStefano A.L., Gudnason V., Boada M., Bis J.C., Smith A.V., Carassquillo M.M., Lambert J.C., Harold D., Schrijvers E.M., Ramirez-Lorca R., Debette S., Longstreth W.T. Jr, Janssens A.C., Pankratz V.S., Dartigues J.F., Hollingworth P., Aspelund T., Hernandez I., Beiser A., Kuller L.H., Koudstaal P.J., Dickson D.W., Tzourio C., Abraham R., Antunez C., Du Y., Rotter J.I., Aulchenko Y.S., Harris T.B., Petersen R.C., Berr C., Owen M.J., Lopez-Arrieta J., Varadarajan B.N., Becker J.T., Rivadeneira F., Nalls M.A., Graff-Radford N.R., Campion D., Auerbach S., Rice K., Hofman A., Jonsson P.V., Schmidt H., Lathrop M., Mosley T.H., Au R., Psaty B.M., Uitterlinden A.G., Farrer L.A., Lumley T., Ruiz A., Williams J., Amouyel P., Younkin S.G., Wolf P.A., Launer L.J., Lopez O.L., van Duijn C.M., Breteler M.M.; CHARGE Consortium; GERAD1 Consortium; EADI1 Consortium. Genomewide analysis of genetic loci associated with Alzheimer disease // JAMA. – 2010. – V.303. – N.18. – P.1832–1840. 416. Shahpasand K., Uemura I., Saito T., Asano T., Hata K., Shibata K., Toyoshima Y., Hasegawa M., Hisanaga S. Regulation of mitochondrial transport and inter-microtubule spacing by tau phosphorylation at the sites hyperphosphorylated in Alzheimer’s disease // J Neurosci. – 2012. – V.32. – N.7. – P.2430–2441. 417. Shankar G.M., Bloodgood B.L., Townsend M., Walsh D.M., Selkoe D.J., Sabatini B.L. Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway // J Neurosci. – 2007. – V.27. – N.11. – P.2866–2875. 244 418. Shankar G.M., Li S., Mehta T.H., Garcia-Munoz A., Shepardson N.E., Smith I., Brett F.M., Farrell M.A., Rowan M.J., Lemere C.A., Regan C.M., Walsh D.M., Sabatini B.L., Selkoe D.J. Amyloid-β protein dimers isolated directly from Alzheimer’s brains impair synaptic plasticity and memory // Nat Med. – 2008. – V.14. – N.8. – P.837–842. 419. Shemesh O.A., Erez H., Ginzburg I., Spira M.E. Tau-induced traffic jams reflect organelles accumulation at points of microtubule polar mismatching // Traffic. – 2008. – V.9. – N.4. – P.458–471. 420. Sheng M., Sabatini B.L., Südhof T.C. Synapses and Alzheimer’s disease // Cold Spring Harb Perspect Biol. – 2012. – V.4. – N.5. – P.1–18. – Article ID: a005777. 421. Sherrington R., Froelich S., Sorbi S., Campion D., Chi H., Rogaeva E.A., Levesque G., Rogaev E.I., Lin C., Liang Y., Ikeda M., Mar L., Brice A., Agid Y., Percy M.E., Clerget-Darpoux F., Piacentini S., Marcon G., Nacmias B., Amaducci L., Frebourg T., Lannfelt L., Rommens J.M., St George-Hyslop P.H. Alzheimer’s disease associated with mutations in presenilin 2 is rare and variably penetrant // Hum Mol Genet. – 1996. – V.5. – N.7. – P.985–988. 422. Sherrington R., Rogaev E.I., Liang Y., Rogaeva E.A., Levesque G., Ikeda M., Chi H., Lin C., Li G., Holman K., Tsuda T., Mar L., Foncin J.F., Bruni A.C., Montesi M.P., Sorbi S., Rainero I., Pinessi L., Nee L., Chumakov I., PollenD., Brookes A., Sanseau P., Polinsky R.J., Wasco W., Da Silva H.A.R., Haines J.L., Pericak-Vance M.A., Tanzi R.E., Roses A.D., Fraser P.E., Rommens J.M., St George-Hyslop P.H. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease // Nature. – 1995. – V.375. – N.6534. – P.754–760. 423. Shi H., Belbin O., Medway C., Brown K., Kalsheker N., Carrasquillo M., Proitsi P., Powell J., Lovestone S., Goate A., Younkin S., Passmore P.; Genetic and Environmental Risk for Alzheimer's Disease Consortium, Morgan K.; Alzheimer's Research UK Consortium. Genetic variants influencing human aging from late-onset Alzheimer's disease (LOAD) genome-wide association studies (GWAS) // Neurobiol Aging. – 2012. – V.33. – N.8. – P.1– 28. 424. Shibata M., Lu T., Furuya T., Degterev A., Mizushima N., Yoshimori T., MacDonald M., Yankner B., Yuan J. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1 // J Biol Chem. – 2006. – V.281. – N.20. – Р.14474–14485. 245 425. Shin W.H., Lee D.Y., Park K.W., Kim S.U., Yang M.S., Joe E.H., Jin B.K. Microglia expressing interleukin-13 undergo cell death and contribute to neuronal survival in vivo // Glia. – 2004. – V.46. – N.2. – P.142–152. 426. Shinohara M., Fujioka S., Murray M.E., Wojtas A., Baker M., Rovelet-Lecrux A., Rademakers R., Das P., Parisi J.E., Graff-Radford N.R., Petersen R.C., Dickson D.W., Bu G. Regional distribution of synaptic markers and APP correlate with distinct clinicopathological features in sporadic and familial Alzheimer's disease // Brain. – 2014. – V.137. – N.5. – P.1533–1549. 427. Shukitt-Hale B., Cheng V., Joseph J.A. Effects of blackberries on motor and cognitive function in aged rats // Nutr Neurosci. – 2009. – V.12. – N.3. – Р.135–140. 428. Siedlak S.L., Casadesus G., Webber K.M., Pappolla M.A., Atwood C.S., Smith M.A., Perry G. Chronic antioxidant therapy reduces oxidative stress in a mouse model of Alzheimer’s disease // Free Radic Res. – 2009. – V.43. – N.2. – P.156–164. 429. Sierra A., Gottfried-Biackmore A.C., McEwen B.S., Bulloch A. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile // Glia. – 2007. – V.55. – N.4. – Р.412–424. 430. Simpson F., Hussain N.K., Qualmann B., Kelly R.B., Kay B.K., McPherson P.S., Schmid S.L. SH3-domain-containing proteins function at distinct steps in clathrin-coated vesicle formation // Nat Cell Biol. – 1999. – V.1. – N.2. – P.119–124. 431. Skulachev M.V., Antonenko Y.N., Anisimov V.N., Chernyak B.V., Cherepanov D.A., Chistyakov V.A., Egorov M.V., Kolosova N.G., Korshunova G.A., Lyamzaev K.G., Plotnikov E.Y., Roginsky V.A., Savchenko A.Y., Severina I.I., Severin F.F., Shkurat T.P., Tashlitsky V.N., Shidlovsky K.M., Vyssokikh M.Y., Zamyatnin A.A., Zorov D.B., Skulachev V.P. Mitochondrial-targeted plastoquinone derivatives. Effect on senescence and acute agerelated pathologies // Curr Drug Targets. – 2011. – V.12. – N.6. – P.800–826. 432. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics // Biochim Biophys Acta. – 1998. – V.1363. – N.2. – Р.100–124. 433. Skulachev V.P., Anisimov V.N., Antonenko Y.N., Bakeeva L.E., Chernyak B.V., Erichev V.P., Filenko O.F., Kalinina N.I., Kapelko V.I., Kolosova N.G., Kopnin B.P., Korshunova G.A., Lichinitser M.R., Obukhova L.A., Pasyukova E.G., Pisarenko O.I., Roginsky V.A., Ruuge E.K., Senin I.I., Severina I.I., Skulachev M.V., Spivak I.M., Tashlitsky V.N., Tkachuk V.A., Vyssokikh M.Y., Yaguzhinsky L.S., Zorov D.B. An attempt to prevent 246 senescence: a mitochondrial approach // Biochim Biophys Acta. – 2009. – V.1787. – N.5. – Р.437–461. 434. Skulachev V.P., Antonenko Y.N., Cherepanov D.A., Chernyak B.V., Izyumov D.S., Khailova L.S., Klishin S.S., Korshunova G.A., Lyamzaev K.G., Pletjushkina O.Y., Roginsky V.A., Rokitskaya T.I., Severin F.F., Severina I.I., Simonyan R.A., Skulachev M.V., Sumbatyan N.V., Sukhanova E.I., Tashlitsky V.N., Trendeleva T.A., Vyssokikh M.Y., Zvyagilskaya R.A. Prevention of cardiolipin oxidation and fatty acid cycling as two antioxidant mechanisms of cationic derivatives of plastoquinone (SkQs) // Biochim Biophys Acta. – 2010. – V.1797. – N.6–7. – P.878–889. 435. Skulachev V.P. Mitochondria-targeted antioxidants as promising drugs for treatment of age-related brain diseases // J Alzheimers Dis. – 2012. – V.28. – N.2. – P.283– 289. 436. Smith J.M., Pilati C.F. Effect of massive sympathetic nervous system activation on coronary blood flow and myocardial energy pool // Exp Biol Med (Maywood). – 2002. – V.227. – N.2. – Р.125–132. 437. Smith R.A., Porteous C.M., Coulter C.V., Murphy M.P. Selective targeting of an antioxidant to mitochondria // Eur J Biochem. –1999. – V.263. – N.3. – Р.709–716. 438. Snyder E.M., Nong Y., Almeida C.G., Paul S., Moran T., Choi E.Y., Nairn A.C., Salter M.W., Lombroso P.J., Gouras G.K., Greengard P. Regulation of NMDA receptor trafficking by amyloid-beta // Nat Neurosci. – 2005. – V.8. – N.8. – P.1051–1058. 439. Song B., Davis K., Liu X.S., Lee H.G., Smith M., Liu X. Inhibition of Polo-like kinase 1 reduces beta-amyloid-induced neuronal cell death in Alzheimer's disease // Aging. – 2011. – V.3. – N.9. – P.846–851. 440.Spilman P., Podlutskaya N., Hart M.J., Debnath J., Gorostiza O., Bredesen D., Richardson A., Strong R., Galvan V. Inhibition of mTOR by rapamycin abolishes cognitive deficits and reduces amyloid-beta levels in a mouse model of Alzheimer's disease // PLoS One. – 2010. – V.5. – N.4. – e9979. doi: 10.1371/journal.pone.0009979. 441. Spires T.L., Meyer-Luehmann M., Stern E.A., McLean P.J., Skoch J., Nguyen P.T., Bacskai B.J., Hyman B.T. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy // J Neurosci. – 2005. – V.25. – N.31. – P.7278–7287. 247 442. Spires-Jones T.L., de Calignon A., Matsui T., Zehr C., Pitstick R., Wu H.Y., Osetek J.D., Jones P.B., Bacskai B.J., Feany M.B., Carlson G.A., Ashe K.H., Lewis J., Hyman B.T. In vivo imaging reveals dissociation between caspase activation and acute neuronal death in tangle-bearing neurons // J Neurosci. – 2008. – V.28. – N.4. – P.862–867 443. Spires-Jones T.L., Stoothoff W.H., de Calignon A., Jones P.B., Hyman B.T. Tau pathophysiology in neurodegeneration: a tangled issue // Trends Neurosci. – 2009. – V.32. – N.3. – P.150–159. 444. Spires-Jones T.L., Hyman B.T. The intersection of amyloid beta and tau at synapses in Alzheimer's disease. // Neuron. – 2014. – V.82. – N.4. – P.756–771. 445. St George-Hyslop P., Haines J., Rogaev E., Mortilla M., Vaula G., Pericak-Vance M., Foncin J.F., Montesi M., Bruni A., Sorbi S., Rainero I., Pinessi L., Pollen D., Polinsky R., Nee L., Kennedy J., Macciardi F., Rogaeva E., Liang Y., Alexandrova N., Lukiw W., Schlumpf K., Tanzi R., Tsuda T., Farrer L., Cantu J.M., Duara R., Amaducci L., Bergamini L., Gusella J., Roses A., Crapper McLachlan D. Genetic evidence for a novel familial Alzheimer’s disease locus on chromosome 14 // Nat Genet. – 1992. – V.2. – N.4. – P.330–334. 446. Staehelin H.B. Micronutrients and Alzheimer’s disease // Proc Nutr Soc. – 2005. – V.64. – N.4. – P.565–570. 447. Stanga S., Lanni C., Govoni S., Uberti D., D'Orazi G., Racchi M. Unfolded p53 in the pathogenesis of Alzheimer's disease: is HIPK2 the link? // Aging. – 2010. – V.2. – N.9. – P.545–554. 448. Starkov A.A. The role of mitochondria in reactive oxygen species metabolism and signaling // Ann N Y Acad Sci. – 2008. – V.47. – Р.37–52. 449. Stefanova N.A., Fursova A., Kolosova N.G. Behavioral effects induced by mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 in Wistar and senescence-accelerated OXYS rats // J Alzheimers Dis. – 2010. – V.21. – N.2. – P.479–491. 450. Stefanova N.A., Fursova A.Z., Sarsenbaev K.N., Kolosova N.G. Effects of Cistanche deserticola on behavior and signs of cataract and retinopathy in senescenceaccelerated OXYS rats // J Ethnopharmacol. – 2011. – V.138. – N.2. – P.624–632. 451. Stefanova N.A., Kozhevnikova O.S., Vitovtov A.O., Maksimova K.Y., Logvinov S.V., Rudnitskaya E.A., Korbolina E.E., Muraleva N.A., Kolosova N.G. Senescenceaccelerated OXYS rats: A model of age-related cognitive decline with relevance to abnormalities in Alzheimer disease // Cell Cycle. – 2014a. – V.13. – N.6. – P.898–909. 248 452. Stefanova N.A., Muraleva N.A., Skulachev V.P., Kolosova N.G. Alzheimer's disease-like pathology in senescence-accelerated OXYS rats can be partially retarded with mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 // J Alzheimers Dis. – 2014b. – V.38. – N.3. – P.681– 694. 453. Stefanova N.A., Maksimova K.Y., Kiseleva E., Rudnitskaya E.A., Muraleva N.A., Kolosova N.G. Melatonin attenuates impairments of structural hippocampal neuroplasticity in OXYS rats during active progression of Alzheimer’s disease-like pathology // J Pineal Res. – 2015b. – DOI: 10.1111/jpi.12248. 454. Stefanova N.A., Muraleva N.A., Korbolina E.E., Kiseleva E., Maksimova K.Y., Kolosova N.G. Amyloid accumulation is a late event in sporadic Alzheimer's disease-like pathology in nontransgenic rats // Oncotarget. – 2015a. – V.6. – N.3. – P.1396–1413. 455. Steiner H., Winkler E., Edbauer D., Prokop S., Basset G., Yamasaki A., Kostka M., Haass C. PEN-2 is an integral component of the γ-secretase complex required for coordinated expression of presenilin and nicastrin // J Biol Chem. – 2002. – V.277. – N.42. – P.39062–39065. 456. Streit W.J., Braak H., Xue Q.S., Bechmann I. Dystrophic (senescent) rather than activated microglial cells are associated with tau pathology and likely precede neurodegeneration in Alzheimer's disease // Acta neuropathol. – 2009. – V.118. – N.4. – P.475–485. 457. Streit W.J., Xue Q.S. Alzheimer's disease, neuroprotection, and CNS immunosenescence // Front Pharmacol. – 2012. – V.3. – N.138. – P.1–7. 458. Sturchler-Pierrat C., Staufenbiel M. Pathogenic mechanisms of Alzheimer's disease analyzed in the APP23 transgenic mouse model // Ann N Y Acad Sci. – 2000. – V.920. – P.134–139. 459. Szabò I, Leanza L, Gulbins E, Zoratti M. Physiology of potassium channels in the inner membrane of mitochondria // Pflugers Arch. – 2012. – V.463. – P.231–246. 460. Sullivan P.G., Dragiceric V.B., Deng J.H., Bai Y., Dimayuga E., Ding Q., Chen Q., Bruce-Keller A.J., Keller J.N. Proteasome inhibition alters neural mitochondrial homeostasis and mitochondria turnover // J Biol Chem. – 2004. – V.279. – N.20. – Р.699–707. 461. Sung S., Yao Y., Uryu K., Yang H., Lee V.M., Trojanowski J.Q., Praticò D. Early vitamin E supplementation in young but not aged mice reduces Abeta levels and amyloid 249 deposition in a transgenic model of Alzheimer’s disease // FASEB J. – 2004. – V.18. – N.2. – P.323–325. 462. Swerdlow R.H., Khan S.M. A “mitochondrial cascade hypothesis” for sporadic Alzheimer's disease // Med Hypotheses. – 2004. – V.63. – N.1. – P.8–20. 463. Swerdlow R.H., Burns J.M., Khan S.M. The Alzheimer's disease mitochondrial cascade hypothesis: progress and perspectives // Biochim Biophys Acta. – 2014. – V.42. – N.8. – P.1219–1231. 464. Tabaton M., Zhu X., Perry G., Smith M.A., Giliberto L. Signaling effect of amyloid-beta(42) on the processing of AbetaPP // Exp Neurol. – 2010. – V.221. – N.1. – P.18– 25. 465. Takatsu H., Owada K., Abe K., Nakano M., Urano S. Effect of vitamin E on learning and memory deficit in aged rats // J Nutr Sci Vitaminol. – 2009. – V.55. – N.5. – Р.389–393. 466. Takeda T. Senescence-accelerated mouse (SAM): a biogerontological resource in aging research // Neurobiol Aging. – 1999. – V.20. – N.2. – P.105–110. 467. Takeda T. Senescence-accelerated mouse (SAM) with special references to neurodegeneration models, SAMP8 and SAMP10 mice // Neurochem Res. – 2009. – V.34. – N.4. – Р.639–659. 468. Tan L., Yu J.T., Zhang W., Wu Z.C., Zhang Q., Liu Q.Y., Wang W., Wang H.F., Ma X.Y., Cui W.Z. Association of GWAS-linked loci with late-onset Alzheimer's disease in a northern Han Chinese population // Alzheimers Dement. – 2013. – V.9. – N.5. – P.546–553. 469. Tanaka N., Abe-Dohmae S., Iwamoto N., Fitzgerald M.L., Yokoyama S. Helical apolipoproteins of high-density lipoprotein enhance phagocytosis by stabilizing ATP-binding cassette transporter A7 // J Lipid Res. – 2010. – V.51. – N.9. – P.2591–2599. 470. Tanisawa K., Mikami E., Fuku N., Honda Y., Honda S., Ohsawa I., Ito M., Endo S., Ihara K., Ohno K., Kishimoto Y., Ishigami A., Maruyama N., Sawabe M., Iseki H., Okazaki Y., Hasegawa-Ishii S., Takei S., Shimada A., Hosokawa M., Mori M., Higuchi K., Takeda T., Higuchi M., Tanaka M. Exome sequencing of senescence-accelerated mice (SAM) reveals deleterious mutations in degenerative disease-causing genes // BMC genomics. – 2013. – V.14. – N.248.- P.1–15. 471. Tanzi R.E., Bertram L. Twenty years of the Alzheimer’s disease amyloid hypothesis: a genetic perspective // Cell. – 2005. – V.120. – N.4. – P.545–555. 250 472. Tarr P.E., Roncarati R., Pelicci G., Pelicci P.G., D'Adamio L. Tyrosine phosphorylation of the beta-amyloid precursor protein cytoplasmic tail promotes interaction with Shc // J Biol Chem. – 2002. – V.277. – N.19. – P.16798–16804. 473. Taub D.D., Murphy W.J., Longo D.L. Rejuvenation of the aging thymus: growth hormone-mediated and ghrelin-mediated signaling pathways // Curr Opin Pharmacol. – 2010. – V.10. – N.4. – P.408–424. 474. Teich A.F., Arancio O. Is the Amyloid Hypothesis of Alzheimer's disease therapeutically relevant? // Biochem J. – 2012. – V.446. – N.2. – P.165–177. 475. Terry R.D., Masliah E., Salmon D.P., Butters N., DeTeresa R., Hill R., Hansen L.A., Katzman R. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment // Ann Neurol. – 1991. – V.30. – N.4. – P.572– 580. 476. Terry R.D., Masliah E., Hansen L.A. The neuropathology of Alzheimer disease and the structural basis of its cognitive alterations. In: RD Terry, Katzman R, Bick KL, Sisodia SS, eds. Alzheimer disease. 2nd ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 1999;. pp. 187–206. 477. Thambisetty M., Simmons A., Velayudhan L., Hye A., Campbell J., Zhang Y., Wahlund L.O., Westman E., Kinsey A., Güntert A., Proitsi P., Powell J., Causevic M., Killick R., Lunnon K., Lynham S., Broadstock M., Choudhry F., Howlett D.R., Williams R.J., Sharp S.I., Mitchelmore C., Tunnard C., Leung R., Foy C., O'Brien D., Breen G., Furney S.J., Ward M., Kloszewska I., Mecocci P., Soininen H., Tsolaki M., Vellas B., Hodges A., Murphy D.G., Parkins S., Richardson J.C., Resnick S.M., Ferrucci L., Wong D.F., Zhou Y., Muehlboeck S., Evans A., Francis P.T., Spenger C., Lovestone S. Association of plasma clusterin concentration with severity, pathology, and progression in Alzheimer disease // Arch Gen Psychiatry. – 2010. – V.67. – N.7. – P.739–748. 478. Thambisetty M., An Y., Kinsey A., Koka D., Saleem M., Güntert A., Kraut M., Ferrucci L., Davatzikos C., Lovestone S., Resnick S.M. Plasma clusterin concentration is associated with longitudinal brain atrophy in mild cognitive impairment // Neuroimage. – 2012. – V.59. – N.1. – P.212–217. 479. Thies E., Mandeikow E.V. Missorting of tau in neurons causes degeneration of synapses that can be rescued by the kinase MARK2/Par-I // J Neurosci. – 2007. – V.27. – N.11. – Р.2896–2897. 251 480. Thinakaran G., Koo E.H. Amyloid precursor protein trafficking, processing, and function // J Biol Chem. – 2008. – V.283. – N.44. – P.29615–29619. 481. Trapnell C., Pachter L., Salzberg S.L. TopHat: discovering splice junctions with RNA- Seq // Bioinformatics. – 2009. – N. 25(9). – P. 1105–1111. 482. Trougakos I.P., Gonos E.S. Regulation of clusterin/apolipoprotein J, a functional homologue to the small heat shock proteins, by oxidative stress in ageing and age-related diseases // Free Radic Res. – 2006. – V.40. – N.12. – P.1324–1334. 483. Trushina E., Dyer R.B., Badger J.D., Ure D., Eide L., Tran D.D., Vrieze B.T., Legendre-Guillemin V., McPherson P.S., Mandavilli B.S., Van Houten B., Zeitlin S., McNiven M., Aebersold R., Hayden M., Parisi J.E., Seeberg E., Dragatsis I., Doyle K., Bender A., Chacko C., McMurray C.T. Mutant huntingtin impairs axonal trafficking in mammalian neurons in vivo and in vitro // Mol Cell Biol. – 2004. – V.24. – N.18. – Р.195–209. 484. Tseng B.P., Green K.N., Chan J.L., Blurton-Jones M., LaFerla F.M. Abeta inhibits the proteasome and enhances amyloid and tau accumulation // Neurobiol Aging. – 2008. – V.29. – N.11. – P.1607–1618. 485. Turner P.R., O’Connor K., Tate W.P., Abraham W.C. Roles of amyloid precursor protein and its fragments in regulating neural activity, plasticity and memory // Prog Neurobiol. – 2003. – V.70. – N.1. – P.1–32. 486. Upham B.L., Trosko J.E. Oxidative-dependent integration of signal transduction with intercellular gap junctional communication in the control of gene expression // Antioxid Redox Signal. – 2009. – V.11. – N.2. – Р.297–307. 487. Upritchard J.E., Schuurman C.R.W.C., Wiersma A., Tijburg L.B., Coolen S.A., Rijken P.J., Wiseman S.A. Spread supplemented with moderate doses of vitamin E and carotenoids reduces lipid peroxidation in healthy, nonsmoking adults // Am J Clin Nutr. – 2003. – V.78. – N.5. – P.985–992. 488. Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M.T., Mazur M., Telser J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease // Int J Biochem Cell Biol. – 2007. – V.39. – N.1. – Р.44–84. 489. Van Dam D., D’Hooge R., Staufenbiel M., Van Ginneken C., Van Meir F., De Deyn P.P. Age-dependent cognitive decline in the APP23 model precedes amyloid deposition // Eur J Neurosci. – 2003. – V.17. – N.2. – P.388–396. 252 490.Van Dam D., De Deyn P.P. Animal models in the drug discovery pipeline for Alzheimer's disease // Br J Pharmacol. – 2011. – V.164. – N.4. – P.1285–1300. 491.Vays V.B., Eldarov C.M., Vangely I.M., Kolosova N.G., Bakeeva L.E., Skulachev V.P. Antioxidant SkQ1 delays sarcopenia-associated damage of mitochondrial ultrastructure // Aging (Albany NY). – 2014. – V.6. – N.2. – P. 140–148. 492.Verghese J., LeValley A., Derby C., Kuslansky G., Katz M., Hall C., Buschke H., Lipton R.B. Leisure activities and the risk of amnestic mild cognitive impairment in the elderly // Neurology. – 2006. – V.66. – N.6. – P.821–827. 493.Vossel K.A., Zhang K., Brodbeck J., Daub A.C., Sharma P., Finkbeiner S., Cui B., Mucke L. Tau Reduction Prevents Aβ-Induced Defects in Axonal Transport // Science. – 2010. – V.330. – N.6001. – P.198. 494.Walsh D.M., Townsend M., Podlisny M.B., Shankar G.M., Fadeeva J.V., El Agnaf O., Hartley D.M., Selkoe D.J. Certain inhibitors of synthetic amyloid beta-peptide (Abeta) fibrillogenesis block oligomerization of natural Abeta and thereby rescue long-term potentiation // J Neurosci. – 2005. – V.25. – N.10. – P.2455–2462. 495.Walsh D.M., Selkoe D.J. A beta oligomers – a decade of discovery // J Neurochem. – 2007. – V.101. – N.5. – P.1172–1184. 496.Walter J., Capell A., Hung A.Y., Langen H., Schnölzer M., Thinakaran G., Sisodia S.S., Selkoe D.J., Haass C. Ectodomain phosphorylation of β-amyloid precursor protein at two distinct cellular locations // J Biol Chem. – 1997. – V.272. – N.3. – P.1896–1903. 497. Walton N.M., Shin R., Tajinda K., Heusner C.L., Kogan J.H., Miyake S., Chen Q., Tamura K., Matsumoto M. Adult neurogenesis transiently generates oxidative stress // PLoSOne. – 2012. – V.7. – N.4. – P.1–14. – Article ID: e35264. 498.Wang X., Su B., Fujioka H., Zhu X. Dynamin-like protein 1 reduction under lies mitochondrial morphology and distribution abnormalities in fibroblasts from sporadic Alzheimer's disease patients // Am J Pathol. – 2008a. – V.173. – N.2. – P.470–482. 499.Wang X., Su B., Siedlak S.L., Moreira P.I., Fujioka H., Wang Y., Casadesus G., Zhu X. Amyloid-beta overproduction causes abnormal mitochondrial dynamics via differential modulation of mitochondrial fission/fusion proteins // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2008b. – V.105. – N.49. – P.19318–19323. 500.Wang X., Blanchard J., Kohlbrenner E., Clement N., Linden R.M., Radu A., Grundke-Iqbal I., Iqbal K. The carboxyterminal fragment of inhibitor-2 of protein 253 phosphatase-2A induces Alzheimer disease pathology and cognitive impairment // FASEB J. – 2010. – V.24. – N.11. – P.4420-4432. 501.Wasco W., Gurubhagavatula S., Paradis M.D., Romano D.M., Sisodia S.S., Hyman B.T., Neve R.L., Tanzi R.E. Isolation and characterization of APLP2 encoding a homologue of the Alzheimer's associated amyloid beta protein precursor // Nat Genet. – 1993. – V.5. – N.1. – P.95–100. 502.Watson J.B., Arnold M.M., Ho Y.S., O'Dell T.J. Age-dependent modulation of hippocampal long-term potentiation by antioxidant enzymes // J Neurosci Res. – 2006. – V.84. – N.7. – Р.1564-1574. 503.West M.J., Bach G., Soderman A., Jensen J.L. Synaptic contact number and size in stratum radiatum CA1 of APP/PS1DeltaE9 transgenic mice // Neurobiol Aging. – 2009. – V.30. – N.11. – P.1756–1776. 504.Wilkinson D. Drugs for treatment of Alzheimer's disease // Int J Clin Pract. – 2001. – V.55. – N.2. – P.129–134. 505.Willem M., Dewachter I., Smyth N., Van Dooren T., Borghgraef P., Haass C., Van Leuven F. β-Site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1 increases amyloid deposition in brain parenchyma but reduces cerebrovascular amyloid angiopathy in aging BACE × APP[V717I] double-transgenic mice // Am J Pathol. – 2004. – V.165. – N.5. – P.1621–1631. 506.Wilquet V., De Strooper B. Amyloid-beta precursor protein processing in neurodegeneration // Curr Opin Neurobiol. – 2004. – V.14. – N.5. – P.582–588. 507.Winkler J.M., Fox H.S. Transcriptome meta-analysis reveals a central role for sex steroids in the degeneration of hippocampal neurons in Alzheimer's disease // BMC Syst Biol. – 2013. – V.7. – N.51. – P.1–11. 508.Wisniewski T., Siggurdsson E.M. Murine models of Alzheimer's disease and their use in developing immunotherapies // Biochim Biophys Acta. – 2010. – V.1802. – N.10. – P.847–859. 509.Witte M.E., Geurts J.J., de Vries H.E., van der Valk P., van Horssen J. Mitochondrial dysfunction: a potential link between neuroinflammation and neurodegeneration? // Mitochondrion. – 2010. – V.10. – N.5. – Р.411–418. 510.Wolfe M.S. When loss is gain: reduced presenilin proteolytic function leads to increased Abeta42/Abeta40. Talking Point on the role of presenilin mutations in Alzheimer disease // EMBO Rep. – 2007. – V.8. – N.2. – P.136–140. 254 511. Wright A.L., Zinn R., Hohensinn B., Konen L.M., Beynon S.B., Tan R.P., Clark I.A., Abdipranoto A., Vissel B. Neuroinflammation and neuronal loss precede Ab plaque deposition in the hAPP-J20 mouse model of Alzheimer's disease // PloS one. – 2013. – V.8. – N.4. – P.1–14. – Article ID: e59586. 512.Wu F., Yao P.J. Clathrin-mediated endocytosis and Alzheimer’s disease: an update // Ageing Res Rev. – 2009. – V.8. – N.3. – P.147–149. 513.Wu F.J., Xue Y., Liu X.F., Xue C.H., Wang J.F., Du L., Takahashi K., Wang Y.M. The protective effect of eicosapentaenoic acid-enriched phospholipids from sea cucumber Cucumaria frondosa on oxidative stress in PC12 cells and SAMP8 mice // Neurochem Int. – 2014. – V.64. – P.9–17. 514. Wu H.Y., Hudry E., Hashimoto T., Kuchibhotla K., Rozkalne A., Fan Z., Spires- Jones T., Xie H., Arbel-Ornath M., Grosskreutz C.L., Bacskai B.J., Hyman B.T. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation // J Neurosci. – 2010. – V.30. – N.7. – P.2636–2649. 515. Wu M., Tsirka S.E. Endothelial NOS-deficient mice reveal dual roles for nitric oxide during experimental autoimmune encephalomyelitis // Glia. – 2009. – V.57. – N.11. – P.1204–1215. 516. Xiao A.W., He J., Wang Q., Luo Y., Sun Y., Zhou Y.P., Guan Y., Lucassen P.J., Dai J.P. The origin and development of plaques and phosphorylated tau are associated with axonopathy in Alzheimer’s disease // Neurosci Bull. – 2011. – V.27. – N.5. – P.287–299. 517. Yamada K., Nabeshima T. Animal models of Alzheimer's disease and evaluation of antidementia drugs // Pharmacol Ther. – 2000. – V.88. – N.2. – P.93–113. 518. Yang F., Uéda K., Chen P., Ashe K.H., Cole G.M. Plaque-associated alpha- synuclein (NACP) pathology in aged transgenic mice expressing amyloid precursor protein // Brain Res. – 2000. – V.853. – N.2. – P.381–383. 519. Yang F., Chu X., Yin M., Liu X., Yuan H., Niu Y., Fu L. mTOR and autophagy in normal brain aging and caloric restriction ameliorating age-related cognition deficits // Behav Brain Res. – 2014. – pii: S0166-4328(14)00072-2. 520. Yankner B.A., Dawes L.R., Fisher S., Villa-Komaroff L., Oster-Granite M.L., Neve R.L. Neurotoxicity of a fragment of the amyloid precursor associated with Alzheimer’s disease // Science. – 1989. – V.245. – N.4916. – P.417–420. 255 521. Yankner B.A., Duffy L.K., Kirschner D.A. Neurotrophic and neurotoxic effects of amyloid β protein: reversal by tachykinin neuropeptides // Science. – 1990. – V.250. – N.4978. – P.279–282. 522. Yao Z.X., Papadopoulos V. Function of beta-amyloid in cholesterol transport: a lead to neurotoxicity // FASEB J. – 2002. – V.16. – N.12. – P.1677–1679. 523. Yasui F., Matsugo S., Ishibashi M., Kajita T., Ezashi Y., Oomura Y., Kojo S., Sasaki K. Effects of chronic acetyl-L-carnitine treatment on brain lipid hydroperoxide level and passive avoidance learning in senescence-accelerated mice // Neurosci Lett. – 2002. – V.334. – N.3. – Р.177–180. 524. Yin K.J., Lee J.M., Chen H., Xu J., Hsu C.Y. Aβ25-35 alters Akt activity, resulting in Bad translocation and mitochondrial dysfunction in cerebrovascular endothelial cells // J Cereb Blood Flow Metab. – 2005. – V.25. – P.1445–1455. 525. Yin R.H., Yu J.T., Tan L. The role of SORL1 in Alzheimer’s disease // Mol Neurobiol. – 2014. – P.1–10. – DOI: 10.1007/s12035-014-8742-5. 526. Yoshiyama Y., Higuchi M., Zhang B., Huang S.M., Iwata N., Saido T.C., Maeda J., Suhara T., Trojanowski J.Q., Lee V.M. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model // Neuron. – 2007. – V.53. – N.3. – P.337–351. 527. Youmans K.L., Tai L.M., Kanekiyo T., Stine W.B. Jr, Michon S.C., Nwabuisi- Heath E., Manelli A.M., Fu Y., Riordan S., Eimer W.A., Binder L., Bu G., Yu C., Hartley D.M., LaDu M.J. Intraneuronal Aβ detection in 5xFAD mice by a new Aβ-specific antibody // Mol Neurodegener. – 2012. – V.7. – N.8. – P.1–14. 528. Yu Y.X., He J., Zhang Y.B., Luo H.M., Zhu S.H., Yang Y., Zhao T., Wu J., Huang Y.G., Kong J.M., Tan Q., Li X.M. Increased hippocampal neurogenesis in the progressive stage of Alzheimer's disease phenotype in an APP/PS1 double transgenic mouse model // Hippocampus. – 2009. – V.19. – N.12. – P.1247–1253. 529. Yuede C.M., Zimmerman S.D., Dong H., Kling M.J., Bero A.W., Holtzman D.M., Timson B.F., Csernansky J.G. Effects of voluntary and forced exercise on plaque deposition, hippocampal volume, and behavior in the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease // Neurobiol Dis. – 2009. – V.35. – N.3. – P.426–432. 530. Zhang J., Montine T.J., Smith M.A., Siedlak S.L., Gu G., Robertson D., Perry G. The mitochondrial common deletion in Parkinson’s disease and related movement disorders // Parkinsonism Rel Disord. – 2002. – V.8. – N.3. – P.165–170. 256 531. Zhu X., Raina A.K., Perry G., Smith M.A. Alzheimer’s disease: the two-hit hypothesis // Lancet Neurol. – 2004. – V.3. – N.4. – P.219–226. 532. Zlokovic B.V., Martel C.L., Matsubara E., McComb J.G., Zheng G., McCluskey R.T., Frangione B., Ghiso J. Glycoprotein 330/megalin: probable role in receptor-mediated transport of apolipoprotein J alone and in a complex with Alzheimer disease amyloid beta at the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1996. – V.93. – N.9. – P.4229–4234. 533. Zorov D.B., Juhaszova M., Sollott S.J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release // Physiol Rev. – 2014. – V.94. – N.3. – P.909–950. 534. Zou K., Gong J.S., Yanagisawa K., Michikawa M. A novel function of monomeric amyloid beta-protein serving as an antioxidant molecule against metal-induced oxidative damage // J Neurosci. – 2002. – V.22. – N.12. – P.4833–4841. 257 Приложение 1 Топ-список ДЭ генов в префронтальной коре крыс OXYS по сравнению с крысами Вистар в возрасте 5, 18 месяцев и измененных у крыс OXYS и Вистар с возрастом, определяемые методом Deseq2 по log2 отношению с уровнем значимости p < 0.01 Ген ENSEMBL ID REFSEQ ID Название гена Log2 отношение p-value 5 месяцев Spag6 ENSRNOG0 0000025787 360747 sperm associated antigen 6 3,42 4,43E-97 Atp1a4 ENSRNOG0 0000032378 29132 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 4 polypeptide 3,04 1,04E-67 RGD15 63668 ENSRNOG0 0000038478 497907 high mobility group protein B1-like 2,81 2,94E-63 Efcab1 ENSRNOG0 0000050091 301957 EF hand calcium binding domain 1 2,43 4,75E-56 ENSRNOG0 0000031378 682571 spindlin-1-like 2,05 5,73E-24 NA 1025544 01 uncharacterized LOC102554401 1,67 2,53E-27 ENSRNOG0 0000007121 NA NA 1,64 7,31E-16 NA 1025466 39 uncharacterized LOC102546639 1,48 8,68E-14 ENSRNOG0 0000025676 316090 family with sequence similarity 198,member A 1,43 2,12E-18 ENSRNOG0 0000010637 1025556 82 uncharacterized LOC102555682 1,39 1,85E-12 ENSRNOG0 0000037673 1003620 69 ribosomal protein L28-like -2,68 1,02E-46 ENSRNOG0 0000045967 316632 NADH dehydrogenase,ubiquinone,1 alpha subcomplex 10-like 1 -2,65 3,28E-40 315162 meiosis inhibitor 1 -2,48 2,31E-51 293544 protein disulfide isomerase-like -2,24 4,00E-34 81760 G protein-coupled receptor kinase 1 -2,13 1,89E-26 LOC682 571 LOC102 554401 Hmgb1ps2 LOC102 546639 Fam198 a Tbc1d5 RGD15 65183 Ndufa10 l1 Mei1 Pdilt Grk1 ENSRNOG0 0000007003 ENSRNOG0 0000015368 ENSRNOG0 0000018430 LOC100 911182 NA 1009111 82 NA -1,77 2,72E-18 Pstpip1 ENSRNOG0 0000016413 300732 proline-serine-threonine phosphataseinteracting protein 1 -1,69 2,31E-24 Ano5 ENSRNOG0 0000015972 308637 anoctamin 5 -1,69 1,46E-17 LOC501 529 ENSRNOG0 0000039295 501529 NA -1,52 3,25E-23 Adprhl1 ENSRNOG0 0000019504 290880 ADP-ribosylhydrolase like 1 -1,52 2,83E-19 258 Продолжение Приложения 1 18 месяцев Spag6 ENSRNOG0 0000025787 360747 sperm associated antigen 6 3,5 8,82E-103 Atp1a4 ENSRNOG0 0000032378 29132 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 4 polypeptide 2,92 6,40E-65 ENSRNOG0 0000031378 682571 spindlin-1-like 2,27 3,45E-29 ENSRNOG0 0000038478 497907 high mobility group protein B1-like 1,78 1,24E-25 ENSRNOG0 0000050091 301957 EF hand calcium binding domain 1 1,69 4,18E-27 ENSRNOG0 0000025676 316090 family with sequence similarity 198,member A 1,63 2,76E-23 NA 1025544 01 uncharacterized LOC102554401 1,43 8,76E-20 685900 ENTH domain containing 1 1,21 5,96E-10 503238 NA 1,14 1,89E-08 ENSRNOG0 0000012562 170796 glutamate receptor, ionotropic, N-methyl-Daspartate 3B 1,11 1,09E-10 ENSRNOG0 0000037673 1003620 69 ribosomal protein L28-like -3,08 2,66E-61 ENSRNOG0 0000045967 316632 NADH dehydrogenase,ubiquinone-1 alpha subcomplex 10-like 1 -2,56 1,47E-37 315162 meiosis inhibitor 1 -2,35 2,26E-47 81760 G protein-coupled receptor kinase 1 -2,21 3,97E-28 293544 protein disulfide isomerase-like -2,02 3,47E-28 LOC682 571 RGD15 63668 Efcab1 Fam198 a LOC102 554401 Enthd1 Tbc1d5 Grin3b RGD15 65183 Ndufa10 l1 Mei1 Grk1 Pdilt ENSRNOG0 0000025344 ENSRNOG0 0000010637 ENSRNOG0 0000007003 ENSRNOG0 0000018430 ENSRNOG0 0000015368 LOC501 529 ENSRNOG0 0000039295 501529 NA -1,83 1,21E-31 Pstpip1 ENSRNOG0 0000016413 300732 proline-serine-threonine phosphataseinteracting protein 1 -1,75 6,33E-26 1025556 75 uncharacterized LOC102555675 -1,57 2,88E-21 308637 anoctamin 5 -1,54 8,78E-15 301348 zeta-chain,TCR-associated protein kinase 70 -1,49 2,97E-17 Itih3 Ano5 Zap70 ENSRNOG0 0000017689 ENSRNOG0 0000015972 ENSRNOG0 0000016995 Крысы OXYS LOC102 546722 NA 1025467 22 NA 1,13 2,96E-09 Cyp2a3 ENSRNOG0 0000028900 24299 cytochrome P450,family 2, subfamily a, polypeptide 3 1,12 4,73E-08 259 Продолжение Приложения 1 LOC102 546709 Rbm38 Cdh23 NA ENSRNOG0 0000006420 ENSRNOG0 0000033087 1025467 09 uncharacterized LOC102546709 1,1 6,03E-08 366262 RNA binding motif protein 38 1,09 4,00E-08 114102 cadherin-related 23 1,01 2,72E-09 LOC102 547688 NA 1025476 88 zinc finger protein 120-like -1,24 4,21E-10 Inhba ENSRNOG0 0000014320 29200 inhibin beta-A -1,22 4,10E-21 RGD15 63668 ENSRNOG0 0000038478 497907 high mobility group protein B1-like -1,2 1,64E-13 297411 Tp53rk binding protein -1,2 1,08E-10 302327 zinc finger protein 711 -1,17 1,96E-14 65044 core 1 synthase, glycoprotein-Nacetylgalactosamine 3-betagalactosyltransferase 1 -1,15 5,11E-17 295107 structural maintenance of chromosomes 4 -1,14 1,42E-11 290396 diaphanous-related formin 3 -1,13 4,85E-10 114094 NA -1,11 2,32E-10 1003621 23 zinc finger protein 53-like -1,11 1,08E-08 TPRKB Zfp711 C1galt1 Smc4 Diaph3 Uchl3 LOC100 362123 ENSRNOG0 0000015818 ENSRNOG0 0000022391 ENSRNOG0 0000007804 ENSRNOG0 0000010274 ENSRNOG0 0000008986 ENSRNOG0 0000046120 NA Крысы Вистар C3 ENSRNOG0 0000046834 24232 complement component 3 1,29 5,74E-29 Cyp2a3 ENSRNOG0 0000028900 24299 cytochrome P450,family 2,subfamily a, polypeptide 3 1,16 1,49E-08 Aqp3 ENSRNOG0 0000009797 65133 aquaporin 3 -1,06 1,82E-13 260 Приложение 2 Значимые изменения экспрессии 85 генов с возрастом у крыс OXYS связанных с метаболическим путем БА, определяемые методом Deseq с уровнем значимости p < 0.05 с поправкой на множественные сравнения Ensemble Gene ID ENSRNOG0 0000015038 ENSRNOG0 0000007503 ENSRNOG0 0000018020 ENSRNOG0 0000023816 ENSRNOG0 0000006997 ENSRNOG0 0000017032 ENSRNOG0 0000002840 ENSRNOG0 0000019223 ENSRNOG0 0000014625 NULL ENSRNOG0 0000016000 ENSRNOG0 0000007235 ENSRNOG0 0000015320 ENSRNOG0 0000001551 ENSRNOG0 0000001991 ENSRNOG0 0000016847 ENSRNOG0 0000021147 NULL ENSRNOG0 0000004060 ENSRNOG0 0000030871 ENSRNOG0 0000016770 ENSRNOG0 0000020935 ENSRNOG0 0000033434 ENSRNOG0 0000010475 ENSRNOG0 0000012944 ENSRNOG0 0000008017 ENSRNOG0 0000017817 ENSRNOG0 0000007827 Refseq Gene ID Ген Название гена Соотношение экспрессии мРНК гена Log2 fold change p-value 29650 Adam10 ADAM metallopeptidase domain 10 -0,44 57027 Adam17 ADAM metallopeptidase domain 17 -0,3 0,007 29722 Apbb1 0,44 0,0001 365872 Aph1a amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family B, member 1 (Fe65) anterior pharynx defective 1 homolog A (C. elegans) 0,27 0,005 54226 App amyloid beta (A4) precursor protein 0,18 0,045 65262 Atp5a1 0,33 0,0006 171374 Atp5b 0,22 0,015 116550 Atp5c1 -0,4 0,009 245965 Atp5d 0,48 1,47E-07 245958 Atp5e 0,33 0,007 171375 Atp5f1 0,45 0,004 29754 Atp5g1 0,29 0,026 171082 Atp5g2 0,37 0,0003 94271 Atp5j 192241 Atp5o ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit 1, cardiac muscle ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta polypeptide ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, gamma polypeptide 1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, delta subunit ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, epsilon subunit ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit B1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit C1 (subunit 9) ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit C2 (subunit 9) ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit F6 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, O subunit 29392 Bace1 64639 -0,53 9,00E-06 1,96E-07 0,25 0,007 beta-site APP cleaving enzyme 1 0,19 0,03 Bad BCL2-associated agonist of cell death 0,37 0,00035 682930 Cacna1s calcium channel, voltage-dependent, L type, alpha 1S subunit 0,44 0,027 24242 Calm1 calmodulin 1 -0,20 0,001 50663 Calm2 calmodulin 2 -0,37 2,13E-06 24244 Calm3 calmodulin 3 0,28 0,003 29153 Capn1 calpain 1, (mu/I) large subunit 0,40 0,005 156117 Casp12 caspase 12 -0,46 0,023 25402 Casp3 caspase 3 -0,32 0,0008 58918 Casp9 caspase 9, apoptosis-related cysteine peptidase 0,32 9,52E-05 140908 Cdk5 cyclin-dependent kinase 5 0,32 0,0056 29445 Cox4i1 cytochrome c oxidase subunit IV isoform 1 0,36 0,0015 84683 Cox4i2 cytochrome c oxidase subunit IV isoform 2 (lung) 0,51 0,0009 261 ENSRNOG0 0000018816 ENSRNOG0 0000016660 ENSRNOG0 0000001170 ENSRNOG0 0000028451 ENSRNOG0 0000021177 ENSRNOG0 0000012457 ENSRNOG0 0000010452 ENSRNOG0 0000012864 ENSRNOG0 0000018630 ENSRNOG0 0000014183 ENSRNOG0 0000011726 ENSRNOG0 0000033942 ENSRNOG0 0000021063 ENSRNOG0 0000002833 ENSRNOG0 0000026651 ENSRNOG0 0000024309 ENSRNOG0 0000012181 ENSRNOG0 0000025053 ENSRNOG0 0000001849 ENSRNOG0 0000019601 ENSRNOG0 0000005133 ENSRNOG0 0000009514 ENSRNOG0 0000033133 ENSRNOG0 0000016470 NULL ENSRNOG0 0000007407 ENSRNOG0 0000017571 ENSRNOG0 0000005512 ENSRNOG0 0000005698 NULL ENSRNOG0 0000005668 ENSRNOG0 0000026930 252934 Cox5a cytochrome c oxidase, subunit Va -0,15 0,048 94194 Cox5b cytochrome c oxidase subunit Vb 0,28 0,014 25282 Cox6a1 cytochrome c oxidase, subunit VIa, polypeptide 1 0,36 0,0025 303393 Cox7b cytochrome c oxidase subunit VIIb -0,36 0,001 171335 Cox8a cytochrome c oxidase subunit VIIIa 0,37 0,00016 300047 Cyc1 cytochrome c-1 0,35 0,0006 25309 Cycs cytochrome c, somatic 498013 Ern1 endoplasmic reticulum to nucleus signaling 1 0,48 0,0014 24383 Gapdh glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 0,38 0,0009 81666 Gnaq 24408 Grin1 24409 Grin2a 24412 Grin2d 84027 -0,89 guanine nucleotide binding protein (G protein), q polypeptide glutamate receptor, ionotropic, N-methyl Daspartate 1 glutamate receptor, ionotropic, N-methyl Daspartate 2A glutamate receptor, ionotropic, N-methyl Daspartate 2D -0,28 Gsk3b glycogen synthase kinase 3 beta 25679 Itpr3 688869 5,53E-12 7,09E-07 0,33 0,0018 -0,35 0,0002 0,41 0,00015 -0,26 0,0029 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, type 3 0,38 0,004 LOC688 869 similar to cytochrome c oxidase, subunit VIb polypeptide 1 0,34 0,0002 24539 Lpl lipoprotein lipase 299858 Lrp1 low density lipoprotein receptor-related protein 1 116590 Mapk1 mitogen activated protein kinase 1 -0,15 0,022 50689 Mapk3 mitogen activated protein kinase 3 0,31 0,0006 29477 Mapt microtubule-associated protein tau 0,26 0,0004 24590 Mme membrane metallo-endopeptidase -0,56 0,00013 84019 Nae1 NEDD8 activating enzyme E1 subunit 1 -0,69 6,70E-09 678759 Ndufa10 301123 Ndufa11 299739 Ndufa12 291660 Ndufa2 681024 Ndufa4 25488 Ndufa5 299643 Ndufa7 296658 Ndufa8 362440 Ndufa9 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex 10 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex 11 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 12 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 2 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 4 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex 5 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 7 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 8 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 9 -0,53 2,59E-05 0,39 1,25E-05 0,16 0,045 0,39 0,00014 0,30 0,003 0,25 0,021 -0,42 3,74E-06 -0,31 3,44E-05 0,23 0,029 0,32 0,0009 0,19 0,034 262 ENSRNOG0 0000014568 ENSRNOG0 0000026616 ENSRNOG0 0000024539 ENSRNOG0 0000028717 ENSRNOG0 0000014078 ENSRNOG0 0000009364 NULL ENSRNOG0 0000011383 ENSRNOG0 0000024568 ENSRNOG0 0000018117 ENSRNOG0 0000001182 ENSRNOG0 0000001130 ENSRNOG0 0000004810 ENSRNOG0 0000033119 ENSRNOG0 0000009882 ENSRNOG0 0000007757 NULL ENSRNOG0 0000043210 ENSRNOG0 0000002879 ENSRNOG0 0000020941 ENSRNOG0 0000007967 ENSRNOG0 0000003163 ENSRNOG0 0000016952 ENSRNOG0 0000032134 ENSRNOG0 0000007233 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 10 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 2 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 6 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 7 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex 8 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 9 NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 2 NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 4 NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 7 NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 1 NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 3 0,31 0,0007 0,30 0,012 -0,40 0,0002 0,41 0,0007 0,38 0,0004 0,26 0,0034 0,29 0,0035 681418 Ndufb10 362344 Ndufb2 297990 Ndufb6 361385 Ndufb7 293991 Ndufb8 299954 Ndufb9 289218 Ndufs2 499529 Ndufs4 362837 Ndufs7 293655 Ndufv1 64539 Ndufv3 24598 Nos1 nitric oxide synthase 1, neuronal 24654 Plcb1 phospholipase C, beta 1 (phosphoinositidespecific) -0,38 1,71E-05 25031 Plcb4 phospholipase C, beta 4 -0,20 0,014106 24674 Ppp3ca -0,40 3,34E-07 24675 Ppp3cb -0,55 2,28E-09 171378 Ppp3cc 29748 Ppp3r1 protein phosphatase 3, catalytic subunit, alpha isozyme protein phosphatase 3, catalytic subunit, beta isozyme protein phosphatase 3, catalytic subunit, gamma isozyme protein phosphatase 3, regulatory subunit B, alpha 81751 Psen2 presenilin 2 0,38 0,0007 292788 Psenen presenilin enhancer 2 homolog (C. elegans) 0,23 0,033 298596 Sdhb 0,27 0,005 289217 Sdhc 0,22 0,034 690848 Uqcr11 succinate dehydrogenase complex, subunit B, iron sulfur (Ip) succinate dehydrogenase complex, subunit C, integral membrane protein ubiquinol-cytochrome c reductase, complex III subunit XI 0,35 0,0003 301011 Uqcrc1 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I 0,43 6,06E-06 497902 Uqcrq ubiquinol-cytochrome c reductase, complex III subunit VII 0,35 0,0012 -0,37 1,56E-06 0,38 0,0047 0,43 9,31E-06 0,25 0,029 0,30 0,018 0,17 -0,42 0,041 3,47E-07
