прооксидантное и цитотоксическое действие n

Реклама
2007
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 49, ¹ 1
ÏÐÎÎÊÑÈÄÀÍÒÍÎÅ È ÖÈÒÎÒÎÊÑÈ×ÅÑÊÎÅ ÄÅÉÑÒÂÈÅ N-ÀÖÅÒÈËÖÈÑÒÅÈÍÀ
È ÃËÓÒÀÒÈÎÍÀ  ÑÎ×ÅÒÀÍÈÈ Ñ ÂÈÒÀÌÈÍÎÌ B12b
© Ì. Å. Ñîëîâüåâà, Â. Â. Ñîëîâüåâ, À. À. Ôàñõóòäèíîâà, À. À. Êóäðÿâöåâ, Â. Ñ. Àêàòîâ
Ì. Å. Ñîëîâüåâà, Â. Â. Ñîëîâüåâ è äð.
Ïðîîêñèäàíòíîå è öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå N-àöåòèëöèñòåèíà è ãëóòàòèîíà
Èíñòèòóò òåîðåòè÷åñêîé è ýêñïåðèìåíòàëüíîé áèîôèçèêè ÐÀÍ, Ïóùèíî;
ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected]
Èññëåäîâàëè ïðîîêñèäàíòíîå è öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå òèîëîâ N-àöåòèëöèñòåèíà (NAC) è ãëóòàòèîíà (GSH) â ñî÷åòàíèè ñ âèòàìèíîì B12b. Ïîêàçàíî, ÷òî òèîëû GSH èëè NAC â ôèçèîëîãè÷åñêèõ êîíöåíòðàöèÿõ ïðè ñîâìåñòíîì ïðèìåíåíèè ñ B12b èíèöèèðóþò àïîïòîç. Óñòàíîâëåíî ïðîîêñèäàíòíîå äåéñòâèå NAC (èëè GSH) ñîâìåñòíî ñ B12b, âûðàæàþùååñÿ â ãåíåðàöèè è íàêîïëåíèè ïåðåêèñè âîäîðîäà âî
âíåêëåòî÷íîé ñðåäå, ÷òî âûçûâàåò âíóòðèêëåòî÷íûé îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ è íàðóøåíèå ðåäîêñ-áàëàíñà
êëåòîê. Îáíàðóæåííûå ýôôåêòû ïîëíîñòüþ ïðåäîòâðàùàþòñÿ íåòèîëîâûìè àíòèîêñèäàíòàìè — êàòàëàçîé è ïèðóâàòîì. Õåëàòîðû æåëåçà ôåíàíòðîëèí è äåôåðîêñàìèí íå ïðåïÿòñòâóþò íàêîïëåíèþ ïåðåêèñè
âîäîðîäà â ñðåäå, íî èíãèáèðóþò ãèáåëü êëåòîê, âûçûâàåìóþ ñîâìåñòíûì äåéñòâèåì NAC è B12b èëè
GSH è B12b. Òàêèì îáðàçîì, òèîëû-àíòèîêñèäàíòû GSH èëè NAC ïðè ñî÷åòàííîì ïðèìåíåíèè ñ âèòàìèíîì B12b ïðîÿâëÿþò ïðîîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà, âûçûâàÿ ïðè ó÷àñòèè âíóòðèêëåòî÷íîãî æåëåçà àïîïòîòè÷åñêóþ ãèáåëü îïóõîëåâûõ êëåòîê.
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: àíòèîêñèäàíòû, âèòàìèí B12b, ãëóòàòèîí, N-àöåòèëöèñòåèí, îêèñëèòåëüíûé
ñòðåññ, àïîïòîç, îïóõîëåâûå êëåòêè.
Ï ð è í ÿ ò û å ñ î ê ð à ù å í è ÿ: ÀÔÊ — àêòèâíûå ôîðìû êèñëîðîäà, DCFHDA — 2S,7S-äèõëîðîäèãèäðîôëóîðåñöåèí äèàöåòàò, DFO — äåôåðîêñàìèí ìåçèëàò, GSH — âîññòàíîâëåííûé ãëóòàòèîí, NAC —
N-àöåòèëöèñòåèí.
áèíîâàÿ êèñëîòà (Akatov et al., 2000), ñïîñîáíû âûñòóïàòü
â êà÷åñòâå ïðîîêñèäàíòîâ. Êàê ïîä÷åðêèâàþò íåêîòîðûå
àâòîðû, â àíòèîêñèäàíòíîé òåðàïèè çà÷àñòóþ íå ó÷èòûâàåòñÿ ñîïóòñòâóþùåå ïîñòóïëåíèå ñîåäèíåíèé ïðîîêñèäàíòíîãî äåéñòâèÿ, ÷òî ìîæåò ïðèâåñòè ê ïîíèæåíèþ åå
ýôôåêòèâíîñòè è äàæå ê ïîâðåæäàþùåìó âîçäåéñòâèþ íà
êëåòêè è òêàíè îðãàíèçìà (Áîáûðåâ è äð., 1994). Ñ äðóãîé
ñòîðîíû, öèòîòîêñè÷åñêèé ýôôåêò ñî÷åòàíèé òèîëà è B12b
ìîæåò áûòü âçÿò çà îñíîâó ïðè ðàçðàáîòêå íîâûõ ëåêàðñòâåííûõ (ïðîòèâîîïóõîëåâûõ) ñðåäñòâ.
Öåëüþ íàñòîÿùåé ðàáîòû ÿâëÿëîñü èçó÷åíèå ìåõàíèçìà ïðîîêñèäàíòíîãî è öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ òèîëîâ NAC èëè GSH â ñî÷åòàíèè ñ âèòàìèíîì B12b.
Òèîëñîäåðæàùèå ñîåäèíåíèÿ èãðàþò âàæíóþ ðîëü â
çàùèòå áåëêîâ êëåòêè îò îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà, â âîññòàíîâëåíèè èõ äèñóëüôèäíûõ ãðóïï. Òèîëû øèðîêî
ïðèìåíÿþòñÿ â ìåäèöèíå êàê ðàäèîïðîòåêòîðû è àíòèîêñèäàíòû, â ëå÷åíèè ïíåâìîòîêñè÷íîñòè, ðåâìàòîèäíîãî àðòðèòà, ïðè ïåðåäîçèðîâêå àöåòàìèíîôåíà. Îäíàêî
òèîëû â êîíöåíòðàöèÿõ, îáû÷íî ïðèìåíÿåìûõ äëÿ çàùèòû êëåòîê îò îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà, ìîãóò îêàçûâàòü è
íåîæèäàííûé ïîâðåæäàþùèé ýôôåêò (Munday, 1989;
Held et al., 1996; Tartier et al., 2000; Qanungo et al., 2004).
Ýòî îáóñëîâëåíî èõ äâîéñòâåííîé ïðèðîäîé: â ÷àñòíîñòè, ñïîñîáíîñòüþ äèòèîòðåèòîëà (ÄÒÒ) (Taatjes et al.,
1997; Spear, Aust, 1998), N-àöåòèëöèñòåèíà (NAC) è ãëóòàòèîíà (GSH) (Held, Biaglow, 1994; Kwak et al., 1995;
Held et al., 1996; Chan et al., 2001; Thibodeau et al., 2001;
Sagrista et al., 2002; Borisenko et al., 2004; Farombi et al.,
2004), öèñòåèíà (Yang et al., 2000), öèñòåàìèíà è äðóãèõ
íèçêîìîëåêóëÿðíûõ òèîëîâ (Jeitner et al., 1998) ãåíåðèðîâàòü àêòèâíûå ôîðìû êèñëîðîäà (ÀÔÊ) â ðåàêöèÿõ ñ
èîíàìè ïåðåõîäíûõ ìåòàëëîâ (Fe è Cu) èëè ðåàãèðîâàòü
ñî ñâîáîäíûìè ðàäèêàëàìè è ñàìèì ñòàíîâèòüñÿ òèèëüíûìè ðàäèêàëàìè, ÷òî â èòîãå âåäåò ê ïîâðåæäåíèþ
ÄÍÊ è äðóãèõ áèîìîëåêóë (Long, Halliwell, 2001).
Íåäàâíî ìû îáíàðóæèëè öèòîòîêñè÷åñêèé ýôôåêò
òèîëîâ GSH èëè NAC ïðè âíåñåíèè èõ â êóëüòóðó êëåòîê
îäíîâðåìåííî ñ âèòàìèíîì B12b (Ñîëîâüåâà è äð., 2005) è
ïðåäïîëîæèëè, ÷òî â êîìáèíàöèè ñ Co3+, âõîäÿùèì â
ñîñòàâ ãèäðîêñèêîáàëàìèíà, ýòè âåùåñòâà, êàê è àñêîð-
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
 ðàáîòå èñïîëüçîâàëè âèòàìèí B12b (Êóðãàíñêèé
êîìáèíàò ìåäïðåïàðàòîâ è èçäåëèé, Ðîññèÿ), ñðåäó
ÄÌÅ, ãëóòàòèîí, NAC, êàòàëàçó, ïèðóâàò, ôåíàíòðîëèí
(MPbiomedicals, ÑØÀ), ýìáðèîíàëüíóþ òåëÿ÷üþ ñûâîðîòêó (FBS) (HyClone, ÑØÀ), áèñáåíçèìèä H33342 è
H33258, ýòèäèóì áðîìèä, íåîêóïðîèí, äåôåðîêñàìèí
ìåçèëàò è êðèñòàëëè÷åñêèé ôèîëåòîâûé (Sigma, ÑØÀ) è
2S,7S-äèõëîðîäèãèäðîôëóîðåñöåèí äèàöåòàò (Molecular
probes, ÑØÀ).
Êëåòêè êàðöèíîìû ãîðòàíè ÷åëîâåêà HEp-2, ïîëó÷åííûå èç Âñåðîññèéñêîé êîëëåêöèè êëåòî÷íûõ êóëüòóð
70
Ïðîîêñèäàíòíîå è öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå N-àöåòèëöèñòåèíà è ãëóòàòèîíà
(Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã), âûðàùèâàëè â ñðåäå ÄÌÅ ñ äîáàâëåíèåì 10 % FBS, 80 ìêã/ìë
ãåíòàìèöèíà, 2.2 ã/ë áèêàðáîíàòà íàòðèÿ ïðè 37 °Ñ è 5 %
CO2. Èññëåäóåìûå âåùåñòâà äîáàâëÿëè â ñðåäó ÷åðåç
24 ÷ ïîñëå ïîñåâà êëåòîê (50 òûñ. êë./ìë). Íåîêóïðîèí è
ôåíàíòðîëèí äîáàâëÿëè èç ìàòî÷íûõ ðàñòâîðîâ â ýòàíîëå çà 30 ìèí äî ââåäåíèÿ â ñðåäó B12b è òèîëà; èòîãîâàÿ
êîíöåíòðàöèÿ ýòàíîëà â ñðåäå íå ïðåâûøàëà 0.1 %. Îñòàëüíûå âåùåñòâà ðàñòâîðÿëè â ñðåäå ÄÌÅ. Õåëàòîð æåëåçà DFO äîáàâëÿëè çà 2 ÷, êàòàëàçó è ïèðóâàò — íåïîñðåäñòâåííî ïåðåä âíåñåíèåì òèîëà è B12b.
Öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå âåùåñòâ îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ ìåòîäèêè, îñíîâàííîé íà îêðàñêå êëåòî÷íûõ
êóëüòóð êðèñòàëëè÷åñêèì ôèîëåòîâûì (Nomizu et al.,
1995). Êëåòêè âûñåâàëè â 96-ëóíî÷íûå ìèêðîïëàíøåòû
è ÷åðåç 1 ñóò ïîñëå ïîñåâà äîáàâëÿëè òèîë è âèòàìèí B12b
èëè òîëüêî òèîë. Ïîñëå 48 ÷ êóëüòèâèðîâàíèÿ îöåíèâàëè êîëè÷åñòâî ïðèêðåïëåííûõ êëåòîê â ëóíêàõ, èñïîëüçóÿ îêðàñêó êðèñòàëëè÷åñêèì ôèîëåòîâûì. Î äîëå êëåòîê, âûðàæàåìîé â ïðîöåíòàõ îò êîíòðîëüíûõ çíà÷åíèé, ñóäèëè ïî îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè.  ðÿäå ýêñïåðèìåíòîâ äîëþ ïîãèáøèõ êëåòîê îïðåäåëÿëè ïîñëå èõ
îòêðåïëåíèÿ òðèïñèíîì, ñ ïîìîùüþ îêðàñêè òðèïàíîâûì ñèíèì.
Àáåððàíòíîå ðàñïðåäåëåíèå õðîìàòèíà âûÿâëÿëè
ìåòîäîì ëþìèíåñöåíòíîé ìèêðîñêîïèè. Âñå êëåòêè,
âêëþ÷àÿ îòêðåïèâøèåñÿ, ñîáèðàëè è îêðàøèâàëè îäíîâðåìåííî äâóìÿ êðàñèòåëÿìè — áèñáåíçèìèäîì H33342,
êîòîðûé ñâÿçûâàåòñÿ ñ ÄÍÊ æèâûõ è ïîãèáøèõ êëåòîê, è
ýòèäèóì áðîìèäîì, ñâÿçûâàþùèìñÿ ñ ÄÍÊ ïîãèáøèõ
êëåòîê, â êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 1 ìêã/ìë êàæäûé (Àêàòîâ è äð., 2000). Èñïîëüçîâàëè îáúåêòèâ 40% è ñâåòîôèëüòðû, ïðè êîòîðûõ ÿäðà ïîãèáøèõ êëåòîê ëþìèíåñöèðîâàëè îðàíæåâûì öâåòîì, à ÿäðà æèâûõ êëåòîê —
çåëåíûì. Ê àïîïòîòè÷åñêèì îòíîñèëè êëåòêè ñ ôðàãìåíòèðîâàííûìè ÿäðàìè, ñ ìàðãèíàëüíûì ðàñïðåäåëåíèåì
õðîìàòèíà, à òàêæå ìåëêèå êëåòêè ñ îäíîðîäíûì, èíòåíñèâíî ôëóîðåñöèðóþùèì (êîíäåíñèðîâàííûì) õðîìàòèíîì (Cohen, 1993). Íåêðîòè÷åñêèìè ñ÷èòàëè êëåòêè ñ
ãåòåðîãåííûì õðîìàòèíîì, õàðàêòåðíûì äëÿ íåïîâðåæäåííûõ êëåòîê êîíòðîëüíûõ êóëüòóð, íî ôëóîðåñöèðóþùèì îðàíæåâûì öâåòîì. Â êàæäîì ïðåïàðàòå (300—
500 êëåòîê) ïîäñ÷èòûâàëè êîëè÷åñòâî ïîãèáøèõ (íåêðîòè÷åñêèõ è àïîïòîòè÷åñêèõ) è æèâûõ êëåòîê (â òîì ÷èñëå àïîïòîòè÷åñêèõ).
Êðîìå òîãî, íàëè÷èå àïîïòîòè÷åñêèõ êëåòîê îöåíèâàëè ìåòîäîì ïðîòî÷íîé öèòîìåòðèè ñ ïîìîùüþ öèòîìåòðà PARTECIII (Ãåðìàíèÿ) ïî ïðèñóòñòâèþ ÷àñòèö â
ñóá-G1-îáëàñòè íà ÄÍÊ-öèòîãðàììàõ. Âñå êëåòêè, âêëþ÷àÿ îòêðåïèâøèåñÿ, ôèêñèðîâàëè 50%-íûì ðàñòâîðîì
ýòàíîëà â ðàñòâîðå Ýðëà, pH 7.2. ÄÍÊ êëåòîê îêðàøèâàëè êðàñèòåëåì áèñáåíçèìèäîì H33258 (5 ìêã/ìë).
×òîáû âûÿâèòü ìåæíóêëåîñîìíóþ ôðàãìåíòàöèþ,
1 ìêã êëåòî÷íîé ÄÍÊ ðàçäåëÿëè ýëåêòðîôîðåòè÷åñêè â
1.2%-íîì àãàðîçíîì ãåëå ñîãëàñíî îïèñàííîé ïðîöåäóðå
(Ren et al., 2001). Ãåëè îêðàøèâàëè ýòèäèóì áðîìèäîì
(0.5 ìêã/ìë) â òå÷åíèå 20 ìèí.
Êîíöåíòðàöèþ H2O2 â ñðåäå îïðåäåëÿëè ïîëÿðîãðàôè÷åñêèì ìåòîäîì, ïîñêîëüêó ìåòîäû, îñíîâàííûå íà
ïåðîêñèäàçíîé ðåàêöèè ñ îêèñëåíèåì êðàñèòåëÿ, â ïðèñóòñòâèè âîññòàíîâèòåëåé íåïðèãîäíû (Akatov et al.,
2000; Long, Halliwell, 2001). ×åðåç 1 ñóò ïîñëå ïîñåâà
350—400 òûñ. êëåòîê âî ôëàêîí Ò25 äîáàâëÿëè òèîë
(NAC èëè GSH äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 5 ìÌ), â îòäåëüíîñòè èëè â ñî÷åòàíèè ñ 25 ìêÌ B12b. Ïðîáû ñðåäû
71
÷åðåç îïðåäåëåííûå ïðîìåæóòêè âðåìåíè âíîñèëè â èçìåðèòåëüíóþ ÿ÷åéêó ñ O2-ýëåêòðîäîì. Êîíöåíòðàöèþ
H2O2 îïðåäåëÿëè ïî èçìåíåíèþ ñîäåðæàíèÿ O2 ïîñëå
äîáàâëåíèÿ êàòàëàçû.
Âíóòðèêëåòî÷íóþ îêèñëèòåëüíóþ àêòèâíîñòü îöåíèâàëè ïî ôëóîðåñöåíöèè çîíäà DCFHDA ñ ïîìîùüþ ïðîòî÷íîãî öèòîìåòðà PARTECIII. Êëåòêè âûñåâàëè â êóëüòóðàëüíûå ôëàêîíû (50 òûñ. êë./ìë) çà 1 ñóò äî îïûòà.
Âûïîëíÿëè ýêñïåðèìåíòû â äâóõ âàðèàíòàõ (Pantopoulos
et al., 1997).
1. Äëÿ îöåíêè íàðóøåíèÿ ðåäîêñ-áàëàíñà êëåòîê â
ðåçóëüòàòå ñî÷åòàííîãî äåéñòâèÿ B12b è òèîëà îöåíèâàëè
îêèñëèòåëüíóþ àêòèâíîñòü ýíäîãåííîãî ïðîèñõîæäåíèÿ.
Äëÿ ýòîãî êëåòêè èíêóáèðîâàëè ñ H2O2 èëè ñ B12b ñîâìåñòíî ñ òèîëîì. Çàòåì îòêðåïèâøèåñÿ êëåòêè îñàæäàëè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì, à ïðèêðåïëåííûå îòêðåïëÿëè ðàñòâîðîì òðèïñèíà, îáúåäèíÿëè èõ, îêðàøèâàëè 40 ìêÌ
DCFHDA â ñâåæåé ðîñòîâîé ñðåäå â òåìíîòå ïðè 37 °Ñ â
òå÷åíèå 30 ìèí, öåíòðèôóãèðîâàëè, îñàäîê ðåñóñïåíäèðîâàëè â õîëîäíîì PBS è ðåãèñòðèðîâàëè ôëóîðåñöåíöèþ êëåòîê íà ïðîòî÷íîì öèòîìåòðå.
2. Âíóòðèêëåòî÷íóþ îêèñëèòåëüíóþ àêòèâíîñòü,
îáóñëîâëåííóþ ãåíåðàöèåé ÀÔÊ âíóòðè êëåòêè è ïîòîêîì âíåêëåòî÷íîé H2O2 âíóòðü êëåòêè âî âðåìÿ èíêóáàöèè ñ H2O2 èëè ñ B12b ñîâìåñòíî ñ òèîëîì, îöåíèâàëè ñëåäóþùèì îáðàçîì. Êëåòêè îòêðåïëÿëè ñ ïîìîùüþ òðèïñèíà, ñóñïåíäèðîâàëè â ðîñòîâîé ñðåäå, îêðàøèâàëè
DCFHDA, îòìûâàëè îò âíåêëåòî÷íîãî êðàñèòåëÿ, ðåñóñïåíäèðîâàëè â ðîñòîâîé ñðåäå, èíêóáèðîâàëè ñ H2O2 èëè
ñ B12b è òèîëîì ñîâìåñòíî îïðåäåëåííîå âðåìÿ, ðåñóñïåíäèðîâàëè â õîëîäíîì PBS è íåìåäëåííî ðåãèñòðèðîâàëè ôëóîðåñöåíöèþ. Êîíòðîëåì ñëóæèëè êëåòêè áåç äîáàâëåíèÿ òèîëîâ è âèòàìèíà B12b.
Ðåçóëüòàòû îáðàáàòûâàëè ñòàòèñòè÷åñêè. Ïî äàííûì 3—5 îïûòîâ îïðåäåëÿëè ñðåäíåå àðèôìåòè÷åñêîå
çíà÷åíèå è îøèáêó îïðåäåëåíèÿ ñðåäíåãî (x ± sx ). Äîñòîâåðíîñòü ðàçëè÷èé îïðåäåëÿëè ïî t-êðèòåðèþ Ñòüþäåíòà.
Ðåçóëüòàòû
Íè NAC, íè GSH â äèàïàçîíå êîíöåíòðàöèé 0.1—
10.0 ìÌ â ñðåäå ÄÌÅ ñ ñûâîðîòêîé íå îêàçûâàëè öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ íà êëåòêè (ðèñ. 1, êðèâûå 3, 4).
Ñî÷åòàíèÿ 5 èëè 10 ìÌ NAC ñ 25 ìêÌ âèòàìèíà B12b
îêàçûâàëè âûðàæåííûé öèòîòîêñè÷åñêèé ýôôåêò (ðèñ. 1,
êðèâàÿ 1). Âèòàìèí B 12b â äèàïàçîíå êîíöåíòðàöèé
0.3 ìêÌ—3.0 ìÌ áûë íåòîêñè÷åí. Ãëóòàòèîí, êîòîðûé
îáû÷íî äîáàâëÿþò â ñðåäó èíêóáàöèè ñ öåëüþ èíãèáèðîâàòü îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ, òàêæå áûë òîêñè÷åí äëÿ êëåòîê â ñî÷åòàíèè ñ âèòàìèíîì B12b (ðèñ. 1, êðèâàÿ 2). Äîñòîâåðíîé ðàçíèöû â âåëè÷èíå öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ B12b è 5 ìÌ GSH èëè B12b è 5 ìÌ NAC íå âûÿâëåíî.
Äîëÿ ïîãèáøèõ êëåòîê, îêðàøåííûõ òðèïàíîâûì ñèíèì
èëè ýòèäèóì áðîìèäîì, íà÷èíàëà óâåëè÷èâàòüñÿ ÷åðåç
4 ÷ ïîñëå îäíîâðåìåííîãî äîáàâëåíèÿ B12b è òèîëà è äîñòèãàëà 90 % ÷åðåç 48 ÷ êóëüòèâèðîâàíèÿ (ðèñ. 2). Òàêèì
îáðàçîì, ñî÷åòàííîå ïðèìåíåíèå òèîëà è âèòàìèíà B12b
îêàçûâàåò èìåííî öèòîòîêñè÷åñêèé, íî íå öèòîñòàòè÷åñêèé ýôôåêò. Ïðåðûâàÿ ñî÷åòàííîå äåéñòâèå B12b è òèîëà
ïóòåì çàìåíû èíêóáàöèîííîé ñðåäû íà ñâåæóþ ðîñòîâóþ ñðåäó, ìû óñòàíîâèëè, ÷òî èíèöèàöèÿ ãèáåëè îñíîâíîé ÷àñòè (90 %) êëåòîê ïðîèñõîäèò â òå÷åíèå ïåðâûõ
2 ÷ èíêóáàöèè. Â ýòîò ïåðèîä âðåìåíè äîëÿ ïîãèáøèõ
êëåòîê îñòàåòñÿ íà óðîâíå êîíòðîëÿ (5 %).
72
Ì. Å. Ñîëîâüåâà, Â. Â. Ñîëîâüåâ è äð.
íàáëþäåíèÿ êîíöåíòðàöèÿ H 2 O 2 ïîääåðæèâàëàñü íà
óðîâíå 25— 35 ìêÌ. Ïðè èíêóáàöèè êëåòîê ñ 25 ìêÌ
B12b è 5 ìÌ GSH òàêæå íàáëþäàëè ïîâûøåíèå êîíöåíòðàöèè H 2 O 2 â ñðåäå äî 25—30 ìêÌ (ðèñ. 5, á, êðèâûå 1, 2). Äîñòîâåðíûõ ðàçëè÷èé ìåæäó ýêñïåðèìåíòàìè
ñ NAC è GSH (ðèñ. 5, á, êðèâûå 1, 2) íå îáíàðóæåíî.
 êîíòðîëüíûõ êóëüòóðàõ ìû íå îáíàðóæèëè íàêîïëåíèÿ H2O2 â ñðåäå.
Íåòèîëîâûå àíòèîêñèäàíòû êàòàëàçà (200 åä./ìë) è
ïèðóâàò (10 ìÌ) ïðè âíåñåíèè íà 2 ÷ â êóëüòóðàëüíóþ
ñðåäó âìåñòå ñ B12b è GSH (èëè NAC) ïîëíîñòüþ èíãèáèðîâàëè èõ öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå (ðèñ. 6, à). Ýòî óêàçûâàåò íà òî, ÷òî îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ, îáóñëîâëåííûé
ñî÷åòàííûì äåéñòâèåì B12b è òèîëà, ÿâëÿåòñÿ ïðè÷èíîé
ãèáåëè êëåòîê. Õåëàòîðû æåëåçà — ôåíàíòðîëèí, ñâÿçûâàþùèé Fe2+ (50 ìêÌ), è DFO (0.3 ìÌ), áîëåå ïðî÷íî
ñâÿçûâàþùèé Fe3+ (Halliwell, Gutteridge, 1986; Byrnes,
1996), òàêæå óñòðàíÿëè öèòîòîêñè÷åñêèé ýôôåêò ñî÷åòà-
Ðèñ. 1. Öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå NAC ñîâìåñòíî ñ âèòàìèíîì
B12b (1) èëè GSH ñîâìåñòíî ñ B12b (2) íà êëåòêè HEp-2 â çàâèñèìîñòè îò êîíöåíòðàöèè òèîëà.
Êðèâàÿ 3 — NAC, 4 — GSH. Òèîë (5 ìÌ) è B12b (25 ìêÌ) äîáàâëÿëè ÷åðåç
1 ñóò ïîñëå ïîñåâà êëåòîê â ìèêðîïëàíøåò. ×åðåç 2 ÷ ñðåäó â ëóíêàõ çàìåíÿëè ñâåæåé ðîñòîâîé ñðåäîé. Öèòîòîêñè÷íîñòü îöåíèâàëè ÷åðåç 48 ÷ ïî
îêðàñêå êðèñòàëëè÷åñêèì ôèîëåòîâûì. Ïðåäñòàâëåíû äàííûå 5 ýêñïåðèìåíòîâ.
Ïðè èçó÷åíèè òèïà ãèáåëè êëåòîê, âûçûâàåìîé ñî÷åòàííûì äåéñòâèåì òèîëà è âèòàìèíà B12b, ìû îáíàðóæèëè óâåëè÷åíèå äîëè êëåòîê ñ óìåíüøåííûì îáúåìîì è
ôðàãìåíòèðîâàííûì, à òàêæå êîíäåíñèðîâàííûì õðîìàòèíîì, ÷òî ÿâëÿåòñÿ õàðàêòåðíûì ìîðôîëîãè÷åñêèì ïðèçíàêîì àïîïòîçà. Äîñòîâåðíîå óâåëè÷åíèå äîëè àïîïòîòè÷åñêèõ êëåòîê (ðèñ. 2) îòìå÷àëè óæå ïîñëå 4 ÷ äåéñòâèÿ òèîëà è âèòàìèíà B12b. Êîíäåíñèðîâàííûé è ôðàãìåíòèðîâàííûé ïî àïîïòîòè÷åñêîìó òèïó õðîìàòèí áûë
îáíàðóæåí êàê â ïîãèáøèõ êëåòêàõ, òàê è â êëåòêàõ, ñîõðàíÿþùèõ öåëîñòíîñòü ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû, ò. å.
åùå æèâûõ. Äîëÿ êëåòîê ñ êîíäåíñèðîâàííûì õðîìàòèíîì ïðåâûøàëà äîëþ êëåòîê ñ ôðàãìåíòèðîâàííûì õðîìàòèíîì, êîòîðàÿ â îïûòå ñîñòàâëÿëà îáû÷íî íå áîëåå
20 % îò îáùåãî ÷èñëà êëåòîê. Äîëÿ íåêðîòè÷åñêèõ êëåòîê íå ïðåâûøàëà 3.1 ± 0.5 %, â êîíòðîëå îíà ñîñòàâëÿëà
1.5 ± 0.1 %. Ìåòîäîì ïðîòî÷íîé öèòîìåòðèè áûëî âûÿâëåíî ïîñòåïåííîå óâåëè÷åíèå äîëè êëåòîê â ñóá-G1-îáëàñòè ïðè ñî÷åòàííîì äåéñòâèè B12b è NAC èëè B12b è GSH,
÷òî îçíà÷àåò ïîÿâëåíèå êëåòîê ñ ñóáäèïëîèäíûì íàáîðîì ÄÍÊ âñëåäñòâèå ïîòåðè ÷àñòè ÄÍÊ ïðè àïîïòîçå
(ðèñ. 3, á, â). Ïîÿâëåíèå ìåæíóêëåîñîìíîé ôðàãìåíòàöèè ÄÍÊ, õàðàêòåðíîé äëÿ àïîïòîçà, ïîñëå 8—10 ÷ èíêóáàöèè êëåòîê â ïðèñóòñòâèè B12b è NAC èëè B12b è GSH
ïîêàçàíî íà ðèñ. 4 (äîðîæêè 3—5).
Êàê èçâåñòíî, îäèí èç ìåõàíèçìîâ àíòèîêñèäàíòíîãî
äåéñòâèÿ òèîëîâ NAC è GSH — ïðÿìîé ïåðåõâàò ÀÔÊ.
Äåéñòâèòåëüíî, NAC èëè GSH â êîíöåíòðàöèè 5 ìÌ â
2—3 ðàçà óñêîðÿëè ýëèìèíàöèþ H2O2, äîáàâëåííîé â
êëåòî÷íóþ êóëüòóðó (ðèñ. 5, à, êðèâûå 2, 3). Ñàìè ïî
ñåáå ýòè òèîëû ïðàêòè÷åñêè íå âûçûâàëè îáðàçîâàíèÿ
H2O2 â ðîñòîâîé ñðåäå: îáíàðóæåíî ìåíåå 8 è íå áîëåå
5 ìêì H2O2 ïîñëå 2-÷àñîâîãî äåéñòâèÿ NAC è GSH ñîîòâåòñòâåííî (ðèñ. 5, á, êðèâûå 3, 4), ÷òî ñîãëàñóåòñÿ ñ îòñóòñòâèåì èõ òîêñè÷íîñòè. Íàïðîòèâ, NAC (5 ìÌ) â ñî÷åòàíèè ñ 25 ìêÌ B12b óæå ÷åðåç 10 ìèí âûçûâàë íàêîïëåíèå H 2 O 2 â ñðåäå äî 30 ìêÌ.  ïîñëåäóþùèå 2 ÷
Ðèñ. 2. Óâåëè÷åíèå äîëè àïîïòîòè÷åñêèõ (1) è ïîãèáøèõ (2)
êëåòîê ïîñëå ñî÷åòàííîãî äåéñòâèÿ 25 ìêÌ B12b ñ 5 ìÌ NAC
(à) è 25 ìêÌ B12b ñ 5 ìÌ GSH (á).
Ê àïîïòîòè÷åñêèì îòíîñèëè ïîãèáøèå êëåòêè ñ àáåððàíòíûì ðàñïðåäåëåíèåì õðîìàòèíà è åùå æèâûå êëåòêè, íî ñ óæå ôðàãìåíòèðîâàííûì è
êîíäåíñèðîâàííûì õðîìàòèíîì. ×èñëî ïîãèáøèõ êëåòîê îïðåäåëÿëè
êàê ñóììó ïîãèáøèõ àïîïòîòè÷åñêèõ è íåêðîòè÷åñêèõ êëåòîê. Êîíòðîëü — íåîáðàáîòàííûå êëåòêè (0 ÷). Çâåçäî÷êîé îòìå÷åíû ðàçëè÷èÿ,
íåäîñòîâåðíûå ïî îòíîøåíèþ ê êîíòðîëþ (P > 0.05). Ïðåäñòàâëåíû äàííûå 5 ýêñïåðèìåíòîâ.
Ïðîîêñèäàíòíîå è öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå N-àöåòèëöèñòåèíà è ãëóòàòèîíà
73
Ðèñ. 3. Ãèñòîãðàììû ðàñïðåäåëåíèÿ êëåòîê HEp-2 ïî ñîäåðæàíèþ ÄÍÊ ïîñëå ñî÷åòàííîãî äåéñòâèÿ B12b è òèîëà â òå÷åíèå 7 ÷.
à — êîíòðîëü, á — 25 ìêÌ B12b ñîâìåñòíî ñ 5 ìÌ NAC, â — 25 ìêÌ B12b ñîâìåñòíî ñ 5 ìÌ GSH.
íèÿ B12b è òèîëà (ðèñ. 6, à) è ìîðôîëîãè÷åñêèå ïðèçíàêè
àïîïòîçà, ñíèæàÿ ôðàãìåíòàöèþ ÿäåð è êîíäåíñàöèþ
õðîìàòèíà â 6—8 ðàç, ñ 89 è 93 % (ðèñ. 2, à, á) äî
11—15 %. Çàùèòíûé ýôôåêò DFO áåç ïðåèíêóáàöèè áûë
â 1.5—2.0 ðàçà ìåíåå âûðàæåí (P < 0.05). Ýôôåêòèâíîñòü
çàùèòíîãî äåéñòâèÿ ôåíàíòðîëèíà íå çàâèñåëà îò ïðåèíêóáàöèè (äàííûå íå ïîêàçàíû). Íàêîïëåíèå H2O2 â ñðåäå, ñîäåðæàùåé B12b è òèîë, â ïåðâûå 2 ÷ íàáëþäåíèÿ
óñòðàíÿëîñü êàòàëàçîé è ïèðóâàòîì, íî íå ôåíàíòðîëèíîì è DFO (ðèñ. 6, á). Õåëàòîð ìåäè íåîêóïðîèí â êîíöåíòðàöèÿõ äî 10 ìêÌ íå óñòðàíÿë ãèáåëü êëåòîê, à ïðè
ïîâûøåíèè êîíöåíòðàöèè îêàçûâàë ñîáñòâåííîå öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå (äàííûå íå ïîêàçàíû).
Ïîâûøåíèå âíóòðèêëåòî÷íîé îêèñëèòåëüíîé àêòèâíîñòè âî âðåìÿ èíèöèàöèè ãèáåëè êëåòîê ïðè äåéñòâèè
B12b ñîâìåñòíî ñ òèîëîì áûëî îáíàðóæåíî ìåòîäîì ïðîòî÷íîé öèòîìåòðèè.  ïåðâûå 30 ìèí ñî÷åòàííîãî äåéñòâèÿ B12b è òèîëà íà êëåòêè, ïðåäâàðèòåëüíî îêðàøåííûå
ôëóîðåñöåíòíûì çîíäîì DCFHDA, íå îáíàðóæåíî ïîâûøåíèÿ èõ ôëóîðåñöåíöèè, õîòÿ â ñðåäå áûë êîíöåíòðàöèîííûé ïèê H 2 O 2 . ×åðåç 1 ÷ ðåãèñòðèðîâàëè
ïîâûøåíèå ôëóîðåñöåíöèè êëåòîê â 2.0—2.5 ðàçà ïî
ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëåì (ðèñ. 7, à, á), ÷òî óêàçûâàåò íà
âíóòðèêëåòî÷íûé îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ. Ýòîò ñòðåññ
ìîã áûòü îáóñëîâëåí âíóòðèêëåòî÷íîé ãåíåðàöèåé ÀÔÊ
è ïîòîêîì â êëåòêó ïåðåêèñè âîäîðîäà, îáðàçóþùåéñÿ
âíå êëåòêè (ðèñ. 5). Äåéñòâèå íà êëåòêè NAC èëè GSH â
îòñóòñòâèå B12b (3—4 ÷) ïðèâîäèëî ê ïàäåíèþ èõ ôëóîðåñöåíöèè îòíîñèòåëüíî êîíòðîëÿ íà 20—30 %. Ýíäîãåííàÿ îêèñëèòåëüíàÿ àêòèâíîñòü, êîòîðóþ îöåíèâàëè
ïî ôëóîðåñöåíöèè êëåòîê, îêðàøåííûõ DCFHDA ïîñëå
èõ èíêóáàöèè ñîâìåñòíî ñ B12b è òèîëîì (NAC èëè GSH)
è óäàëåíèÿ èç ñðåäû ýòèõ âåùåñòâ, ÷åðåç 1 ÷ íå îòëè÷àëàñü îò êîíòðîëÿ (ðèñ. 8). Ñëåäîâàòåëüíî, ðåäîêñ-ñèñòåìà êëåòîê â òå÷åíèå 1-ãî ÷ ñî÷åòàííîãî äåéñòâèÿ B12b è
òèîëà îñòàâàëàñü íåèçìåííîé è ïîâûøåíèå âíóòðèêëå-
Ðèñ. 4. Ìåæíóêëåîñîìíàÿ ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ êëåòîê HEp-2, âûçâàííàÿ ñî÷åòàííûì äåéñòâèåì 25 ìêÌ B12b è 5 ìÌ òèîëà (NAC
èëè GSH).
Äîðîæêè: 1 — êîíòðîëü; 2—5 — ñîîòâåòñòâåííî 7, 10, 12 è 16 ÷ ñî÷åòàííîãî äåéñòâèÿ B12b è 5 ìÌ NAC (à) èëè ñîîòâåòñòâåííî 6, 8, 10 è 12 ÷ ñî÷åòàííîãî äåéñòâèÿ B12b è 5 ìÌ GSH (á). Äîðîæêà 6 — ìàðêåðû ÄÍÊ, êðàòíûå 100 ïàðàì îñíîâàíèé.
74
Ì. Å. Ñîëîâüåâà, Â. Â. Ñîëîâüåâ è äð.
ñ GSH èëè ñ NAC îáóñëîâëåíî H2O2, îáðàçóþùåéñÿ â èíêóáàöèîííîé ñðåäå, à íà çàâåðøàþùåé ñòàäèè èíèöèàöèè (2-é ÷) — åùå è íàðóøåíèåì ðåäîêñ-áàëàíñà êëåòîê.
Îáñóæäåíèå
 íàñòîÿùåå âðåìÿ äîñòèãíóòî ïîíèìàíèå òîãî, ÷òî
ëþáîé àíòèîêñèäàíò â ñèëó ñâîåé äâîéñòâåííîé ïðèðîäû â îïðåäåëåííûõ óñëîâèÿõ ìîæåò âûñòóïàòü â êà÷åñòâå ïðîîêñèäàíòà (Çåíêîâ è äð., 2001; Kohen, Nyska,
2002). Òàê, àñêîðáèíîâàÿ êèñëîòà â ðåàêöèè ñ äâóõâàëåíòíûì æåëåçîì (Buettner, Jurkiewicz, 1996), ñ èîíàìè äðóãèõ ïåðåõîäíûõ ìåòàëëîâ, íàïðèìåð ìåäè (Kimoto et al.,
1983) è êîáàëüòà (Âîëüïèí è äð., 1998; Ðóìÿíöåâà è äð.,
1989; Àêàòîâ è äð., 2000), ïðèâîäèò ê ãåíåðàöèè ÀÔÊ.
 ëèòåðàòóðå èìåþòñÿ äàííûå î òîì, ÷òî øèðîêî èñïîëüçóåìûå â êà÷åñòâå àíòèîêñèäàíòîâ òèîëû NAC è GSH
ìîãóò òàêæå âûñòóïàòü â êà÷åñòâå ïðîîêñèäàíòîâ, ïðîäó-
Ðèñ. 5. Àíòèîêñèäàíòíîå äåéñòâèå òèîëîâ ïî îòíîøåíèþ ê ýêçîãåííîé H2O2 (à) è ïðîîêñèäàíòíîå äåéñòâèå òèîëîâ â ñî÷åòàíèè ñ 25 ìêÌ B12b â êóëüòóðå êëåòîê (á).
à: êðèâàÿ 1 — ïîñëå ââåäåíèÿ 100 ìêÌ H2O2 â êóëüòóðó êëåòîê; êðèâûå 2,
3 — ïîñëå ââåäåíèÿ 100 ìêÌ H2O2 â ïðèñóòñòâèè 5 ìÌ NAC èëè 5 ìÌ
GSH ñîîòâåòñòâåííî. á: êðèâûå 1, 2 — êèíåòèêà íàêîïëåíèÿ H2O2 â ðîñòîâîé ñðåäå ïîñëå äîáàâêè B12b ñîâìåñòíî ñ 5 ìÌ NAC èëè ñ 5 ìÌ GSH â
êóëüòóðó êëåòîê ñîîòâåòñòâåííî; êðèâûå 3, 4 — â ïðèñóòñòâèè 5 ìÌ NAC
èëè GSH ñîîòâåòñòâåííî. Òèîëû âíîñèëè ÷åðåç 1 ñóò ïîñëå ïîñåâà
3.5$105 êëåòîê â êóëüòóðàëüíûé ôëàêîí Ò25 íåïîñðåäñòâåííî ïåðåä äîáàâëåíèåì H2O2 èëè B12b. Ïðåäñòàâëåíû äàííûå 3 ýêñïåðèìåíòîâ.
òî÷íîé îêèñëèòåëüíîé àêòèâíîñòè (ðèñ. 7) áûëî îáóñëîâëåíî ýêçîãåííîé H2O2 (ðèñ. 5). Ñîâìåñòíîå 2-÷àñîâîå äåéñòâèå B12b è òèîëà ïðèâîäèò ê çíà÷èòåëüíîìó ïîâûøåíèþ ïðîäóêöèè ÀÔÊ ýíäîãåííîãî ïðîèñõîæäåíèÿ
(ðèñ. 8), êîòîðîå ñâèäåòåëüñòâóåò î íàðóøåíèè ðåäîêñ-áàëàíñà êëåòêè. ×åðåç 3—4 ÷ íàáëþäàëè ïîÿâëåíèå
êëåòîê ñ èíòåíñèâíîñòüþ ôëóîðåñöåíöèè, ïðåâûøàþùåé êîíòðîëüíóþ â 7—10 ðàç (ðèñ. 8). Êàòàëàçà ïðåäîòâðàùàëà âíóòðèêëåòî÷íûé îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ, âûçâàííûé ñî÷åòàííûì äåéñòâèåì B12b è òèîëà (äàííûå íå
ïîêàçàíû).  êà÷åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ íà
ðèñ. 8 ïîêàçàíî óâåëè÷åíèå ôëóîðåñöåíöèè êëåòîê, èíêóáèðîâàííûõ ñ 2 ìÌ H2O2 â òå÷åíèå 0.5 ÷, äî 20 ðàç ïî
ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëåì. Òàêèì îáðàçîì, ïîâûøåíèå
âíóòðèêëåòî÷íîé îêèñëèòåëüíîé àêòèâíîñòè âî âðåìÿ
èíèöèàöèè ãèáåëè êëåòîê ïðè ñîâìåñòíîì äåéñòâèè B12b
Ðèñ. 6. Âëèÿíèå íåòèîëîâûõ àíòèîêñèäàíòîâ è õåëàòîðîâ æåëåçà íà öèòîòîêñè÷åñêèé ýôôåêò (à) è íàêîïëåíèå ïåðåêèñè
âîäîðîäà â ñðåäå (á) ïðè ñîâìåñòíîì äåéñòâèè 5 ìÌ NAC èëè
5 ìÌ GSH ñ âèòàìèíîì B12b (25 ìêÌ).
à — àíòèîêñèäàíòû è õåëàòîðû æåëåçà äîáàâëÿëè, êàê îïèñàíî â ðàçäåëå
«Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà»; ñî÷åòàííîå äåéñòâèå B12b è òèîëà ïðåðûâàëè
÷åðåç 2 ÷ ïóòåì çàìåíû èíêóáàöèîííîé ñðåäû ñâåæåé ðîñòîâîé ñðåäîé;
êîëè÷åñòâî êëåòîê ÷åðåç 48 ÷ îïðåäåëÿëè ïî îêðàñêå êðèñòàëëè÷åñêèì
ôèîëåòîâûì. á — êîíöåíòðàöèþ H2O2 â ñðåäå îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ
O2-ýëåêòðîäà ÷åðåç 1 ÷ ïîñëå âíåñåíèÿ â ñðåäó B12b ñîâìåñòíî ñ NAC èëè
GSH. Ïðåäñòàâëåíû äàííûå 5 ýêñïåðèìåíòîâ.
Ïðîîêñèäàíòíîå è öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå N-àöåòèëöèñòåèíà è ãëóòàòèîíà
öèðîâàòü OH1-ðàäèêàë è îêàçûâàòü ïîâðåæäàþùåå äåéñòâèå íà êëåòêè ïðè ïåðåõîäå â òèèëüíûå ðàäèêàëû (Sagrista et al., 2002; Borisenko et al., 2004).  íåêîòîðûõ ñëó÷àÿõ öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå NAC, ïðèìåíÿåìîãî â
êà÷åñòâå ïðåäøåñòâåííèêà âíóòðèêëåòî÷íîãî ãëóòàòèîíà, çàìåòíî ïðåâûøàëî ýôôåêò, äîñòèãàåìûé ïðè èíêóáàöèè ñ ýêçîãåííûì GSH (Held, Biaglow, 1994; Thibodeau
et al., 2001). Ýòî îáúÿñíÿþò ìåíüøåé ñïîñîáíîñòüþ
GS1-ðàäèêàëà ê îáðàçîâàíèþ ñóïåðîêñèäà ïî ñðàâíåíèþ ñ
N-àöåòèèëüíûì ðàäèêàëîì è áûñòðûì îáðàçîâàíèåì
GSSG (îêèñëåííîãî ãëóòàòèîíà) ïðè ðåàêöèè äâóõ ãëóòàòèîíèëüíûõ ðàäèêàëîâ. Ãëóòàòèîí ñïîñîáåí ñâÿçûâàòü
èîíû Cu+, áëîêèðóÿ èõ ðåàêöèþ ñ H2O2, ïðèâîäÿùóþ ê
îáðàçîâàíèþ ãèäðîêñèë-ðàäèêàëà. NAC â îòëè÷èå îò
GSH, âîññòàíàâëèâàÿ èîíû Cu2+ â Cu+, îáðàçóåò òèèëüíûé ðàäèêàë, êîòîðûé ðåàãèðóåò ñ êèñëîðîäîì âîçäóõà,
îáðàçóÿ ñóïåðîêñèä-àíèîí (Thibodeau et al., 2001).  íåêîòîðûõ ñëó÷àÿõ íàáëþäàëàñü òîêñè÷íîñòü ãëóòàòèîíà
ïðè åãî âíåñåíèè â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó. Àâòîðû îáúÿñíÿþò ýòîò ýôôåêò òåì, ÷òî ãëóòàòèîí ìîæåò âîññòàíàâëèâàòü èîíû æåëåçà, íåîáõîäèìûå äëÿ îáðàçîâàíèÿ OH1-ðàäèêàëà, èç ïåðåêèñè âîäîðîäà (Brazzolotto et al., 1999).
Êðîìå òîãî, Fe2+ â ðåàêöèè ñ êèñëîðîäîì ìîæåò îáðàçîâàòü ïåðôåððèëüíûå èîíû, îáëàäàþùèå áîëåå âûðàæåííûì ïîâðåæäàþùèì äåéñòâèåì (Farombi et al., 2004). Íåêîòîðûå àâòîðû ñ÷èòàþò, ÷òî ãëóòàòèîíèëüíûå èëè ðàäèêàëû, îáðàçóþùèåñÿ èç íèõ äàëåå ïî êàñêàäó ðåàêöèé,
ìîãóò ïðèñóòñòâîâàòü â êëåòêàõ â çíà÷èòåëüíûõ êîëè÷åñòâàõ (Kwak et al., 1995). Òàêèì îáðàçîì, èñïîëüçîâàíèå
òèîëîâ â êà÷åñòâå àíòèîêñèäàíòîâ ìîæåò ïðèâåñòè ê íåîæèäàííûì ïîâðåæäàþùèì ýôôåêòàì.  íàñòîÿùåå âðåìÿ ëåêàðñòâåííûå ïðåïàðàòû àíòèîêñèäàíòíîãî äåéñòâèÿ íà îñíîâå ãëóòàòèîíà è àöåòèëöèñòåèíà øèðîêî ïðèìåíÿþòñÿ, ðàçðàáàòûâàþòñÿ èõ íîâûå ìîäèôèêàöèè
(Øàíèí è äð., 2003). Àíòèîêñèäàíòíàÿ òåðàïèÿ ÷àñòî äîïîëíÿåòñÿ ââåäåíèåì âèòàìèííûõ ñìåñåé, êîìïîíåíòîì
êîòîðûõ ìîæåò ÿâëÿòüñÿ ãèäðîêñèêîáàëàìèí — âèòàìèí
B12b. Â íåêîòîðûõ ñòðàíàõ ââåäåíèå âèòàìèíà B12b ïðîèçâîäÿò èíòðàíàçàëüíî (Dharmarajan, Norkus, 2001). Ýòîò
æå ñïîñîá èñïîëüçóåòñÿ ïðè ëå÷åíèè íàñìîðêà ñ ïîìîùüþ ïðåïàðàòà ÀÖÖ, îñíîâíûì êîìïîíåíòîì êîòîðîãî
ÿâëÿåòñÿ NAC. Ïîýòîìó èçó÷åíèå âçàèìîäåéñòâèÿ òèîëîâ NAC è GSH ñ âèòàìèíîì B12b íåîáõîäèìî ñ öåëüþ
ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè ïðèìåíåíèÿ ýòèõ âåùåñòâ è
ïðåäîòâðàùåíèÿ âîçìîæíûõ íåæåëàòåëüíûõ ïîñëåäñòâèé èõ ñîâìåñòíîãî èñïîëüçîâàíèÿ.
Ïîëó÷åííûå íàìè ðåçóëüòàòû ðàñøèðÿþò è äåòàëèçèðóþò ïðåäñòàâëåíèÿ î ïðîîêñèäàíòíîì äåéñòâèè òèîëîâ â
ñî÷åòàíèè ñ êàòàëèçàòîðàìè íà îñíîâå ìåòàëëîâ ñ ïåðåìåííîé âàëåíòíîñòüþ. Íàìè óñòàíîâëåíà äëèòåëüíàÿ ãåíåðàöèÿ H2O2 ïðè âíåñåíèè òèîëîâ GSH èëè NAC â ôèçèîëîãè÷åñêèõ êîíöåíòðàöèÿõ ñîâìåñòíî ñ B12b, íî íå òèîëàìè â
îòäåëüíîñòè. Óðîâåíü H2O2 â ñðåäå äîñòèãàåò 30—40 ìêÌ.
H2O2 â ýòîé êîíöåíòðàöèè îêàçûâàåò íà êëåòêè HEp-2 íåçíà÷èòåëüíûé öèòîòîêñè÷åñêèé ýôôåêò ïðè âíåñåíèè â
ñðåäó îäíîêðàòíî, íî ïðè âíåñåíèè òèîëà ñîâìåñòíî ñ B12b
ïîääåðæàíèå òàêîé êîíöåíòðàöèè H2O2 ïðîäîëæàåòñÿ â òå÷åíèå êàê ìèíèìóì 1.5—2.0 ÷. Èçâåñòíî, ÷òî âîçäåéñòâèå
íà êëåòêó íåâûñîêèõ, íî äëèòåëüíî ïîääåðæèâàåìûõ êîíöåíòðàöèé H2O2 ïî ñòåïåíè ýôôåêòà ïîäîáíî îäíîêðàòíîé
äîáàâêå H2O2 â âûñîêèõ êîíöåíòðàöèÿõ (Pantopoulos et al.,
1997). Î÷åâèäíî, îáíàðóæåííîå â íàøèõ ýêñïåðèìåíòàõ
äëèòåëüíîå ïîääåðæàíèå êîíöåíòðàöèè H2O2 â êóëüòóðàëüíîé ñðåäå, ñîäåðæàùåé B12b è GSH èëè B12b è NAC, íà
óðîâíå 30 ìêÌ è âûøå ìîæíî ðàññìàòðèâàòü â êà÷åñòâå
75
Ðèñ. 7. Ïîâûøåíèå âíóòðèêëåòî÷íîé îêèñëèòåëüíîé àêòèâíîñòè â êëåòêàõ HEp-2 ïðè 1-÷àñîâîì äåéñòâèè B12b ñîâìåñòíî ñ
NAC (à) èëè GSH (á), âûçûâàåìîå ïîòîêîì H2O2 èç ñðåäû è
ñîáñòâåííîé ãåíåðàöèåé ÀÔÊ êëåòêîé.
1 — êîíòðîëü, 2 — NAC, 3 — B12b ñîâìåñòíî ñ NAC, 4 — GSH, 5 — B12b
ñîâìåñòíî ñ GSH. Êîíöåíòðàöèÿ B12b 25 ìêÌ, NAC è GSH — ïî 5 ìÌ.
Îáùåå ÷èñëî êëåòîê â êàæäîé èç öèòîãðàìì íå ìåíåå 10 òûñ. Ïðèâåäåíû
äàííûå 1 èç 3 ýêñïåðèìåíòîâ, äàâøèõ îäèíàêîâûé ðåçóëüòàò.
ïðè÷èíû âûçûâàåìîãî èìè öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà. Ýòî
ïîäòâåðæäàåòñÿ òåì, ÷òî íåéòðàëèçàöèÿ H2O2 â ñðåäå ïðè
ïîìîùè êàòàëàçû èëè ïèðóâàòà èíãèáèðîâàëà è öèòîòîêñè÷åñêèé ýôôåêò, íàáëþäàåìûé ïðè ñî÷åòàííîì äåéñòâèè
òèîëà è âèòàìèíà B12b. Îòìåòèì, ÷òî NAC è GSH âî âñåõ
èñïîëüçóåìûõ íàìè êîíöåíòðàöèÿõ íå îêàçûâàëè öèòîòîêñè÷åñêîãî äåéñòâèÿ è âûçûâàëè íåçíà÷èòåëüíîå íàêîïëåíèå H2O2 â ñðåäå, ñóùåñòâåííî ìåíüøåå, ÷åì â ðàáîòå Ëîíã
è Õàëëèâåëë (Long, Halliwell, 2001). Òàêîå îòëè÷èå ìîæåò
áûòü îáóñëîâëåíî, ñîãëàñíî íàøèì è ëèòåðàòóðíûì äàííûì (Held et al., 1996), ñîñòàâîì èñïîëüçóåìîé ñûâîðîòêè,
â ÷àñòíîñòè ðàçíûì ñîäåðæàíèåì ìåòàëëîâ ïåðåìåííîé âàëåíòíîñòè, ñ êîòîðûìè òèîëû ìîãóò âñòóïàòü â ðåäîêñ-âçàèìîäåéñòâèÿ.
Ñîãëàñíî íàøèì ðåçóëüòàòàì, ðàçâèòèå îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà â êëåòêå ïðè ñî÷åòàííîì äåéñòâèè òèîëà
B12b âûãëÿäèò ñëåäóþùèì îáðàçîì. Ñíà÷àëà (íà ïðîòÿæåíèè ïðèìåðíî 30 ìèí) îêèñëèòåëüíî-âîññòàíîâèòåëüíàÿ ñèñòåìà êëåòîê ñïðàâëÿåòñÿ ñ ïîòîêîì ýêçîãåííîé
H2O2, äîñòèãàþùèì ìàêñèìóìà óæå â ïåðâûå 10 ìèí.
Îäíàêî çàòåì, ê êîíöó 1-ãî ÷, îáíàðóæèâàåòñÿ âíóòðèêëåòî÷íûé îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ. Ýòî óêàçûâàåò íà ñíèæåíèå ñïîñîáíîñòè ðåäîêñ-ñèñòåìû êëåòîê ñäåðæèâàòü
ïîòîê ýêçîãåííîé H2O2, õîòÿ, ñóäÿ ïî óðîâíþ ýíäîãåííûõ ÀÔÊ, áëèçêîìó ê êîíòðîëþ, îíà åùå íå ïîâðåæäåíà.
Ñíèæåíèå àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè â ýòî âðåìÿ âðÿä
ëè ñâÿçàíî ñ èñòîùåíèåì ãëóòàòèîíà, ïîñêîëüêó èçâåñòíî, ÷òî ïàäåíèå êîíöåíòðàöèè âíóòðèêëåòî÷íîãî ãëóòàòèîíà ïîä äåéñòâèåì ïåðåêèñè âîäîðîäà íà÷èíàåòñÿ
ïîçäíåå (Kwak et al., 1995). Òàê, ïðè ñî÷åòàííîì äåéñò-
76
Ì. Å. Ñîëîâüåâà, Â. Â. Ñîëîâüåâ è äð.
Ðèñ. 8. Èçìåíåíèÿ âíóòðèêëåòî÷íîé îêèñëèòåëüíîé àêòèâíîñòè ýíäîãåííîãî ïðîèñõîæäåíèÿ ïîñëå èíêóáàöèè êëåòîê HEp-2 c B12b
è òèîëîì.
Ïî ãîðèçîíòàëè — ôëóîðåñöåíöèÿ, îòí. åä.; ïî âåðòèêàëè — êîëè÷åñòâî êëåòîê. Îáùåå ÷èñëî êëåòîê â êàæäîé èç öèòîãðàìì íå ìåíåå 10 òûñ. Îêèñëèòåëüíóþ àêòèâíîñòü îöåíèâàëè ïî ôëóîðåñöåíöèè êëåòîê, îêðàøåííûõ DCHFDA. Ïðèâåäåíû äàííûå 1 èç 3 ýêñïåðèìåíòîâ, äàâøèõ îäèíàêîâûé
ðåçóëüòàò.
âèè âèòàìèíîâ B12b è C ñíèæåíèå GSH â êëåòêàõ HEp-2
íà÷èíàëîñü ÷åðåç 3 ÷ ïîñëå èõ âíåñåíèÿ â ñðåäó, ïðè
ýòîì ðàçâèòèå îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà, èíèöèàöèÿ è êèíåòèêà êëåòî÷íîé ãèáåëè áûëè áëèçêèìè ê òåì, êîòîðûå
îïèñàíû â íàñòîÿùåé ñòàòüå (Akatov et al., 2000). Íàðóøåíèå ðåäîêñ-áàëàíñà êëåòêè íàáëþäàåòñÿ ê êîíöó
2-ãî ÷ äåéñòâèÿ, ÷òî âûðàæàåòñÿ â ïîâûøåíèè óðîâíÿ
ÀÔÊ ýíäîãåííîãî ïðîèñõîæäåíèÿ. Óñòðàíåíèå êàòàëàçîé ýòîãî ýôôåêòà íàðÿäó ñ êëåòî÷íîé ãèáåëüþ äîêàçûâàåò, ÷òî âíóòðèêëåòî÷íûé îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ ÿâëÿåòñÿ êëþ÷åâîé ñîñòàâëÿþùåé öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà
ïðè èíêóáàöèè êëåòîê ñ òèîëîì è B12b.
Îïûòû ñ õåëàòîðàìè ìåòàëëîâ ïîêàçûâàþò, ÷òî îäíîãî îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà äëÿ èíèöèàöèè àïîïòîçà
ïðè ñî÷åòàííîì ïðèìåíåíèè òèîëà ñ âèòàìèíîì B12b íåäîñòàòî÷íî. Èçâåñòíî, ÷òî H2O2 â êëåòêå ìîæåò ðåàãèðîâàòü ñ ìåòàëëàìè ïåðåìåííîé âàëåíòíîñòè (Fe2+ è Cu+),
ïðè ýòîì «ïî ìåñòó» èõ ëîêàëèçàöèè ãåíåðèðóåòñÿ ãèäðîêñèë-ðàäèêàë, ïîâðåæäàþùèé áèîìîëåêóëû (Halliwell, Gutteridge, 1986; Held, Biaglow, 1994; Yang et al.,
2000; Barbouti et al., 2001; Thibodeau et al., 2001; Kohen,
Nyska, 2002). Îäíàêî ëèøü äåôåðîêñàìèí è ôåíàíòðîëèí, ñâÿçûâàþùèå èîíû æåëåçà íà íåñêîëüêî ïîðÿäêîâ
ýôôåêòèâíåå, ÷åì èîíû ìåäè, óñòðàíÿëè ãåíî- è öèòîòîê-
Ïðîîêñèäàíòíîå è öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå N-àöåòèëöèñòåèíà è ãëóòàòèîíà
ñè÷åñêèé ýôôåêò, îáóñëîâëåííûé ñî÷åòàííûì äåéñòâèåì òèîëà è B12b, íå âëèÿÿ íà íàêîïëåíèå â ñðåäå H2O2. Õåëàòîð èîíîâ ìåäè íåîêóïðîèí çàùèòíîãî äåéñòâèÿ íå
îêàçûâàë. Íåîáõîäèìîñòü äëÿ óñòðàíåíèÿ öèòîòîêñè÷åñêîãî ýôôåêòà ïðåäâàðèòåëüíîé èíêóáàöèè ñ DFO, êîòîðûé ïîñòóïàåò â êëåòêó ïóòåì ýíäîöèòîçà (Kotamraju et
al., 2002), åùå ðàç ïîä÷åðêèâàåò ðîëü èìåííî âíóòðèêëåòî÷íîãî æåëåçà. Îòñóòñòâèå äîñòîâåðíîé ðàçíèöû ìåæäó
ýôôåêòàìè ôåíàíòðîëèíà, ââåäåííîãî çà 1 ÷ èëè îäíîâðåìåííî ñ B12b è òèîëîì, âîçìîæíî, îáúÿñíÿåòñÿ åãî áîëåå áûñòðûì ïðîíèêíîâåíèåì â êëåòêó, à òàêæå áîëüøåé
ýôôåêòèâíîñòüþ â ñâÿçûâàíèè Fe2+, íåïîñðåäñòâåííî
ðåàãèðóþùåãî ñ H2O2 (Byrnes, 1996).  öåëîì ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû óêàçûâàþò íà íåîáõîäèìîñòü ó÷àñòèÿ
âíóòðèêëåòî÷íîãî æåëåçà â èíèöèàöèè ãèáåëè êëåòîê ñî÷åòàííûì äåéñòâèåì òèîëà è B12b.
Òàêèì îáðàçîì, â íàøåé ðàáîòå ïîêàçàíî, ÷òî òèîëû-àíòèîêñèäàíòû (NAC èëè GSH) ïðè ñî÷åòàííîì ïðèìåíåíèè ñ âèòàìèíîì B12b ïðîÿâëÿþò ïðîîêñèäàíòíûå
ñâîéñòâà. Ýêçîãåííûé îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ, îáóñëîâëåííûé ðåàêöèåé òèîëà ñ B12b, âûçûâàåò âíóòðèêëåòî÷íûé îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ, íàðóøåíèå ðåäîêñ-áàëàíñà è
èíèöèàöèþ àïîïòîòè÷åñêîé ãèáåëè êëåòîê ïðè îáÿçàòåëüíîì ó÷àñòèè âíóòðèêëåòî÷íîãî æåëåçà. Ïîëó÷åííûå
ðåçóëüòàòû óêàçûâàþò íà âàæíîñòü ïðàâèëüíîãî ïîäáîðà
àíòèîêñèäàíòîâ è ïðåäñòàâëÿþò èíòåðåñ äëÿ êëåòî÷íîé
áèîëîãèè, îíêîëîãèè è ôàðìàêîëîãèè.
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Àêàòîâ Â. Ñ., Åâòîäèåíêî Þ. Â., Ìåäâåäåâ À. È., Ëåùåíêî Â. Â., Ñîëîâüåâà Ì. Å., Êóäðÿâöåâ À. À., Ëåæíåâ Ý. È., ßêóáîâñêàÿ Ð. È. 2000. Ïîâðåæäåíèå ÄÍÊ è ãèáåëü îïóõîëåâûõ
êëåòîê â ðåçóëüòàòå ñîâìåñòíîãî äåéñòâèÿ âèòàìèíîâ B12b è C.
Äîêë. ÐÀÍ. 373 (6) : 838—840.
Áîáûðåâ Â. Í., Ïî÷åðíÿåâà Â. Ô., Ñòàðîäóáöåâ Ñ. Ã., Áîáûðåâà Ë. Å., Äóáèíñêàÿ Ã. Ì., Âîñêðåñåíñêàÿ Î. Í. 1994. Ñïåöèôè÷íîñòü ñèñòåì àíòèîêñèäàíòíîé çàùèòû îðãàíîâ è òêàíåé — îñíîâà äèôôåðåíöèðîâàííîé ôàðìàêîòåðàïèè àíòèîêñèäàíòàìè. Ýêñïåðèì. êëèí. ôàðìàêîë. 57 (1) : 47—54.
Âîëüïèí Ì. Å., Êðàéíîâà Í. Þ., Ëåâèòèí È. ß., Ìèòÿåâà Ç. ß., Íîâîäàðîâà Ã. Í., Îãàíåçîâ Â. Ê., Ïàíêðàòîâ À. À., ×èññîâ Â. È., ßêóáîâñêàÿ Ð. È. 1998. Ñîåäèíåíèÿ ðÿäà B12b â ñî÷åòàíèè ñ àñêîðáèíîâîé êèñëîòîé êàê ïîòåíöèàëüíûå ïðîòèâîîïóõîëåâûå àãåíòû. Ðîñ. õèì. æóðí. 42 (5) : 116—127.
Çåíêîâ Í. Ê., Ëàíêèí Â. Ç., Ìåíüùèêîâà Å. Á. 2001. Îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ. Ì.: Íàóêà. 342 ñ.
Ðóìÿíöåâà Ã. Â., Âàéíåð Ë. Ì., Òóâèí Ì. Þ., Íîâîäàðîâà Ã. Í., Âîëüïèí Ì. Å. 1989. Ãåíåðàöèÿ OH-ðàäèêàëîâ
ïðè îêèñëèòåëüíî-âîññòàíîâèòåëüíûõ ðåàêöèÿõ êîððèíîâûõ
êîìïëåêñîâ êîáàëüòà. Èçâ. ÀÍ ÑÑÑÐ. Ñåð. õèì. 12 : 2679—
2683.
Ñîëîâüåâà Ì. Å., Ñîëîâüåâ Â. Â., Ôàñõóòäèíîâà À. À., Êóäðÿâöåâ À. À., Àêàòîâ Â. Ñ., ÷ë.-êîð. ÐÀÍ ×àéëàõÿí Ë. Ì. 2005.
Ïðîîêñèäàíòíîå è öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå òèîëîâ â ñî÷åòàíèè ñ âèòàìèíîì B12b. Äîêë. ÐÀÍ. 404 (5) : 704—706.
Øàíèí Þ. Í., Øàíèí Â. Þ., Çèíîâüåâ Å. Â. 2003. Àíòèîêñèäàíòíàÿ òåðàïèÿ â êëèíè÷åñêîé ïðàêòèêå. ÑÏá.: ÝËÁÈ-ÑÏá.
128 ñ.
Akatov V. S., Evtodienko Y. V., Leshchenko V. V., Teplova V. V., Potselueva M. M., Kruglov A. G., Lezhnev E. I., Yakubovskaya R. I. 2000. Combined viramins B12b and C induce the glutathione depletion and the death of epidermoid human larynx carcinoma cells HEp-2. Biosci. Rep. 20 : 411—417.
Barbouti A., Doulias P., Zhu B., Frei B., Galaris D. 2001. Intracellular iron, but not copper, plays a critical role in hydrogene peroxide-induced DNA damage. Free Radic. Biol. Med. 31 : 490—
498.
77
Borisenko G. G., Martin I., Zhao Q., Amoscato A. A., Tyurina Y. Y., Kagan V. E. 2004. Glutathione propagates oxidative stress
triggered by myeloperoxidase in HL-60 cells. Evidence for glutathionyl radical-induced peroxidation of phospholipids and cytotoxicity. J. Biol. Chem. 279 : 23 453—23 462.
Brazzolotto X., Gaillard J., Pantopoulos K., Hentze M., Moulis J.-M. 1999. Human cytoplasmic aconitase (Iron regulatory protein 1) is converted into its [3Fe-4S] form by hydrogen peroxide in
vitro but is not activated for iron-responsive element binding.
J. Biol. Chem. 274 : 21 625—21 630.
Buettner G. R., Jurkiewicz B. A. 1996. Catalytic metals, ascorbate and free radicals: combinations to avoid. Radiat. Res. 145 :
532—541.
Byrnes R. W. 1996. Evidence for involvement of multiple iron
species in DNA single-strand scission by H2O2 in HL-60 cells. Free
Radic. Biol. Med. 20 : 399—406.
Chan E. D., Riches D. W., White C. W. 2001. Redox paradox:
effect of N-acetylcysteine and serum on oxidation reduction-sensitive mitogen-activated protein kinase signaling pathways. Amer.
J. Respir. Cell. Mol. Biol. 24 : 627—632.
Cohen J. J. 1993. Apoptosis. Immunol. Today. 14 : 126—130.
Dharmarajan T. S., Norkus E. P. 2001. Approaches to vitamin
B12b deficiency. Early treatment may prevent devastating complications. Postgraduate Med. 110 : 99—105.
Farombi E. O., Moller P., Dragsted L. O. 2004. Ex-vivo and
in vitro protective effects of kolaviron against oxygen-derived radical-induced DNA damage and oxidative stress in human lymphocytes and rat liver cells. Cell Biol. Toxicol. 20 : 71—82.
Halliwell B., Gutteridge J. M. C. 1986. Oxygen free radicals
and an iron in relation to biology and medicine: some problems and
concepts. Arch. Biochem. Biophys. 246 : 501—514.
Held K. D., Biaglow J. E. 1994. Mechanisms for the oxygen
radical-mediated toxicity of various thiol-containing compounds in
cultured mammalian cells. Radiat. Res. 139 : 15—23.
Held K. D., Sylvester F. C., Hopcia K. L., Biaglow J. E. 1996.
Role of Fenton chemistry in thiol-induced toxicity and apoptosis.
Radiat. Res. 145 : 542—553.
Jeitner T. M., Delikatny E. J., Bartier W. A., Capper H. R.,
Hunt N. H. 1998. Inhibition of drug-naive and -resistant leukemia
cell proliferation by low molecular weight thiols. Biochem. Pharmacol. 55 : 793—802.
Kimoto E., Tanaka H., Gyotoku J., Morishige F., Pauling L.
1983. Enhancement of antitumor activity of ascorbate against Ehrlich ascites tumor cells by the copper: glycylglycylhistidine complex. Cancer Res. 43 : 824—828.
Kohen R., Nyska A. 2002. Oxidation in biological systems: oxidative stress phenomena, antioxidants, redox reactions, and methods for their quantification. Toxicol. Pathol. 30 : 620—650.
Kotamraju S., Chitambar C. R., Kalivendi S. V., Joseph J., Kalyanaraman B. 2002. Transferrin receptor-dependent iron uptake is
responsible for doxorubicin-mediated apoptosis in endothelial cells.
J. Biol. Chem. 277 : 17 179—17 187.
Kwak H. S., Yim H. S., Chock P. B., Yim M. B. 1995. Endogenous intracellular glutathionyl radicals are generated in neuroblastoma cells under hydrogen peroxide oxidative stress. Proc. Nat.
Acad. Sci. USA. 92 : 4582—4586.
Long L. H., Halliwell B. 2001. Oxidation and generation of hydrogen peroxide by thiol compounds in commonly used cell culture
media. Biochem. Biophys. Res. Commun. 286 : 991—994.
Munday R. 1989. Toxicity of thiols and disulphides: involvement of free-radical species. Free Radic. Biol. Med. 7 : 659—673.
Nomizu M., Kim W. H., Yamamura K., Utani A., Song S., Otaka A., Roller P. P., Kleinman H. K., Yamada Y. 1995. Identification
of cell binding sites in the laminin a1 chain carboxyl-terminal globular domain by systematic screening of synthetic peptides. J. Biol.
Chem. 270 : 20 583—20 590.
Pantopoulos K., Mueller S., Atzberger A., Ansorge W., Stremmel W., Hentze M. W. 1997. Differences in regulation of iron regulatory protein-1 (IRP-1) by extra- and intracellular oxidative stress.
J. Biol. Chem. 272 : 9802—9808.
Qanungo S., Wang M., Nieminen A.-L. 2004. N-acetyl-L-cysteine enhances apoptosis through inhibition of nuclear factor-êB in
78
Ì. Å. Ñîëîâüåâà, Â. Â. Ñîëîâüåâ è äð.
hypoxic murine embryonic fibroblasts. J. Biol. Chem. 279 :
50 455—50 464.
Ren J.-G., Xia H.-L., Just T., Dai Y.-R. 2001. Hydroxyl radical-induced apoptosis in human tumor cells is associated with telomere shortering but not telomerase inhibition and caspase activation. FEBS Lett. 488 : 123—132.
Sagrista M. L., Garcia A. E., Africa De Madariaga M., Mora M. 2002. Antioxidant and pro-oxidant effect of the thiolic compounds N-acetyl-L-cysteine and glutathione against free radical-induced lipid peroxidation. Free Radic. Res. 36 : 329—340.
Spear N., Aust S. D. 1998. The effects of different buffers on
the oxidation of DNA by thiols and ferric iron. J. Biochem. Mol.
Toxicol. 12 : 125—132.
Taatjes D. J., Gaudiano G., Koch T. H. 1997. Production of
formaldehyde and DNA-adriamycin of DNA-daunomycin adducts,
initiated through redox chemistry of dithiothreitol/iron, xanthine
oxidase/NADH/iron, or glutathione/iron. Chem. Res. Toxicol. 10 :
953—961.
Tartier L., McCarey Y. L., Biaglow J. E., Kochevar I. E.,
Held K. D. 2000. Apoptosis induced by dithiothreitol in HL-60
cells shows early activation of caspase 3 and is independent of mitochondria. Cell Death Differ. 7 : 1002—1010.
Thibodeau P. A., Kocsis-Bedard S., Courteau J., Niyonsenga T., Paquette B. 2001. Thiols can either enhance or suppress
DNA damage induction by catecholestrogens. Free Radic. Biol.
Med. 30 : 62—73.
Yang E. Y., Campbell A., Bondy S. C. 2000. Configuration of
thiols dictates their ability to promote iron-induced reactive oxygen
species generation. Redox. Rep. 5 : 371—375.
Ïîñòóïèëà 22 III 2006
PROOXIDANT AND CYTOTOXIC ACTION OF N-ACETYLCYSTEINE
AND GLUTATHIONE COMBINED WITH VITAMIN B12b
M. E. Solovieva, V. V. Soloviev, A. A. Faskhutdinova, A. A. Kudryavtsev, V. S. Akatov
Institute of Theoretical and Experimental Biophysics RAS, Pushchino, Moscow region;
e-mail: [email protected]
We studied the prooxidant and cytotoxic action of thiols N-acetylcystein (NAC) and glutathione (GSH)
combined with vitamin B12b. The synergism of action of the thiols and B12b resulted in human carcinoma cell
damage was found. It was shown that GSH and NAC in physiological doses combined with B12b caused the initiation of apoptosis. It was established that prooxidant action of the thiols combined with vitamin B12b, i. e. generation and accumulation of hydrogen peroxide in culture medium, led to intracellular oxidative stress and injury of cell redox system. These effects were completely abolished by nonthiol antioxidants catalase and pyruvate. The chelators of iron phenanthroline and deferoxamine did not suppress the H2O2 accumulation in culture
medium but significantly inhibited the cell death induced by the thiols combined with B12b. Therefore, the thiols
GSH and NAC widely used as antioxidants, in combination with vitamin B12b show prooxidant characteristics
and induce, with the participation of intracellular iron, apoptotic HEp-2 cell death.
K e y w o r d s: thiols, antioxidants, vitamin B12b, oxidative stress, apoptosis, tumor cells.
Скачать