MS NS - Кафедра генетики - Кемеровский государственный
реклама
ГОУ ВПО «Кемеровский государственный университет» Кафедра генетики М. Б. Лавряшина, Т. А. Толочко, А. Н. Волков АЛЛОАНТИГЕНЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Учебное пособие Кемерово 2006 2 УДК 612.118.221.2(075.8) ББК Е912Я73 Печатается по решению редакционно-издательского совета ГОУ ВП «Кемеровский государственный университет» Рецензенты Начева Л. В., д.б.н., профессор кафедры Общей Биологии ГОУ ВП Кемеровской Государственной Медицинской Академии (КемГМА) Головин В. С., начальник Кемеровского областного Бюро Судебно-Медицинской Экспертизы (КОБСМЭ) Лавряшина, М. Б. Л-13 Аллоантигены крови человека: учебное пособие /М. Б. Лавряшина, Т. А. Толочко, А. Н. Волков; ГОУ ВП «Кемеровский государственный университет». – Кемерово: Кузбассвузиздат, 2006. – 100 с. Учебное пособие разработано по специальности 020201 «Биология». Содержит сведения о природе и биологической значимости аллоантигенов крови человека, включает методики типирования аллоантигенов в классическом и современном вариантах, а также методы математической обработки первичных результатов исследований аллоантигенов, применяемые в популяционной и медицинской генетике. Учебное пособие «Аллоантигены крови человека» предназначено для студентов биологических и медицинских специальностей. УДК 612.118.221.2(075.8) ББК Е912я73 © М.Б. Лавряшина, Т. А. Толочко, А. Н. Волков © ГОУ ВПО «Кемеровский ISBN 5-8353-0495-1 государственный университет», 2006 3 Предисловие Аллоантигены – это собственные антигены индивидуума, маркирующие состояние всего организма в целом, его отдельных структурных частей, этапы дифференцировки клеток и тканей, индивидуальные различия внутри одного вида и так далее. В основе такой маркировки лежат генетические, биохимические и иммунологические процессы. Она необходима для точного, сбалансированного взаимодействия и, соответственно, функционирования всех компонентов организма, лежит в основе распознавания «свое – чужое», обеспечивает гомеостаз и биологическую индивидуальность как межвидовую, так и внутривидовую. В соответствии со своей биологической ролью аллоантигены человека и животных классифицируют на видоспецифичные, индивидуально специфичные, стадиоспецифичные, органоспецифичные, тканеспецифичные и антигены специфичные для определенных патологических состояний или образований. Аллоантигены, описанные в настоящем учебном пособии, – это индивидуальноспецифичные антигены. Для них разработаны собственные системы классификаций. Так, в соответствии с локализацией аллоантигенов их классифицируют следующим образом: клеточные факторы – это аллоантигены, расположенные на мембранах эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и так далее; сывороточные факторы – это аллоантигены белков плазмы крови. Данная классификация отражает тот факт, что все фракции крови содержат особые аллоантигены – генетически детерминированные молекулы. На основе изучения аллоантигено, их генетики и биохимических особенностей было сформировано понятие «группы крови». Речь идет об иммунобиологических характеристиках крови, благодаря которым всех людей можно подразделять на группы независимо от их пола, возраста, географической зоны проживания и этнической принадлежности. Биологическая роль большинства аллоантигенов, в настоящее время, не установлена. Хотя многочисленные исследования в этой 4 области свидетельствуют о том, что наличие у индивида той или иной группы крови не является безразличным признаком, а играет определенную роль, как на этапе внутриутробного развития, так и в процессе жизнедеятельности взрослого организма. Группы крови человека являются одним из основных объектов изучения формальной, популяционной, молекулярной и медицинской генетики. Первоначально, ассоциирующиеся только с системой эритроцитарных аллоантигенов АВО, которая была открыта в 1901 году нобелевским лауреатом Карлом Ландштейнером, в настоящее время «группы крови» объединяют более 500 групповых факторов, включенных не менее чем в 75 моно- и полиморфных генетических систем. Путь совершенствования научных представлений в этой области был стремительным. Если до 1955 года понятие «группы крови» отождествлялось с аллоантигенами, находящимися на мембране эритроцитов, то после открытия генетического полиморфизма белка сыворотки крови гаптоглобина (Нр) область, включенная в это понятие, расширилась и стала также включать сывороточные протеины. В 1958 году были открыты лейкоцитарные, а в 1959 году тромбоцитарные аллоантигены. И, наконец, в 1968 году в эритроцитах человека был выявлен целый ряд ферментов – ферментных групп эритроцитов. Эти системы нашли широкое применение в этнической антропологии, эпидемиологии, трансфузиологии, трансплантологии и судебной медицине. Аллоантигены наследуются, не изменяются в течение жизни, их сочетание индивидуально для каждого человека. Одинаковые комбинации аллоантигенов, учитывая число возможных сочетаний, крайне редки, за исключением однояйцовых близнецов, групповые аллоантигены которых идентичны. В определенной степени аллоантигены характеризуют молекулярную эволюцию и успешно использовались для генетического картирования и выяснения вопросов генетической корреляции. Благодаря групповым системам крови у человека впервые были открыты аутосомальные сцепления генов (система Лютеран и выделительства), картирован ген наследственного онихоартроза (система АВО), а также найдена первая аутосомная локализация генного локуса на хромосоме (система Даффи). 5 Цель, которую поставили перед собою авторы учебного пособия – познакомить читателя с аллоантигенами крови человека, локализованными на мембране клеточных элементов. С их строением, биологической значимостью, моделями наследования, а также с методами типирования аллоантигенов крови. Учебное пособие содержит сведения о классических и современных подходах изосерологии, таких как типирование с использованием моноклональных антител и стандартных тест-сывороток, а также о методах популяционной статистики, традиционно применяемым в генетике групп крови. 6 § 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Кровь – внутренняя среда организма (один из видов внутренней среды), состоит из форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) и жидкой фракции – плазмы. Плазма, содержащая клеточные элементы, заключена в кровеносной системе и постоянно циркулирует благодаря деятельности сердца и участию экстракардиальных факторов. Широко разбросанная сеть кровеносных сосудов обеспечивает контакт крови со всеми органами, тканями и клетками организма. Биологические функции крови важны и многогранны. К ним относятся транспорт различных веществ, участие в физико-химической и нейрогуморальной регуляции и так далее1. У эмбриона человека кроветворение начинается на 21 - 28 день (3 – 4 неделя внутриутробного развития). Обеспечиваются процессы кроветворения желточным мешком, в котором образуются кровяные островки Вольфа. Желточный мешок является не только кроветворным органом в эмбриональном периоде, но и служит источником циркулирующих стволовых кроветворных клеток и клеток-предшественников, которые затем мигрируют в печень и инициируют печеночную стадию эмбрионального кроветворения (конец 2 – 5 месяц внутриутробного развития). С 3 месяца эмбрионального развития местом лейкопоэза и эритропоэза становится костный мозг. Инициируется костномозговой гемопоэз мигрировавшими из печени стволовыми кроветворными клетками. В конце 3 – начале 4 месяца развития в процессы кроветворения вступает селезенка. Сначала в процессе селезеночного кроветворения происходит эритропоэз, затем появляются элементы миелоидного ряда, а с 20 недели начинают образовываться лимфоциты. Различные очаги эмбрионального кроветворения активны только на соответствующих этапах развития. Исключение составляет только костный мозг, который сохраняется как основной центр кроветворения у взрослого организма. 1 Шиффоман, Ф. Дж. Патофизиология крови. – Невский диалект, 2000. М.; Спб.: БИНОМ; 7 С момента рождения развитие первичных полипотентных стволовых клеток и миелопоэз происходят в костном мозге, в то время как лимфопоэз – в тимусе, селезенке, лимфатических узлах и лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником. При патологии миелопоэз может возобновляться в селезенке и печени. Практически все клетки крови взрослого человека имеют костномозговое происхождение и формируются в результате сложного процесса, называемого гемопоэзом (рис. 1.). В ходе гемопоэза образуются различные типы клеток крови, каждая из которых обладает уникальными особенностями. Стволовая кроветворная клетка лимфопоэз Т- лф Влф лейкопоэз моноцит миелопоэз эритропоэз гранулоцит эритроцит тромбоцитопоэз тромбоцит Рис. 1. Схема кроветворения Морфология, функциональная активность и продолжительность жизни клеток крови человека различны. Так, тромбоциты участвуют в процессах свертывания крови. У многих позвоночных тромбоциты содержат ядро, у млекопитающих – безъядерные. Срок жизни от 8 до 11 суток. Лимфоциты участвуют в иммунных реакциях. Это ядросодержащие гетерогенные клетки. Срок жизни колеблется от 3 – 7 суток до нескольких десятков лет (клетки-памяти). Лейкоциты имеют общее онтогенетическое и филогенетическое происхождение с эритроцитами. Являются одним из компонентов неспецифической системы резистентности. Выделяют мо- 8 ноцитарные и гранулоцитарные формы. Гранулоциты, как правило, короткоживущие клетки (2-3 дня), тогда как срок жизни моноцитов и макрофагов значительно длиннее. Эритроциты – клетки крови позвоночных и некоторых беспозвоночных, например иглокожих. У птиц, пресмыкающихся, земноводных и рыб эритроциты содержат ядра, а у млекопитающих – зрелые формы – безъядерные. Срок жизни эритроцитов человека в среднем составляет около 120 дней. §2. ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АЛЛОАНТИГЕНЫ ЧЕЛОВЕКА Эритроцит – высокоспециализированная клетка, основной функцией которой является транспорт кислорода из легких в ткани, а двуокиси углерода – обратно в легкие. Зрелый эритроцит – безъядерная клетка в форме двояковогнутого диска, лишенная цитоплазматических органелл, диаметр эритроцита около 8 мкм. Особенности строения, размеры, способность изменять и восстанавливать свои объем и форму позволяют эритроцитам проникать в самые отдаленные участки микроциркуляторного русла и проходить через каналы размером 2-3 мкм. Структура эритроцита однообразна. Он состоит из тонкой, одинаковой на всем протяжении замкнутой мембраны, цитоплазма наполнена гемоглобином, который составляет около 98 % от массы белков цитоплазм ы эритроцита2. Гемоглобиновые гены локализованы на 11 и 16 хромосомах. У эмбриона, плода и взрослого человека активируются разные гены, в результате чего синтезируются отдельные цепи гемоглобина, которые впоследствии объединяются. Эритроцит обладает чрезвычайно активной мембраной, обладающей рядом важных свойств для поддержания нормального функционирования клетки. Мембране принадлежит ведущая роль в определении иммунологических свойств эритроцитов. Определенную роль в этом играют аллоантигены, локализованные на мембране клетки. В настоящее время типировано около 100 антигенов, 2 Шиффоман, Ф. Дж. Патофизиология крови. – Невский диалект, 2000. М.; Спб.: БИНОМ; 9 относящихся примерно к 15 генетическим системам. Это системы АВО, Rhesus и другие, обусловливающие ауто- и изосенсибилизацию. Учитывая современные научные представления, можно утверждать, что эритроцит не ограничивается функцией переноса кислорода и углекислого газа, а посредством чрезвычайно активной мембраны принимает участие в процессах поддержания гомеостаза, а также в функционировании иммунной системы, поддерживая в норме иммунный гомеостаз. Классификация аллоантигенов эритроцит о в. Прошло более 100 лет со времени открытия первых эритроцитарных антигенов. За этот период были открыты сотни антигенов, локализованных на мембране эритроцитов и других компонентах крови. Для систематизации множества выявленных аллоантигенов предлагались самые разнообразные классификации и терминологии. Возникло определенное разобщение между учеными и практическими врачами, для преодоления которого в 1980 году было проведено рабочее совещание по терминологии антигенов поверхности эритроцитов, организованное Международным обществом переливания крови (ISBT). Основной задачей совещания было на основе данных генетического картирования создать номерную классификацию для аллоантигенов эритроцитов. По результатам работы совещания была создана следующая классификация3. I. Системы групп крови – объединяют антигены контролируемые тесно связанными генетическими локусами с не выявленной или небольшой рекомбинацией между ними. В настоящее время известны 23 системы групп крови, объединяющие 194 аллоантигена, с нумерацией согласно хронологии их открытия (табл. 1.) II. Коллекции групп крови – содержат серологически, биохимически или генетически родственные антигены, характеристики которых не соответствуют критериям системы. Известно 5 коллекций, содержащих 11 антигенов. 3 Шевченко Ю. Л. Безопасное переливание крови. / Ю. Л. Шевченко, Е. Б. Жилбут – СПб.: Питер, 2000. 10 III. Редко встречающиеся антигены – это около 37 антигенов, распространенность которых в популяции не превышает 1 %. IV. Часто встречающиеся антигены – 14 антигенов, распространенность которых в популяции превышает 90 %. Таблица 1 Системы групп крови эритроцитов № системы 001 002 003 004 005 006 007 008 009 010 011 012 013 014 015 016 017 018 019 020 021 022 Наименование системы ABO MNSs P Rhesus Lutheran Kell Lewis Duffy Kidd Diego Yt Xg Scianna Dombrock Colton Landsteiner-Winner Chido/Rogers Hh Kx Gerbich Cromer Knops Обозначение Хромосомная системы локализация ABO 9q34.1-q34.2 MNSs 4q28-q31 P 22q11.2-qter Rh 1q36.2-q34 Lu 19q12-q13 Kel 7q33 Le 19q33 Fy 1q22-q23 Jk 18q11-q12 Di 17q12-q21 Yt 7q22 Xg Xp22.32 Sc 1p36.2-p22. Do Co 7p14 LW 19p13.2-p22 Ch/Rg 6p21.3 H 19q13 Xk Xp21.1 Ge 2q14-q21 Crom 1q32 Kn 1q32 В настоящее время ведутся активные исследования по проблеме генетического полиморфизма антигенов групп крови, особенностям их тканевой экспрессии, биологических свойств и структурнофункциональных взаимосвязей. Уже сейчас, с учетом полученной 11 информации можно, условно разделить аллоантигены эритроцитов на 5 категорий: транспортные и мембранные каналы; рецепторы для экзогенных лигандов и микроорганизмов; молекулы адгезии; ферменты; структурные белки. § 3. ЭРИТРОЦИТАРНАЯ СИСТЕМА ГРУПП КРОВИ АВО И с т о р и я о т к р ы т и я. Карл Ландштейнер, венский врач, открывший группы крови системы АВО, родился 14 июня 1868 года в Вене в семье юриста и журналиста Леопольда Ландштейнера. После окончания народной школы и государственной гимназии Ландштейнер работал в медицинской клинике Венского университета, в университетской хирургической клинике, в институте патологии. Еще в 1900 году Ландштейнер писал: «Сыворотка крови здоровых людей вызывает агглютинацию не только эритроцитов крови живот- Landsteiner, Karl ных, но и эритроцитов крови другого челове(1868–1943) ка. Остается выяснить, обусловлено ли это индивидуальным различием или же агглютинация эритроцитов происходит под действием бактериальной флоры». Свои эксперименты по этой проблеме Ландштейнер завершил в 1900 году и опубликовал в статье «Об агглютинабельной способности нормальной крови человека». Результатом экспериментальных исследований ученого было открытие первой системы групп крови человека – системы АВО. В ходе исследования Ландштейнер обрабатывал отмытые эритроциты одних людей сывороткой крови других людей и получил достаточно любопытные результаты (табл. 2). Попарно смешивая шесть образцов крови, принадлежащих ему и пяти его сотрудникам, Ландштейнер обнаружил, что в некоторых случаях, при смешивании эритроциты склеиваются (агглютинируют). 12 Результаты реакции зависели от сочетания сыворотка – эритроцит. Проанализировав данные таблицы, Ландштейнер сделал следующие выводы: эритроциты крови не агглютинируются собственной сывороткой; есть эритроциты (образцы 1 и 6), которые не агглютинируются ни одной нормальной сывороткой крови человека – согласно современной номенклатуре, группа крови О(I); некоторые эритроциты проявляют одинаковую реакцию (образцы 3 и 4) – А(II), (образцы 2 и 5) – В(III). Таблица 2 Агглютинация эритроцитов в эксперименте К. Ландштейнера Сыворотка Эритроциты Реакция агглютинации 1 1 _ 2 + 3 + 4 + 5 + 6 _ 2 _ _ + + _ _ 3 _ + _ _ + _ 4 _ + _ _ + _ 5 _ _ + + _ _ 6 (Ландштейнер) _ + + + + _ Так были обнаружены три из четырех ныне известных групп крови системы АВО. Спустя год, в 1902 г., Ландштейнер, Декастелло и Стерли открыли достаточно редкую AB(IV) группу крови, особенность которой заключалась в том, что сыворотка крови лиц с этой группой не агглютинирует эритроциты любой другой групповой принадлежности4. Зотиков, Е. А. Антигенные системы человека и гомеостаз. / Е. А. Зотиков – М., 1982. 4 13 Н о м е н к л а т у р а. После открытия эритроцитарных изоантигенных групп крови, для их обозначения было предложено несколько номенклатур. Первые номенклатуры были цифровыми, причем в этих схемах для обозначения одной и той же групповой принадлежности использовалась разная нумерация, в результате чего возникла определенная путаница. Так, первой известной классификацией была классификация, предложенная чешским врачом Янски, в основе которой лежала частота обнаружения групп крови в популяциях, затем американский врач Мосс предложил свою цифровую схему, в которой 1 и 4 группы по Янски были переставлены местами (табл. 3). Из-за этой путаницы лаборантам в европейских и американских клиниках в течение многих лет приходилось указывать группы крови одновременно и по Янски, и по Моссу. В 1910 году Ландштейнер решил отменить обе цифровые системы обозначения. На совете Американской ассоциации иммунологов он настоял на введении буквенной системы, которая используется и в настоящее время. Наиболее часто встречавшаяся у европейцев группа крови получила обозначение – А, более редкая – В. Группа крови, эритроциты которой не агглютинировались ни одной сывороткой, была обозначена символом «О», а четвертая группа получила обозначение – АВ. Таблица 3 Первые номенклатуры групп крови системы АВО Номенклатура Сыворотка Эритроцит 1 2 3 4 1 + + + По Янски 2 3 + + + + 4 1 + - - По Моссу 2 3 + + - + + - 4 + + + - Эта номенклатура была одобрена Национальным комитетом по научным исследованиям, идею быстро подхватили в редакции «Журнала Американской медицинской ассоциации», после чего буквенная схема обозначения получила распространение и в Евро- 14 пе. Официально номенклатура Ландштейнера была утверждена в 1925 году на конгрессе судебной и социальной медицины и комиссией Союза по гигиене. Сам же Ландштейнер перешел на новую схему в своих публикациях только в 1928 году, ссылаясь на ее «официальное происхождение». Г е н е т и к а.5 Гены, кодирующие антигены системы АВО, картированы на длинном плече 9 хромосомы. Наследование групп крови постулировали еще в 1908 году Эпштейн и Оттенберг. Первую рациональную схему наследования предложили в 1911 году Хиршфельд и Дангерн. Согласно их гипотезе, наследование групп крови системы АВО обеспечивалось двумя парами аллеломорфов (А/а и В/в) с доминантно-рецессивным типом взаимодействия, за формирование «О» группы отвечали сочетания а/а или в/в. Эта схема продержалась 14 лет и была заменена в 1925 году теорией Бернштейна. Основываясь на накопленных к тому времени сведениях, Бернштейн предложил такую схему генетического контроля этой системы: существуют три аллельных гена, из них два кодоминантных аллеля А и В и один рецессивный аллель О, которые при сочетании по два дают шесть генотипов: АА, АО, ВВ, ВО, АВ и ОО, проявляющихся в четырех фенотипах: А, В, АВ и О. Основное отличие гипотезы Бернштейна от схемы наследования Хиршфельда и Дангерна, заключалось в том, что она исключала возможность рождения детей с группой крови «О» от родителей с группами «А, В» или «АВ», а также ребенка с группой «АВ» от родителей, при наличии в паре хотя бы одной «нулевки». Согласно современным представлениям группы крови системы АВО наследуются в соответствии с законами Менделя по кодоминантному типу. Существует три основных аллеля H, А, В. Аллели А и В доминантны по отношению к гену H и кодоминантны по отношению друг к другу. Предполагается, что полиморфизм генов системы АВО – результат генетической эволюции. Бернштейн, предложивший схему наследования системы АВО, предполагал возможность редкого кроссинговера в области этого локуса. Штерн высказал предположение о возможности не 5 Прокоп, О. Группы крови человека / О. Прокоп, В. Геллер. – М., 1991 15 расхождения при мейозе у человека с группой крови АВ хромосом, несущих аллели А и В. Куприна и Потапов предположили наличие хромосомных аберраций по данному локусу. В свете этих предположений интересно, что были неоднократно отмечены варианты группы крови А2В со слабым проявлением антигена В и изоагглютинином анти-В в сыворотке крови. В браках А2В - О рождались дети с группой крови А2В. Исследуя это явление, Комаи предположил, что в такой группе АВ, в противоположность транс-положению генов в пространстве (генотип АВ), имеет место цис-положение генов А и В и возможен генотип АВО (гены расположены на одной хромосоме). Эффект цис-положения часто обусловливает слабую выраженность антигена А и всегда антигена В. Теоретически допустимы и другие генотипы с цисположением АВА. Например, если в браке АВ - О родились дети с группами крови А и АВ, то значит группа крови АВ имела цисструктуру АВА. Более редкой формой цис-АВ является цис-А1В и цис-АВ с антигеном А, промежуточным между А1 и А2; в этих случаях антиген В выражен также слабо. Случаи присутствия цис-АВ аллеля надо отличать от случаев, когда у больных колитом или раком толстой кишки с группой крови А на эритроцитах выявляется слабовыраженный, В-подобный антиген6. А н т и г е н ы (АГ). Существует несколько разновидностей антигенов системы АВО. Антиген А – маркер группы А(II) подразделяется на основные варианты: А1 (частота встречаемости около 88 %) и А2 (около 12 %), причем антиген А2 имеет меньшую антигенную активность и проявляется слабо, особенно в группе А2В. Гетерозиготы А1А2 серологически неотличимы от А1А1 и А1О. В группе А открыты также антигены А3 (частота 1: 1000 – 1 : 10000), А4 (частота в популяции 1 : 30000), Аm, Ао, Ах, Аz, Аg, Ае и Аend, которые встречаются крайне редко. Есть также количественные варианты антигена, например, промежуточный между А1 и А2, А in- 6 Генофонд и геногеография народонаселения / под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. – СПб.: Наука, 2000. – 611 с. 16 termediate, который встречается у африканских народов, а также такой антиген, как Аhel, который встречается с антигенами А1 и А2. Разновидностей антигена В – маркера группы В(III) меньше и встречаются они реже: В2, В3 (обнаружен в японской популяции), В4, Вх; иногда при отсутствии в генотипе гена В, слабую Вподобную реакцию дает антиген Escherichia coli. Некоторые разновидности антигенов А и В контролируются, по-видимому, соответствующими мутантными аллелями, а другие, вероятно, являются результатом действия гена-супрессора. Э к с п р е с с и я а н т и г е н о в. В соответствии с генотипом каждый человек несет определенные антигены системы АВО, которые присутствуют не только в крови на строме эритроцитов, но и в биологических жидкостях (слюне, слезах, молоке, сперме и желудочном соке) и большинстве тканей, кроме яичек, хрусталика, хориона, плаценты, хряща и эпителия кожи. Антигены найдены также в крови на поверхности лейкоцитов и тромбоцитов. Специфичность антигенов при этом идентична и не зависит от локализации вещества, хотя АГ, связанные с клеточной поверхностью, – водонерастворимые гликолипиды, а АГ биологических жидкостей – водорастворимые гликопротеины. АВО-подобные антигены широко распространены в живой природе. Например, у свиней, коров, баранов, оленей, а также у тунцов в эритроцитах содержатся агглютиногены А и В, идентичные или близкие человеческим. АВО-антигенная дифференцировка встречается у многих приматов, в том числе у человекообразных обезьян. Вещества, сходные с антигенами системы АВО, выявлены у некоторых беспозвоночных, вирусов, риккетсий, бактерий, грибов и высших растений. С т р о е н и е а н т и г е н о в. Изучение антигенов выделенных из секретов показало, что они представляют собой гликопротеины с молекулярной массой 2 · 105 – 2 · 106 Да. Построены из пептидного остова и коротких олигосахаридных цепей. Пептидный фрагмент составляет около 15 % от молекулы, в его состав входит не менее 15 аминокислот, из которых 2/3 составляют треонин, серин, пролин и аланин. Углеводный компонент содержит четыре са- 17 хара: L-фукозу, D-галактозу, N-ацетил-D-галактозамин и Nацетилнейраминовую кислоту и составляет около 85 % от молекулы изоантигена. Углеводные цепи соединены с полипептидным остовом посредством гликозидной связи с гидроксильной группой треонина или серина. Антигенная специфичность вещества зависит от последовательности сахаров, расположенных на концах углеводных цепей молекул. У пептидного остова, который сходен по структуре у изоантигенов разной групповой принадлежности, основная функция каркасная, то есть он поддерживает определенную конфигурацию углеводных цепей. Антигены А и В структурно связаны с мембраной клетки дисульфидными связями. Б и о с и н т е з.7 Синтез антигенов системы АВО находится под контролем специальных ферментов – гликозилтрансфераз. Для экспрессии группоспецифических гликозилтрансфераз необходим специфический субстрат – углеводная цепь-предшественник. Антигены круп крови АВО близки между собой по строению и содержат общий структурный компонент – вещество Н. Сейчас установлено, что антиген Н, который является химическим предшественником антигенов А и В и конечным продуктом у людей с группой крови О, контролируется отдельным локусом Н. При генотипах HH и Hh образуется вещество Н, а при генотипе hh оно не образуется даже в том случае, если эти гомозиготы являются носителями аллелей локуса АВО. Такие индивиды, у которых не обнаружено антигенов АВН ни в эритроцитах, ни в секретах, впервые наблюдались в нескольких семьях в Бомбее, их фенотип был назван “бомбейским”. В сыворотке крови лиц с таким фенотипом содержатся в высоком титре анти-А, анти-В и анти-Н антитела. Биосинтез аллоантигенов системы АВО инициируется активностью гена Н, кодирующего фермент α-L-фукозо-трансферазуI, которая переносит остаток фукозы на акцепторы веществапредшественника. Кроме того, Н-трансфераза отвечает за экспрессию Н-антигена на эритроцитах. Известно, что Н-вещество как ан7 Литвин, С. Иммуногенетика. / С. Литвин. – М.: Мир, 1994. т. 2., 368 с. 18 тиген не однородно. Наряду с общей молекулой существует не менее трех разновидностей. Биосинтез антигенов А и В кодируют соответствующие гены. Ген А катализирует присоединение к атому С3 терминальной галактозы Н-вещества α-N-ацетилгалактозамин. Ген В – D-галактозу. И м м у н о л о г и ч е с к и е а с п е к т ы. Особенность системы групп крови АВО заключается в том, что это единственная система, для которой характерно наличие в сыворотке крови естественных, а не иммунных антител (изогемагглютининов). Считается, что синтез антител в данном случае стимулируется перекрестно реагирующими антигенами микробного происхождения. АВО-подобные антигены широко распространены в живой природе. Например, у свиней, коров, баранов, оленей, а также у тунцов в эритроцитах содержатся агглютиногены А и В, идентичные или близкие человеческим. АВО-антигенная дифференцировка встречается у многих приматов, в том числе у человекообразных обезьян. Вещества, сходные с антигенами системы АВО, выявлены у некоторых беспозвоночных, вирусов, риккетсий, бактерий, грибов и высших растений. У человека естественные изогемагглютинины α и β находятся в сыворотке крови лиц, не имеющих соответствующих антигенов (табл. 4). Антитела системы АВО представлены тремя основными классами иммуноглобулинов: IgM, IgG, IgA. Важными отличительными свойствами IgG-агглютининов являются их способность проникать через плаценту и большая агглютинационная сила. Нормальные антитела – полные IgM-антитела, а иммунные антитела, как правило, являются неполными. Таблица 4 Индивидуальное сочетание АВО антиген-антитело Группа крови O(I) A(II) B(III) AB(IV) Антигены А В АиВ Антитела αиβ β α - 19 Б и о л о г и ч е с к а я р о л ь в о н т о г е н е з е. АВОантигенная дифференцировка наблюдается в большинстве тканей организма человека на самых ранних стадиях эмбриогенеза. Исследования, показали, что антигены А и Н обнаруживаются в крови плода уже в возрасте 5 недель. АВО-локус функционирует практически в течение всего онтогенеза, поэтому можно предположить участие АВО-антигенов в нормальном эмбриогенезе человека. На ранних стадиях онтогенеза у плода не выявляются агглютинины (антитела), отсутствующие у матери. При наличии в сыворотке у плода двух агглютининов α и β относительная выраженность их находилась в соответствии с их выраженностью у матери. Указанные данные свидетельствуют о том, что агглютинины проникают в кровь плода из крови матери. Раннее формирование антигенов АВО в организме плода в сочетании с нормальным иммунологическим статусом женского организма предопределяет возможность несовместимости по системе АВО между матерью и плодом. Это приводит к конфликту, который может способствовать развитию у младенца гемолитической болезни новорожденных, а также является причиной недоношенности и спонтанных абортов. Явление несовместимости подтвердили в своих исследованиях Хиршфельд и Зборовски в 1926 году. Они обнаружили, что в браках 0 - A на 25 % меньше детей с группой крови А, чем в реципрокных браках А - 0, и объяснили это явление внутриутробной гибелью плодов с группой крови А у женщин с O(I) группой крови. Конфликт выражается в том, что антитела проникают из сыворотки крови матери в кровь ребенка с группой крови А(II) и вызывают агглютинацию его эритроцитов, что приводит к гибели плода на ранних стадиях эмбриогенеза. Современные данные свидетельствуют о двух направлениях отбора при АВО-несовместимости, а не одного, как предполагалось раньше. Один направлен против несовместимого, а другой – против совместимого потомства. Направленность зависит от возраста матери и от количества родов. Отсев на ранних стадиях развития плода не имеет клинических проявлений, но на более поздних сроках беременности внутриутробная гибель плода приводит к спонтанным выкидышам. Причем на частоту выкидышей в сроки беременностей свыше 16 20 недель АВО-несовместимость, по-видимому, не влияет. Отсев на стадии зрелого плода преимущественно связан с гибелью от гемолитической болезни новорожденных. АВО-гемолитическая болезнь новорожденных разной степени тяжести встречается в 3-5 % случаев и крайне редко в тяжелых формах. Различая по степени выраженности болезни зависят от возраста матери. Редкость тяжелых форм осложнений при АВОнесовместимости объясняется существованием защитных механизмов. Одним из таких механизмов является низкая активность А- и В-субстанций в эритроцитах плода и новорожденного. Б и о м е д и ц и н с к и е а с п е к т ы. Система АВО является одной их основных систем совместимости у человека, играет важную роль при переливании крови и пересадке тканей и органов. Ее гены обладают выраженным плейотропным эффектом в предрасположенности к некоторым заболеваниям. Многочисленными исследованиями была установлена ассоциативная связь между АВО-принадлежностью индивида и подверженностью заболеваниям как инфекционной, так и не инфекционной природы (табл. 5). Система групп крови АВО подвержена возрастной динамике. Установлено, что до старческого возраста чаще доживают люди с группой крови «О» по сравнению с «А», так как первые меньше предрасположены к наиболее опасным и распространенным в настоящее время болезням. Э т н о г е о г р а ф и я. Частота носителей фенотипов системы АВО в разных популяциях мира неодинакова. Существуют гипотезы, объясняющие неравномерное распределение групп крови АВО на земном шаре влиянием эпидемий таких инфекционных заболеваний, как чума, оспа и холера. Фогель в 1970 году сообщил, что лица с группой крови «О» особо восприимчивы к холере и чуме, а с группой А – к оспе. Причиной разных реакций на инфекционных агентов является наличие у возбудителей инфекций антигенов, сходных с антигенами крови у человека. Например, палочка чумы содержит антиген, подобный антигену «О», а вирус оспы - антигену «А». Соответственно, лица, 21 имеющие соответствующие антигены, будут менее устойчивы к указанным инфекциям, так как их организм не сразу “распознает” антигены возбудителей как чужие и реагирует на них очень слабо. Таблица 5 Предрасположенность к заболеваниям в зависимости от АВОпринадлежности8 Болезни Мультифакториальные АВО O(I) Язва желудка и 12-перстной кишки, рак языка, молочной железы и легких, бронхиальная астма. A(II) Аппендицит, рак желудка, поджелудочной железы, яичника, матки и слюнной железы, поясничный остеохондроз, ревматизм, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, холецистит и желчнокаменная болезнь, B(III) Аппендицит, осложненный перитонитом, рак пищевода и полости рта, осложненный инфаркт миокарда, пернициозная анемия, лейкемия. AB(IV) Остеохондроз позвоночника, тромбофлебит. Инфекционные Грипп типа А, острая пневмония. Вирусный гепатит, натуральная оспа (иммунитет плохо формируется даже при вакцинации). Туберкулез легких. Действительно, обращает на себя внимание низкая частота группы крови «О» у населения тех мест, где свирепствовали эпидемии чумы: Индия, Северная Африка, Монголия, Турция9. Для оценки частот фенотипов и генов в популяциях человека используются принятые в популяционной генетике методы. Оценка Шабалин, В. Н. Клиническая гематология. / В. Н. Шабалин, Л. Д. Серова. – Л., 1988 8 Харрисон, Дж. Биология человека. / Дж. Харрисон, Дж. Уайнер, Дж. Тэннер и др. – М.: Мир, 1979. 9 22 частот (p, q, r) генов (А, В, 0) проводится по известным формулам Бернштейна10. Предварительная оценка частот генов 0, А и В: r' = (0')1/2; p' = 1 - (A' + 0')1/2; q' = 1 - (B' + 0')1/2; где 0', A' и B' - частоты фенотипов, т.е. отношение числа лиц с определенным фенотипом к объему выборки. Если сумма предварительных частот генов не равна 1, вводится поправка D = 1 - (r" + p" + q"). Далее вычисляем окончательные (скорректированные) частоты генов: r = (r" + 1/2D) (1 + 1/2D); p = p' (1 + 1/2D); q = q' (1 + 1/2D); r + p + q = 1. Находим предварительные оценки частот генов: r' = (0')1/2; p1' = 1 - (0' + A2' + B' + A2B')1/2; p2' = (0' + A2' + B' + A2B')1/2 - (0' + B')1/2; q' = 1 - (0' + A')1/2; Вводим поправку D = 1 - (r' + p1' + p2' + q') и находим окончательные частоты генов: r = (r'+1/2D)(1 + 1/2D); p1 = p1'(1 + 1/2D); p2 = p2'(1 + 1/2D); q = q'(1 + 1/2D); r + p1 + p2 + q = 1. Если определение групп крови АВ0 проводится с использованием антисывороток, позволяющих типировать антигены А1 и А2, расчет проводится иначе (табл. 6). Генофонд и геногеография народонаселения / под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. – СПб.: Наука, 2000. 10 23 Таблица 6 Расчет частот генов по расширенному спектру фенотипов Фенотип 0 A1 A2 B A1B A2B Генотип 00 A1A1, A1A2, A10 A2A2, A20 BB, B0 A1B A2B Частота генотипа r2 (p1)2 + 2p1p2 + 2p1r (p2)2 + 2p2r q2 + 2qr 2p1q 2p2q Частота группы «О» в некоторых местах, например в отдельных популяциях южноамериканских индейцев, достигает 1. На большей части Нового Света частота группы «О» колеблется около 0,8. Пояс низких частот этой группы тянется от Восточной Европы через Центральную Азию до Тихого океана. В Европе наблюдается повышение частоты группы «В» и понижение «О» в направлении с запада на восток. В Азии в среднем концентрация группы «В» больше на 0,4-0,5. В Австралии же группа «А» резко преобладает над группой «В», группа «О» также довольно многочисленна. На африканском континенте у разных племен наблюдаются всевозможные сочетания частот, близкие к европейскому, азиатскому, американскому и австралийскому типам. Мировой максимум частоты аллеля «О» равен 1, минимум – 0,175, мировая средняя – 0,708; для аллеля «А» эти значения будут соответственно 0,544, 0 и 0,160; для В – 0,79, 0 и 0,13. Распространение подгруппы А2 более ограниченно по сравнению с А1. Частота гена А2 близка к 0,10 в Европе и Африке и падает до 0,05 в Индии и Юго-Восточной Азии. В других частях света этот ген встречается редко или отсутствует. Частота этого аллеля заметно повышена (0,25-0,37) у саамов и довольно высока у финнов. Амплитуда колебаний этнических частот генов «О», «А» и «В» в странах прежнего Советского Союза небольшая. Этнические частоты гена «О» в Европейском регионе лежат в интервале 0,550,60, кроме карелов, карагашей и караимов, у которых они немногим выше 0,6; на Кавказе этнические частоты этого гена несколько выше – 0,6-0,7 (у адыгейцев и абхазов выше 0,7); в Средней Азии и 24 Казахстане этнические частоты гена «О» близки к европейским (0,5-0,6); по сравнению с другими регионами этносы Сибири и Дальнего Востока имеют более высокие частоты (0,60-0,75). Максимальных величин частота гена «О» достигает также в популяциях некоторых сибирских народов: манси – 0,807, нивхов – 0,809, эвенков – 0,899. Высокие частоты гена отмечены на Кавказе: у осетин – 0,715, абхазов – 0,729, адыгейцев – 0,745, грузин – 0,767. Минимальные частоты гена «О» наблюдаются в Европейском регионе: у русских – 0,336, саамов – 0,389; а также в Средней Азии в популяциях горцев Памира – 0.200, каракалпаков – 0,299. Этнические частоты гена «А» в Европейской историкоэтнографической провинции имеют значения от 0,2 до 0,3, при этом у саамов она выше (0,371), а у карагашей, калмыков и караимов понижена по сравнению с другими группами и равны соответственно 0,186, 0,184 и 0,161. У народов Кавказа частота этого гена также изменяется от 0,2 до 0,3, но выделяется этническая частота армян – 0,335. Народы Средней Азии и Казахстана довольно однородны по частоте гена «А» (0,20-0,25). На территории Сибири и Дальнего Востока наблюдается заметное по сравнению с другими регионами снижение этнических частот этого аллеля. Максимальные значения часты гена «A» отмечаются в некоторых локальных популяциях народов Средней Азии (у каракалпаков – 0,459, горцев Памира – 0,573); высокие - на Кавказе (у армян – 0,380 и народов Дагестана – 0,410) и в Европейском регионе (у башкир – 0,379 и саамов – 0,453). Минимальные значения частоты гена «A» отмечены в основном в сибирских популяциях: у бурят – 0,098, восточных эвенков – 0,098, манси – 0,089, лесных ненцев – 0,083, а также в Средней Азии в одной из популяций таджиков – 0,086. На территории Северной Евразии антигены А1 и А2 изучены неравномерно. Большая часть полученных данных (около 70 %) относится к народонаселению Сибири и Дальнего Востока. Высокие значения частоты аллеля А1 (более 0,200) отмечены в популяциях марийцев, белорусов, узбеков, нганасан, а у алеутов частота этого аллеля достигает максимального значения (0,344). Минимальное значение частоты аллеля А1 наблюдалось у лесных ненцев (0,059). Максимальная частота аллеля А2 отмечена у абхазов (0,079). У 25 многих народов Сибири и Дальнего Востока, а также у казахов и узбеков концентрация аллеля А2 равна «0» или близка к нему. Ген «В» распространен в Северной Евразии довольно равномерно по всем регионам. В Европейской историкоэтнографической провинции его этнические частоты достигают значений 0.15-0.25, однако у саамов частота равна 0,067. У населения Кавказа наблюдается понижение частоты гена по сравнению с Европейским регионом – здесь этнические частоты варьируют от 0,1 до 0,2; в Средней Азии и Казахстане они выше, чем в Европе и на Кавказе – 0,18-0,3. Народы Сибири и Дальнего Востока также характеризуется в среднем высокой частотой гена «В» и большей амплитудой колебания частот (от 0,11 до 0,30). Максимальных значений частоты гена «В» достигают в самых различных популяциях Северной Евразии, независимо от региона: в Сибири и на Дальнем Востоке у энцев – 0,282, тундровых ненцев – 0,282, лесных ненцев – 0,342, у алтайцев – 0,325, коряков – 0,341, удэгейцев – 0,410; на европейской территории у марийцев – 0,398; на Кавказе у дагестанцев – 0,345, в Средней Азии у узбеков – 0,383 и горцев Памира – 0,371. Минимальные значения частоты гена «В» наблюдаются в популяциях народов Сибири: чукчей – 0,083, шорцев – 0,063, алтайцев – 0,043, эвенков – 0,020; в Европейской части СССР – у русских – 0,082, белорусов – 0,071, саамов – 0,067, украинцев – 0,043; на Кавказе – у армян – 0,081, грузин – 0,033; в Средней Азии – у горцев Памира – 0,059. Т и п и р о в а н и е г р у п п к р о в и с и с т е м ы А В О. В настоящее время в лабораторной практике используются два основных подхода к определению групповой принадлежности по системе АВО. В основе методов лежит реакция агглютинации. Различие методов заключается в применяемых для тестирования реагентах. Классический метод базируется на использовании стандартных изогемагглютинирующих тест-сывороток, которые готовят из донорской крови. Современный – на использовании цоликлонов. 26 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ СИСТЕМЫ АВО О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы: скарификаторы, пинцеты, планшеты для определения групп крови, дозаторы, наконечники для дозаторов, капилляры для крови, резиновая груша, вата, этиловый спирт 70 %, нормальный физиологический раствор, пластиковая пипетка на 2,5 мл, стандартные сыворотки Оαβ, Аβ, Вα, АВо, цоликлоны анти-А и анти-В. О п р е д е л е н и е. При помощи стандартных сывороток. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки для определения групп крови системы АВО готовят из донорской крови. Для маркирования стандартные сыворотки группы A(II) окрашивают в красный цвет эозином калия или натрия, сыворотки B(III) – в синий цвет метиленовым или трипановым синим, сыворотка AB(IV) – в желтый цвет суданом желтым. Сыворотки O(I) не окрашивают, они имеют естественную беловато-желтую окраску. Определение проводят следующим образом: 1. В планшету для определения групп крови дозатором раскапывают стандартные сыворотки Оαβ, Аβ, Вα, АВо по 2 капли в лунку, в указанной последовательности, меняя наконечники дозатора. Оαβ Аβ Вα АВо 2. Дозатором в каждую лунку добавляют каплю цельной гепаринизированной крови или, в случае гемолиза в типируемых образцах, 2 % взвесь эритроцитов. Для приготовления 2 % взвести 0,1 мл эритроцитов предварительно отмывают нормальным физиологическим раствором (2 мл) или 199 средой, распипетируют, центрифугируют 5 минут при 1500 об/мин, надосадочную жидкость удаляют и готовят взвесь необходимой концентрации, добавляя к осадку 1 мл нормального физиологического раствора. 27 3. Исследуемые образцы крови смешивают, например, встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 5 – 10 минут. 4. Учитывают результаты реакции (в случае использования цельной крови, для лучшей регистрации результатов можно добавить в лунки несколько капель физиологического раствора) по схеме (табл. 7). Таблица 7 Схема учета результатов определения АВО-принадлежности при помощи стандартных сывороток Сыворотка Группа O(I) A(II) B(II) AB(IV) Оαβ Аβ Вα АВо + + + + + + + - Агглютинация в лунках с сыворотками Оαβ, Аβ, Вα указывает на наличие в исследуемой сыворотке крови агглютиногенов А и В, то есть кровь относится к группе АВ(IV). Однако, учитывая, что в данном случае может иметь место неспецифическая реакция, необходимо протестировать исследуемую кровь стандартной сывороткой АВо. Если агглютинация не наступает, то исследуемая кровь относится к группе АВ(IV). Если агглютинация проявляется, – значит реакция неспецифическая, и кровь необходимо протестировать другими сериями сывороток. В литературе описано два случая «химер», когда при рождении в течение всей жизни у человека находятся эритроциты, реагирующие как с сывороткой анти-А, так и с анти-О. Это явление объясняется тем, что у близнецов с развитыми сосудистыми связями во время внутриутробной жизни эритроциты группы А поступают в организм к близнецу с группой О, «приживаются» там и воспроизводятся в течение всей жизни. При помощи цоликлонов. Цоликлоны анти-А и анти-В являются продуктом гибридомных клеточных линий, полученных в 28 результате слияния мышиных, антителообразующих В-лимфоцитов с клетками мышиной миеломы, то есть являются моноклональными антителами. Цоликлоны анти-А и анти-В представляют собой асцитную жидкость мышей носителей соответствующей гибридомы, в которой содержатся специфические IgM, направленные против группоспецифических веществ А и В. Типирование проводят следующим образом: 1. В лунку планшеты для определения групп крови или пластины вносят по большой капле цоликлонов анти-А и анти-В. Анти- Анти- А В 2. В лунку дозатором, меняя наконечники, вносят каплю цельной крови или 2 % взвесь эритроцитов. 3. Через 5 минут учитывают результаты реакции по схеме (табл. 8). Таблица 8 Учет результатов при использовании цоликлонов Цоликлон Анти-А Анти-В _ + _ + _ _ + + Группа O(I) A(II) B(II) AB(IV) В о п р о с ы. 1. История открытия системы АВО. 2. Номенклатуры системы АВО. 3. Строение антигенов. 4. Биосинтез антигенов. 5. Наследование групп крови системы АВО. 6. Иммунологические основы системы АВО. 7. Роль антигенов системы АВО в онтогенезе. 8. Геногеография. 9. Биомедицинские аспекты. 29 § 4. СИСТЕМА ГРУПП КРОВИ RHESUS И с т о р и я о т к р ы т и я.11 Официальной датой открытия антигенов системы Rhesus считается 1940 год. К этому времени учеными было открыто уже три эритроцитарных антигенных систем крови (ABO, MN, P), но, учитывая биологическую и медицинскую значимость антигенов системы Rhesus, мы рассмотрим эту систему второй, нарушая хронологию открытий. История открытия антигенов системы Rh сопровождалась определенной путаницей, в результате чего название, которое носит данная система, ей принадлежать не должно. Термин, обозначающий антигены вновь открытой системы, принадлежит Карлу Ландштейнеру. В конце 30-х годов 20 века Карл Ландштейнер и Александр Винер изучали изоагглютиногены стромы эритроцитов, отличные от антигенов ABO, MN, P. Для этого они использовали метод иммунизации подопытных животных с целью выработки в их организме специфических антител. Полученные в результате иммунизации антитела ученые использовали для обработки эритроцитов человека и, соответственно, обнаружения новых антигенов. Предположив, что различия в антигенном составе мембран эритроцитов человека и человекообразных обезьян обеспечат иммуногенность антигенов последних для человека, Ландштейнер и Винер иммунизировали кроликов и морских свинок эритроцитами крови обезьяны макаки-резуса (Macacus rhesus, или по современной номенклатуре M. mulatta). Полученные в результате реакции гетероиммунные антитела абсорбировали эритроцитами человека, и оказалось, что полученные антитела агглютинируют не только эритроциты обезьян, но и эритроциты человека, причем не зависимо от наличия на их мембране антигенов другой групповой принадлежности. Новые выявленные антигены Ландштейнер предложил называть резус-антигенами, а людей, несущих эти антигены, – резус-положительными. Другими исследователями – Левиным и Стетсоном – в 1939 году при обследовании женщины, родившей мертвого ребенка, бы11 Прокоп, О. Группы крови человека / О. Прокоп, В. Геллер. – М., 1991 30 ли обнаружены антитела, способные агглютинировать эритроциты крови 80 % людей, совместимых по системам ABO, MN, P. В анамнезе этой женщины была отмечена гемолитическая болезнь, развившаяся в результате переливания ей несовместимой крови супруга. Выработавшиеся в результате иммунизации организма женщины антитела агглютинировали эритроциты крови ее мужа. Левин и Стетсон предположили, что эта женщина была иммунизирована антигеном мужа, впоследствии экспрессированном на тканях плода. Названия выявленному антигену ученые не дали. В 1940 году исследователи Винер и Петерс описали возможность выработки антител организмами людей, страдающих от посттрансфузионных реакций при переливании несовместимой, по неизвестному антигену, крови. Серологическая специфичность антител оказалась идентичной антителам, обнаруженным Ландштейнером и Левиным. Практически одновременно Винер исследовал антитела, выделенные из сыворотки крови беременной женщины, которые демонстрировали схожую реакцию. Ландштейнер и Винер сделали вывод, о том, что все изученные антитела синтезируются в ответ на одни и те же антигены, которые стали считать антигенами Rhesus. Понадобилось почти 20 лет, чтобы доказать, что это не так. В 1968 году группа ученых (Левин, Стетсон, Матсон) доказали, что антитела, агглютинирующие эритроциты крови человека и животных, связывают антигены, принадлежащие к двум самостоятельным системам крови, генетически независимым и закодированным в генах, расположенных на разных хромосомах. Так, локус, кодирующий антиген, открытый Ландштейнером и Винером в результате иммунизации животных эритроцитами обезьян, был картирован на 19 хромосоме. Сейчас данный антиген обозначен в честь, открывших его ученых – LW (Landsteiner, Wiener). Известно, что антиген LW присутствует на мембране эритроцитов крови почти всех людей (80 %), обезьян и морских свинок. Локус, кодирующий систему антигенов, ответственных за развитие гемолитической болезни новорожденных и посттрансфузионные реакции при переливании несовместимой по этой системе крови, картирован на 1 хромосоме. Тем не менее данная антигенная система сохранила название системы Rhesus. Таким образом, мож- 31 но утверждать, что название системы Rh. является не совсем точным. По выражению Пола Левина оно представляет собой «misnomer» – неправильное употребление термина.12 Н о м е н к л а т у р а. Как и история открытия, номенклатура системы Rhesus также запутана и сложна для понимания. В основе существующих трудностей лежит наличие трех равноценных и активно используемых номенклатур. Это номенклатуры Винера, Фишера-Рейса и Алена-Резенфорда. Номенклатуры Винера и ФишераРейса различаются не только формально, но и отражают различия в концепциях о взаимодействиях генов, кодирующих антигены данной системы (табл. 9). Таблица 9 Номенклатуры системы Rhesus Авторы номенклатур Винер Фишер-Рейс Обозначение антигенов системы Rhesus Rho D rh’ C rh” E Hro d hr’ c hr” e Номенклатура Резенфорда-Алена – это простая цифровая номенклатура. Она была разработана в 1962 году. Она не связана с генетическими теориями, а просто фиксирует результаты серологических исследований. Так в 1962 году было известно 25 антигенов системы Rhesus, к 1986 году – 47, и этот список продолжает расширяться. Г е н е т и к а. Локусы системы Rhesus картированы на 1-й хромосоме (1 p36.2-p34). Антигены локуса D контролируются по типу полного доминирования. Резус-положительные лица, на эритроцитах которых обнаруживается антиген D, являются либо гомозиготами DD по доминантному аллелю, либо гетерозиготами Dd, а лица фенотипа D(–), не имеющие D-антигена на эритроцитах, являются гомозиготами dd по рецессивному аллелю, антигенный продукт которого до сих пор неизвестен, либо отсутствует вовсе, поэтому аллель d считается “молчащим”. Антигены C, c, E, e явля12 Иммуногенетика человека / под ред. С. Литвина. – М.: Мир, 1994. 2 т. 32 ются продуктами одноименных аллелей соответственно в локусах С и Е. Аллели C и c, как и аллели E и e, кодоминантны, благодаря чему все генотипы по каждому из локусов фенотипически различимы. В настоящее время существуют две основные концепции наследования антигенов системы Rhesus13: 1. Автором концепции американской школы генетиков является А. Винер. Согласно данной теории, совокупность факторов системы Rhesus, наблюдаемая на эритроцитах, является продуктом определенного гена в едином генном локусе этой системы. То есть наблюдаемое разнообразие комбинаций антигенов системы Rh обусловлено наличием на соответствующих хромосомах в едином генном локусе множественных аллелей. 2. В 1943 году английский генетик Р. Фишер, обобщив работы Рейса, постулировал, что каждому фактору или антигену системы Rhesus соответствует конкретный аллель, ответственный за его фенотипическую реализацию. Концепция Фишера предполагает наличие на одной хромосоме трех тесно сцепленных локусов, в каждом из которых имеется не менее двух аллельных генов, обусловливающих существование не менее 8 генных комплексов – гаплотипов14 CDE(Rz), CDe(R1), cDE(R2), cDe(R0), cde(r), Cde(r'), cdE(r”), CdE(ry). В сочетаниях по два, гаплотипы серологически выявляются в 18 фенотипах: CDE, CDEe, CDe, CcDE, CcDEe, CcDe, cDE, cDEe, cDe, CD(-)E, CD(-)Ee, CD(-)e, CcD(-)E, CcD(-)Ee, CcD()e, cD(-)E, cD(-)Ee, cD(-)e. Восемь последних фенотипов являются вариантами некогда первоначально открытой резус-отрицательной группы крови Rh(-) или Резус-фактора; последний восемнадцатый фенотип соответствует тройной гомозиготе (ccddee) по отсутствию в генотипе аллелей C, D и E и в этом смысле представляет крайнее (но не редкое) проявление резус-отрицательности. Фишер предсказал открытие соответствующих антител к антигенам; впоследствии все антитела были открыты, кроме анти-d, которое остается и сегодня неизвестным, поддерживая определение Генофонд и геногеография народонаселения / под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. – СПб.: Наука, 2000. 13 14 В скобках даны обозначения по Винеру 33 d-аллеля, как “молчащего гена”. Концепция Р. Фишера позволила также объяснить известные систематические различия в частотах гаплотипов, одни из которых широко распространены (CDe, cDe, cDe, и cde), другие – редки, а третьи – крайне редки, зависимостью частоты гаплотипа от вероятности кроссинговера в том или ином участке последовательности из трех сцепленных локусов. Согласно теории Фишера, при популяционных исследованиях можно найти распространенные, редкие и чрезвычайно редкие фенотипы Rhesus. Редкие фенотипы обусловлены редкими гаплотипами, возникающими не в результате свободного перераспределения аллельных генов в трехлокусном комплексе, а в силу межлокусного кроссинговера. Чрезвычайно редкие фенотипы появляются за счет гаплотипов, которые возникают лишь за счет двойного кроссинговера и потому крайне редки. Наиболее часто встречаются гаплотипы CDe(R1), cDE(R2), cde(r), а четыре редких гаплотипа CDE(Rz), Cde(r'), cdE(r”) и CdE(ry) возникают как продукты различных вариантов кроссинговера, время от времени происходящего в пределах области Rh генов на хромосоме. Редкость гаплотипов кроссоверного происхождения отражает общую редкость такого события, как кроссинговер, в пределах тесно сцепленных генов. Различия между кроссоверными гаплотипами по степени редкости указывают на то, что разные возможные варианты кроссинговера происходят, хотя и с малой, но все же разной частотой. Приняв частоту кроссинговера за сколь угодно малую, но постоянную величину, получим, что частота гаплотипа ry должна быть существенно ниже частоты остальных кроссоверных гаплотипов потому, что комбинация генов CdE (ry) может возникнуть лишь в результате кроссинговера между хромосомами, несущими одна – какой-либо из основных гаплотипов CDe(R1), cDE(R2), cde(r), а другая – какой-либо из кроссоверных гаплотипов CDE(Rz), Cde(r') или cdE(r”). Это равносильно требованию двойного кроссинговера, вероятность которого существенно меньше, чем и без того малая вероятность одинарного кроссинговера между тесно сцепленными локусами. Также легко убедиться, что неравенство в частоте трех остальных кроссоверных гаплотипов соответствует неравенству ча- 34 стот тех гетерозиготных комбинаций хромосом с основными гаплотипами, на основе которых может происходить кроссинговер. Можно показать, что порядок расположения кроссоверных гаплотипов по частоте - CDE(Rz) > Cde(r') > cdE(r”) соответствует частоте гетерозигот, потенциально способных произвести эти кроссоверные гаплотипы, т. е. (CDe(R1) х cDE(R2)>CDE(Rz))>(CDe(R1) x cde(r) >(Cde(r'))>(cDE(R2) x cde(r”)). Из такого соответствия двух последовательностей частот можно сделать вывод, что кроссоверные гаплотипы не просто, возникнув однажды, с тех пор удерживаются в популяциях мира, а возникают вновь и вновь пусть с малой, но все же отличной от нуля частотой. Только в этом случае их частоты могут оказаться в соответствии с частотами гетерозигот по основным гаплотипам системы Rhesus. Последовательность расположения генных локусов C, D и E на хромосоме – D—C—E, а не C—D—E, как считали раньше. Это предположение подтверждается многими наблюдениями, в частности наблюдениями Рейс и сотрудников (1950), которые обнаружили генную комбинацию D––. У лиц с необычным гомозиготным генотипом D––/D–– в эритроцитах крови отсутствовали антигены C, c, E и e. Наличие таких редких фенотипов с повреждением генных локусов C и E свидетельствует о непосредственном их соседстве на хромосомах. В своих многочисленных работах Винер до конца своих дней категорически отрицал теорию Фишера-Рейса. В мировой литературе преимущество отдается и классификации, и генетической концепции Фишера, но правомерно сосуществуют обе концепции. А н т и г е н ы. После открытия в 1940 году антигена системы Rhesus предполагалось, что это простая одноаллельная система. Год спустя, в 1941 г. Винер показал, что примерно 70 % людей несут антиген, отличный от основного резус-фактора. Первый открытый антиген обозначили как антиген D или Rho, а вновь открытый антиген, как С или rh’. Еще спустя год, в 1943 году открыли антиген Е (rh”). В настоящее время число распознанных Rhантигенов продолжает расти. 35 Принятое в медицинской практике деление людей на резусположительных (Rh+) и резус-отрицательных (Rh-) базируется на присутствии антигена D на мембране эритроцитов. Дальнейшее изучение групп крови Rh привело к новым открытиям антигенов и генов этой системы генетического полиморфизма. В 1946 году Страттон открыл вариант антигена D – антиген Du. Оказалось, что определенные D-антигены слабо реагируют с некоторыми антисыворотками (их обозначили Du), кроме того, непостоянство выраженности реакции позволяет предполагать существование серии Du-антигенов. Du-антиген часто встречается у африканского населения, и может быть ошибочно принят за D-отрицательный. Фенотип Du считают резус-положительным у доноров и резус-отрицательным у реципиентов. В отношении антигена С выявлено не менее 5 вариантов. Частота встречаемости и иммуногенность аллельных вариантов антигена С различны. Тип Cw представляет собой одну из альтернативных форм этого антигена. Многие анти-C сыворотки являются также и сыворотками анти-Cw (т. е. представляют собой серологическую специфичность анти-CCw). Частота данной формы в популяциях варьирует от 1 до 7 %. Существуют и более редкие разновидности С-антигена – это u C , Cv, Cx, Cn. Известно, что, несмотря на небольшую распространенность, антиген Сх, тем не менее, может являться причиной гемолитической болезни. Разновидности антигенов Е и е: Eu, Ew, e s. Описаны также антигены f, v и ряд других, всего около 30 разновидностей. Открыта сыворотка анти-v, которая реагирует с клетками, содержащими аллели c, e и e s на одной хромосоме, а также анти-Ce, анти-се и другие полиспецифичные сыворотки такого рода. Есть сообщения об индивидуумах, которые содержали только D-антиген. У других людей не выявлялись реакции ни с одним из Rh-антигенов («Rhнулевые»), хотя эти лица были носителями генов Rh, так как их родители были D-положительными; по-видимому, у этих лиц данные гены подвергались супрессии15. 15 Иммуногенетика человека / под ред. С. Литвина. – М.: Мир, 1994. 2 т. 36 Э к с п р е с с и я. В зависимости от гаплотипа на мембране эритроцитов может быть экспрессировано от 10000 до 30000 молекул АГ D, который является наиболее сильным иммуногеном из 5 основных антигенов групп крови системы Rhesus. Присутствие антигенов системы Rhesus на мембране тромбоцитов и лейкоцитов изучено недостаточно. О наличии в тромбоцитах антигенов C, D и E данные противоречивы: одни авторы их обнаруживают, другие нет. В лейкоцитах данные антигены пока не обнаружены. С т р о е н и е а н т и г е н о в. Известно, что резус-антигены состоят из протеолипидов и интегральных белков, соединенных с цитоскелетом. Липиды необходимы для поддержания правильной конфигурации антигенов, кроме того, они участвуют в экспрессии АГ. При удалении липидов с мембраны антигенные свойства утрачиваются. Полипептиды, несущие антигенные детерминанты разных резус-антигенов (D, C, E), различны по аминокислотному составу. И м м у н о л о г и я. Анти-Rh антитела, как правило, иммунной природы, то есть возникают в результате иммунных реакций в ответ на введение антигена. Анти-D антитела в основном являются IgG или IgM, класс А встречается крайне редко. Гемолитическая болезнь новорожденных (фетальный эритробластоз, Erythroblastosis foetalis) возникает в результате иммунизации Rh– женщины при беременности плодом фенотипа Rh+. В организме резус-отрицательной женщины формируются антитела против чужеродного ей антигена. Иммунные антитела (анти-Rh) являются IgG-иммуноглобулинами, которые, как известно, способны проникать через плацентарный барьер, иммунизируя плод, что и приводит к гемолитической болезни новорожденного. Анти-Rh антитела вызывают гемолиз эритроцитов крови плода или новорожденного, вызывая тяжелые последствия, вплоть до гибели ребенка. Острота иммунологического конфликта резко возрастает с каждой последующей беременностью, приводя не только к более тяжелой форме гемолитической болезни ребенка, но и к более ранней внутриутробной гибели плода. 37 Различают следующие состояния16: Ikterus gravis – тяжелая желтуха, характеризуется значительным повышением уровня билирубина, внутренними кровоизлияниями и судорогами. Hydrops congenitus – выраженная водянка полостей тела, множественные кровоизлияния. Anaemia congenita – выраженная нарастающая анемия. Hepato- и splenomegalia – в результате интоксикации увеличиваются размеры печени и пр. Более высокая частота возникновения гемолитической болезни новорожденных в результате Rh–конфликта наблюдается у матерей с группой крови A по сравнению с женщинами, имеющими группу крови O системы ABO. До середины 60-х годов единственным средством спасения новорожденных, страдающих фетальным эритробластозом, было быстрое переливание крови. В настоящее время иммунизацию матери предотвращают с помощью введения анти-D-антисыворотки, которая разрушает D-положительные клетки плода в кровотоке матери. Б и о л о г и ч е с к а я р о л ь в о н т о г е н е з е. Антигены системы Rhesus достаточно хорошо выражены на всех этапах онтогенеза. Еще в 1964 году Бронникова и Гаркави показали, что наименьший плод, в эритроцитах которого обнаружены Rhантигены, имел возраст 8 недель. Антигены системы Rhesus являются причиной конфликта между плодом и матерью – гемолитической болезнью новорожденных (фетальный эритробластоз). Частота возникновения гемолитической болезни новорожденного, обусловленная антигенами системы Rhesus, представлена в следующем убывающем порядке: D, C, c, E, Cw, e, f. Б и о м е д и ц и н с к и е а с п е к т ы. В долгой истории развития генетики едва ли найдется еще одно открытие, равное по своему научному и практическому значению открытию в крови человека антигенов системы Rhesus. Как было сказано выше, антигены системы Rhesus являются причиной конфликта между плодом и ма16 Иммуногенетика человека / под ред. С. Литвина. – М.: Мир, 1994. 2 т. 38 терью, то есть обусловливают развитие гемолитической болезни новорожденных17. Подобно антигенам системы АВО Rh-антигены являются сильными, мажорными антигенами, с выраженными иммуногенными свойствами. Доказано важное значение антигенов системы Rhesus при трансфузионных осложнениях. Несмотря на интенсивные исследования физиологическая роль данной системы до сих пор неясна. Предполагается, что полипептид D участвует в стабилизации и формировании фосфолипидной асимметрии эритроцитарной мембраны. Посредством связи с цитоскелетом он участвует в поддержании формы и жизнеспособности эритроцита. Также предполагается возможность участия резус-антигенов в транспорте катионов в эритроците. Многочисленными исследованиями установлена связь между Rh-антигенами и риском развития заболеваний как мультифакториальными, так и средовыми (инфекционными). Показана повышенная частота Rh+ фенотипа и фенотипа CcDe у больных язвой желудка и сахарным диабетом. Туберкулез, гломерулонефрит и острая почечная недостаточность чаще встречаются у резус-отрицательных людей. Выявлены достоверные различия генных частот по системе Rhesus у больных острой пневмонией. Показано, что среди больных деформирующим остеоартрозом фенотип Rh- встречается реже, чем Rh+, а группа крови Rh+ чаще встречается у больных остеохондрозом позвоночника. Найдена связь с такими инфекционными заболеваниями у детей первых 7 лет жизни, как корь, краснуха, ангина. Выявлена связь гормонального статуса здоровых людей с системой Rhesus: у резусположительных людей выше содержание тироксина, а у резусотрицательных – АКТГ и СТГ. Отмечено взаимодействие этой системы с другими системами наследственного полиморфизма: Rhнесовместимость между матерью и ребенком влияет на распределение фенотипов гаптоглобина у детей. Дранник, Г. Н. Генетические системы крови человека и болезни. / Г. Н. Дранник, Г. М. Дизик. – Киев, 1990. 17 39 Э т н о г е о г р а ф и я18. Для оценки частот генов (q и p) отдельных локусов (D, C, E) системы Rhesus пользуются формулами для расчета простых двухаллельных систем. q = √nRh-/N ; p = 1 – q, где nRh- - количество резус-отрицательных лиц, N –объем выборки, q – аллельная частота фенотипа Rh- , а p – аллельная частота Rh+. Генотипы рассчитывают следующим образом: IRh+IRh+ = p2; IRh+IRh- = 2pq; IRh-IRh- = q2. Оценка частот гаплотипов системы Rhesus осуществляется так. Находим предварительные оценки частот гаплотипов: cde' = (ccD(-)ee)1/2; cDe' = (ccD(+)ee)1/2 - cde'; Cde' = (CcD(-)ee / 2cde'; cdE' = (ccD(-)Ee / 2cde'; CDe' = ((Cde')2 + CCD(+)ee)1/2 - Cde'; cDe' = ((cdE')2 + ccD(+)EE)1/2 - cdE'; CDE' = CCD(+)Ee / [2(CDe' + Cde')]; где ccD(-)ee, ccD(+)ee и т. д. – частоты фенотипов. Окончательные частоты гаплотипов будут следующие: CDE = CDE' C/(CDe' + Cde' + CDE'); CDe = CDe' C/(CDe' + Cde' + CDE'); Cde = Cde' C/(CDe' + Cde' + CDE'); cDE = cDE'(E - CDE)/(cDE' + cdE'); cdE = cdE'(E - CDE)/(cDE' + cdE'); cDe = cDe'(1 - C - E + CDE)/(cDe' + cde'); Генофонд и геногеография народонаселения / под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. – СПб.: Наука, 2000. 18 40 cde = cde'(1 - C - E + CDE)/(cDe'+ cde'); CDE + CDe + Cde + cDE + cdE + cDe + cde = 1, где C и E - частота аллелей отдельного локуса. При этой технике расчета не учитывается крайне редкий гаплотип CdE. Rh-полиморфизм широко исследован в различных группах населения мира, особенно – полиморфизм по локусу Rh(D). Частоты аллелей D и d отличают, в частности европеоидные (и негроидные) популяции от монголоидных: в монголоидных популяциях аллель d редок и чаще отсутствует вовсе, тогда как в Европе его частота регулярно возрастает с 15-20 % в Восточной Европе до 40-50 % в Западной, достигая максимума на крайнем западе у басков (65 %). Изменчивость частот Rh-гаплотипов в мире высока. Частота гаплотипа CDe (R1) варьирует от 0,05 в некоторых популяциях Африки до 0,90 в племенах Новой Гвинеи. В Европе это один из наиболее часто встречающихся гаплотипов, частота которого повышается с севера в район Средиземноморья. Аллель Сw в гаплотипе CDe очень часто встречается у саамов, финнов, латышей. Гаплотип cDE (R2) заметно чаще обнаруживается у индейцев (частота более 0,50). Уникально распределение гаплотипа cDe (R0) в Африке, где его частота значительно выше, чем в других регионах мира, достигая значений 0,90. С максимальной частотой гаплотип cde наблюдается в Европе и практически отсутствует на Дальнем Востоке. Гаплотип CDE повсеместно редок из-за малой вероятности того типа кроссинговера, при котором может возникнуть такая линейная комбинация аллелей, однако этот гаплотип довольно часто встречается в племенах Индии и в некоторых австралийских племенах; редкий по той же причине гаплотип cdE обнаружен с высокой частотой у айнов Хоккайдо. В Европейской историко-этнографической провинции этнические частоты гена d в среднем равны 0,2-0,4, минимальная частота у саамов (0,163), а максимальная – у латышей (0,388). На Кавказе этнические частоты этого аллеля несколько ниже – 0,30-0,35. На территории Средней Азии и Казахстана разброс этнических частот такой же, как в Европейской части страны. Сибирь и Дальний Во- 41 сток характеризуется самыми низкими в Северной Евразии значениями этнических средних частот гена d: 0-0,20. Максимальные частоты гена d отмечены в локальных популяциях Европейской части страны у литовцев – 0,436, украинцев – 0,442, белорусов – 0,483; в двух популяциях горцев Памира – 0,427 и 0,506, а также в одной сибирской популяции – у долган – 0,528. Минимальные значения частот гена d в локальных популяциях Европейской части страны составляют: у украинцев – 0,095, саамов – 0,137, башкир – 0,172; на территории Казахстана у казахов – 0, также равна нулю частота аллеля в большинстве популяций Сибири и Дальнего Востока. Частота гаплотипа CDE (RZ) на уровне локальных популяций меняется в интервале от 0 до 0,44. Частоты гаплотипа RZ большие 0,08, отмечены лишь в популяциях Сибири и Дальнего Востока. Для большего числа изученных этносов (66 %) характерна частота меньше 0,08. Средняя этническая частота RZ в Северной Евразии составляет 0,066±0.010 и почти в 3 раза больше мировой средней (0,023). Частота гаплотипа CDe (R1) меняется по локальным популяциям от 0 до 0,7. Практически для всех этносов частота R1 лежит в интервале от 0,1 до 0,7 и лишь для селькупов определена низкая частота (0,060). Отметим, что столь большой размах изменчивости характерен для народов историко-этнографической провинции Сибири и Дальнего Востока. Коренное население Европейской провинции, Кавказа и Средней Азии имеет частоты R1-гаплотипа в пределах от 0,3 до 0,6. Средняя этническая частота R1 составляет 0,379±0,018, оказывается меньше мировой средней (0,562) частоты гаплотипа CDe (R1). Частота гаплотипа cDE (R2) в локальных популяциях меняется от 0 до 0,7. Максимальная частота отмечена в популяциях лесных ненцев и нганасан. Частота R2 на этническом уровне варьирует в столь же широких пределах, что и на популяционном. Частоты больше 0,3 встречаются лишь у коренного населения Сибири и Дальнего Востока. Общая этническая средняя частота (R2) – 0,249 оказывается больше мировой средней (0,179) частоты гаплотипа cDE (R2). 42 Частота гаплотипа cDe (R0) в локальных популяциях варьирует в очень широких пределах (от 0 до 0,8). Частота R0 на этническом уровне варьирует в гораздо более узких пределах от 0 до 0.5, причем частота 0,0-0,2 отмечена только у народов Сибири и Дальнего Востока. Общая этническая средняя частота (R0) – 0,152; лишь в регионе Сибири и Дальнего Востока региональная частота достоверно больше этой общей средней, тогда как в других – она меньше. Мировая средняя частота (0,143) близка к этнической средней частоте (0,152) гаплотипа cDe (R0) у народов Северной Евразии. Частота гаплотипа Cde (r') в локальных популяциях имеет размах изменчивости от 0 до 0,12. Этническое распределение асимметрично. Большинство этносов характеризуются частотой r' 0–0,02. Частота Cde (r') – 0,04 встретилась только у башкир и сванов. Общая средняя этническая частота (r') – 0,010 характерна для большинства изученных этносов и совпадает с мировой частотой r'. Для коренного населения европейского, кавказского и среднеазиатского регионов в целом характерна частота r', большая общей средней, в то время как для коренного населения сибирского региона характерно отсутствие гаплотипа r' (за исключением хантов, якутов и южных алтайцев). Частота гаплотипа cdE (r”) в локальных популяциях имеет размах изменчивости от 0 в большинстве популяций до 0,18 (у казахов). В большинстве изученных этносов (90 %) гаплотип r” отсутствует вовсе. Так, из 25 этносов в Сибири гаплотип r” наблюдался только в трех (манси, ханты, тофалары). Общая этническая средняя частота гаплотипа cdE в Северной Евразии мала – 0,006±0,002, но все же она вдвое выше мировой средней (0,003). Частота гаплотипа cde (r) в локальных популяциях имеет размах изменчивости от 0 до 0,45. Общая этническая средняя частота (0,136) гаплотипа cde(r) приходится на интервал 0,10-0,15, в который попадают частоты этносов, имеющих смешанное монголоидно-европеоидное происхождение, либо испытавшие влияние той или иной из двух больших рас человека: хакасы, северные алтайцы, манси, уйгуры и калмыки. Для этносов Европейской и Кавказской провинций (кроме калмыков) характерны частоты cde (r) выше 0,20, более низкие частоты cde наблюдаются у казахов, узбеков и уйгур, в то время как в провинции Сибири и Дальнего Востока гап- 43 лотип cde (r) очень редок или просто отсутствует у многих этносов. Общая этническая средняя частота cde(r) (0,136) в Северной Евразии почти вдвое превышает мировую среднюю (0,08). Т и п и р о в а н и е г р у п п к р о в и R h e s u s. Для определения антигенов системы резус Rh(D) применяют стандартный универсальный реагент Rho(D), содержащий полные резусантитела IgG, с высокой агглютинационной активностью. Источником получения таких сывороток анти-резус является кровь резусотрицательных женщин, сенсибилизированных резус-положительным плодом в течение беременности. Первично отрицательные образцы дополнительно исследуются с использованием стандартного универсального реагента Rho’(DС) и стандартной сывороткой Rho”(DСЕ). Резус-отрицательными считают доноров, кровь которых не содержит ни одного из трех антигенов (D, C, E). В последнее время в лабораторной практике применяются цоликлоны, например «Анти-D-супер». ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы: скарификаторы, пинцеты, планшеты для определения резус-принадлежности, дозаторы, наконечники для дозаторов, капилляры для крови, резиновая груша, вата, этиловый спирт 70 %, нормальный физиологический раствор, пластиковая пипетка на 2,5 мл, стандартные сыворотки Rho(D), цоликлон анти-D-супер. Определение антигена D С помощью универсальных реагентов19. Стандартный реагент Rho(D) содержит поликлональные анти-D-антитела. Одновременно с исследованием образца крови проводится контрольное исследование стандартных резус-положительных эритроцитов и стандартных резус-отрицательных эритроцитов обязательно одногруппных с исследуемой кровью. Шевченко, Ю. Л. Безопасное переливание крови. / Ю. Л. Шевченко, Е. Б. Жибурт. – СПб.: Питер, 2000. 19 44 1. На дно пробирки вносят 1 каплю стандартного реагента Rho(D), добавляют каплю исследуемой крови или 2 % взвеси эритроцитов, содержимое пробирки перемешивают встряхиванием. 2. Медленно переворачивают пробирку, наклоняя ее почти горизонтально таким образом, чтобы содержимое растекалось по стенкам. Это делает реакцию более выраженной. 3. Учет результатов производят через 3-5 минут. Для исключения неспецифической реакции в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают покачиванием (не встряхивать!). Наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветленной жидкости свидетельствует о резусположительной принадлежности исследуемой крови. При помощи цоликлона «Анти D-супер». Моноклональный реагент содержит полные антитела анти-D Ig M. Реакция проводится не в пробирке, а на плоскости, в нативной крови без антикоагулянта. 1. На пластинку наносят большую каплю (0,1 мл) реагента, рядом помещают исследуемый образец (0,01-0,05 мл). 2. Кровь и реагент смешивают стеклянной палочкой и через 10 с начинают покачивать пластинку. 3. Результат учитывают через 3 мин. Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии в исследуемых эритроцитах антигена D, то есть исследуемый образец – резус-положительный. Определение антигенной принадлежности крови по АГ С, с, Е, е с использованием цоликлонов «Анти-АГсупер» осуществляется таким же образом. В о п р о с ы. 1. История открытия системы Rh. 2. Номенклатуры системы Rh. 3. Строение антигенов. 4. Полиморфизм антигенов. 5. Генетические концепции и наследование групп крови системы Rh. 6. Иммунологическая значимость Rh. 7. Роль антигенов системы Rh в онтогенезе. 8. Геногеография. 9. Биомедицинские аспекты. 45 § 5. ЭРИТРОЦИТАРНАЯ АНТИГЕННАЯ СИСТЕМА MNSs И с т о р и я. Эритроцитарная антигенная система MN является второй, с точки зрения хронологии открытий, системой групп крови, выявленной на мембране эритроцитов людей. Первые антигены системы MN были обнаружены в 1927 году Карлом Ландштейнером и Полом Левиным. В своем эксперименте они использовали гетероиммунные антитела, полученные в результате иммунизации кроликов человеческими эритроцитами разной групповой принадлежности по системе АВО. Полученные в эксперименте гетероиммунные антитела исследователи предварительно адсорбировали кровью соответствующих доноров, для удаления из смеси антител анти-АВО принадлежности, а затем оставшуюся смесь антител продолжали изучать. Ландштейнер и Левин выяснили, что в полученной смеси гетероиммунных антител оставались антитела против каких-то неизвестных антигенов, так как после адсорбции АВО-антигенами, оставшиеся антитела продолжали агглютинировать эритроциты людей вне зависимости от их групповой принадлежности по системе АВО. Характер наблюдаемых реакций позволил предположить наличие двух различных антигенных рецепторов, так как только часть исследуемых образцов крови агглютинировалась этими антителами, а другая часть – не взаимодействовала с ними. В последующих экспериментах, при дальнейшей иммунизации кроликов эритроцитами, не вступавшими в реакцию взаимодействия с антителами первого типа, Ландштейнер и Левин получили новую смесь гетероиммунных антител с противоположной серологической характеристикой. Получив, таким образом, два серологических реагента, каждый из которых выявлял свой специфический антиген, ученые обнаружили, что у части людей на мембране эритроцитов присутствуют оба антигена, так как оба реагента в реакции вызывали специфическую агглютинацию. Открытые антигены обозначили символами M и N. На этом история открытия антигенов данной системы не завершилась. Спустя почти 20 лет, в 1947 году, Р. Волш и К. Монтгомери в ходе исследования случая резус-конфликта обнаружили 46 антитела ранее неизвестной специфичности. Выявленные антитела они обозначили как анти-S и впоследствии неоднократно обнаруживали в сыворотке крови разных людей. В 1948 году Р. Сангер со своими сотрудниками сообщили о существовании какой-то связи между анти-S антителами и системой MN. Ими была обнаружена генетическая корреляция между антигенами M, N и фактором S. В своей работе исследователи протестировали 190 образцов крови и установили, что антиген S чаще встречался у людей с фенотипом М и, соответственно, реже при фенотипе N. В 1951 году П. Левин высказал предположение о существовании антигена анти-s, что и было экспериментально подтверждено в 1958 году Гиблеттом. Гетероиммунные антитела антиs были получены в результате иммунизации кроликов эритроцитами, гомозиготных по антигену s, людей. Н о м е н к л а т у р а. Таким образом, к концу 50-х годов 20 века было установлено, что система MNSs состоит из двух пар антигенов, которые были обозначены как M, N и S, s. То есть символика, предложенная учеными, открывшими данные антигены, «прижилась» и продолжает использоваться в настоящее время. В описании антигенов системы MNSs используются номенклатурные обозначения гликофоринов, этот подход базируется на особенностях биохимического строения групповых субстанций (табл. 10). Таблица 10 Современная номенклатура гликофоринов Номенклатуры по H.Furthmayr по W.Dahr по D.J.Anstee GP-A MN-SGP α-sgp GP-B Ss-SGP β-sgp Примечание. GP – гликофорин, SGP – сиалогликопротеин После того как было доказано, что мембраны эритроцитов человека содержат четыре богатых сиаловой кислотой гликопротеина, называемых гликофоринами, а также того, что именно гликофорины служат антигенами групп крови системы MNSs, в описаниях 47 особенностей биохимического строения антигенов стали применяться новые обозначения.20 Г е н е т и к а. Локус MNSs у человека находится на 4-й хромосоме (4q28–4q31). Первая гипотеза о механизме наследования антигенов M и N была высказана исследователями, открывшими эти антигены, то есть Ландштейнером и Левиным. Они высказали предположение о простом аутосомальном кодоминантном типе наследования. Правильность данного предположения была подтверждена позднее в их собственных исследованиях и в работах других ученых, например Винера и Векслера. Порядок наследования антигена S был установлен в 1948 году Сангером и подтвержден в 1949 году Рейсом. Они выдвинули гипотезу о тесной корреляции генных локусов, контролирующих синтез антигенов MN и Ss. О генетической связи генов, кодирующих групповые субстанции M и N, а также S и s, было высказано множество предположений. Наиболее признанными и достаточно длительное время конкурирующими за истинность были две концепции. Первая, сформулированная А. Винером, подразумевала наличие единого генного локуса системы MNSs с четырьмя кодоминантными аллелями MS, Ms, NS и Ns. Вторая, сторонником которой был Р. Рейс, заключалась в наличии двух тесно сцепленных между собой генных локусов MN и Ss, в каждом из которых присутствует пара кодоминантных аллелей (M – N и S – s). Из этих гипотез о наследовании генетической взаимосвязи групп крови MN и Ss предпочтение отдается последней. В пользу гипотезы Р.Рейса свидетельствуют данные о рекомбинации генов локусов MN и Ss и биохимические исследования антигенов M, N, S и s. В 1967 году Т. Гедде-Дал, изучая семейный случай доминантно наследуемого заболевания, обнаружил ребенка с фенотипом MSNS у родителей с фенотипом MSNs. Так как возможность внебрачного ребенка была полностью исключена, данный случай свидетельствовал о рекомбинации генов внутри тесно сцепленных генных локусов. 20 Иммуногенетика человека / под ред. С. Литвина. – М.: Мир, 1994. 2 т. 48 Согласно современным представлениям, локус MNSs соответствует двум родственным и расположенным рядом генам, кодирующим две молекулы гликофоринов GP-A и GP-B. Локусы MN и Ss (по новой номенклатуре GP-A и GP-B соответственно) расположены на 4 хромосоме. Четыре гаплотипа могут образовывать 10 генотипов, из которых фенотипически различимы 9: MS (MSMS), MSs (MSMs), Ms (MsMs), MSN (MSNS), MSNs (MSNs, MsNS), MsN (MsNs), NS (NSNS), NSs (NSNs), Ns (NsNs). Предполагается, что полиморфизм системы MNSs возник очень давно, еще на этапе гоминид, являющихся общими предками человека и человекообразных обезьян. Э к с п р е с с и я. Попытки обнаружить антигены MNSs в различных тканях человека привели к противоречивым результатам. Было выявлено, что эти молекулы присутствуют в костном мозге, но их экспрессия ограничена только клетками эритроидного ростка. Распространенность антигенов системы MNSs в животном и растительном мире изучена еще недостаточно. Есть сведения, что антигены M и N найдены у некоторых беспозвоночных: дождевых червей, улиток, аскарид. Б и о х и м и я. Известно, что различия в групповой специфичности субстанций M и N основаны на аминокислотных различиях MN- и Ss-специфичных гликопротеинов. Методом электрофореза в ПААГ в эритроцитарных мембранах выделили три фракции сиалогликопротеинов: PAS-1, PAS-2 и PAS-3. Групповые субстанции MN относятся к PAS-1 (MN-SGP,GP-A или α-sgp, по другим номенклатурам гликофоринов). К фракции PAS-3 относятся антигены Ss (табл. 11). Таблица 11 Особенности гликофориновых фракций Гликофорины GP-A GP-B Число молекул на эритроцит 900 000 300 000 Молекулярная масса 37 кДа 24 кДа Содержание в мембране (%) 60 15 49 А н т и г е н ы. В систему MNSs входят 4 основных антигена и более 30 редких вариантов, различающихся и по антигенным характеристикам, и по биохимическому строению. В ряд антигенов, относящихся к GP-A (гликофорин А), входят редкие антигены, объединенные в комплекс «Мильтенбергер» – Mi. Выделяют 8 классов от Mi-l до Mi-8. К гликофоринам А относят Mi-1, Mi-2, Mi-7 и Mi-8. Антигены Mi-1, Mi-2 отличаются заменой треонина на метионин и лизин соответственно в 28 позиции. У антигенов Mi-7 аргинин-49 и тирозин-52 заменены остатками гидроксиаминокислот . В случае Mi-8 выявлена одна замена в позиции аргинин-49, что позволяет сделать предположение о том, что ген Mi-8 является промежуточным звеном в эволюции между аллелем М и Mi-7. Помимо антигенов подсистемы Мильтенбергер к редким антигенам MN локуса относятся антигены M1, M2, Mc, Mgy, Mk и другие. Пятым по хронологии открытий антигеном, принадлежность которого к комплексу MNSs была доказана, был антиген U. По своему биохимическому строению он относится к GP-B (гликофоринВ). Позже были открыты антигены Hu, He, обнаруженные у негроидной расы. Описаны также антигены подсистемы Мильтенбергер: Mi-3, Mi-4 и Mi-6. Это редко встречающиеся специфичности. С т р о е н и е а н т и г е н о в21. GP-A состоит из 131 аминокислоты и 16 олигосахаридов. Около 60 % от массы GP-A приходится на углеводы. Молекула построена из трех доменов: внеклеточного – гидрофильного, центрального – гидрофобного, погруженного в двойной липидный слой мембраны и цитоплазматического – гидрофильного. Внеклеточный фрагмент содержит углеводную цепь, присоединенную к остатку аспаргина гликозидной связью. Именно внеклеточный домен GP-A несет антигенные детерминанты АГ M и N, которые образованы N-концевыми пептидами, несущими олигосахариды. Антигенная специфичность групповых субстанций MN основана на различиях аминокислотных последовательностей внекле21 Иммуногенетика человека / под ред. С. Литвина. – М.: Мир, 1994. 2 т. 50 точного домена в позициях 1 и 5. В молекуле, определяющей группу «М», находятся остатки серина и глицина. В молекуле – «N» – лейцина и глутаминовой кислоты. GP-B построен подобно GP-A. Молекула состоит из 71 аминокислотного остатка, его гидрофильные домены короче, чем у GP-A. Существует гипотеза, согласно которой гены GP образовались в ходе эволюции как результат дупликации. Различия в строении группоспецифических веществ S и s сфокусированы в замене метионина (S) на треонин (s) в 29 позиции гликофорина В. И м м у н о л о г и ч е с к и е а с п е к т ы. Антитела анти-M и анти-N из сыворотки крови человека обладают «эффектом дозы», то есть значительно сильнее агглютинируют эритроциты крови гомозиготных фенотипов «M» и «N» по сравнению с гетерозиготным – «MN». Система MNSs имеет меньшее значение при переливании крови по сравнению с системами АВО и Rhesus, видимо, в связи с меньшей иммуногенностью антигенов. Однако известны случаи посттрансфузионных осложнений, вызванных антителами анти-M, а также при несовместимости по антигенному набору Ss. Б и о л о г и ч е с к а я р о л ь в о н т о г е н е з е. Групповые антигены системы MNSs выявляются у плода в возрасте 5 недель, а к моменту рождения ребенка полностью сформированы. Антигены «S» и «Mi» могут быть причиной гемолитической болезни новорожденного в легкой форме, в то время как антигены «M» и «N» не приводят к иммунному конфликту между матерью и плодом. Б и о м е д и ц и н с к и е а с п е к т ы. Физиологическая роль антигенов системы MNSs остается неясной. Так как наружные участки гликофоринов гидрофильны и отрицательно заряжены, предполагается, что они могут предотвращать адгезию эритроцитов и их «прилипание» к клеткам эндотелия. Возможно также, что углеводные цепи гликофоринов формируют оболочку, которая препятствует протеолизу эритроцитов. В ряде исследований было показано, что антигены MN могут влиять на резистентость или чувствительность к микроорганизмам. 51 Так, например, белки, входящие в состав фимбрий бактерий, которые способствуют прилипанию, направленно реагируют с GP-А групповой специфичности М. Подобно антигенам систем ABO и Rhesus эритроцитарные изоантигены MNSs используют в судебно-медицинской экспертизе, популяционно-генетических исследованиях, при изучении несовместимости мать-плод и выявлении предрасположенности к заболеваниям. Рядом исследователей показана связь между системой MNSs и болезнями. Достоверно повышенная частота группы крови «MN» отмечена у больных сахарным диабетом. Вероятность заболеть острой пневмонией у детей зависит от фенотипа по системе «MN». Отмечена повышенная частота группы «M» у больных атеросклерозом, ИБС. Группы крови «N» чаще встречаются у больных остеохондрозом и при инфаркте миокарда. Показана также ассоциация между систолическим давлением и группами крови системы MNSs.22 Э т н о г е о г р а ф и я23. Расчет аллельных частот проводится следующим образом: m = 2MM + MN/ 2n; n = 2NN + mn/ 2n где m и n – аллельные частоты M и N, соответственно; MM, MN, NN – наблюдаемые численности людей с данными фенотипами, а n – общий объем группы. Используя в работе антисыворотки анти-M, -N, -S и s, исследователь может наблюдать 9 фенотипов системы MNSs (табл. 12). Частоты гаплотипов MS, Ms, NS, Ns могут быть рассчитаны по следующей схеме. Находим предварительные оценки частот гаплотипов: MS' = MMSS + 1/2 (MMSs + MNSS); Дранник, Г. Н. Генетические системы крови человека и болезни. / Г. Н. Дранник, Г. М. Дизик. – Киев, 1990. 22 23 Генофонд и геногеография народонаселения / под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. – СПб.: Наука, 2000. 52 Ms' = MMss + 1/2 (MMSs + MNss); NS' = nnSS + 1/2 (NNSs + MNSS); Ns' = NNss + 1/2 (NNSs + MNss); где MMSS, MMSs и т. д. – частоты соответствующих фенотипов. Поскольку сумма предварительных оценок частот гаплотипов не равна 1, а составляет MS' + Ms' + NS' + Ns' = 1 - MNSs, подразделяем величину MNSs пропорционально полученным оценкам частот гаплотипов: MNSs = (MS' Ns')/(Ms' NS' ). Таблица 12 Оценка частот гаплотипов системы MNSs Фенотип MS MSs Ms MNSS MNSs MNss NNSS NNSs NNss Генотип MS/MS MS/Ms Ms/Ms MS/NS MS/Ns, Ms/NS Ms/Ns NS/NS NS/Ns Ns/Ns Частота генотипа (MS)2 2 MS Ms (Ms)2 2 MS NS 2 MS Ns + 2 Ms NS 2 Ms Ns (NS)2 2 NS Ns (Ns)2 Далее находим окончательные частоты гаплотипов: MS = MS' + 1/2 [MNSs/ (MS' Ns' + Ms' NS')] MS' Ns'; Ms = Ms' + 1/2 [MNSs/ (MS' Ns' + Ms' NS')] Ms' NS'; NS = NS' + 1/2 [MNSs/ (MS' Ns' + Ms' NS')] Ms' NS'; Ns = Ns' + 1/2 [MNSs/ (MS' Ns' + Ms' NS')] MS' Ns'; 53 MS + Ms + NS + Ns = 1. Для системы MNSs более подробно изучено распространение в мировой популяции антигенов «M» и «N». Частоты генов «M» и «N» в мире в среднем колеблются от 0,4 до 0,7. Ген «М» имеет крайне низкую частоту (0,2) в Новой Гвинее и некоторых районах Австралии и достигает частоты 0,9 в некоторых частях Нового Света. Сравнительно высокие частоты этого гена встречаются также в Аравии, на северо-востоке Сибири, в Юго-Восточной Азии. На большей части территории Европы частота этого гена примерно равна 0.5, однако она ниже у саамов и выше у сардинцев. Максимальная частота гена N в мире – 1, минимальная – 0,006. Частоты аллеля «S» в Европе составляют 0,30-0,35, выше на Среднем Востоке – 0,40, в Восточной Азии – от 0,05 до 0,20, в Австралии этот аллель практически отсутствует. Фенотипы MNS и MNs чаще встречаются в Европе. У китайцев сочетание MNSS достигает 0,38, такая же картина наблюдается и в Африке. Гаплотип MS представляет собой наиболее частое сочетание генов на Среднем Востоке и в Индии, в Восточной Азии чаще встречается гаплотип Ms. Частота гена «N» этносов Европейской провинции лежит в весьма узких пределах 0,4-0,5, в Сибири и на Дальнем Востоке этнические частоты гена колеблются от 0,3 до 0,7. Самая низкая частота аллеля «N» отмечается в одной из популяций башкир – 0,108, а самые высокие частоты – в некоторых сибирских популяциях: у тундровых ненцев – 0,702, у нганасан – 0,783; довольно высокие частоты наблюдаются также среди русского населения – 0,632 и у белорусов – 0,650. Частоты гаплотипов на популяционном уровне варьирует в широких пределах. Максимальная частота MS (0,812) отмечена в одной из популяций ульчей. Гаплотипа Ms встречается с частотой от 0,145 (ханты) до 0,649 (хакасы), таким образом, этнические минимум и максимум частоты гаплотипа находятся в одной историкоэтнографической провинции Сибири и Дальнего Востока. Отсутствие гаплотипа NS отмечено в популяциях лесных ненцев, ульчей и чукчей. На этническом уровне частота NS меняется от 0,01 (лесные ненцы) до 0,365 (тофалары). Частота гаплотипа Ns варьирует от 0 (в популяциях негидальцев и ульчей) до 0,777 (в одной из по- 54 пуляций нганасан). Минимальное значение частоты Ns отмечено у бурят (0,119), максимальное – у нганасан (0,713). Т и п и р о в а н и е г р у п п к р о в и с и с т е м ы MN. Для определения антигенов системы MN используются кроличьи адсорбированные сыворотки анти-М и анти-N, которые получают (анти-М) методом иммунизации кроликов эритроцитами «ОМ» с последующей адсорбцией их эритроцитами групп «ON», «AN», «BN». Анти-N – «ON» адсорбируя эритроцитами «ОМ», «АМ», «ВМ». В последнее время в лабораторной практике применяются цоликлоны, например «анти-M» и «анти-N». ОПРЕДЕЛЕНИЕ MN-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы: скарификаторы, пинцеты, планшеты для определения MN-принадлежности, дозаторы, наконечники для дозаторов, капилляры для крови, резиновая груша, вата, этиловый спирт 70 %, нормальный физиологический раствор, пластиковая пипетка на 2,5 мл, кроличьи адсорбированные сыворотки, цоликлоны. О п р е д е л е н и е а н т и г е н ов. С помощью универсальных реагентов. Кроличьи сыворотки содержит поликлональные анти-MN-антитела. 1. В лунку планшеты вносят 1 каплю стандартного тестсыворотки, добавляют каплю исследуемой крови или 2% взвеси эритроцитов, содержимое перемешивают встряхиванием. АнтиМ АнтиN 2. Медленно переворачивают планшету, чтобы содержимое растекалось по стенкам. Это делает реакцию более выраженной. 55 3. Учет результатов производят через 3 – 5 минут (табл. 13). Для исключения неспецифической реакции в лунку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают покачиванием. Таблица 13 Учет результатов при типировании антигенов M и N Тест-сыворотки Анти-М Анти-N Фенотипы MM + MN + + NN + Примечание. «+» – наличие агглютинации, «-» – отсутствие Наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветленной жидкости свидетельствует о положительной принадлежности исследуемой крови. При помощи цоликлонов. Используют моноклональные реагенты с полными антителами. Типирование проводят следующим образом. 1. В лунку планшеты для определения групп крови или пластины вносят по большой капле цоликлонов анти-M и анти-N. АнтиM 2. 3. АнтиN В лунку дозатором, меняя наконечники, вносят каплю цельной крови или 2 % взвесь эритроцитов. Через 5 минут учитывают результаты реакции по схеме (табл. 13). В о п р о с ы. 1. История открытия системы MN. 2. Номенклатуры системы MN. 3. Строение антигенов. 4. Полиморфизм антигенов. 5. Генетические концепции и наследование групп крови системы MN. 6. Иммунологическая значимость MN. 7. Роль антигенов системы MN в онтогенезе. 8. Геногеография. 9. Биомедицинские аспекты. 56 § 6. СИСТЕМА Р И с т о р и я о т к р ы т и я. Антиген Р был открыт в 1927 году К. Ландштейнером и П. Левиным практически одновременно с открытием на мембране эритроцитов людей первого антигена системы MNSs. Тест-сывороткой для выявления нового антигена послужила смесь гетероиммунных антител, полученная путем иммунизации кроликов эритроцитами крови человека. Позже, в 1934 году японские исследователи обнаружили антиген, который обозначили символом «Q». Этот антиген имел определенное отношение к антигену Р, так как содержался на мембране эритроцитов большинства Р+ людей. Но, тем не менее, практически до 1955 года система Р считалась простой однофакторной системой крови. Открытие новых антигенов, принадлежность которых к системе Р была позже установлена, началось с 1951 года. Именно в этом году Пол Левин, анализируя сыворотку крови женщины по имени Джей (Jay) фенотип которой по эритроцитарным антигенам был О, Р- , обнаружил антитела, агглютинирующие эритроциты большинства людей, исследованных Левиным. Антитела обозначили как анти-Tja (tumor Jay), по имени женщины в сыворотке они были обнаружены. В 1954 – 1955 годах две исследовательские группы, возглавляемые П. Левиным и Р. Рейсом, открыли антитела анти-Tjb. Они оказались очень редкими и присутствовали у немногих людей. То, что антитела анти-Tja и Tjb относятся к системе Р в 1955 году, установил Р. Сангер. В результате первый открытый антиген этой системы получил обозначение Р1, а внутри старой группы Рпоявилось два новых фенотипа Р2 и р. Затем представления об антигенах системы Р еще более усложнились. В 1959 году Дж. Матсон и Я. Свенсон выявили еще один антиген, принадлежность которого к системе Р была установлена. Этот антиген обозначили символом «рk», а в 1965 году А. Е. Кортекангас подразделил этот фенотип еще на два фенотипа: р1k и р2k. Согласно современным представлениям существует 5 фенотипов по системе: Р, Р1, Р2, рk, р1k и р2k . 57 Г е н е т и к а. Гены системы Р локализованы на 22 хромосоме (22 q11.2-q ter). История становления представлений о механизмах наследования антигенов системы Р отражает те изменения, которые происходили во взглядах на эту систему с каждым вновь открытым антигеном. Первоначально система P считалась простой генетически обусловленной системой – ген P доминировал над гипотетическим геном p, обусловливающим в гомозиготной форме отсутствие антигена P в эритроцитах крови человека. После того, как было установлено присутствие в системе Р трех антигенов: Р1, Р2 и р, возникла трехаллельная концепция наследования антигенов этой системы. Согласно данной теории в одном кодоминантном аутосомном генном локусе находятся три аллельных гена Р1, Р2 и р, которые контролируют полиморфизм антигенов системы Р. Причем аллель Р1 доминирует над аллелем Р2 и р, а аллель Р2 – над р. А. Е. Кортекангас, обнаружив новые антигены р1k и р2k, предложил новую формально-генетическую модель наследования антигенов системы Р. Суть ее сводилась к следующему: антигены системы Р генетически реализуются под действием аллелей, относящихся к двум независимым генным локусам, которые оказывают совместное воздействие на общую субстанцию антигенного предшественника. В результате под действием гена рk из вещества предшественника образуется субстанция рk, на которую может действовать аллель Р, вызывая ее переход в субстанцию Р (Рглобозид). Далее на Р-глобозид воздействует аллель Р1 из другого генного локуса, вызывая трансформацию Р-глобозида в субстанцию Р1. Согласно другой концепции, предложенной в середине 70-х годов Р. Рейсом и Р. Сангером, также считается, что локус Р включает четыре аллеля Р1, Р2, Рk и р; серологически определяются четыре фенотипа: Р1, Р2, Рk, Tja. Антиген Tja содержится почти у всех людей, антитело анти-Tja агглютинирует клетки людей с фенотипами Р1, Р2, Рk. Лица, не имеющие Tja-антигена, считаются гомозиготными по очень редкому аллелю р, у них в плазме крови содержатся все антитела системы Р. Генный контроль в этой системе осуществляется следующим образом (данные в табл. 14). 58 Таблица 14 Фенотипические и генотипические варианты Фено- Tja+ Tja+ Tja+ Tja- Фено- P1 P2 Pk p Гено- P1P1, P1P2, P 1p P2P2, P1p PkPk, Pkp pp тип тип тип Э к с п р е с с и я. Антигены Р и Р-подобные вещества обнаружены у аскарид, дождевых червей, в икре плотвы, улиток, голубей, в некоторых растениях и др. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что антигены Р широко распространены в природе, примерно так же, как и групповые антигены системы ABO(H). У человека антигены рk и Р2 присутствуют на мембране всех нормальных эритроцитов, а также обнаруживаются в различных концентрациях практически во всех тканях человека, за исключением нервной. Б и о с и н т е з24. Биохимически антигены Р представляют собой нейтральные гликосфинголипиды. Современные представления о биосинтезе антигенов системы Р отражены на рис. 2 – 4. Биосинтез антигенов системы Р в нормальных эритроцитах протекает следующим образом: ген рk кодирует α-4-Dгалактозилтрансферазу, которая обеспечивает синтез антигена рk – глоботриозилцерамида (CTH) из вещества предшественника – лактозилцерамида (CDH). рk (CTH) CDH Ген рk 24 Ген Р2 P2 (Р-глобозид) или параглобозид Р1 Ген Р1 Иммуногенетика человека / под ред. С. Литвина – М.: Мир, 1994. – 368 с. 59 Рис. 2. Биосинтез антигенов системы «Р» в нормальных эритроцитах Под действием гена Р2 следующая трансфераза (β-3-Dгалактозаминилтрансфераза) катализирует превращение субстанции рk в антиген Р2 – глоботетрзилцерамид. Затем под действием гена Р1 образуется антиген Р1. Природа продукта гена Р1 до конца не установлена. Однако известно, что кодируемая им трансфераза может использовать другие акцепторные молекулы, например, параглобозид - лактонеотетразилцерамид. Фенотип «рk» CDH рk (CTH) -------//------ P2 (Р-глобозид) Ген рk Рис. 3. Биосинтез антиген «рk» в эритроцитах с биохимическим дефектом Биохимический дефект, определяющий появление фенотипа «р », обусловлен утратой β-3-D-галактозаминилтрансферазной активности, что и обусловливает неспособность к синтезу антигена P2 и накоплению его предшественника антиген рk. k Фенотип «р» CDH ------//------- рk (CTH) Рис. 4. Биосинтез антигена «р» в эритроцитах с биохимическим дефектом Появление фенотипа «р» объясняется дефицитом α-4-Dгалактозилтрансферазной активности, то есть неспособностью к превращению вещества предшественника CDH, при этом активность β-3-D-галактозаминилтрансферазы сохраняется, но не реализуется из-за отсутствия антигена рk. При наличии параглобозида под действием гена Р2 синтезируется гликолипид, обладающий слабой Р-подобной активностью, в результате чего эритроциты людей с фенотипом «р» могут проявлять слабую Р-реактивность. 60 И м м у н о л о г и ч е с к и е а с п е к т ы. Антигенная несовместимость по системе Р может вызывать осложнения после переливания крови. Антитела против антигенов Р1, Р2 и рk широко распространены и могут быть представлены иммуноглобулинами класса G. Сыворотка крови лиц с фенотипом «р» содержит смесь антител, которые направлены против всех антигенов системы Р. Антитела изотипа IgG, направленные против антигена Р2, могут быть причиной развития синдрома, получившего название пароксизмальная холодовая гемоглобинурия. Это аутоиммунная гемолитическая анемия, при которой переохлаждение человека может вызвать внутрисосудистый гемолиз, глобинурию и гемоглобинемию. Гемолитические антитела, содержащиеся в сыворотке крови таких людей, обладают двухфазным действием. При низкой температуре они соединяются с эритроцитами, а когда температура повышается с 20 до 37оС, вызывают лизис клеток при участии системы комплемента. Б и о л о г и ч е с к а я р о л ь в о н т о г е н е з е. Антиген Р1 выявляется у плода уже в возрасте 6-7 недель. Было показано, что антигены системы Р могут явиться причиной возникновения самопроизвольных выкидышей. Так у некоторых женщин с фенотипами «р» и «рk» наблюдалась подверженность выкидышам. Было выяснено, что причиной таких выкидышей могут служить антитела к антигенам плода отцовского происхождения, которые проникают через плацентарный барьер и вызывают повреждение развивающегося эмбриона. Также описаны случаи гемолитической болезни новорожденных, обусловленных образованием антител анти-Р; отмечено также, что у женщин после переливания крови, несовместимой по Р системе, чаще бывают самопроизвольные аборты. Б и о м е д и ц и н с к и е а с п е к т ы 25. Физиологическая роль антигенов системы Р в настоящее время неясна. Тем не менее, в ряде исследований было показано, что антигены системы Р могут выступать в качестве рецепторов для Escherichia coli. Общеизвестно, что адгезия бактерий на клеточной поверхности – важный этап 25 Иммуногенетика человека / под ред. С. Литвина – М.: Мир, 1994. 61 в патогенезе инфекций. Некоторые штаммы E.coli, которые вызывают пиелонефрит у человека, имеют пили или фимбрии, обеспечивающие прикрепление бактериальных клеток к эпителиальным клеткам мочеполового тракта. Адгезивные белки фимбрий связываются с углеводной последовательностью в составе субстанции р k и Р 2. Отмечен плейотропный эффект данного локуса в связи с некоторыми заболеваниями. Например, отмечена предрасположенность лиц с фенотипом Р2 к остеохондрозу. Также есть сведения об изменении антигенов системы Р при злокачественных перерождениях тканей. Э т н о г е о г р а ф и я26. Расчет аллельных частот для данной системы проводится аналогично расчету аллельных частот системы Rhesus, то есть простой, двухаллельной системы. В мировом распределении наблюдаются большие различия частот этих аллелей системы Р для разных регионов. Частота аллеля Р2 в Европе (50 %), а в Китае и Японии еще выше (75-80 %), максимальная частота гена у айнов (96,2 %), в Западной Африке отмечены минимальные частоты аллеля (ниже 5 %). Этнические частоты гена Р2 на территории Европейского региона варьируют от 0,391 (саами) до 0,693 (белорусы). На Кавказе максимальная частота Р2 отмечена у абхазов (0,703), минимальная – у армян – 0,467. В Средней Азии и Казахстане частоты Р2 сильно колеблются от 0,444 (киргизы) до 0,876 (узбеки). На территории Сибири и Дальнего Востока этнические частоты в целом выше (0,70-0.80), чем в других историко-этнографических провинциях прежнего СССР (Р2max = 0,847 у западных эвенков). Лишь у ульчей, нанайцев отмечена частота аллеля Р2 0,4. Таким образом, как в случае гена d системы Rhesus, ген Р2 строго разграничивает два больших региона прежнего СССР – Европейскую часть и Дальний Восток, т. е. выделяются два расовых типа – европеоидный и монголоидный. 26 Генофонд и геногеография народонаселения / под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. – СПб.: Наука, 2000. 62 Т и п и р о в а н и е г р у п п к р о в и с и с т е м ы Р. Для выявления антигена Р1 используют иммунные сыворотки анти-Р, полученные иммунизацией кроликов эритроцитами крови человека группы Р+ или сыворотки анти-Р1, полученные путем иммунизации коз жидкостью из эхинококковых кист органов животных с последующей адсорбцией иммунных сывороток нативными эритроцитами человека групп ОР-, АР-, ВР-. Сыворотки анти-Р1 реагируют с сильно или умеренно выраженным антигеном Р1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Р ПРИНАДЛЕЖНОСТИ О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы: скарификаторы, пинцеты, иммунологические планшеты для определения Р-принадлежности, дозаторы, наконечники для дозаторов, капилляры для крови, резиновая груша, вата, этиловый спирт 70 %, нормальный физиологический раствор, пластиковая пипетка на 2,5 мл, кроличьи или козьи адсорбированные сыворотки. О п р е д е л е н и е а н т и г е н а Р1 Стандартный метод 1. Приготовить 2 % взвесь эритроцитов. Для этого к 0,1 мл испытуемой крови с антикоагулянтом добавить 2 мл физиологического раствора NaCl, тщательно распипетировать, отцентрифугировать в течение 5-10 мин при 1500-3000 об/мин, надосадочную жидкость удалить. К оставшемуся осадку добавить 1 мл нормального физиологического раствора. 2. В лунки иммунологической планшеты раскапать дозатором по 1 капле тест-сыворотки. 3. Раскапать в лунки с тест-сывороткой 2 % взвесь испытуемых эритроцитов. 4. Планшету аккуратно встряхнуть и оставить в холодильнике на 24 часа при температуре 4оС. 5. Планшету встряхнуть и оценить результаты реакции по учету агглютинации. 63 Экспресс-метод. Этот метод позволяет типировать антигены Р1 непосредственно в день обследования. При применении экспресс-метода техника типирования принципиально не отличается от определения антигенов стандартным методом, за исключением последнего этапа. Вместо планшеты при экспресс-методе используются специальные пластиковые или стеклянные емкости с плотными крышечками, в которые помещают тест-сыворотку и испытуемый образец. После чего пробирки инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре, затем центрифугируют 3 минуты при 1500 об/мин, надосадочную жидкость удаляют и каплю оставшегося осадка помещают на предметное стекло для учета результата реакции. Агглютинацию учитывают по системе 4-х крестов при помощи лупы или бинокуляра. ++++ +++ - Крупнолепестковая агглютинация, видимая невооруженным глазом ++ - Четко выраженная агглютинация, различимая с помощью лупы +--Агглютинация, слабо различимая с помощью лупы ---Отсутствие агглютинации Рис. 5. Система 4-х крестов В о п р о с ы. 1. История открытия антигенов системы Р. 2. Биосинтез антигенов. 3. Генетические концепции наследования групп крови системы Р. 4. Иммунологическая значимость Р. 7. Роль антигенов системы Р в онтогенезе. 8. Геногеография. 9. Биомедицинские аспекты. §7. CИСТЕМА КРОВИ LEWIS И с т о р и я о т к р ы т и я. Система Lewis названа по фамилии женщины, в крови которой были впервые обнаружены антиLewis антитела. В 1946 году А. Мурант выявил в сыворотке крови женщины антитела, агглютинирующие эритроциты с ранее неизвестным антигенным рецептором, отличным от уже известных к 64 тому времени антигенов групповой принадлежности ABO, MN, P и Rhesus. Спустя два года, в 1948 году, П. Андерсен обнаружил антитела новой специфичности, которые, как было установлено, реагировали с эритроцитами, несущими антиген Le b. В 1949 году П. Андерсен и К. Яордал предположили, что ген Leb доминантен по отношению к гену Lea. Однако позже было установлено, что генетические взаимосвязи в системе Lewis гораздо более сложны. В 1948 году было сделано еще одно важное открытие, заложившее базу для понимания механизмов наследования и биосинтеза антигенов системы Lewis. Р. Грабб открыл сцепленность генных локусов системы Lewis и системы Sese (выделительства). Он установил, что все индивиды с фенотипом Le a+b- являются невыделителями групповых субстанций системы ABO(H), то есть имеют фенотип se/se. В 1948-1949 годах Р. Грабб и Морган обнаружили, что у лиц с фенотипом Le a+b- субстанция «Le a» присутствует как в сыворотке, так и на эритроцитах и в слюне, в то время как у лиц с фенотипом Le a-b+ субстанция «Le a» присутствовала только в слюне. Из чего было сделано предположение, подтвердившееся гораздо позже в 1965 году в работах J. S. Sneath и P.H. Sneath о том, что эритроциты лишь адсорбируют антигены этой группы крови на своей поверхности. В 1956 году исследователи G. Garraytty и G. Kleinschmidt показали, что существуют эритроциты, не содержащие антигены «Le a» и «Le b». То есть с фенотипом Le a-b-. В 1957 году японские ученые С. Исеки и С. Масаки иммунизируя кроликов слюной людей с фенотипом Le a-b-, являвшихся выделителями ABO(H) Se, открыли антиген «Le c». В 1970 году М. И. Потапов доказал, что полученные японцами антитела не однородны, а содержат смесь антител против двух антигенов. Он иммунизировал коз слюной людей с группой крови O(I), Le a-b+, Se. Получил при этом высокоактивные гетероиммунные антитела «анти-Le b», после адсорбции слюной людей с фенотипом O(I), se, Le a-b- и эритроцитами (O(I), Se, Le a-b+) получил антитела «анти-Le d-специфичности». Эти антитела продолжали слабо реагировать с эритроцитами Le a-b-, Se и не реагировали с эритроцитами Le a-b-, se. 65 Символ «Le c» Потапов оставил для еще не открытых тогда антител, которые бы реагировали с эритроцитами Le a-b-, se. Эти антитела и соответствующий антиген Гунсон и Латам открыли в 1972 году в сыворотке крови женщины с фенотипом Se, Le a-b+, имевшей в анамнезе и беременности и многократные переливания крови. Так было окончательно установлено существование четырех фенотипов системы Lewis, каждый из которых характеризовался наличием только одного антигена этой системы: «Le a» и «Le c» для se (невыделителей), «Le b» и «Le d» для Se (выделителей).27 Г е н е т и к а28. Локус Lewis находится на 19-й хромосоме в группе сцепления с локусом С3 компонента комплемента, который локализован на коротком плече 19-й хромосомы в области 19 p ter 19 p13.2. На этой же хромосоме находятся локусы Secretor и Hh. В 50-х годах 20 века Грабб и Цеппеллини выдвинули гипотезу наследования системы Lewis, которая получила признание серологов, иммунологов и генетиков. Эта гипотеза предусматривала наличие двух пар аллеломорфных генов: пары генов АВН-секреции (Se и se) и пары генов системы Lewis: Le и le. Наличие антигена «Le a» в слюне контролируется парой аллельных генов Le и le. У индивидуумов, гомозиготных по рецессивному гену le, антиген «Le a» в слюне отсутствует. Лица, имеющие в своем генотипе ген Le (доминантные гомозиготы LeLe и гетерозиготы Lele), содержат в слюне антиген «Le a». Посемейные исследования подтвердили аутосомно-доминантный характер наследования наличия антигена «Le a» в слюне. В 1959 году Морган и Уоткинс показали, что в биосинтезе антигена «Le b» участвуют гены локуса H. Антиген «Le b» образуется под влиянием продуктов действия генов трех локусов (ген Se - локус Secretor, ген Le - локус Lewis и ген Н - локус Hh). В отсутствие хотя бы одного из этих доминантных генов образования Le bспецифичности в слюне не происходит. 27 Прокоп, О. Группы крови человека / О. Прокоп, В. Геллер. – М., 1991 Генофонд и геногеография народонаселения / под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. – СПб.: Наука, 2000. 28 66 Эритроцитарные фенотипы системы Lewis определяются взаимодействием трех пар аллеломорфных генов: Se и se, Le и le, Н и h. Антиген «Le a» в эритроцитах образуется только в результате действия генов Le и se. Для проявления антигена «Le b» в эритроцитах необходимо наличие в генотипе генов Le, Se и Н. Открытие четырех антигенов системы Lewis и данные о возрастной трансформации этой системы позволили М. И. Потапову в 1973 году интерпретировать генетическую концепцию ГраббаЦеппеллини следующим образом: «Доминантный ген Le обеспечивает возникновение вещества-предшественника, обладающего свойством реагировать как с сывороткой анти-Lea, так и с сывороткой анти-Leb. Это вещество способно превратиться в антиген «Le b» (под влиянием гена выделительства Se) или в равной мере в антиген «Le a» (под влиянием рецессивного гена невыделительства se). Когда рецессивный ген le находится в гомозиготном состоянии, синтезируется второе вещество-предшественник, способное одновременно взаимодействовать с сыворотками анти-Lec и анти-Led. В организме выделителя (генотип SeSelele или Seselele) это вещество видоизменяется в антиген «Le d», а в организме невыделителя (генотип seselele) - в антиген «Le c». Б и о с и н т е з. Согласно современным представлением в биосинтезе антигенов системы Lewis участвуют несколько генных локусов (схемы 1 и 2). Локус Se имеет два аллеля: Se и se. Аллель Se обусловливает образование водорастворимых групповых субстанций ABH – гликопротеинов, в связи с чем они секретируются в различные биологические жидкости. Аллель se в гомозиготном состоянии кодирует формирование нерастворимых в воде групповых субстанций ABO – гликосфинколипидов, поэтому у невыделителей антигены системы АВО присутствуют только на строме эритроцитов. Локус Hh также имеет два аллельных варианта – H и h. Ген H кодирует α-2-L-фукозилтрансферазу, присоединяющую остаток L-фукозы к остатку галактозы в составе вещества предшественника. Ген h – аморфен. У гомозигот по этому гену на мембране эритроцитов не экспрессируются антигены H, A и В. Фенотип таких людей обозначен термином «Бомбей», то есть в сыворотке крови 67 содержатся специфические трансферазы, кодирующие группоспецифические вещества А и В, но из-за отсутствия α-2-Lфукозилтрансферазы предшественники антигенов А и В не синтезируются. Далее свою роль играют гены локуса Lewis. Таким образом, пути синтеза антигенов системы Lewis выглядят так На углеводную цепь вещества-предшественника воздействуют аллели Le (цепь I типа) или le (цепь II типа), кодирующие синтез трансфераз, вызывающих образование антигенов Le a и Le c. Затем на субстанции Le a и Le c действуют аллельные гены локусов H (Hh) и Se (Se/se). В результате чего они трансформируются в антигены Le b и Le d. На эритроцитах будет адсорбироваться только один антиген, а в слюне – оба. При генотипических вариантах Hse, hSe и hse антигены Le a и Le c не трансформируются и присутствуют как на эритроцитах, так и в слюне. Э к с п р е с с и я. Антигены системы Lewis являются первичными антигенами слюны и сыворотки, и только вторично они проявляют себя как антигены на поверхности стромы эритроцитов. Антигены «Le a» и «Le b» экспрессируются во многих тканях организма: на эпителии дыхательных, мочевыводящих путей, желудочно-кишечного тракта, слюнных желез и пр. Известно, что количество антигенов Lewis на одном эритроците колеблется в пределах от 4500 до 7300 молекул. Для сравнения: на одном эритроците экспрессировано 8 • 105 – 2 • 106 антигена системы АВО или 2 • 106 антигена системы Rhesus. А н т и г е н ы. Антигены системы Lewis не синтезируются эритроцитами, а адсорбируются последними из плазмы. По химической структуре антигены системы Lewis близки к антигенам А, В, Н и представляют собой гликопротеиды, содержащие те же компоненты, что и АВН-антигены. Основную роль в антигенной специфичности Lewis-антигенов играет L-фукоза. И м м у н о л о г и ч е с к и е а с п е к т ы. Установлена определенная связь между группоспецифическими веществами Lewis и 68 противомикробным и противоопухолевым иммунным ответом. Так, например, установлено, что антиген «Le b» способствует связыванию геликобактерий с эпителием желудка, а отсутствие этого антигена сочетается с рецидивами мочеполовых инфекций у женщин. Возможный механизм действия в данном случае следующий. 69 70 Инфицирование человека геликобактериями (H.pylori)29 может приводить к формированию гастрита и язвенной болезни. Наиболее известным способом снижения иммунного ответа макроорганизма на микроорганизм, который имеется у H.pylori, является низкая иммуногенность продуктов его жизнедеятельности и мембранных антигенов. Действительно, липополисахарид клеточной стенки H.pylori обладает низкой иммуногенной активностью. Структура липополисахаридного О-специфического антигена у разных штаммов H.pylori сходна с антигенами групп крови по системе Lewis макроорганизма. Эта антигенная мимикрия может быть причиной образования аутоантител к слизистой оболочке желудка и развития аутоиммунного атрофического гастрита. Исследование противоопухолевого иммунного ответа показа30 ло , что при онкогенезе наблюдаются изменения в экспрессии SGL, обусловленные гликозилированием. В нормальных клетках экспрессируется большое разнообразие антигенов (включая ABH групп крови и антигены Lewis) на сфингогликолипидах (SGL). Функции SGL включают участие в клеточной адгезии и в трансмембранной передаче сигналов. Некоторые ассоциированные с раком изменения гликозилирования, структур Lewis групп крови являются общими и для гликопротеинов и для гликолипидов. Дополнительные изменения гликолипидов включают накопление предшественников ганглиозидов и глобозидов. Эти изменения гликолипидов могут влиять не только на адгезию между клетками и между клетками и матриксом, но и на передачу трансмембранных сигналов посредством тирозин-киназ, сцепленных с рецепторами, или протеин-киназы С. Остается понять пути, с помощью которых измененное гликозилирование раковых клеток влияет на их злокачественный потен29 Шкитин В. А. Роль Helicobacter pylori в патологии человека / В. А. Шкитин, А. И. Шпирна, Г. Н. Старовойтов //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002, Т.4, №2. 30 Rhodes J. M. Unifying hypothesis for inflammatory bowel disease and related colon cancer: sticking the pieces together with sugar // Lancet. 1996. 347. 71 циал. Предполагается, что особая тенденция раков метастазировать в печень, может быть следствием увеличенной экспрессии оканчивающихся на галактозу олигосахаридов, которые действуют как лиганды для гепатоцитарных сиалогликопротеиновых рецепторов, которые сами по себе являются галактоза-связывающими лектинами. Усиление сиализации периферических Lewis структур, как было установлено, присутствует в метастазах рака по сравнению с первичной опухолью. Ассоциированные с раком изменения гликозилирования, которые обнаруживают корреляцию с плохими прогнозами, включают и повышенную экспрессию структур Lewis групп крови, включая Lea, Lex и их варианты. Некоторые из структур Lewis группы крови, особенно Lea и Lex, могут функционировать как лиганды для селектинов и тем самым влиять на взаимодействия между раковыми клетками и другими клетками, такими как тромбоциты. Б и о л о г и ч е с к а я р о л ь в о н т о г е н е з е. Фенотип Le a+b+ очень редок у взрослых, но часто встречается у новорожденных и детей. Еще в 1948 году Андерсен выявил у 79 % детей в возрасте 1-3 месяцев антиген «Le a». В 1968 году М. А. Бронникова исследуя сыворотку крови и эритроциты новорожденных и детей, показала, что для них характерно присутствие антигенов «Le a» и «Le b» в сыворотке крови, тогда как в сыворотке крови взрослых содержится лишь один антиген, тот, который фиксирован на эритроцитах. Эритроциты у подавляющего большинства детей первого года жизни и многих детей второго года относятся к группе Le a+b+, которая у взрослых бывает в виде исключения. В эритроцитах плодов и новорожденных имеются антигены, отсутствующие у обоих родителей. На первых этапах постнатального и, вероятно, эмбрионального развития существуют не Leантигены, а антиген-предшественник, реагирующий как с сывороткой анти-Lea, так и с сывороткой анти-Leb. В процессе возрастной трансформации из антигена-предшественника формируются три фенотипа эритроцитарных групп Lewis: Le a+b–, Le a–b– и Le a+b–. 72 Б и о м е д и ц и н с к и е а с п е к т ы. Биологическая роль антигенов системы Lewis до конца не выяснена. Описаны редкие случаи посттрансфузионных осложнений, вызванных антителами антиLea, и еще реже - антителами анти-Leb. Антитела против антигенов Lewis встречаются в более низких титрах, но могут вызывать тяжелые гемолитические реакции. Выявлена ассоциативная взаимосвязь между фенотипами системы Lewis и мультифакториальными заболеваниями. Так, обнаружена связь между носительством фенотипа Le a-b- и риском ишемической болезни сердца при повышенном индексе массы тела, увеличением частоты гипретензии и диабета у мужчин. При сочетании с группами крови А(II), В(III) и АВ(IV) этот же фенотип рассматривается как маркер риска атеротромботической болезни, так как связан с высоким уровнем содержания фактора VIII и фактора Виллебранда. Так как антигены Lewis экспрессированы на эпителиальных клетках дистальных канальцев и собирающих протоков почек, то при пересадке индивидам с фенотипом Le a-b- органов несущих, антигены по данной системе, повышается риск отторжения трансплантата. Э т н о г е о г р а ф и я31. После открытия антигенов Lewis последовал этап интенсивного изучения распространения их в различных популяциях мира. Первоначально исследовалось лишь присутствие антигена «Le a» в эритроцитах и лишь затем начались исследования, характеризующие систему Lewis по двум антигенам: Le a и Le b. В целом по миру в отдельных популяциях частота гена le варьирует в широких пределах. На уровне локальных популяций частота гена le в Северной Евразии варьирует от 0 (в двух популяциях нанайцев) до 0,971 (популяции тофаларов). Минимальная частота гена le отмечена у абхазов (0,204), максимальная – у тофаларов (0,926). Для большинства этносов характерны генные частоты 0,30-0.70, за этими пределами находятся эт- Генофонд и геногеография народонаселения / под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. – СПб.: Наука, 2000. – 611 с. 31 73 носы с низкой частотой гена – абхазы и селькупы, и с высокой – казахи, ульчи и тофалары. Оценивая среднеэтническую частоту гена le по провинциям, отметим, что в Европейской провинции (0,437-0,043) и на Кавказе (0,430-0,059) она меньше 0,50, а в Среднеазиатско-казахстанской (0,581-0,069) и Сибирско-дальневосточной (0,561-0,032) провинциях – больше 0,50. Причем народы Сибири и Дальнего Востока имеют частоту гена le достоверно (Р<0.05) более высокую, чем народы Европейской части провинции. Т и п и р о в а н и е г р у п п к р о в и с и с т е м ы Lewis Для типирования антигенов системы Lewis используют анти-Le a и анти Le b козьи адсорбированные сыворотки с полными или неполными антителами. Сыворотку Le a получают иммунизацией коз слюной людей невыделителей группы крови O(I) с последующей адсорбцией нативными (сыворотки с полными антителами) или трипсинизированными (сыворотки с неполными антителами) эритроцитами групп крови OLe(a-b+), Ale(a-b+), BLe(a-b+). Сыворотку анти-Le b получают путем иммунизации коз слюной людей выделителей группы O(I) с последующей адсорбцией нативными или трипсинизированными эритроцитами групп крови OLe(a+b-), Ale(a+b-), BLe(a+b-). ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ LEWIS О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы: скарификаторы, пинцеты, иммунологические планшеты для определения Leпринадлежности, дозаторы, наконечники для дозаторов, капилляры для крови, резиновая груша, вата, этиловый спирт 70 %, нормальный физиологический раствор, пластиковая пипетка на 2,5 мл, кроличьи или козьи адсорбированные сыворотки. Стандартный метод – определение антигенов методом агглютинации, при помощи тест-систем с неполными антителами. 1. Приготовить раствор трипсина. 10 мг сухого трипсина развести в 10 мл нормального физиологического раствора в течение 1 часа при комнатной температуре. 74 2. Довести pH раствора трипсина до 7,2, добавив фосфатный буфер Зеренсена, для чего к раствору трипсина добавить 2 мл 1/15 молярного раствора Na2HPO4 и 0,05 мл 1/15 молярного раствора KH2PO4. 3. Рабочие растворы готовят следующим образом, 1/15 молярный раствор Na2HPO4 (9,4 г Na2HPO4 - на 1000 мл дистиллированной воды). 1/15 молярный раствор KH2PO4 (9.066 г KH2PO4 - на 1000 мл дистиллированной воды). 4. Затем к 1 объему отмытых в физрастворе эритроцитов добавить 1,5 объема раствора трипсина, пробирки встряхнуть и поместить в термостат при температуре 37оС на 30 минут. 5. Образцы центрифугировать 3-5 мин при 1500-3000 об/мин, надосадочную жидкость слить. 6. Приготовить 2 % взвесь эритроцитов. Для этого к оставшемуся осадку добавить 1 мл нормального физиологического раствора. 7. В лунки иммунологической планшеты раскапать дозатором по 1 капле тест-сыворотки. 8. Раскапать в лунки с тест-сывороткой 2% взвесь испытуемых эритроцитов. 9. Планшету аккуратно встряхнуть и оставить в холодильнике на 24 часа при температуре 4оС. 10. Планшету встряхнуть и оценить результаты реакции по учету агглютинации. Экспресс-метод. Этот метод позволяет типировать антигены Lewis непосредственно в день обследования. При применении экспресс-метода техника типирования принципиально не отличается от определения антигенов стандартным методом, за исключением последнего этапа. Вместо планшеты при экспресс-методе используются специальные пластиковые или стеклянные емкости с плотно прилегающими крышечками, в которые помещают тест-сыворотку и испытуемый образец. После чего пробирки инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре, затем центрифугируют 3 минуты при 1500 об/мин, надосадочную жидкость удаляют и каплю оставшегося осадка помещают на предметное стекло для учета результата ре- 75 акции. Агглютинацию учитывают по системе 4-х крестов при помощи лупы или бинокуляра. В о п р о с ы. 1. История открытия антигенов системы Lewis. 2. Биосинтез антигенов. 3. Генетические концепции наследования групп крови системы Р. 4. Иммунологическая значимость Lewis. 5. Геногеография. 6. Биомедицинские аспекты. §8. СИСТЕМА КРОВИ KELL И с т о р и я о т к р ы т и я. В 1946–1949 гг. Кумбс и Левин обнаружили антигены системы Kell-Cellano. Антиген K системы Kell открыл Кумбс в 1946 г. в эритроцитах ребенка с тяжелым эмбриональным эритробластозом. На основании наличия антигена K в эритроцитах или его отсутствия все люди могут быть разделены на две группы: Kell-отрицательные и Kell-положительные. Первоначально полагали, что Kell-отрицательный фенотип зависит от гена k, который не продуцирует никакого вещества с антигенными свойствами. Однако в 1949 г. Левин в сыворотке крови женщины по фамилии Cellano были обнаружены изоантитела анти-Cellano. Было установлено, что антитела анти-Cellano являются противоположными по своей серологической реакции антителам анти- K, поэтому их стали обозначать анти-k. Антиген Cellano (k) является продуктом гена k, аллельного гену K. В 1958 г. Рейс и Сангер на основании многочисленных семейных исследований, подтверждили простой тип наследования антигенов системы Kell. Антигены K и k полностью независимы от других изосерологических групповых систем крови человека. В 1957 г. Ален и Левис провели анализ сыворотки, которая позволила открыть в эритроцитах людей антиген Kpa, относящийся к системе Kell. Антитела анти-Kpa были найдены у человека по имени Penney независимо от иммунизации, т.е. они были естественного происхождения. Они агглютинировали около 2 % образцов эритроцитов европейского населения. В дальнейшем антитела анти-Kpa были получены от женщин после переливания им крови. Вычислено, что гомозиготный тип по гену Kpa может встретиться приблизительно с частотой 1:10000. 76 В 1958 г. Аллен и соавторы сообщили об обнаружении ими в сыворотке мужчины по фамилии Rautenberg, перенесшего несколько переливаний крови и гомозиготного по аллелю Kpa, ранее неизвестных антител, которые возникли у него после многочисленных гемотрансфузий. Эти антитела, названные анти-Kpb, агглютинировали 99,98 % всех образцов обследованных эритроцитов европейского населения. Таким образом, был открыт противоположный Kpa-антигену антиген Kpb. В 1957 г. Коун и соавторы обнаружили совершенно необычный фенотип системы Kell: K-k-Kp(a-b-), который был назван фенотипом К0, а аллель, ответственный за его генетическое проявление К0. Было выявлено несколько семей, в которых наследование антигенов Kell можно объяснить только исходя из того, что гомозиготы по этому особому аллелю не синтезируют антигенов K, k, Kpa, Kpb. У человека по фамилии McLeod с фенотипом К0, по мнению Аллена и соавторов 1961 г., был найден новый необычный вариант k и Kpb. В 1961 году Коркаран обнаружили в сыворотке крови человека по фамилии Peltz, имевшего фенотип К0, антитела, агглютинирующие все без исключения исследованные эритроциты. Эти антитела авторы назвали анти-Ku, или анти-Peltz. Вторую сыворотку анти-Ku обнаружили в 1966 году Нан у женщины также с фенотипом К0. Итак, был выявлен особый синтезируемый продукт генных комплексов системы Kell – антиген Ku. В 1958 году Гилбетт и Чейз в эритроцитах представителей негритянского населения бал открыт антиген Jsa. Антитела анти- Jsa были получены от мужчины по имени Sutter, которому переливали кровь. В дальнейшем сыворотки были получены и от женщин. Существование антигена Jsb, который является аллелем антигена Jsa, было установлено Уолкером в 1963 году. В 1965 году Строуп определил, что эритроциты двух женщин с фенотипом К 0 имели также и фенотип Js( a-b-) и поэтому не реагировали с антителами анти-Jsa и анти-Jsb, выявляющими групповые антигены Sutter-антиген Jsa (Sutter) и антиген Jsb (Matthews). Так как фенотип Js( a-b-) встречается редко, то вероятность того, что такое совпадение случайно, равна 10-15, т.е. эта связь не могла быть случайной. 77 На этом основании, а также в результате многочисленных семейных обследований показано, что группа Sutter с ее групповыми антигенами Jsa и Jsb тоже относится к системе Kell. Н о м е н к л а т у р а. Таким образом, согласно современным представлениям система Kell включает все перечисленные антигены: K, k, Kpa, Kpb, Ku, Jsa, Jsb, к каждому из которых получены специфические антитела. В 1961 г. Аллен и Розенфельд предложили цифровую номенклатуру системы Kell, аналогичную цифровой номенклатуре Rh-системы. В настоящее время антигенам системы Kell присвоены следующие обозначения (табл. 1). Таблица 1. Номенклатура антигенов системы Kell Новое обозначение Старое обозначение Название системы K1 K Kell K2 k Cellano a K3 Kp Penney b K4 Kp Rautenberg K5 Ku Peltz a K6 Js Sutter b K7 Js Matthews w Описаны новые антигены: К8 (K ), K9 (KL), K10 (UIa), K11 (Cote), K12 ( Bos/Sp), K13 (Sgro), K14 (San), K15 (Kx), K17 (Wka), K18, K19, K20 и K22. Изучение этих антигенов еще не закончено. Г е н е т и к а. Гены, кодирующие антигены системы Kell , картированы на 7 q 33. Система Kell сложная изосерологическая система с большим количеством групповых антигенов, передающихся по наследству по тем же генетическим законам, как и другие изоантигенные групповые признаки человека. Генетическую концепцию в отношении данной системы предложил в 1979 году Барникот. Суть ее сводится к следующему. Биосинтез антигенов системы Kell контролируется аллельными генами, составляющими ассоциацию локусов или антигенообразующих сайтов. 78 По мнению Рейса и Сенгера (1975 г) антигены K и k, Kpa и Kpb, а также Jsa и Jsb являются генными продуктами соответствующих аллельных пар, находящихся в трех тесно сцепленных генных локусах комплексной генетической системы Kell. Из 8 возможных гаплотипов описаны только 4 ( KKpbJsb, kKpbJsb, kKpaJsb, kKpbJsa), а из 27 возможных фенотипов только 9. Поскольку антигены K и Kpa встречаются почти исключительно у европеоидов, а Jsa обнаруживаются у негроидов и не встречаются у людей других рас, то обнаружение недостающих фенотипов остается под вопросом. Смешение рас началось в последнее столетие, т.е. слишком недавно, чтобы вследствие кроссинговера могли возникнуть рекомбинации, дающие сочетания K c Jsa и Kpa c Jsa. Еще Аллен и Льюис в 1957 году в оригинальной статье писали, что, согласно всем данным, К и k – это алелли, и что Kpa и Kpb соотносятся с К и k так же, как в системе Rhesus Е и е соотносятся с С и с. Ген К0 можно считать аморфом, т.е. геном, не продуцирующим Kell-антигенов. Еще более вероятным представляется, что это редкий аллель в сайте оператора Kell, который переключает все активности в соседних с ним сайтах К, Кр и Js. Какой бы природы ни был ген К0, в любом случае он должен находиться в гомозиготном состоянии, для того чтобы проявился фенотип К0. Скорее, фенотип К0 связан с гомозиготностью по сцепленному регуляторному комплексу. Б и о с и н т е з. Для антигенов Kell и Gerbich (Гербич) установлено наличие вещества-предшественника, состоящего из двух частей – Х и Y. Гены системы Kell действуют на Х-часть, а Gerbich – на Y-часть. При этом система Kell превращает Х-часть в Х' и достраивает на нее свои антигены, а система Gerbich превращает Yчасть в Y' и в свою очередь достраивает свои антигены. Для проявления антигенов Kell существенно, чтобы Х-часть предшественника не была изменена. Если же она изменена, как это бывает у людей с фенотипом McLeod или у больных хроническим грануломатозом (GGD), то тогда Kell-антиген не проявляется. Для четкого проявления фенотипа Kell, по-видимому, необходимо, чтобы одновременно с изменением Х-части вещества- 79 предшественника прошла модификация Y-части, осуществляемая системой Gerbich, поскольку фенотип Ge(a-) сопряжен с весьма слабым проявлением антигенов Kell. Данная схема (Рейс и Сангер, 1975 г.) удовлетворительно описывает факты, но является гипотетической. Х-часть вещества-предшественника контролируется отдельным геном Х, который не сцеплен с Kell. Ген Х, обуславливающий синтез предшественника Kell, локализуется на половой хромосоме Х (р22.3). И м м у н о л о г и ч е с к и е а с п е к т ы. Антигены Kell и Cellano обладают высокой иммуногенной активностью, занимая второе место после антигенов системы Rhesus. Антитела к этим антигенам могут возникать в процессе беременности (при отсутствии того или другого антигена у матери и наличии их у плода), так и в результате повторных переливаний крови, несовместимой в отношении антигенов системы Kell. Естественные антитела к антигену К встречаются крайне редко. Антитела к антигенам системы Kell могут встречаться как полные, так, и так и неполные. Последние обнаруживаются чаще, в связи, с чем применяют соответствующие методы их выявления. Описаны многие случаи гемотрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных, причиной которых была изоиммунизация антигеном К. Изоиммунизация антигеном k наблюдается значительно реже, что обусловлено редкой встречаемостью (0,2 % случаев) лиц с генотипом KK, которые могут продуцировать антитела анти-k в процессе беременности или повторных переливаниях крови. О н т о г е н е з. Формирование антигенов К и к относится к раннему периоду эмбриогенеза. Их обнаруживают уже в эритроцитах плодов 10–14-недельного возраста. Антигены Кра, Крb, Jsa, Jsb также формируются рано и определяются в эритроцитах новорожденных. Б и о м е д и ц и н с к и е а с п е к т ы. Все антигены системы Kell-Cellano были открыты в результате трансфузионных осложне- 80 ний гемолитического вида и плодного эритробластоза, что свидетельствует об их клинической значимости. Систему Kell-Cellano отчасти можно сравнить в резус-системой, а фактор Kell, правда в меньшей мере, уподобить по иммуногенной активности фактору Rh (D). Фактор Kell стоит на втором месте после фактора Rh D в шкале трансфузионно опасных антигенов эритроцитов32. Профилактика и терапия гемолитической болезни новорожденных, вызванной антителами системы Kell, в принципе не отличается от профилактики и терапии гемолитической желтухи, вызванной антителами системы Rhesus. Э т н о г е н е з.33 Частоты генов системы Kell широко варьируют у разных народов. Например, в Европе антиген К встречается с частотой 5-10 %. У англичан на долю К-положительных людей, имеющих генотипы Kk или kk, приходится 7,72 % от общей популяции. У русских Москвы эта частота достигает 8,02 %. Лица, гомозиготные по гену К (КК), встречаются с частотой только 0,2 %. Вне Европы и Среднего Востока антиген К встречается редко. Он практически отсутствует в монголоидных популяциях и в Австралии. Его редко обнаруживают в Африке и Индии. Большая частота (10 %) отмечена у жителей Аравии. С максимальной частотой антиген К выявлен в одной из популяций Испании – 31,71 %. Антиген Кра встречается у европеоидов с частотой 2,2 %. У негроидов данный антиген не обнаружен. Гомозиготы по гену Кра редки – 0,01 %. Антиген Jsa (Sutter)встречается с частотой 9 % среди негров Америки. В Африке и соседних регионах его частота гораздо выше: около 20% негров являются Jsa-положительными. Все люди других рас имеют фенотип Js(a-). С очень низкой частотой Js(a+) обнаружили у евреев Йемена и на севере Южной Америки. Народы прежнего Советского Союза характеризуются по системе Kell (аллели К и k) на основании данных, полученных при Шевченко, Ю. Л. Безопасное переливание крови. / Ю. Л. Шевченко, Е. Б. Жибурт – СПб.: Питер, 2000. – 320 с. 32 Генофонд и геногеография народонаселения / под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. – СПб.: Наука, 2000. 33 81 обследовании 30180 человек из 139 популяций, относящиеся к 32 этносам. Общая средняя этническая частота гена K равна 0,041. Данные по аллелям Kpa и Kpb немногочисленны. На уровне локальных популяций частота гена K в С. Евразии варьирует от 0 (в популяциях нанайцев и бурят) до 0,157 (в популяции казахов). Изменчивость этнических частот гена K столь же велика как и популяционных – от 0 (нганасаны и буряты) до 0,129 (казахи). Т и п и р о в а н и е а н т и г е н о в с и с т е м ы K e l l. ФЕНОТИПИРОВАНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ ПО АНТИГЕНУ К О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы: скарификаторы, пинцеты, планшеты для определения К-принадлежности, дозаторы, наконечники для дозаторов, капилляры для крови, резиновая груша, вата, этиловый спирт 70 %, нормальный физиологический раствор, пластиковая пипетка на 2,5 мл, цоликлон анти-К «супер». О п р е д е л е н и е а н т и г е н ов. Экспресс-метод на плоскости.34 1. на плоскость помещают две капли сыворотки анти-К и каплю эритроцитов в количестве 1/3 объема взятой сыворотки. 2. капли смешивают стеклянной палочкой и при плавном покачивании пластинки наблюдают за ходом реакции. 3. через 3-4 мин. в реагирующую смесь добавляют 1-2 капли изотонического раствора для предотвращения неспецифической агрегации эритроцитов. 4. через 5-7 мин. учитывают результаты реакции по наличию или отсутствию агглютинации. В о п р о с ы. 1. История открытия антигенов системы Kell. 2. Биосинтез антигенов. 3. Генетические концепции наследования групп крови систеШевченко, Ю. Л. Безопасное переливание крови. / Ю. Л. Шевченко, Е. Б. Жибурт – СПб.: Питер, 2000. 34 82 мы Р. 4. Иммунологическая значимость Kell. 5. Геногеография. 6. Биомедицинские аспекты. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Генофонд и геногеография народонаселения / под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. – СПб.: Наука, 2000. 2. Дранник, Г. Н. Генетические системы крови человека и болезни. / Г. Н. Дранник, Г. М. Дизик. – Киев, 1990. 3. Зотиков, Е. А. Антигенные системы человека и гомеостаз. / Е. А. Зотиков – М., 1982. 4. Иммуногенетика человека / под ред. С. Литвина. – М.: Мир, 1994. 2 т. 5. Прокоп, О. Группы крови человека / О. Прокоп, В. Геллер. – М., 1991 6. Томилин. В.В. Судебно-медицинские исследования крови. / В. В. Томилин, А. С. Гладких. – М., 1981 7. Шабалин, В. Н. Клиническая гематология. / В. Н. Шабалин, Л. Д. Серова. – Л., 1988 8. Шевченко, Ю. Л. Безопасное переливание крови / Ю. Л. Шевченко, Е. Б. Жибурт. – СПб: Питер, 2000. 9. Шиффоман, Ф. Дж. Патофизиология крови. – М.; Спб.: БИНОМ; Невский диалект, 2000. 10. Шкитин, В. А. Роль Helicobacter pylori в патологии человека. / В. А. Шкитин, А. И. Шпирина, Г. Н. Старовойтов. //Клиническая микробиология и антиомикробная химиотерапия. 2002. Т.4. № 2. 11. Харрисон, Дж. Биология человека. / Дж. Харрисон, Дж. Уайнер, Дж. Тэннер и др. – М.: Мир, 1979. 12. Rhodes, J. M. Unifying hypothesis for inflammatory bowel disease and related colon cancer: sticking the pieces together with sugar // Lancet. 1996. 347. P. 40-44 83 СОДЕРЖАНИЕ Глава 1 Глава 2 Глава 3 Глава 4 Глава 5 Глава 6 Глава 7 Глава 8 Предисловие Общие положения Эритроцитарные аллоантигены человека Эритроцитарная система групп крови АВО Система групп крови Rhesus Эритроцитарная антигенная система MNSs Система Р Система Lewis Система Kell Список литературы Стр. 4 6 9 13 36 58 73 83 Редактор Е. Л. Наркевич Подписано в печать 6.10.05. Формат 60 х 84 1/16. Печать офсетная. Бумага офсетная. Уч.-изд. л. 6,25. Тираж 100экз. Заказ № ГОУ ВПО «Кемеровский государственный университеи». 650043, Кемерово, ул. Красная, 6. Отпечатано в издательстве «Кузбассвузиздат». 650043, Кемерово, ул. Ермака, 7.
