УДК 675.371:616.5-006.81 Д. В. Антонец Е. В. Старостина

Реклама
УДК 675.371:616.5-006.81
Е. А. Боробова 1, Д. В. Антонец 1, Е. В. Старостина 1, О. Ю. Смирнова 1
Д. Н. Щербаков 1, О. Ю. Волкова 2, С. Ф. Орешкова 1, Л. И. Карпенко 1
А. А. Ильичев 1, С. И. Бажан 1
1
√ÓÒÛ‰‡рÒÚ‚ÂÌÌ˚È Ì‡Û˜Ì˚È ˆÂÌÚр ‚ËрÛÒÓÎÓ„ËË Ë ·ËÓÚÂıÌÓÎÓ„ËË ´¬ÂÍÚÓрª
ÓθˆÓ‚Ó, ÕÓ‚ÓÒË·ËрÒ͇ˇ Ó·Î., 630559, —ÓÒÒˡ
2
»ÌÒÚËÚÛÚ ÏÓÎÂÍÛΡрÌÓÈ Ë ÍÎÂÚÓ˜ÌÓÈ ·ËÓÎÓ„ËË –Œ —¿Õ
Ôр. ¿Í‡‰. À‡‚рÂÌڸ‚‡, 8, ÕÓ‚ÓÒË·ËрÒÍ, 630090, —ÓÒÒˡ
E-mail: [email protected]
КАНДИДАТЫ ДНК-ВАКЦИНЫ ПРОТИВ МЕЛАНОМЫ:
ДИЗАЙН, КОНСТРУИРОВАНИЕ И ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ ЦЕЛЕВЫХ ГЕНОВ
В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ *
С использованием оригинального программного обеспечения проведен дизайн двух Т-клеточных иммуногенов MEL-TCI-A0201 и MEL-TCI – кандидатов ДНК-вакцины против меланомы. Первый «аллель-специфический» иммуноген MEL-TCI-A0201 включает CTL-эпитопы, рестриктированные только одним алломорфом HLAA*0201, который наиболее широко распространен в мировой популяции. Второй «универсальный» иммуноген
MEL-TCI содержит CTL-эпитопы, рестриктированные 12 мажорными аллельными вариантами молекул HLA
I класса. Гены, кодирующие целевые иммуногены, получены химическим синтезом и клонированы в векторной
плазмиде pcDNA3.1. Подлинность полученных рекомбинантных плазмид pMEL-TCI-A0201 и pMEL-TCI подтверждена рестрикционным анализом и секвенированием. Получены данные, подтверждающие экспрессию генов
MEL-TCI и MEL-TCI-A0201 в клетках эукариот, трансфицированных плазмидами pMEL-TCI и pMEL-TCI-A0201,
с использованием трех методов: с помощью ОТ-ПЦР, иммуноблоттинга и по окрашиванию клеток с помощью
МАТ к Gag-эпитопу, экспрессируемому в составе полиэпитопных конструкций.
Ключевые слова: Т-клеточные эпитопы, HLA I и II класса, дизайн полиэпитопных иммуногенов, противораковая ДНК-вакцина, меланома.
Меланома – опухоль, развивающаяся из
меланоцитов. Данное заболевание привлекает значительное внимание исследователей, поскольку отличается чрезвычайно
быстрым развитием и метастазированием,
пациенты с трудом поддаются лечению. Патология является наиболее агрессивным и
опасным видом рака кожи. В течение последних десятилетий по всему миру отмечается рост заболеваемости меланомой. В России ежегодный прирост заболеваемости
меланомой составляет около 5 %.
Значительный интерес представляет иммуногенность клеток меланомы. Описан ряд
высокоиммуногенных белковых антигенов,
специфичных для меланомы и некоторых
других видов рака, отсутствующих (или
практически отсутствующих) в нормальных
тканях организма человека. Из них известны
такие антигены, как Melan-A/MART-1,
gp100, тирозиназа, MAGE-3 и NY-ESO-1
и др. [1–3]. Высокая иммуногенность меланомных опухолей позволяет предположить
возможность создания эффективной тера-
*
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации
(госконтракт № 16.512.11.2186).
ISSN 1818-7943. ¬ÂÒÚÌËÍ Õ√”. –Âрˡ: ¡ËÓÎӄˡ, ÍÎËÌ˘ÂÒ͇ˇ ωˈË̇. 2012. “ÓÏ 10, ‚˚ÔÛÒÍ 5
© ≈. ¿. ¡ÓрÓ·Ó‚‡, ƒ. ¬. ¿ÌÚÓ̈, ≈. ¬. –Ú‡рÓÒÚË̇, Œ. fi. –ÏËрÌÓ‚‡, ƒ. Õ. ŸÂр·‡ÍÓ‚,
Œ. fi. ¬ÓÎÍÓ‚‡, –. ‘. Œр¯ÍÓ‚‡, À. ». ‡рÔÂÌÍÓ,
¿. ¿. »Î¸Ë˜Â‚, –. ». ¡‡Ê‡Ì, 2012
24
ŒрË„Ë̇θÌ˚ ËÒÒΉӂ‡Ìˡ
певтической вакцины или разработки эффективной иммунотерапевтической стратегии, использующей последние достижения
молекулярной иммунологии и клеточных
технологий.
Привлекательным и перспективным подходом к лечению больных с онкологическими заболеваниями является ДНК-вакцинация, индуцирующая цитотоксические
CD8+ Т-лимфоциты, которые являются
главными эффекторными клетками противоракового иммунитета [4].
Цель исследования – провести дизайн
искусственных полиэпитопных иммуногенов, содержащих множественные Т-клеточные эпитопы из основных раковых
антигенов меланомы, и на их основе сконструировать рекомбинантные плазмиды –
кандидаты ДНК-вакцины против меланомы,
а также подтвердить экспрессию генов, кодирующих эти целевые иммуногены, в
эукариотических клетках.
Материал и методы
Предсказание Т-клеточных эпитопов и
дизайн последовательностей двух искусственных Т-клеточных иммуногенов (MELTCI-A0201 и MEL-TCI) осуществлялись с
использованием программного обеспечения
TEpredict и PolyCTLDesigner [5; 6]. Гены,
кодирующие целевые иммуногены, синтезированы и затем клонированы в составе
плазмиды pcDNA3.1, являющейся эукариотическим экспрессионным вектором. Трансформацию клеточной культуры E. coli
DH5αFI (№ B-593 из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) рекомбинантными плазмидами проводили стандартным методом [7].
Подлинность целевых генов подтверждена секвенированием на автоматическом
секвенаторе. Правильность вставки гена,
кодирующего полиэпитопный иммуноген,
проверена с помощью рестрикционного
анализа с использованием рестриктаз NheI,
HindIII, BglII, PsiI. Анализ продуктов гидролиза проводили с помощью электрофореза в
1 % агарозном геле в аппарате фирмы «BioRad» для горизонтальных гелей при комнатной температуре и напряженности электрического поля 5 В/см в течение 1 ч с
дальнейшей визуализацией в проходящем
ультрафиолетовом свете. Наращивание биомассы клеточной культуры E. coli DH5αFI
для препаративного выделения рекомбинантных плазмидных ДНК проводили по
стандартной схеме [7]. Препаративные количества рекомбинантной плазмидной ДНК,
пригодной для трансфекции эукариотических клеток, получали щелочным методом,
включающим дополнительные стадии с рядом осаждений ацетатом аммония [8]. Для
оценки чистоты препарата ДНК измеряли
оптическое поглощение при длинах волн
260–280 нм.
Для оценки экспрессии целевых генов
проводили трансфекцию клеток 293Т c использованием реагента FuGENE®HD
(«Roche») согласно инструкции производителя набора, когда количество пролиферирующих клеток в монослое достигало 60–
70 %. Клетки выращивали в среде DMEM c
10 % содержанием FBS. В дальнейшем оценивался синтез специфической мРНК с помощью ОТ-ПЦР. Выделение суммарной
РНК проводили из 0,8 × 106 клеток 293Т,
трансфицированных плазмидами pMELTCI-A0201, pMEL-TCI, а также вектором
pcDNA3.1 (отрицательный контроль) и
плазмидой pcDNA-mart1, кодирующей полноразмерный белок MART-1 (положительный контроль), с использованием набора
для выделения суммарной РНК фирмы
«Promega» (cat. № Z3100) по прилагаемой
инструкции с использованием соответствующих для данных генов праймеров. Наличие целевого белка в трансфицированных
клетках определяли с помощью иммуноокрашивания и иммуноблота. Окрашивание
цитоплазмы трансфицированных клеток осуществлялось с помощью антител Mab29F2
(Вектор-Бэст) к эпитопу белка р24 ВИЧ и
конъюгата антител кролика против IgG мыши с пероксидазой хрена. При окрашивании
использован субстрат 3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлорид.
Результаты исследования
и обсуждение
Для дизайна полиэпитопных конструкций, на основе анализа литературы, выбрано
шесть антигенов: Cancer / testis antigen 1
(CTAG1A, NY-ESO-1), Melanoma antigen
recognized by T-cells 1 (MART1), MAGE-A1,
MAGE-A11, MAGE-A3, MAGE-C1. С помощью программы TEpredict [5] в составе
выбранных антигенов предсказаны Т-клеточные эпитопы (как CD8+ CTL, так и
¡ÓрÓ·Ó‚‡ ≈. ¿. Ë ‰р. ‡Ì‰Ë‰‡Ú˚ ƒÕ -‚‡ÍˆËÌ˚ ÔрÓÚË‚ Ï·ÌÓÏ˚
CD4+ Тh эпитопы), рестриктированные различными аллельными вариантами молекул
HLA (Human Leukocyte Antigen) I и II классов.
Предсказание CTL-эпитопов проведено
для наиболее распространенных в мировой
популяции аллельных вариантов молекул
HLA I класса (HLA-A*0101, A*0201,
A*0301, A*1101, A*2402, A*6801, B*0702,
B*0801, B*3501, B*1801, B*4402, B*2705).
Из множества предсказанных пептидов выбрано 74 эпитопа, имеющих высокую или
среднюю аффинность связывания с молекулой HLA I класса (для отбора пептидов использовано пороговое значение pIC50 = 6,8,
так что пептиды, для которых pIC50 < 6,8,
исключались из рассмотрения).
Для наиболее эффективной индукции
Т-клеточного ответа для проектирования
целевых иммуногенов отобраны не только
цитотоксические (CTL), но и Т-хелперные
(Тh) эпитопы. Для этого с помощью программного обеспечения TEpredict в составе
выбранных раковых антигенов предсказаны
Th-эпитопы с наиболее широкой специфичностью по отношению к молекулам HLA
II класса, которые были локализованы в
шести фрагментах длиной от 20 до 30 а.к.о.
Известно, что для создания эффективной
полиэпитопной вакцины, индуцирующей
высокий уровень Т-клеточного ответа, необходимо обеспечить адекватную доставку
и эффективный процессинг искусственного
иммуногена. Наиболее эффективный путь
представления CTL-эпитопов иммунной
системе обеспечивается при использовании
ДНК-вакцин или вирусных векторов, которые могут доставлять ген, кодирующий целевой иммуноген, в антиген-презентирующие клетки, что необходимо для эндогенной
экспрессии антигена, обеспечивающей наиболее эффективный путь представления
эпитопов CD8+ клеткам в комплексе с молекулами MHC I класса. Это связано с тем,
что CTL распознают вирусные белки и раковые антигены, синтезируемые внутри
клетки, не как полноразмерные белки, а как
короткие пептиды (8–12 а.о.), ассоциированные со специфическими молекулами
MHC (Major Histocompatibility Complex)
I класса. Эти короткие антигенные эпитопы
появляются из вирусных цитоплазматических белков в результате протеасомопосредуемого процессинга [9]. После процессинга пептиды переносятся в просвет
25
эндоплазматического ретикулума (ЭПР) с
помощью гетеродимеров транспортных белков TAP1 / TAP2 (transporter associated with
antigen processing) и связываются с образующимися молекулами MHC I класса.
В отличие от индукции ответа CD8+ CTL
стимуляция ответа CD4+ Th происходит
путем представления Th-эпитопов в комплексе с молекулами MHC II класса. В данном случае процессинг антигенов, ведущий
к образованию Th-эпитопов, происходит в
лизосомах. Поэтому в случае вакцин, которые индуцируют ответы как CD8+ CTL, так
и CD4+ Th, необходимо обеспечить эффективный процессинг продукта экспрессии
целевого гена как в протеасоме, так и в лизосоме для освобождения антигенных пептидов с целью их последующего связывания
с молекулами MHC I и II классов.
В данной работе поставленная задача
решалась с помощью разработанного ранее
оригинального программного обеспечения
PolyCTLDesigner [5; 6], которое позволяет
оптимизировать размещение целевых Т-клеточных эпитопов в составе полиэпитопного
иммуногена и выбрать оптимальные спейсерные аминокислотные последовательности, фланкирующие эпитопы в составе полиэпитопной конструкции.
С помощью данной программы отобранные пептиды использовались для проектирования последовательностей двух искусственных Т-клеточных иммуногенов MEL-TCI
и MEL-TCI-A0201 – кандидатов ДНК-вакцины против меланомы. Первый «универсальный» иммуноген (MEL-TCI) содержит
множественные Т-клеточные эпитопы (как
CD4+ Th, так и CD8+ CTL) опухолевых антигенов меланомы, рестриктированные
множественными аллельными вариантами
молекул HLA I класса, тогда как второй
«аллель-специфический» иммуноген содержит эпитопы, рестриктированные только
одним алломорфом HLA-A*0201.
Выбор двух конструкций (универсальной
и аллель-специфической) обусловлен двумя
разными подходами к созданию противораковых вакцин. Первая универсальная конструкция является прототипом вакцины для
широкого применения, вторая аллель-специфическая конструкция является прототипом
одного из компонентов вакцины, предназначенной для индивидуализированной
иммунотерапии, при которой лечение осуществляется с использованием набора ал-
26
ŒрË„Ë̇θÌ˚ ËÒÒΉӂ‡Ìˡ
лель-специфических поли-CTL-эпитопных конструкций, несущих CTL-эпитопы, рестриктированные аллельными вариантами молекул HLA, присутствующими у пациента.
Чтобы оптимизировать MHC I- и / или
MHC II-зависимую презентацию антигенов,
в состав обеих конструкций включены
специальные сигнальные последовательности [10–15]. На N-конец обоих полиэпитопов был добавлен сигнальный пептид (Signal) белка HER2 (P04626)
(MELAALCRWGLLLALLPPGAAS), направляющий образующийся полипептид в эндоплазматический ретикулум (ЭПР). На Сконец добавлен мотив RKRSHAGYQTI,
включающий 11 последних аминокислотных остатков белка LAMP-1 человека, обеспечивающих перенаправление полипептида
из секреторного пути на деградацию в лизосомы, где его пептидные фрагменты, образующиеся в результате протеолиза, могут
связываться с рециркулирующими молекулами MHC II класса. Для оценки экспрессии
и метаболической стабильности полученных
иммуногенов в их состав был включен Gagэпитоп из белка р24 ВИЧ-1, с которым связываются МАТ 29F2 и 30A6.
Структуры спроектированных целевых
иммуногенов MEL-TCI-A0201 и MEL-TCI
схематически можно представить в следующем виде:
Signal_polyCTL-A0201_polyTh_Gagэпитоп_LAMP;
Signal_polyCTL_polyTh_Gagэпитоп_LAMP.
С помощью программы Gene Designer
спроектированы последовательности искусственных генов, кодирующих целевые
иммуногены, которые оптимизированы для
экспрессии в клетках человека. На 5'-конце перед инициирующим кодоном ATG
добавлена последовательность Козак
(CCGCCACC). В конце кодирующих последовательностей размещены три стоп-кодона
(TAGTGATGA). Последовательности искусственных генов имеют длину 3 428 и
1 535 п. н. соответственно.
Гены, кодирующие универсальный
(MEL-TCI) и аллель-специфический (MELTCI-A0201) иммуногены, получены химическим синтезом и клонированы в составе
векторной плазмиды pcDNA3.1. Структуры
полученных рекомбинантных плазмид
pMEL-TCI-A0201 и pMEL-TCI представлены на рис. 1. Кроме этих двух плазмид, ко-
дирующих искусственные иммуногены,
также сконструирована рекомбинантная
плазмида pcDNA-mart1, кодирующая полноразмерный раковый антиген MART1, являющийся одним из маркеров клеток меланомы, которая использовалась в качестве
положительного контроля при оценке активности целевой ДНК-вакциной конструкции.
Подлинность сконструированных ДНКвакцин подтверждена рестрикционным анализом. Для подтверждения структуры синтезированных генов фрагменты плазмид,
содержащие промоторную область и структурную часть целевых генов, секвенированы
на автоматическом секвенаторе. Плазмиды
наработаны и очищены в препаративном
количестве в клетках E. coli DH5αFI. На
эукариотических клетках 293Т проведена
трансфекция полученных плазмид.
Оценку экспрессии целевых генов проводили тремя способами: 1) по определению
наличия синтеза специфических мРНК в
клетках 293Т, трансфицированных плазмидами pMEL-TCI-A0201 и pMEL-TCI; 2) по
окрашиванию клеток с помощью МАТ к
Gag-эпитопу; 3) путем иммуноблоттинга.
В первом случае суммарную РНК выделяли из трансфицированных клеток, затем
получали кДНК в реакции обратной транскрипции. Полученную кДНК использовали
для проведения ПЦР с использованием специфических праймеров к соответствующим
генам. Продукты реакции анализировали с
помощью электрофореза в 1 % агарозном
геле. На электрофореграмме наблюдалось
наличие амплифицируемых фрагментов,
соответствующих исследуемым генам, что
подтверждает их экспрессию (рис. 2).
Окрашивание трансфицированных клеток (рис. 3) проводили с помощью антител к
р24 и конъюгата антител кролика против
IgG мыши с пероксидазой хрена. Окрашивание цитоплазмы наблюдалось только при
трансфекции плазмидами, несущими целевой
иммуноген, и не наблюдалось при трансфекции исходным вектором pcDNA3.1, что подтверждает экспрессию соответствующих
генов. Максимальное количество окрашенных клеток (25–26 %) наблюдалось в случае
трансфекции плазмидой рсDNA-mart1, кодирующей полноразмерный белок MART1, тогда как в случае трансфекции плазмидами
pMEL-TCI-A0201 и рMEL-TCI количество
окрашенных клеток составило ≈ 1,6 %. Низ-
¡ÓрÓ·Ó‚‡ ≈. ¿. Ë ‰р. ‡Ì‰Ë‰‡Ú˚ ƒÕ -‚‡ÍˆËÌ˚ ÔрÓÚË‚ Ï·ÌÓÏ˚
27
Рис. 1. Структуры рекомбинантных плазмид pMEL-TCI-A0201 и pMEL-TCI – кандидатов ДНК-вакцины против
меланомы
кий уровень окрашенных клеток, по-видимому, обусловлен быстрой деградацией целевых иммуногенов, поскольку они спроектированы таким образом, чтобы обеспечить
высокую скорость процессинга, необходимую для освобождения CTL-эпитопов.
Иммуноблоттинг проводили после разделения клеточных белков в полиакрила-
мидном геле и переноса на нитроцеллюлозную мембрану. Выявление специфических
белков осуществляли с МКА 29F2 к эпитопу-маркеру, включенному в состав всех
исследуемых белков. Оказалось, что в
трансфицированных клетках присутствуют
целевые белки, выявляемые МАТ 29F2
(рис. 4), что подтверждает их синтез, на-
28
ŒрË„Ë̇θÌ˚ ËÒÒΉӂ‡Ìˡ
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов
ОТ-ПЦР в 1 % агарозном геле: 1–3 –
продукты ОТ-ПЦР 375, 359, 255 пар
оснований (п. о.), полученные с использованием в качестве матрицы исходных
плазмид pMEL-TCI-A0201, pMEL-TCI и
pcDNA-mart1 (положительный контроль) соответственно; 4 – маркер молекулярных весов (М12 фирмы «Сибэнзим»), указаны фрагменты 10 000,
8 000, 6 000, 5 000, 4 000, 3 000, 2 500,
2 000, 1 500, 1 000, 750, 500, 250 п.о.; 5–
7 – продукты ОТ-ПЦР, полученные с
использованием в качестве матрицы
соответствующие кДНК трансфицированных 293Т-клеток: pMEL-TCI-A0201,
pMEL-TCI-, pcDNA-mart1 а
б
в
г
Рис. 3. Регистрация продуктов экспрессии целевых генов в клетках 293Т, трансфицированных плазмидами pMELTCI-A0201 и pMEL-TCI с помощью иммуноокрашивания: а – клетки, трансфицированные плазмидой pMEL-TCIA0201; б – клетки, трансфицированные плазмидой pMEL-TCI; в – клетки, трансфицированные плазмидой pcDNAmart1 (положительный контроль); г – клетки, трансфицированные плазмидой pcDNA3.1 (отрицательный контроль)
¡ÓрÓ·Ó‚‡ ≈. ¿. Ë ‰р. ‡Ì‰Ë‰‡Ú˚ ƒÕ -‚‡ÍˆËÌ˚ ÔрÓÚË‚ Ï·ÌÓÏ˚
29
Рис. 4. Иммуноблоттинг лизатов клеток 293Т, трансфицированных плазмидами: 1 – pcDNA-mart1; 2 – pMELTCI; 3 – pMEL-TCI-A0201; 4 – маркеры молекулярного веса (кД) правляемый целевыми ДНК-вакцинными
конструкциями. При этом результаты, представленные на рис. 4, показывают, что в
клетках, трансфицированных плазмидой
pcDNA-mart1, МАТ 29F2 выявляют только
полноразмерный раковый антиген MART1,
тогда как в клетках, трансфицированных
целевыми плазмидами pMEL-TCI-A0201 и
pMEL-TCI, МАТ 29F2, выявляют не полноразмерные белки, а их более короткие фрагменты. Полученные результаты являются
вполне закономерными, поскольку иммуногены MEL-TCI и MEL-TCI-A0201 проектировались так, чтобы обеспечить процессинг
иммуногенов, необходимый для связывания
освободившихся пептидов с молекулами
MHC I и II классов и индукции ответов
CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов.
Заключение
С использованием оригинального программного обеспечения в составе шести раковых антигенов меланомы предсказаны
Т-клеточные эпитопы, на основе которых
проведен дизайн двух полиэпитопных иммуногенов MEL-TCI и MEL-TCI-A0201 и
сконструированы рекомбинантные плазмиды – кандидаты ДНК-вакцины против меланомы, кодирующие эти иммуногены.
Структура плазмид охарактеризована рестрикционным анализом и секвенировани-
ем. Показано, что все полученные ДНКвакцинные конструкции обеспечивают синтез соответствующих мРНК и белков в
культуре эукариотических клеток и являются перспективными кандидатами для дальнейших исследований их противоопухолевой активности.
Список литературы
1. Parmiani G. Melanoma Antigens and
Their Recognition by T Cells // Keio J. Med.
2001. Vol. 50, № 2. P. 86–90.
2. Pandolfi F., Cianci R., Lolli S., Dunn I. S.,
Newton E.E., Haggerty T. J., Boyle L. A., Kurnick J. T. Strategies to Overcome Obstacles to
Successful Immunotherapy of Melanoma // Int.
J. Immunopathol. Pharmacol. 2008. Vol. 21,
№ 3. P. 493–500.
3. Halama N., Zoernig I., Jaeger D. Advanced Malignant Melanoma: Immunologic
and Multimodal Therapeutic Strategies //
J. Oncol. 2010. ID 689893. doi:10.1155/2010/
689893.
4. Балдуева И. А. Противоопухолевые вакцины // Практ. мол. биол. 2003. Т. 4. С. 157–
166.
5. Антонец Д. В., Максютов А. З. TEpredict: программное обеспечение для предсказания Т-клеточных эпитопов // Мол. биол.
2010. Т. 44, № 1. С. 130–139.
30
ŒрË„Ë̇θÌ˚ ËÒÒΉӂ‡Ìˡ
6. Bazhan S. I., Karpenko L. I., Ilyicheva T. N., Belavin P. A., Seregin S. V., Danilyuk N. K., Antonets D. V., Ilyichev A. A. Rational Design Based Synthetic Polyepitope
DNA Vaccine for Eliciting HIV-specific CD8+
T Cell Responses // Mol. Immunol. 2010.
Vol. 47, № 7–8. P. 1507–1515.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.
Молекулярное клонирование: Пер. с англ.
М., 1984.
8. Saporito-Irwin S. M., Geist R. T., Gutmann D. H. Ammonium Acetate Protocol for
the Preparation of Plasmid DNA Suitable
for Mammalian Cell Transfections // Biotechniques. 1997. Vol. 23, № 3. Р. 424–442.
9. York I. A., Rock K. L. Antigen Processing
and Presentation by the Class I Major Histocompatibility Complex // Annu. Rev. Immunol.
1996. Vol. 14. P. 369–396.
10. Ishioka G. Y., Fikes J., Hermanson G.,
Livingston B., Crimi C., Qin M., Guercio M. F.
del, Oseroff C., Dahlberg C., Alexander J.,
Chesnut R.W., Sette A. Utilization of MHC
Class I Transgenic Mice for Development of
Minigene DNA Vaccines Encoding Multiple
HLA-restricted CTL Epitopes // J. Immunol.
1999. Vol. 162, № 7. P. 3915–3925.
11. Livingston B. D., Newman M., Crimi C., McKinney D., Chesnut R., Sette A. Optimization of Epitope Processing Enhances
Immunogenicity of Multiepitope DNA Vaccines // Vaccine. 2001. Vol. 19, № 32. P. 4652–
4660.
12. Uebel S., Tampe R. Specificity of the
Proteasome and the TAP Transporter // Curr.
Opin. Immunol. 1999. Vol. 11, № 2. P. 203–
208.
13. Peters B., Bulik S., Tampe R., Endert P. M. van, Holzhutter H. G. Identifying
MHC Class I Epitopes by Predicting the TAP
Transport Efficiency of Epitope Precursors //
J. Immunol. 2003. Vol. 171, № 4. P. 1741–
1749.
14. Cardinaud S., Bouziat R., Rohrlich P. S.,
Tourdot S., Weiss L., Langlade-Demoyen P.,
Burgevin A., Fiorentino S., Endert P. van, Lemonnier F. A. Design of a HIV-1-derived
HLA-B07.02-restricted Polyepitope Construct
// AIDS. 2009. Vol. 23, № 15. P. 1945–1954.
15. Ruff A. L., Guarnieri F. G., StaveleyO'Carroll K., Siliciano R. F., August J. T. The
Enhanced Immune Response to the HIV gp160
/ LAMP Chimeric Gene Product Targeted to
the Lysosome Membrane Protein Trafficking
Pathway // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272,
№ 13. P. 8671–8678.
Материал поступил в редколлегию 06.08.2012
E. A. Borobova, D. V. Antonets, E. V. Starostina, O. Yu. Smirnova, D. N. Scherbakov, O. Yu. Volkova
S. F. Oreshkova, L. I. Karpenko, A. A. Ilyichev, S. I. Bazhan
CANDIDATES OF DNA VACCINE AGAINST MELANOMA: DESIGN, ENGINEERING
AND ESTIMATING THE EXPRESSION OF TARGET GENES IN EUKARYOTIC CELLS
Design of two T-cell immunogens MEL-TCI-A0201 and MEL-TCI – candidates of DNA vaccine against melanoma
was carried out using the original software. The first «allele-specific» immunogen MEL-TCI-A0201 includes a CTLepitopes restricted with only one allomorph HLA-A*0201, which is the most widely distributed in the world population.
The MEL-TCI, second «universal» immunogen, contains CTL-epitope restricted with 12 major allelic variants of HLA
class I molecules. The genes encoding the target immunogens were obtained by chemical synthesis, and cloned into the
vector plasmid pcDNA3.1. The authenticity of the developed recombinant plasmids pMEL-TCI-A0201 and pMEL-TCI
was confirmed by restriction analysis and DNA sequencing. The expression of both MEL-TCI and MEL-TCI-A0201
genes in eukaryotic cells transfected with plasmids pMEL-TCI and pMEL-TCI-A0201 was analyzed using three methods:
RT-PCR, immunoblotting, and staining of cells with MAb to Gag-epitope which was expressed in framework the
polyepitope constructs.
Keywords: T-cell epitopes, HLA class I and II, designing polyepitope immunogens, antitumor DNA vaccine,
melanoma.
Скачать