Сравнительная оценка влияния «Рибомунила» и комбинации
реклама
Титов Л. П., Адамович Т. Г. НИИ ЭМ, БГМУ Сравнительная оценка влияния «Рибомунила» и комбинации «Теотард + Рибомунил» на показатели иммунитета у детей с бронхиальной астмой с анергией на внутрикожное введение туберкулина Было обследовано 58 детей с бронхиальной астмой, имеющих анергическую реакцию на внутрикожное введение туберкулина (30 детей – получали Рибомунил по общепринятой схеме, 28 детей – получали Теотард в течение 2–х недель в дозировке, соответствующей возрасту, а затем –Рибомунил по общепринятой схеме. Определяли показатели клеточного (иммунофенотипирование мононуклеаров периферической крови, синтез IFN–γ и IL–4) и гуморального (определение концентрации IgG, IgA, IgМ, общего IgE в сыворотке и IgG, IgM и sIgA в слюне) иммунитета. Применение препарата Теотард у детей, больных БА и имеющих анергический тип реакции на внутрикожное введение туберкулина, повышает иммунологическую эффективность иммунизации Рибомунилом: происходит более эффективное увеличение CD3+ и CD8+ клеток, снижение CD22+ клеток, снижение нестимулированного синтеза IL–4 , увеличение нестимулированного и ФГА–стимулированного синтеза IFN–γ, большее снижение уровня IgE в сыворотке и увеличение sIgA, IgM и IgG в слюне, уменьшение соотношения IgE/sIgA. Ключевые слова: бронхиальная астма, Рибомунил, Теотард, дети, анергия. ВВЕДЕНИЕ В настоящее время одной из важнейших проблем педиатрии и иммунологии продолжает оставаться бронхиальная астма (БА). По результатам международных исследований детской астмы и аллергии (International Study of Asthma and Allergies in Childhood), проведенных в 37 странах, за 98 Опыт применения последние 5 лет количество детей, страдающих БА, в возрастной группе до 10 лет увеличилось с 11% до 11,6% [1,2]. Группой ведущих специалистов мира были разработано руководство по диагностике и лечению БА, что подчеркивает значимость данной проблемы [3]. Особенностью иммунного воспаления при БА является Th2– зависимый IgE–опосредованный иммунный ответ. В то же время известно, что баланс Th1/Th2 зависит от различных факторов (инфекционный анамнез, состояние микрофлоры, воздействие неблагоприятных экологических факторов и др.). Th1 тип иммунного ответа развивается при микобактериальной инфекции и БЦЖ вакцинации. Анергический тип реакции на внутрикожное введение туберкулина у детей, привитых БЦЖ, может свидетельствовать об анергии Th1 типа (неспособности проявить эффекторные функции в ответ на стимуляцию через TCR и другие рецепторы, необходимые для полной активации). Согласно GINA, в лечении больных БА предусмотрены вспомогательные методы терапии, в том числе иммуномодуляторы. Одним из таких препаратов является Рибомунил, состоящий из рибосомальных фракций четырех наиболее распространенных возбудителей инфекций дыхательных путей. Введение рибосомальных фракций Рибомунила вызывает продукцию специфических лимфоцитов, активных как в отношении рибосом, так и в отношении целых бактериальных антигенов. В то же время, Рибомунил активирует Th1–зависимый иммунный ответ, уменьшая выраженность Th2– зависимых реакций [4, 5, 6]. Учитывая полученные нами ранее данные, необходимо отметить, что ответ на введение Рибомунила у детей с БА отличается в зависимости от типа реакции на внутрикожное введение туберкулина. У детей с анергией действие Рибомунила было незначительным [7, 8, 9]. Таким детям необходимо предварительно провести коррекцию анергического состояния, а затем применять Рибомунил. Одним из препаратов, которые используются при БА у детей, а также обладают иммунокоррегирующими свойствами, является Теотард (теофиллин пролонгированного действия). Действие теофиллина является иммуномодулирующим и складывается, по–видимому, из отдельных эффектов, вызываемых им в различных клеточных популяциях, участвующих в генерации иммунного ответа. Теофиллин угнетает пролиферацию Т–лимфоцитов, транспорт их в дыхательные пути и высвобождение ими IL–2, повышает количество Т–супрессоров в периферической крови. Некоторые исследователи указывают на ингибицию им продукции IL–4 CD4+ Т–лимфоцитами, что, соответственно, способствует развитию клеточного иммунного ответа, реализуемого Th1 типа и стимуляции процессов переключения биосинтеза классов иммуноглобулинов [10, 11, 12]. При этом необходимо отметить специфику иммуномодулирующего действия теофиллина, который трансформирует минимальные и гиперергические реакции в нормальные, т. е. повышение реактивности происходит в основном за счет увеличения числа нормальных реакций. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Провести сравнительную оценку влияния Рибомунила и комбинации «Теотард + Рибомунил» на показатели иммунитета у детей с БА с анергией на внутрикожное введение туберкулина. «Рецепт» № 1 (63), 2009 99 Внутрикожная проба с туберкулином (проба Манту) позволяет оценить состояние противотуберкулезного иммунитета индивидуума. Сравнительная оценка влияния «Рибомунила» и комбинации «Теотард + Рибомунил» на показатели иммунитета у детей с бронхиальной астмой с анергией на внутрикожное введение туберкулина МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Дизайн исследования был одобрен этическим комитетом, от родителей было получено информированное согласие. Характеристика обследованных детей. Под наблюдением находилось58 детей с БА. Группа 1: 30 детей, получали Рибомунил (Pierre Fabre, Франция). Препарат вводили перорально по общепринятой схеме. Группа 2: 28 детей, которые получали Теотард (KRKA, Словения) в течение 2–х недель в дозировке, соответствующей возрасту, а затем –Рибомунил перорально, по общепринятой схеме. Все дети были привиты БЦЖ согласно календарю прививок и имели анергический тип реакции на внутрикожное введение туберкулина (по результатам реакции Манту с 2 TU PPD). Контрольную группу составили 50 здоровых детей. Все дети на момент исследования были в возрасте от 5 до 10 лет. Постановка и оценка пробы Манту проводились согласно требованиям, изложенным в приложении №7 к приказу №143 МЗ РБ «Инструкция по применению туберкулиновых проб» и инструктивно–методическом письме «Организация противотуберкулезной помощи детям и подросткам». Реакцию считали анергической при полном отсутствии инфильтрата (гиперемии) или при наличии уколочной реакции (0–1 мм). Материал Венозная кровь и слюна. Методы Иммунофенотипирование МПК (CD3, CD4, CD8, CD22) выполняли методом непрямой иммунофлюоресценции на проточном цитофлюориметре FACSCalibur («Becton Dickinson», США). Концентрацию IgG, IgA и IgМ классов в сыворотке крови и IgG, IgM и sIgA определяли методом простой радиальной иммунодиффузии в агаре по Манчини. Содержание общего IgE в сыворотке определяли наборами «IgE–ИФА–БЕСТ–стрип» (ЗАО «Вектор–Бест», Россия) на ИФА– анализаторе («Behring GmbH», Германия). Продукцию IFN–γ и IL–4 определяли в супернатантах, полученных при культивировании МПК в присутствии ФГА, ЛПС и без стимулятора, иммуноферментным методом (ИФА) с помощью наборов «интерлейкин– 4–ИФА–БЕСТ» и «гамма–интерферон–ИФА–БЕСТ» (ЗАО «Вектор–Бест», Россия) на ИФА–анализаторе («Behring GmbH», Германия). Для характеристики продукции и баланса IFN–γ и IL–4 рассчитывалось соотношение IFN–γ/IL–4. Статистическую обработку данных, полученных в результате исследований, проводили общепринятыми методами. Использовали пакет прикладных программ STATISTICA5.5 и Microsoft Excel. Достоверность различий между группами оценивали с помощью критерия t Стьюдента и критерия χ2 при уровне вероятности различий 95% (р<0,05). РЕЗУЛЬТАТЫ Использование двухнедельного курса Теотарда перед иммунизацией Рибомунилом у детей с анергической реакцией на внутрикожное введение туберкулина привело к увеличению сниженного до лечения относительного количества CD3+ клеток (p<0,05) (таблица 1). Влияние комбинации «Теотард + Рибомунил» у детей с анергией на относитель100 Опыт применения ное количество CD 3+ клеток было более эффективным, чем применение одного Рибомунила (47,9±3,7 % – после применения «Рибомунила», 53,6±2,4 % – после применения комбинации «Теотард + Рибомунил» (χ2 = 8,000, p<0,05)) (таблица 1). Однако мы не выявили достоверных различий между результатами применения Рибомунила и комбинации «Теотард + Рибомунил» на относительное количество CD4+ клеток (р>0,05). Относительное количество CD8+ клеток увеличилось как в результате иммунизации Рибомунилом, так и в результате применения комбинации «Теотард + Рибомунил» (таблица 1). При этом нами отмечено достоверно более эффективное влияние комбинированного применения Теотарда с Рибомунилом на количество CD8+клеток (26,5±2,0 % – после использования Рибомунила, 36,3±5,7 % – после использования комбинации «Теотард + Рибомунил» (χ2=6,750, р<0,05)) (таблица 1). Оценивая динамику относительного количества В–лимфоцитов можно отметить, что у детей из обеих групп до лечения количество клеток, экспрессирующих на своей поверхности CD22, было повышенным. Иммунизация Рибомунилом детей с анергической реакцией на внутрикожное введение туберкулина несколько увеличила количество СD22+ клеток. Применение препарата Теотард и иммунизация на этом фоне Рибомунилом привела к уменьшению CD22+клеток, при этом после лечения в группе, принимавшей Рибомунил и в группе, принимавшей «Теотард + Рибомунил» данные достоверно отличаются (таблица 1), что подтверждает большую эффективность применения комбинации «Теотард + Рибомунил». Иммунизация Рибомунилом детей с анергией на туберкулин привела к некоторому увеличению соотношения IFN–γ/IL–4 в основном за счет снижения синтеза IL–4 (р>0,05). Ожидаемого увеличения синтеза IFN–γ у детей из данной группы после иммунизации Рибомунилом не произошло, что, вероятно, обусловлено состоянием анергии Th1. Нестимулированный синтез IL–4 после применения комбинации «Теотард + Рибомунил» был ниже (3,5±0,5 пг/мл – у детей, принимавших Применение комбинации «Теотард + Рибомунил» у детей с анергией на туберкулин привело к увеличению сниженного относительного количества CD4+ клеток (р<0,05). Таблица 1 Экспрессия СD–антигенов МПК у детей с БА (с анергией) в процессе иммунизации «Рибомунилом» и комбинацией «Теотард + Рибомунил» Группа детей, иммунизированных «Рибомунилом» CD– антигены CD3% CD4% CD8% CD4/CD8 CD22% До лечения (М±m) I 49,02±4,3 43,3±6,04 17,8±1,9 2,2±0,5 26,6±4,1 «Рецепт» № 1 (63), 2009 После лечения (М±m) II 47,9±3,7 40,3±5,6 26,5±2,0 1,5±0,2 27,8±2,1 Р (I–II) >0,05 >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 Группа детей, иммунизированных «Рибомунилом» на фоне применения «Теотарда» После До лечеР лечения ния (М±m) (III– (М±m) III IV) VI 42,9±4,2 53,6±2,4 <0,05 30,6±2,7 42,0±5,5 <0,05 24,4±2,9 36,3±5,7 <0,05 1,85±0,04 1,4±0,1 <0,05 23,2±4,8 19,6±1,9 >0,05 101 χ2 Р (II–IV) (II–IV) 8,000 0,873 6,750 4,000 5,404 <0,05 >0,05 <0,05 >0,05 <0,05 Сравнительная оценка влияния «Рибомунила» и комбинации «Теотард + Рибомунил» на показатели иммунитета у детей с бронхиальной астмой с анергией на внутрикожное введение туберкулина только Рибомунил, 2,9±0,3пг/мл – у детей, принимавших комбинацию «Теотард + Рибомунил» (χ2 =6,750, р<0,05)), а нестимулированный и ФГА– стимулированный синтез IFN–γ – выше, чем после иммунизации Рибомунилом (р<0,05) (таблица 2). После лечения соотношение IFN–γ/IL–4 в супернатантах нестимулированных (158,9±22,1 – группа 1, 272,7±31,8 – группа 2 (χ2 =8,967, р<0,05)) и ФГА–стимулированных МПК (489,03±59,1 – группа 1, 586,3±40,8 8 группа 2 (χ2 =4,806, р<0,05)) у детей, получавших комбинацию препаратов «Теотард + Рибомунил», увеличилось более значительно. Это свидетельствует о более эффективном влиянии комбинации «Теотард + Рибомунил» на баланс Th1/Th2 и о смещении его в сторону Th1. Концентрация IgM в сыворотке у детей, принимавших комбинацию «Теотард + Рибомунил» увеличилась (р>0,05) и после лечения была достоверно больше, чем у детей, принимавших только Рибомунил(1,6±0,5 г/л и 1,4±0,2 г/л соответственно(χ2 = 8,800, р<0,05)). Оценивая изменение концентрации IgE в сыворотке крови при иммунизации Рибомунилом и при комбинированном использовании Теотарда и Рибомунила, необходимо отметить, что и в одной и во второй группе концентрация IgE доствеорно снизилась. Однако, у детей с анергией на туберкулин, иммунизированных Рибомунилом на фоне применения Теотарда, концентрация IgE в сыворотке крови после лечения достоверно более низкая, чем у детей с анергией, иммунизированных Рибомунилом без применения Теотарда (416,6±31,1 kUl/L и 480,1±43,8 kUl/L соответственно (χ2 =6,480, р<0,05)). При этом в группе детей, применявших комбинацию «Теотард + Рибомунил» после лечения соотношение IgE в сыворотке/sIgA в слюне было достоверно ниже, чем у детей, принимавших только Рибомунил (595,14±23,2 и 1200±85,3 соответственно (χ2 =7,675, р<0,05)). Прием комбинации «Теотард + Рибомунил» привел к увеличению концентрации IgG в слюне детей, больных бронхиальной астмой и имеющих анергию на туберкулин, причем применение комбинации оказалось более эффективным, чем прием только Рибомунила (0,092±0,002 мг/мл – после иммунизации Рибомунилом, 0,19±0,07мг/мл – после им- Таблица 2 Динамика продукции IFN–γ in vitro у детей, больных бронхиальной астмой (с анергией) в процессе иммунизации Рибомунилом и комбинацией «Теотард + Рибомунил» Группа детей, иммунизиГруппа детей, иммунизирован- рованных «Рибомунилом» ных «Рибомунилом» на фоне применения χ2 Р «Теотарда» (II–IV) (II–IV) После До После Р До лечения Р лечения лечения лечения (III– (М±m) I (I–II) (М±m) II (М±m) III (М±m)VI IV) Без стимуля474,3± 556,3± 541,2± 790,7± >0,05 <0,05 5,000 <0,05 ции, пг/мл 25,7 82,1 51,3 44,9 Стимули2056,4± 3276,5± 2365,4± 4572,9± <0,05 <0,05 4,899 <0,05 рованные 596,3 318,0 289,2 245,0 ФГА, пг/мл 102 Опыт применения мунизации Рибомунилом на фоне приема Теотарда (χ2 = 12,604, р<0,05)). Двухнедельный прием Теотарда, а затем иммунизация Рибомунилом привела к увеличению sIgA в слюне и после лечения она была достоверно больше, чем у детей, принимавших только Рибомунил (0,7±0,06 мг/мл и 0,4±0,008мг/мл соответственно (χ2 = 9,000, р<0,05)). ОБСУЖДЕНИЕ В настоящий момент очевидна ведущая роль Т–лимфоцитов в астме. В основе атопической БА у детей лежит превалирующий Th2 ответ (и синтез IL–4, IL–5 и IL–13), а также синтез IgE в ответ на поступление антигенов. При этом Th1 ответ (в том числе синтез Th1 цитокинов) и синтез IgG и IgA снижен [13, 14]. Также у астматиков снижено количество Treg, которые могут уменьшить аллергениндуцированную Т–клеточную пролиферацию и синтез ими цитокинов, приведя к снижению синтеза IgE и увеличению синтеза IgG и IgA в ответ на поступление антигена [15]. Очевидно, что не у всех детей, больных БА, одинакова активность Th1, Th2 и Treg. Состояние Th1 типа можно определить в реакции Манту у детей, привитых БЦЖ, т.к. БЦЖ вакцина является мощным активатором Th1 ответа. Проведенные нами ранее исследования подтвердили тот факт, что у детей, имеющих анергический тип реакции на внутрикожное введение туберкулина, функция Th1 типа больше угнетена, чем у детей с нормергическим типом реакции. Одним из важных аспектов воздействия Рибомунила у детей с БА (помимо специфической иммунизации) является регуляция баланса Th1/ Th2 с увеличением функциональной активности Th1 типа, повышением синтеза IFN–γ и, как следствие, снижением функциональной активности Th2 типа, снижением синтеза IgE, и увеличением синтеза sIgA [4,5,6,16, 17]. У детей с анергией этот аспект не был реализован. Скорее всего, это обусловлено именно наличием анергии Th1 типа, которая была зарегистрирована в кожных тестах с туберкулином. Мы предложили таким детям предварительно провести коррекцию анергического состояния, а затем применять Рибомунил и использовали для этой цели Теотард. Известно, что Теотард, являясь пролонгированным препаратом теофиллина, оказывает влияние на экспрессию рецепторов и дифференцировочных антигенов, оптимизирует механизмы антигенпрезентации и костимуляции, регулирует процессы активации и пролиферации, изменяет уровень продукции и спектр синтезируемых цитокинов, модулирует клеточный иммунный ответ [10,12]. Сравнивая изменения, произошедшие в группе детей, иммунизированных Рибомунилом, и в группе детей, которые применяли комбинацию препаратов «Теотард + Рибомунил», можно отметить, что введение Теотарда перед иммунизацией Рибомунилом более эффективно увеличивает относительное количество CD3+ и CD8+ клеток и снижает количество CD22+ клеток у детей, больных БА и имеющих анергический тип реакции на внутрикожное введение туберкулина (р<0,05). Спектр синтезируемых in vitro цитокинов также изменялся неодинаково. Нестимулированный синтез IL–4 после применения комбинации «Теотард + Рибомунил» был ниже, а нестимулированный и ФГА– стимулированный синтез IFN–γ – выше, чем после иммунизации Рибомунилом (р<0,05). При этом соотношение IFN–γ/IL–4 в супернатантах «Рецепт» № 1 (63), 2009 103 Сравнительная оценка влияния «Рибомунила» и комбинации «Теотард + Рибомунил» на показатели иммунитета у детей с бронхиальной астмой с анергией на внутрикожное введение туберкулина Таким образом, у детей с бронхиальной астмой, имеющих анергический тип реакции на внутрикожное введение туберкулина, применение Теотарда повышает эффективность иммунизации Рибомунилом. нестимулированных и ФГА–стимулированных МПК у детей, получавших комбинацию препаратов «Теотард + Рибомунил», увеличилось более значительно (р<0,05). Это можно объяснить тем фактом, что Теотард, введенный перед иммунизацией, приводит к мягкому иммуносупрессорному эффекту посредством угнетения пролиферации Т–лимфоцитов и увеличения количества Т–супрессоров, а также его влиянием на «наивные» Т–лимфоциты (стимуляция образования Th1). Введение на этом фоне микробных компонентов Рибомунила приводит к активной стимуляции Th1 типа, снижению уровня IgE в сыворотке и увеличению синтеза sIgA, IgG и IgM в слюне, а также снижению соотношения IgE/sIgA больше, чем у детей, иммунизированных Рибомунилом без предварительной подготовки. ВЫВОДЫ 1. Применение препарата Теотард у детей, больных БА и имеющих анергический тип реакции на внутрикожное введение туберкулина, повышает иммунологическую эффективность иммунизации Рибомунилом. У таких детей иммунизация Рибомунилом после применения Теотарда приводит к большему увеличению относительного количества CD3+ и CD8+ клеток и снижению CD22+ клеток, чем у детей, иммунизированных Рибомунилом без предварительной подготовки. 2. Уровень нестимулированного синтеза IL–4 у детей с БА (с анергией на туберкулин) ниже, а уровень нестимулированного и ФГА– стимулированного синтеза IFN–γ выше после применения комбинации «Теотард + Рибомунил», чем после иммунизации Рибомунилом без предварительной подготовки. Соотношение IFN–γ/IL–4 в супернатантах нестимулированных и ФГА–стимулированных МПК у детей, получавших комбинацию «Теотард + Рибомунил» выше, что свидетельствует о более эффективном воздействии на баланс Th1/Th2 со снижением функциональной активности Th2 и повышением функциональной активности Th1. 3. Иммунизация Рибомунилом после применения Теотарда приводит к большему снижению уровня IgE в сыворотке и увеличению sIgA, IgM и IgG в слюне, при этом соотношение IgE/sIgA после применения комбинации «Теотард + Рибомунил» достоверно меньше, чем у детей, иммунизированных Рибомунилом без предварительной подготовки. ЛИТЕРАТУРА: 1. Asthma, atopic eczema and allergic rhino–conjunctivitis in school children / M. L. Kabir [et al.] // Mymensingh Med J. – 2005. – V.14, №1. – P. 41–45. 2. Prevalence of asthma–like symptoms in young children / H. Bisgaard [et al.] // Pediatr Pulmonol. – 2007. – V.42, № 8. – P. 723–728. 104 Опыт применения 3. Еханссон , С. Дж. О. Всемирная организация по аллергии: Руководство по профилактике аллергии и аллергической астмы / С. Дж. О. Еханссон, Т. Хатела // Аллергология и иммунология. – 2005. – Т.6, №1. – С. 81–91. 4. Efficacy of vaccine therapy with ribomunil in patients with chronic obstructive pulmonary disease/ I. A. Smirnova [et al.] // Ter Arkh. – 2006. – V. 78(8). – P. 70–73. 5. Immunostimulants revisited: focus on the pharmacology of Ribomunyl / P. Portalès [et al.] // BioDrugs. – 2006. – V. 20(2). – P.81–84. 6. Clot, J. Pharmacology of ribosomal immunotherapy/J. Clot // Drugs. – 1997.– V. 54 (1). – P.33– 36. 7. Влияние Рибомунила на фагоцитарную активность нейтрофилов у детей с бронхиальной астмой в зависимости от исходной реактивности ребенка /Л.П.Титов [и др.] //Asthma. – 2001. – V.2, №1.– P.182. 8. Immune system anergy can affect the efficiency of immunocorrection with Ribomunyl in children with different types of immune reactivity / L.P.Titov [et al.] // Abstract book XIX congress of EAACI.– Lisbon, Portugal., 1–5 Jule 2000 – Р. 58. 9. Влияние рибомунила на состояние В–системы иммунитета у детей, больных бронхиальной астмой / Т. Г. Шилова [и др.]// Труды молодых ученых. Юбилейное издание: Сб.науч.работ / Под общ.ред. С.Л.Кабака.–Мн.: БГМУ,2001.– C.173–175. 10. Современные представления о фармакодинамике теофиллина / Ю. Б. Белоусов [и др.] // Качественная клиническая практика. – 2002. – №7. – С.12–20. 11. Effects of theophylline on CD4+ T lymphocyte, interleukin–5, and interferon gamma in induced sputum of asthmatic subjects / H.X. Nie [et al.] // Acta Pharmacol Sin. – 2002. –Vol.3. –P.267– 272. 12. Теофиллин – регулятор функции иммунокомпетентных клеток и иммуномодулятор межклеточных взаимодействий / Л. П. Титов [и др.] // Рецепт. – 2003. – №31. – C. 78–81. 13. Филянская, Е. Г. Th2–иммунный ответ и цитокины в патогенезе бронхиальной астмы у детей / Е. Г. Филянская, В. В. Ботвиньева // Российский педиатрический журнал. – 2003. – №5. – С. 39–42. 14. Subtle immunodeficiency in severe asthma : IgA and IgG2 correlate with lung function and symptoms / S. Balzar [et al.] // Int. Arch. Allergy Immunol. – 2006.– V. 140(3). – P. 96 – 102. 15. T regulatory cells in allergy / M. Akdis [et al.] // Chem. Immunol. Allergy. – 2006. – Vol. 91 – P.159– 173. 16. Характеристика ммунофармакотерапевтических препаратов / Д. К. Новиков [и др.] // Иммунопатология, иммунология, аллергология. – 2002. – №4. – С. 7–27. 17. Эффективность вакцинотерапии рибомунилом у больных бронхиальной астмой / Я. А. Смирнова [и др.] // Аллергология. – 2006. – №4. – С. 37–39. «Рецепт» № 1 (63), 2009 105
