Диссертация ()
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИМ. Н. Н. БЛОХИНА» РАМН АЛТАЙСКИЙ ФИЛИАЛ На правах рукописи КОБЯКОВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО. ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗ 14.03.02 – патологическая анатомия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор А.Ф. Лазарев доктор медицинских наук А.М. Авдалян Новосибирск - 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................ 5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................... 20 1.1. Немелкоклеточный рак легкого: клинико-морфологические параметры и прогноз ..................................................................................... 20 1.2. Взаимосвязь молекулярно-биологических характеристик с клинико-морфологическими параметрами и прогнозом жизни больных НМКРЛ ............................................................................... 30 1.2.1. Ag-ЯОР-белки ............................................................................................ 30 1.2.2. Маркеры пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα) ... 36 1.2.3. Маркеры апоптоза (p53, bcl-2 и bax) ....................................................... 42 1.2.4. ПМЦР-Г и ПМЦР-Л .................................................................................. 49 1.2.5. Статус белка и гена Her2 .......................................................................... 55 1.3. Резюме ........................................................................................................... 60 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .............................. 61 2.1. Материал исследования ............................................................................... 61 2.2. Методы исследования .................................................................................. 64 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 3. Ag-ЯОР-БЕЛКИ ................................................................................. 78 3.1. ИП Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параллели .................. 79 3.2. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры ................. 88 3.3. КВ Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параллели ................. 91 3.4. КВ Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры ................. 98 ГЛАВА 4. Ag-ЯОР-БЕЛКИ В MIB-1 ПОЗИТИВНЫХ КЛЕТКАХ ............. 102 4.1. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках и клиникоморфологические параллели ...................................................................... 102 4.2. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках и молекулярнобиологические маркеры .............................................................................. 111 3 4.3. Показатель пролиферации и клинико-морфологические параллели ... 114 4.4. Показатель пролиферации и молекулярно-биологические маркеры ... 118 ГЛАВА 5. МАРКЕРЫ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ................ 122 5.1. Ki-67 и клинико-морфологические параллели ........................................ 123 5.2. Ki-67 и молекулярно-биологические маркеры ....................................... 130 5.3. Топоизомераза IIα и клинико-морфологические параллели ................. 133 5.4. Топоизомераза IIα и молекулярно-биологические маркеры ................. 139 ГЛАВА 6. МАРКЕРЫ АПОПТОЗА ................................................................ 143 6.1. p53, bcl-2, bax и клинико-морфологические параллели ......................... 143 6.2. p53, bcl-2, bax и молекулярно-биологические маркеры ......................... 151 ГЛАВА 7. ПМЦР-Г и ПМЦР-Л ....................................................................... 158 7.1. ПМЦР-Г и клинико-морфологические параллели .................................. 159 7.2. ПМЦР-Г и молекулярно-биологические маркеры .................................. 164 7.3. ПМЦР-Л и клинико-морфологические параллели ................................. 165 7.4. ПМЦР-Л и молекулярно-биологические маркеры ................................. 169 ГЛАВА 8. СТАТУС БЕЛКА И ГЕНА HER2 .................................................. 171 8.1. Статус белка Her2 и клинико-морфологические параллели ................. 171 8.2. Статус белка Her2 и молекулярно-биологические маркеры ................. 175 8.3. Статус гена Her2 и клинико-морфологические параллели .................... 177 8.4. Статус гена Her2 и молекулярно-биологические маркеры .................... 179 ГЛАВА 9. АНАЛИЗ ВЫЖИВАЕМОСТИ ...................................................... 182 9.1. Клинические критерии .............................................................................. 182 9.2. Клинико-морфологические параметры .................................................... 184 9.3. Молекулярно-биологические маркеры .................................................... 186 9.3.1. Ag-ЯОР-белки .......................................................................................... 186 9.3.2. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках ....................................... 188 9.3.3. Маркеры пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα) . 191 9.3.4. Маркеры апоптоза (p53, bcl-2 и bax) ..................................................... 193 9.3.5. ПМЦР-Г и ПМЦР-Л ................................................................................ 196 9.3.6. Статус белка и гена Her2 ........................................................................ 198 4 9.4. Коэкспрессия молекулярно-биологических маркеров ........................... 202 9.4.1. Коэкспрессия Ag-ЯОР-белков, маркеров пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα) и Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках ................................................................... 202 9.4.2. Коэкспрессии маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) ............................ 213 9.4.3. Коэкспрессия и маркеры ангиогенеза ПМЦР-Г и ПМЦР-Л ............... 215 ГЛАВА 10. МНОГОФАКТОРНЫЙ АНАЛИЗ ............................................... 217 10.1. Корреляционный анализ .......................................................................... 217 10.2. Регрессионный анализ ............................................................................. 224 10.2.1. Однофакторный регрессионный анализ ............................................. 224 10.2.2. Многофакторный регрессионный анализ ........................................... 228 10.3. Модели прогноза ...................................................................................... 236 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................. 244 ВЫВОДЫ ........................................................................................................... 272 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ........................................................... 275 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................... 277 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................. 278 5 ВВЕДЕНИЕ Рак легкого – серьезная медицинская и социальная проблема, в развитых странах он является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью и наиболее распространенной причиной смерти от онкологической патологии. По данным мировой статистики, ежегодно выявляются более 1 млн. 600 тыс. больных этой нозологией и около 1 млн. 400 тыс. человек умирают [Jemal A. et al., 2011]. Пятилетняя выживаемость составляет 16%, и варьируется от 73% при 1А стадии до 2% при 4 стадии [Goldstraw P. et al., 2007]. В России и странах СНГ рак легкого так же занимает 1 место среди онкологических заболеваний, показывая тенденции аналогичные мировой статистике [Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2012; Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В., 2012; Siegel R, Naishadham D, Jemal A., 2012; Woolhouse I., 2011]. Не менее 80% рака легкого приходится на НМКРЛ. Несмотря на определенные успехи в диагностике и лечении результаты, в целом, остаются малоутешительными. Общепризнанно, что основными факторами прогноза, влияющими на продолжительность жизни оперированных больных НМКРЛ, являются клинико-морфологические параметры опухоли. Международная классификация по системе TNM не лишена недостатков в плане прогнозирования течения заболевания, так как в один и тот же показатель включаются больные НМКРЛ неоднородные по другим факторам, имеющим прогностическое значение. Поэтому в практической онкологии после хирургического лечения больных НМКРЛ, однородных по системе TNM, наблюдается выздоровление у одних, а у других наступает прогрессирование и рецидивирование. Поэтому актуальным является исследование фундаментальных молекулярно-биологических параметров, определяющих как прогноз, так и показания для последующей полихимиотерапии и направленной таргетной терапии НМКРЛ [Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н., 2004; Захарычев В.Д., 2010]. На сегодняшний день существуют определенные трудности в достоверной оценке пролиферативного потенциала, так как пролиферация включает в себя не только количество пролиферирующих клеток (пролиферативная активность, фракция роста), но и скорость прохождения (продолжитель- 6 ность) клеточного цикла. Для оценки пролиферативной активности общепризнанным и доступным является иммуногистохимическое определение уровня антигена Ki-67. Антиген Ki-67 выявляется в клетках в позднюю G1, S, G2, М фазы, однако, функциональное значение этого ядерного белка в процессе пролиферации не совсем ясно. Фермент топоизомераза IIα (ТороIIα) – белок с ферментативной активностью, участвующий в топологической сборке ДНК во время транскрипции, конденсации и сегрегации хромосом. Выявляется в клетках в S, G2, M фазы клеточного цикла, в связи с чем, является также маркером пролиферативной активности. Кроме того, в схемы химиотерапии НМКРЛ включены препараты антрациклинового ряда, ингибирующие фермент топоизомеразу IIα, степенью активности которого и обусловлена чувствительность опухоли к данным препаратам. Ag-ЯОР-белки являются маркером скорости клеточного цикла. До 75% окрашивания Ag-ЯОР-белков составляют два главных аргирофильных белка С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин), играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК [Hernandez-Verdun D. et al., 2010]. Количественное содержание Ag-ЯОР-белков имеет обратную зависимость с длительностью клеточного цикла и временем удвоения опухоли [Canet V. еt al., 2001, Trere D. еt al., 1997, Trerè D., 1998]. Основополагающими догмами биологии опухоли является изменение как процесса пролиферации, так и программируемой гибели клетки - апоптоза. Р53 является транскрипционным фактором, регулирующим функцию большинства генов; bcl-2 является антиапоптотическим, а bax - проапоптотическим белком митохондриального пути апоптоза. Ангиогенез имеет фундаментальное значение для роста и распространения новообразований различных локализаций. В настоящее время, в эпоху развития таргетной терапии, одной из мишеней для такого типа лечения являются сосуды опухоли – кровеносные и лимфатические [Имянитов Е.Н., 2014]. Иммуногистохимическая визуализация антигенов CD 34 и подопланина позволяет на микроскопическом светооптическом уровне оценивать разные стороны ангиогенеза в НМКРЛ – гемангиогенеза и лимфангиогенеза. Семейство онкогенов Her (erbB) часто гиперэкспрессируются при раке легкого [Pelosi G. et al., 2005]. Онкоген Her2 находится на длинном плече хромосомы 17 (q12-q21), продуктом этого онкогена является мембранный 7 белок Her2. В раковых клетках гиперэкспрессия этого онкогена часто происходит за счет амплификации. Повышение содержания белка Her2 и амплификация гена Her2 частое событие в инвазивном раке молочной железы, связанное с плохим прогнозом, резистентностью к гормонотерапии и ответом опухоли на терапию Her2 моноклональными антителами трастузумаб (герцептин). Повышение содержания белка Her2 и амплификация гена Her2 найдены также и при злокачественных опухолях желудка, толстой кишки, а также легких [Завалишина Л. Э., Андреева Ю. Ю., Франк Г. А., 2012; Reinmuth N. et al., 2000], что открывает возможность таргетной терапии опухолей этих локализаций. Таким образом, на сегодняшний день актуальным является исследование молекулярно-биологических маркеров (Ag-ЯОР-белков, маркеров пролиферативной активности, апоптоза, ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, статуса белка и гена Her2) во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, выживаемостью больных и прогнозом при НМКРЛ. Цель исследования: Изучить патоморфологические и молекулярнобиологические параметры немелкоклеточного рака легкого во взаимосвязи с их прогностической значимостью. Задачи исследования: Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи исследования: 1. Определить дифференциально-диагностическую значимость молекулярно-биологических параметров немелкоклеточного рака легкого в сопоставлении с неизмененным легким. 2. Изучить молекулярно-биологические характеристики во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами немелкоклеточного рака легкого: возрастом, полом, стадией заболевания, показателями Т и N, наибольшим размером опухоли, гистогенезом, дифференцировкой. 3. Определить взаимосвязи между молекулярно-биологическими параметрами немелкоклеточного рака легкого. 4. Изучить общую 5-летнюю выживаемость больных немелкоклеточным раком легкого в зависимости от клинико-морфологических и молекулярно-биологических параметров, а также коэкспрессии молекулярнобиологических маркеров. 8 5. Выявить независимые факторы 5-летней выживаемости больных немелкоклеточным раком легкого. 6. Разработать комбинированную морфобиомолекулярную модель прогноза для больных немелкоклеточным раком легкого на основании многофакторного анализа клинико-морфологических и молекулярно- биологических факторов. Научная новизна. Впервые при НМКРЛ и его гистогенетических вариантах (Ак и Пк) на большом клиническом материале (243 больных), с использованием метода тканевых матриц комплексно изучены молекулярнобиологические маркеры: Ag-ЯОР-белки, экспрессия маркеров пролиферативной активности (Ki-67 и топоизомеразы IIα), Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках, показатель пролиферации, экспрессия маркеров апоптоза (р53, bcl-2 и bax), ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, экспрессия белка Her2 и статус гена Her2 и СЕР17. На операционном материале НМКРЛ применены SISH метод (для выявления амплификация гена Her2 и состояния СЕР17), а также метод двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки (для изучения AgЯОР-белков в пролиферирующих клетках) с последующим компьютерным анализом изображений. Впервые на большом клиническом материале выявлены и систематизированы данные о молекулярно-биологических параметрах при неизмененном легком и НМКРЛ: ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, маркерах пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), Ag-ЯОР-белках в MIB-1 позитивных клетках, показателе пролиферации, маркерах апоптоза (р53, bcl-2 и bax), ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, экспрессии белка Her2 и амплификации гена Her2. Выявлена дифференциально-диагностическая значимость определения данных молекулярно-биологических маркеров в операционном материале для разграничения НМКРЛ и неизмененного легкого. Впервые при НМКРЛ и его гистогенетических вариантах (Ак и Пк) проведено комплексное, систематическое исследование взаимосвязи между клиническими критериями, клинико-морфологическими параметрами по системе TNM и молекулярно-биологическими маркерами, а также исследование корреляционных взаимосвязей между молекулярно-биологическими маркерами: ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, маркерами пролиферативной активно- 9 сти (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателем пролиферации, маркерами апоптоза (р53, bcl-2 и bax), ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, экспрессией белка Her2 и амплификацией гена Her2. Впервые на большом материале при НМКРЛ и его гистогенетических вариантах (Ак и Пк) проанализирована 5-летняя выживаемость в зависимости от молекулярно-биологических маркеров: ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα, площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателя пролиферации, экспрессии р53, bcl-2 и bax, ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, экспрессии белка Her2 и амплификации гена Her2. Также показана взаимосвязь 5-летней выживаемости и коэкспрессии вышеперечисленных молекулярно-биологических маркеров. Проведены детальные одно- и многофакторные анализы прогноза жизни при НМКРЛ и его гистогенетических вариантах (Ак и Пк) с включением следующих групп факторов: клинических (возраст, пол, тип операции, полихимиотерапия, лучевая терапия, полихимио- и лучевая терапия), клиникоморфологических (показатель Т, наибольший размер, показатель N, стадия, гистогенез, дифференцировка) и молекулярно-биологических (ИП и КВ AgЯОР-белков, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα, площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателя пролиферации, экспрессии р53, bcl-2 и bax, ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, экспрессии белка Her2 и амплификации гена Her2. На основании многофакторного регрессионного анализа по Коксу разработаны комбинированные, морфобиомолекулярные модели прогноза при НМКРЛ, Ак и Пк. Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость работы заключается в том, что на большом клиническом материале при неизмененном легком и при НМКРЛ, а также при гистогенетических вариантах - Ак и Пк, комплексно изучен целый спектр молекулярнобиологических маркеров: Ag-ЯОР-белки, экспрессия маркеров пролиферативной активности (Ki-67 и топоизомеразы IIα), Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках, показателя пролиферации, экспрессия маркеров апоптоза (р53, bcl-2 и bax), ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, экспрессия белка Her2 и статус гена Her2 и СЕР17. Выявлены взаимосвязи между вышеперечисленными молеку- 10 лярно-биологическими маркерами, с одной стороны, и между молекулярнобиологическими маркерами и клиническими, клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ, Ак и Пк. Практическая значимость работы представлена, во-первых, определением дифференциально-диагностической значимости исследованных молекулярно-биологических маркеров для разграничения НМКРЛ и неизмененного легкого. Во-вторых, скорректирована оценка выживаемости на основании анализа 5-летней общей выживаемости в зависимости от экспрессии молекулярно-биологических маркеров при НМКРЛ, Ак и Пк. В-третьих, оптимизировано клиническое прогнозирование по разработанным морфобиомолекулярным моделям прогноза на основании многофакторного анализа при НМКРЛ, Ак и Пк. В анализе использована действующая классификация стадий рака легкого по системе TNM 7 пересмотра, что облегчает применение полученных данных на практике. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Дифференциально-диагностическое значение между неизмененным легким и НМКРЛ имеют следующие молекулярно-биологические маркеры: ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показатель пролиферации, экспрессия р53, bcl-2 и bax, ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, экспрессия белка Her2 и амплификация гена Her2. 2. Клинико-морфологические параметры НМКРЛ (пол, стадия заболевания, показатели Т и N, наибольший размер опухоли, гистогенез, дифференцировка) взаимосвязаны с молекулярно-биологическими характеристиками: ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателем пролиферации, экспрессией р53, bcl-2 и bax, ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, экспрессией белка Her2 и амплификацией гена Her2. 3. Разные характеристики пролиферации (ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показатель пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα) являются взаимосвязанными, отражая единый процесс повышения пролиферативного уровня НМКРЛ. Имеются особенности изменения процесса пролиферации НМКРЛ во взаимосвязи с экспресси- 11 ей р53, bcl-2, bax, белка Her2 и амплификацией гена Her2. 4. Низкий показатель общей 5-летней выживаемости больных НМКРЛ взаимосвязан с клинико-морфологическими (тип операции пневмонэктомия, показатель Т2-3, показатель N1-3, стадия заболевания II-III, наибольший размер опухоли ≥ 3см, гистогенез Ак, дифференцировка умеренная-низкая) и молекулярно-биологическими параметрами (большими количественными значениями ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателя пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, ПМЦРГ и ПМЦР-Л, р53 положительной и bcl-2 отрицательной экспрессией, положительной экспрессией белка Her2, амплификацией гена Her2 и увеличением СЕР17). Также выживаемость больных НМКРЛ взаимосвязана с коэкспрессией Ag-ЯОР-белков, Ki-67, ТороIIα, Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках; и в незначительной степени с коэкспрессией маркеров апоптоза (р53, bcl-2 и bax), ПМЦР-Г и ПМЦР-Л. 5. Неблагоприятными факторами прогноза являются: при НМКРЛ – большие количественные значения площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, ПМЦР-Г, КВ Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67, а также показатель N1-3, наибольший размер опухоли ≥ 3 см; при Ак - большие количественные значения показателя пролиферации, ПМЦР-Г, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках; при Пк - большие количественные значения ПМЦР-Г, ИМ ТороIIα, площади Ag-ЯОР-белков в MIB1 позитивных клетках, ПМЦР-Л, КВ Ag-ЯОР-белков, а также тип операции пневмонэктомия. 6. Комбинированная морфобиомолекулярная модель прогноза основана на клинико-морфологических и молекулярно-биологических параметрах НМКРЛ. Данная модель имеет наибольшую значимость фактора прогноза жизни больных НМКРЛ по сравнению с клинико-морфологическими и молекулярно-биологическими факторами. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на российской научно-практической конференции с международным участием «Современные аспекты диагностики и лечения рака легкого» (Томск, 2013); 9 конференция по фундаментальной онкологии «Петровские чтения», в рамках VIII Всероссийского съезда онкологов (Санкт-Петербург, 2013); Всероссийской 12 конференции с международным участием «Современные подходы в клиникоморфологической диагностике и лечении заболеваний человека» (СанктПетербург, 2013); XVIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2014); Всероссийской конференции, посвященной 155-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Актуальные вопросы патологической анатомии в мирное и военное время» (Санкт-Петербург, 2014); 10 конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2014); VIII Съезде онкологов и радиологов стран СНГ и Евразии (Казань, 2014); Всероссийской конференции с международным участием «Проблемы современной онкологии» (Барнаул, 2009); Всероссийской конференции с международным участием «Новые методы в онкологической практике» (Барнаул, 2013); Всероссийской конференции с международным участием «Таргетная терапия в онкологии» (Барнаул, 2014); Ученом совете Алтайского филиала ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина» РАМН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 47 научных работ, из них 16 статей в журналах по списку ВАК и 7 статей в зарубежных рецензируемых журналах. 1. Кобяков Д.С., Лазарев А.Ф., Авдалян А.М., Бычкова Е.Ю., Климачев В.В. Пролиферативная активность и степень дифференцировки немелкоклеточного рака легкого // Сибирский онкологический журнал. – 2009. – Приложение № 2. – С. 98-99. 2. Лазарев А.Ф., Кобяков Д.С., Авдалян А.М., Бычкова Е.Ю., Климачев В.В. Иммунофенотип р53/bcl-2 и пролиферативная активность рака легкого // Сибирский онкологический журнал. – 2009. – Приложение № 2. – С. 116-117. 3. Кобяков Д.С., Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бычкова Е.Ю. Особенности пролиферативной активности рака легкого и лимфогенное метастазирование // Материалы российской научно-практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2009. – С. 91-92. 4. Лазарев А.Ф., Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бычкова Е.Ю. Размер опухоли и особенности экспрессии р53 и bcl-2 в раке легкого // Материалы российской научно-практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2009. – С. 96. 13 5. Бобров И.П., Авдалян А.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Гервальд В.Я., Долгатов А.Ю., Самуйленкова О.В., Ковригин М.В., Кобяков Д.С. Модификация гис-тохимического метода выявления ядрышковых организаторов на гистологических срезах // Архив патологии. - 2010. - № 3.-С.35-37. 6. Кобяков Д.С., Бобров И.П., Авдалян А.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. Аргиро-фильные белки районов ядрышковых организаторов в аденомах с различной степенью дисплазии и аденокарциноме толстой кишки // Архив патологии. – 2010. - № 4. – С. 16-20. 7. Бычкова Е.Ю., Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Круглова Н.М., Лазарев А.Ф. Взаимосвязь между аргирофильными белками районов ядрышковых организаторов и стадией (по TNM системе) в плоскоклеточном раке легкого // Материалы российской научно- практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2013. – С. 46-47. 8. Бычкова Е.Ю., Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Круглова Н.М., Лазарев А.Ф. Взаимосвязь между аргирофильными белками районов ядрышковых организаторов и стадией (по TNM системе) в плоскоклеточном раке легкого // Материалы российской научно- практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2013. – С. 47-48. 9. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лазарев А.Ф. Клинико-морфологические параллели количества аргирофильных белков районов ядрышковых организаторов при аденокарциноме легкого // Российский онкологический журнал. – 2013. -№ 1. – С. 28-32. 10. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лазарев А.Ф., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Взаимосвязь между аргирофильными белками районов ядрышковых организаторов и стадией плоскоклеточного рака легкого // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. – Т. 156, № 7. - С. 93-97. 11. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лазарев А.Ф. Аргирофильные белки районов ядрышковых организаторов и клинико-морфологические параллели при аденокарциноме легкого // Вопросы онкологии. – 2013. – Приложение к № 3. – С. 80-81. 14 12. Лазарев А.Ф., Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П. Взаимосвязь аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67 с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при аденокарциноме легкого // Вопросы онкологии. – 2013. – Приложение к № 3. – С. 90-91. 13. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Лазарев А.Ф. Взаимосвязь аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67 с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при аденокарциноме легкого // Российский онкологический журнал. – 2013. -№ 3. – С. 21-27. 14. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Лазарев А.Ф., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Взаимосвязь аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67 с клинико- морфологическими параметрами и выживаемостью при плоскоклеточном раке легкого // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2014. - № 2. – С. 97-102. 15. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лазарев А.Ф. Аргирофильные белки районов ядрышковых организаторов и клинико-форфологические параллели при аденокарциноме легкого // Сибирский онкологический журнал. – 2013. – Приложение № 2. – С. 36-37. 16. Лазарев А.Ф., Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю. Взаимосвязь между аргирофильными белками районов ядрышковых организаторов и стадией (по TNM системе) в плоскоклеточном раке легкого // Сибирский онкологический журнал. – 2013. – Приложение № 2. – С. 46-47. 17. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Лазарев А.Ф. Взаимосвязь аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67 с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при аденокарциноме легкого // Сибирский онкологический журнал. – 2013. - № 5. – С. 5-11. 18. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лазарев А.Ф. Взаимосвязь между аргирофильными белками районов ядрышковых организаторов и стадией (по TNM системе) в плоскоклеточном 15 раке легкого // Материалы всероссийской конференции с международным участием «Современные подходы в клинико-морфологической диагностике и лечении заболеваний человека» памяти О.К.Хмельницкого. – СанктПетербург. - 2013. – С. 169-171. 19. Лазарев А.Ф., Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П. Взаимосвязь аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67 с выживаемостью при аденокарциноме легкого // Материалы всероссийской конференции с международным участием «Современные подходы в клинико-морфологической диагностике и лечении заболеваний человека» памяти О.К.Хмельницкого. – Санкт-Петербург. - 2013. – С. 198-199. 20. Кобяков Д.С., Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Взаимосвязь экспрессии белка и амплификации гена HER2/NEU с клинико- морфологическими параметрами и выживаемостью при немелкоклеточном раке легкого (исследование методами иммуногистохимии и гибридизации in situ) // Материалы всероссийской конференции, посвященной 155-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Актуальные вопросы патологической анатомии в мирное и военное время». - Санкт-Петербург. - 2014. – С. 115-117. 21. Лазарев А.Ф., Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Исследование уровня экспрессии топоизомеразы IIα во взаимосвязи с клинико- морфологическими параметрами и пролиферацией (по выявлению аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67) при аденокарциноме легкого // Материалы всероссийской конференции, посвященной 155-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Актуальные вопросы патологической анатомии в мирное и военное время». - Санкт-Петербург. - 2014. – С. 128-130. 22. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Лазарев А.Ф., Лушнико-ва Е.Л., Непомнящих Л.М. Исследование уровня экспрессии топоизомеразы IIа во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и пролиферацией (по выявлению аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67) при аденокарциноме легкого // Вопросы 16 онкологии. – 2014. - № 2.-С. 63-68. 23. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Лазарев А.Ф. Исследо-вание активности топоизомеразы IIа во взаимосвязи с клиникоморфологическими пара-метрами и пролиферацией (по выявлению аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67) при плоскоклеточном раке легкого // Российский онкологический журнал. – 2014. № 2. – С. 22-27. 24. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лазарев А.Ф. Her-2/neu, топоизомераза IIα, p53 и клиникоморфологические параллели при немелкоклеточном раке легкого.// Материалы конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения». Санкт-Петербург. - 2014. - С. 47. 25. Кобяков Д.С., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лазарев А.Ф., Лушнико-ва Е.Л., Непомнящих Л.М. Взаимосвязь экспрессии белка и амплификации гена HER2/NEU с клинико-морфологическими параметрами немелкоклеточного рака легкого // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2014. – Т. 157, № 6. - С.761-766. 26. Лазарев А.Ф., Кобяков Д.С., Авдалян А.М., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Взаимосвязь аргирофильных белков ядрышкообразующих районов в Ki-67 позитивных клетках с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при аденокарциноме легкого // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2014. - № 3. – С. 169-173. 27. Авдалян А.М., Кобяков Д.С., Климачев В.В., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Круглова Н.М., Лазарев А.Ф., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Исследование пролиферации (по выявлению аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67) при плосколкеточном раке легкого // Материалы российской научно-практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2014. – С. 44. 28. Бычкова Е.Ю., Кобяков Д.С., Авдалян А.М., Бобров И.П., Лазарев А.Ф., Лазарев С.А., Круглова Н.М., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Морфофункциональная активность клеток (по количеству аргирофильных белков области ядрышковых организаторов) как важный параметр прогноза при немелкоклеточном раке легкого // Материалы российской научно- 17 практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2014. – С. 53-54. 29. Кобяков Д.С., Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Взаимосвязь экспрессии белка и амплификации гена HER2/NEU с клинико- морфологическими параметрами и выживаемостью при немелкоклеточном раке легкого (исследование методами иммуногистохимии и гибридизации in situ) // Материалы российской научно-практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2014. – С. 72-73. 30. Круглова Н.М., Кобяков Д.С., Авдалян А.М., Лазарев А.Ф., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Взаимосвязь маркеров апоптоза (p53, bcl-2, bax) с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при немелкоклеточном раке легкого // Материалы российской научно-практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2014. – С. 74-75. 31. Лазарев А.Ф., Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М.Исследование активности топоизомеразы IIα во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и пролиферативной активностью при плоскоклеточном раке легкого. // Материалы российской научно-практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2014. – С. 78. 32. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Лазарев А.Ф. Клинико-морфологическая значимость определения уровня экспрессии фермента гиразы топоизомеразы IIа при аденокарциноме легкого // Проблемы клинической медицины. – 2013. - № 2.-С. 29-34. 33. Кобяков Д.С., Лазарев А.Ф., Авдалян А.М. Взаимосвязь экспрессии белка и амплификации гена HER2/NEU с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при немелкоклеточном раке легкого (исследование методами иммуногистохимии и гибридизации in situ). Материалы VIII съезда онкологов и радиологов СНГ и Евразии // Евразийский онкологический журнал. - 2014. - №3. - С. 360-361. 34. Кобяков Д.С., Лазарев А.Ф., Авдалян А.М., Бычкова Е.Ю. Исследование уровня экспрессии топоизомеразы IIα во взаимосвязи с клиникоморфологическими параметрами и пролиферацией (по выявлению аргиро- 18 фильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67) при аденокарциноме легкого. Материалы VIII съезда онкологов и радиологов СНГ и Евразии // Евразийский онкологический журнал. - 2014. - №3. - С. 361. 35. Кобяков Д.С., Бычкова Е.Ю., Авдалян А.М., Бобров И.П., Лазарев А.Ф., Лазарев С.А., Круглова Н.М., Лушникова Е.Л., Непомнящих А.М. Взаимосвязь аргирофильных белков ядрышкообразующих районов с клиникоморфологическими параметрами и вы-живаемостью при немелкоклеточном раке легкого // Онкология. - 2014.-№ 4.-С.19-24. 36. Лазарев А.Ф., Кобяков Д.С., Авдалян А.М., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Климачевский А.А. Исследование аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67 при немелкоклеточном раке легкого // Фундаментальные исследования. – 2014. - № 10.-С. 523-529. 37. Кобяков Д.С., Авдалян А.М., Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Бобров И.П. Взаимосвязь клинико-морфологических параметров и выживаемости при аденокарциноме легкого с активностью ядрышковых организаторов в MIB-1 позитивных клетках. Материалы конференции XVIII Российский онкологический конгресс с международным участием // Злокачественные опухоли. - Москва. –2014. - № 3. – С. 57-59. 38. Кобяков Д.С., Лазарев А.Ф., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Взаимосвязь мар-керов апоптоза (p53, bcl-2, bax) с клинико- морфологическими параметрами и выживаемостью при немелкоклеточном раке легкого // Сибирский онкологический журнал. – 2014. -№ 5. – С. 1016. 39. Кобяков Д.С., Авдалян А.М., Лазарев А.Ф., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Взаимосвязь клинико-морфологических параметров и выживаемости при немелкоклеточ-ном раке легкого с экспрессией белка и амплификацией гена HER2/NEU // Российский онкологический журнал. – 2014. -№ 5. – С. 31-36. 40. Кобяков Д.С., Авдалян А.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Немелкоклеточный рак легкого: статус онкогена HER2/NEU (иммуногистохимический анализ и гибридизация in situ) // Архив патологии. – 2015. – Т. 77, № 2. (принята в печать) 41. Kobyakov DS, Klimachev VV, Avdalyan AM, Bobrov IP, Bychkova 19 EY, Lazarev AF, Lushnikova EL, Nepomnyashchikh LM. Relationship between the argyrophilic proteins of the nucleolar organizer region and stage of squamouscell carcinoma of the lung // Bull Exp Biol Med. – 2013. - Vol. 156. №1. – Р. 8185. 42. Kobyakov D., Klimachev V., Avdalyan A., Bobrov I., Bychkova E., Kruglova N., Lazarev A., Lushnikova E., Nepomnyashchikh L. Association between Argyrophilic Proteins of Nucleolar Organizer Regions, Clinicomorphological Parameters, and Survival in Non-Small-Cell Lung Cancer // Lung Cancer International. – 2014. Article ID 891917, 7 pages. 43. Kobyakov DS, Klimachev VV, Avdalyan AM, Bobrov IP, Bychkova EY, Kruglova NM, Lazarev AF, Lushnikova EL, Nepomnyashchikh LM. Argyrophilic proteins of nucleolar organizer regions and proliferative activity of cells in squamous cell carcinoma of the lung // Bull Exp Biol Med. – 2014. - Vol. 157, № 5. – Р. 677-682. 44. Kobyakov D.S., Bychkova E.Yu., Avdalyan A.M., Bobrov I.P., Lazarev A.F., Lazarev S.A., Kruglova N.M., Lushnikova E.L., Nepomnyaschikh L.M. Interrelation of Argyrophilic Proteins of Nucleolar Organizer Regions and Ki-67 with Clinical and Morphological Parameters and Survival in Patients with Nonsmall Cell Lung Cancer // British Journal of Medicine & Medical Research. 2014. - Vol. 4, № 22. - Р. 3941-3953. 45. Kobyakov DS, Avdalyan AM, Bobrov IP, Bychkova EY, Lazarev AF, Lushnikova EL, Nepomnyashchikh LM. Correlation of HER-2/Neu Protein Expression and HER2 Gene Amplification with Clinical Morphological Parameters of Nonsmall Cell Lung Cancer // Bull Exp Biol Med. – 2014. - Vol. 157, № 6. – Р. 789-793. 46. Lazarev AF, Kobyakov DS, Avdalyan AM, Lushnikova EL, Nepomnyashchikh LM. Relationship of argyrophilic proteins of nucleolal organizer regions in Ki-67(+) cells with clinical and morphological parameters in lung adenocarcinoma // Bull Exp Biol Med. – 2014. - Vol. 158, № 1. - 145-149. 47. Kobyakov D.S., Avdalyan A.M., Lazarev A.F., Lushnikova E.L., Nepomnyashchikh L.M. Argyrophilic nucleolar organizer region in MIB-1 positive cells in non-small cell lung cancer: clinicopathological significance and survival // Cancer Biology & Medicine. – 2014. – Vol. 11. – P. 264-269. 20 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Немелкоклеточный рак легкого: клинико-морфологические параметры и прогноз Рак легкого – серьезная медицинская и социальная проблема, в развитых странах он является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью и наиболее распространенной причиной смерти от онкологической патологии. По данным мировой статистики, ежегодно выявляются более 1 млн. 600 тыс. больных этой нозологией и около 1 млн. 400 тыс. человек умирают [Jemal A. et al., 2011]. Пятилетняя выживаемость составляет 16%, и варьируется от 73% при 1А стадии до 2% при 4 стадии [Goldstraw P. et al., 2007]. Согласно данным Международного агентства по изучению рака (IACR), в 2008 году в мире зарегистрировано 1608055 новых случаев рака легкого, при этом показатели смертности приближаются к показателям заболеваемости и составляют 1376579 погибших от рака легкого [Ferlay J. et al., 2008]. Это 13 % всех заболевших злокачественными новообразованиями и 18% умерших от них. Число заболевших в Азии составляет 872070 человек. На долю США и ЕС приходится 504383 новых случаев [Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009]. В России и странах СНГ рак легкого так же занимает 1 место среди онкологических заболеваний, показывая тенденции аналогичные мировой статистике [Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2012; Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В., 2012; Агеев А.А.,2005; Давыдов М.И., 2004; Переводчикова Н.И., 2003; Мерабишвили В.М., Дятченко О.Т., 2000; Siegel R, Naishadham D, Jemal A., 2012; Woolhouse I., 2011; Coleman M.P. et al., 2011]. В 2012 году в России выявлено 55475 новых случаев этого заболевания. За последние 5 лет абсолютное число заболевших мужчин снизилось на 4,4%, женщин – увеличилось на 3,8%. Доля рака легкого в структуре онкологической заболеваемости мужского населения колебалась от 10,5% (в Узбекистане) до 1726% в Кыргызстане, Беларуси, Казахстане, Азербайджане и Армении, в России – 18,7%; у женщин она составляла 2,5-5,2%. По сравнению с 2006 годом отмечено снижение или стабилизация доли рака легкого среди всех злокачественных новообразований практически во всех странах СНГ. В 2012 году в 21 структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями женского населения России рак легкого находился на 9-м месте (3,6%). У мужчин рак легкого занимал 1-е место в возрастной группе 40-69 лет (19,0% и 21,7%); 2-е ранговое место – (17,1%) в возрастной группе 70-84 лет и в 85 лет и старше (11,8%). У женщин рак легкого занимал 4-е ранговое место в возрастной группе 85 лет и старше (5,0%). Средний возраст больных раком легкого колебался от 60-62 лет (в Кыргызстане и Азербайджане) до 64-68 лет (в России, Беларуси, Армении и Казахстане). Среди регионов России максимальные стандартизованные показатели заболеваемости зарегистрированы в Еврейской автономной области (84,2 на 100 000 мужчин и 16,2 на 100 000 женщин), Республике Чечня (81,6 и 14,8), а также у мужчин в Курганской (75,8) и Сахалинской (73,9) областях, Алтайском крае (71,6); у женщин – в Чукотском автономном округе(45,9), Сахалинской, Магаданской и Читинской областях, республиках Бурятия, Тыва и Якутия (12-16). Анализ смертности от пяти наиболее распространенных в России злокачественных опухолей в зависимости от возраста показал, что в возрастной группе 40-84 года у мужчин 1-е ранговое место занимал рак легкого, 2-е – рак желудка, 3-е – рак поджелудочной (в возрастной группе 40-69 лет) и предстательной (в возрастной группе 70-84 года) желез и желудка (в 85 лет и старше). Сухие цифры статистических данных свидетельствуют о том, что рак легкого является одним из наиболее часто встречающихся и характеризуется неблагоприятным прогнозом заболевания. Несмотря на определенные успехи в диагностике и лечении НМКРЛ результаты, в целом, остаются малоутешительными. Около 60% больных среди первично выявленных имеют местно-распространенные стадии заболевания [Гагуа P.O. с соавт., 2000; Torre W, Sierra A., 2002]. Существующие методы консервативной терапии (лучевая и химиотерапия) недостаточно эффективны [Горбунова В. B. и соавт., 2007]. Только своевременно выполненная хирургическая операция позволяет рассчитывать на выздоровление [Пикин О.В. и соавт., 2014; Колбанов К.И. и соавт., 2012; Трахтенберг А.Х., Колбанов К.И., Пикин О.В., 2010; Лапина Т.В., Вишневский А.А., 2008; Барчук A.C., Арсентьев А.И., Пожарисский K.M., 2003; Давыдов М.И., 2000; Дарьялова СЛ., Бойко A.B., Черниченко A.B., 2000]. К сожалению, только у 10-20% 22 больных НМКРЛ возможно проведение хирургического лечения. Эти цифры остаются практически неизменными последние 10-15 лет. Основным критерием эффективности хирургического лечения больных раком легкого является продолжительность жизни – 5-летняя выживаемость. Совокупная статистика данных многочисленных авторов показывает, что, несмотря на совершенствование хирургического метода, этот срок переживает не более 20 30% радикально оперированных больных и заметной тенденции к улучшению этих результатов не наблюдается. Общепризнанно, что основными факторами прогноза, влияющими на продолжительность жизни оперированных больных НМКРЛ, являются клинико-морфологические параметры опухоли. Международная классификация по системе TNM – интергальная характеристика опухоли, выраженная в понятии стадия заболевания. Используется для решениях нескольких задач: выбор тактики и вида лечения (хирургическое, лучевое, химиотерапевтическое и комплексное), наблюдения и обследования пациента, а также прогнозирование течения заболевания. Классификация по системе TNM основана на трех факторах: показатель Т – размер опухоли и соотношение с окружающими анатомическими структурами; показатель N – наличие/отсутствие метастазов в регионарные лимфатические узлы (лимфогенное метастазирование); показатель М – наличие/отсутствие метастазов во внутренние органы (гематогенное метастазирование). В связи с этим международная классификация по системе TNM не лишена недостатков в плане прогнозирования течения заболевания у больным НМКРЛ, так как в один и тот же показатель (стадию заболевания) включаются больные неоднородные по другим факторам, имеющим прогностическое значение при НМКРЛ. Поэтому в практической онкологии после хирургического лечения больных НМКРЛ, однородных по системе TNM, наблюдается выздоровление у одних, а у других наступает прогрессирование (раковый плеврит, внутрилегочная диссеминация, метастазирование во внутренние органы и др.) и рецидивирование заболевания. К общепризнанным, «классическим» клинико-морфологическим факторам прогноза при НМКРЛ относятся следующие. 1) Показатель Т – первый из дескрипторов по системе TNM, отражающий наибольший размер опухоли и характер отношения опухоли с окру- 23 жающими анатомическими структурами. Характер отношения опухоли с окружающими анатомическими структурами имеет значение не только при выборе тактики хирургического лечения, но и имеет прогностическое значение. Так, Lakha S. с соавторами (2014), Fibla J.J. с соавторами (2012) показали, что инвазия в плевру является независимым фактором прогноза, ухудшающим выживаемость больных НМКРЛ после операции при опухоли одного и того же размера, но не более 7 см. В классификации TNM 7 пересмотра инвазия в плевру является критерием выбора при Т1 и Т2 – в опухолях до 7 см, и не является критерием выбора при Т3 и Т4 – в опухолях более 7 см. В тоже время, прогностическая значимость данного критерия (инвазия в плевру) остается дискутабельной в мировой литературе, так как имеются исследования показывающие отсутствие прогностической значимости инвазии в плевру НМКРЛ [David E. et al., 2013]. Одной из причин расхождения опубликованных результатов является методология исследования инвазии опухоли в плевру [Kawase A. et al., 2013; Marchevsky AM., 2006]. В большинстве исследований было выявлено, что увеличение показателя Т связано со снижением показателя выживаемости больных и является неблагоприятным фактором прогноза при НМКРЛ [Riquet M. et al., 2014; Shao W. et al., 2014; Lyu J. et al., 2014; Szturmowicz M. et al., 2014; Oven Ustaalioglu B.B. et al., 2013; Sonobe M. et al., 2013]. Так, Yano T. с соавторами (2010) показали, что пятилетняя выживаемость больных НМКРЛ составила 77,8% при T1a, 63,3% при T1b, 46,4% при T2a, 38,8% при T2b, 21,4% при T3. 2) Показатель N – второй из дескрипторов по системе TNM, отражающий наличие или отсутствие метастазов в регионарных лимфатических узлах, а при наличии метастазов – степень поражения лимфатических коллекторов. По данным Rena O. с соавторами (2014) пятилетняя выживаемость больных НМКРЛ составила 93%, 66% и 25% соответственно при N0, N1 и N2. Rusch V.W. с соавторами (2007, 2009) приводят более низкие показатели пятилетней выживаемости больных: 56% при N0, 38% при N1, 26% при N2 и 6% при N3. Однако, общеизвестно, что после хирургического лечения больных с 1 стадией заболевания (показатель N0) рецидив наблюдается в 25-30% [Lei Y., Wu Y., 2013]. В некоторой степени данный факт связан с точностью и методологией оценки показателя N [Колесник А.П., Кузьменко В.А., 2013; 24 Давыдов М.И., Полоцкий Б.Е., Аллахвердиев А.К., 2007; Попов А.В. и соавт., 2005]. Показано, что точность определения показателя N и прогноз заболевания зависит как от количества исследованных и пораженных лимфатических узлов [Yang M. et al., 2013; Mlika M. et al., 2013; Saji H. et al., 2013], так и от анатомического расположения лимфатического узла в одной и той же группе [Li ZM. et al., 2013]. Однако кроме метастазов (размер более 2 мм) в лимфатических узлах могут определяться микрометастазы (размер 0,2-2 мм) и группы опухолевых клеток (размер менее 0,2 мм). Наличие микрометастазов является неблагоприятным прогностическим фактором и характеризуется более низким показателем выживаемости больных НМКРЛ [Стариков В.И., Ходак А.С., Белый В.И., 2010; Dai C.H. et al., 2013; Ouyang W.W. et al., 2008; Li S.H. et al., 2008]. Определение микрометастазов и групп опухолевых клеток крайне трудоемкая и на сегодняшний день трудно выполнимая задача в рутинной патогистологической работе. В связи с этим при показателе N0 ведется поиск маркеров, которые могли бы с большей точностью классифицировать метастатический потенциал. Например, определение в первичном опухолевом узле инвазии в кровеносные и/или лимфатические сосуды корректирует прогноз и является фактором более низкой выживаемости [Акопов А.Л., Двораковская И.В., 2004; Tantraworasin A. et al., 2013; Funaki S. et al., 2013; Nentwich M.F. et al., 2013; Alerić I. et al., 2012]. Несмотря на это показатель N является самым значимым фактором прогноза, при отсутствии метастазов во внутренние органы (показатель М0). Практически во всех исследованиях выявлено, что показатель N является фактором прогноза и его увеличение приводит к снижению выживаемости больных НМКРЛ [Колесник А.П. и соавт., 2013; Захарычев В.Д., 2000; Tanvetyanon T. et al., 2014; Jiang L. et al., 2014; Riquet M. et al., 2014; Lyu J. et al., 2014; Kanou T. et al., 2014; Yang M. et al., 2013; Tantraworasin A. et al., 2013; Ni S.S. et al., 2013; Sonobe M. et al., 2013; Whitson B.A. et al., 2011]. 3) Показатель М - третий из дескрипторов по системе TNM, отражающий наличие или отсутствие метастазов во внутренних органах. Наличие микрометастазов и групп опухолевых клеток во внутренних органах на момент установления стадии заболевания и проведения хирургической операции затрудняет не только истинное стадирование, но и определение лечебной 25 тактики и прогноза для больного. Поэтому маркеры связанные с метастатическим гематогенным потенциалом могли бы более точно классифицировать данный дескриптор. Например, наличие циркулирующих опухолевых клеток взаимосвязано с метастатическим потенциалом НМКРЛ и является неблагоприятным фактором прогноза [Wang J. et al., 2013]. Показано, что при НМКРЛ показатель М является фактором прогноза и его увеличение приводит к снижению выживаемости [Sánchez de Cos Escuín J. et al., 2014; Javid J. et al., 2014]. 4) Стадия заболевания – является интегральным дескриптором по системе TNM и определяется по совокупности показателей Т, N и М. В 2009 году вышел 7 пересмотр классификации TNM, изменения коснулись в основном показателей Т и М, а также стадирования заболевания, что привело к более высокой прогностической значимости данной классификации [Bergman P., Brodin D, Lewensohn R, de Petris L., 2013; Klikovits T. et al., 2011]. Goldstraw P. с соавторами (2007) показали взаимосвязь стадирования по классификации TNM 7 пересмотра и показателя пятилетней выживаемости, так при IА стадии -50-80%, IВ стадии – 47%, IIА стадии – 36%, IIВ стадии – 26%, IIIА стадии – 19%, IIIВ стадии – 7%, IV стадии – 2%. Стадия заболевания, также как и показатели Т, N и М является фактором прогноза и его увеличение приводит к снижению выживаемости больных НМКРЛ [Javid J. et al., 2014; Jiang L. et al., 2014; Lara M.S. et al., 2014; Mazza F. et al., 2014; Fukumoto K. et al., 2014; Szturmowicz M. et al., 2014; Shao W. et al., 2014; Huang L. et al., 2014; Rena O. et al., 2013; Ni S.S. et al., 2013]. Дескрипторы по системе TNM являются наиболее значимыми прогностическими факторами для постоперационного периода больных НМКРЛ [Pelletier M.P. et al., 2001]. На сегодняшний день адекватное стадирование НМКРЛ по системе TNM в практической медицине является проблемой, так как оценивается как очень плохое, причем в мировом масштабе [Osarogiagbon R.U., 2012]. Например, оценка показателя N – как наиболее значимого дескриптора - после хирургического лечения является крайне неудовлетворительной. В США 40-50% резекций НМКРЛ происходят без забора медиастинальных регионарных лимфатических узлов для исследования [Varlotto J.M. et al., 2009; Allen J.W. et al., 2009], количество медиастиналь- 26 ных регионарных лимфатических узлов забираемых для исследования является не достаточным [Varlotto J.M. et al., 2009; Allen J.W. et al., 2009], только у 8% больных НМКРЛ проводится полное системное исследование регионарных лимфатических узлов [Osarogiagbon R.U., Allen J.W., Farooq A., Wu J.T., 2012], в 18% резекций НМКРЛ регионарные лимфатические узлы вообще не исследуются - показатель Nх [Osarogiagbon RU. et al., 2010; Ou S.H. et al., 2008]. Причем, данная проблема существует на фоне доказанных знаний о том, что независмыми факторами прогноза при показателе N0 является количество гистологически исследованных регионарных лимфатических узлов [Ou S.H. et al., 2008; Ludwig M.S. et al., 2005], а при показателе N1-3 - количество регионарных лимфатических узлов с метастазами в соотношении к лимфатическим узлам без метастазов [Wei S. et al., 2011; Jonnalagadda S. et al., 2011]. В данном контексте становится понятным интерес исследователей к поиску других факторов у оперированных больных НМКРЛ, способных как улучшать стадирование по системе TNM, прогнозирование заболевания, так и помогать в выборе адекватной терапии. 5) Наибольший размер опухоли – является одним из критериев выбора при определении показателя Т. В классификации TNM 7 пересмотра по сравнению с 6 пересмотром данный дескриптор претерпел наибольшие изменения. В TNM 7 пересмотра в зависимости от размеры были выделены 5 групп (менее 2 см, 2-3 см, 3-5 см, 5-7 см и более 7 см) по сравнению с двумя группами (менее 3 см и более 3 см) в TNM 6 пересмотра. Однако еще Riquet M. с соавторами (1997) показали, что пятилетняя выживаемость составила 77%, 62,8% и 62,9% при размере НМКРЛ 0,5–1 см, 1,1–2 см и 2,1–3 см соответственно. Lyons G. с соавторами (2008) показали динамику снижения выживаемости по актуариальным кривым у больных НМКРЛ при размере опухоли 0-2 см, 2-3 см, 3-5 см, 5-7 см и более 7 см; однако, достоверные различия найдены только при размере опухоли менее 1,5 см и более 1,6 см – пятилетняя выживаемость 95% и 65% соответственно. По данным Li Z.В. с соавторами (2009) пятилетняя выживаемость при показателе Т1 составила 78,57% и 73,33% при размере опухоли менее 2 см и 2-3 см соответственно, при показателе Т2 составила 75,49%, 74,58%, 60,87%, 55,63% и 46,15% при размере опухоли менее 2 см, 2-3 см, 3-5 см, 5-7 см и более 7 см соответственно. В 27 большинстве исследований показано, что при увеличении размера опухоли снижается показатель выживаемости больных НМКРЛ, что является неблагоприятным фактором прогноза [Tanvetyanon T. et al., 2014; Kim M.K. et al., 2014; Kuo S.W. et al., 2014; Kanou T. et al., 2014; Oven Ustaalioglu B.B. et al., 2013; Yang M. et al., 2013; Izar B. et al., 2013; Tantraworasin A. et al., 2013; Li Z.M. et al., 2013; Ni S.S. et al., 2013; Choi P.J. et al., 2013; Lopez Guerra J.L. et al., 2013; Sonobe M. et al., 2013; Liu C.Y. et al., 2013; Tsutani Y. et al., 2013; Morgensztern D. et al., 2012; Whitson B.A. et al., 2011]. 6) Гистогенез. Патогистологическая структура рака легкого представлена в более чем 80% случаев НМКРЛ. Около 90% НМКРЛ представлены плоскоклеточным раком и аденокарциномой; редкие формы НМКРЛ представлены крупноклеточным и железисто-плоскоклеточным раком [Davidson M.R., Gazdar A.F., Clarke B.E.. 2013]. Современной особенностью НМКРЛ является увеличение удельной доли Ак и уменьшение удельной доли Пк, что связывают с изменением спектра канцерогенов. В современной структуре НМКРЛ на долю Пк приходится 49%, Ак – 42%, крупноклеточного рака – 7%, железисто-плоскоклеточного рака – 2% [Chansky K. еt al., 2009]. Основные гистогенетические типы НМКРЛ – Ак и Пк – отражают два различных пути канцерогенеза и патогенеза опухоли. В связи с этим Ак и Пк имеют значимые различия не только на морфологическом, но и на молекулярнобиологическом и генетическом уровнях [Cooper W.A., Lam D.C.L., O’Toole S.A., Minna J.D., 2013; Yousem S.A., 2012; Cheng L. et al., 2012; Rose-James A., TT S., 2012; Moran С., 2011], а также в тактике лечения. В мировой литературе нет единого мнения относительно прогностической значимости гистогенетического типа НМКРЛ. Одна треть публикаций указывает, что при Ак по сравнению с Пк выживаемость лучше и прогноз благоприятнее [Inoue M. et al., 2014; Tao H. et al., 2013; Yoshida Y. et al., 2013; Whitson B.A. et al., 2012, 2011], вторая треть публикаций приводит диаметрально противоположные данные [Tanvetyanon T. et al., 2014; Javid J. et al., 2014; Jiang L. et al., 2014; Lyu J. et al., 2014; Li Z.M. et al., 2013; Rena O. et al., 2013], в третьей части публикаций исследователи не находят разницы в выживаемости больных Ак и Пк [Caldarella A. et al., 2007; Ou S.H.I. et al., 2007; Riquet M. et al., 2006; Berardi R. et al., 2005; Kawai H. et al., 2005]. 28 7) Дифференцировка. Предполагается, что более высокая степень гистологической дифференцировки опухоли имеет большую аналогию с нормальным тканевым источником происхождения и соответственно меньшую агрессивность злокачественного процесса по сравнению с низкодифференцированной опухолью. В доступной литературе одна половина исследований указывает на отсутствие взаимосвязи степени дифференцировки НМКРЛ с выживаемостью больных и прогнозом, однако, в другой половине исследований прослеживается взаимосвязь снижения степени дифференцировки с более низкой выживаемостью больных и неблагоприятным прогнозом [Chen Y.Y. et al., 2014; Kuo S.W. et al., 2014; Choi P.J. et al., 2013; Ni S.S. et al., 2013; Liu C.Y. et al., 2013; Alerić I. et al., 2012; Shimada Y. et al., 2012; Whitson B.A. et al., 2012, 2011; Maeda R. et al., 2010; Kobayashi N. et al., 2007; Sun Z. et al., 2006]. 8) Возраст. В большинстве исследований выявлено, что при увеличении возраста больных НМКРЛ, а также у больных старше 70 лет, снижается показатель выживаемости. Также более старший возраст больных НМКРЛ является независимым неблагоприятным фактором прогноза [Tanvetyanon T. et al., 2014; Javid J. et al., 2014; Riquet M. et al., 2014; Lara M.S. et al., 2014; Mazza F. et al., 2014; Fukumoto K. et al., 2014; Yoshida Y. et al., 2013; Inoue M. et al., 2014; Tsutani Y. et al., 2013; Morgensztern D. et al., 2012; Whitson B.A. et al., 2012, 2011]. 9) Пол. При НМКРЛ соотношение мужчин и женщин составляет 6:1; а каждый четвёртый мужчина, страдающий злокачественной опухолью - больной раком лёгкого. Практически все исследователи согласны с тем, что женский пол по сравнению с мужским является взаимосвязан с более высокой выживаемостью при НМКРЛ [Tanvetyanon T. et al., 2014; Javid J. et al., 2014; Riquet M. et al., 2014; Lara M.S. et al., 2014; Mazza F. et al., 2014; Fukumoto K. et al., 2014; Inoue M. et al., 2014; Shao W. et al., 2014; Huang L. et al., 2014; Rena O. et al., 2013; Choi P.J. et al., 2013; Tao H. et al., 2013; Sonobe M. et al., 2013; Yoshida Y. et al., 2013; Tsutani Y. et al., 2013; Morgensztern D. et al., 2012; Whitson BA. et al., 2012, 2011]. Однако, Sterlacci W. с соавторами (2001), а также Jubelirer S.J. с соавторами (2009) показали, что пол не является независимым фактором прогноза, а зависит от других факторов. Напри- 29 мер, у женщин по сравнению с мужчинами чаще определяется аденокарцинома, более дифференцированные опухоли, меньшая стадия заболевания, более молодой возраст и низкий ИМ Ki-67. Кроме вышеперечисленных факторов прогноза при НМКРЛ в литературе описывается большое количество других как клинико- морфологических, так и эпидемиологических, молекулярно-биологических и генетических факторов [Шикеева А.А. и соавт., 2013; Колбанов К.И. и соавт., 2013; Демидова И.А. и соавт., 2012; Владимирова Л.Ю., Кит О.И., Шолохова Е.А., 2012; Колбанов К.И., 2011; Колбанов К.И. и соавт., 2013; Валиус Л., Инчюра А., Сакалаускас Р., Юозайтите Э., 2004]. На основании выявленных факторов прогноза исследователи предлагают классификации подобные классификации TNM [Хабаров Ю.А.. 2010]. Например, Kratz J.R. с соавторами (2012) предложили классификацию НМКРЛ на основании определения 11 онкогенов. С практической точки зрения крайне востребованы альтернативные прогностические факторы и классификации по отношению к дескрипторам по системе TNM и другим «классическим», клинико-морфологическим факторам. Таким образом, клинико-морфологические факторы прогноза далеко не совершенны и одним из перспективных направлений исследований в онкологии является поиск новых прогностических факторов при злокачественных новообразованиях [Кушлинский Н.Е., Немцова М.В., 2014; Лазарев А.Ф., Авдалян А.М., 2011; Юрин А.Г. , 2009; Юрин А.Г., Ковальский Б.Г., 2009; Сокуренко В.П. и соавт., 2008]. На сегодняшний день актуальным является исследование фундаментальных молекулярно-биологических маркеров, определяющих как прогноз, так и показания для последующей полихимиотерапии и направленной таргетной терапии новообразования [Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н., 2004; Захарычев В.Д., 2010]. Так, например, высокий уровень топоизомеразы IIα типа является показателем лекарственной чувствительности раковых клеток к антрациклиновым антибиотикам и эпиподофилотоксинам, а высокое содержание белка и/или амплификация гена Her2 – показателем для таргетной терапии Her2 моноклональными антителами трастузумаб (герцептин). Кроме того, исследование молекулярно-биологических маркеров в единичном образце опухолевой ткани, исключает погрешности 30 хирургического этапа забора материала, а также патогистологического анализа. В связи с чем данные о взаимосвязи молекулярно-биологических маркеров с клинико-морфологическими параметрами могут использоваться в качестве дополнительно критерия для более рационального стадирования и выявления групп риска. 1.2. Взаимосвязь молекулярно-биологических характеристик с клиникоморфологическими параметрами и прогнозом жизни больных НМКРЛ 1.2.1. Ag-ЯОР-белки Ядрышко – безмембранная, ядерная органелла, видимая в нуклеоплазме в период интерфазы клеточного цикла. Ядрышко реорганизуется в процессе митоза: исчезает в профазе митоза, когда ядрышковые организаторы "растаскиваются" в ходе конденсации соответствующих хромосом, и вновь формируется в телофазе. Восстановление ядрышка в телофазе митоза начинается с ядрышковых организаторов, отчего и произошло такое название. Ядрышкообразующие районы – это вторичная перетяжка на пяти акроцентрических хромосомах (13-й, 14-й, 15-й, 21-й и 22-й), где располагаются многочисленные копии генов, кодирующие рибосомальные РНК. Ядрышко содержит хроматин (ядрышкообразующие районы - многократные повторы рибосомных ДНК цистронов для синтеза 45S РНК) и ядрышковые рибонуклеопротеины, состоящие из прерибосомальных РНК, малых ядерных РНК и рибосомных белков. Ag-ЯОР-белки – это рибосомные белки (нуклеолин, нуклеофозмин и фибриллярин), а также РНК-полимераза I и фактор инициации транскрипции, которые связывают ионы серебра, являясь субстратом цитохимической реакции с нитратом серебра (реакция специфична для фосфосериновых и фосфотреониновых остатков, которыми богаты данные белки). Нуклеолин и нуклеофозмин являются главными AgЯОР-белками, так как их доля в аргентофилии составляет более 70 %. При исследовании в электронный микроскоп ядрышко состоит из 3 основных компонентов. 1. Фибриллярные центры – округлые структуры, диаметром 0,3-2,0 мкм, их количество в ядрышке зависит от пролиферативной активности клетки, соответствуют ядрышковым организаторам, содержат 31 РНК-полимеразу I. 2. Плотный фибриллярный компонент – окружает фибриллярный цент, состоит из фибрилл толщиной 5 нм, содержит Ag-ЯОРбелки (нуклеолин, нуклеофозмин, фибриллярин и фактор инициации транскрипции). 3. Гранулярный компонент – состоит из гранул 15-20 нм, окружает фибриллярные центры и плотный фибриллярный компонент, содержит Ag-ЯОР-белки (нуклеолин и нуклеофозмин) [Hernandez-Verdun D. et al., 2010; Sirri V., Urcuqui-Inchima S., Roussel P., Hernandez-Verdun D., 2008]. Нуклеолин (белок С23) – фосфопротеин массой 105 кДа, кодируется геном NCL, расположенном на 2q37.1. Нуклеолин является в основном структурным белком, участвует в транскрипции, синтезе и созревании рибосом. Нуклеофозмин (белок В23, нуматрин) – фосфопротеин массой 38-39 кДа, кодируется геном NPM1, расположенном на 5q35.1. Нуклеофозмин является в основном транспортным белком, участвует в синтезе и созревании рибосом, а также в транспорте белков, регуляции сигнального пути ARF/p53, сборке гистонов и дупликации центросом. Рибосомные белки участвуют практически во всех функциональных проявлениях ядрышка: конденсации и деконденсации хроматина, транскрипции, процессинге, созревании и транспорте прерибосомных частиц в цитоплазму [Hernandez-Verdun D. et al., 2010; Sirri V., Urcuqui-Inchima S., Roussel P., Hernandez-Verdun D., 2008; Derenzini М., Trere D., M.-F. O’Donohue, Ploton D., 2003]. Ag-ЯОР-белки выявляются в ядрах клеток на протяжении всего клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5-3 раза в S- и G2-фазы [Sirri V., Roussel P., Hernandez-Verdun D., 2000]. Количественное содержание Ag-ЯОР-белков имеет обратную зависимость с длительностью клеточного цикла и временем удвоения опухоли, как в экспериментальных моделях, так и в клинической практике [Уханова Е.М. и соавт., 2013; Зенит-Журавлева Е.Г. и соавт., 2013; Райхлин Н.Т. и соавт., 2011, 2008, 2006; Canet V. еt al., 2001, Trerè D., 1998]. Обратную зависимость количественного содержания Ag-ЯОР-белков со временем удвоения Ак были показаны Abe S. с соавторами (1992), а при Пк - Ogura S. с соавторами (1992). Гистохимический метод выявления ядрышковых организаторов был впервые описан и применен в цитогенетических исследованиях Goodpasture C. и Bloom S.E. в 1975 году и состоял из 2 последовательных фаз: импрегнации и проявления. Одноэтапный метод окрашивания (с одновременной им- 32 прегнацией и проявлением) предложили Howell W.M. и Black D.A. в 1980 году. Адаптированным вариантом для гистологической практики оказалась дальнейшая модифицикация метода, предложенная Ploton D. с соавторами в 1986 году (более низкая температура и более длительное время инкубации по сравнению с методикой Howell W.M. и Black D.A.), ввиду более удобного управления ходом реакции и получения наиболее оптимальных результатов окрашивания тканевых срезов. С этого времени отмечается значительный интерес к данной методике в онкоморфологии, и признанием ее, как ценного диагностического и прогностического метода [Лазарев А.Ф. и соавт., 2010; Бобров И.П. и соавт., 2010; Болгова Л.С. и соавт., 2010; Волченко Н.Н. и соавт., 2007; Montanaro L, Treré D, Derenzini M., 2008; Derenzini М., Trere D., M.-F. O’Donohue, Ploton D., 2003; Pich A., Chiusa L., Margaria E., 2000; Ofner D., Schmid K. W., 1996]. Для оценки результатов окрашивания Ag-ЯОР-белков предложено два метода: первый заключается в подсчете количества гранул серебра, второй – в определении площади Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток путем автоматического или полуавтоматического измерения с использованием анализатора изображения. Определение площади Ag-ЯОР-белков с использованием компьютерного анализа изображений рекомендовано "Международным комитетом по количественной оценке Ag-ЯОР-белков" в качестве метода оценки Аg-ЯОР-белков в ядрах клеток [Aubele M. et al., 1994]. Однако, из 1000 работ опубликованных к 2000 году по исследованию Ag-ЯОР-белков в опухолях человека только в 15,4 % при оценки активности Ag-ЯОР-белков использовался анализ изображения [Trerè D., 2000]. Для исключения межлабораторной объективной вариабельности исследования Ag-ЯОР-белков Ruschoff J. (1990) предложили использовать площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов в качестве стандарта окрашивания и внутреннего контроля. При определении площади Ag-ЯОР-белков рекомендуется соотносить ее со средней площадью стандарта окрашивания – получившее название ИП Ag-ЯОРбелков или индекса Ruschoff. В наших исследованиях показана большая диагностическая значимость определения ИП по сравнению с площадью AgЯОР-белков [Лазарев А.Ф. с соавт., 2010; Кобяков Д.С., 2006]. Большие количественные показатели Ag-ЯОР-белков взаимосвязаны с 33 низким показателем выживаемости и негативным прогнозом при злокачественных новообразованиях разной локализации: молочной железы [Treré D. et al., 2006], эндометрия [Giuffrè G. et al., 2001], яичника [Sah SP. et al., 2004], щитовидной железы [Райхлин Н.Т. и соавт., 2010], надпочечника [Райхлин Н.Т. и соавт., 2011, 2002; Букаева И.А. и соавт., 2001], почки [Yasunaga Y. et al., 1998], полости рта и глотки [Pillai KR. et al., 2005; Piffkò J. et al., 1997], лимфоме [Райхлин Н.Т. и соавт., 2000; Смирнова Е.А. и соавт., 2004], легкого [Казачков Е.Л., Белосохов М.В., 2013; Райхлин Н.Т. и соавт., 2012, 2008], желудка [Бобров И.П., 2005; Климачев В.В., 2003], толстой кишки [Лазарев А.Ф. и соавт., 2010; Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Кобяков Д.С., 2006; Кобяков Д.С., 2006], саркоме [Авдалян А.М., 2013; Авдалян А.М. и соавт., 2009, 2010; Лазарев А.Ф. и соавт., 2008; Бобpов И.П. и соавт., 2008]. Pich A. с соавторами (2000) провели обзор исследований Ag-ЯОР-белков и показали, что при большинстве злокачественных новообразований количественные показатели Ag-ЯОР-белков взаимосвязаны с клинико-морфологическими параметрами опухоли, общей и безрецидивной продолжительностью жизни больных и являются независимым фактором прогноза. По данным мировой литературы в эпителии бронха и альвеолы количественные показатели Ag-ЯОР-белков минимальны, но последовательно увеличиваются от нормы к гиперпластическим, метапластическим, диспластическим изменениям эпителия и достигают максимальных значений при раке легкого [Болгова Л.С., Туганова Т.Н., Алексеенко О.И., 2012; Болгова Л.С., Туганова Т.Н., Ярощук Т.М., 2011; Gulati A. et al., 2002; Zaczek M. et al., 1995; Fisseler-Eckhoff A. et al., 1994; Nonomura A. et al., 1993; Abe S. et al., 1992; Boldy D.A. et al., 1991]. Такая динамика изменений количественных показателей Ag-ЯОР-белков описана нами при опухолях толстой кишки и может использоваться в качестве диагностического метода [Лазарев А.Ф. и соавт., 2010; Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Кобяков Д.С., 2006]. В исследованиях, посвященных изучению Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ, найдена взаимосвязь количественного содержания Ag-ЯОР-белков с большинством клинико-морфологических параметров: показателем Т и N [Kaneko S. et al., 1991], показателем М [Matheus R.S. et al., 2004], стадией заболевания [Minamoto H. et al., 2003; Antonangelo L. et al., 1997; Bernardi F.D. 34 et al., 1997; Rodrigues O. R. et al., 1997; Oyama T. et al., 1993; Kaneko S. et al., 1991], гистогенезом [Oyama T. et al., 1993; Nonomura A. et al., 1993; Kaneko S. et al., 1991] и дифференцировкой [Cemerikić-Martinović V. et al., 1998; Rodrigues O. R. et al., 1997; Antonangelo L. et al., 1997; Bernardi F.D. et al., 1997; Lee YC. et al., 1997]. Однако, некоторые авторы не находят взаимосвязи между Ag-ЯОР-белками и клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ [Mourad W.A. et al., 1997; Abe S. et al., 1992]. В большинстве исследований показана взаимосвязь большого количественного содержания Ag-ЯОР-белков с низкой выживаемостью и негативным прогнозом для больных НМКРЛ [Райхлин Н.Т. с соавт., 2008, Carvalho P. E. et al., 2000, Rodrigues O. R. et al., 1997, Antonangelo L. et al., 1997, Bernardi F.D. et al., 1997, Lee YC. et al., 1996, Tateishi M. et al., 1995, Ishida T. et al., 1993, Oyama T. et al., 2000, 1993, Kaneko S. et al., 1991, Ogura S. et al., 1992, Abe S. et al., 1992]. В то же время некоторые авторы не находят такой взаимосвязи [Boldy D.A. et al., 1997]. Следует отметить, что только в единичных исследованиях, посвященных изучению Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ, определялась площадь Ag-ЯОР-белков с использованием компьютерного анализа изображений, как объективного стандартизованного метода анализа [Matheus R. S. et al., 2004, Carvalho P. E. et al., 2000, Rodrigues O. R. et al., 1997, Antonangelo L. et al., 1997, Bernardi F.D. et al., 1997]. В связи с наличием гетерогенности клеточной популяции в пределах одной опухоли, наряду с определением количественных показателей AgЯОР-белков предлагается оценивать показатель вариабельности Ag-ЯОРбелков - коэффициент вариации (КВ) [Ofner D., Schmid K. W., 1996]. Применение данного показателя при анализе Ag-ЯОР-белков имеет две цели. Первая - методологическая – для стандартизации и анализа исследуемой клеточной популяции. Вторая – дискриминативно-диагностическая – для анализа взаимосвязи между гетерогеностью опухоли и клинико-морфологическими параметрами, биологическим поведением новообразования (выживаемость больных и прогноз). В доступной литературе единичные исследования посвящены изучению КВ Ag-ЯОР-белков в злокачественных новообразованиях [Bankfalvi A. et al., 1999, Piffko J. et al., 1997, Bellotti M. et al., 1997, Aubele M. et al., 1994]. В этих исследованиях на материале железистого рака молочной 35 железы и плоскоклеточного рака полости рта показана взаимосвязь КВ AgЯОР-белков с важнейшими клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью больных. Пролиферация - основополагающий процесс в возникновении и развитии опухоли, а также фактор прогноза ее биологического поведения. На сегодняшний день существуют определенные трудности в достоверной оценке пролиферативного потенциала опухоли, так как пролиферация включает в себя не только количество пролиферирующих клеток (пролиферативная активность, фракция роста), но и скорость прохождения клеткой фаз митоза (продолжительность клеточного цикла). В настоящее время для оценки пролиферативной активности общепризнанным и доступным является иммуногистохимическое определение уровня антигена Ki-67, исследование Ag-ЯОРбелков является общепризнанным маркером скорости клеточного цикла. Munakata S. и Hendricks J.B. (1994) предложили метод двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки, позволяющий оценивать AgЯОР-белки (продолжительность клеточного цикла) в пролиферирующих клетках. В мировой литературе имеются единичные исследования, с использованием двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки, при раке молочной железы [Abboud P. et al., 2008; Kidogawa H. et al., 2005; Biesterfeld S. et al., 2001; Lorenzato M. et al., 2000], мочевого пузыря [Tomobe M. et al., 1999], толстой кишки [Nakamura S., 1998] и НМКРЛ [Bigras G. et al., 1996; Yamaguchi S., 1994]. Авторы этих исследований показали взаимосвязь количественного содержания Ag-ЯОР-белков в пролиферирующих клетках с клинико-морфологическими параметрами опухоли. Kidogawa H. с соавторами (2005) при раке молочной железы нашли увеличение количества Ag-ЯОРбелков в MIB-1 позитивных клетках в опухоли с наибольшим размером более 2 см по сравнению с опухолью менее 2 см. Tomobe M. с соавторами (1999) при раке мочевого пузыря нашли последовательное увеличение количества Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках в группах Т1, Т2, Т3. Nakamura S. (1998) нашел взаимосвязь типа роста и глубины инвазии в стенку при раке толстой кишки. Yamaguchi S. (1994) при НМКРЛ нашел увеличение количества Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при Т4 по сравнению с Т13 и при N 2, 3 по сравнению с N 0, 1. Также показана взаимосвязь количе- 36 ственного содержания Ag-ЯОР-белков в пролиферирующих клетках с выживаемостью больных при раке молочной железы [Abboud P. et al., 2008; Kidogawa H. et al., 2005; Biesterfeld S. et al., 2001; Lorenzato M. et al., 2000], мочевого пузыря [Tomobe M. et al., 1999] и НМКРЛ [Bigras G. et al., 1996]. Кроме того, предложено использовать показатель пролиферации в качестве интегральной оценки пролиферативного потенциала опухоли [Abboud P. et al., 2008; Lorenzato M. et al., 2000]. Показатель пролиферации определяется путем умножения средней площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках на ИМ Ki-67. Авторы, предложившие данный метод, нашли взаимосвязь показателя пролиферации с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью больных раком молочной железы. Таким образом, является актуальным исследование Ag-ЯОР-белков (ИП, КВ, площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках) во взаимосвязи с клинико-морфологическими и молекулярно-биологическими параметрами (пролиферативной активностью, апоптозом, ангиогенезом, мембранными рецепторами), а также выживаемостью больных и прогнозом при НМКРЛ. 1.2.2. Маркеры пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα) Изменение процесса пролиферации – основополагающий процесс в канцерогенезе и биологии рака, обуславливающий биологическое поведение новообразования - клиническое течение и прогноз. На сегодняшний день информативным, доступным и распространенным методом оценки уровня пролиферации является изучение пролиферативной активности (количества пролиферирующих клеток, фракции роста) на основании ИГХ выявления маркеров специфичных для определенных фаз клеточного цикла. Ki-67 – ядерный негистоновый белок, существующий в двух изоформах 359 и 320 кДа (в конкретной клетке существует только одна изоформа белка), кодируется одним геном MKI67 расположенным на длинном плече хромосомы 10 (10q25). Первоначально антиген Ki-67 был идентифицирован из ядерного экстракта клеточной линии лимфомы Ходжкина. Антиген Ki-67 удобный клеточный маркер пролиферации: экспрессия ограничена пролифе- 37 рирующими клетками, но количество белка в клетке непостоянно на протяжении клеточного цикла. Синтез белка Ki-67 наступает в середине фазы G1, затем в течение клеточного цикла нарастает, достигая максимума в метафазе и резко уменьшается в анафазе; в фазе G0 и начальной G1 антиген Ki-67 не определяется. Характеризуется коротким периодом полураспада – 60-90 минут. Внутриклеточная локализация Ki-67 также изменчива при переходе от одной фазы клеточного цикла к другой. В середине G1-фазы белок Ki-67 обнаруживается в ядрышках, в плотном фибриллярном компоненте - в местах, где отсутствует нуклеолин, нуклеофозмин и фибриллярин, и функционально не связан с этими белками. В последующие S- и G2-фазы белок Ki-67 определяется и в ядрышках, и в нуклеоплазме. После распада ядерной оболочки (в фазе митоза) распределение носит диффузный характер и повторяет рисунок ажурной сети конденсированного хроматина. В настоящее время функция белка Ki-67 в прогрессии клеточного цикла остается не совсем ясной. Выдвинуты две основные гипотезы относительно роли Ki-67: первая – является белком-регулятором клеточного цикла, вторая – ДНК-ассоциированным белком, участвуя в организации структуры ДНК. Методами молекулярной биологии установлено, что антиген Ki-67 связан с рибосомальной транскрипцией рРНК и ингибирование гена MKI Ki-67 приводит к остановке синтеза рРНК [Bullwinkel J., 2006; Rahmanzadeh R., 2007]. На сегодняшний день исчерпывающие данные о генетике, молекулярной биологии, строении и функции белка Ki-67 можно узнать в обзорах [Шацева Т.А, Мухина М.С., 2004; Brown D.C., 2002; Endl E., Gerdes J., 2000; Scholzen T., Gerdes J., 2000]. Маркер с успехом применяется в исследовательских и клинических целях при диагностике всех патологических процессов организма человека, сопровождающихся изменением пролиферативной активности, дифференциальной диагностике практически всех неоплазий и всех локализаций: толстой кишки, предстательной железы, молочной железы, шейки матки, яичника, мочевого пузыря, опухолях центральной нервной системы, печени, поджелудочной железы, почек, щитовидной железы, меланоме, пищеводе, желудке, саркомах различных локализаций и т.д. [Авдалян А.М., 2013; Наврузов С.Н. и соавт., 2012; Колотов К.А., Машковцев О.В., Бейн Б.Н., 2012; Лазарев А.Ф. и со- 38 авт., 2010; Авдалян А.М. и соавт., 2009; Иванцов А.О. и соавт., 2009; Соболева Ю.В., 2009; Юрин А.Г. 2009; Коган Е. А. с соавт., 2009, 2004; Кожемяко О.В, Соболева Ю.В., 2008; Панкратов В.А., Тен В.П., Горбань Н.А., 2007; Коваленко В.Л. и соавт., 2006, 2002; Кобяков Д.С., 2006]. На сегодняшний день существуют определенные трудности в интерпретации результатов ИГХ окрашивания антигена Ki-67 при НМКРЛ. Вопервых, в исследованиях используются гетерогенные группы НМКРЛ и различные антитела к антигену Ki-67 (клиническая и межлабораторная гетерогенность). Некоторые исследования проводились на ограниченных клиникоморфологических группах. В большинстве исследований используется клон MIB-1 в качестве первичных антител, однако, есть исследования в которых используются другие антитела. Во-вторых, в связи с внутриопухолевой гетерогенностью, при исследовании злокачественных новообразований и в частности при НМКРЛ [Warth A. et al., 2014; Jakobsen J.N. et al., 2013] не определено в каких участках опухоли производить подсчет Ki-67 положительных клеток. Рабочей группой по изучению рака молочной железы рекомендовано вести подсчет Ki-67-положительных клеток по всему срезу с вычислением среднего значения, не обращая специального внимания на «горячие» точки участки с повышенным ИМ Ki-67 [Dowsett M. et al., 2011]. Однако, в случаях, когда в опухоли наблюдается увеличение ИМ Ki-67 к краю опухоли, необходимо вести подсчет Ki-67-положительных клеток в области края опухоли, как в более биологически активной части опухоли. В противоположность этому, европейское общество нейроэндокринных опухолей (ENET) при нейроэндокринных опухолях желудка, кишечника и поджелудочной железы рекомендует вести подсчет Ki-67 положительных клеток в «горячих» точках с вычислением среднего значения по этим участкам [Klimstra D.S. et al., 2010]. В-третьих, в большинстве опухолей, и в частности при НМКРЛ, не определено пороговое значение ИМ Ki-67, на основании которого проводить разделение опухолей с низкой и высокой пролиферативной активностью. В случаях НМКРЛ средние значения, а также величина порогового значения ИМ Ki-67 весьма вариабельны и составляют: 5% [Yamashita S. et al., 2011; Inoue M. et al., 2008], 10% [Haga Y. et al., 2003; Woo T. et al., 2009; Carbognani P. et al., 2002], 20% [Tsubochi H. et al., 2006; David O. et al., 2004; Minami K. et 39 al., 2002; Rigau V. et al., 2002], 22,2% [Demarchi L.M.et al., 2000], 25% [Imai H. et al., 2009; Kaira K. et al., 2008; Ngyuen X.C.et al., 2007; Yang J. et al., 2006; Maddau C. et al., 2006], 27,8% [Carvalho et al., 2000], 30% [Carvalho P.E.et al., 2000; Hommura F. et al., 2000; Ngyuen V.N.et al., 2000] и до 52,8% при Пк [Warth A. et al., 2014]. Неизмененный эпителий бронха и альвеолы имеет низкую пролиферативную активность. По литературным данным экспрессия антигена Ki-67 в эпителии бронха составляет от 1% до 22%; Ki-67 положительные клетки определяются только в базальном и парабазальном слоях эпителия бронха, а в эпителии альвеол практически не выявляются. [Khojasteh M. et al., 2012; Kim E.S. et al., 2010; Miller Y.E. et al., 2007; Cohen L. et al., 2007; Meert A.P. et al., 2006; Fjellbirkeland L. et al., 2003; Hiroshima K. et al., 2002; Lee J.J. et al., 2001]. Также показано последовательно увеличение ИМ Ki-67 в ряду неизмененный эпителий бронха – метапластический эпителий - диспластический эпителий – НМКРЛ. В большинстве исследований в ряду клинико-морфологических параметров НМКРЛ найдена взаимосвязь экспрессии антигена Ki-67 с гистогенезом - при Пк по сравнению с Ак экспрессии антигена Ki-67 выше [Warth A. et al., 2014; Ahn H.K. et al., 2014; Niemiec J. et al., 2005; Haga Y. et al., 2003; Nguyen V.N. et al., 2000] и дифференцировкой – при снижении степени дифференцировки повышается экспрессия антигена Ki-67 [Werynska B. et al., 2011; Ludovini V. et al., 2008; Niemiec J. et al., 2005]. Однако, в некоторых исследованиях не найдена взаимосвязь экспрессии антигена Ki-67 с клиникоморфологическими параметрами НМКРЛ [Yoo J. et al., 2007; Fujita Y. et al., 2003]. В большинстве исследований, посвященных изучению антигена Ki-67 при НМКРЛ, авторы указывают на взаимосвязь повышенной экспрессии антигена Ki-67 с низким показателем выживаемости и неблагоприятным прогнозом [Tabata K. et al., 2014; Tsoukalas N. et al., 2014; Zhong X. et al., 2014; Ahn H.K. et al., 2014; Berghoff A.S. et al., 2014; Lei B. et al., 2013; Jakobsen J.N., Sоrensen J.B. et al., 2013; Sterlacci W. et al., 2012; Yamashita S. et al., 2011; López-Encuentra A. et al., 2001; Kaira K. et al., 2010; Woo T. et al., 2009; Ludovini V. et al., 2008; Kaira K. et al., 2008; Ulukus E.C. et al., 2007; Mohamed S. 40 et al., 2007; Nguyen X.C. et al., 2007; Tsubochi H. et al., 2006; Maddau C. et al., 2006; Huang C. et al., 2005; Kim S.J. et al., 2004; Haga Y. et al., 2003; Poleri C. et al., 2003; Gasinska A. et al., 2005; Takahashi S. et al., 2002; Pugsley J.M. et al., 2002; Rigau V. et al., 2002; Bubb R.S. et al., 2002], результаты меньшей части исследований показывают отсутствие взаимосвязи экспрессии антигена Ki-67 с выживаемостью и прогнозом [Werynska B. et al., 2011; Yan S. et al., 2010; Yoo J. et al., 2007; Maounis N.F. et al., 2006; Szelachowska J. et al., 2006; Yang J. et al., 2006; Szelachowska J. et al., 2004; David O. et al., 2004; Fujita Y. et al., 2003; Hilbe W. et al., 2003; Harpole D.H. et al., 2004; Cagini L. et al., 2000]. Однако, в некоторых исследованиях показана взаимосвязь повышенной экспрессии антигена Ki-67 с высоким показателем выживаемости и благоприятным прогнозом при Пк [Warth A. et al., 2014; Niemiec J. et al., 2005]. Martin B. с соавторами (2004) предоставили метанализ исследований, посвященных изучению антигена Ki-67 при НМКРЛ, согласно которому в 15 исследованиях из 37 исследований (41%) был показан негативный эффект повышенной экспрессии антигена Ki-67 для прогноза больных НМКРЛ. Суммарные данные 16 исследований (1863 больных), отобранных по критериям для метанализа, показали, что повышенная экспрессия антигена Ki-67 связана с плохой выживаемостью как при НМКРЛ, так и при отдельных гистогенетических типах – Ак и Пк. Топоизомераза IIα (TopoIIα) – белок с ферментативной активностью, массой 170 кДа, который кодируется геном ТОР2А, расположенным на 17q21-q22. Выделяют топоизомеразу 1 типа (мономер, функционирует при одноцепочечном разрыве ДНК) и топоизомеразу 2 типа (димер, функционирует при двуцепочечном разрыве ДНК), в каждом типе по две изоформы α и β. Активность TopoIIα зависит от фазы клеточного цикла - TopoIIα выявляется в клетках в S, G2, M фазы клеточного цикла, в связи с чем, является маркером пролиферативной активности [Beresford M.J., Wilson G.D., Makris A., 2006; Zhao H. et al., 2008; Doussis-Anagnostopoulou I.A. et al., 2009]. Морфофункциональные особенности TopoIIα обуславливают участие этого фермента в репликации, транскрипции, конденсации и сегрегации ДНК [Nitiss J.L. et al., 2009; Chang C. et al., 2003]. Исследование активности TopoIIα с успехом применяется в практиче- 41 ской онкологии для определения химиорезистентности опухоли, при определении риска развития метастазов и прогнозе [Тарасова М.В. и соавт., 2009; Соболева Ю.В., 2009; Петров С.В. и соавт., 2007]. TopoIIα является мишенью для таких химиопрепаратов как антрациклин и этопозид. Изменения в гене ТОР2А (амплификации и/или делеции) взаимосвязаны с чувствительностью опухоли к препаратам ингибиторам TopoIIa [Du Y. et al., 2011; Jarvinen T.A., Liu E.T., 2006]. Причем в качестве предиктивного фактора для химиотерапии антрациклинами предпочтительнее ИГХ метод оценки белка TopoIIa по сравнению с исследованием изменений в гене ТОР2А [Schindlbeck C. et al., 2010]. Показано, что повышенная экспрессия белка TopoIIα приводит к лучшим результатам в ответ на химиотерапию антрациклинами, а также к более короткой выживаемости больных [Авдалян А.М., 2013; Авдалян А.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. 2011]. По литературным данным экспрессия белка TopoIIα в эпителии бронха крайне низкая и/или вообще не определяется [Giaccone G. et al., 1995]. При НМКРЛ повышенная экспрессия белка TopoIIα определяется от 22% до 52% [Коган Е. А. с соавт., 2009, 2004; Соболева Ю.В., 2009; Кожемяко О.В, Соболева Ю.В., 2008; Zhu W.Y. et al., 2012; Erguden H.С. et al., 2012; Yan S. et al., 2010; Woenckhaus M. et al., 2008; Li C. et al., 2005; Dingemans A.C. et al., 2001; Langendijk H. et al., 2000]. Из всех клинико-морфологических параметров НМКРЛ найдена взаимосвязь повышенной экспрессии белка TopoIIα с показателем N [Woenckhaus M. et al., 2008] и дифференцировкой [Li C. et al., 2005]. Однако, в некоторых исследованиях не найдена взаимосвязь повышенной экспрессии белка TopoIIα с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ [Erguden H.С. et al., 2012; Yan S. et al., 2010]. Результаты исследований, посвященных изучению белка TopoIIα при НМКРЛ, носят противоречивый характер, относительно взаимосвязи экспрессии белка TopoIIα с выживаемостью больных и прогнозом. В одной части исследований показана взаимосвязь высокой экспрессии белка TopoIIα с низким показателем выживаемости и неблагоприятным прогнозом [Dingemans A.C. et al., 2001], в другой - наоборот, с высоким показателем выживаемости и благоприятным прогнозом [Yan S. et al., 2010], в третьей части исследований не выявлена взаимосвязь экспрессии белка TopoIIα с вы- 42 живаемостью больных и прогнозом НМКРЛ [Zhu W.Y. et al., 2012; Erguden H.С. et al., 2012; Woenckhaus M. et al., 2008; Langendijk H. et al., 2000]. Таким образом, актуальным является исследование маркеров пролиферативной активности (Ki-67, ТороIIα) во взаимосвязи с клинико- морфологическими и молекулярно-биологическими параметрами, выживаемостью больных и прогнозом НМКРЛ. 1.2.3. Маркеры апоптоза (p53, bcl-2 и bax). Баланс между пролиферацией и гибелью клеток является основополагающим процессом в развитии и жизнедеятельности организма. Апоптоз – это программируемый вид гибели клетки, имеющий отличия (генетические, молекулярно-биологические и морфологические) от других видов гибели клетки: некроза, аутофагии и старения. Каспазы (цистеин-зависимые аспартат-специфические протеазы) играют центральную роль в механизме апоптоза. Известны три пути активации каспаз: 1. внутренний или митохондриальный путь, 2. внешний или рецептор-зависимый путь, 3. общий или эффекторный путь апоптоза. При митохондриальном пути активации апоптотические стимулы (гипоксия, повреждение ДНК) приводят к снижению митохондриального мембранного потенциала, транслокации белков bax и bak из митохондрий в цитоплазму и их последующей олигомеризации [Wei M.C. et al., 2001; Hajra K.M., Liu J.R., 2004]. Олигомеры bax/bak встраиваясь в наружную митохондриальную мембрану приводят к перемещению проапоптотических малых молекул, наиболее значимый из них - цитохром С, из межмембранного митохондриального пространства в цитоплазму. Этот процесс регулируется белками относящимися к семейству bcl-2. Выделяют две группы белков семейства bcl-2: проапоптотические белки (bax, bak, bad, bclXs, bid, bik bim, hrk), стимулирующие высвобождение проапоптотических малых молекул из митохондрий, и антиапоптотические (bcl-2, bcl-XL, bcl-W, bfl-1, mcl-1), блокирующие высвобождение проапоптотических малых молекул из митохондрий. В цитоплазме цитохром С формирует апоптосому (цитохром С, Apaf-1, каспаза 9), которая активирует каспазу 3 [Acehan D. et al., 2002]. При рецептор-зависимом пути активации апоптоза специфические ли- 43 ганды активируют рецепторы «смерти», наиболее изученным среди них является TNFR1 (Tumor Necrosis Factor Receptor 1) и лиганды TNF и Fas. При активации рецептора лигандом, происходит активация внутриклеточного домена смерти и каспазы 8, которая активирует каспазу 3 [Walczak H., Krammer P.H., 2000]. Внутренний и внешний пути соединяются в эффекторном пути – каспаза 3 взаимодействует с субстратами: каспаз-активируемым ингибитором ДНКазы (inhibitor of caspase-activated DNase - ICAD) и полимеразой (poly(ADP-ribose) polymerase - PARP), что приводит к нуклеосомной фрагментации ДНК. В противоположность апоптотическому существует и антиапоптотический путь, предотвращающий апоптоз. Антиапоптотические белки (в основном bcl-2 и bcl-XL) предотвращают транслокацию bax. за счет олигомеризации с этим белком. Белок р53 активирует механизм апоптоза двумя путями: транскрипционно-зависимым – через активацию транскрипции генов, например, гена bax и транскрипционно-независимым – белок р53 транслоцируется из ядра в цитоплазму, взаимодействует с белками bcl-2 и bcl-XL в митохондриях и активирует олигомеризацию Bax/Bak [Chipuk J.E. et al., 2004; Mihara M. et al., 2003]. Р53. Ген TР53 (Tumor Protein 53) расположен на хромосоме 17 (17p13.1), кодирует ядерный фосфопротеин массой 53 кДа. Белок р53 - фактор транскрипции, контролирует пролиферацию через регуляцию сверочной точки G1/S перед синтезом ДНК, путем активации циклин-зависимых киназ. Белок р53 регулирует функцию большого количества генов (более 100), которые контролируют ключевые супрессивные функции – остановка клеточного цикла, ДНК репарация, старение и апоптоз. При повреждении ДНК (радиация, химические вещества, канцерогены), активации онкогенов, гипоксии р53 индуцирует репарацию ДНК или апоптоз клетки, активируя регуляторные гена, такие как р14, mdm2 [Лисачев П.Д., Пустыльняк В.О., Штарк М.Б., 2014; Воропаева О.Ф. и соавт., 2014]. Р53 - это один из наиболее изучаемых маркеров клетки и привлекает внимание исследователей многих специальностей, как при изучении канцерогенеза, так и во взаимосвязи с прогнозом, показателями опухолевой прогрессии и ответа на терапию [Лоскутова К.С. и соавт., 2014; Авдалян А.М., 2013; Плосконос М., Николаев А.А., 2013; Пак Л.Б. и соавт., 2013; Наврузов С.Н. 44 и соавт., 2012; Колотов К.А., Машковцев О.В., Бейн Б.Н., 2012; Бабиченко И.И., Самойлов М.В., Кудрявцева Л.В., 2012; Барышников А.Ю. и соавт., 2011; Аничков Н.М, Чупров И.Н., 2011; Казаков С.П., 2010; Наврузов С.Н. и соавт., 2010; Авдалян А.М. и соавт., 2009; Коган Е. А. и соавт., 2009, 2004; Иванцов А.О. и соавт., 2009; Соболева Ю.В., 2009; Юрин А.Г., 2009; Поддубная И.В. и соавт., 2009; Глухов А.И. и соавт., 2009; Бабиченко И.И. и соавт., 2008; Соболева Ю.В., Кожемяко О.В., 2008; Панкратов В.А., Тен В.П., Горбань Н.А., 2007; Рябчикова Е.И. и соавт., 2003]. В онкопатологии исследование р53, как фактора прогноза, включает исследование гена ТР53 на предмет мутаций (методом ДНК секвенирования или методом одноцепочечного конформационного полиморфизма) или белка (методом ИГХ) в ткани опухоли. ТР53 самый часто мутирующий ген при НМКРЛ. Мутация гена ТР53 предотвращает связывание белка р53 с mdm2 и дальнейший убиквитин-зависимый протеолиз. Также, мутация гена ТР53 приводит к стабилизации белка р53 и возможности его ИГХ визуализации. В неизменной ткани «дикий» тип р53 не визуализируется ИГХ методом, так как период его полураспада крайне короткий. Данный факт подтверждается тем, что в большинстве исследований не найдено экспрессии р53 в эпителии бронха и альвеолы [Porebska I. et al., 2006; Walker C. et al., 1994]. Однако, в единичных исследованиях сообщается о возможности ИГХ визуализации в эпителии бронха до 10% [Walker C. et al., 1994]. По мнению большинства исследователей ИМ р53=10% является пороговым значением для оценки экспрессии маркера. ИГХ экспрессия р53 менее 10% выявляет «дикий» тип р53, а более 10% - мутантный, стабилизированный тип [Breuer R.H. et al., 2003; Brambilla E. et al., 1998]. Положительная экспрессия белка р53 выявляет 70% мутаций гена ТР53, которые относятся к миссенс-мутациям и не обнаруживает 20–30% нонсенс-мутаций и делеций гена ТР53. Возможна положительная экспрессия белка р53 и при отсутствии изменений в гене ТР53, например при повышенной экспрессии белка р14, которая приводит к секвестрации белка mdm-2 и стабилизации белка р53 [Midgley C.A, Lane D.P., 1997]. По литературным данным при НМКРЛ положительная экспрессия белка р53 определяется от 22% до 79% случаев [Ahn H.K. et al., 2014; Porebska I. 45 et al., 2006; Shabnam M.S. et al., 2004; Gregorc V. et al., 2003; Hwang J.H. et al., 2001]. В большинстве исследований найдена взаимосвязь положительной экспрессии белка р53 с гистогенезом – выше при Пк по сравнению с Ак [Jeong S.H. et al., 2008; Ohmura Y. et al., 2000; Grossi F. et al., 2003; Laudanski J. et al., 2001]. Однако, другие исследователи не находили взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ [Porebska I. et al., 2006]. Прогностическая значимость положительной экспрессии белка р53 не вполне определена. Примерно в половине исследований, посвященных изучению белка р53 при НМКРЛ, выявлена взаимосвязь положительной экспрессии с низким показателем выживаемости больных и неблагоприятным прогнозом [Ahn H.K. et al., 2014; Tsubochi H. et al., 2006; Maddau C. et al., 2006; Grossi F. et al., 2003; Han H. et al, 2002; Bubb R.S. et al., 2002; Moldvay J. et al, 2000; Langendijk H. et al., 2000], в другой половине исследований не выявлено никакой взаимосвязи [Mohamed S. et al., 2007; Ulukus E.C. et al., 2007; Shibata Y. et al., 2004; Gregorc V. et al., 2003; Tomita M. et al., 2003; Lai R.S. et al., 2002; Cagini L. et al., 2000]. Помимо оригинальных исследований в мировой литературе представлены метанализы исследований гена ТР53 и белка р53 при НМКРЛ. Mitsudomi T. С соавторами (2000) на данных метанализа 43 статей, показали что при НМКРЛ частота мутаций и делеций гена ТР53 составляет 37%, а частота положительной экспрессии белка р53 – 48%. Частота мутаций гена ТР53 и положительная экспрессия белка р53 при Ак (соответственно 34% и 36%) была ниже по сравнению с Пк (соответственно 52% и 54%). Мутации и делеции гена ТР53 являются неблагоприятным фактором прогноза только при Ак. Метанализ 74 статей проведенный Steels E. с соавторами (2001) был категоризирован по гистогенезу, стадии, типу лечения больных НМКРЛ, а также методу исследования. Авторы показали, что мутации и делеции гена ТР53, положительная экспрессия белка р53 являются неблагоприятным фактором прогноза при всех стадиях НМКРЛ, а также при Ак и Пк. Всl2. Ген bсl-2 (B-Cell Lymphoma) расположен на 18 хромосоме (18q21.3), кодирует белок массой 25 кДа. Белок bсl-2 локализуется на внутренней митохондриальной мембране, эндоплазматическом ретикулуме, ядерной мембране (перинуклеарной зоне) и даже в митотических хромосомах. 46 Является супрессором апоптоза (путем олигомеразции bax/bсl-2), и соответственно, его основное действие – пролонгировать жизнь клетки при остановке в G0, G1 фазах клеточного цикла. Впервые ген bcl-2 был обнаружен в В-клеточной фолликулярной лимфоме при хромосомной перестройке t(14;18), в результате которой ген bсl-2 попадает под транскрипционно активный локус тяжелых цепей иммуноглобулина, что приводит к повышению синтеза белка bсl-2. Впоследствии повышенное содержание белка bсl-2 было найдено также и при большинстве солидных опухолей. Вместе с тем, нет единого мнения об экспрессии белка bcl-2 и связи с некоторыми молекулярно-биологическими и клиникоморфологическими параметрами при новообразованиях различных локализаций у человека. В целом работы по изучению экспрессии белка bcl-2 в опухолях человека отвечают на два основных вопроса: роль в онкогенезе и влияние на прогноз [Казаков С.П., 2010; Заботина Т.Н., Казаков С.П., Кушлинский Н.Б., 2010; Петров С.Б., Антонеева И.И., 2008]. Были получены данные, что для целого ряда опухолей различной тканевой принадлежности и практически любой локализации существует корреляция между экспрессией bcl-2 и прогнозом [Авдалян А.М., 2013; Наврузов С.Н. и соавт., 2012; Барышников А.Ю. и соавт., 2011; Аничков Н.М, Чупров И.Н., 2011; Авдалян А.М. и соавт., 2009; Kaye P. V. et al., 2005]. На сегодняшний день при НМКРЛ белок bcl-2 является самым изученным из всех белков семейства bcl-2. По литературным данным экспрессия белка bcl-2 в эпителии бронха ограничивается слоем базальных клеток и составляет менее 10 % [Porebska I. et al., 2006; Walker C. et al., 1995]. Являясь антиапоптотическим белком, bcl-2 предотвращает гибель недифференцированных стволовых клеток бронхиального эпителия. По данным мировой литературы при НМКРЛ положительная экспрессия белка bcl-2 определяется в от 5% до 46% [Porebska I. et al., 2006; Ludovini V. et al., 2004; Shibata Y. et al., 2004; Hwang J.H. et al., 2001; Cagini L. et al., 2000]. Взаимосвязь положительной экспрессии белка bcl-2 с клиникоморфологическими параметрами НМКРЛ показана преимущественно для гистогенеза - в большем количестве случаев при Пк по сравнению с Ак [Shibata Y. et al., 2004; Kren L. et al., 2004; Grossi F. et al., 2003; Poleri C. et al., 47 2003; Hanaoka T. et al., 2002; Lai R.S. et al., 2002; Hanaoka T. et al., 2002; Nguyen VN. et al., 2000; Apolinario R.M. et al., 1997] и показателя N - в большем количестве случаев при отсутствии метастазов в регионарные лимфатические узлы по сравнению с наличием метастазов [Groeger A.M. et al., 2004; Ohmura Y. et al., 2000]. Однако, в некоторых исследованиях не найдена взаимосвязь положительной экспрессии белка bcl-2 с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ [Porebska I. et al., 2006]. Взаимосвязь положительной экспрессии белка bcl-2 с биологическим поведением НМКРЛ (выживаемость больных, прогноз заболевания) также остается дискутабельной в доступной литературе. Примерно в половине исследований выявлена взаимосвязь положительной экспрессии белка bcl-2 с высоким показателем выживаемости больных и благоприятным прогнозом при НМКРЛ [Biesaga B. et al., 2014; Yoo J. et al., 2007; Ludovini V. et al., 2004; Kren L. et al., 2004; Tomita M. et al., 2003; Moldvay J. et al., 2000; Apolinario R.M. et al., 1997], в другой половине исследований не выявлено никакой взаимосвязи [Ulukus E.C. et al., 2007; Yaren A. et al., 2006; Han H. et al., 2002; Gregorc V. et al., 2003; Hilbe W. et al., 2003; Grossi F. et al., 2003; Shibata Y. et al., 2004; Hanaoka T. et al., 2002; Bubb R.S. et al., 2002; Rigau V. et al., 2002; Lai R.S. et al., 2002; Nguyen VN. et al., 2000; Langendijk H. et al., 2000; Cagini L. et al., 2000]. Однако, в некоторых исследованиях показана взаимосвязь положительной экспрессии белка bcl-2 с низким показателем выживаемости больных и неблагоприятным прогнозом при НМКРЛ [Groeger A.M. et al., 2004; Poleri C. et al., 2003; Hwang J.H. et al., 2001]. В доступной литературе имеется один метанализ исследований, посвященных изучению белка bcl-2 при НМКРЛ. Martin B. с соавторами (2003) провели метанализ публикаций с 1993 по 1999 годы, в которых изучалась экспрессия белка bcl-2. При НМКРЛ положительная экспрессия белка Bcl-2 наблюдалась в среднем в 35% случаев, при Ак чаще по сравнению с Пк (соответственно 61% и 32%). 21 исследование (публикация) были включены в метанализ: в 10 исследованиях было показано, что положительная экспрессия белка bcl-2 связана с более длительной выживаемостью больных НМКРЛ, в 10 исследованиях не было выявлено взаимосвязи с выживаемостью и в одном исследовании былапоказана связь с более короткой выживаемостью больных 48 НМКРЛ. На основании суммарных данных 18 исследований (2909 больных НМКРЛ) было показано, что положительная экспрессия белка bcl-2 является благоприятным прогностическим фактором. Вах. Ген bах (bcl-2-associated X protein) расположен на 19 хромосоме (19q13.3), кодирует белок массой 21 кДа. Белок bax – один из основных регуляторов проапоптического пути. Является активатором апоптоза путем олигомеразции bax/bak, и соответственно, его основное действие – запуск митохондриального пути апоптоза. В отличие от белка bcl-2 литературные сведения об экспрессии белка bax менее многочисленны и противоречивы [Плосконос М., Николаев А.А., 2013; Барышников А.Ю. и соавт., 2011; Булычева И.В. и соавт., 2010; Петров С.Б., Антонеева И.И., 2008]. По литературным данным экспрессия белка bax в эпителии бронха определяется по всей толщине эпителиального пласта, таким образом, определяя вероятность апоптоза дифференцированных бронхиальных эпителиоцитов [Porebska I. et al., 2006; Brambilla E. et al., 1998]. Однако, реализация процесса апоптоза является следствием соотношения большого количества про- и антиапоптотических факторов, а не активностью одного белка. По литературным данным при НМКРЛ положительная экспрессия белка bax определяется от 23 до 87% случаев [Jeong S.H. et al., 2008; Tanaka R. et al., 2006; Milas I. et al., 2003; Gessner C. et al., 2002]. В большинстве исследований найдена взаимосвязь положительной экспрессии белка bax с гистогенезом - выше при Ак по сравнению с Пк [Jeong S.H. et al., 2008; Porebska I. et al., 2006; Mori S. et al., 2004; Apolinario R.M. et al., 1997]. Однако, в некоторых исследованиях не найдена взаимосвязь положительной экспрессии белка bax с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ [Milas I. et al., 2003; Hanaoka T. et al., 2002]. Также не ясна взаимосвязь экспрессии белка bax с выживаемостью больных и прогнозом НМКРЛ. Одни исследователи выявляют взаимосвязь положительной экспрессии белка bах с благоприятным прогнозом и высоким показателем выживаемости больных [Jeong S.H. et al., 2008; Gessner C. et al., 2002], другие не находят взаимосвязи с выживаемостью больных и прогнозом НМКРЛ [Ulukus E.C. et al., 2007; Yaren A. et al., 2006; Tanaka R. et al., 2006; Groeger A.M. et al., 2004; Krug L. et al., 2003; Hanaoka T. et al., 2002; 49 Apolinario R.M. et al., 1997]. Таким образом, является актуальным исследование маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) во взаимосвязи с клинико-морфологическими и молекулярно-биологическими параметрами, а также выживаемостью больных и прогнозом при НМКРЛ. 1.2.4. ПМЦР-Г и ПМЦР-Л Ангиогенез (неоваскуляризация) – процесс формирования новых сосудов, происходящий при развитии организма и при патологических процессах. В зависимости от вида сосудов ангиогенез подразделяется на гемангиогенез (процесс формирования новых кровеносных сосудов) и лимфангиогенез (процесс формирования новых лимфатических сосудов). Лимфатические сосуды структурно и функционально отличаются от кровеносных сосудов: стенка лимфатических сосудов более тонкая, в лимфатических капиллярах отсутствуют перициты и гладкомышечные клетки, в связи с этим стенка лимфатических капилляров напрямую соединена с внеклеточным матриксом коллагеновыми и ретикулярными волокнами, цитоплазма эндотелиоцитов менее плотная, базальная мембрана прерывистая, просвет лимфатических сосудов примерно в три и более раза больше, часто коллабирован и неправильной формы. Ангиогенез имеет фундаментальное значение для роста и распространения новообразований различных локализаций. Не только связь с опухолевой прогрессией заставляет исследователей активно изучать степень ангиогенеза. В настоящее время в эпоху развития таргетных препаратов одной из мишеней для такого рода лечения логично являются сосуды опухоли – как кровеносные, так и лимфатические [Имянитов Е.Н., 2014; Коненков В.И., Бородин Ю.И., Бгатова Н.П., 2011; Жуков Н.В. 2007; Hansen T.F. et al., 2010; Beecken W.D. et al., 2000]. Гемангиогенез. Концепция опухолевого гемангиогенеза была сформулирована в 1971 группой ученых из Израиля и поддержана большинством исследователей [Folkman J., 1994]. Долгое время считалось, что опухолевые клетки являются самодостаточными. Однако, Folkman J. было доказано, что при достижении опухолью размера 2 мм клетки, составляющие ее, испыты- 50 вают недостаток в кислороде и питательных веществах, что приводит к активации неоангиогенеза. Эти наблюдения легли в основу создания концепции опухолевого гемангиогенеза. Суть ее сводится к тому, что если трансформированные клетки не продуцируют факторов, способствующих эффективному формированию интратуморальной сосудистой сети, новообразование не может достичь размеров, превышающих в диаметре 2 мм. Значимые неоплазмы возникают лишь в тех случаях, когда процесс злокачественной трансформации сопровождается не только самопроизвольным делением клеток, утратой их способности к апоптозу, инвазией, метастазированием, но и секрецией гуморальных стимуляторов ангиогенеза, обеспечивающих адекватную оксигенацию нарастающей опухолевой массы. Ключевым моментом является продукция митогенных факторов опухолевой клеткой. Известно, что в условиях гипоксии происходит накопление транскриптомных факторов, индуцируемых гипоксией, – HIF (HIF-1α и HIF-1β). Их комплекс проникает в ядро, связывается с соответствующим HIF-ответственным участком и изменяет транскрипцию многих генов, в том числе генов сосудистого эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor – VEGF-A и VEGF-В), фактора роста фибробластов (fibroblast growth factors – FGF), трансформирующего фактора роста-β (transforming growth factor – TGF-β) и других [Харченко Е.П., 2013; Коненков В.И., Бородин Ю.И., Бгатова Н.П., 2011; Банин В.В., 2006; Patel P.H. et al., 2006; Gupta M.K., Qin R.Y., 2003]. Молекулярный механизм действия факторов гемангиогенеза инициируется через рецепторы сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR-1 и VEGFR-2), при участии рецепторных тирозинкиназ (receptor tyrosine kinases – RTK) и заканчивается активацией митоген активируемой протеин киназы (MAP), экстраклеточной регуляторной киназы (ERK) и других сигнальных путей. В настоящее время связь степени кровоснабжения с прогнозом больных с новообразованиями различных локализаций широко обсуждается в литературе, однако единого мнения в данном аспекте нет. Большинство авторов считает, что одним из основных неблагоприятных прогностических критериев является высокий уровень кровоснабжения, коррелирующий с риском развития метастазов. Такие данные были получены при исследовании сосудов в раке молочной железы, эндометрия, желудка, легкого, кожи, гипофиза, пред- 51 стательной железы, плоскоклеточной карциномы полости рта, колоректальном раке, меланоме и лейомиоме, саркоме [Хлебникова А.Н., Новоселова Н.В., 2014; Адамян Л.В. и соавт., 2014; Лысенко О.В. и соавт., 2014; Авдалян А.М., 2013; Колесник А.П. и соавт., 2013; Лапшина А.М., Воронкова И.А., Марова Е.И., 2013;Лазарев А.Ф. и соавт., 2010; Коган Е.А. и соавт., 2009, 2004; Козаченко В.П. и соавт., 2006; Лазарев А.Ф. и соавт., 2008; Авдалян А.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., 2008; Авдалян А.М. и соавт., 2010; Пржияловская Е.Г. и соавт., 2010; Коваленко В.Л. и соавт., 2006; Avdalyan A., Lazarev A., Bobrov I., Klimatchev V., 2012]. Пролиферация и соответственно обновление эндотелиального слоя сосудов в норме у человека крайне низкие. Однако, эндотелиальные клетки при гемангиогенезе в опухолевой ткани показывают уровень пролиферации в 202000 раз больший по сравнению с нормальной тканью. В неизмененной ткани альвеол определяется максимально высокая ПМЦР-Г в связи со специфической газотранспортной функцией. В неизмененной ткани бронха определяется невысокая (минимальная) ПМЦР-Г, которая последовательно возрастает в ряду метапластических, диспластических изменений эпителияй достигая максимальных значений при НМКРЛ [Meert AP. et al., 2007; Hiroshima K. et al., 2002; Keith R.L. et al., 2002; Fontanini G. et al., 1999, 1996]. По данным мировой литературы прослеживается взаимосвязь высокой ПМЦР-Г с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ. Kuang B.H. с соавторами (2013) показали взаимосвязь высокой ПМЦР-Г при НМКРЛ с лимфогенным и гематогенным метастазированием (показателями N и M). Колесник А.П. и соавторы (2013) показали взаимосвязь высокой ПМЦР-Г при НМКРЛ с наибольшим размером опухолевого узла. Ushijima C. с соавторами (2001) показали взаимосвязь высокой ПМЦР-Г с показателями Т и N, а также стадией заболевания. Ozbudak I.H. с соавторами (2009) показали, что ПМЦР-Г выше при Ак по сравнению с Пк, однако в исследовании Lee C.H. с соавторами (2003) найдены противоположные результаты. В то же время имеются исследования в которых не найдена взаимосвязь ПМЦР-Г с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ [Mineo T.C. et al., 2004]. Также неоднозначные результаты получены при изучении взаимосвязи показателей ПМЦР-Г и выживаемостью больных НМКРЛ, прогнозом заболе- 52 вания. Одна часть опубликованных исследований приводит данные о взаимосвязи высокой ПМЦР-Г с неблагоприятным прогнозом и низким показателем выживаемости больных НМКРЛ [Колесник А.П. и соавт., 2013; Lu M. et al., 2014; Tang H. et al., 2014; Lu M. et al., 2014; Kuang BH. et al., 2013; Wu S. et al., 2012; Li SH. et al., 2011; Anagnostou VK. et al., 2011; Kadota K. et al., 2008; Yoo J. et al., 2007; Zhu ZH. et al., 2005; Mineo TC. et al., 2004], другая часть исследований сообщает об отсутствии такой взаимосвязи [Sardari Nia P. et al., 2010; Kim S.J. et al., 2010; Donnem T. et al., 2007; Wang Y. et al., 2006; Chen F. et al., 2004; Lee C.H. et al., 2003]. Однако, имеются исследования в которых показана взаимосвязь высокой ПМЦР-Г с благоприятным прогнозом и высоким показателем выживаемости больных НМКРЛ [Berghoff AS. et al., 2014; Kreuter M. et al., 2009]. Meert A.P. с соавторами (2002) провели метанализ публикаций до 2001 года, в которых изучалась ПМЦР-Г при НМКРЛ. В данном метанализе приводятся данные 14 исследований (1866 больных НМКРЛ) с использованием антител к фактору VIII, 10 исследований (1440 больных НМКРЛ) с использованием антител к CD34 и 8 исследований (1093 больных НМКРЛ) с использованием антител к CD31. Суммарные данные метанализа показали негативное прогностическое значение высокой ПМЦР-Г при НМКРЛ. При изучении ПМЦР-Г с использованием антител к CD34 прослежено негативное прогностическое значение высокой ПМЦР-Г в 6 исследованиях и отсутствие - в 4 исследованиях. Однако, в следующем метанализе, который провели Trivella M. с соавторами (2007) на основании 17 исследований (2719 больных НМКРЛ), не найдена взаимосвязь ПМЦР-Г с выживаемостью больных и прогнозом при НМКРЛ. Лимфангиогенез - процесс образования новых лимфатических сосудов, под воздействием факторов роста. В настоящее время отмечается значительный интерес к опухолевому лимфангиогенезу, в связи с открытием лиганд-рецепторных взаимосвязей и специфических лимфангиогенных механизмов [Коненков В.И., Бородин Ю.И., Бгатова Н.П., 2011; Миннебаев М.М. и соавт., 2006; Stacker SA. et al., 2014; Alitalo A, Detmar M. et al., 2012; Duong T, Koopman P, Francois M. et al., 2012; Christiansen A1, Detmar M. et al., 2011]. Для лимфангиогенеза специфическими факторами роста являются 53 VEGF-C и VEGF-D [Enholm B. et al., 2001; Rissanen TT. et al., 2003], а рецепторами - рецепторы сосудистого эндотелиального фактора роста (преимущественно VEGFR-3 и в меньшей степени VEGFR-2). Помимо VEGFR-3 и VEGFR-2, VEGF-C способен специфически взаимодействовать с нейропилином-2 и α9β1-интегрином, которые также присутствуют на поверхности эндотелиоцитов лимфатических сосудов. Ранее считалось, что лимфогенное метастазирование представляет собой лишь пассивный процесс, при котором опухолевые клетки, случайно попав в лимфатические сосуды, имеющиеся вблизи первичного опухолевого очага, с током лимфы заносятся в лимфатические узлы. Однако данные последних лет убедительно свидетельствуют, что стимуляция лимфангиогенеза и последующая интравазация опухолевых клеток в лимфатические сосуды являются важным условием для метастазирования в лимфатические узлы. Возможны два пути лимфогенной диссеминации опухолевых клеток: либо через лимфатические капилляры, предсуществующие в окружении опухолевого узла, либо через лимфатические капилляры, которые формируются внутри него. Вопрос о функциональной значимости интратуморальных лимфатических капилляров до сих пор остается дискуссионным. Предполагалось, что интратуморальные лимфатические капилляры не могут участвовать в транспорте опухолевых клеток с лимфотоком, поскольку они находятся в сдавленном состоянии из-за повышенного гидростатического давления внутри опухоли [Fukumura D. et al., 2010; Padera T. et al., 2002]. Однако, в ряде работ сообщается о выявлении взаимосвязи между интратуморальной ПМЦР-Л и наличием метастазов в лимфатических узлах и/или неблагоприятным прогнозом. Так, показано, что высокое значение ПМЦР-Л взаимосвязано с низким показателем выживаемости и негативным прогнозом при злокачественных новообразованиях различной локализации: молочной железы [Lee JA. et al., 2011], эндометрия [Weber SK. et al., 2012], яичника [Li L. et al., 2009], пищевода [Chen B. et al., 2014], желудка [Donizy P. et al., 2014], толстой кишки [Caie PD. et al., 2014]. На сегодняшний день для оценки лимфангиогенеза в онкоморфологии широко используется метод иммуногистохимии, позволяющий выявлять высокоспецифичные антигены - LYVE-1, подопланин и Prox-1. LYVE-1 54 (lymphatic endothelium hyaluronate receptor) - рецептор гиалуроновой кислоты эндотелиоцитов лимфатических сосудов. Большая часть исследований, посвященных изучению лимфангиогенеза в опухолевой ткани, была проведена с применением анти-LYVE-1 антител. Однако, снижение экспрессии LYVE-1 в некоторых тканях при воспалительных реакциях, а также отсутствие этого маркера в отдельных опухоль-ассоциированных эндотелиоцитах лимфатических сосудов показывает, что для более адекватной оценки лимфангиогенеза необходимо использовать LYVE-1 в комбинации с другими маркерами [Van der Auwera I. et al., 2006]. Подопланин – мембранный мукопротеин, массой 38 кДа, впервые обнаруженный на поверхности подоцитов, экспрессия подопланина контролируется фактором транскрипции Prox-1 [Breiteneder-Geleff S. et al., 1999]. Подопланин играет роль в адгезии и миграции эндотелиоцитов лимфатических сосудов [Schacht V. et al., 2003]. Prox-1 - фактор транскрипции эндотелиоцитов лимфатических сосудов. В настоящее время в патогистологической практике при исследовании опухолевого лимфангиогенеза рекомендуется использовать антитела D2-40, которые выявляют резистентный к фиксации эпитоп подопланина с высокой специфичностью и чувствительностью [Evangelou E. et al., 2005]. В исследованиях, посвященных изучению лимфангиогенеза при НМКРЛ, сообщается о взаимосвязи данного процесса с клинико- морфологическими параметрами, такими как: показатель N - высокая ПМЦРЛ чаще наблюдается при наличии метастазов в лимфатические узлы по сравнению с отсутствием метастазов [Hu Z. et al., 2012; Zhang BC. et al., 2012; Jin S. et al., 2012; Feng Y. et al., 2010; Guo X. et al., 2009; Takanami I., 2006; RenyiVamos F. et al., 2005], гистогенез - при Пк по сравнению с Ак выше ПМЦР-Л [Min KH. et al., 2011; Kadota K. et al., 2010], дифференцировка – высокая ПМЦР-Л характерна для умеренной и низкой дифференцировки по сравнению с высокой [Hu Z. et al., 2012; Iwakiri S. et al., 2009]. Однако, в некоторых работах не найдено взаимосвязи ПМЦР-Л с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ [Li M. et al., 2010; Faoro L. et al., 2008]. Данные мировой литературы указывают на взаимосвязь высокой ПМЦР-Л с неблагоприятным прогнозом и низким показателем выживаемости НМКРЛ [Hu Z. et al., 2012; Zhang BC. et al., 2012; Anagnostou VK. et al., 55 2011; Kadota K. et al., 2010, 2008; Chen X. et al., 2010; Donnem T. et al., 2010; Iwakiri S. et al., 2009; Guo X. et al., 2009; Sun JG. et al., 2009; Donnem T. et al., 2007; Wang Y. et al., 2006; Okudera K. et al., 2006; Renyi-Vamos F. et al., 2005; Kojima H. et al., 2005; Arinaga M. et al., 2003]. Однако, в некоторых исследованиях не обнаружено взаимосвязи между ПМЦР-Л и выживаемостью больных, прогнозом при НМКРЛ [Faoro L. et al., 2008]. Wang J. с соавторами (2012) провели метанализ публикаций проведенных до 2012 года, в которых изучалась ПМЦР-Л при НМКРЛ. В метанализ было включено 10 исследований (1426 больных НМКРЛ) и на основании суммарных данных показано негативное прогностическое значение высокой ПМЦР-Л при НМКРЛ, причем в 5 исследованиях с использованием антител D2-40. Таким образом, является актуальным исследование гемангио- и лимфангиогенеза во взаимосвязи с клинико-морфологическими и молекулярнобиологическими параметрами, а также выживаемостью больных и прогнозом при НМКРЛ. 1.2.5. Статус белка и гена Her2 Ген ERBB2 (Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog 2) расположен на 17 хромосоме (17q12), кодирует белок массой 185 кДа - Her2 или neu. Белок Her2 – это мембранный тирозинкиназный рецептор, который относится к семейству ERBB рецепторов, состоящего из четырех видов: HER1 (ERBB1, EGFR), HER2 (ERBB2, Neu),HER3 (ERBB3), HER4 (ERBB4) [Ross J.S. et al., 2004]. От активированного рецептора через сигнальные пути RasRaf-MEK-MAPKs, фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K)/Akt, фосфолипаза C γ1 происходит активация процессов пролиферации, дифференцировки или миграции [Hudis C.A., 2007]. Для активации сигнального пути от рецептора необходимы три составляющие: лиганд, рецептор и димеризационный партнер [Yarden Y., Sliwkowski M.X., 2004]. Рецепторы семейства Her2 расположены на клеточной мембране в виде мономеров. При связывании лиганда с экстрацеллюлярным доменом рецептора из семейства Her2 происходит дальнейшая димеризация данного рецептора с рецептором из семейства Her2 – с подобным рецептором (гомодимеризация) или с другим рецептором (гетеро- 56 димеризация). Внутриклеточный домен димеризованного рецептора аутофосфорилируется и запускает каскад сигнального пути. Лигандами для рецепторов HER1 (EGFR), HER2 и HER3 являются: эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor - EGF), трансформирующий фактор роста α (transforming growth factor - TGFα), эпинефрин, ньюрегулины, амфирегулин, гепарин-связывающий фактор роста (heparinbinding growth factor - HBGF). На сегодняшний день лиганд к рецептору Her2 не найден и предполагается, что этот рецептор является димеризационным партнером для других рецепторов семейства ERBB рецепторов. Также выявлено, что Her2 гетеродимеры более стабильны [Roskoski R. et al., 2004] и обладают большей активирующей способностью [Karunagaran D. et al., 2004]. При злокачественных новообразованиях человека активация клеточного Her2-рецепторного сигнального пути происходит тремя путями: 1) за счет повышения транскрипционной активности гена - экспрессии гена Her2, 2) реже за счет амплификации гена Her2 и 3) очень редко за счет мутации гена Her2. При злокачественных новообразованиях человека повышенная экспрессия белка и амплификация гена Her2 ассоциированы с повышенной пролиферацией, клеточной подвижностью, инвазивностью, метастазированием, повышенным ангиогенезом, снижением апоптоза и неблагоприятным прогнозом [Шляхтунов Е.А., Семенов В.М., 2014; Имянитов Е.Н., 2010; Имянитов Е.Н., Хансон К.П., 2002; Moasser M.M. et al., 2007; Jorissen R.N. et al., 2003]. Изучение белка и гена Her2 при злокачественных новообразованиях привлекает исследователей с позиций изучения канцерогенеза, прогноза и возможности назначения таргетной терапии Her2 моноклональными антителами трастузумаб (герцептин). Среди злокачественных новообразований человека повышенное содержание белка Her2, как за счет транскрипционной регуляции (экспрессии), так и за счет амплификации гена с наибольшей частотой определяются при раке молочной железы и яичников (примерно в 10-30% случаев) и имеют взаимосвязь с неблагоприятным прогнозом [Мационис А.Э. и соавт., 2014; Мационис А.Э. и соавт., 2012; Опаленов К.В. и соавт., 2004; Завалишина Л.Э. и соавт., 2014; Франк Г.А. и соавт., 2012; Завалишина Л.Э. и соавт., 2011; Франк Г.А. и соавт., 2009; Завалишина Л.Э. и соавт., 2008; Завалишина Л.Э. и 57 соавт., 2008; Франк Г.А. и соавт., 2007; Petrelli F., Barni S., 2012; de Graeff P. et al. 2009]. При других локализациях злокачественных новообразований также выявлено повышенное содержание белка и амплификация гена Her2, однако, с меньшей частотой встречаемости - при раке желудка [Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., 2012; Завалишина Л.Э. и соавт., 2012; Yano T. et al., 2006], пищевода [Делекторская В.В. и соавт., 2010; Mimura K. et al., 2005], эндометрия [Morrison C. et al. 2006], раке полости рта и ротоглотки [Khan A.J. et al. 2002], мочевого пузыря [Latif Z. et al. 2003]. Также в мировой литературе имеются данные об экспрессии белка и амплификации гена Her2 при НМКРЛ [Rita R.G. et al., 2014; Martin V. et al., 2014; Landi L., Cappuzzo F., 2013; Thibault C. et al., 2013]. По литературным данным экспрессия белка и амплификация гена Her2 отсутствуют в эпителии бронха и альвеол, а также при предраковых изменениях эпителия бронха [Xu Y.J. et al., 2011; Radoviс S. et al., 2007; Tan D. et al., 2003; Meert A.P. et al., 2005; Piyathilake C.J. et al., 2002; Scheurle D. et al., 2000; al Moustafa A.E. et al., 1999]. По данным литературы при НМКРЛ найдена амплификация гена Her2, однако частота встречаемости значительно варьирует - от 1% до 53% [Cappuzzo F. et al., 2012; Tiseo M. et al.,2010; Al-Saad S. et al.,2010; Varella-Garcia M. et al., 2009; Kuyama S. et al.,2008; Hirsch F.R. et al.,2007; Soh J. et al., 2007; Pelosi G. et al., 2005; Meert AP. et al., 2005; Cappuzzo F. et al., 2005; Nakamura H. et al., 2003; Tan D. et al., 2003]. В большинстве исследований авторы оценивают частоту амплификации гена Her2 при НМКРЛ как низкую – не более 10%. В настоящее время прогностическая значимость амплификации гена Her2 при НМКРЛ четко не определена. В части исследований обнаружено, что амплификация гена Her2 является неблагоприятным фактором, связанным с низким показателем выживаемости и неблагоприятным прогнозом для больных НМКРЛ [Al-Saad S. et al., 2010; Meert A.P. et al., 2005; Tan D. et al., 2003], в других исследованиях- не выявлено такой взаимосвязи [Cappuzzo F. et al., 2012; Tiseo M. et al., 2010; Varella-Garcia M. et al., 2009; Kuyama S. et al., 2008; Hirsch F.R. et al., 2007; Soh J. et al., 2007; Pelosi G. et al., 2005;Cappuzzo F. et al., 2005; Nakamura H. et al., 2003]. При НМКРЛ отмечается выраженная 58 корреляция между экспрессией белка и амплификацией гена Her2 [Al-Saad S. et al., 2010; Kuyama S. et al., 2008; Hirsch F.R. et al., 2007; Soh J. et al., 2007; Pelosi G. et al., 2005; Meert A.P. et al., 2005; Cappuzzo F. et al., 2005; Nakamura H. et al., 2003; Tan D. et al., 2003]. По литературным данным при НМКРЛ повышенная экспрессия белка Her2 определяется от 1,8% [Cox G. et al., 2001] до 78% [Shou Y. et al., 2001]. В большинстве исследований найдена взаимосвязь положительной экспрессии белка Her2 с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ: гистогенезом - чаще при Ак по сравнению с Пк [Xia Q. et al., 2012; Toh C.K. et al., 2010; Radoviс S. et al., 2007; Mukohara T. et al., 2004; Hilbe W. et al., 2003; Tan D. et al., 2003; Bakir K. et al., 2002; Scheurle D. et al., 2000] и показателем N - чаще при наличии метастазов в лимфатические узлы по сравнению с отсутствием метастазов [Gomez A.M. et al., 2014; Panagiotou I. et al., 2012; Ludovini V. et al., 2008; Akita K. et al., 2002]. Также в настоящее время остается дискутабельным вопрос о взаимосвязи повышенной экспрессии белка Her2 с прогнозом заболевания и выживаемостью больных НМКРЛ. В одних литературных источниках сообщается о взаимосвязи положительной экспрессии белка Her2 с неблагоприятным прогнозом и низким показателем выживаемости больных НМКРЛ [Xia Q. et al., 2012; Takenaka M. et al., 2011; Toh CK. et al., 2010; Hirsch F.R. et al., 2009; Calikusu Z. et al., 2009; Kashihara M. et al., 2009; Parra ER. et al., 2008; Tsutsumida H. et al., 2007; Szelachowska J. et al, 2006; Meert A.P. et al.,2005; Szelachowska J. et al, 2004; Wang Y. et al., 2004; Onn A. et al., 2004; Au N.H. et al., 2004; Saad R.S. et al., 2004; Nakamura H. et al.,2003; Tan D. et al.,2003; Han H. et al., 2002], однако, в другой половине - такая взаимосвязь отсутствует [Aleric I. et al., 2012; Xu Y.J. et al., 2011; Feng X.L.et al., 2011; Grossi F.et al., 2010; Tiseo M. et al.,2010; Al-Saad S. et al.,2010; Varella-Garcia M. et al., 2009; Xu J.M. et al., 2009; Ludovini V. et al., 2008; Kuyama S. et al., 2008; Hirsch F.R. et al., 2007; Soh J. et al., 2007; Szelachowska J. et al., 2006; Vallbohmer D. et al., 2006; Pelosi G. et al., 2005; Cappuzzo F. et al.,2005; Hilbe W. et al., 2003; Piyathilake C.J. et al., 2002; Carbognani P. et al., 2002; Hirsch F.R. et al., 2002; Cox G. et al., 2001; Shou Y. et al., 2001; Moldvay J. et al., 2000]. В мировой литературе помимо оригинальных исследований представ- 59 лены метанализы исследований, посвященных изучению белка и гена Her2 при НМКРЛ. Meert A.P. с соавторами. (2003) провели метанализ 29 исследований и показали, что в 31% случаев НМКРЛ является Her2 положительным. Положительная экспрессия белка Her2 была взаимосвязана с низким показателем выживаемости в 12 исследованиях (1583 пациента), не найдено взаимосвязи с выживаемостью в 16 исследованиях (2705 пациентов) и в 1 исследовании (101 пациент) выявлена взаимосвязь с высоким показателем выживаемости. Однако, суммарные данные исследований позволяют сделать вывод о том, что повышенная экспрессия белка Her2 достоверно связана с низким показателем выживаемости больных и неблагоприятным прогнозом при НМКРЛ. Метанализ 44 статей, проведенный Nakamura H. с соавторами (2005) показали, что повышенная экспрессия белка Her2 определяется в 35% случаев (от 12% до 78%) НМКРЛ и прослеживается значимая взаимосвязь с гистогенезом опухоли - повышенная экспрессия белка Her2 выявляется 38% случаев Ак и в 16% Пк. Из 18 исследований, выбранных для метанализа, в 8 исследованиях показана связь повышенной экспрессии белка Her2 с низкой выживаемостью больных НМКРЛ, а в 10 исследованиях такой связи не выявлено. Liu L. с соавторами (2010) провели метанализ 40 исследований (6135 больных НМКРЛ), опубликованных до 2010 года - в 32 исследованиях изучалось содержание белка Her2 методом ИГХ и в 7 исследованиях изучалось состояние гена Her2 методом FISH. По результатам метанализа при НМКРЛ положительная экспрессия белка Her2 определяется в 25% (от 1,8% до 78%), амплификация гена Her2 – в 20% (от 1,4% до 44%). Суммарные данные метанализа показали, что повышенная экспрессия белка Her2 взаимосвязана с низким показателем выживаемости больных и неблагоприятным прогнозом НМКРЛ; однако, только при Ак, при Пк такой связи не установлено. Также показано, что амплификация гена Her2 не связана с выживаемостью больных и прогнозом НМКРЛ. Таким образом, является актуальным исследование содержания белка и статуса гена Her2 во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и молекулярно-биологическими факторами (Ag-ЯОР-белками, маркерами пролиферативной активности, апоптоза и ангиогенеза), а также выживаемостью больных и прогнозом при НМКРЛ. 60 1.3. Резюме Анализ литературных источников позволяет говорить о ряде нерешенных вопросов, относящихся к стадированию, выделению групп риска, прогнозированию и определению показателей для терапевтического лечения НМКРЛ. Показатели по системе TNM, а также «классические» клиникоморфологические параметры имеют ограниченное прогностическое значение при НМКРЛ, в связи с чем, на сегодняшний день актуальным является поиск новых прогностических факторов. Такими факторами могут являться молекулярно-биологические маркеры - определяющие как прогноз, так и показания для последующего постоперационного лечения. Наиболее перспективным при НМКРЛ является изучение следующих молекулярно-биологических маркеров: Ag-ЯОР-белков, маркеров пролиферативной активности (Ki-67, топоизомеразы IIα), маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax), маркеров ангиогенеза (CD34, подопланин) и мембранных рецепторов (статус белка и гена Her2). Однако, в мировой литературе исследования, посвященные изучению вышеперечисленных молекулярно-биологических маркеров при НМКРЛ, немногочисленны, а в отечественной литературе практически отсутствуют. В имеющихся литературных источниках приводятся противоречивые данные о взаимосвязи между вышеперечисленными молекулярно-биологическими маркерами, с одной стороны, и клинико-морфологическими параметрами, выживаемостью и прогнозом при НМКРЛ, с другой стороны. Отсутствуют исследования, в которых совокупно, комплексно изучались данные молекулярно-биологические маркеры и взаимосвязи между ними. Также отсутствуют исследования о взаимосвязи между коэкспрессией молекулярнобиологических маркеров и выживаемостью больных НМКРЛ. В то же время, в доступной литературе показаны противоречивые данные о наличии независимой прогностической значимости при НМКРЛ вышеперечисленных молекулярно-биологических маркеров. 61 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материал исследования Исследование выполнено на операционном материале, полученном от 243 пациентов. Материал был получен в отделении торакальной онкологии Алтайского филиала РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН «Алтайский краевой онкологический диспансер» города Барнаула (директор - д.м.н., профессор, А.Ф. Лазарев). Набор материала осуществлялся с 1 августа 2007 года по 1 августа 2009 года. Исследование материала проведено на базе патологоанатомического отделения муниципального лечебно-профилактического учреждения "Когалымская городская больница" и лаборатории молекулярной диагностики Алтайского филиала РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН «Алтайский краевой онкологический диспансер» (заведующий - д.м.н., профессор, А.М. Авдалян). Данные о выживаемости больных получены из «Канцер-регистра» Алтайского края. Таблица 1. Возрастно-половой состав больных и гистологический тип НМКРЛ (абсолютное количество (%)). Пол Возраст, лет Всего до 40 41-50 51-60 61-70 71-80 Женский 1 (3) 2 (6) 15 (44) 11 (32) 5 (15) 34 - Ак 1 (3) 0 13 (45) 10 (35) 5 (17) 29 (85) - Пк 0 2 (40) 2 (40) 1 (20) 0 5 (15) Мужской 0 26 (12) 78 (37) 85 (41) 20 (10) 209 - Ак 0 11 (13) 27 (33) 37 (45) 7 (9) 82 (39) - Пк 0 15 (12) 51 (40) 48 (38) 13 (10) 127 (61) Всего 1 (0,4) 28 (12) 93 (38) 96 (40) 25 (10) 243 (100) Средний возраст больных НМКРЛ составил 59,4±7,7 лет (от 35 до 75 лет), в 78% случаев в возрасте от 50 до 70 лет. В большинстве случаев больные были мужского пола - 209 (86%) случаев, женщины - 34 (14%) случая. Не было отличий полового состава и гистологического типа опухоли от возраста больных. Среди больных женского пола преобладающим гистологическим типом была Ак (85%), среди мужчин – Пк (61%) (таблица 1). В большинстве случаев (2/3 случаев) объем операции соответствовал 62 лобэктомии, в остальных случаях (1/3 случаев) – пневмонэктомии. При Ак лобэктомия проводилась чаще по сравнению с плоскоклеточным раком, что связано с локализацией опухолевого узла (таблица 2). Таблица 2. Тип оперативного лечения и гистологический тип НМКРЛ (абсолютное количество (%)). Операция Лобэктомия Пневмонэктомия Ак 89 (80) 22 (20) Количество больных Пк 84 (64) 48 (36) Всего 173 (71) 70 (29) Предоперационная химио-лучевая терапия не проводилась, постоперационная химио-лучевая терапия проведена 92 (38%) больным. При проведении химиотерапии в подавляющем большинстве случаев использовался цисплатин и этопозид. При лучевой терапии назначалась суммарная очаговая доза 50-60 Гр. Не было связи типа постоперационной химио-лучевой терапии с гистологическим типом НМКРЛ (таблица 3). Таблица 3. Тип постоперационной химио-лучевой терапии и гистологический тип НМКРЛ (абсолютное количество (%)). Послеоперационная терапия Химиотерапия Лучевая Химиотерапия и лучевая Ак 9 (8) 29 (26) 6 (5) Количество больных Пк 10 (8) 31 (24) 7 (5) Всего 19 (8) 60 (25) 13 (5) В исследование включены только случаи НМКРЛ – 111 случаев Ак и 132 случая Пк, случаев железисто-плоскоклеточного рака не было. Случаи с отдаленными метастазами (параметр М1) и первично-множественными опухолями исключены из исследования. Клинико-морфологические параметры и стадия заболевания определены согласно классификации TNM 7 пересмотра и представлена в таблице 4 и 5 [Sobin L., Gospodarowicz M., Wittekind C., 2009]. Показатель Т в 61% соответствовал Т2, в 27% - Т1 и в 12% - Т3, примерно с одинаковой частотой при Ак и Пк. Опухоли с показателем Т4 в исследовании отсутствовали. Опухоли с наибольшим размером ≥ 3 см незначи- 63 тельно преобладали над опухолями меньшего размера. В 36% отмечалось метастатическое поражение лимфатических узлов, с одинаковой частотой при Ак и Пк. Примерно в половине случаев определялась умеренная дифференцировка опухоли (таблица 4). Таблица 4. Клинико-морфологические параметры и гистологический тип НМКРЛ (абсолютное количество (%)). Характеристика Ак Первичная опухоль (Т) Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы (N) N0 N1 N2 N3 Дифференцировка (G) высокая умеренная низкая Количество больных Пк Всего 36 (32) 60 (54) 15 (14) 30 (23) 87 (66) 15 (11) 66 (27) 147 (61) 30 (12) 53 (48) 58 (52) 51 (39) 81 (61) 104 (43) 139 (57) 68 (61) 23 (21) 18 (16) 2 (2) 88 (67) 32 (24) 10 (8) 2 (1) 156 (64) 55 (23) 28 (12) 4 (1) 19 (17) 54 (49) 38 (34) 44 (33) 63 (48) 25 (19) 63 (26) 117 (48) 63 (26) Высокая и низкая дифференцировка прослеживалась с примерно с одинаковой частой (в четверти случаев) – высокодифференцированные опухоли чаще наблюдались при Пк по сравнению с Ак, низкодифференцированные при Ак по сравнению с Пк. Первая стадия заболевания найдена в 57% случаев, вторая - в 25% и третья - в 18%. Распределение по стадии заболевания имело примерно одинаковую частоту при Ак и Пк (таблица 5). В качестве контроля в 10 случаях исследованы кусочки патологически неизмененной ткани легкого – стенка бронха (бронхиальный эпителий) и паренхима легкого (альвеолярный эпителий), полученные из отдаленных от опухоли участков. Средний возраст составил 59 лет (от 45 до 75 лет), 5 женщин и 5 мужчин. 64 Таблица 5. Стадия и гистогенетический тип НМКРЛ (абсолютное количество (%)). Стадия Ак 60 (54) 28 (25) 32(29) 26 (23) 5 (5) 12 (11) 5 (5) 1 (1) 3 (2) 25 (23) 5 (5) 3 (2) 9 (8) 6 (5) 1 (1) 1 (1) I IА - T1aN0, T1bN0 IВ - T2aN0 II IIА - T1aN1, T1bN1 - T2aN1 - T2bN0 IIВ - T2bN1 - T3N0 III IIIА - T3N1 - T1N2 - T2N2 - T3N2 IIIВ - T1N3 - T2N3 - T3N3 Количество больных Пк Всего 78 (59) 138 (57) 20 (15) 48 (20) 58 (44) 90 (37) 34 (26) 60 (25) 6 (5) 11 (5) 16 (12) 28 (12) 6 (5) 11 (5) 2 (1) 3 (1) 4 (3) 7 (2) 20 (15) 45 (18) 8 (6) 13 (5) 3 (2) 6 (2) 5 (4) 14 (6) 2 (1) 8 (3) 1 (1) 1 (0,5) 1 (0,5) 1 (1) 2 (1) 2.2. Методы исследования Для достижения цели исследования и решения поставленных задач в работе были применены следующие методы исследования: 1) гистологический 2) гистохимический 3) компьютерный анализ изображений 4) иммуногистохимический 5) SISH метод 6) статистическая обработка данных. Гистологический метод. После операции материал немедленно доставлялся в патологогистологическую лабораторию, где производилось описание и вырезка. В протоколе гистологического исследования детально описывали макроскопическую картину: локализацию, характер роста, форму опухоли, измеряли наибольший размер опухоли, взаимоотношение с бронхиальным деревом, плеврой, распространенность некрозов и состояние регио- 65 нальных лимфатических узлов. Из каждой опухоли забирали три кусочка: один из центральной части и два из периферической части (из периферического отдела, который ближе к корню легкого и из противоположного периферического отдела, который ближе к плевре). Кусочки ткани немедленно фиксировали в 10%-ном нейтральном, забуференном по Лилли (рН=7,4) растворе формалина в течение 18-24 часов. Спиртовую проводку материала выполняли по стандартному протоколу в гистологическом аппарате LEICA TP 1020, заливку материала в парафин в аппарате LEICA EG 1160, срезы готовили на роторном микротоме LEICA RM 2135. Температура парафина при проводке и заливке не превышала 56˚С. Приготовление красителей, буферных растворов и технику окраски проводили по общепринятым прописям, приведенным в соответствующих руководствах [Сапожников А.Г., Доросевич А.Е., 2000; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996; Автандилов Г.Г., 1994; Лилли Р., 1969; Пирс Э., 1962; Меркулов Г.А., 1961]. С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4 мкм, которые помещали на предметное стекло и окрашивали растворами гематоксилина и эозина в автостейнере LEICA XL. Под световым микроскопом срезы исследовали для выявления общей морфологической картины, определения гистогенеза и степени гистологической дифференцировки опухоли. Определение гистогенеза и степени гистологической дифференцировки опухоли [Краевский Н.А., Смольянников А.В., Саркисов Д.С., 1993; Головин Д.И., 1982; Tomashefski J.F., 2008; Syrigos K.N., Nutting C.M., Roussos C., 2006; Travis W.D. et al., 2004; Akcerman S., 1995]. При микроскопическом исследовании опухоли для Ак характерно наличие желестоподобных структур (ацинарных, папиллярных) и слизи (внутри- и/или внеклеточно). Для Пк характерно наличие межклеточных мостиков и кератина (внутри- и/или внеклеточно). Исходя из степени выраженности данных признаков выделяли три степени дифференцировки Ак или Пк - высокая, умеренная и низкая. 66 Рисунок 1. Ак: а – высокодифференцированная, б - умерено дифференцированная, в – низкодифференцированная, г – экспрессия цитокератина 7 при низкодифференцированной Ак, д – альциановый синий положительная (кислые мукополисахариды) и е – ШИК положительная (нейтральные мукополисахариды) секреция внутри- и внеклеточной слизи при умерено дифференцированной Ак. а, б, в – окраска гематоксилином и эозином, г – иммуногистохимический метод, д, е – окраски ШИК реактивом и альциановым синим. х200. 67 Рисунок 2. Пк: а – высокодифференцированный, б - умерено дифференцированный, в – низкодифференцированный, г – экспрессия высокомолекулярного цитокератина (34βE12) при умерено дифференцированном Пк, д – внутри- и внеклеточная секреция кератина при высокодифференцированном Пк, е – межклеточные мостики при высокодифференцированном Пк. а, б, в – окраска гематоксилином и эозином, г – иммуногистохимический метод, д, е – окраски по Крейбергу. а, б, в, г, д - х200, е – х1000. 68 При высокодифференцированной Ак характерно наличие ацинарных и/или папиллярных структур и внутри- и/или внеклеточной слизи; при умерено дифференцированной Ак - ацинарные и/или папиллярные структуры менее развиты, определяются участки солидного строения, продукция внутри- и/или внеклеточной слизи снижена; при низкодифференцированной Ак характерно солидное строение, ацинарные и/или папиллярные структуры редуцированы по форме и редко встречаются, также редко определяются клетки с единичными каплями внеклеточной слизи (рисунок 1). В исследованном материале отсутствовали случаи бронхиолоальвеолярного рака и редких форм Ак (фетальной, муцинозной, перстневидно-клеточной и светлоклеточной). При высокодифференцированном Пк характерно наличие развитых межклеточных мостиков, кератинизации цитоплазмы клеток (внутриклеточный кератин) и «роговых жемчужин» (внеклеточный кератин); при умерено дифференцированном Пк межклеточные мостики и кератинизации цитоплазмы клеток снижена, «роговые жемчужины» редуцированы по форме и редко встречаются; при низкодифференцированном Пк межклеточные мостики и кератинизации цитоплазмы встречаются в единичных клетках, «роговые жемчужины» не определяются (рисунок 2). Для определения гистогенеза и степени дифференцировки опухоли, дополнительно к окраске гематоксилином и эозином, исследовались результаты гистохимической окраски срезов для выявления слизи (окраска ШИКреактивом и альциановым синим) и кератина (окраска по Крейбергу), а также результаты иммуногистохимического исследования. Для Ак характерным было положительное окрашивание на TTF-1, цитокератины 7/20 и отрицательное на кератин High Molecular Weight и 5/6; наоборот, для Пк - положительное окрашивание на кератин High Molecular Weight, 5/6 и отрицательное на TTF-1, цитокератины 7/20. Изготовление тканевых матриц [van de Rijn M., Gilks C.B., 2004; Packeisen J. et al., 2003; Bubendorf L. et al., 2001; Kononen J. et al., 1998]. В каждом случае из трех парафиновых блоков (блоков-доноров) забраны столбики ткани иглой-панчером с внутренним диаметром 1,5 мм, на основании просмотра соответствующих гистологических препаратов. Столбики ткани 69 из парафиновых блоков-доноров помещены в шесть парафиновых блоковреципиентов, с формированием тканевых матриц 12х12 столбиков и размером 20х20 мм. С парафиновых блоков-реципиентов изготавливались серийные гистологические срезы толщиной 4 мкм и переносились на стекла (с двух парафиновых блоков на одно стекло) (рисунок 3). Рисунок 3. Тканевые матрицы: справа – шесть блоков-реципиентов, по центру – три стекла окрашенные SISH методом (INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail), слева – три стекла окрашенные ИГХ методом с первичными антителами к TopoIIα. Гистохимический метод. Срезы окрашивали ШИК-реактивом и альциановым синим, для выявление нейтральных и кислых мукополисахаридов, и по Крейбергу для выявления кератина, согласно общепринятым прописям. Метод серебрения азотнокислым серебром Ag-ЯОР-белков проводили по одностадийной методике, согласно рекомендациям Ploton D. с соавторами (1986). Для данной методики использовались химически чистые стекла (после стандартной обработки в растворе хромпика), покрытые 0,1% раствором поли-L-лизина [Munakata S., Hendricks J.B., 1994]. На стекла монтировали срезы толщиной 4 мкм, приготовленные с парафиновых блоков, и высушивали при 37˚С на термостолике в течение 12 часов. Протокол окрашивания [Trere D., 2000]: 70 1. Стандартная депарафинизация, дистиллированная вода. 2. Стекла со срезами помещали в термостойкий пластиковый стакан в 0,01 М раствор цитратного буфера (рН=6,0) и автоклавировали в автоклаве SIEMENS "VALIDATOR PLUS Model AE" при 120˚С в течение 20 минут. После высокотемпературной обработки стекла со срезами охлаждали до комнатной температуры в бидистиллированной воде в течение 10 минут [Aubele M. et al., 1994]. 3. На срезы наносили 2 капли 2%-го раствора желатины на 1% водном растворе муравьиной кислоты и 4 капли 50%-го водного раствора нитрата серебра. Для приготовления вышеуказанных растворов использовалась бидистилированная вода. Для окрашивания использовались только свежие растворы, приготовленные непосредственно перед окрашиванием. После нанесения растворов срезы покрывали покровным стеклом и помещали в термостат при 37˚С на 16 минут в герметично закрытой камере (чашка Петри), содержащей листок фильтровальной бумаги, смоченный дистиллированной водой [Trere D., 2000]. После инкубации стекла со срезами промывали в 2 сменах бидистиллированной воды по 3 минуты в каждой. 4. Докрашивания ядер не проводили, стандартно обезвоживали, заключали под покровное стекло в канадский бальзам. Двойное окрашивание на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки. Протокол окрашивания: 1. Стандартная депарафинизация, дистиллированная вода. 2. Для антигенного восстановления депарафинированные срезы обрабатывали в автоклаве SIEMENS "VALIDATOR PLUS Model AE" 20 минут при 120˚С в 0,01М цитратном буфере (рН=6,0); далее охлаждали 10 минут при комнатной температуре в дистиллированной воде. 3. Ингибирование эндогенной пероксидазы проводили в 3%-ном растворе перекиси водорода 20 минут при +4˚С. Промывание осуществляли в 2 сменах трис-буфера (рН=7,4) по 5 минут. 4. В качестве первичных антител использовались антитела к антигену Ki-67 (клон MIB-1, Dako) в разведении 1:400. Инкубацию с первичными антителами проводили 18-24 часа при +4˚С. Разведение первичных антител подобрано экспериментальным путем согласно времени окрашивания (мини- 71 мальное фоновое окрашивание и максимальное специфическое). Для иммунного окрашивания использовали стрептавидин-биотиновый фосфатазный метод (LSAB2 System-АР, Dako). В качестве хромогенного субстрата для щелочной фосфатазы использовался Fuchsin (Dako). Стекла со срезами промывали в 2 сменах бидистилированной воды по 5 мин. 6. На срезы наносили 2 капли 2%-го раствора желатины на 1% водном растворе муравьиной кислоты и 4 капли 50%-го водного раствора нитрата серебра. Для приготовления вышеуказанных растворов использовалась бидистилированная вода. Для окрашивания использовались только свежие растворы, приготовленные непосредственно перед окрашиванием. После нанесения растворов срезы покрывали покровным стеклом и помещали в термостат при 37˚С на 18 минут в герметично закрытой камере (чашка Петри), содержащей листок фильтровальной бумаги, смоченный дистиллированной водой [Trere D., 2000]. После инкубации стекла со срезами промывали в 2 сменах бидистиллированной воды по 5 минуты в каждой. 7. Заключали под покровное стекло в водорастворимую среду Faramount Aqueous (Dako). Компьютерный анализ изображений. Применяли следующее оборудование: микроскоп DMLS (Leica) проходящего света с подсоединенной цветной видеокамерой JVC TK-C1380E (Япония) и микроскоп CX41 (Olympus) проходящего света с подсоединенной цветной видеокамерой DP72 (Olympus). Изображение вводили в компьютер непосредственно с микроскопа с помощью видеокамеры. Каждое изображение сохраняли в формате TIFF или JPEG на жесткий диск компьютера, размер файла – 1360х1024 пикселей. Программное обеспечение - анализатор изображений ImageJ 1.42. Протокол полуавтоматизированного исследования площади (двойное окрашивание на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки) и ИП Ag-ЯОР-белков (окрашивание азотнокислым серебром на Ag-ЯОР-белки). Исследовали только ядра интерфазных клеток, с четкими очертаниями ядра (клетки в фазе митоза не учитывались), при увеличении микроскопа в 1000 раз (объектив х100, 1.25, oil, окуляр х10), с использованием иммерсионной системы. В каждом случае исследовались 100 ядер клеток, с 10-30 цифровых изображений, полученные с 10 полей зрения. 72 1. Вручную отмечали только ядра анализируемых эпителиальных клеток (с депозитами серебра в них), которые автоматически сохранялись на жесткий диск в стек (файл множественных изображений, размер каждого изображения по 125х125 пикселей, количество изображений 100) и переводились из цветного в серое изображение. 2. Калибровка программы. Для определения ИП Ag-ЯОР-белков предварительно измеряли площадь Ag-ЯОР-белков в 20-25 ядрах малых лимфоцитов, определяли среднюю площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов и проводили калибровку программы по средним значениям для каждого случая. ИП Ag-ЯОР-белков определяли как отношение площади Ag-ЯОРбелков в клетке к значению средней площади Ag-ЯОР-белков в ядре малого лимфоцита [Ruschoff J. et al., 1990]. Для исключения ошибки измерений в программе выставляли ограничение - гранулы размером менее 0,1 мкм² исключены из анализа (не измерялись). 3. Анализ изображений: 1) автоматическое выделение гранул серебра в ядрах клеток по значению серого (0 – абсолютно черное, 256 – абсолютно белое) и перевод в бинарное изображение (0 – черное, 1 – белое). Во всех проведенных измерениях для выделения Ag-ЯОР-белков пороговое значение серого было установлено постоянным – 110. 2) автоматическoе измерение площади на бинарном изображении, с последующим расчетом ИП, среднего значения площади, среднего значения ИП и КВ Ag-ЯОР-белков. КВ Ag-ЯОРбелков определяли как отношение стандартного (среднеквадратического) отклонения к среднему значению и умноженное на 100%. Показатель пролиферации вычислялся как произведение ИМ Ki-67 на площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках. 4. Статистическая обработка полученных данных (результатов измерений и расчетов) произведена в программе STATISTICA. Иммуногистохимический метод [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004]. Для данной методики использовались химически чистые стекла, после стандартной обработки в растворе хромпика, покрытые 0,1% раствором поли-Lлизина. На стекла монтировали срезы толщиной 4 мкм, приготовленные с парафиновых блоков, и высушивали при 37˚С на термостолике в течение 12 ча- 73 сов. Все этапы ИГХ окрашивания проводились в автоматическом режиме в автостейнере BenchMark XT (Ventana). Использовались две группы первичных антител (таблица 6). Первая группа первичных антител – дифференциально-диагностические маркеры, характеризующие гистогенез опухоли. Вторая группа первичных антител - молекулярно-биологические маркеры, отражающие характеристики пролиферации, апоптоза, ангиогенеза, рецепторного статуса. Система визуализации ultraView Universal DAB Detection Kit (Ventana) – полимерный комплекс с вторичными антителами, хромоген DAB. Таблица 6. Первичные антитела, использованные в работе. Название Клон РазведеФирма Демаскировка ние производитель дифференциально-диагностические маркеры СК 7 SP52 RTU Ventana Автоматическая СК 20 SP33 RTU Ventana Автоматическая TTF-1 SP141 RTU Ventana Автоматическая HMWК 34βE12 RTU Ventana Автоматическая СК 5/6 D5/16B4 RTU Ventana Автоматическая молекулярно-биологические маркеры Ki-67 MIB-1 1:150 Dako Автоматическая Topoisomerase IIα JS5B4 RTU Ventana Автоматическая p53 DO-7 RTU Dako Автоматическая Bcl-2 124 RTU Dako Автоматическая Bax SP47 1:20 SpringBio Автоматическая CD34 QBEnd/10 RTU Ventana Автоматическая Podoplanin D2-40 RTU Ventana Автоматическая Her2 4В5 RTU Ventana Автоматическая Примечание. СК – цитокератины. HMWК – высокомолекулярный кератин. Критерии оценки экспресссии молекулярно-биологических маркеров проводили согласно общепринятым методикам и согласно протоколу производителя (таблица 7). В каждом случае при исследовании Ki-67, TopoIIα, р53, Bcl-2, Bax вычисляли индекс метки (ИМ) для соответствующего антигена – количество положительно окрашенных клеток от общего числа исследованных клеток, выраженный в процентах. 74 Таблица 7. Критерии оценки экспрессии молекулярно-биологических маркеров. Маркер Локализация Ki-67 Ядро TopoIIα Ядро р53 Ядро Bcl-2 Цитоплазма Bax Цитоплазма СD34 Эндотелий кровеносных сосудов Pod Эндотелий лимфатических сосудов Her2 мембрана Исследование 1000 клеток, в 5-7 полях зрения, при увеличении х400 1000 клеток, в 5-7 полях зрения, при увеличении х400 1000 клеток, в 5-7 полях зрения, при увеличении х400 1000 клеток, в 5-7 полях зрения, при увеличении х400 1000 клеток, в 5-7 полях зрения, при увеличении х400 Количество сосудов с позитивно окрашенным эндотелием, 3 поля зрения, при увеличении х200 Количество сосудов с позитивно окрашенным эндотелием, 3 поля зрения, при увеличении х200 1000 клеток в 5-7 полях зрения, при увеличении х400 Порог экспрессии Медиана ИМ для соответствующей выборки Медиана ИМ для соответствующей выборки Отрицательная при ИМ <10%, положительная при ИМ ˃10% Отрицательная при ИМ <10%, положительная при ИМ ˃10% Отрицательная при ИМ <10%, положительная при ИМ ˃10% Медиана ПМЦР-Г для соответствующей выборки Медиана ПМЦР-Л для соответствующей выборки Отрицательная при 0 и 1+, положительная при 2+ и 3+ * В каждом случае при исследовании СD34 и Pod вычисляли соответственно плотность микроциркуляторного русла кровеносных сосудов (ПМЦР-Г) или лимфатических сосудов (ПМЦР-Л) - среднее значение количества сосудов в поле зрения с позитивно окрашенным эндотелием; подсчитывали отдельно расположенные сосуды с определяемым просветом и без просвета (кластеры позитивно окрашенных клеток). В каждом случае при исследовании Her2 оценку окрашивания проводили в баллах (от 0 до 3), согласно рекомендациям производителя, с модификацией предложенной для рака желудка [4], ввиду того, что НМКРЛ не является гормонозависимой опухолью, как рак молочной железы: 0 – нет окрашивания или мембранное окрашивание менее 10% клеток; 1+ - слабое или фрагментарное мембранное окрашивание более 10% клеток; 2+ - слабое или умеренное базолатеральное или полное мембранное окрашивание более 10% клеток; 3+ - умеренное или выраженное базолатеральное или полное окрашивание более 10% клеток. 75 SISH метод [Франк Г.А. и соавт., 2013; Завалишина Л.Э. и соавт., 2011]. Для данной методики использовались три стекла со срезами тканевых матриц. Все этапы подготовки срезов и непосредственно гибридизации in situ проводились в автоматическом режиме в автостейнере BenchMark XT (Ventana). Использовались: INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail - набор зондов меченных динитрофенилом (DNP) и дигоксигенином (DIG), для выявления соответственно гена Her2 и центромерного участка 17 хромосомы, ultra View Silver ISH DNP Detection – визуализирующая система на основе серебра (метка черного цвета) к зонду для гена Her2, меченного динитрофенилом (DNP), ultra View Red ISH DIG Detection - визуализирующая система на основе красителя Fast Red (метка красного цвета) к зонду для центромерного участка 17 хромосомы, меченного дигоксигенином (DIG). Оценку результатов реакции SISH проводили согласно инструкции к набору: подсчитывали метку в 20/40 ядрах опухолевых клеток (увеличение х1000), вычисляли соотношение Her2/CEP17. Оценку амплификации проводили согласно рекомендациям производителя: при соотношении Her2/CEP17<1,8, считали, что амплификация гена Her2 отсутствует, а при соотношении Her2/CEP17˃2,0 – наличие амплификации. При соотношении Her2/CEP17=1,8-2,0 в просчет включали дополнительный объем клеток до тех пор пока не получали пограничного уровня. Для оценки состояния CEP17 использовали классификацию, предложенную Wang S. с соавторами [21]: при наличии менее 2,25 красных меток - отсутствие увеличения CEP17, при наличии более 2,25 красных меток - увеличение CEP17. По состоянию гена Her2 и CEP17 выделены четыре типа опухоли: отсутствие амплификации гена Her2 и отсутствие увеличения CEP17 – тип N, отсутствие амплификации гена Her2 и наличие увеличения CEP17 – тип P, наличие амплификации гена Her2 и отсутствие увеличения CEP17 – тип A, наличие амплификации гена Her2 и наличие увеличения CEP17 – тип AP. Статистическая обработка данных. Статистические расчеты проводили автоматизированно в статистическом пакете прикладных программ STATISTICA, версия 6.0 (Stat-Soft Inc., USA, 2001) [Боровиков В.П., 2003, 2000, 1998; Боровиков В.П., Ивченко Г.И., 2000; Реброва О.Ю., 2002; Халафян А.А., 2007; Вуколов Э.А., 2004; Автандилов Г.Г., 2002]. В полученных 76 выборках предварительно определяли характер распределения данных, с помощью теста Колмогорова-Смирнова и по критерию Шапиро-Уилка (W), на основании которых выбирали методы описания и анализа. Представление данных в выборках и методы анализа выбраны следующие. 1. Описательная статистика. В каждой выборке определяли четыре статистических момента: первый статистический момент - центральная тенденция (среднее или медиана); второй статистический момент – мера рассеяния (стандартное отклонение или интерквартильный интервал) , также дополнительно определяли минимальное и максимальное значения выборки; третий статистический момент - ассиметрия; четвертый статистический момент – эксцесс. При параметрическом распределении меру центральной тенденции в группах представляли в виде среднего (М), меру рассеяния в виде стандартного отклонения (с.о.). При непараметрическом распределении меру центральной тенденции в группах представляли в виде медианы (Ме), меру рассеяния в виде интерквартильного интервала (и.и.) – интервал между 25 % и 75 % данных в выборке, который независимо от распределения данных в выборке представляет 50% данных вокруг центральной тенденции. 2. Различия между величинами оценивали непараметрическими методами. При сравнении качественных и порядковых (полуколичественных) данных - двусторонний точный критерий Фишера. При сравнении количественных данных – предварительно, для избежания проблемы множественных сравнений, в выборках данные сравнивали с использованием однофакторного теста Краскелла-Уоллиса (аналог параметрического дисперсионного анализа), затем выборки попарно сравнивали с использованием U-критерия Манна-Уитни. 3. Степень корреляции оценивали с использованием непараметрических методов: при сравнении качественных и порядковых (полуколичественных) данных – тест χ2, при сравнении количественных данных - рангового коэффициента корреляции Спирмена (r). Силу корреляции оценивали как слабая при r≤0,25, умеренная 0,25<r<0,75, сильная r≥0,75. Выживаемость больных рассчитывали актуариальных способом. Общую 5-летнюю выживаемость определяли с даты операции до даты последнего наблюдения или смерти от любой причины. Для анализа выживаемости 77 использовали метод Каплана - Мейера, для сравнения между группами - тест log-rank. Для выявления значимости влияния отдельного фактора или совокупности факторов на выживаемость больных использовали непараметрический вариант регрессионного анализа - модель пропорциональных интенсивностей Кокса. Достоверность оценивали при р<0,05 - 95% уровень безошибочного суждения. Таким образом, для достижения цели исследования и решения поставленных задач исследование выполнено на достаточном объеме материала (выборки), были использованы современные методические и методологические подходы исследования, выбраны корректные методы статистического анализа результатов исследования. 78 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 3. Ag-ЯОР-БЕЛКИ При окраске азотнокислым серебром Ag-ЯОР-белки имели вид гранул черного цвета, матрикс ядрышек окрашивался в коричневый или темнокоричневый цвет, ядра клеток окрашивались в светло-желтый цвет. В эпителиальных клетках гранулы серебра черного цвета располагались либо на коричневом фоне ядрышка (внутриядрышковая локализация Ag-ЯОР-белков), либо на светло-желтом фоне ядра (внеядрышковая локализация Ag-ЯОРбелков). В ядрах малых лимфоцитов (фолликулы лимфатического узла) определялись от 1 до 2 гранул серебра (чаще одно), по размерам соответствовавшие ядрышкам, матрикс ядрышка не окрашивался (рисунок 4в). Средняя площадь Ag-ЯОР-белков в ядре малого лимфоцита равнялась 1,48 (0,12) мкм2, КВ Ag-ЯОР-белков 19,7 (1,1) %. Рисунок 4. Ag-ЯОР-белки в ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол (а), бронха (б) и в малых лимфоцитах фолликулов лимфатического узла (в) стромы. Окраска азотнокислым серебром, х1000. 79 В ядрах клеток неизмененного эпителия альвеолы определялись от 1 до 2 гранул серебра, по размерам соответствовавшие ядрышкам, матрикс ядрышка не окрашивался. В ядрах клеток неизмененного эпителия бронха определялись 1-3 (чаще два) ядрышка, округлой формы, небольших размеров, с 1-3 гранулами серебра (рисунок 4а,б). Морфология Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол аналогична таковой в ядрах малых лимфоцитов лимфатических фолликулов, в фибробластах и в гладкомышечных клетках стромы. В ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол ИП Ag-ЯОР-белков составил 1,31±0,20, КВ Ag-ЯОР-белков 28,3±3,1%. В эпителии бронхов ИП Ag-ЯОР-белков составил 1,85±0,24, КВ Ag-ЯОРбелков 29,3±3,3 %. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое увеличение ИП и КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р<0,001). Размер ядрышек в раковых клетках был значительно больше по сравнению с клетками неизмененного эпителия, с характерным полиморфизмом ядрышек умеренной и выраженной степени. Для ядер раковых клеток была характерна как внутриядрышковая, так и значительная внеядрышковая локализация гранул серебра, а также разные размеры гранул серебра. Ag-ЯОР-белки исследованы в 243 НМКРЛ, из них 111 Ак и 132 Пк. 3.1. ИП Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параллели В НМКРЛ ИП Ag-ЯОР-белков составил 6,52±1,66; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,99, р=0,96). Минимальное значение выборки составило 2,25, максимальное – 11,80. Гистограмма распределения характеризовалась незначительными сдвигом вправо (ассиметрия 0,13) и островершинностью (эксцесс 0,03) (рисунок 5а). Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 8 и 9. Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отра- 80 жают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с ИП Ag-ЯОР-белков. Пол больных НМКРЛ и Ак имел слабую корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (соответственно r=0,20 и r=0,24, р<0,05). Рисунок 5. Гистограммы распределения ИП Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах). Таблица 8. ИП и КВ Ag-ЯОР-белков и пол больных НМКРЛ, Ак и Пк. Маркер НМКРЛ ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ак ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Пк ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Пол р мужской женский 6,71±1,63 31,03±4,59% 5,69±1,65 28,25±3,86% 0,002 ˂0,001 6,33±1,79 30,54±4,83% 5,38±1,58 27,82±3,75% 0,01 0,004 6,94±1,48 31,31±4,44% 7,40±0,67 30,63±3,95% 0,3 0,9 81 Таблица 9. ИП и КВ Ag-ЯОР-белков и возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк. Маркер НМКРЛ ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ак ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Пк ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Возраст р ˂ 59 лет ≥ 59 лет 6,55±1,59 30,99±4,82 6,56±1,74 30,30±4,39 0,8 0,3 6,02±1,74 30,02±5,10 6,10±1,82 29,62±4,44 0,7 0,7 6,90±1,39 31,64±4,56 7,01±1,54 30,94±4,27 0,6 0,4 Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 10. ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше в группе Т2-3 по сравнению с Т1. Также при размере первичной опухоли более 3 см ИП Ag-ЯОР-белков был больше, чем в опухоли менее 3 см. ИП Ag-ЯОР-белков имел умеренную корреляцию Таблица 10. ИП Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параметры НМКРЛ. Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Гистогенез Ак Пк Дифференцировка высокая умеренная-низкая M±с.о. р 5,89±1,49 6,81±1,68 <0,001 5,84±1,54 7,05±1,58 <0,001 6,27±1,59 7,06±1,70 <0,001 6,23±1,62 6,99±1,64 <0,001 6,05±1,78 6,96±1,46 <0,001 5,90±1,54 6,76±1,66 <0,001 82 Рисунок 6. Ag-ЯОР-белки при Ак: а, б – опухоль с показателем Т1 и Т2 соответственно, в, г – опухоль с наибольшим размером до 3 см и более 3 см соответственно, д, е – опухоль с показателем N0 и N1 соответственно. Окраска азотнокислым серебром, х1000. с показателем Т (r=0,34, р<0,001) и размером первичной опухоли (r=0,45, р<0,001). Таким образом, с увеличением размера опухолевого узла наблюдалось увеличение количественных показателей ядрышковых организаторов в 83 клетках опухоли, что указывало на повышение пролиферативной активности в процессе роста опухоли в больших по размеру опухолях. Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов. Показатель N при НМКРЛ имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р<0,001). Таким образом, метастатический потенциал НМКРЛ был связан с высокими количественными показателями ядрышковых организаторов опухолевых клеток. ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше при II и III стадии по сравнению с I стадией. Стадия процесса при НМКРЛ имела умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р<0,001). Таким образом, на ранних этапах опухолевого роста количественные показатели Ag-ЯОР-белков минимальны по сравнению с последующими стадиями процесса. ИП Ag-ЯОР-белков достоверно больше в Пк по сравнению с Ак. Гистогенез НМКРЛ имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р<0,001) (рисунок 8). Таким образом, имелась зависимость количественных показателей Ag-ЯОР-белков от тканевого происхождения опухоли. В клетках НМКРЛ ИП Ag-ЯОР-белков больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой (рисунок 8). Степень дифференцировки НМКРЛ имела умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,33, р<0,001). Количественные показатели ядрышковых организаторов возрастали в зависимости от степени дедифференцировки НМКРЛ. Тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ в группах показатель Т, наибольший размер опухоли, показатель N, стадия заболевания, гистогенез и дифференцировка. В Ак ИП Ag-ЯОР-белков составил 6,05±1,78; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,99, р=0,58). Минимальное значение выборки составило 2,25, максимальное – 10,63. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,17) и незначительной пологостью вершины (эксцесс -0,41) (рисунок 5б). В клетках Ак наблюдалось статистически значимое повышение ИП Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным альвеолярным эпителием (р<0,001). 84 Рисунок 7. Ag-ЯОР-белки при Пк: а, б – опухоль с показателем Т1 и Т2 соответственно, в, г – опухоль с наибольшим размером до 3 см и более 3 см соответственно, д, е – опухоль с показателем N0 и N1 соответственно. Окраска азотнокислым серебром, х1000. Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 11. 85 Таблица 11. ИП Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параметры Ак. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N1 N2 N3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая M±с.о. р 5,36±1,55 6,24±1,72 7,0±2,03 1-2: р=0,03 2-3: р=0,21 1-3: р=0,03 5,24±1,51 6,76±1,70 4-5: р<0,001 5,74±1,72 6,74±1,51 6,64±2,1 6,58±1,1 6-7,8,9: р<0,01 7-8,9: р=0,5 8-9: р=0,7 5,66±1,72 6,43±1,34 6,68±1,85 10-11: р=0,04 11-12: р=0,64 10-12: р=0,04 4,95±1,57 6,46±1,82 6,0±1,62 13-14: р=0,004 14-15: р=0,41 13-15: р=0,03 Отмечалось последовательное увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Ак в группах Т1, Т2 и Т3, однако, статистически значимое отличие найдено только между группами Т1 и Т2, Т3 (рисунок 6а,б). Показатель Т имел тенденцию к слабой корреляции с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,27, р=0,006). В Ак с размером первичной опухоли менее 3 см ИП Ag-ЯОР-белков был меньше, чем в опухоли более 3 см (р<0,001) (рисунок 6в,г). Размер Ак имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,42, р<0,001). Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Ак с наличием метастатического поражения лимфатических узлов по сравнению с опухолью без метастазов (р<0,01) (рисунок 6д,е). Отсутствовали статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков между N1, N2 и N3. Показатель N в Ак имел тенденцию к слабой корреляции с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,22, р=0,03). 86 Рисунок 8. Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ с разной степенью дифференцировки: а, в, д – соответственно высоко-, умерено и низкодифференцированная аденокарцинома, б, г, е – соответственно высоко-, умерено и низкодифференцированный плоскоклеточный рак. Окраска азотнокислым серебром, х1000. Отмечается последовательное увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Ак в I, II, III стадии заболевания, однако, статистически значимое отличие получено только между I и II, I и III стадиями. Стадия заболевания Ак имела тенден- 87 цию к слабой корреляции с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,23, р=0,02). ИП Ag-ЯОР-белков был статистически значимо ниже в клетках высокодифференцированной Ак по сравнению с умерено и низкодифференцированной и имел умеренную (r=0,33, р<0,001) корреляцию. Проведенный тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков в Ак в группах показатель Т, наибольший размер опухоли, показатель N и дифференцировка. Таблица 12. ИП Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параметры Пк. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N1 N2 N3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая M±с.о. р 6,46±1,20 6,99±1,39 7,80±1,71 1-2: р=0,04 2-3: р=0,04 1-3: р=0,005 6,45±1,33 7,26±1,46 4-5: р=0,002 6,69±1,36 7,46±1,33 7,84±2,12 7,90±0,83 6-7,8,9: р<0,01 7-8,9: р=0,5 8-9: р=0,9 6,65±1,40 7,27±1,19 7,71±1,90 10-11: р=0,009 11-12: р=0,33 10-12: р=0,04 6,32±1,32 7,06±1,21 7,72±1,76 13-14: р=0,002 14-15: р=0,04 13-15: р=0,001 В Пк ИП Ag-ЯОР-белков составил 6,96±1,46; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,98, р=0,1). Минимальное значение выборки составило 4,10, максимальное – 11,80. Гистограмма распределения характеризовалась умеренным сдвигом вправо (ассиметрия 0,52) и незначительной островершинностью (эксцесс 0,29) (рисунок 5в). В клетках Пк наблюдалось статистически значимое повышение ИП Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием бронхов (р<0,001). Результаты опре- 88 деления ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток Пк во взаимосвязи с клиникоморфологическими параметрами представлены в таблице 12. Отмечалось статистически значимое последовательное увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Пк в группах Т1, Т2 и Т3 (рисунок 7а,б). Показатель Т имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,35, р=0,02). В клетках Пк с размером первичной опухоли менее 3 см ИП Ag-ЯОР-белков был меньше, чем в опухоли более 3 см (р=0,002) (рисунок 7в,г). Размер Пк имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,37, р=0,002). Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Пк с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (р<0,01) (рисунок 7д,е). Отсутствовали отличия ИП Ag-ЯОР-белков между N1, N2 и N3. Показатель N при Пк имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р=0,003). Отмечалось последовательное увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Пк при I, II, III стадиях заболевания; однако, статистически значимое отличие получено только между I и II, I и III стадиями. Стадия заболевания Пк умеренно коррелировала с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,37, р=0,003). ИП Ag-ЯОР-белков статистически значимо увеличивался в ряду высоко-, умерено и низкодифференцированный Пк. ИП Ag-ЯОР-белков имел умеренную корреляцию со степенью дифференцировки (r=0,35, р<0,001). Проведенный тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков в Пк в группах показатель Т, наибольший размер опухоли, показатель N, стадия заболевания и дифференцировка. 3.2. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 13. Так как при НМКРЛ среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,52, то случаи с ИП AgЯОР-белков 6,52 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (118 случаев – 49%), до 6,52 мкм² – с небольшим (125 случаев – 51%). 89 Таблица 13. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ИП Ag-ЯОР-белков р ˂ 6,52 29,08±3,99 8,82 (7,61-9,82) 198,1 (115,5-330,1) 22 (15-38) 17 (10-22) 39 (34) 29 (25) 66 (58) 42 (34-59) 4 (2-8) 50 (48) 4 (4) ≥ 6,52 32,22±4,66 12,52 (11,02-13,98) 405,7 (291,8-661,7) 32 (24-48) 23 (14-30) 58 (53) 12 (11) 57 (52) 45 (33-64) 4 (2-9) 52 (50) 14 (13) ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,005 0,005 0,4 0,9 0,6 0,8 0,01 В НМКРЛ при увеличении количественных показателей ИП Ag-ЯОРбелков отмечалось увеличение количественных показателей КВ Ag-ЯОРбелков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. Также в группе опухолей с большим количественным значением ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось большее количество р53 положительных случаев, меньшее количество bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При НМКРЛ ИП Ag-ЯОР-белков имел корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,43, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,71, р<0,001), ПП (r=0,43, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,34, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,32, р<0,001), экспрессией р53 (r=0,24, р<0,01), bcl-2 (r=-0,22, р<0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,14, р<0,05). Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 14. Так как при Ак среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,05, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,05 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (48 случаев – 43%), до 6,05 мкм² – с небольшим (63 случая – 57%). 90 Таблица 14. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры Ак. Молекулярнобиологические маркеры КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ИП Ag-ЯОР-белков р ˂ 6,05 28,14±4,31 8,56±1,81 155,1 (40,9-277,1) 17 (5-31) 12 (4-18) 20 (33) 9 (15) 37 (61) 43 (36-61) 4 (2-9) 35 (60) 3 (9) ≥ 6,05 31,79±4,41 13,17±1,98 401,6 (188,8-534,6) 27 (18-41) 19 (11-25) 15 (39) 3 (8) 27 (71) 50 (37-73) 4 (1-9) 22 (67) 12 (21) ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,01 0,02 0,01 0,02 0,2 0,9 0,2 0,02 0,006 В Ак при увеличении количественных показателей ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось увеличение количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков, AgЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. Также в группе опухолей с большим количественным значением ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось большее количество р53 положительных случаев, меньшее количество bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При Ак ИП Ag-ЯОР-белков имел корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,46, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,76, р<0,001), ПП (r=0,48, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,37, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,35, р<0,001), экспрессией р53 (r=0,29, р<0,01), bcl-2 (r=-0,27, р<0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,24, р<0,01). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИП Ag-ЯОРбелков с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ. Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 15. Так как при Пк среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,96, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,96 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (59 случаев – 45%), до 6,96 мкм² – с небольшим (73 случая – 55%). 91 Таблица 15. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры Пк. Молекулярнобиологические маркеры КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ИП Ag-ЯОР-белков р ˂ 6,96 30,02±3,94 9,13±2,10 269,1 (180,5-365,0) 28 (18-38) 20 (16-26) 19 (36) 20 (38) 29 (55) 38 (30-59) 4 (1-6) 15 (33) 1 (2) ≥ 6,96 32,75±4,50 12,47±2,29 476,0 (333,6-683,2) 39 (28-52) 25 (18-31) 43 (60) 9 (13) 30 (42) 41 (30-56) 4 (2-10) 30 (42) 2 (4) ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,006 0,004 0,002 ˂0,001 0,1 0,4 0,9 0,3 0,3 В Пк при увеличении количественных показателей ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось увеличение количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков, AgЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. Также в группе опухолей с большим количественным значением ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось большее количество р53 положительных случаев и меньшее количество bcl-2 положительных случаев. При Пк ИП Ag-ЯОР-белков имел корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,48, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,74, р<0,001), ПП (r=0,46, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,39, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,36, р<0,001), экспрессией р53 (r=0,33, р=0,002) и bcl-2 (r=-0,31, р<0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИП Ag-ЯОР-белков с молекулярнобиологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которой отсутствовала при Пк. 3.3. КВ Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параллели В НМКРЛ КВ Ag-ЯОР-белков составил 30,5±4,6%; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,99, р=0,42). Минимальное значение выборки составило 17,1, максимальное – 43,3. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 92 0,02) и незначительной островершинностью (эксцесс 0,02) (рисунок 9а). В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое повышение КВ AgЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р<0,01). Увеличение вариабельности Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли по сравнению с неизмененной тканью подтверждало факт участия ядрышкового аппарата клетки в процессе канцерогенеза. Рисунок 9. Гистограммы распределения КВ Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах). Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 8 и 9. Найдено статистически значимое увеличение КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с КВ Ag- 93 ЯОР-белков. Пол больных НМКРЛ и Ак имел слабую корреляцию с КВ AgЯОР-белков (r=0,22 и r=0,28, р<0,001). Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 16. Таблица 16. КВ Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параметры НМКРЛ. Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Гистогенез Ак Пк Дифференцировка высокая умеренная-низкая M±с.о. р 29,5±4,5 31,1±4,6 0,006 29,3±4,0 31,5±4,8 <0,001 30,3±4,5 31,2±4,8 0,1 30,4±4,5 30,9±4,7 0,5 29,8±4,7 31,2±4,4 0,02 29,4±3,7 31,0±4,8 0,02 КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше в группе Т2-3 по сравнению с Т1. Также при размере первичной опухоли более 3 см КВ AgЯОР-белков был больше, чем в опухоли менее 3 см (рисунок 10 а,б). КВ AgЯОР-белков имел умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,29, р=0,006) и размером первичной опухоли (r=0,34, р<0,001). Таким образом, с увеличением размера опухолевого узла наблюдалось увеличение гетерогенности ядрышковых организаторов в клетках опухоли, что указывало на неоднородность пролиферативной активности в больших по размеру опухолях. Не найдено статистически значимого увеличения КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 1). Показатель N при НМКРЛ 94 не имел корреляции с КВ Ag-ЯОР-белков. Таким образом, метастатический потенциал НМКРЛ не связан с гетерогенностью ядрышковых организаторов опухолевых клеток. КВ Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ не имел достоверных отличий при II и III стадии по сравнению с I стадией. Стадия процесса при НМКРЛ не имела корреляции с КВ Ag-ЯОР-белков. Таким образом, на ранних и поздних этапах опухолевого роста гетерогенность Ag-ЯОР-белков одинакова. КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше в Пк по сравнению с Ак (рисунок 10 в,г). Гистогенез НМКРЛ имел умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,29, р=0,01). Таким образом, имелась зависимость гетерогенности Ag-ЯОР-белков от тканевого происхождения опухоли. В клетках НМКРЛ КВ Ag-ЯОР-белков больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой (рисунок 10 д,е). Степень дифференцировки НМКРЛ имела умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,27, р=0,02). Гетерогенность ядрышковых организаторов возрастали в зависимости от степени дедифференцировки НМКРЛ. Проведенный тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ в группах показатель Т, наибольший размер опухоли, гистогенез и дифференцировка. В Ак КВ Ag-ЯОР-белков составил 29,8±4,7%; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,98, р=0,03). Минимальное значение выборки составило 17,1, максимальное – 40,7. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом влево (ассиметрия 0,03) и незначительной пологостью вершины (эксцесс -0,18) (рисунок 9б). Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 17. В клетках Ак наблюдалось статистически значимое повышение КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным альвеолярным эпителием (р<0,01). КВ Ag-ЯОР-белков ниже в группе опухолей Т1 по сравнению с Т2 и Т3, но статистическая значимость отличий была найдена только между группами Т1 и Т2. Между показателем Т и КВ Ag-ЯОР-белков отсутствовала корреляция. 95 Рисунок 10. Гетерогенность Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ: а, б – опухоль с наибольшим размером до 3 см и более 3 см соответственно, в, г – соответственно при Ак и Пк, д, е – соответственно при высокой и низкой дифференцировке. Окраска азотнокислым серебром, х1000. 96 Таблица 17. КВ Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параметры Ак. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N1 N2 N3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая M±с.о. р 28,6±4,3 30,5±5,0 30,0±4,1 1-2: р=0,03 2-3: р=0,67 1-3: р=0,25 28,4±4,3 31,0±4,7 4-5: р=0,002 29,8±4,5 30,2±4,5 30,7±6,1 30,8±2,3 6-7,8,9: р=0,9 7-8,9: р=0,9 8-9: р=0,9 29,9±4,7 29,8±4,2 29,4±5,6 10-11: р=0,93 11-12: р=0,79 10-12: р=0,73 27,9±3,9 30,2±4,8 30,3±4,8 13-14: р=0,04 14-15: р=0,85 13-15: р=0,04 В Ак с размером первичной опухоли менее 3 см КВ Ag-ЯОР-белков был меньше, чем в опухоли более 3 см (р=0,002). Размер Ак имел умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,35, р<0,001). Отсутствовали статистически значимые отличия КВ Ag-ЯОР-белков между N0, N1, N2 и N3. Показатель N в Ак не имел корреляции с КВ Ag-ЯОР-белков. КВ Ag-ЯОР-белков приблизительно одинаков в группах I, II и III стадия и не имел статистически значимых отличий. Стадия заболевания Ак не коррелировала с КВ Ag-ЯОРбелков. КВ Ag-ЯОР-белков был статистически значимо ниже в клетках высокодифференцированной Ак по сравнению с умерено и низкодифференцированной и имели незначительную корреляцию (r=0,20, р=0,03). Тест КраскелаУоллиса показал статистически значимые отличия КВ Ag-ЯОР-белков в Ак только в группе наибольший размер опухоли. В Пк КВ Ag-ЯОР-белков составил 31,2±4,4%; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,99, р=0,5). Минимальное значение выборки составило 21,2, максимальное – 43,3. Гистограмма распределения 97 характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,14) и значительной островершинностью (эксцесс 0,14) (рисунок 9в). В клетках Пк наблюдалось статистически значимое повышение КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием бронхов (р<0,01). Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Пк во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 18. Таблица 18. КВ Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параметры Пк. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N1 N2 N3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая M±с.о. р 30,4±4,5 31,5±4,4 31,9±4,1 1-2: р=0,11 2-3: р=0,80 1-3: р=0,24 30,3±3,5 31,9±4,8 4-5: р=0,04 30,7±4,4 33,2±4,0 32,4±4,6 32,6±1,6 6-7,8,9: р<0,05 7-8,9: р=0,4 8-9: р=0,9 30,7±4,4 32,3±4,6 31,7±4,1 10-11: р=0,09 11-12: р=0,71 10-12: р=0,36 30,0±3,5 31,1±4,0 33,7±5,6 13-14: р=0,23 14-15: р=0,01 13-15: р<0,001 Отмечалось последовательное увеличение КВ Ag-ЯОР-белков в Пк в группах Т1, Т2 и Т3. Однако статистически значимого отличия между этими группами не найдено. Показатель Т не имел корреляции с КВ Ag-ЯОРбелков. В клетках Пк с размером первичной опухоли менее 3 см КВ Ag-ЯОРбелков был меньше, чем в опухоли более 3 см (р=0,04) (рисунок 1 б). Размер Пк не имел корреляции с КВ Ag-ЯОР-белков. Найдено статистически значимое увеличение КВ Ag-ЯОР-белков в Пк с наличием метастазов в регионар- 98 ных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (р=0,01) (рисунок 1 в). Отсутствовали статистически значимые отличия КВ Ag-ЯОРбелков между N1, N2 и N3. Показатель N при Пк имел умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,31, р=0,01). При разных стадиях Пк КВ AgЯОР-белков не имел статистически значимых отличий. Стадия заболевания Пк не коррелировала с КВ Ag-ЯОР-белков. КВ Ag-ЯОР-белков последовательно увеличивался в ряду высоко-, умерено и низкодифференцированный Пк, но статистическая значимость получена только для низкодифференцированного рака. КВ Ag-ЯОР-белков не имел корреляции со степенью дифференцировки опухоли. Проведенный тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия КВ Ag-ЯОР-белков в Пк только в группе показатель N. 3.4. КВ Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 19. Так как при НМКРЛ среднее значение КВ Ag-ЯОР-белков составило 30,5, то случаи с КВ AgЯОР-белков 30,5 и более считались с большим КВ Ag-ЯОР-белков (108 случай – 44%), до 30,5 мкм² – с небольшим (135 случаев – 56%). В НМКРЛ при увеличении количественных показателей КВ Ag-ЯОРбелков отмечалось увеличение количественных показателей ИП Ag-ЯОРбелков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. При НМКРЛ КВ Ag-ЯОР-белков имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,43, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,39, р<0,001), ПП (r=0,36, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,35, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,26, р<0,001). Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 20. Так как при Ак среднее значение КВ Ag-ЯОР-белков составило 29,8, то случаи с КВ Ag-ЯОР-белков 29,8 и более считались с большим КВ Ag-ЯОР-белков (54 случая – 49%), до 29,8 мкм² – с небольшим (57 случаев – 51%). 99 Таблица 19. КВ Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 КВ Ag-ЯОР-белков р ˂ 30,5 5,89±1,43 9,00 (7,86-11,55) 225,9 (114,0-372,4) 23 (14-38) 18 (9-25) 48 (38) 24 (19) 77 (61) 43 (34-62) 4 (2-9) 54 (46) 10 (8) ≥ 30,5 7,39±1,58 11,75 (9,98-13,59) 403,6 (245,2-617,1) 31 (23-50) 22 (14-28) 49 (49) 17 (17) 47 (47) 44 (31-58) 4 (2-8) 49 (54) 9 (10) ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,002 0,09 0,7 0,07 0,5 0,8 0,2 0,7 Таблица 20. КВ Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры Ак. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 КВ Ag-ЯОР-белков р ˂ 29,8 4,94±1,25 8,99±2,41 146,5 (35,9-264,5) 14 (4-29) 8 (3-16) 20 (31) 7 (11) 44 (68) 41 (35-57) 4 (2-9) 35 (56) 10 (16) ≥ 29,8 7,19±1,50 12,31±2,53 401,6 (180,0-534,3) 27 (18-41) 18 (12-25) 15 (43) 5 (14) 21 (60) 52 (42-73) 4 (2-12) 23 (77) 6 (20) ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,004 0,009 0,2 0,1 0,1 0,3 0,4 0,2 0,5 В Ак при увеличении количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков отмечалось увеличение количественных показателей ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. При Ак КВ Ag-ЯОРбелков имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,46, р<0,001), Ag-ЯОРбелками (MIB-1) (r=0,45, р<0,001), ПП (r=0,39, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,41, 100 р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,31, р<0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи КВ Ag-ЯОР-белков с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ. Таблица 21. КВ Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры Пк. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 КВ Ag-ЯОР-белков р ˂ 31,2 6,21±1,02 9,45±2,34 290,8 (180,5-375,2) 28 (19-39) 20 (16-27) 28 (46) 17 (28) 33 (54) 40 (31-60) 4 (2-8) 19 (34) 0 ≥ 31,2 7,79±1,44 12,07±2,51 433,4 (300,3-681,3) 35 (27-52) 24 (16-31) 34 (53) 12 (19) 26 (41) 40 (29-54) 4 (1-6) 26 (43) 3 (5) ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,4 0,6 0,4 0,2 0,4 0,3 0,7 Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 21. Так как при Пк среднее значение КВ Ag-ЯОР-белков составило 31,2, то случаи с КВ Ag-ЯОР-белков 31,2 и более считались с большим КВ Ag-ЯОР-белков (62 случай – 47%), до 31,2 мкм² – с небольшим (70 случаев – 53%). В Пк при увеличении количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков отмечалось увеличение количественных показателей ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. При Пк КВ Ag-ЯОРбелков имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,48, р<0,001), Ag-ЯОРбелками (MIB-1) (r=0,41, р<0,001), ПП (r=0,41, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,39, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,29, р<0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи КВ Ag-ЯОР-белков с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ. 101 Суммируя данные результатов исследования ИП и КВ Ag-ЯОР-белков следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое повышение ИП и КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Имеется гендерная взаимосвязь с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, так как найдено статистически значимое увеличение ИП и КВ Ag-ЯОР-белков у лиц мужского пола по сравнению с женским. ИП и КВ Ag-ЯОР-белков были взаимосвязаны с основными клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателем Т, наибольшим размером опухоли, гистогенезом и дифференцировкой. Также ИП и КВ Ag-ЯОР-белков имели корреляцию с большинством молекулярнобиологических маркеров: Ag-ЯОР-белками (MIB-1), показателем пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, экспрессией р53, bcl-2 и состоянием гена Her2. Таким образом, исследование ИП и КВ Ag-ЯОР-белков является важной молекулярно-биологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования. 102 ГЛАВА 4. Ag-ЯОР-БЕЛКИ В MIB-1 ПОЗИТИВНЫХ КЛЕТКАХ Результат иммуногистохимического окрашивания срезов с первичными антителами MIB-1 и последующей окраской азотнокислым серебром определялся в виде округлых гранул черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенных на фоне красного ядра (в MIB-1 позитивных клетках) или на фоне коричневого ядрышка или бледно-желтого ядра (в MIB-1 негативных клетках) (рисунок 11). В неизмененном эпителии бронха Ag-ЯОР-белки (MIB-1) составила 2,19±0,27 мкм², ПП 8,8±1,1. В неизмененном эпителии альвеолы MIB-1 позитивные клетки отсутствовали. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП по сравнению с неизмененным эпителием бронхов (р<0,001). Ag-ЯОР-белки (MIB1) исследована в 207 НМКРЛ, из них 94 Ак и 113 Пк. Рисунок 11. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках неизмененного эпителия бронха. Двойная окраска на Ki-67 (клон MIB-1) методом иммуногистохимии и на Ag-ЯОР-белки азотнокислым серебром, х1000. 4.1. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках и клинико-морфологические параллели В НМКРЛ Ag-ЯОР-белки (MIB-1) составила 10,47 (8,57-12,69) мкм²; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,98, р=0,02). Минимальное значение выборки составило 4,89 мкм², максимальное – 18,25 мкм². Гистограмма распределения характеризовалась незначитель- 103 ным сдвигом вправо (ассиметрия 0,26) и незначительной пологостью вершины (эксцесс -0,56) (рисунок 12а). Рисунок 12. Гистограммы распределения Ag-ЯОР-белков (MIB-1) при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y относительное содержание (в процентах). Результаты определения Ag-ЯОР-белков (MIB-1) при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 22 и 23. Отсутствовала статистически значимая взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с Ag-ЯОР-белками (MIB-1). Результаты определения Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 24. Отмечалось увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) в группе Т2-3 по сравнению с Т1. При размере первичной опухоли менее 3 см Ag-ЯОР-белки (MIB-1) была меньше, чем в опухоли более 3 см. Найдено увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) НМКРЛ с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению 104 с опухолью без метастазов (рисунок 1 а, б). Ag-ЯОР-белки (MIB-1) меньше в I стадию заболевания по сравнению с II-III стадиями. Отсутствовало отличие Ag-ЯОР-белков (MIB-1) между Ак и Пк (рисунок 15). Ag-ЯОР-белки (MIB-1) больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой (рисунок 15). В НМКРЛ Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела корреляцию с показателем Т (r=0,36, р<0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,44, р<0,001), показателем N (r=0,39, р<0,001), стадией заболевания (r=0,35, р<0,001) и дифференцировкой (r=0,33, р<0,001). Таблица 22. Взаимосвязь Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП с полом больных НМКРЛ, Ак и Пк. Маркер Пол мужской НМКРЛ Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП Ак Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП Пк Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП р женский 10,51(8,69-12,69) 323,9(192,2-531,5) 9,83(7,65-12,52) 137,2(33,9-333,6) 0,4 ˂0,001 10,89±2,96 271,1(147,7-517,0) 9,75±2,85 65,8(30,6-215,0) 0,1 ˂0,001 10,60±2,80 342,7(214,2-558,4) 12,54±1,31 392,3(338,4-637,5) 0,1 0,3 Таблица 23. Взаимосвязь Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП с возрастом больных НМКРЛ, Ак и Пк. Маркер НМКРЛ Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП Ак Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП Пк Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП Возраст р ˂ 59 лет ≥ 59 лет 10,78(8,31-12,97) 319,7(175,3-534,7) 10,41(8,71-12,62) 290,9(169,5-476,0) 0,9 0,3 10,64±3,13 188,8(120,7-409,7) 10,53±2,86 235,5(57,3-477,0) 0,8 0,8 10,65±2,85 354,2(230,9-663,7) 10,69±2,73 326,7(218,1-461,9) 0,9 0,1 105 Рисунок 13. Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при Ак: а, б – опухоль с показателем Т1 и Т2 соответственно, в, г – опухоль с наибольшим размером до 3 см и более 3 см соответственно, д, е – опухоль с показателем N0 и N1 соответственно. Двойная окраска на Ki-67 (клон MIB-1) методом иммуногистохимии и на AgЯОР-белки азотнокислым серебром, х1000. 106 Таблица 24. Ag-ЯОР-белки (MIB-1) и клинико-морфологические параметры НМКРЛ. Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Гистогенез Ак Пк Дифференцировка высокая умеренная-низкая Ме (и.и.) p 8,95 (7,60-10,91) 11,08 (8,92-13,16) <0,001 8,93 (7,60-10,92) 11,60 (9,37-13,42) <0,001 9,43 (8,04-11,88) 11,89 (10,37-14,23) <0,001 9,35 (7,89-11,87) 11,41 (9,21-13,75) <0,001 10,20 (8,79-12,53) 10,58 (8,37-12,69) 0,8 8,79 (7,73-10,95) 11,01 (8,97-13,04) <0,001 Результаты определения Ag-ЯОР-белков (MIB-1) Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 25. В Ак Ag-ЯОР-белки (MIB-1) составила 10,56±2,96 мкм²; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,98, р=0,2). Минимальное значение выборки составило 4,89 мкм², максимальное – 18,25 мкм². Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,2) и незначительной пологостью вершины (эксцесс -0,45) (рисунок 12б). Отмечалось последовательное увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) в группах Т1, Т2 и Т3, однако, статистически значимое отличие найдено только между группами Т1 и Т2, Т3 (рисунок 13а,б). При размере первичной опухоли менее 3 см Ag-ЯОР-белки (MIB-1) была меньше, чем в опухоли более 3 см (рисунок 13в,г). Найдено статистически значимое увеличение Ag-ЯОРбелков (MIB-1) в Ак с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 13д,е). Ag-ЯОРбелки (MIB-1) достоверно больше при 2 и 3 стадии по сравнению с 1 стадией, 107 Рисунок 14. Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при Пк: а, б – опухоль с показателем Т1 и Т2 соответственно, в, г – опухоль с наибольшим размером до 3 см и более 3 см соответственно, д, е – опухоль с показателем N0 и N1 соответственно. Двойная окраска на Ki-67 (клон MIB-1) методом иммуногистохимии и на AgЯОР-белки азотнокислым серебром, х1000. 108 а также при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокой (рисунок 1 а, б). В Ак Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,40, р<0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,46, р<0,001), показателем N (r=0,35, р<0,001), стадией процесса (r=0,33, р=0,001) и дифференцировкой (r=0,36, р<0,001). Таблица 25. Ag-ЯОР-белки (MIB-1) и клинико-морфологические параметры Ак. № 1 2 3 4 5 6 7 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая М±с.о. p 9,08±2,21 11,05±3,11 12,32±2,49 1-2: 0,003 1-3: <0,001 2-3: 0,1 9,17±2,55 11,76±2,77 4-5: <0,001 9,76±2,60 12,03±3,03 6-7: <0,001 9,63±2,45 11,77±3,19 11,62±3,14 10-11: 0,005 10-12: 0,01 11-12: 0,8 8,25±1,99 11,28±3,02 10,59±2,77 13-14: <0,001 13-15: 0,003 14-15: 0,3 В Пк Ag-ЯОР-белки (MIB-1) составила 10,67±2,78 мкм²; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,98, р=0,1). Минимальное значение выборки составило 5,61 мкм², максимальное – 17,66 мкм². Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,25) и значительной пологостью вершины (эксцесс -0,65) (рисунок 12в). Результаты определения Ag-ЯОР-белков (MIB-1) Пк во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 26. Отмечалось последовательное увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) в группах Т1, Т2 и Т3, однако, статистически значимое отличие найдено только для Т3 по сравнению с Т1 и Т2 (рисунок 14а,б). 109 Рисунок 15. Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при НМКРЛ с разной степенью дифференцировки: а, в, д – соответственно высоко-, умерено и низкодифференцированная аденокарцинома, б, г, е – соответственно высоко-, умерено и низкодифференцированный плоскоклеточный рак. Двойная окраска на Ki-67 (клон MIB-1) методом иммуногистохимии и на AgЯОР-белки азотнокислым серебром, х1000. 110 Таблица 26. Ag-ЯОР-белки (MIB-1) и клинико-морфологические параметры Пк. № 1 2 3 4 5 6 7 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая М±с.о. p 9,53±2,42 10,54±2,73 12,79±2,41 1-2: 0,1 1-3: <0,001 2-3: 0,003 9,46±2,60 11,44±2,63 4-5: <0,001 9,96±2,58 11,91±2,70 6-7: <0,001 9,83±2,64 10,92±2,61 12,71±2,51 10-11: 0,058 10-12: <0,001 11-12: 0,02 9,70±2,61 10,82±2,60 11,93±2,97 13-14: 0,04 13-15: 0,007 14-15: 0,1 При размере первичной опухоли менее 3 см Ag-ЯОР-белки (MIB-1) была меньше, чем в опухоли более 3 см (рисунок 14в,г). Найдено статистически значимое увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) в Пк с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 14д,е). Ag-ЯОР-белки (MIB-1) последовательно возрастает в 1, 2 и 3 стадию заболевания, однако, достоверное отличие найдено между 3 стадией и 1, 2 стадиями; между 1 и 2 стадиями – на уровне тенденции статистической значимости. Также последовательное увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) прослеживается при снижении дифференцировки опухоли, статистически значимое отличие найдено при высокодифференцированной карциноме по сравнению с умерено и низкодифференцированной (рисунок 1 а, б). В Пк Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,33, р<0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,35, р<0,001), показателем N (r=0,34, р<0,001), стадией процесса (r=0,34, р<0,001) и дифференцировкой (r=0,25, р<0,01). 111 4.2. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 27. Таблица 27. Ag-ЯОР-белки (MIB-1) и молекулярно-биологические маркеры при НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках ˂ 10,47 ≥ 10,47 5,49±1,29 7,60±1,39 29,24±4,45 32,05±4,25 199,1 (113,6-330,1) 410,13 (274,3-663,7) 24 (15-38) 31 (21-51) 17 (11-24) 23 (14-29) 38 (36) 50 (50) 28 (27) 11 (11) 57 (54) 56 (55) 42 (34-61) 47 (31-60) 4 (1-9) 4 (2-9) 43 (46) 53 (55) 6 (6) 12 (13) р ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,001 0,001 0,04 0,004 0,9 0,9 0,4 0,02 0,1 Так как при НМКРЛ медиана Ag-ЯОР-белков (MIB-1) составила 10,47 мкм², то случаи с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) 10,47 мкм² и более считались с большой площадью (101 случай – 49%), до 10,47 мкм² – с небольшой (106 случаев – 51%). В НМКРЛ при увеличении Ag-ЯОР-белков (MIB-1) отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. Также в группе опухолей с большой Ag-ЯОРбелками (MIB-1) отмечалось большее количество р53-положительных случаев, меньшее количество bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с положительным ИГХ Her2 статусом. При НМКРЛ Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,71, р<0,001), КВ AgЯОР-белков (r=0,39, р<0,001), показателем пролиферации (r=0,49, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,27, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,26, р<0,001), р53 положитель- 112 ной экспрессией (r=0,20, р<0,05), bcl-2 отрицательной экспрессией (r=-0,22, р<0,01) и ИГХ Her2 статусом (r=0,17, р<0,05). Результаты определения Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 28. Так как при Ак среднее значение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) составило 10,56 мкм², то случаи с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) 10,56 мкм² и более считались с большой площадью (44 случая – 47%), до 10,56 мкм² – с небольшой (50 случаев – 53%). Таблица 28. Ag-ЯОР-белки (MIB-1) и молекулярно-биологические маркеры Ак. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках ˂ 10,56 ≥ 10,56 4,82±1,19 7,37±1,38 28,18±4,59 31,49±4,48 145,3 (37,9-268,8) 403,6 (195,7-584,3) 16 (4-30) 27 (16-47) 12 (4-17) 19 (11-27) 15 (30) 18 (41) 9 (18) 3 (7) 29 (58) 31 (70) 43 (38-58) 51 (36-73) 4 (2-10) 4 (2-10) 28 (62) 25 (61) 5 (10) 10 (24) р ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,004 0,002 0,3 0,1 0,2 0,4 1,0 0,9 0,1 В Ак при увеличении Ag-ЯОР-белков (MIB-1) отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. При Ак Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела корреляцию с ИП Ag-ЯОРбелков (r=0,76, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,45, р<0,001), показателем пролиферации (r=0,52, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,31, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,32, р<0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи Ag-ЯОРбелков (MIB-1) с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ, за исключением экспрессии р53, bcl-2 и ИГХ Her2 статуса – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Ак. Результаты определения Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках 113 Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 29. Так как при Пк среднее значение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) составило 10,67 мкм², то случаи с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) 10,67 мкм² и более считались с большой площадью (57 случаев – 50%), до 10,67 мкм² – с небольшой (56 случаев – 50%). Таблица 29. Ag-ЯОР-белки (MIB-1) и молекулярно-биологические маркеры Пк. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках ˂ 10,67 ≥ 10,67 6,08±1,08 7,79±1,38 30,18±4,13 32,49±4,04 262,4 (176,5-369,6) 422,9 (333,0-681,3) 30 (22-40) 33 (27-52) 20 (17-27) 25 (17-30) 23 (42) 32 (56) 19 (35) 8 (14) 28 (51) 25 (44) 39 (26-62) 41 (29-56) 4 (1-7) 4 (2-8) 15 (31) 28 (50) 1 (2) 2 (4) р ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,08 0,1 0,1 0,01 0,4 0,7 0,2 0,04 0,6 В Пк при увеличении Ag-ЯОР-белков (MIB-1) отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков и ПП. Также в группе опухолей с большой Ag-ЯОР-белками (MIB-1) отмечалось меньшее количество bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с положительным ИГХ Her2 статусом. При Пк Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,74, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,41, р<0,001), показателем пролиферации (r=0,55, р<0,001), bcl-2 отрицательной экспрессией (r=-0,26, р<0,05) и ИГХ Her2 статусом (r=0,21, р<0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи Ag-ЯОР-белков (MIB-1) с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα и экспрессии р53 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк. 114 4.3. Показатель пролиферации и клинико-морфологические параллели В НМКРЛ ПП составил 304,2 (172,9-476,5); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,92, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 11,6, максимальное – 1245,7. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,07) и значительной островершинностью (эксцесс 0,97) (рисунок 16а). Рисунок 16. Гистограммы распределения ПП при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах). Результаты определения ПП при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 22 и 23. Найдено статистически значимое увеличение ПП при НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не вза- 115 имосвязан с показателем пролиферации. Пол больных НМКРЛ и Ак имел умеренную корреляцию с показателем пролиферации (соответственно r=0,32 и r=0,42, р<0,001). Результаты определения ПП при НМКРЛ во взаимосвязи с клиникоморфологическими параметрами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 30. Таблица 30. ПП и клинико-морфологические параметры при НМКРЛ. Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Гистогенез Ак Пк Дифференцировка высокая умеренная-низкая Ме (и.и.) p 222,0 (96,8-409,7) 330,1 (192,2-531,5) 0,006 203,5 (110,6-405,9) 345,2 (215,0-558,4) <0,001 273,4 (145,3-409,7) 384,7 (214,1-618,0) 0,003 248,5 (137,5-404,7) 357,7 (214,1-575,0) <0,001 218,4 (80,3-454,1) 343,3 (222,0-558,4) <0,001 192,5 (96,8-330,1) 343,8 (195,4-532,5) <0,001 Отмечалось увеличение ПП в группе Т2-3 по сравнению с Т1. При размере первичной опухоли менее 3 см ПП был меньше, чем в опухоли более 3 см. Найдено увеличение ПП при НМКРЛ с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 1 а, б). ПП был меньше в I стадию заболевания по сравнению с II-III стадиями, а также при Ак по сравнению с Пк. ПП был больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой (рисунок 1 в, г). В НМКРЛ ПП имел корреляцию с показателем Т (r=0,29, р=0,006), наибольшим размером опухоли (r=0,39, р<0,001), показателем N (r=0,30, р=0,003), стадией заболевания (r=0,33, р<0,001), гистогенезом (r=0,37, 116 р<0,001) и дифференцировкой (r=0,37, р<0,001). В Ак ПП составил 218,4 (80,3-454,1) ; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,89, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 11,6, максимальное – 1245,7. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,19) и значительной островершинностью (эксцесс 1,55) (рисунок 16б). Результаты определения ПП при Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 31. Таблица 31. ПП и клинико-морфологические параметры при Ак. № 1 2 3 4 5 6 7 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая М (и.и.) p 169,5 (43,9-365,2) 233,3 (110,6-454,1) 237,8 (195,7-509,5) 1-2, 3: 0,2 2-3: 0,6 145,9 (43,9-321,5) 261,9 (166,9-531,5) 4-5: 0,002 176,4 (66,1-409,7) 314,8 (175,3-517,0) 6-7: 0,048 169,5 (65,5-409,7) 218,4 (110,4-532,5) 263,6 (162,5-517,0) 10-11, 12: 0,2 11-12: 0,9 41,3 (23,3-110,6) 255,5 (120,7-454,1) 268,8 (176,9-534,3) 13-14, 15: <0,001 14-15: 0,3 Отмечалось последовательное увеличение ПП в группах Т1, Т2, Т3 и при I, II, III стадиях заболевания, однако, отличия статистически не значимые. При размере первичной опухоли менее 3 см ПП была меньше, чем в опухоли более 3 см. Найдено статистически значимое увеличение ПП в Ак с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 1 в, г). ПП достоверно больше при высокодифференцированной Ак по сравнению с умерено и низкодифференцированной (рисунок 1 а, б). В Ак ПП имел умеренную корреляцию с наиболь- 117 шим размером опухоли (r=0,31, р=0,002), дифференцировкой (r=0,45, р<0,001) и слабую корреляцию с показателем N (r=0,23, р=0,048). Таблица 32. ПП и клинико-морфологические параметры при Пк. № 1 2 3 4 5 6 7 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая Ме (и.и.) p 260,8 (163,5-420,3) 327,3 (214,2-476,0) 558,4 (402,5-683,3) 1-2: 0,2 1-3: 0,001 2-3: <0,001 279,6 (172,9-420,3) 353,5 (286,7-595,6) 4-5: 0,01 323,9 (202,3-411,5) 420,3 (274,3-663,7) 6-7: 0,02 297,3 (193,8-389,1) 358,6 (247,5-663,7) 451,2 (357,7-664,2) 10-11: 0,03 10-12: 0,001 11-12: 0,2 291,8 (168,2-383,8) 344,4 (248,5-558,4) 480,2 (375,7-705,5) 13-14: 0,02 13-15: <0,001 14-15: 0,02 В Пк ПП составил 343,3 (222,0-558,4); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,89, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 83,3, максимальное – 1178,6. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,15) и значительной островершинностью (эксцесс 0,85) (рисунок 16в). Результаты определения ПП Пк во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 32. Отмечалось последовательное увеличение ПП в группах Т1, Т2 и Т3, однако, статистически значимое отличие найдено только для Т3 по сравнению с Т1 и Т2. При размере первичной опухоли менее 3 см ПП был меньше, чем в опухоли более 3 см. Найдено статистически значимое увеличение ПП в Пк с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 1 в, г). ПП последовательно увеличи- 118 вался в I, II и III стадию заболевания, однако, достоверное отличие найдено только для I стадии. Последовательное увеличение ПП найдено при снижении дифференцировки опухоли (рисунок 1 а, б). В Пк ПП имел умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,35, р<0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,25, р=0,01), стадией процесса (r=0,32, р<0,001), дифференцировкой (r=0,31, р<0,01) и слабую корреляцию с показателем N (r=0,23, р=0,02). 4.4. Показатель пролиферации и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения ПП при НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 33. Так как при НМКРЛ медиана ПП составила 456,3, то случаи с показателем пролиферации 456,3 и более считались с большим показателем пролиферации (100 случаев – 50%), до 456,3 – с небольшим (100 случаев – 50%). Таблица 33. ПП и молекулярно-биологические маркеры при НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ПП р ˂ 456,6 5,88±1,57 29,14±4,18 8,99 (7,70-11,12) 19 (13-25) 14 (8-21) 39 (34) 25 (22) 42 (49) 43 (34-61) 4 (2-6) 52 (50) 2 (2) ≥ 456,3 7,31±1,52 32,44±4,42 12,16 (10,43-13,76) 47 (36-60) 27 (19-35) 45 (52) 13 (15) 71 (62) 45 (31-60) 4 (2-11) 43 (53) 16 (15) ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,01 0,2 0,04 0,9 0,3 0,7 0,003 В НМКРЛ при увеличении ПП отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. Также в группе опухолей с большим показателем пролиферации отмечалось большее количество р53 и bax положительных случаев и большее 119 количество случаев с амплификацией гена Her2. При НМКРЛ ПП имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,43, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,49, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,74, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,52, р<0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,25, р<0,001), bax положительной экспрессией экспрессией (r=0,20, р<0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,21, р<0,01). Результаты определения ПП при Ак во взаимосвязи с молекулярнобиологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 34. Так как при Ак медиана ПП составила 327,6, то случаи с показателем пролиферации 327,6 и более считались с большим показателем пролиферации (46 случаев – 51%), до 327,6 – с небольшим (45 случаев – 49%). Таблица 34. ПП и молекулярно-биологические маркеры при Ак. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ПП р ˂ 327,6 5,23±1,49 27,84±4,54 9,27±2,60 9 (4-16) 6 (4-13) 11 (24) 6 (13) 26 (57) 50 (37-75) 4 (2-10) 27 (68) 4 (10) ≥ 327,6 6,73±1,79 31,38±4,41 11,79±2,82 39 (27-53) 22 (18-34) 20 (43) 6 (13) 34 (76) 47 (38-60) 4 (2-9) 26 (59) 11 (28) ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 ˂0,001 0,04 0,9 0,1 0,7 0,8 0,4 0,03 В Ак при увеличении ПП отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. Также в группе опухолей с большим показателем пролиферации отмечалось большее количество р53 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При Ак ПП имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,48, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,39, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,52, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,77, р<0,001), ИМ 120 ТороIIα (r=0,57, р<0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,28, р<0,05) и амплификацией гена Her2 (r=0,26, р<0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ПП с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ, за исключением экспрессии bax – взаимосвязь с которой отсутствовала при Ак. Результаты определения ПП при Пк во взаимосвязи с молекулярнобиологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 35. Так как при Пк медиана ПП составила 514,9, то случаи с показателем пролиферации 514,9 и более считались с большим показателем пролиферации (55 случаев – 50%), до 514,9 – с небольшим (54 случая – 50%). Таблица 35. ПП и молекулярно-биологические маркеры при Пк. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ПП р ˂ 514,9 6,11±1,08 30,07±3,72 9,15±2,25 22 (17-26) 20 (16-24) 16 (36) 16 (36) 22 (50) 38 (28-59) 4 (3-5) 14 (35) 1 (3) ≥ 514,9 7,46±1,48 32,18±4,40 11,77±2,57 43 (31-55) 25 (17-31) 37 (57) 10 (15) 31 (48) 41 (29-57) 5 (1-10) 28 (46) 2 (3) ˂0,001 0,007 ˂0,001 ˂0,001 0,01 0,04 0,01 0,8 0,6 0,3 0,3 0,8 В Пк при увеличении ПП отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. Также в группе опухолей с большим показателем пролиферации отмечалось большее количество р53 положительных случаев и меньшее количество bcl-2 положительных случаев. При Пк ПП имел корреляцию с ИП AgЯОР-белков (r=0,46, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,41, р<0,001), Ag-ЯОРбелками (MIB-1) (r=0,55, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,79, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,29, р<0,05), р53 положительной экспрессией (r=0,23, р<0,05), bcl-2 отри- 121 цательной экспрессией (r=-0,24, р<0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ПП с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением экспрессии bax и амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк. Однако, при Пк по сравнению с НМКРЛ отмечается корреляция ПП с экспрессией bcl-2. Суммируя данные результатов исследования Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое повышение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Имеется гендерная взаимосвязь с показателем пролиферации, так как найдено статистически значимое увеличения ПП у лиц мужского пола по сравнению с женским. AgЯОР-белки (MIB-1) и ПП были взаимосвязаны с основными клиникоморфологическими параметрами по системе TNM: показателем Т, наибольшим размером опухоли, показателем N, стадией процесса, гистогенезом и дифференцировкой. Также Ag-ЯОР-белки (MIB-1) и ПП имели корреляцию с большинством молекулярно-биологических маркеров: ИП и КВ Ag-ЯОРбелков, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, экспрессией р53, bcl-2, bax, ИГХ Her2 статусом и амплификацией гена Her2. Таким образом, исследование Ag-ЯОРбелков (MIB-1) и ПП является важной молекулярно-биологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования. 122 ГЛАВА 5. МАРКЕРЫ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ При проведении иммуногистохимического окрашивания на антиген Ki67 и ТороIIα окрашивались ядра эпителиальных клеток и ядра пролиферирующих клеток лимфатических фолликулов, воспалительного инфильтрата стромы от светло- до темно-коричневого цвета. Рисунок 17. Экспрессия Ki-67 (а) и ТороIIα (б) в неизмененном эпителии бронхов. Иммуногистохимический метод, х400. По выраженности (интенсивности) окрашивания эпителиальных клеток на антиген Ki-67 можно было выделить три типа ядер интерфазных клеток: гранулярный, гранулярно-диффузный и диффузный [Lindboe C.F., Torp S.H., 2002]. Гранулярный тип окрашивания – соответствовал незначительной интенсивности окрашивания ядер клеток - характеризовался отсутствием или незначительным окрашиванием ядра (нуклеоплазмы), на фоне которой четко выделялись интенсивно прокрашенные ядрышки в виде гранул. Гранулярнодиффузный тип окрашивания – соответствовал умеренной интенсивности окрашивания ядер клеток - характеризовался умеренным окрашиванием нуклеоплазмы (более интенсивным по сравнению с гранулярным типом), на фоне которой определялась гранулярность (более интенсивно окрашенные ядрышки). Диффузный тип окрашивания – соответствовал выраженной интенсивности окрашивания ядер клеток - характеризовался равномерным, интенсивным окрашиванием ядра, ядрышки не дифференцировались. Разная интенсивность окрашивания ядер интерфазных клеток (ядрышек и нуклео- 123 плазмы) зависит от фазы клеточного цикла и последовательного изменения локализации антигена Ki-67 в ядре на протяжении клеточного цикла. В фазе митоза также определяется окрашивание хромосом делящихся ядер - интенсивного, равномерного типа, причем форма окрашивания полностью соответствует морфологической форме митоза или патологического митоза (рис. 21). При определении ИМ Ki-67 окрашенные хромосомы в М-фазе не подсчитывались. Окрашивание на антиген ТороIIα имело интенсивный, равномерный, диффузный характер окрашивания ядра, ядрышки не дифференцировались. В неизмененном эпителии альвеол ИМ Ki-67 и ТороIIα составил менее 1% (единичные положительные клетки). В неизмененном эпителии бронхов ИМ Ki-67 составил 4 (1-8)%, ИМ ТороIIα - менее 1% (единичные положительные клетки). Ki-67 и ТороIIα позитивные клетки определялись в базальном слое и нижней трети эпителия бронха. В НМКРЛ наблюдалось повышение ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р<0,001) (рисунок 17). Экспрессия антигена Ki-67 исследована в 215 НМКРЛ, из них 97 Ак и 118 Пк. Экспрессия антигена ТороIIα исследована в 193 НМКРЛ, из них 82 Ак и 111 Пк. 5.1. Ki-67 и клинико-морфологические параллели В НМКРЛ ИМ Ki-67 составил 25 (18-42)% ; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,93, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 2%, максимальное – 95%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,93) и значительной островершинностью (эксцесс 0,62) (рисунок 18а). Результаты определения ИМ Ki-67 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 36 и 37. Найдено статистически значимое увеличение ИМ Ki-67 в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола 124 больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с ИМ Ki-67. Пол больных НМКРЛ и Ак имел умеренную корреляцию с ИМ Ki-67 (соответственно r=0,37 и r=0,42, р<0,001). Рисунок 18. Гистограммы распределения ИМ Ki-67 при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах). Таблица 36. Пол больных НМКРЛ, Ак, Пк и ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα. Маркер Пол мужской НМКРЛ ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ак ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Пк ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα р женский 30 (19-45) 20 (13-28) 14 (5-22) 7 (3-17) ˂0,001 ˂0,001 27 (16-47) 17 (9-25) 9 (4-18) 4 (3-14) ˂0,001 ˂0,001 30 (23-45) 22 (16-28) 30 (27-31) 25 (22-28) 0,9 0,6 125 Таблица 37. Возраст больных НМКРЛ, Ак, Пк и и ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα. Маркер Возраст ˂ 59 лет НМКРЛ ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ак ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Пк ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα р ≥ 59 лет 30 (18-47) 20 (12-28) 27 (17-40) 19 (12-25) 0,2 0,4 19 (11-39) 12 (7-21) 21 (10-37) 14 (4-22) 0,9 1,0 32 (22-52) 23 (17-30) 28 (23-42) 22 (16-27) 0,1 0,5 Результаты определения ИМ Ki-67 при НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 38. Отмечалось увеличение ИМ Ki-67 в группах Т2-3 по сравнению с Т1 (показатель Т), N1-3 по сравнению с N0 (показатель N), II-III по сравнению с I (стадия заболевания), однако, статистически значимого отличия не было получено. Таблица 38. ИМ Ki-67 и клинико-морфологические параметры при НМКРЛ. Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Гистогенез Ак Пк Дифференцировка высокая умеренная-низкая Ме (и.и.) р 22 (15-38) 28 (19-43) 0,1 22 (13-38) 30 (21-45) ˂0,01 27 (16-40) 29 (20-45) 0,2 26 (16-39) 29 (19-46) 0,09 20 (11-38) 30 (23-45) ˂0,001 19 (13-32) 30 (20-45) ˂0,001 126 Рисунок 19. Экспрессия Ki-67 при Ак с разным наибольшим размером новообразования (а, в, д – < 3 см; б, г, е - ≥ 3 см) и разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома). Иммуногистохимический метод, х400. Статистически значимые отличия ИМ Ki-67 получены в следующих группах: наибольший размер опухоли (до 3 см и более 3 см), гистогенез (Ак и Пк), дифференцировка (высокодифференцированная и умерено, низкодиф- 127 ференцированная опухоль) (рисунок 19, 20). ИМ Ki-67 при НМКРЛ имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,21, р˂0,01), дифференцировкой (r=0,22, р˂0,01) и умеренную корреляцию с гистогенезом (r=0,31, р˂0,001). Таким образом, пролиферативная активность увеличивается в процессе увеличения размера НМКРЛ и при Пк по сравнению с Ак. В опухолях без солидизации (высокодифференцированные) по сравнению с опухолями с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированные) минимально содержание антигена Ki-67. Таблица 39. ИМ Ki-67 и клинико-морфологические параметры при Ак. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N1 N2 N3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая Ме (и.и.) р 19 (5-44) 20 (11-36) 25 (14-38) 1-2: р=0,8 2-3: р=0,5 1-3: р=0,5 16 (5-35) 25 (16-41) 4-5: р=0,02 19 (8-37) 24 (18-40) 27 (10-41) 26 (24-28) 6-7,8,9: р˃0,2 7-8,9: р=0,9 8-9: р=0,9 19 (9-39) 22 (11-38) 27 (18-40) 10-11: р=0,6 11-12: р=0,5 10-12: р=0,3 6 (4-17) 20 (12-38) 35 (18-52) 13-14: р˂0,001 14-15: р=0,04 13-15: р˂0,001 В Ак ИМ Ki-67 составил 20 (11-38)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,92, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 2%, максимальное – 92%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,93) и умеренной островершинностью (эксцесс 0,49) (рисунок 18б). Результаты определения ИМ Ki-67 в Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 39. 128 Рисунок 20. Экспрессия Ki-67 при Пк с разным показателем Т (а, в, д – Т1-2; б, г, е – Т3) и разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома). Иммуногистохимический метод, х400. Отмечалось последовательное увеличение ИМ Ki-67 в Ак в группах Т1, Т2, Т3 (показатель Т), N0, N1, N2 (показатель N), I, II, III (стадия заболева- 129 ния), однако, достоверного отличия не было получено. Статистически значимые отличия ИМ Ki-67 получены в следующих группах: наибольший размер опухоли (до 3 см и более 3 см), дифференцировка (высокая и умеренаянизкая) (рисунок 19). ИМ Ki-67 в Ак имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,25, р=0,02), дифференцировкой (r=0,23, р=0,03). Таким образом, пролиферативная активность увеличивается в процессе увеличения размера Ак. Также в опухоли без солидизации (высокодифференцированная) по сравнению с опухолью с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированная) минимально значение ИМ Ki-67. Таблица 40. ИМ Ki-67 и клинико-морфологические параметры при Пк. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N1 N2 N3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая Ме (и.и.) р 26 (18-38) 30 (23-45) 42 (30-53) 1-2: р=0,2 2-3: р=0,04 1-3: р=0,02 29 (18-41) 31 (24-46) 4-5: р=0,2 30 (22-42) 32 (24-53) 31 (24-38) 35 (28-41) 6-7,8,9: р˃0,2 7-8,9: р=0,8 8-9: р=0,9 29 (22-42) 31 (21-55) 38 (28-45) 10-11: р=0,3 11-12: р=0,8 10-12: р=0,1 24 (17-42) 30 (25-43) 42 (30-52) 13-14: р=0,04 14-15: р=0,04 13-15: р=0,006 В Пк ИМ Ki-67 составил 30 (23-45)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,89, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 11%, максимальное – 95%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,17) и значи- 130 тельной островершинностью (эксцесс 0,83) (рисунок 18в). Результаты определения ИМ Ki-67 в эпителиальных клетках Пк в связи с клиникоморфологическими параметрами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 40. Отмечалось последовательное увеличение ИМ Ki-67 в Пк в группах Т1, Т2, Т3, однако, статистически значимое отличие получено только между Т3 и Т1, Т2. ИМ Ki-67 возрастал в группах опухолей до 3 см и более 3 см (наибольший размер), N0, N1, N2, N3 (показатель N), I, II и III стадии заболевания; однако, статистически значимого отличия не было получено. Достоверное отличие ИМ Ki-67 получено в ряду высоко-, умерено и низкодифференцированный Пк (рисунок 20). ИМ Ki-67 в Пк имел слабую корреляцию с показателем Т (r=0,24, р=0,008) и умеренную корреляцию с дифференцировкой (r=0,33, р р˂0,001). 5.2. Ki-67 и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения ИМ Ki-67 при НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 41. Так как при НМКРЛ медиана ИМ Ki-67 составила 25%, то случаи с ИМ Ki-67 25% и более считались с большим ИМ Ki-67 (116 случаев – 54%), до 25% – с небольшим (99 случаев – 46%). В НМКРЛ при увеличении ИМ Ki-67 отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и ИМ ТороIIα. Также в группе опухолей с большим ИМ Ki-67 отмечалось большее количество р53 и bax положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При НМКРЛ ИМ Ki-67 имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,35, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,27, р<0,001), ПП (r=0,74, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,68, р<0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,22, р<0,01), bax положительной экспрессией (r=0,23, р<0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,16, р<0,05). 131 Таблица 41. ИМ Ki-67 и молекулярно-биологические маркеры при НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ИМ Ki-67 р ˂ 25 6,14±1,55 29,10±4,17 9,81 (8,13-12,30) 168,8 (80,2-239,2) 14 (6-22) 30 (30) 19 (19) 60 (52) 41 (33-64) 4 (2-7) 44 (48) 5 (6) ≥ 25 6,84±1,69 31,73±4,67 10,96 (8,97-13,11) 450,8 (324,4-663,6) 23 (17-31) 61 (53) 20 (17) 63 (64) 47 (34-59) 4 (2-10) 56 (52) 13 (12) 0,001 ˂0,001 0,02 ˂0,001 ˂0,001 0,001 0,7 0,04 0,9 0,5 0,5 0,04 Результаты определения ИМ Ki-67 при Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 42. Так как при Ак медиана ИМ Ki-67 составила 20%, то случаи с ИМ Ki-67 20% и более считались с большим ИМ Ki-67 (51 случай – 53%), до 20% – с небольшим (46 случаев – 47%). Таблица 42. ИМ Ki-67 и молекулярно-биологические маркеры при Ак. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ИМ Ki-67 р ˂ 20 5,57±1,70 28,18±4,44 9,69±2,76 66,0 (30,6-166,9) 6 (3-12) 9 (19) 5 (10) 32 (59) 48 (36-78) 4 (1-10) 29 (64) 4 (10) ≥ 20 6,48±1,77 31,15±4,53 11,35±2,98 413,3 (277,1-549,1) 20 (17-29) 27 (50) 7 (13) 34 (71) 48 (39-60) 4 (2-9) 31 (63) 11 (24) 0,004 0,001 0,008 ˂0,001 ˂0,001 0,001 0,7 0,2 0,8 1,0 0,9 0,02 132 В Ак при увеличении ИМ Ki-67 отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и ИМ ТороIIα. Также в группе опухолей с большим ИМ Ki-67 отмечалось большее количество р53 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При Ак ИМ Ki-67 имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,37, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,41, р<0,001), AgЯОР-белками (MIB-1) (r=0,31, р<0,001), ПП (r=0,77, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,71, р<0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,28, р<0,001) и амплификацией гена Her2 (r=0,21, р<0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИМ Ki-67 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ, за исключением экспрессии bax – взаимосвязь с которой отсутствовала при Ак. Результаты определения ИМ Ki-67 при Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 43. Так как при Пк медиана ИМ Ki-67 составила 30%, то случаи с ИМ Ki-67 30% и более считались с большим ИМ Ki-67 (65 случаев – 55%), до 30% – с небольшим (53 случая – 45%). Таблица 43. ИМ Ki-67 и молекулярно-биологические маркеры при Пк. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ИМ Ki-67 р ˂ 30 6,60±1,25 30,03±3,79 10,46±2,73 214,2 (163,5-306,5) 20 (14-24) 23 (43) 15 (28) 29 (43) 38 (30-58) 4 (2-6) 18 (35) 1 (2) ≥ 30 7,22±1,58 32,27±4,68 10,90±2,76 474,9 (346,0-697,8) 25 (18-32) 38 (56) 14 (21) 30 (56) 39 (29-58) 5 (1-11) 26 (42) 2 (3) 0,03 0,01 0,4 ˂0,001 ˂0,001 0,1 0,3 0,2 0,5 0,3 0,5 0,7 В Пк при увеличении ИМ Ki-67 отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ПП и ИМ ТороIIα. При Пк ИМ Ki-67 133 имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,39, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,39, р<0,001), ПП (r=0,79, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,73, р<0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИМ Ki-67 с молекулярно- биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением Ag-ЯОР-белков (MIB-1), экспрессии р53, bax и амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк. 5.3 Топоизомераза IIα и клинико-морфологические параллели В НМКРЛ ИМ ТороIIα составил 19 (12-27)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,91, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 1%, максимальное – 80%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,26) и значительной островершинностью (эксцесс 2,41) (рисунок 21а). Рисунок 21. Гистограммы распределения ИМ ТороIIα при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах). 134 Результаты определения ИМ ТороIIα при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 36 и 37. Найдено статистически значимое увеличение ИМ ТороIIα в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с ИМ ТороIIα. Пол больных НМКРЛ и Ак имел умеренную корреляцию с ИМ ТороIIα (соответственно r=0,32 и r=0,38, р<0,001). Таблица 44. ИМ ТороIIα и клинико-морфологические параметры НМКРЛ. Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Гистогенез Ак Пк Дифференцировка высокая умеренная-низкая Ме (и.и.) р 18 (9-25) 20 (12-28) 0,2 17 (9-22) 22 (13-29) ˂0,001 18 (11-25) 20 (13-27) 0,3 18 (11-24) 21 (12-28) 0,1 14 (6-21) 22 (16-28) ˂0,001 16 (9-23) 20 (12-28) ˂0,01 Результаты определения ИМ ТороIIα в НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 44. Отмечалось увеличение ИМ ТороIIα в группах Т2-3 по сравнению с Т1 (показатель Т), N1-3 по сравнению с N0 (показатель N), IIIII по сравнению с I (стадия заболевания), однако, статистически значимого отличия не было получено. Статистически значимые отличия ИМ ТороIIα получены в следующих группах: наибольший размер опухоли (до 3 см и 135 Рисунок 22. Экспрессия ТороIIα при Ак с разным наибольшим размером новообразования (а, в, д – < 3 см; б, г, е - ≥ 3 см) и разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома). Иммуногистохимический метод, х400. 136 более 3 см), гистогенез (Ак и Пк), дифференцировка (высокая и умеренаянизкая) (рисунок 22,23). ИМ ТороIIα при НМКРЛ имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,25, р˂0,001), дифференцировкой (r=0,23, р˂0,01) и умеренную корреляцию с гистогенезом (r=0,38, р˂0,001). Таким образом, активность ТороIIα увеличивается в процессе увеличения размера НМКРЛ и при Пк по сравнению с Ак. В опухолях без солидизации (высокодифференцированные) по сравнению с опухолями с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированные) минимальный ИМ ТороIIα. Вероятно, при Ак, в процессе роста и снижении дифференцировки опухоли происходит увеличение активности ТороIIα, связанное как с увеличением пролиферативной активности опухоли, так и с изменением функциональных процессов мутированной ДНК. Результаты определения ИМ ТороIIα в Ак во взаимосвязи связи с клинико-морфологическими параметрами представлены в таблице 45. Таблица 45. ИМ ТороIIα и клинико-морфологические параметры при Ак. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N1 N2 N3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая Ме (и.и.) р 13 (4-20) 13 (6-22) 17 (10-24) 1-2: р=0,5 2-3: р=0,3 1-3: р=0,2 11 (4-18) 17 (8-25) 4-5: р=0,02 12 (4-19) 17 (8-24) 18 (6-27) 16 6-7: р=0,2 7-8: р=0,9 6-8: р=0,4 12 (4-20) 13 (8-19) 18 (8-24) 10-11: р=0,5 11-12: р=0,5 10-12: р=0,2 4 (3-8) 12 (7-22) 18 (12-28) 13-14: р˂0,001 14-15: р=0,08 13-15: р˂0,001 137 Рисунок 23. Экспрессия ТороIIα при Пк с разным наибольшим размером новообразования (а, в, д – < 3 см; б, г, е - ≥ 3 см) и разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома). Иммуногистохимический метод, х400. В Ак ИМ ТороIIα составил 14 (6-21)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,84, р˂0,001). Минимальное значение 138 выборки составило 1%, максимальное – 80%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,81) и значительной островершинностью (эксцесс 4,50) (рисунок 21б). Отмечалось последовательное увеличение ИМ ТороIIα в Ак в группах Т1, Т2, Т3 (показатель Т), N0, N1, N2 (показатель N), I, II, III (стадия заболевания), однако, статистически значимого отличия не было получено. Статистически значимые отличия ИМ ТороIIα получены в следующих группах: наибольший размер опухоли (до 3 см и более 3 см), дифференцировка (высокая и умереная-низкая) (рисунок 22). ИМ ТороIIα в Ак имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,25, р=0,02), дифференцировкой (r=0,33, р=0,002). Таким образом, активность ТороIIα увеличивается в процессе увеличения размера Ак. Также в опухолях без солидизации (высокодифференцированные) по сравнению с опухолями с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированные) минимально содержание ТороIIα. Таблица 46. ИМ ТороIIα и клинико-морфологические параметры при Пк. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Характеристика Первичная опухоль Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N1 N2 N3 Стадия I II III Дифференцировка высокая умеренная низкая Ме (и.и.) р 21 (16-26) 22 (14-30) 26 (22-35) 1-2: р=0,9 2-3: р=0,01 1-3: р=0,02 19 (15-25) 24 (17-31) 4-5: р=0,02 21 (16-29) 23 (14-33) 25 (22-27) 27 (25-28) 6-7: р=0,2 7-8: р=0,8 6-8: р=0,2 20 (14-27) 23 (17-32) 26 (22-28) 10-11: р=0,2 11-12: р=0,2 10-12: р=0,008 19 (15-26) 23 (18-28) 26 (21-35) 13-14: р=0,2 14-15: р=0,2 13-15: р=0,01 139 В Пк ИМ ТороIIα составил 22 (16-28)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,89, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 5%, максимальное – 64%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,33) и значительной островершинностью (эксцесс 2,12) (рисунок 21в). Результаты определения ИМ ТороIIα в эпителиальных клетках Пк в связи с клиникоморфологическими параметрами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 46. ИМ ТороIIα возрастал в в группах Т1, Т2, Т3, однако, статистически значимое отличие получено только между Т3 и Т1, Т2. Также отмечалось достоверное отличие ИМ ТороIIα между опухолями до 3 см и более 3 см (рисунок 23). Отмечалось последовательное увеличение ИМ ТороIIα в группах N0, N1, N2, N3 (показатель N), однако, статистически значимого отличия не было получено. Достоверное отличие ИМ ТороIIα получено между I и III стадиями заболевания, высоко- и низкодифференцированной опухолью (рисунок 23). ИМ ТороIIα в Пк имел слабую корреляцию с показателем Т (r=0,20, р=0,04), наибольшим размером опухоли (r=0,23, р=0,02), стадией (r=0,24, р=0,01). 5.4. Топоизомераза IIα и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения ИМ ТороIIα при НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 47. Так как при НМКРЛ медиана ИМ ТороIIα составила 19%, то случаи с ИМ ТороIIα 19% и более считались с большим ИМ ТороIIα (99 случаев – 52%), до 19% – с небольшим (94 случая – 48%). В НМКРЛ при увеличении ИМ ТороIIα отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и ИМ Ki-67. Также в группе опухолей с большим ИМ ТороIIα отмечалось большее количество р53 и bax положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При НМКРЛ ИМ ТороIIα имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,32, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,26, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,26, р<0,001), ПП (r=0,52, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,68, р<0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,21, р<0,05), 140 bax положительной экспрессией (r=0,19, р<0,05) и амплификацией гена Her2 (r=0,16, р<0,05). Таблица 47. ИМ ТороIIα и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ИМ ТороIIα р ˂ 19 6,05±1,60 29,72±4,66 9,43 (7,79-12,12) 184,7 (105,6-322,4) 19 (11-28) 33 (35) 16 (17) 47 (47) 42 (34-65) 3 (1-8) 48 (56) 4 (4) ≥ 19 7,05±1,72 31,14±4,29 11,16 (8,99-13,20) 409,4 (286,6-657,3) 38 (27-53) 49 (49) 18 (18) 58 (62) 43 (31-59) 4 (2-9) 39 (41) 12 (14) ˂0,001 0,03 0,003 ˂0,001 ˂0,001 0,04 0,8 0,04 0,5 0,3 0,3 0,02 Результаты определения ИМ ТороIIα при Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 48. Так как при Ак медиана ИМ ТороIIα составила 14%, то случаи с ИМ ТороIIα 14% и более считались с большим ИМ ТороIIα (42 случая – 51%), до 14% – с небольшим (40 случаев – 49%). В Ак при увеличении ИМ ТороIIα отмечалось увеличение количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и ИМ Ki-67. Также в группе опухолей с большим ИМ ТороIIα отмечалось большее количество р53 и bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При Ак ИМ ТороIIα имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,35, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,31, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,32, р<0,01), ПП (r=0,57, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,71, р<0,001), р53 и bcl-2 положительной экспрессией (соответственно r=0,25, р<0,01 и r=-0,22, р<0,05) и амплификацией гена Her2 (r=0,22, р<0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИМ ТороIIα с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ, за исключением ИП Ag-ЯОР-белков и экспрессии bax – взаимосвязь с которы- 141 ми отсутствовала при Ак. Однако, при Ак по сравнению с НМКРЛ отмечается корреляция ИМ ТороIIα с экспрессией bcl-2. Таблица 48. ИМ ТороIIα и молекулярно-биологические маркеры при Ак. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ИМ ТороIIα р ˂ 14 5,12±1,79 27,78±4,64 9,51±2,85 66,1 (30,0-169,5) 9 (4-17) 8 (20) 1 (3) 26 (62) 45 (36-75) 3 (1-9) 23 (62) 2 (5) ≥ 14 6,29±1,90 31,05±3,99 11,06±2,91 405,5 (215,0-534,3) 36 (22-52) 21 (50) 8 (19) 27 (68) 51 (39-67) 4 (2-10) 23 (59) 12 (23) 0,001 ˂0,001 0,01 ˂0,001 ˂0,001 0,005 0,02 0,6 0,7 0,2 0,8 0,02 Результаты определения ИМ ТороIIα при Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 49. Так как при Пк медиана ИМ ТороIIα составила 22%, то случаи с ИМ ТороIIα 22% и более считались с большим ИМ ТороIIα (61 случай – 55%), до 22% – с небольшим (50 случаев – 45%). В Пк при увеличении ИМ ТороIIα отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и ИМ Ki-67. При Пк ИМ ТороIIα имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,29, р<0,001), ПП (r=0,29, р=0,01), ИМ Ki-67 (r=0,73, р<0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИМ ТороIIα с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением Ag-ЯОР-белков (MIB-1), экспрессии р53, bax и амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк. 142 Таблица 49. ИМ ТороIIα и молекулярно-биологические маркеры при Пк. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ИМ ТороIIα р ˂ 22 6,61±1,20 30,33±4,17 10,03±2,78 290,9 (180,5-369,6) 26 (19-39) 22 (44) 15 (30) 22 (44) 38 (31-65) 3 (1-6) 20 (43) 1 (2) ≥ 22 7,31±1,64 31,85±4,39 11,24±2,65 404,7 (292,7-663,7) 37 (27-52) 31 (51) 10 (16) 30 (49) 40 (29-52) 4 (2-9) 21 (36) 1 (2) 0,01 0,04 0,1 0,01 ˂0,001 0,5 0,1 0,6 0,6 0,2 0,4 0,9 Суммируя данные результатов исследования ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое повышение ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Имеется гендерная взаимосвязь с ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα, так как найдено статистически значимое увеличение ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα у лиц мужского пола по сравнению с женским. ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα был взаимосвязан с основными клиникоморфологическими параметрами по системе TNM: наибольшим размером опухоли, гистогенезом и дифференцировкой. Также ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα имел корреляцию с большинством молекулярно-биологических маркеров: ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белками (MIB-1), ПП, р53 и bax положительной экспрессией и амплификацией гена Her2. Таким образом, исследование ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα является важной молекулярно-биологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования. 143 ГЛАВА 6. МАРКЕРЫ АПОПТОЗА Результат иммуногистохимической окраски определялся в виде окрашивания - от светло- до темно-коричневого оттенка. Ядерное равномерное окрашивание было характерным для р53 и цитоплазматическое гранулярное окрашивание - для bcl-2 и bax. В неизмененном эпителии альвеол отсутствовала экспрессия p53, bcl-2 и bax. В неизмененном эпителии бронхов отсутствовали p53-положительные клетки. В неизмененном эпителии бронхов bcl2-положительные клетки определялись только в базальном слое, ИМ bcl-2 составил менее 10%. В неизмененном эпителии бронхов bax-положительные клетки определялись во всех слоях, ИМ bax составил более 90% (рисунок 24). В клетках НМКРЛ наблюдалось повышение экспрессии p53, bcl-2 и bax по сравнению с неизмененным эпителием альвеол (р<0,001). В клетках НМКРЛ наблюдалось повышение экспрессии p53 и bcl-2 и снижение экспрессии bax по сравнению с неизмененным эпителием бронхов (р<0,001). Экспрессия р53, bcl-2 и bax исследована в 237 НМКРЛ, из них 109 Ак и 128 Пк. Рисунок 24. Экспрессия bcl-2 (а) и bax (б) в неизмененном эпителии бронхов. Иммуногистохимический метод, х400. 6.1. p53, bcl-2, bax и клинико-морфологические параллели При НМКРЛ положительная экспрессия р53 определялась в 104 случаях (44%) и в 133 случаях (56%) отрицательная экспрессия, положительная 144 экспрессия bcl-2 определялась в 43 случаях (18%) и в 194 случаях (82%) отрицательная экспрессия, положительная экспрессия bax определялась в 130 случаях (55%) и в 107 случаях (45%) отрицательная экспрессия. Таблица 50. Возраст и пол больных НМКРЛ, Ак, Пк и экспрессия p53, bcl-2, bax (абсолютное количество (%)). Маркер НМКРЛ p53 bcl-2 bax Ак p53 bcl-2 bax Пк p53 bcl-2 bax Пол мужской женский р Возраст ˂ 59 лет ≥ 59 лет р 93 (46) 38 (19) 104 (51) 11 (32) 5 (15) 26 (76) 0,1 0,6 0,006 46 (43) 19 (18) 56 (53) 58 (44) 24 (18) 74 (56) 0,8 0,9 0,6 30 (38) 9 (11) 46 (58) 9 (31) 4 (14) 23 (79) 0,5 0,7 0,04 16 (37) 5 (12) 28 (65) 23 (35) 8 (12) 41 (62) 0,8 0,9 0,8 63 (51) 29 (24) 58 (47) 2 (40) 1 (20) 3 (60) 0,6 0,9 0,6 30 (48) 14 (22) 28 (44) 35 (54) 16 (25) 33 (51) 0,5 0,8 0,5 Результаты определения экспрессии р53, bcl-2 и bax при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 50. Найдено статистически значимое увеличение положительной экспрессии bax при НМКРЛ у лиц женского пола по сравнению с мужским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с экспрессией р53, bcl-2 и bax. Пол больных НМКРЛ и Ак имел слабую корреляцию с положительной экспрессией bax (соответственно r=0,18 и r=0,20, р<0,05). Результаты исследования экспрессии р53, bcl-2 и bax при НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами представлены в таблице 51. Найдено статистически значимое увеличение количества случаев с положительной экспрессией р53 при Пк по сравнению с Ак (р˂0,05) – соответственно 65 случаев (51%) и 39 случаев (36%). Отмечается достоверное 145 увеличение количества случаев с положительной экспрессией bcl-2 в группе опухолей без метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями с наличием метастазов (р˂0,05; соответственно 34 случая (23%) и 9 случаев (10%)), при I стадии заболевания по сравнению со II-III стадиями (р˂0,01; соответственно 30 случаев (25%) и 13 случаев (11%)), а также в Пк по сравнению с Ак (р˂0,05; соответственно 30 случаев (23%) и 13 случаев (12%)). Количество случаев с положительной экспрессией bax достоверно больше в Ак по сравнению с Пк (р˂0,05; соответственно 69 случаев (63%) и 61 случай (48%)). В НМКРЛ гистогенез имел слабую корреляцию с р53 (r=0,15, р˂0,05), bcl-2 (r=0,15, р˂0,05) и bax (r=0,16, р˂0,05), показатель N и стадия процесса с bcl-2 (r=0,15, р˂0,05 и r=0,18, р˂0,01 соответственно). Таблица 51. Положительная экспрессия p53, bcl-2, bax и клиникоморфологические параметры при НМКРЛ (абсолютное количество (%)). Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Гистогенез Ак Пк Дифференцировка высокая умеренная-низкая Положительная экспрессия p53 bcl-2 bax 25 (40) 79 (45) 14 (22) 29 (17) 32 (51) 98 (56) 36 (37) 68 (49) 21 (21) 22 (16) 50 (51) 80 (56) 62 (41) 42 (48) 34 (23) 9 (10) 85 (57) 45 (52) 51 (43) 53 (45) 30 (25) 13 (11) 68 (57) 62 (53) 39 (36) 65 (51) 13 (12) 30 (23) 69 (63) 61 (48) 23 (40) 81 (45) 15 (26) 28 (16) 33 (57) 97 (54) 146 Рисунок 25. Положительная экспрессия р53 при НМКРЛ разного гистогенетического типа (а, в, д – при Ак; б, г, е – при Пк) и с разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома). Иммуногистохимический метод, х400. Таким образом, гистогенез НМКРЛ взаимосвязан с экспрессией р53 (выше при Пк), bcl-2 (выше при Пк) и bax (выше при Ак), что вероятно, от- 147 ражает взаимосвязь особенностей генетических нарушений и гистогенеза опухоли (рисунок 25, 26, 27). При появлении метастатического потенциала и в более поздних стадиях экспрессия белка bcl-2 снижается, что указывает и на снижение антиапоптотического влияния этого белка. При Ак положительная экспрессия р53 определялась в 39 случаях (36%) и в 89 случаях (64%) отрицательная экспрессия, положительная экспрессия bcl-2 определялась в 13 случаях (12%) и в 96 случаях (88%) отрицательная экспрессия, положительная экспрессия bax определялась в 69 случаях (63%) и в 40 случаях (37%) отрицательная экспрессия. Результаты исследования р53, bcl-2 и bax при Ак во взаимосвязи с клинико- морфологическими параметрами представлены в таблице 52. Не найдено статистически значимого отличия и корреляции количества случаев с положительной экспрессией р53, bcl-2 и bax в зависимости от клинико-морфологических параметром Ак – показателя Т, наибольшего размера опухоли, показателя N, стадии заболевания и дифференцировки. Таким образом, отсутствует взаимосвязь положительной экспрессии р53, bcl-2 и bax с клинико-морфологическими параметрами Ак. Таблица 52. Положительная экспрессия p53, bcl-2, bax и клиникоморфологические параметры при Ак (абсолютное количество (%)). Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Дифференцировка высокая умеренная-низкая Положительная экспрессия p53 bcl-2 bax 13 (37) 26 (35) 6 (17) 7 (10) 19 (54) 50 (68) 17 (33) 22 (38) 7 (14) 6 (10) 28 (55) 41 (71) 22 (33) 17 (40) 10 (15) 3 (7) 41 (62) 28 (65) 19 (34) 20 (38) 9 (16) 4 (8) 34 (61) 35 (66) 5 (28) 34 (37) 2 (11) 11 (12) 11 (61) 58 (64) 148 Рисунок 26. Положительная экспрессия bcl-2 при НМКРЛ разного гистогенетического типа (а, в, д – при Ак; б, г, е – при Пк) и с разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома). Иммуногистохимический метод, х400. При Пк положительная экспрессия р53 определялась в 65 случаях (51%) и в 63 случаях (49%) отрицательная экспрессия, положительная экспрессия bcl-2 определялась в 30 случаях (23%) и в 98 случаях (77%) отрица- 149 тельная экспрессия, положительная экспрессия bax определялась в 61 случаях (48%) и в 67 случаях (52%) отрицательная экспрессия. Результаты исследования р53, bcl-2 и bax при Пк во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами представлены в таблице 53. Таблица 53. Положительная экспрессия p53, bcl-2, bax и клиникоморфологические параметры при Пк (абсолютное количество (%)). Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Дифференцировка высокая умеренная-низкая Положительная экспрессия p53 bcl-2 bax 12 (43) 53 (53) 8 (29) 22 (22) 13 (46) 48 (48) 19 (40) 46 (57) 14 (30) 16 (20) 22 (47) 39 (48) 40 (48) 25 (57) 24 (29) 6 (14) 44 (52) 17 (39) 32 (50) 33 (52) 21 (33) 9 (14) 34 (53) 27 (42) 18 (45) 47 (53) 13 (33) 17 (19) 22 (55) 39 (44) Не найдено отличия и корреляции количества случаев с положительной экспрессией р53 и bax в зависимости от клинико-морфологических параметром Пк – показателя Т, наибольшего размера опухоли, показателя N, стадии заболевания и дифференцировки. Отмечается увеличение количества случаев с положительной экспрессией bcl-2 при I стадии заболевания по сравнению со II-III стадиями (р=0,02; соответственно 21 случай (33%) и 9 случаев (14%)), а также в группе опухолей без метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями с наличием метастазов (на уровне тенденции к статистической значимости р=0,06). В Пк положительная экспрессия bcl-2 имела слабую корреляцию со стадией заболевания (r=0,23, р=0,01) и на уровне тенденции к статистической значимости с показателем N (r=0,17, р=0,06). Таким образом, при Пк стадия заболевания и в меньшей степени показатель N взаимосвязаны с экспрессией bcl-2. 150 Рисунок 27. Положительная экспрессия bax при НМКРЛ разного гистогенетического типа (а, в, д – при Ак; б, г, е – при Пк) и с разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома). Иммуногистохимический метод, х400. Таким образом, экспрессия р53, bcl-2 и bax взаимосвязана с гистогенетическим происхождением НМКРЛ. При НМКРЛ экспрессия bcl-2 взаимосвязана с местастазированием в лимфатические узлы и стадией заболевания, 151 данная тенденция прослеживается за счет группы Пк, так как при Ак она не наблюдается (рисунок 25, 26, 27). 6.2. p53, bcl-2, bax и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения экспрессии р53, bcl-2 и bax во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами при НМКРЛ, а также результаты сравнения представлены в таблицах 54, 55 и 56. Таблица 54. Экспрессия p53 и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Экспрессия p53 р отрицательная 6,23±1,70 30,21±4,78 9,87 (7,95-12,21) 244,5 (130,8-415,2) 24 (15-38) 18 (11-25) 23 (17) 77 (58) 41 (32-59) 4 (1-8) 57 (48) 9 (8) положительная 6,98±1,54 31,16±4,30 11,16 (8,94-12,95) 347,3 (220,2-574,8) 31 (21-48) 22 (14-28) 20 (19) 53 (51) 46 (36-61) 4 (2-11) 48 (49) 10 (10) ˂0,001 0,1 0,03 ˂0,001 0,001 0,02 0,7 0,3 0,2 0,3 0,8 0,5 В НМКРЛ при положительной экспрессии р53 по сравнению с отрицательной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. При НМКРЛ экспрессия р53 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,24, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,20, р<0,05), ПП (r=0,25, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,22, р<0,01), ИМ ТороIIα (r=0,21, р<0,05). В НМКРЛ при отрицательной экспрессии bcl-2 по сравнению с положительной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков и Ag-ЯОР-белков (MIB-1). При НМКРЛ экспрессия bcl-2 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,22, р<0,01) и Ag-ЯОРбелками (MIB-1) (r=0,24, р<0,01). 152 Таблица 55. Экспрессия bcl-2 и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Экспрессия bcl-2 р отрицательная 6,69±1,64 30,69±4,74 10,92 (8,92-12,97) 318,1 (175,3-510,0) 28 (18-42) 19 (11-26) 84 (43) 107 (55) 43 (34-60) 4 (2-9) 85 (48) 15 (8) положительная 5,94±1,66 30,27±3,92 8,59 (7,31-11,59) 238,4 (145,9-401,6) 29 (18-42) 20 (16-28) 20 (47) 23 (53) 39 (26-59) 4 (2-8) 20 (51) 4 (10) 0,007 0,5 0,001 0,1 0,9 0,1 0,7 0,8 0,3 0,9 0,7 0,7 Таблица 56. Экспрессия bax и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Экспрессия bax р отрицательная 6,64±1,67 31,37±4,48 10,47 (8,85-12,43) 271,1 (145,3-407,0) 25 (16-37) 18 (11-25) 51 (48) 20 (19) 42 (32-59) 4 (2-10) 45 (45) 7 (7) положительная 6,49±1,67 30,01±4,61 10,51 (8,47-12,97) 343,3 (214,1-574,6) 32 (20-53) 20 (1-331) 53 (41) 23 (18) 43 (34-60) 4 (2-9) 60 (52) 12 (10) 0,4 0,08 0,5 0,005 ˂0,001 0,04 0,3 0,8 0,8 0,8 0,3 0,4 В НМКРЛ при положительной экспрессии bax по сравнению с отрицательной экспрессией отмечались более высокие значения ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. При НМКРЛ экспрессия bax имела корреляцию с ПП (r=0,20, р<0,01), ИМ Ki-67 (r=0,23, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,19, р<0,05). 153 Результаты определения экспрессии р53, bcl-2 и bax во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами при Ак, а также результаты сравнения представлены в таблицах 57, 58 и 59. Таблица 57. Экспрессия p53 и молекулярно-биологические маркеры Ак. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Экспрессия p53 р отрицательная 5,82±1,76 29,30±5,04 10,30±3,01 173,2 (56,1-409,7) 18 (7-37) 11 (4-19) 8 (11) 45 (64) 48 (36-64) 4 (1-10) 35 (57) 8 (13) положительная 6,50±1,75 30,67±3,90 11,09±2,84 283,1 (175,3-509,5) 27 (20-40) 18 (12-23) 5 (13) 24 (62) 47 (38-61) 4 (2-9) 25 (69) 8 (22) 0,04 0,2 0,3 0,03 0,02 0,02 0,8 0,8 0,7 0,9 0,2 0,2 Таблица 58. Экспрессия bcl-2 и молекулярно-биологические маркеры Ак. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Экспрессия bcl-2 р отрицательная 6,20±1,71 29,83±4,83 10,73±2,82 218,4 (80,3-465,6) 20 (11-38) 21 (17-35) 34 (35) 60 (63) 48 (36-64) 4 (1-10) 53 (62) 13 (15) положительная 5,04±2,03 29,42±3,76 9,52±3,75 241,9 (89,9-403,6) 22 (15-42) 12 (5-19) 5 (38) 9 (69) 40 (34-51) 3 (2-11) 7 (58) 3 (25) 0,03 0,8 0,1 0,7 0,7 0,04 0,8 0,6 0,4 0,8 0,8 0,4 154 Таблица 59. Экспрессия bax и молекулярно-биологические маркеры Ак. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Экспрессия bax р отрицательная 5,76±1,75 30,20±5,13 9,77±2,40 174,0 (65,8-405,7) 19 (7-35) 12 (6-18) 15 (38) 4 (10) 44 (40-68) 3 (1-12) 18 (51) 4 (11) положительная 6,23±1,79 29,56±4,47 11,04±3,16 268,8 (176,9-510,0) 31 (15-53) 18 (8-32) 24 (35) 9 (13) 49 (36-61) 4 (2-9) 42 (68) 12 (19) 0,1 0,7 0,08 0,06 0,07 0,2 0,8 0,6 0,6 0,8 0,1 0,3 В Ак при положительной экспрессии р53 по сравнению с отрицательной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков, ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. При Ак экспрессия р53 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,29, р<0,05), ПП (r=0,28, р<0,05), ИМ Ki-67 (r=0,28, р<0,05), ИМ ТороIIα (r=0,25, р<0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии р53 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ, за исключением Ag-ЯОР-белков (MIB-1) – взаимосвязь с которой отсутствовала при Ак. В Ак при отрицательной экспрессии bcl-2 по сравнению с положительной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков и ИМ ТороIIα. При Ак экспрессия bcl-2 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,27, р<0,05) и ИМ ТороIIα (r=0,22, р<0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии bcl-2 с молекулярнобиологическими маркерами имели отличия - при Ак отсутствовала взаимосвязь с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) и была взаимосвязь с ИМ ТороIIα по сравнению с НМКРЛ. В Ак при положительной и отрицательной экспрессии bax отсутствовали отличия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров. Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии bax с молекулярно- 155 биологическими маркерами имели отличия - при Ак отсутствовала взаимосвязь с ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα по сравнению с НМКРЛ. Результаты определения экспрессия р53, bcl-2 и bax во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами при Пк, а также результаты сравнения представлены в таблицах 60, 61 и 62. Таблица 60. Экспрессия p53 и молекулярно-биологические маркеры Пк. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Экспрессия p53 р отрицательная 6,66±1,53 31,14±4,33 10,26±2,74 304,3 (193,8-417,7) 28 (22-39) 22 (16-28) 15 (24) 32 (51) 38 (29-55) 4 (1-6) 22 (38) 1 (2) положительная 7,26±1,33 31,43±4,52 11,18±2,71 365,0 (282,4-659,7) 32 (25-52) 23 (16-30) 15 (23) 29 (45) 43 (31-62) 5 (2-12) 23 (38) 2 (3) 0,002 0,6 0,04 0,02 0,08 0,5 0,9 0,5 0,1 0,1 0,9 0,6 Таблица 61. Экспрессия bcl-2 и молекулярно-биологические маркеры Пк. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Экспрессия bcl-2 р отрицательная 7,15±1,44 31,49±4,53 11,15±2,66 357,7 (274,3-616,2) 31 (24-46) 23 (16-29) 50 (51) 47 (48) 40 (31-58) 4 (2-7) 32 (35) 2 (2) положительная 6,31±1,36 30,63±3,99 9,32±2,61 238,4 (149,5-365,0) 30 (19-43) 20 (16-28) 15 (50) 14 (47) 34 (25-59) 5 (1-8) 13 (48) 1 (4) 0,003 0,2 0,003 0,006 0,2 0,5 0,9 0,9 0,6 0,7 0,2 0,7 156 Таблица 62. Экспрессия bax и молекулярно-биологические маркеры Пк. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Экспрессия bax р отрицательная 7,11±1,42 31,99±4,00 10,86±2,66 347,3 (248,0-640,9) 28 (22-38) 23 (17-28) 36 (54) 16 (24) 41 (27-57) 4 (2-9) 27 (41) 3 (5) положительная 6,78±1,50 30,50±4,74 10,54±2,86 330,1 (200,1-417,1) 32 (24-52) 22 (16-30) 29 (48) 14 (23) 39 (33-60) 4 (2-7) 18 (34) 0 0,1 0,08 0,5 0,1 0,07 0,9 0,5 0,9 0,6 0,4 0,4 0,1 В Пк при положительной экспрессии р53 по сравнению с отрицательной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП. При Пк экспрессия р53 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,33, р<0,01), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,26, р<0,05), ПП (r=0,24, р<0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии р53 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк. В Пк при отрицательной экспрессии bcl-2 по сравнению с положительной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП. При Пк экспрессия bcl-2 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,31, р<0,01), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,26, р<0,05) и ПП (r=0,24, р<0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии bcl-2 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ; однако, при Пк отмечается взаимосвязь с ПП по сравнению с НМКРЛ. В Пк при положительной и отрицательной экспрессии bax отсутствовали отличия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров. Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии bax с молекулярно- 157 биологическими маркерами имели отличия - при Пк отсутствовала взаимосвязь с ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα по сравнению с НМКРЛ. Суммируя данные результатов исследования экспрессии р53, bcl-2 и bax следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое изменение экспрессии р53, bcl-2 и bax по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Отсутствовала гендерно-возрастная взаимосвязь с экспрессией р53, bcl-2. Экспрессия bax была выше у лиц женского пола по сравнению с мужским. Экспрессия р53, bcl-2 и bax была взаимосвязана с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: гистогенезом и для экспрессии bcl-2 - с показателем N и стадией заболевания. Также экспрессия р53, bcl-2 и bax имела корреляцию с некоторыми молекулярно-биологическими маркерами: ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белками (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα. Таким образом, исследование экспрессии р53, bcl-2 и bax является важной молекулярнобиологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования. 158 ГЛАВА 7. ПМЦР-Г и ПМЦР-Л Результат иммуногистохимической окраски определялся в виде окрашивания темно-коричневого цвета эндотелиальных клеток кровеносных (антитела CD34) и лимфатических (антитела D2-40) сосудов, а также комплексов клеток без просвета. Рисунок 28. Экспрессия CD34 (а, б) в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов и подопланина (в, г) в эндотелиальных клетках лимфатических сосудов неизмененной ткани альвеол (а, в) и бронхов (б, г). Иммуногистохимический метод, х200. В неизмененных альвеолах ПМЦР-Г составила 86 (73-102). Лимфатические сосуды в стенке альвеол отсутствовали и определялись в межальвеолярной соединительной ткани, около кровеносных сосудов, вне состава микроциркуляторного русла. В альвеолах найдена высокая плотность кровенос- 159 ных и отсутствие лимфатических сосудов, что связано с наличием газотранспортной функции и отсутствием лимфатической дренажной функции альвеол. В неизмененных бронхах ПМЦР-Г составила 22 (17-31), ПМЦР-Л – 4 (27). В бронхах плотность кровеносных сосудов меньше по сравнению с альвеолами и присутствуют лимфатические сосуды, обеспечивая трофическую и дренажную функцию. В НМКРЛ наблюдалось снижение ПМЦР-Г по сравнению с альвеолами и повышение по сравнению с бронхами (р<0,001), а также повышение ПМЦР-Л по сравнению с альвеолами (р<0,001) и отсутствие отличия по сравнению с бронхами (рис. 28). ПМЦР-Г и ПМЦР-Л исследована в 228 НМКРЛ: 105 Ак и 123 Пк. 7.1. ПМЦР-Г и клинико-морфологические параллели Результаты определения ПМЦР-Г при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 63 и 64. Отсутствовала статистически значимая взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с ПМЦР-Г. Таблица 63. Пол больных НМКРЛ, Ак, Пк и ПМЦР-Г, ПМЦР-Л. Маркер Пол мужской НМКРЛ ПМЦР-Г ПМЦР-Л Ак ПМЦР-Г ПМЦР-Л Пк ПМЦР-Г ПМЦР-Л Результаты р женский 43 (33-62) 4 (2-9) 39 (35-52) 3 (1-10) 0,9 0,1 48 (36-68) 4 (2-10) 42 (37-59) 3 (1-6) 0,8 0,3 41 (31-59) 4 (2-7) 31 (30-34) 4 (2-15) 0,08 0,7 определения ПМЦР-Г во взаимосвязи с клинико- морфологическими параметрами НМКРЛ, Ак и Пк представлены в таблице 65. Не найдено статистически значимого отличия и корреляции ПМЦР-Г в зависимости от клинико-морфологических параметром НМКРЛ – показателя 160 Т, наибольшего размера опухоли, показателя N, стадии заболевания и дифференцировки. Отмечается статистически значимое увеличение ПМЦР-Г при Ак по сравнению с Пк (р=0,01). В НМКРЛ гистогенез имел слабую корреляцию с ПМЦР-Г (r=0,16, р=0,01). Таблица 64. Возраст больных НМКРЛ, Ак, Пк и ПМЦР-Г, ПМЦР-Л. Маркер Возраст ˂ 59 лет НМКРЛ ПМЦР-Г ПМЦР-Л Ак ПМЦР-Г ПМЦР-Л Пк ПМЦР-Г ПМЦР-Л р ≥ 59 лет 42 (33-59) 4 (2-9) 43 (34-61) 4 (2-9) 0,7 0,7 49 (36-74) 4 (2-10) 44 (36-60) 4 (2-10) 0,4 0,8 38 (30-55) 4 (1-7) 42 (31-64) 4 (2-8) 0,2 0,7 Рисунок 29. Гистограммы распределения ПМЦР-Г при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах). 161 При НМКРЛ ПМЦР-Г составила 43 (34-60); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,97, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 7, максимальное – 98. Гистограмма распределения характеризовалась умеренным сдвигом вправо (ассиметрия 0,41) и умереннной пологостью вершины (эксцесс -0,47) (рисунок 29а). Таблица 65. ПМЦР-Г и клинико-морфологические параметры НМКРЛ, Ак и Пк. Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Дифференцировка высокая умеренная-низкая НМКРЛ Ак Пк 41 (38-62) 44 (32-60) 42 (38-61) 48 (36-72) 39 (34-64) 41 (30-57) 42 (36-62) 43 (30-60) 42 (38-61) 49 (34-73) 40 (34-65) 40 (29-56) 42 (34-62) 44 (33-59) 47 (38-63) 49 (34-73) 38 (31-59) 43 (30-56) 44 (36-63) 42 (31-59) 47 (38-64) 48 (34-62) 39 (31-60) 41 (30-56) 38 (33-61) 44 (34-60) 39 (36-63) 48 (36-72) 38 (31-59) 41 (30-57) При Ак ПМЦР-Г составила 47 (36-64); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,96, р˂0,01). Минимальное значение выборки составило 10, максимальное – 98. Гистограмма распределения характеризовалась умеренным сдвигом вправо (ассиметрия 0,42) и умеренной пологостью вершины (эксцесс -0,51) (рисунок 29б). При Пк ПМЦР-Г составила 40 (30-59); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,97, р=0,02). Минимальное значение выборки составило 7, максимальное – 93. Гистограмма распределения характеризовалась умеренным сдвигом вправо (ассиметрия 0,38) и умеренной пологостью вершины (эксцесс -0,55) (рисунок 29в). Не найдено статистически значимого отличия и корреляции ПМЦР-Г в зависимости от клинико-морфологических параметром Ак и Пк – показателя Т, наибольшего размера опухоли, показателя N, стадии заболевания и дифференцировки (рисунок 30, 31). 162 Рисунок 30. ПМЦР-Г при высокодифференцированной (а, б), умерено дифференцированной (в, г) и низкодифференцированной (д, е) Ак. а, в, д - небольшая ПМЦР-Г, б, г, е - большая ПМЦР-Г. Иммуногистохимический метод, х200. 163 Рисунок 31. ПМЦР-Г при высокодифференцированном (а, б), умерено дифференцированном (в, г) и низкодифференцированном (д, е) Пк. а, в, д - небольшая ПМЦР-Г, б, г, е - большая ПМЦР-Г. Иммуногистохимический метод, х200. 164 7.2. ПМЦР-Г и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения ПМЦР-Г при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблицах 66, 67 и 68. В НМКРЛ и Пк при небольшой и большой ПМЦР-Г отсутствовали статистически значимые отличия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров. Таблица 66. ПМЦР-Г и молекулярно-биологические маркеры при НМКРЛ. Молекулярно-биологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ПМЦР-Г ˂ 6,05 6,32±1,70 30,75±4,68 9,96 (8,16-12,59) 304,8 (174,1-433,4) 28 (17-42) 19 (12-27) 44 (39) 23 (21) 61 (54) 4 (1-10) 45 (45) 8 (8) ≥ 6,05 6,77±1,65 30,39±4,58 10,90 (8,92-12,87) 298,7 (171,2-480,2) 28 (17-44) 19 (12-27) 54 (48) 19 (17) 63 (56) 4 (2-8) 58 (54) 11 (10) р 0,1 0,8 0,2 0,8 0,9 1,0 0,2 0,5 0,8 0,8 0,2 0,6 Таблица 67. ПМЦР-Г и молекулярно-биологические маркеры при Ак. Молекулярно-биологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ПМЦР-Г ˂ 6,05 5,52±1,87 29,54±4,63 9,65±2,95 218,4 (48,6-473,1) 20 (7-39) 11 (4-19) 16 (33) 8 (16) 30 (61) 4 (1-12) 24 (59) 8 (20) р ≥ 6,05 6,40±1,62 0,02 29,71±4,81 0,2 11,21±2,85 0,01 224,1 (128,5-413,3) 0,5 20 (11-36) 1,0 15 (6-22) 0,2 19 (35) 0,8 5 (9) 0,3 37 (69) 0,4 4 (2-8) 0,7 35 (69) 0,5 8 (15) 0,5 165 Таблица 68. ПМЦР-Г и молекулярно-биологические маркеры при Пк. Молекулярно-биологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ПМЦР-Г ˂ 6,05 6,74±1,30 31,51±4,61 10,77±2,57 342,7 (230,9-477,0) 31 (22-45) 22 (16-30) 27 (45) 15 (25) 30 (50) 4 (1-7) 22 (39) 1 (2) ≥ 6,05 7,24±1,60 31,12±4,28 10,72±2,81 347,3 (231,4-562,3) 31 (23-45) 23 (15-28) 36 (59) 14 (23) 27 (44) 5 (2-8) 22 (39) 2 (4) р 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 0,7 0,1 0,8 0,5 0,2 1,0 0,6 В Ак при большой ПМЦР-Г по сравнению с небольшой отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков и Ag-ЯОРбелков (MIB-1). При Ак ПМЦР-Г имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,21, р<0,05) и Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,23, р<0,05). 7.3. ПМЦР-Л и клинико-морфологические параллели Результаты определения ПМЦР-Л при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 63 и 64. Отсутствовала статистически значимая взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с ПМЦР-Л. Результаты определения ПМЦР-Л во взаимосвязи с клинико- морфологическими параметрами НМКРЛ, Ак и Пк представлены в таблице 69. ПМЦР-Л при НМКРЛ составила 4 (2-9); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,70, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 1, максимальное – 46. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 2,29) и значительной островершинностью (эксцесс 5,35) (рисунок 32а). ПМЦР-Л при Ак составила 4 (2-10); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,74, р˂0,001). Минимальное значение выбор- 166 ки составило 1, максимальное – 41. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,93) и значительной островершинностью (эксцесс 3,61) (рисунок 32б). Рисунок 32. Гистограммы распределения ПМЦР-Л при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в %). Таблица 69. ПМЦР-Л и клинико-морфологические параметры НМКРЛ, Ак и Пк. Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Дифференцировка высокая умеренная-низкая НМКРЛ Ак Пк 4 (2-9) 4 (2-9) 4 (2-10) 4 (1-9) 4 (2-6) 4 (2-8) 4 (1-9) 4 (2-9) 4 (1-12) 4 (2-9) 4 (2-6) 4 (2-8) 4 (2-9) 4 (1-8) 4 (2-10) 4 (1-8) 4 (2-7) 4 (1-8) 4 (2-10) 4 (1-7) 4 (2-12) 4 (1-8) 4 (2-8) 4 (1-7) 4 (2-9) 4 (1-9) 3 (1-17) 4 (2-9) 4 (3-7) 4 (1-8) 167 Рисунок 33. ПМЦР-Л при высокодифференцированной (а, б), умерено дифференцированной (в, г) и низкодифференцированной (д, е) Ак. а, в, д - небольшая ПМЦР-Л, б, г, е - большая ПМЦР-Л. Иммуногистохимический метод, х200. ПМЦР-Л при Пк составила 4 (2-8); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,66, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 1, максимальное – 46. Гистограмма распределения характеризо- 168 валась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 2,58) и значительной островершинностью (эксцесс 6,88) (рисунок 32в). Рисунок 34. ПМЦР-Л при высокодифференцированном (а, б), умерено дифференцированном (в, г) и низкодифференцированном (д, е) Пк. а, в, д - небольшая ПМЦР-Л, б, г, е - большая ПМЦР-Л. Иммуногистохимический метод, х200. 169 Не найдено отличия и корреляции ПМЦР-Л в зависимости от клиникоморфологических параметров НМКРЛ, Ак и Пк – показателя Т и N, наибольшего размера, стадии, гистогенеза и дифференцировки (рис. 33, 34). 7.4 ПМЦР-Л и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения ПМЦР-Л при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблицах 70, 71 и 72. Таблица 70. ПМЦР-Л и молекулярно-биологические маркеры при НМКРЛ. Молекулярно-биологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ПМЦР-Л ˂ 30,5 6,54±1,80 30,46±4,35 9,78 (8,21-12,17) 282,6 (172,8-425,4) 25 (18-38) 18 (11-25) 42 (43) 18 (18) 52 (53) 42 (33-62) 38 (43) 6 (7) ≥ 30,5 6,60±1,55 30,74±4,65 10,97 (8,91-13,04) 314,1 (169,5-477,0) 28 (17-44) 20 (14-28) 71 (55) 23 (18) 75 (58) 43 (33-59) 66 (55) 13 (11) р 0,6 0,4 0,1 0,5 0,3 0,4 0,8 0,9 0,4 0,9 0,1 0,3 Таблица 71. ПМЦР-Л и молекулярно-биологические маркеры при Ак. Молекулярно-биологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ПМЦР-Л ˂ 30,5 5,94±1,88 29,40±4,23 9,96±2,66 217,9 (41,4-409,4) 20 (6-37) 12 (4-19) 16 (36) 6 (14) 25 (57) 47 (36-64) 23 (58) 5 (13) ≥ 30,5 6,18±1,66 30,09±4,67 11,05±3,03 205,4 (110,6-465,6) 22 (13-39) 16 (7-22) 21 (35) 6 (10) 43 (72) 49 (36-64) 36 (67) 11 (20) р 0,4 0,2 0,1 0,5 0,4 0,2 0,9 0,6 0,1 0,9 0,4 0,3 170 Таблица 72. ПМЦР-Л и молекулярно-биологические маркеры при Пк. Молекулярно-биологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 ПМЦР-Л ˂ 30,5 6,99±1,60 31,25±4,31 10,56±2,58 344,4 (212,7-447,7) 30 (22-42) 20 (14-27) 26 (48) 12 (22) 27 (50) 38 (29-59) 15 (31) 1 (2) ≥ 30,5 6,95±1,38 31,28±4,60 10,93±2,89 339,4 (243,4-524,8) 30 (25-46) 24 (18-31) 37 (54) 17 (25) 32 (46) 41 (30-59) 30 (45) 2 (3) р 0,9 1,0 0,5 0,6 0,4 0,2 0,5 0,8 0,7 0,7 0,1 0,8 В НМКРЛ, Ак и Пк при небольшой и большой ПМЦР-Г отсутствовали статистически значимые отличия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров. Суммируя данные результатов исследования ПМЦР-Г и ПМЦР-Л следует отметить следующие основные моменты. При НМКРЛ по сравнению с неизмененным легким наблюдались статистически значимые отличия ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Отсутствовала гендерная взаимосвязь с ПМЦР-Г и ПМЦРЛ. ПМЦР-Г имела взаимосвязь с только гистогенезом. Также ПМЦР-Г имела корреляцию с незначительным количеством молекулярно-биологических маркеров - ИП Ag-ЯОР-белков и Ag-ЯОР-белками (MIB-1). Отсутствовала взаимосвязь ПМЦР-Л с основными клинико-морфологическими и молекулярно-биологическими параметрами. 171 ГЛАВА 8. СТАТУС БЕЛКА И ГЕНА HER2 Результат иммуногистохимической окраски на белок Her2 определялся в виде мембранного окрашивания, от светло- до темно-коричневого цвета. В неизмененном эпителии альвеол и бронхов отсутствовала положительная экспрессия белка Her2. В неизмененном эпителии бронхов определялось фрагментарное мембранное ИГХ окрашивание на Her2 в единичных клетках (до 10%). В клетках НМКРЛ наблюдалось повышение экспрессии белка Her2 по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р<0,001). В ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол и бронхов определялись от 1 до 2 гранул черного цвета (ген Her2) - чаще одна, от 1 до 2 гранул красного цвета (СЕР17) - чаще одна; соотношение Her2/CEP17 не превышало значения 1,8 (рисунок 35). Таким образом, в неизмененном эпителии альвеол и бронхов отсутствовала амплификация гена Her2 и увеличение СЕР17. Экспрессия белка Her2 и статус гена Her2, СЕР17 исследованы в 218 НМКРЛ, из них 99 Ак и 119 Пк. Рисунок 35. Статус гена Her2 и СЕР17 в неизмененной ткани альвеол (а) и бронхов (б). SISH метод, а - х200, б, в, г – х1000. 8.1. Статус белка Her2 и клинико-морфологические параллели При НМКРЛ положительный Her2 статус определен в 106 случаях (49%) и в 112 случаях (51%) отрицательный. При Ак положительный Her2 статус определен в 61 случае (62%) и в 38 случаях (38%) отрицательный. При 172 Пк положительный Her2 статус определен в 45 случаях (38%) и в 74 случаях (62%) отрицательный. Результаты определения экспрессии белка Her2 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 73. Отсутствовала статистически значимая взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с положительным Her2 статусом опухоли. Таблица 73. Возраст и пол больных НМКРЛ, Ак, Пк и положительная экспрессия белка Her2, статус гена Her2, CEP17 (абсолют. количество (%)). Маркер НМКРЛ ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 Ак ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 Пк ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 Пол мужской женский р Возраст ˂ 59 лет ≥ 59 лет р 86 (46) 13 (7) 22 (12) 20 (61) 6 (18) 4 (12) 0,1 0,04 1,0 45 (47) 8 (8) 8 (8) 61 (50) 11 (9) 18 (15) 0,6 0,9 0,1 42 (59) 10 (14) 13 (18) 19 (68) 6 (21) 3 (11) 0,4 0,4 0,4 21 (58) 6 (17) 3 (8) 40 (63) 10 (16) 13 (21) 0,6 0,9 0,1 44 (39) 3 (3) 9 (8) 1 (20) 5 (100) 1 (20) 0,4 0,7 0,3 24 (40) 2 (3) 5 (8) 21 (36) 1 (2) 5 (8) 0,6 0,6 1,0 Результаты исследования экспрессии белка Her2 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами опухоли представлены в таблице 74. При НМКРЛ отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с положительным Her2 статусом в группе опухолей с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями без метастазов - соответственно 44 (58%) и 62 (44%) случаев (р=0,048). Количество случаев с положительным Her2 статусом достоверно больше при Ак, чем при Пк - соответственно 61 (62%) и 45 (38%) случаев (р<0,001) (рисунок 36). Положительный Her2 статус НМКРЛ имел слабую корреляцию с показателем N (r=0,14, р=0,04) и гистогенезом (r=0,24, р<0,001). Таким образом, содержание белка Her2 в НМКРЛ взаимосвязано с гистогенезом и метастатическим потенциалом опухоли. 173 Рисунок 36. Иммуногистохимический статус белка Her2 при НМКРЛ: а, б – 1 балл (+), в, г – 2 балла (++), д, е – 3 балла (+++). а, в, д – Ак, б, г, е - Пк. Иммуногистохимический метод, х200. 174 Таблица 74. Положительная экспрессия белка Her2 и клиникоморфологические параметры НМКРЛ, Ак и Пк (абсолютное количество (%)). Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Дифференцировка высокая умеренная-низкая НМКРЛ Ак Пк 24 (41) 82 (52) 18 (53) 43 (66) 6 (24) 39 (41) 41 (46) 65 (52) 27 (56) 34 (66) 14 (33) 31 (40) 62 (44) 44 (58) 39 (62) 22 (61) 23 (29) 22 (55) 50 (44) 56 (53) 33 (62) 28 (61) 17 (28) 28 (47) 25 (45) 81 (50) 13 (72) 48 (59) 12 (32) 33 (40) При Ак отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с положительным Her2 статусом в группе опухолей с наибольшим размером более 3 см по сравнению с опухолями до 3см - соответственно 34 (66%) и 27 (56%) случаев (р=0,03). Отсутствовало статистически значимое отличие и корреляции количества случаев с положительным Her2 статусом в зависимости от клинико-морфологических параметром Ак – показателя Т и N, стадии заболевания и дифференцировки. Положительный Her2 статус Ак имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,21, р=0,03) (рисунок 36). Таким образом, содержание белка Her2 в Ак взаимосвязано только с наибольшим размером опухоли. При Пк отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с положительным Her2 статусом в группе опухолей с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями без метастазов - соответственно 22 (55%) и 23 (29%) случаев (р=0,009). При Пк отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с положительным Her2 статусом в группе опухолей со II-III стадиями заболевания по сравнению с опухолями с I стадией - соответственно 28 (47%) и 17 (28%) случаев (р=0,04). Отсутствовало статистически значимое отличие и корреляции количества 175 случаев с положительным Her2 статусом в зависимости от клиникоморфологических параметром Ак – показателя Т, наибольшего размера опухоли и дифференцировки. Положительный Her2 статус Пк имел умеренную корреляцию с показателем N (r=0,31, р=0,006) и стадией заболевания (r=0,21, р=0,03) (рисунок 36). Таким образом, содержание белка Her2 в Пк взаимосвязано со стадией заболевания и метастатическим потенциалом опухоли. 8.2. Статус белка Her2 и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения ИГХ Her2 статуса при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблицах 75, 76 и 77. Таблица 75. ИГХ Her2 статус и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л Состояние гена Her2 ИГХ Her2 статус р отрицательный 6,43±1,52 30,33±4,76 10,41 (8,13-12,17) 312,2 (176,5-517,0) 28 (18-45) 22 (14-29) 49 (44) 19 (17) 55 (50) 41 (33-64) 4 (1-8) 0 положительный 6,75±1,81 30,82±4,51 11,19 (8,94-13,55) 298,8 (163,5-477,0) 27 (16-40) 17 (11-26) 48 (46) 20 (19) 60 (57) 47 (34-61) 4 (2-10) 19 (18) 0,2 0,4 0,02 0,8 0,3 0,06 0,8 0,7 0,3 0,6 0,1 ˂0,001 В НМКРЛ и Пк при положительном ИГХ Her2 статусе отмечались достоверно большие значения Ag-ЯОР-белков (MIB-1); в Ак данные отличия были не достоверны. При НМКРЛ и Пк ИГХ Her2 статуса коррелировал с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (соответственно r=0,17, р<0,05 и r=0,21, р<0,01). В НМКРЛ, Пк и Ак только при положительном ИГХ Her2 статусе отмечалась амплификация гена Her2, при отрицательном ИГХ Her2 статусе отсутствова- 176 ла амплификация гена Her2. При НМКРЛ, Пк и Ак отмечалась умеренная корреляция между ИГХ Her2 статусом и амплификацией гена Her2 (соответственно r=0,32, р<0,001 и r=0,48, р<0,001 и r=0,23, р<0,05). Таблица 76. ИГХ Her2 статус и молекулярно-биологические маркеры Ак. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л Состояние гена Her2 ИГХ Her2 статус р отрицательный 5,55±1,46 28,41±4,58 10,44±3,17 268,8 (46,5-510,0) 21 (6-48) 17 (4-27) 11 (30) 5 (14) 20 (54) 48 (37-73) 4 (1-9) 0 положительный 6,30±1,87 30,28±4,53 10,82±2,88 215,0 (110,6-413,3) 20 (11-36) 14 (7-21) 25 (42) 7 (12) 42 (70) 49 (37-72) 4 (2-12) 16 (26) 0,1 0,1 0,7 1,0 0,9 0,9 0,2 0,8 0,1 0,9 0,3 0,001 Таблица 77. ИГХ Her2 статус и молекулярно-биологические маркеры Пк. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л Состояние гена Her2 ИГХ Her2 статус р отрицательный 6,84±1,38 31,23±4,60 10,26±2,59 332,5 (214,1-566,6) 29 (22-45) 23 (18-30) 38 (51) 14 (19) 35 (47) 40 (30-59) 4 (2-7) 0 положительный 7,34±1,56 31,52±4,43 11,83±2,64 380,3 (262,4-566,1) 31 (25-46) 22 (14-28) 23 (51) 13 (29) 18 (40) 40 (31-56) 5 (3-8) 3 (7) 0,1 0,5 0,002 0,2 0,5 0,5 1,0 0,2 0,4 0,9 0,2 0,03 177 8.3. Статус гена Her2 и клинико-морфологические параллели Результаты определения статуса гена Her2, CEP17 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 73. Найдено статистически значимое увеличение количества случаев с амплификацией гена Her2 при НМКРЛ у лиц женского пола по сравнению с мужским. Однако, при Ак и Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с статусом гена Her2, CEP17. Пол больных НМКРЛ имел слабую корреляцию с амплификацией гена Her2 (r=0,14, р=0,04). Таблица 78. Статус гена Her2, CEP17 и клинико-морфологические параметры при НМКРЛ (абсолютное количество (%)). Характеристика Первичная опухоль Т1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N 1-3 Стадия I II-III Гистогенез Ак Пк Дифференцировка высокая умеренная-низкая тип N тип P тип A тип AP 49 (83) 131 (82) 5 (9) 14 (9) 2 (3) 10 (6) 3 (5) 4 (3) 76 (85) 104 (81) 7 (8) 12 (10) 3 (3) 9 (7) 4 (4) 3 (2) 120 (85) 60 (79) 6 (4) 13 (17) 10 (7) 2 (3) 6 (4) 1 (1) 95 (85) 85 (81) 5 (4) 14 (13) 7 (6) 5 (5) 6 (5) 1 (1) 73 (74) 107 (90) 10 (10) 9 (7) 10 (10) 2 (2) 6 (6) 1 (1) 43 (78) 137 (84) 6 (11) 13 (8) 4 (7) 8 (5) 2 (4) 5 (3) Кросстабулированные данные исследования гена Her2 и CEP17 в эпителиальных клетках НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами опухоли представлены в таблице 78. 178 Рисунок 37. Статус гена Her2 и СЕР17 при НМКРЛ: а - высокий уровень (в нижней части) и низкий уровень (в верхней части) амплификации гена Her2 в умерено дифференцированной аденокарциноме, б -низкий уровень амплификации гена Her2 в умерено дифференцированной аденокарциноме, в - амплификация гена Her2 совместно с увеличением СЕР17 в высокодифференцированной аденокарциноме, г - увеличение СЕР17 в высокодифференцированном плоскоклеточном раке. SISH метод, а - х200, б, в, г – х1000. Хромогенная гибридизация in situ показала, что амплификация гена Her2 была в 19 (9%) случаях, увеличение CEP17 в 26 (12%) случаях. В 4 случаях (2%) Ак амплификация гена Her2 (без увеличения CEP17) определялась в виде кластеров (12 и более копий) и соответствовала высокому уровню амплификации. В остальных 15 случаях (7%) амплификация гена Her2 определялась в виде отдельных множественных копий (от 4 до 8) и соответствовала низкому уровню амплификации, из которых, в 7 (3%) случаях – низкий уровень амплификации гена Her2 совместно с увеличением CEP17 и в 8 (4%) случаях - низкий уровень амплификации гена Her2 и отсутствие увеличения CEP17 (рисунок 37б,в,г). Во всех случаях увеличение CEP17 было незначи- 179 тельной степени (до 4 красных меток). Во всех исследованных нами случаях отсутствовала внутриопухолевая гетерогенность амплификации гена Her2. Однако в одном из четырех случаев аденокарциномы легкого с высоким уровнем амплификации гена Her2 найдена неоднородность амплификации гена Her2: в участках опухоли с железистоподобным строением отмечался низкий уровень амплификации гена Her2, а в участках солидизации - высокий уровень амплификации гена Her2 (рисунок 37а). Количество случаев с амплификацией гена Her2 достоверно больше при Ак по сравнению с Пк - соответственно 16 (16%) и 3 (3%) случая (р<0,001). Другие клинико-морфологические параметры НМКРЛ (показатель Т и N, наибольший размер опухоли, стадия заболевания и дифференцировка) не имели взаимосвязи с амплификацией гена Her2. Отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с увеличением CEP17 в группе опухолей с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями без метастазов - соответственно 14 (18%) и 12 (8%) случаев (р=0,047). Другие клинико-морфологические параметры НМКРЛ (показатель Т, наибольший размер опухоли, стадия заболевания, гистогенез и дифференцировка) не имели взаимосвязи с состоянием CEP17. Состояние гена Her2 имело слабую корреляцию с гистогенезом опухоли (r=0,24, р<0,001), а состояние CEP17 - с показателем N (r=0,15, р=0,03). Таким образом, при НМКРЛ состояние гена Her2 взаимосвязано с гистогенезом, а состояние CEP17 - с метастатическим потенциалом опухоли. 8.4 Статус гена Her2 и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения статуса гена Her2 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблицах 79, 80 и 81. В НМКРЛ и Ак при амплификации гена Her2 отмечались достоверно большие значения ИП Ag-ЯОРбелков, ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα; в Пк данные отличия были не достоверны. При НМКРЛ амплификации гена Her2 имела корреляцию с ИП AgЯОР-белков (r=0,14, р<0,05), ПП (r=0,21, р<0,01), ИМ Ki-67 (r=0,16, р<0,05), ИМ ТороIIα (r=0,16, р<0,05). При Ак амплификации гена Her2 имела корре- 180 ляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,24, р<0,05), ПП (r=0,26, р<0,05), ИМ Ki-67 (r=0,21, р<0,05), ИМ ТороIIα (r=0,22, р<0,05). В НМКРЛ, Пк и Ак амплификация гена Her2 коррелировала с положительным ИГХ Her2 статусом (соответственно r=0,32, р<0,001 и r=0,48, р<0,001 и r=0,23, р<0,05). Таблица 79. Статус гена Her2 и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Амплификация гена Her2 р отсутствие 5,96±1,84 30,54±4,74 9,46 (8,94-11,88) 184,4 (110,4-271,1) 19 (11-31) 13 (7-19) 87 (44) 35 (18) 103 (52) 43 (33-62) 4 (2-9) 87 (44) наличие 6,65±1,65 30,90±3,47 10,91 (8,77-12,79) 330,1 (176,5-517,0) 28 (18-45) 20 (13-28) 10 (53) 4 (21) 12 (63) 48 (36-55) 5 (3-9) 19 (100) 0,04 0,8 0,4 0,006 0,03 0,03 0,5 0,7 0,4 0,9 0,4 ˂0,001 Таблица 80. Статус гена Her2 и молекулярно-биологические маркеры Ак. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Амплификация гена Her2 р отсутствие 5,79±1,69 29,42±4,83 9,74±2,46 172,8 (100,9-242,9) 18 (9-26) 12 (6-16) 28 (35) 9 (11) 50 (62) 49 (37-72) 4 (2-10) 45 (54) наличие 6,08±1,78 30,40±3,46 10,87±3,06 263,6 (128,5-509,5) 25 (11-41) 18 (5-29) 8 (50) 3 (19) 12 (75) 46 (37-56) 5 (3-9) 16 (100) 0,03 0,6 0,2 0,009 0,03 0,04 0,2 0,4 0,3 0,4 0,4 0,001 181 Таблица 81. Статус гена Her2 и молекулярно-биологические маркеры Пк. Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Амплификация гена Her2 р отсутствие 6,87±2,78 31,29±4,55 10,85±2,72 343,8 (230,9-566,1) 30 (23-45) 22 (17-29) 59 (51) 26 (22) 53 (46) 39 (30-58) 4 (2-8) 42 (36) наличие 7,04±1,44 33,57±2,42 12,90±2,15 324,5 (247,5-574,6) 31 (17-42) 29 (14-43) 2 (67) 1 (33) 0 52 (30-55) 5 (2-5) 3 (100) 0,6 0,2 0,2 1,0 0,8 0,8 0,6 0,7 0,1 0,8 0,9 0,03 Суммируя данные результатов исследования ИГХ Her2 статуса и состояния гена Her2 следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое изменение ИГХ Her2 статуса и состояния гена Her2 по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Имеется гендерная взаимосвязь с состоянием гена Her2 – амплификация гена Her2 чаще у лиц женского пола по сравнению с мужским. ИГХ Her2 статус и состояния гена Her2 были взаимосвязаны с основными клиникоморфологическими параметрами по системе TNM: показателем N и гистогенезом. Также ИГХ Her2 статус и состояние гена Her2 имели корреляцию с некоторыми молекулярно-биологическими маркерами: ИП Ag-ЯОР-белков, площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателем пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα. Таким образом, исследование ИГХ Her2 статуса и состояния гена Her2 является важной молекулярно-биологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования. 182 ГЛАВА 9. АНАЛИЗ ВЫЖИВАЕМОСТИ Общая скорректированная выживаемость больных НМКРЛ за 5-летний период после операции составила 41,3±3,5%. Выживаемость больных НМКРЛ исследована во взаимосвязи с клиническими критериями, клиникоморфологическими параметрами и коэкспрессии молекулярно-биологических маркеров. 9.1. Клинические критерии Результаты определения выживаемости больных НМКРЛ во взаимосвязи с клиническими критериями, а также результаты сравнения представлены в таблице 82. Таблица 82. Выживаемость и клинические критерии НМКРЛ. Характеристика Возраст до 59 лет 59 лет и старше Пол мужской женский Тип операции лобэктомия пневмонэктомия Полихимиотерапия не проводилась проводилась Лучевая терапия не проводилась проводилась Полихимио- и лучевая терапия не проводилась проводилась Пятилетняя общая скорректированная р выживаемость (%) 41,4±5,3 41,2±4,6 р=0,8 43,7±3,8 22,0±9,5 р=0,1 45,4±4,2 29,3±6,0 р=0,007 41,7±3,6 36,1±11,3 р=0,5 40,4±3,9 44,5±7,4 р=0,6 43,2±3,6 18,4±8,0 р=0,1 183 Так как при НМКРЛ средний возраст составил 59 лет, то все случаи были поделены на группу с возрастом до 59 лет и группу старше 59 лет. Выживаемость больных НМКРЛ не имела статистически значимого отличия между группами с возрастом до 59 лет и старше 59 лет. Также выживаемость больных НМКРЛ не имела статистически значимого отличия в зависимости от половой принадлежности. Рисунок 38. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ после проведения лобэктомии и пневмонэктомии. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р=0,007) в зависимости от типа операции: 45,4±4,2% - при лобэктомии и 29,3±6,0% - при пневмонэктомии (рисунок 38). Полихимиотерапия, лучевая терапия и комбинированная терапия (полихимио- и лучевая терапия) не имели статистически значимого влияния на выживаемость больных НМКРЛ. Таким образом, из всех клинических критериев имеется взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ только с типом операции. Однако, тип операции, отражая оперативную тактику и объем операции, взаимосвязан с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM (показателем Т, наибольшим размером первичной опухоли, показателем N, стадией заболевания и гистогенезом) и имеет вторичное (суммирующее) влияние на выживаемость больных НМКРЛ по сравнению с первичными клиникоморфологическими параметрами опухоли. 184 9.2. Клинико-морфологические параметры Результаты определения выживаемости больных НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM, а также результаты сравнения представлены в таблице 83. Таблица 83. Выживаемость и клинико-морфологические параметр НМКРЛ. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Характеристика Показатель Т Т1 Т2 Т3 Наибольший размер < 3 см ≥ 3 см Лимфатические узлы N0 N1 N2 N3 Стадия I II III Гистогенез Ак Пк Дифференцировка высокая умеренная низкая Пятилетняя общая скорректированная выживаемость (%) р 51,4±7,3 42,1±4,5 20,7±6,9 1-2: р=0,03 2-3: р=0,002 1-3: р<0,001 55,1±5,5 30,8±4,2 4-5: р<0,001 55,8±4,5 12,2±5,0 15,4±7,2 1,5±2,5 6-7,8,9: р<0,001 7-8,9: р=0,8 8-9: р=0,8 58,9±4,9 27,3±5,9 11,7±5,4 10-11: р<0,001 11-12: р=0,02 10-12: р<0,001 33,9±5,0 47,6±4,7 13-14: р=0,045 63,5±7,0 37,4±5,0 24,7±5,9 15-16: р<0,001 16-17: р=0,1 15-17: р<0,001 Наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости от группы с показателем Т1, к Т2 и Т3, а также между группами с размером опухоли менее 3 см и более 3 см (рисунок 39а,б). В зависимости от показателя N достоверные отличия получены только для группы N0 (выживаемость длиннее) по сравнению с N1, N2 и N3 (выживаемость короче). Между 185 Рисунок 39. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ в зависимости от показателя Т (а), наибольшего размера (б), показателя N (в), стадии (г), гистогенеза (д) и дифференцировки опухоли (е). По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. группами N1, N2 и N3 отсутствовали статистически значимые отличия выживаемости (рисунок 39в). Наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду 1, 2 и 3 стадия (рисунок 38г). Выживаемость больных достоверно длиннее при Пк по сравнению с Ак (рисунок 39д). Выживаемость больных достоверно длиннее при высокой дифференцировке по сравнению с 186 умеренной и низкой дифференцировкой. Между умерено и низкодифференцированной карциномами отсутствовало достоверное отличие в выживаемости больных (рисунок 39е). Таким образом, имеется взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателем Т, наибольшим размером первичной опухоли, показателем N, стадией заболевания, гистогенезом и дифференцировкой опухоли. 9.3. Молекулярно-биологические маркеры 9.3.1. Ag-ЯОР-белки Так как при НМКРЛ среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,52, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,52 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (118 случаев – 49%), до 6,52 – с небольшим (125 случаев – 51%). Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от ИП Ag-ЯОР-белков: 49,8±5,2% - при небольшой площади и 28,6±4,7% - при большой (рисунок 40а). Так как при Ак среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,05, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,05 и более считались с большим ИП Ag-ЯОРбелков (48 случаев – 43%), до 6,05 – с небольшим (63 случая – 57%). Выживаемость больных Ак имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от ИП Ag-ЯОР-белков: 39,0±8,2% - при небольшой площади и 13,1±5,6% - при большой (рисунок 40б). Так как при Пк среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,96, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,96 и более считались с большим ИП Ag-ЯОРбелков (59 случаев – 45%), до 6,96 – с небольшим (73 случая – 55%). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от ИП Ag-ЯОР-белков: 68,9±6,3% - при небольшой площади и 19,0±5,9% - при большой (рисунок 40в). Так как при НМКРЛ среднее значение КВ Ag-ЯОР-белков составило 30,5%, то случаи с КВ Ag-ЯОР-белков 30,5% и более считались с большим КВ Ag-ЯОР-белков (108 случай – 44%), до 30,5% – с небольшим (135 случаев 187 – 56%). Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от КВ Ag-ЯОР-белков: 50,2±4,9% - при небольшом КВ и 25,8±4,9% - при большом КВ (рисунок 41а). Рисунок 40. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в) с небольшим (-) и большим (+) ИП Ag-ЯОР-белков. По оси абсцисс – время жизни (дни), по оси ординат – доля выживших больных. Так как при Ак среднее значение КВ Ag-ЯОР-белков составило 29,8%, то случаи с КВ Ag-ЯОР-белков 29,8% и более считались с большим КВ AgЯОР-белков (54 случая – 49%), до 29,8% – с небольшим (57 случаев – 51%). Выживаемость больных Ак имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от КВ Ag-ЯОР-белков: 38,3±8,7% - при небольшом КВ и 18,5±6,2% - при большом КВ (рисунок 41б). Так как при Пк среднее значение КВ Ag-ЯОР-белков составило 31,2%, то случаи с КВ Ag-ЯОР-белков 31,2% и более считались с большим КВ AgЯОР-белков (62 случай – 47%), до 31,2% – с небольшим (70 случаев – 53%). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие (р<0,001) 188 в зависимости от КВ Ag-ЯОР-белков: 67,5±6,4% - при небольшом КВ и 22,2±6,0% - при большом КВ (рисунок 41в). Рисунок 41. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в) с небольшим (-) и большим (+) КВ Ag-ЯОР-белков. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. 9.3.2. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках Так как при НМКРЛ медиана Ag-ЯОР-белков (MIB-1) составила 10,47 мкм², то случаи с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) 10,47 мкм² и более считались с большой площадью (101 случай – 49%), до 10,47 мкм² – с небольшой (106 случаев – 51%). Выживаемость больных имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от Ag-ЯОР-белков (MIB-1): 61,2±5,4% - при небольшой площади и 16,2±4,2% - при большой (рисунок 42а). Так как при Ак среднее значение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) составило 10,56 мкм², то случаи с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) 10,56 мкм² и более считались с большой площадью (44 случая – 47%), до 10,56 мкм² – с небольшой 189 (50 случаев – 53%). Выживаемость больных имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от Ag-ЯОР-белков (MIB-1): 45,0±8,9% - при небольшой площади и 7,9±4,8% - при большой (рисунок 42б). Рисунок 42. График выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в) с большой (+П) и небольшой (-П) Ag-ЯОР-белков (MIB-1). Ось абсцисс – время жизни (дни), ось ординат – доля выживших больных. Так как при Пк среднее значение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) составило 10,67 мкм², то случаи с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) 10,67 мкм² и более считались с большой площадью (57 случаев – 50%), до 10,67 мкм² – с небольшой (56 случаев – 50%). Выживаемость больных имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от Ag-ЯОР-белков (MIB-1): 72,3±6,7% - при небольшой площади и 19,6±6,2% - при большой (рисунок 42в). Так как при НМКРЛ медиана ПП составила 304,2, то случаи с ПП 304,2 и более считались с большим ПП (100 случаев – 50%), до 304,2 – с неболь- 190 шим (100 случаев – 50%). Выживаемость больных имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от ПП: 51,0±5,7% - при небольшом значении и 27,5±4,9% - при большом (рисунок 43а). Так как при Ак медиана ПП составила 218,4, то случаи с ПП 218,4 и более считались с большим ПП (46 случаев – 51%), до 218,4 – с небольшим (45 случаев – 49%). Выживаемость больных имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от ПП: 43,4±9,6% - при небольшом значении и 14,3±5,9% - при большом (рисунок 43б). Рисунок 43. График выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в) с большим (+) и небольшим (-) ПП. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Так как при Пк медиана ПП составила 343,3, то случаи с ПП 343,3 и более считались с большим ПП (55 случаев – 50%), до 343,3 – с небольшим (54 случая – 50%). Выживаемость больных имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от ПП: 63,6±7,5% - при небольшом значении и 29,1±6,7% - при большом (рисунок 43в). 191 9.3.3. Маркеры пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα) Так как при НМКРЛ медиана ИМ Ki-67 составила 25%, то случаи с ИМ Ki-67 25% и более считались с большим ИМ Ki-67 (116 случаев – 54%), до 25% – с небольшим (99 случаев – 46%). Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р=0,006) в зависимости от ИМ Ki-67: 50,3±5,5% - при небольшом и 31,6±4,7% - при большом (рисунок 44а). Рисунок 44. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в) с небольшим (-Ki-67) и большим (+Ki-67) ИМ Ki-67. По оси абсцисс – время жизни (дни), по оси ординат – доля выживших больных. Так как при Ак медиана ИМ Ki-67 составила 20%, то случаи с ИМ Ki67 20% и более считались с большим ИМ Ki-67 (51 случай – 53%), до 20% – с небольшим (46 случаев – 47%). Выживаемость больных Ак имела статистически значимое отличие (р=0,002) в зависимости от ИМ Ki-67: 44,6±8,4% при небольшом ИМ Ki-67 и 16,7±6,1% - при большом (рисунок 44б). Так как при Пк медиана ИМ Ki-67 составила 30%, то случаи с ИМ Ki- 192 67 30% и более считались с большим ИМ Ki-67 (65 случаев – 55%), до 30% – с небольшим (53 случая – 45%). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие (р=0,01) в зависимости от ИМ Ki-67: 57,7±7,9% - при небольшом ИМ Ki-67 и 38,4±6,4% - при большом (рисунок 44в). Рисунок 45. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в) с небольшим (-ТороIIα) и большим (+ТороIIα) ИМ ТороIIα. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Так как при НМКРЛ медиана ИМ ТороIIα составила 19%, то случаи с ИМ ТороIIα 19% и более считались с большим ИМ ТороIIα (99 случаев – 52%), до 19% – с небольшим (94 случая – 48%). Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р=0,003) в зависимости от ИМ ТороIIα: 53,0±5,5% - при небольшом и 31,7±5,1% - при большом (рисунок 45а). Так как при Ак медиана ИМ ТороIIα составила 14%, то случаи с ИМ ТороIIα 14% и более считались с большим ИМ ТороIIα (42 случая – 51%), до 14% – с небольшим (40 случаев – 49%). Выживаемость больных Ак имела 193 статистически значимое отличие (р=0,001) в зависимости от ИМ ТороIIα: 48,6±9,2% - при небольшом и 17,9±6,1% - при большом (рисунок 45б). Так как при Пк медиана ИМ ТороIIα составила 22%, то случаи с ИМ ТороIIα 22% и более считались с большим ИМ ТороIIα (61 случай – 55%), до 22% – с небольшим (50 случаев – 45%). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от ИМ ТороIIα: 74,8±6,6% - при небольшом и 24,8±6,6% - при большом (рисунок 45в). 9.3.4. Маркеры апоптоза (p53, bcl-2 и bax) Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие в зависимости от экспрессии р53 (р=0,03): 46,2±4,7% – при отрицательной экспрессии и 32,4±5,1% - при положительной экспрессии (рисунок 46а). Рисунок 46. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ с отрицательной (-) и положительной (+) экспрессией р53(а), bcl-2(б) и bax(в). Ось абсцисс – время жизни (дни), ось ординат – доля выживших больных. 194 Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие в зависимости от экспрессии bcl-2 (р=0,004): 35,6±3,8% – при отрицательной и 58,4±8,8% - при положительной экспрессии (рисунок 46б). Выживаемость больных НМКРЛ при положительной экспрессии bax была ниже по сравнению с отрицательной (36,8±4,7% и 44,8±5,2% соответственно), однако, отличие не достоверно (р=0,7) (рисунок 46в). Рисунок 47. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных Ак с отрицательной (-) и положительной (+) экспрессией р53(а), bcl-2(б) и bax(в). Ось абсцисс – время жизни (дни), ось ординат – доля выживших больных. Выживаемость больных Ак не имела статистически значимого отличия в зависимости от экспрессии р53 (р=0,2): 36,4±6,5% – при отрицательной экспрессии и 23,5±7,7% - при положительной экспрессии (рисунок 47а). Выживаемость больных Ак не имела статистически значимого отличия в зависимости от экспрессии bcl-2 (р=0,1): 29,8±5,2% – при отрицательной экспрессии и 52,7±15,0% - при положительной экспрессии (рисунок 47б). Выживаемость больных Ак при положительной экспрессии bax была 195 ниже по сравнению с отрицательной экспрессией (23,4±6,4% и 44,6±8,7% соответственно), однако, отличие не достоверно (р=0,1) (рисунок 47в). Рисунок 48. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных Пк с отрицательной (-) и положительной (+) экспрессией р53(а), bcl-2(б) и bax(в). Ось абсцисс – время жизни (дни), ось ординат – доля выживших больных. Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие в зависимости от экспрессии р53 (р=0,03): 54,8±7,0% – при отрицательной экспрессии и 37,0±6,5% - при положительной экспрессии (рисунок 48а). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие в зависимости от экспрессии bcl-2 (р=0,047): 41,3±5,4% – при отрицательной экспрессии и 59,0±10,4% - при положительной экспрессии (рисунок 48б). Выживаемость больных Пк при положительной экспрессии bax была выше по сравнению с отрицательной экспрессией (52,8±6,5% и 43,5±6,6% соответственно), однако, отличие не достоверно (р=0,2) (рисунок 48в). 196 9.3.5. ПМЦР-Г и ПМЦР-Л Так как при НМКРЛ медиана ПМЦР-Г составила 43, то случаи с ПМЦР-Г 43 и более считались с большой ПМЦР-Г (115 случаев – 50%), до 43 – с небольшой (113 случаев – 50%). Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р=0,008) в зависимости от ПМЦР-Г: 49,8±5,2% - при небольшой и 29,8±4,8% - при большой (рисунок 49а). Так как при Ак медиана ПМЦР-Г составила 47, то случаи с ПМЦР-Г 47 и более считались с большой ПМЦР-Г (56 случаев – 53%), до 47 – с небольшой (49 случаев – 47%). Выживаемость больных Ак имела статистически значимое отличие (р=0,002) в зависимости от ПМЦР-Г: 46,3±8,9% - при небольшой и 18,9±5,9% - при большой (рисунок 49б). Рисунок 49. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в) с небольшой (-) и большой (+) ПМЦР-Г. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. 197 Так как при Пк медиана ПМЦР-Г составила 40, то случаи с ПМЦР-Г 40 и более считались с большой ПМЦР-Г (62 случая – 50%), до 40 – с небольшой (61 случай – 50%). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие (р=0,01) в зависимости от ПМЦР-Г: 57,2±6,8% - при небольшой и 31,5±7,1% - при большой (рисунок 49в). Рисунок 50. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в) с небольшой (-) и большой (+) ПМЦР-Л. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Так как при НМКРЛ медиана ПМЦР-Л составила 4, то случаи с ПМЦРЛ 4 и более считались с большой ПМЦР-Л (129 случаев – 57%), до 4 – с небольшой (99 случаев – 43%). Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р=0,03) в зависимости от ПМЦР-Л: 48,3±5,5% при небольшой и 34,0±4,6% - при большой (рисунок 50а). Так как при Ак медиана ПМЦР-Л составила 4, то случаи с ПМЦР-Л 4 и более считались с большой ПМЦР-Л (60 случаев – 57%), до 4 – с небольшой 198 (45 случаев – 43%). Выживаемость больных Ак не имела статистически значимого отличия (р=0,5) в зависимости от ПМЦР-Л: 32,8±8,0% - при небольшой и 29,4±6,9% - при большой (рисунок 50б). Так как при Пк медиана ПМЦР-Л составила 4, то случаи с ПМЦР-Л 4 и более считались с большой ПМЦР-Л (69 случаев – 56%), до 4 – с небольшой (54 случая – 44%). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие (р=0,02) в зависимости от ПМЦР-Л: 59,0±7,5% - при небольшой ПМЦР-Л˂4 и 36,1±6,3% - при большой ПМЦР-Л≥4 (рисунок 50в). 9.3.6. Статус белка и гена Her2 Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие в зависимости от экспрессии белка Her2 (р=0,02): 46,8±5,2% – при отрицательной и 30,9±5,0% - при положительной (рисунок 51а). Рисунок 51. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в) с отрицательным (-) и положительным (+) Her2 статусом. Ось абсцисс – время жизни (дни), ось ординат – доля выживших больных. 199 Выживаемость больных Ак при положительной экспрессии белка Her2 была ниже по сравнению с отрицательным (26,6±6,6% и 34,1±8,9% соответственно), однако, отличие не достоверно (р=0,4) (рисунок 51б). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие в зависимости от экспрессии белка Her2 (р=0,04): 51,8±6,5% – при отрицательной и 33,6±7,6% - при положительной (рисунок 51в). Выживаемость больных НМКРЛ при наличии амплификации гена Her2 была ниже по сравнению с опухолями, в которых отсутствовала амплификация гена Her2 (31,0±11,5% и 39,9±3,8% соответственно), однако, отличие не достоверно (р=0,5) (рисунок 52а). Рисунок 52. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ: а – при отсутствии (-HER2) и наличии (+HER2) амплификации генаHer2, б при отсутствии (-CEP17) и наличии (+CEP17) увеличения CEP17, в – при четырех типах, в зависимости от состояния гена Her2 и CEP17. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. 200 Выживаемость больных НМКРЛ при наличии увеличения CEP17 была ниже по сравнению с опухолями, в которых отсутствовало увеличение CEP17 (25,6±8,9% и 42,3±3,8% соответственно), однако, имеется только тенденция к статистической достоверности (р=0,07) (рисунок 52б). При анализе выживаемости больных НМКРЛ с четырьмя типами опухоли выявлено отсутствие отличий между типами N и AP (р=0,3; выживаемость соответственно 44,6±4,0% и 55,1±19,6%) и между типами A и P (р=0,7; выживаемость соответственно 9,2±8,8% и 9,5±7,0%). Наблюдалось статистически значимое снижение выживаемости больных с типами A и P, с одной стороны, по сравнению с типами N и AP, с другой стороны (рисунок 52в). Рисунок 53. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных Ак: а – при отсутствии (-HER2) и наличии (+HER2) амплификации генаHer2, б - при отсутствии (-CEP17) и наличии (+CEP17) увеличения CEP17, в – при четырех типах, в зависимости от состояния гена Her2 и CEP17. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Выживаемость больных Ак при наличии амплификации гена Her2 была ниже по сравнению с опухолями, в которых отсутствовала амплификация ге- 201 на Her2 (34,6±12,5% и 30,3±5,7% соответственно), однако, отличие не достоверно (р=0,6) (рисунок 53а). Выживаемость больных Ак при наличии и при отсутствии увеличения CEP17 не имела статистически значимых отличий (р=1,0; выживаемость соответственно 33,3±12,1% и 31,4±5,6%) (рисунок 53б). Рисунок 54. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных Пк: а – при отсутствии (-HER2) и наличии (+HER2) амплификации генаHer2, б - при отсутствии (-CEP17) и наличии (+CEP17) увеличения CEP17, в – при четырех типах, в зависимости от состояния гена Her2 и CEP17. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. При анализе выживаемости больных Ак с четырьмя типами опухоли выявлено отсутствие отличий между типами A и P (р=0,5; выживаемость соответственно 10,0±9,5% и 5,0±6,9%), наблюдалось снижение выживаемости при типе N по сравнению с AP (р=0,03; выживаемость соответственно 34,8±6,2% и 58,9±20,3%) . Также наблюдалось статистически значимое снижение выживаемости больных с типами A и P по сравнению с типом AP (р=0,008 и р=0,01 соответственно); и отсутствие отличий с типом N (рис.53в). 202 Выживаемость больных Пк при наличии амплификации гена Her2 была ниже по сравнению с опухолями, в которых отсутствовала амплификация гена Her2 (10,0±16,1% и 46,1±5,1% соответственно), однако, отличие не достоверно (р=0,2) (рисунок 54а). Выживаемость больных Пк при наличии увеличения CEP17 была достоверно ниже по сравнению с опухолями, в которых отсутствовало увеличение CEP17 (р=0,01; выживаемость соответственно 20,0±12,6% и 49,4±5,2% соответственно) (рисунок 54б). При анализе выживаемости больных Пк с четырьмя типами опухоли выявлено, что выживаемость с типом N составила 49,1±5,3%, с типом АР был один больной - завершенный случай, прожил 209 дней, с типом A два больных – один завершенный случай, прожил 614 дней и один незавершенный случай, был под наблюдением 68 дней, выживаемость с типом P составила 22,2±13,9%. Наблюдалось статистически значимое снижение выживаемости больных с типом P по сравнению с типом N (р=0,03) (рисунок 54в). 9.4. Коэкспрессия молекулярно-биологических маркеров 9.4.1. Коэкспрессия Ag-ЯОР-белков, маркеров пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα) и Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках Результаты определения выживаемости больных НМКРЛ во взаимосвязи с коэкспрессией ядрышковых организаторов (ИП и КВ Ag-ЯОРбелков), маркеров пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), а также результаты сравнения представлены в таблице 84. При исследовании ядрышковых организаторов наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -ИП Ag-ЯОР-белков /КВ Ag-ЯОР-белков, тип -ИП Ag-ЯОР-белков /+КВ Ag-ЯОР-белков и тип +ИП Ag-ЯОР-белков /-КВ Ag-ЯОР-белков, тип +ИП Ag-ЯОР-белков /+КВ Ag-ЯОР-белков (рисунок 55а,б). Найдено статистически значимое отличие в выживаемости больных с типами -ИП Ag-ЯОР-белков /-КВ Ag-ЯОР-белков и +ИП Ag-ЯОР-белков /+KВ Ag-ЯОР-белков. 203 Таблица 84. Выживаемость больных НМКРЛ и коэкспрессия Ag-ЯОРбелков и маркеров пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα). № Характеристика 1 2 3 4 5 6 7 8 ИП и КВ -ИП/-КВ -ИП/+КВ +ИП/-КВ +ИП/+КВ ИМ Ki-67и ИМ ТороIIα -ИМ Ki-67 /-ИМ ТороIIα -ИМ Ki-67 /+ИМ ТороIIα +ИМ Ki-67 /-ИМ ТороIIα +ИМ Ki-67 /+ИМ ТороIIα Количество случаев (абс.(%)) Пятилетняя общая скорректированная выживаемость (%) 94 (39) 30 (12) 42 (17) 77 (32) 53,2±6,0 38,5±10,0 38,7±9,1 20,7±5,2 1-3,4 / 2-4: р<0,05 1-2/3-4/2-3: р˃0,2 59 (32) 29 (16) 32 (17) 65 (35) 56,4±7,2 40,8±15,1 41,9±9,4 25,0±5,6 6-8 / 5-8: р<0,05 5-6,7 / 7-6,8: р˃0,2 р Примечание: ИП - ИП Ag-ЯОР-белков, КВ – КВ Ag-ЯОР-белков. В группе опухолей с небольшим или большим ИП Ag-ЯОР-белков выживаемость не отличалась при небольшом или большом КВ Ag-ЯОР-белков (между –ИП Ag-ЯОР-белков /-КВ Ag-ЯОР-белков и –ИП Ag-ЯОР-белков /+KВ Ag-ЯОР-белков; между +ИП Ag-ЯОР-белков /-KВ Ag-ЯОР-белков и +ИП Ag-ЯОР-белков /+КВ Ag-ЯОР-белков). В группе опухолей с небольшим КВ Ag-ЯОР-белков выживаемость длиннее в опухолях с небольшим ИП AgЯОР-белков (-ИП Ag-ЯОР-белков /-KВ Ag-ЯОР-белков) по сравнению с опухолями с большим ИП Ag-ЯОР-белков и большим КВ Ag-ЯОР-белков (+ИП Ag-ЯОР-белков /-KВ Ag-ЯОР-белков). Аналогично, в группе опухолей с большим КВ Ag-ЯОР-белков выживаемость длиннее в опухолях с небольшим ИП Ag-ЯОР-белков (-ИП Ag-ЯОР-белков /+KВ Ag-ЯОР-белков) по сравнению с опухолями с большим ИП Ag-ЯОР-белков (+ИП Ag-ЯОР-белков /+ИП Ag-ЯОР-белков). Также не найдено статистически значимого отличия в выживаемости больных с типами -ИП Ag-ЯОР-белков /+КВ Ag-ЯОР-белков и +ИП Ag-ЯОР-белков /-KВ Ag-ЯОР-белков. Исходя из полученных данных типы -ИП Ag-ЯОР-белков /+КВ AgЯОР-белков и +ИП Ag-ЯОР-белков /-KВ Ag-ЯОР-белков НМКРЛ объединены в «промежуточный» тип, в котором ИП и КВ Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли имели противоположные значения (-ИП Ag-ЯОР-белков /+КВ AgЯОР-белков и +ИП Ag-ЯОР-белков /-КВ Ag-ЯОР-белков). Выживаемость больных с «промежуточным» типом опухоли статистически значимо отлича- 204 лась от опухолей с типом -ИП Ag-ЯОР-белков /-КВ Ag-ЯОР-белков и типом +ИП Ag-ЯОР-белков /+КВ Ag-ЯОР-белков и имела промежуточное значение – 38,4±6,8%. Рисунок 55. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ в зависимости от параметров Ag-ЯОР-белков (а, б) и коэкспрессии маркеров пролиферативной активности (в). ИП - ИП Ag-ЯОР-белков, КВ – КВ AgЯОР-белков, Ki-67, ТороIIα - соответственно ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Таким образом, имелась взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков. При исследовании коэкспрессии маркеров пролиферативной активности наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -ИМ Ki-67 /-ИМ ТороIIα, тип +ИМ Ki-67 /-ИМ ТороIIα, тип -ИМ Ki-67 /+ИМ ТороIIα, тип +ИМ Ki-67 /+ИМ ТороIIα (рисунок 55в). Найдено статистически значимое отличие в выживаемости больных с типами -ИМ Ki-67 /-ИМ ТороIIα и +ИМ Ki-67 /+ИМ ТороIIα. В группе опу- 205 холей с небольшим или большим ИМ Ki-67 выживаемость не отличалась при небольшом или большом ИМ ТороIIα (между -ИМ Ki-67 /-ИМ ТороIIα и -ИМ Ki-67 /+ИМ ТороIIα; между +ИМ Ki-67 /-ИМ ТороIIα и +ИМ Ki-67 /+ИМ ТороIIα). Также в группе опухолей с небольшим ИМ ТороIIα выживаемость не отличалась при небольшом или большом ИМ Ki-67 (-ИМ Ki-67 /-ИМ ТороIIα и +ИМ Ki-67 /-ИМ ТороIIα). В группе опухолей с большим ИМ ТороIIα выживаемость длиннее в опухолях с небольшим ИМ Ki-67 (-ИМ Ki-67 /+ИМ ТороIIα) по сравнению с опухолями с большим ИМ Ki-67 (+ИМ Ki-67 /+ИМ ТороIIα). Также не найдено статистически значимого отличия в выживаемости больных с типами -ИМ Ki-67 /+ИМ ТороIIα и +ИМ Ki-67 /-ИМ ТороIIα. Таким образом, имелась взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ с коэкспрессией маркеров пролиферативной активности. Результаты определения выживаемости больных НМКРЛ во взаимосвязи параметров ядрышковых организаторов (ИП и КВ Ag-ЯОР-белков) с маркерами пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), а также результаты сравнения представлены в таблице 85 и 86. Таблица 85. Выживаемость больных НМКРЛ и коэкспрессия ИП Ag-ЯОРбелков с маркерами пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα). № Характеристика 1 2 3 4 5 6 7 8 Количество случаев (абс.(%)) ИП и ИМ Ki-67 -ИП /-ИМ Ki-67 61 (29) -ИП /+ИМ Ki-67 44 (21) +ИП /-ИМ Ki-67 36 (17) +ИП /+ИМ Ki-67 69 (33) ИП и ИМ ТороIIα -ИП /-ИМ ТороIIα 60 (32) -ИП /+ИМ ТороIIα 37 (19) +ИП /-ИМ ТороIIα 32 (17) +ИП /+ИМ ТороIIα 60 (32) Примечание: ИП - ИП Ag-ЯОР-белков. Пятилетняя общая скорректированная выживаемость (%) р 56,8±7,4 43,9±8,1 33,8±8,7 23,8±5,6 1-3,4 / 2-4: р<0,05 1-2/3-4/2-3: р˃0,1 56,7±7,2 47,5±9,3 37,5±9,1 21,0±5,9 8-5,6: р<0,05 5-6,7 / 7-6,8: р˃0,2 При исследовании ИП Ag-ЯОР-белков и ИМ Ki-67 наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67, тип -ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67, тип +ИП Ag-ЯОР-белков /ИМ Ki-67, тип +ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67 (рисунок 56а,б). 206 Рисунок 56. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ в зависимости от ИП Ag-ЯОР-белков и экспрессии Ki-67 (а, б), ТороIIα (в). ИП - ИП Ag-ЯОР-белков, Ki-67, ТороIIα - соответственно ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Найдено статистически значимое отличие в выживаемости больных с типами -ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67 и +ИП Ag-ЯОР-белков /+KВ AgЯОР-белков. В группе опухолей с небольшим или большим ИП Ag-ЯОРбелков выживаемость не отличалась при небольшом или большом ИМ Ki-67 (между -ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67 и –ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67; между +ИП Ag-ЯОР-белков /- ИМ Ki-67 и +ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67). В группе опухолей с небольшим ИМ Ki-67 выживаемость длиннее в опухолях с небольшим ИП Ag-ЯОР-белков (-ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67) по сравнению с опухолями с большим ИП Ag-ЯОР-белков и небольшим ИМ Ki67 (+ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67). Аналогично, в группе опухолей с большим ИМ Ki-67 выживаемость длиннее в опухолях с небольшим ИП Ag-ЯОР-белков (-ИП Ag-ЯОР-белков 207 /+ИМ Ki-67) по сравнению с опухолями с большим ИП Ag-ЯОР-белков (+ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67). Также не найдено статистически значимого отличия в выживаемости больных с типами -ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67 и +ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67. Исходя из полученных данных типы -ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67 и +ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67 НМКРЛ объединены в «промежуточный» тип, в котором ИП Ag-ЯОР-белков и ИМ Ki-67 в клетках опухоли имели противоположные значения (-ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67 и +ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67). Выживаемость больных с «промежуточным» типом опухоли статистически значимо отличалась от опухолей с типом -ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67 и типом +ИП Ag-ЯОРбелков /+ИМ Ki-67 и имела промежуточное значение – 41,0±5,9%. При исследовании ИП Ag-ЯОР-белков и ИМ ТороIIα наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду типов: -ИП Ag-ЯОРбелков/-ИМ ТороIIα, -ИП Ag-ЯОР-белков/+ИМ ТороIIα, +ИП Ag-ЯОРбелков/-ИМ ТороIIα, +ИП Ag-ЯОР-белков/+ИМ ТороIIα (рисунок 56в). Найдено статистически значимое отличие в выживаемости больных с типами -ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ ТороIIα и +ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ ТороIIα. В группе опухолей с небольшим или большим ИП Ag-ЯОР-белков выживаемость не отличалась при небольшом или большом ИМ ТороIIα (между -ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ ТороIIα и -ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ ТороIIα; между +ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ ТороIIα и +ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ ТороIIα). Также в группе опухолей с небольшим ИМ ТороIIα выживаемость не отличалась при небольшом или большом ИП Ag-ЯОР-белков (-ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ ТороIIα и +ИП Ag-ЯОР-белков /-ИМ ТороIIα). В группе опухолей с большим ИМ ТороIIα выживаемость длиннее в опухолях с небольшим ИП Ag-ЯОР-белков (-ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ ТороIIα) по сравнению с опухолями с большим ИП Ag-ЯОР-белков (+ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ ТороIIα). Также не найдено статистически значимого отличия в выживаемости больных с типами -ИП Ag-ЯОР-белков /+ИМ ТороIIα и +ИП AgЯОР-белков /-ИМ ТороIIα. Таким образом, имелась взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ с активностью ядрышковых организаторов (ИП AgЯОР-белков) во взаимосвязи с экспрессией маркеров пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα). 208 При исследовании КВ Ag-ЯОР-белков и ИМ Ki-67 наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -КВ Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67, тип -КВ Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67, тип +КВ Ag-ЯОР-белков /ИМ Ki-67, тип +КВ Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67 (рисунок 57а,б). Таблица 86. Выживаемость больных НМКРЛ и коэкспрессия КВ Ag-ЯОРбелков с маркерами пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα). № Характеристика 1 2 3 4 5 6 7 8 КВ и ИМ Ki-67 -КВ /-ИМ Ki-67 -КВ /+ИМ Ki-67 +КВ /-ИМ Ki-67 +КВ /+ИМ Ki-67 КВ и ИМ ТороIIα -КВ /-ИМ ТороIIα -КВ /+ИМ ТороIIα +КВ /-ИМ ТороIIα +КВ /+ИМ ТороIIα Количество случаев (абс.(%)) Пятилетняя общая скорректированная выживаемость (%) р 65 (30) 58 (27) 34 (16) 58 (27) 57,3±7,1 40,5±7,0 38,9±9,9 18,3±5,5 4-1,2,3: р<0,05 1-2,3 / 2-3: р˃0,08 59 (31) 48 (25) 34 (18) 49 (26) 58,4±7,2 45,7±7,9 39,1±9,0 15,7±6,3 8-5,6,7: р<0,05 5-6,7 / 6-7: р˃0,09 Примечание: КВ – КВ Ag-ЯОР-белков. Найдено статистически значимое отличие в выживаемости больных с типами -КВ Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67 и +КВ Ag-ЯОР-белков /+ ИМ Ki-67. В группе опухолей с небольшим КВ Ag-ЯОР-белков выживаемость не отличалась при небольшом или большом ИМ Ki-67 (между -КВ Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67 и –КВ Ag-ЯОР-белков /+ ИМ Ki-67). В группе опухолей с большим КВ Ag-ЯОР-белков выживаемость длиннее в опухолях с небольшим ИМ Ki-67 (+КВ Ag-ЯОР-белков /- ИМ Ki-67) по сравнению с опухолями с большим ИМ Ki-67 (+КВ Ag-ЯОР-белков /+ ИМ Ki-67). В группе опухолей с небольшим ИМ Ki-67 выживаемость не отличалась при небольшом или большом КВ Ag-ЯОР-белков (между -КВ Ag-ЯОР-белков /-ИМ Ki-67 и +КВ AgЯОР-белков /- ИМ Ki-67). В группе опухолей с большим ИМ Ki-67 выживаемость длиннее в опухолях с небольшим КВ Ag-ЯОР-белков (-КВ Ag-ЯОРбелков /+ ИМ Ki-67) по сравнению с опухолями с большим КВ Ag-ЯОРбелков и (+КВ Ag-ЯОР-белков /+ ИМ Ki-67). Не найдено статистически значимого отличия в выживаемости больных с типами -КВ Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67 и +КВ Ag-ЯОР-белков /- ИМ Ki-67. 209 Рисунок 57. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ в зависимости от активности ядрышковых организаторов (КВ Ag-ЯОР-белков) и экспрессии Ki-67 (а, б), ТороIIα (в). КВ - КВ Ag-ЯОР-белков, Ki-67, ТороIIα - соответственно ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Исходя из полученных данных типы -КВ Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67 и +КВ Ag-ЯОР-белков /- ИМ Ki-67 НМКРЛ объединены в «промежуточный» тип, в котором КВ Ag-ЯОР-белков и ИМ Ki-67 в клетках опухоли имели противоположные значения (-КВ Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67 и +КВ Ag-ЯОРбелков /-ИМ Ki-67). Выживаемость больных с «промежуточным» типом опухоли статистически значимо отличалась от опухолей с типом -КВ Ag-ЯОРбелков /-ИМ Ki-67 и типом +КВ Ag-ЯОР-белков /+ИМ Ki-67 и имела промежуточное значение – 40,1±5,6%. При исследовании КВ Ag-ЯОР-белков и ИМ ТороIIα наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -КВ Ag-ЯОРбелков /-ИМ ТороIIα, тип -КВ Ag-ЯОР-белков /+ИМ ТороIIα, тип +КВ Ag- 210 ЯОР-белков /-ИМ ТороIIα , тип +КВ Ag-ЯОР-белков /+ИМ ТороIIα (рисунок 57в). Найдено статистически значимое отличие в выживаемости больных с типами -КВ Ag-ЯОР-белков /-ИМ ТороIIα и +КВ Ag-ЯОР-белков /+KВ AgЯОР-белков. В группе опухолей с небольшим КВ Ag-ЯОР-белков выживаемость не отличалась при небольшом или большом ИМ ТороIIα (между -КВ Ag-ЯОР-белков /-ИМ ТороIIα и –КВ Ag-ЯОР-белков /+ ИМ ТороIIα). В группе опухолей с большим КВ Ag-ЯОР-белков выживаемость длиннее в опухолях с небольшим ИМ ТороIIα (+КВ Ag-ЯОР-белков /- ИМ ТороIIα) по сравнению с опухолями с большим ИМ ТороIIα (+КВ Ag-ЯОР-белков /+ ИМ ТороIIα). В группе опухолей с небольшим ИМ ТороIIα выживаемость не отличалась при небольшом или большом КВ Ag-ЯОР-белков (между -КВ AgЯОР-белков /-ИМ ТороIIα и +КВ Ag-ЯОР-белков /- ИМ ТороIIα). В группе опухолей с большим ИМ ТороIIα выживаемость длиннее в опухолях с небольшим КВ Ag-ЯОР-белков (-КВ Ag-ЯОР-белков /+ ИМ ТороIIα) по сравнению с опухолями с большим КВ Ag-ЯОР-белков и (+КВ Ag-ЯОР-белков /+ ИМ ТороIIα). Не найдено статистически значимого отличия в выживаемости больных с типами -КВ Ag-ЯОР-белков /+ИМ ТороIIα и +КВ Ag-ЯОРбелков /- ИМ ТороIIα. Таким образом, имелась взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ с активностью ядрышковых организаторов (КВ Ag-ЯОРбелков) во взаимосвязи с экспрессией маркеров пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα). Результаты определения выживаемости больных НМКРЛ во взаимосвязи ядрышковых организаторов в MIB-1 позитивных клетках с маркерами пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), а также результаты сравнения представлены в таблице 87. При исследовании Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ИМ Ki-67 наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду типов: -Ag-ЯОР-белков (MIB-1) /-ИМ Ki-67, -Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ Ki-67, +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/-ИМ Ki-67, +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ Ki-67 (рисунок 58а). 211 Таблица 87. Выживаемость больных НМКРЛ и Ag-ЯОР-белков (MIB-1) с маркерами пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα). № Характеристика 1 2 3 4 5 6 7 8 П и ИМ Ki-67 -П /-ИМ Ki-67 -П /+ИМ Ki-67 +П /-ИМ Ki-67 +П /+ИМ Ki-67 П и ИМ ТороIIα -П /-ИМ ТороIIα -П /+ИМ ТороIIα +П /-ИМ ТороIIα +П /+ИМ ТороIIα Количество случаев (абс.(%)) Пятилетняя общая скорректированная выживаемость (%) р 52 (26) 49 (25) 37 (18) 61 (31) 65,2±8,1 53,6±8,0 28,7±7,7 9,9±4,2 1-3,4/2-3,4/3-4:р<0,01 1-2: р=0,3 56 (32) 36 (21) 28 (16) 54 (31) 61,5±7,2 64,7±9,6 23,9±8,3 8,2±4,7 5-7,8/6-7,8:р<0,001 5-6/7-8: р˃0,09 Примечание: П - Ag-ЯОР-белков (MIB-1). Найдено статистически значимое отличие выживаемости больных с типами -Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/-ИМ Ki-67 и +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ ИМ Ki-67. В группе опухолей с небольшой Ag-ЯОР-белками (MIB-1) выживаемость не отличалась при небольшом или большом ИМ Ki-67 (между -AgЯОР-белков (MIB-1)/-ИМ Ki-67 и –Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ Ki-67). В группе опухолей с большой Ag-ЯОР-белками (MIB-1) выживаемость длиннее в опухолях с небольшим ИМ Ki-67 (+Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/-ИМ Ki-67) по сравнению с опухолями с большим ИМ Ki-67 (+Ag-ЯОР-белков (MIB1)/+ИМ Ki-67). В группе опухолей с небольшим и большим ИМ Ki-67 выживаемость длиннее в опухолях с небольшой Ag-ЯОР-белками (MIB-1) по сравнению с большой (между -Ag-ЯОР-белков (MIB-1) /-ИМ Ki-67 и +AgЯОР-белков (MIB-1)/-ИМ Ki-67; между -Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ Ki-67 и +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ Ki-67). Найдено статистически значимое отличие выживаемости больных с типами -Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ Ki67 и +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/- ИМ Ki-67. При исследовании Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ИМ ТороIIα наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду типов: -Ag-ЯОРбелков (MIB-1) /+ИМ ТороIIα, -Ag-ЯОР-белков (MIB-1) /-ИМ ТороIIα, +AgЯОР-белков (MIB-1) /-ИМ ТороIIα, +Ag-ЯОР-белков (MIB-1) /+ИМ ТороIIα (рисунок 50б). Найдено статистически значимое отличие выживаемости 212 больных с типами -Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/-ИМ ТороIIα и +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ ТороIIα. Рисунок 58. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ в зависимости от активности ядрышковых организаторов в MIB-1 позитивных клетках и экспрессии Ki-67 (а), ТороIIα (б). П - Ag-ЯОР-белков (MIB-1), Ki67, ТороIIα - соответственно ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. В группе опухолей с небольшой и большой Ag-ЯОР-белками (MIB-1) выживаемость больных НМКРЛ не отличалась при большом или небольшом ИМ ТороIIα (между -Ag-ЯОР-белков (MIB-1) /-ИМ ТороIIα и -Ag-ЯОРбелков (MIB-1)/+ИМ ТороIIα; между +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/-ИМ ТороIIα и +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ ТороIIα). В группе опухолей с небольшим и большим ИМ ТороIIα выживаемость длиннее в опухолях с небольшой AgЯОР-белками (MIB-1) по сравнению с большой (между -Ag-ЯОР-белков (MIB-1) /-ИМ ТороIIα и +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/-ИМ ТороIIα; между -AgЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ ТороIIα и +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ ТороIIα). Найдено статистически значимое отличие выживаемости больных с типами Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/+ИМ ТороIIα и +Ag-ЯОР-белков (MIB-1)/- ИМ ТороIIα. Таким образом, имелась взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ с активностью ядрышковых организаторов в MIB-1 позитивных клетках во взаимосвязи с экспрессией маркеров пролиферативной активности (ИМ Ki67 и ИМ ТороIIα). 213 9.4.2. Коэкспрессия маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) Результаты определения выживаемости больных НМКРЛ во взаимосвязи с коэкспрессией маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax), а также результаты сравнения представлены в таблице 88. Таблица 88. Выживаемость больных НМКРЛ и коэкспрессия p53, bcl-2, bax. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Характеристика p53 и bcl-2 -p53/+bcl-2 -p53/-bcl-2 +p53/+bcl-2 +p53/-bcl-2 p53 и bax -p53/-bax -p53/+bax +p53/-bax +p53/+bax bcl-2 и bax +bcl-2/-bax +bcl-2/+bax -bcl-2/-bax -bcl-2/+bax Количество случаев (абс.(%)) Пятилетняя общая скорректированная выживаемость (%) 23 (10) 110 (46) 20 (8) 84 (36) 70,1±12,5 38,9±5,1 32,6±12,7 30,3±5,6 1-2,3,4: р<0,001 2-3,4 / 3-4: р˃0,3 56 (24) 77 (32) 51 (22) 53 (22) 47,4±7,3 43,5±6,4 38,8±7,5 25,3±6,8 8-5,6: р<0,05 5-6,7 / 6-7 / 8-7: р˃0,3 20 (8) 23 (10) 87 (37) 107 (45) 58,9±13,3 56,2±10,8 39,5±5,7 32,4±5,1 9-11,12 / 10-12: р<0,05 9-10 / 10-11 / 11-12: р˃0,1 р Выживаемость больных НМКРЛ уменьшалась в ряду иммунофенотипов опухоли: 1) тип -p53/+bcl-2, тип -p53/-bcl-2, тип +p53/+bcl-2 и тип +p53/bcl-2; 2) тип -p53/-bax, тип -p53/+bax, тип +p53/-bax и тип +p53/+bax; 3) тип +bcl-2/-bax, тип +bcl-2/+bax, тип -bcl-2/-bax и тип -bcl-2/+bax (рисунок 59). При анализе парной коэкспрессии р53 и bcl-2 статистически значимые отличия выживаемости больных получены только для иммунофенотипа -p53/+bcl2 (р˂0,001). При анализе парной коэкспрессии р53 и bax больные с иммунофенотипом +p53/+bax имели наихудшую выживаемость (отличие достоверно (р˂0,05) при сравнении с иммунофенотипами -p53/-bax и -p53/+bax). При анализе парной коэкспрессии bcl-2 и bax отмечается тенденция к укорочению выживаемости при +bax в опухолях с +bcl-2 или -bcl-2 иммунофенотипом. В группе опухолей с положительной или отрицательной экспрессией bax вы- 214 живаемость больных НМКРЛ длиннее при положительной экспрессии bcl-2 по сравнению с отрицательной (между +bcl-2/-bax и -bcl-2/-bax; между +bcl2/+bax и -bcl-2/+bax). Также найдено статистически значимое отличие выживаемости больных с типами +bcl-2/-bax и -bcl-2/+bax. Рисунок 59. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ в зависимости от коэкспрессии маркеров апоптоза: а – при иммунофенотипах p53/bcl-2; б - при иммунофенотипах p53/bax; в - при иммунофенотипах bcl2/bax. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Таким образом, имелась взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ с коэкспрессией маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax). Выживаемость больных НМКРЛ благоприятнее в +bcl-2 опухолях, хуже в +p53 опухолях и имеет тенденцию к укорочению в +bax опухолях. 215 9.4.3. Коэкспрессия маркеров ангиогенеза (ПМЦР-Г, ПМЦР-Л) Результаты определения выживаемости больных НМКРЛ во взаимосвязи с коэкспрессией маркеров ангиогенеза (ПМЦР-Г и ПМЦР-Л), а также результаты сравнения представлены в таблице 89. Таблица 89. Выживаемость больных НМКРЛ и коэкспрессия ПМЦР-Г, ПМЦР-Л. № Характеристика 1 2 3 4 -ПМЦР-Г/-ПМЦР-Л -ПМЦР-Г/+ПМЦР-Л +ПМЦР-Г/-ПМЦР-Л +ПМЦР-Г/+ПМЦР-Л Количество случаев (абс.(%)) 59 (32) 29 (16) 32 (17) 65 (35) Пятилетняя общая скорректированная выживаемость (%) 59,7±7,5 38,9±7,7 35,8±7,3 25,7±6,0 р 1-2,3,4: р<0,05 2-3,4 / 3-4: р˃0,2 Выживаемость больных НМКРЛ уменьшалась в ряду иммунофенотипов опухоли тип -ПМЦР-Г /-ПМЦР-Л, тип -ПМЦР-Г /+ПМЦР-Л, тип +ПМЦР-Г /-ПМЦР-Л и тип +ПМЦР-Г /+ПМЦР-Л (рисунок 60). Статистически значимые отличия выживаемости больных получены только для иммунофенотипа -ПМЦР-Г /-ПМЦР-Л. Таким образом, имелась взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ с коэкспрессией маркеров ангиогенеза (ПМЦРГ и ПМЦР-Л), выживаемость благоприятнее при небольшой ПМЦР-Г и ПМЦР-Л. Рисунок 60. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ в зависимости от коэкспрессии маркеров ангиогенеза. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. 216 Суммируя данные результатов анализа выживаемости следует отметить следующие основные моменты. Показатель 5-летней выживаемости при НМКРЛ, Ак и Пк имел статистически значимые отличия в зависимости от клинических критериев (типа операции), клинико-морфологических параметров (показателя Т, наибольшего размера, показателя N, стадии заболевания, гистогенеза, дифференцировки) и молекулярно-биологических маркеров (ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, экспрессии р53, bcl-2, ПМЦР-Г, ПМЦР-Л, ИГХ Her2 статус, амплификация гена Her2 и увеличение СЕР17). Также на продолжительность послеоперационной 5-летней выживаемости влияла взаимная коэкспрессия молекулярно-биологических маркеров Ag-ЯОР-белков, маркеров пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα) и Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках; в меньшей степени коэкспрессия маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) и ангиогенеза (ПМЦР-Г, ПМЦР-Л). 217 ГЛАВА 10. МНОГОФАКТОРНЫЙ АНАЛИЗ При анализе совокупности полученных данных (клинические критерии, клинико-морфологические параметры, молекулярно-биологические маркеры) был проведен корреляционно-регрессионный анализ. Корреляционный анализ был применен с целью выявления статистически значимых взаимосвязей и их степени выраженности между полученными данными, то есть определение и выделение зависимых переменных. Регрессионный анализ был применен с целью выявления независимых переменных и степени их влияния на прогноз больного. Завершающим этапом явилось создание математической модели с целью прогнозирования индивидуального исхода заболевания. 10.1. Корреляционный анализ В данном разделе представлены сводные суммарные данные о корреляционных взаимосвязях между клиническими критериями, клиникоморфологическими параметрами и молекулярно-биологическими маркерами, которые по отдельности и фрагментарно были освещены в предыдущих разделах, посвященных отдельным молекулярно-биологическим маркерам. Результаты определения корреляционных взаимосвязей клинических критериев с клинико-морфологическими параметрами и с молекулярнобиологическими маркерами представлены в таблице 90 и 91. Возраст больных НМКРЛ не имел взаимосвязи с клинико- морфологическими параметрами и молекулярно-биологическими маркерами при НМКРЛ. При анализе взаимосвязи пола больных НМКРЛ с клинико- морфологическими параметрами отмечается корреляция только с гистогенезом (р<0,001). У мужчин чаще определялся Пк (127 (61%) случаев) по сравнению с Ак (82 (39%) случая), у женщин чаще определялась Ак (29 (85%) случаев) по сравнению с Пк (5 (15%) случаев). Пол больных НМКРЛ при анализе связи с молекулярно-биологическими факторами имел достоверную взаимосвязь с Ag-ЯОР-белками, ПП, маркерами пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα) и апоптоза (bax), состоянием гена Her2. 218 Показатель Т Наибольший размер Показатель N Стадия Гистогенез Дифференцировка 0,01 0,01 0,12 0,11 0,06 0,01 0,07 0,11 0,01 0,02 0,291 0,03 0,212 0,182 0,341 0,391 0,182 0,09 0,02 0,01 0,07 0,03 0,01 0,03 0,12 0,11 0,10 0,11 0,03 0,10 ПХТ+ЛТ ЛТ ПХТ Тип операции Пол Клиникоморфологические параметры Возраст Таблица 90. Корреляционные взаимосвязи (коэффициент Спирмена) между клиническими и клинико-морфологическими параметрами при НМКРЛ. 0,12 0,09 0,09 0,07 0,03 0,06 Примечание: 1 - р<0,001, 2 - р<0,01. Тип операции имел достоверную взаимосвязь с клинико-морфологическими параметрами: показателем Т, наибольшим размером опухоли, показателем N, стадией заболевания и гистогенезом. При лобэктомии опухоль чаще соответствовала показателю Т1 (54 (39%) случая) по сравнению с показателем Т2-3 (119 (69%) случаев); при пневмонэктомии опухоль чаще соответствовала показателю Т2-3 (58 (83%) случаев) по сравнению с показателем Т1 (12 (17%) случаев) (р=0,03). При лобэктомии наибольший размер опухоли чаще был менее 3 см (84 (49%) случая) по сравнению с размером опухоли более 3 см (89 (51%) случаев); при пневмонэктомии наибольший размер опухоли чаще был более 3 см (50 (71%) случаев) по сравнению с размером опухоли менее 3 см (20 (29%) случаев) (р=0,004). При лобэктомии чаще выявлялся показатель N0 (129 (75%) случаев) по сравнению с показателем N1-3 (44 (25%) случая); при пневмонэктомии чаще выявлялся показатель N1-3 (43 (61%) случая) по сравнению с показателем N0 (27 (39%) случаев) (р<0,001). При лобэктомии чаще выявлялась 1 стадия заболевания (110 (64%) случаев) по сравнению со 2-3 стадиями (63 (36%) случая); при пневмонэктомии чаще выявлялась 2-3 стадии заболевания (54 (77%) случая) по сравнению с 1 стадией (16 (23%) случаев) (р<0,001). При лобэктомии чаще определялась Ак (89 (51%) случаев) по сравнению с Пк (84 (49%) случая); при пневмонэктомии чаще определялся Пк (48 (69%) случаев) по сравнению с Ак (22 (31%) случая) (р=0,005). 219 Тип операции не имел статистически значимой корреляции с молекулярно-биологическими маркерами. Полихимиотерапия, лучевая терапия и комбинированная терапия (полихимио- и лучевая терапия) не имели статистически значимой корреляции с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM и молекулярно-биологическими маркерами. ИП Ag-ЯОР-белков 0,01 КВ Ag-ЯОР-белков 0,04 ИМ Ki-67 0,06 ИМ ТороIIα 0,06 Ag-ЯОР-белки (MIB-1) 0,02 ПП 0,07 p53 0,01 bcl-2 0,04 bax 0,06 ПМЦР-Г 0,08 ПМЦР-Л 0,03 ИГХ Her2 статус 0 Состояние гена Her2 0,04 Состояние CEP17 0,02 Примечание: 1 - р<0,001, 2 - р<0,01. 0,202 0,222 0,371 0,321 0,06 0,321 0,10 0,04 0,182 0,01 0,10 0,10 0,142 0 0,17 0,05 0,13 0,15 0,14 0,15 0,01 0,09 0,06 0,13 0,05 0 0,12 0,02 0,04 0,08 0,06 0,11 0,01 0,04 0 0,07 0,04 0,05 0,08 0,02 0,07 0,02 0,01 0,03 0,05 0,01 0,05 0,03 0,01 0,07 0,01 0,09 0,02 0,05 0,04 0,06 ПХТ+ЛТ ЛТ ПХТ Тип операции Пол Молекулярнобиологические маркеры Возраст Таблица 91. Корреляционные взаимосвязи (коэффициент Спирмена) между клиническими и молекулярно-биологическими параметрами при НМКРЛ. 0,05 0,01 0,05 0,04 0 0,09 0,02 0,01 0,05 0,06 0,07 0 0,02 0,03 Таким образом, гистогенез НМКРЛ взаимосвязан с полом – у женщин чаще определялась Ак, у мужчин – Пк, что обуславливает гендерные особенности гистогенеза НМКРЛ. Тип операции взаимосвязан с показателем Т, наибольшим размером первичной опухоли, показателем N, стадией заболевания и гистогенезом, что отражает оперативную тактику и объем операции при определенной совокупности клинико-морфологических параметров по системе TNM у больного. Ag-ЯОР-белки, ПП, экспрессия маркеров пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα) и апоптоза (bax), состояние гена Her2 взаимосвязаны с полом больных НМКРЛ, что обусловлено корре- 220 ляцией данных молекулярно-биологических маркеров с третьим (промежуточным) параметром - гистогенезом, который коррелирует и с полом больных и с данными молекулярно-биологическими маркерами. Результаты определения корреляционных взаимосвязей между клинико-морфологическими параметрами и молекулярно-биологическими маркерами представлены в таблице 92. Гистогенез Дифференцировка ИП Ag-ЯОР-белков 0,341 0,451 0,341 КВ Ag-ЯОР-белков 0,13 0,291 0,341 2 ИМ Ki-67 0,09 0,11 0,21 1 ИМ ТороIIα 0,09 0,13 0,25 1 1 Ag-ЯОР-белки (MIB-1) 0,46 0,44 0,391 ПП 0,291 0,391 0,301 p53 0,05 0,12 0,07 bcl-2 -0,06 -0,07 -0,153 bax 0,05 0,06 0,05 ПМЦР-Г 0,06 0,03 0,05 ПМЦР-Л 0,04 0,02 0,01 ИГХ Her2 статус 0,10 0,05 0,143 Состояние гена Her2 0,01 0,03 0,12 Состояние CEP17 0,03 0,01 0,153 Примечание: 1 - р<0,001, 2 - р<0,01, 3 – р<0,05. Стадия Показатель N Наибольший размер Молекулярнобиологические маркеры Показатель Т Таблица 92. Корреляционные взаимосвязи (коэффициент Спирмена) между клинико-морфологическими и молекулярно-биологическими параметрами НМКРЛ. 0,341 0,06 0,12 0,13 0,351 0,331 0,03 -0,182 0,04 0,02 0,05 0,09 0,10 0,07 0,361 0,291 0,311 0,381 0,04 0,371 0,153 -0,153 0,163 0,163 0,01 0,241 0,241 0,12 0,331 0,271 0,222 0,232 0,331 0,371 0,05 -0,11 0,02 0,10 0,02 0,04 0,05 0,05 Показатель Т имел статистически значимую взаимосвязь с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП. Наибольший размер опухоли имел коррелировал с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, маркерами пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП. Показатель N был достоверно взаимосвязан с ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, отрицательной экспрессией bcl-2, ИГХ Her2 статусом и состоянием CEP17. Стадия заболевания была взаимосвязана с ИП Ag-ЯОР-белков, 221 Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и отрицательной экспрессией bcl-2. Гистогенетическое происхождение опухоли имело наибольшее количество достоверных взаимосвязей с молекулярно-биологическими маркерами: ИП и КВ AgЯОР-белков, маркерами пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), ПП, маркерами апоптоза (р53, bcl-2 и bax), гемангиогенезом (ПМЦРГ), ИГХ Her2 статусом и амплификацией гена Her2. Степень гистологической дифференцировки опухоли имела корреляционные взаимосвязи с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, маркерами пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП. Результаты определения корреляционных взаимосвязей между молекулярно-биологическими маркерами (квадратичная матрица) представлены в таблице 93. При анализе Ag-ЯОР-белков, маркеров пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП выявлена их взаимная прямая корреляция друг с другом умеренной степени (р<0,001). Показатели Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП являются взаимосвязанными, отражая единый процесс повышения уровня пролиферации при НМКРЛ – как с количественной стороны (пролиферативная активность - ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), так и с качественной (скорость пролиферации - Ag-ЯОР-белки). При анализе маркеров апоптоза (р53, bcl-2 и bax) отсутствовала статистически значимая корреляция друг с другом (р˃0,05). Отмечается прямая корреляция незначительной степени (р<0,05) экспрессии р53 с ИП Ag-ЯОРбелков, маркерами пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП. Отмечается обратная корреляциянезначительной степени (р<0,01) экспрессии bcl-2 с ИП Ag-ЯОР-белков и Ag-ЯОРбелков (MIB-1). Отмечается прямая корреляция незначительной степени (р<0,05) экспрессии bax с маркерами пролиферативной активности (ИМ Ki67 и ИМ ТороIIα) и ПП. Таким образом, экспрессия маркеров апоптоза (р53, bcl-2 и bax) не является взаимосвязанной при НМКРЛ, отражая разные стороны процесса запрограммированной смерти клетки. Экспрессия р53 имела прямую 222 ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 0,251 -0,11 0,202 0,01 0,05 0,02 0,212 0,08 bax 0,491 0,203 -0,242 0,05 0,02 0,06 0,173 0,06 0,1 bcl-2 ПП 0,261 0,521 0,213 -0,11 0,193 0,1 0,13 0,14 0,163 0,14 p53 Ag-ЯОР-белки (MIB-1) КВ Ag-ЯОР-белков 0,431 1 1 ИМ Ki-67 0,34 0,35 1 ИМ ТороIIα 0,32 0,261 0,681 Ag-ЯОР-белки (MIB-1) 0,711 0,391 0,271 ПП 0,431 0,361 0,741 p53 0,241 0,1 0,222 bcl-2 -0,222 -0,04 0 bax 0,05 0,13 0,232 ПМЦР-Г 0,07 0,05 0,06 ПМЦР-Л 0,03 0 0,11 ИГХ Her2 статус 0,08 0,06 0,07 3 Состояние гена Her2 0,02 0,163 0,14 Состояние CEP17 0,11 0,12 0,06 1 2 3 Примечание: р<0,001, р<0,01, р<0,05. ИМ ТороIIα ИМ Ki-67 КВ Ag-ЯОР-белков Молекулярнобиологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков Таблица 93. Корреляционные взаимосвязи (коэффициент Спирмена) между молекулярно-биологическими маркерами при НМКРЛ. -0,02 0,07 0,08 0,07 0,02 0,05 0,1 -0,01 -0,07 0 -0,03 -0,02 -0,03 0,01 0,01 0,08 0,06 0,03 0,04 0,04 0,01 0,09 0,11 0,06 0,07 0,321 0,381 0,241 223 взаимосвязь как с количеством пролиферирующих клеток (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), так и со скоростью пролиферации - ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОРбелков (MIB-1), ПП. Экспрессия bcl-2 имела обратную взаимосвязь с маркерами скорости пролиферации - ИП Ag-ЯОР-белков и Ag-ЯОР-белков (MIB1). Экспрессия bax имела прямую взаимосвязь с количеством пролиферирующих клеток (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα) и ПП. При анализе маркеров ангиогенеза (ПМЦР-Г и ПМЦР-Л) отсутствовала статистически значимая корреляция друг с другом (р˃0,05). Также отсутствовала статистически значимая корреляционная взаимосвязь маркеров ангиогенеза (ПМЦР-Г и ПМЦР-Л) с маркерами апоптоза (р53, bcl-2 и bax), AgЯОР-белками, маркерами пролиферативной активности (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, а также с ИГХ Her2 статусом и состоянием гена Her2. ИГХ Her2 статус НМКРЛ имел прямую корреляцию умеренной степени с состоянием гена Her2 (наличие или отсутствие амплификации) и состоянием СЕР17 (наличие или отсутствие увеличения), что отражало связь функционирования белка Her2 с амплификацией гена Her2 и полисомией 17 хромосомы. При НМКРЛ отмечалась прямая корреляция незначительной степени состояния гена Her2 (наличие или отсутствие амплификации) с состоянием СЕР17 (наличие или отсутствие увеличения), что отражало взаимосвязь амплификации гена Her2 с полисомией 17 хромосомы. Отмечается прямая корреляция незначительной степени (р<0,05) ИГХ Her2 статуса НМКРЛ с Ag-ЯОР-белков (MIB-1). Отмечается прямая корреляция незначительной степени (р<0,05) состояния гена Her2 (наличие или отсутствие амплификации) с ИП Ag-ЯОР-белков, маркерами пролиферативной активности (ИМ Ki67 и ИМ ТороIIα) и ПП. ИГХ Her2 статус и состояние гена Her2, СЕР17 не имели корреляционной взаимосвязи с экспрессией р53, bcl-2 и bax. Таким образом, ИГХ Her2 статус НМКРЛ был взаимосвязан с состоянием гена Her2 и полисомией 17 хромосомы. Также ИГХ Her2 статус НМКРЛ имеет прямую взаимосвязь с маркером скорости пролиферации - AgЯОР-белками (MIB-1), а амплификация гена Her2 как с увеличением количества пролиферирующих клеток (ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), так и со скоростью пролиферации - ИП Ag-ЯОР-белков. 224 10.2. Регрессионный анализ 10.2.1. Однофакторный регрессионный анализ Среди клинических критериев статистически значимое влияние на выживаемость больных НМКРЛ имел только тип операции (лобэктомия или пневмонэктомия) (таблица 94). Данный факт можно объяснить объемом операции и более запущенной стадией заболевания при пневмонэктомии по сравнению с лобэктомией. Комбинированная терапия (полихимио- и лучевая терапия) имела лишь тенденцию (р=0,07) к влиянию на выживаемость больных НМКРЛ. При анализе клинических критериев при Ак и Пк отмечались аналогичные тенденции как и в целом при НМКРЛ. Таблица 94. Однофакторный регрессионный анализ по Коксу и клинические критерии при НМКРЛ, Ак и Пк. Фактор прогноза НМКРЛ Возраст Пол Тип операции Полихимиотерапия Лучевая терапия Полихимио- и лучевая терапия Ак Возраст Пол Тип операции Полихимиотерапия Лучевая терапия Полихимио- и лучевая терапия Пк Возраст Пол Тип операции Полихимиотерапия Лучевая терапия Полихимио- и лучевая терапия χ2 β Стандартная ошибка t р 0,04 2,2 7,5 0,4 0,3 2,9 0,04 0,11 0,52 0,20 0,11 0,52 0,18 0,08 0,18 0,32 0,21 0,32 0,2 1,6 2,8 0,6 0,5 1,8 0,8 0,1 0,005 0,5 0,6 0,07 0,6 0,1 4,6 1,6 0,08 0,8 0,19 0,03 0,65 0,53 0,08 0,44 0,25 0,09 0,29 0,40 0,28 0,47 0,8 0,4 2,3 1,3 0,3 0,9 0,4 0,7 0,02 0,2 0,8 0,3 0,007 1,8 5,9 0,1 0,9 2,6 0,007 0,26 0,62 0,19 0,29 0,78 0,25 0,17 0,25 0,51 0,31 0,43 0,03 1,5 2,5 0,4 0,9 1,7 1,0 0,1 0,01 0,7 0,3 0,08 Среди клинико-морфологических параметров статистически значимое влияние на выживаемость больных НМКРЛ имели следующие факторы в порядке уменьшения значимости критерия t (таблица 95): 225 1. стадия (t=7,2) 2. показатель N (t=6,8) 3. наибольший размер опухоли (t=4,7) 4. показатель Т(t=4,4) 5. гистогенез (t=2,0) Таблица 95. Однофакторный регрессионный анализ по Коксу и клиникоморфологические параметры при НМКРЛ, Ак и Пк. Фактор прогноза НМКРЛ Показатель Т Наибольший размер Показатель N Стадия Гистогенез Дифференцировка Ак Показатель Т Наибольший размер Показатель N Стадия Дифференцировка Пк Показатель Т Наибольший размер Показатель N Стадия Дифференцировка χ2 β Стандартная ошибка t р 19,0 23,9 37,3 48,7 4,0 0,6 0,60 0,88 0,49 0,78 0,17 0,08 0,14 0,19 0,07 0,11 0,08 0,11 4,4 4,7 6,8 7,2 2,0 0,8 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,045 0,4 15,4 18,5 18,1 24,9 0,03 0,71 1,08 0,45 0,73 0,02 0,18 0,26 0,09 0,14 0,14 4,0 4,2 4,6 5,2 0,2 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,8 6,1 8,9 17,1 23,4 1,0 0,51 0,78 0,51 0,81 0,18 0,21 0,27 0,11 0,16 0,18 2,5 2,9 4,7 5,0 1,0 0,01 0,004 <0,001 <0,001 0,3 Спектр факторов, влияющих на выживаемость, был закономерным, исходя из алгоритма определения показателей и стадирования по TNM системе. Степень дифференцировки опухоли не имела статистически значимого влияния на выживаемость больных НМКРЛ. Аналогичные тенденции выживаемости отмечались при анализе Ак и Пк, как и в целом при НМКРЛ. Среди молекулярно-биологических маркеров статистически значимое влияние на выживаемость больных НМКРЛ имели следующие факторы (в порядке уменьшения значимости критерия t) (таблица 96): 1. площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (t=7,4) 2. ИП Ag-ЯОР-белков (t=4,3) 226 3. КВ Ag-ЯОР-белков (t=4,2) 4. ИМ Ki-67 (t=3,4) 5. ПП (t=3,4) 6. ИМ ТороIIα (t=3,1) 7. ПМЦР-Г(t=2,9) 8. экспрессия bcl-2 (t=2,7) 9. ИГХ Her2 статус (t=2,4) 10. экспрессия p53 (t=2,2) Таблица 96. Однофакторный регрессионный анализ по Коксу и молекулярно-биологические маркеры при НМКРЛ. Фактор прогноза ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 χ2 β 19,1 17,2 12,2 9,6 59,3 11,4 4,6 8,5 0,6 8,5 0,009 5,8 0,4 3,2 0,81 0,76 0,66 0,61 1,53 0,66 0,38 0,75 0,14 0,53 0,001 0,45 0,10 0,47 Стандартная ошибка 0,18 0,18 0,19 0,19 0,20 0,19 0,18 0,28 0,18 0,18 0,01 0,18 0,16 0,25 t р 4,3 4,2 3,4 3,1 7,4 3,4 2,2 2,7 0,8 2,9 0,09 2,4 0,7 1,9 <0,001 <0,001 <0,001 0,002 <0,001 <0,001 0,03 0,008 0,4 0,004 0,9 0,01 0,5 0,06 В первой группе прогностически важных факторов – это показатели ядрышковых организаторов, как показателя скорости клеточного цикла, наиболее важный среди них - площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (показатель скорости клеточного цикла пролиферирующих клеток). Во второй группе – маркеры пролиферативной активности (ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα и ПП). В третьей группе - ПМЦР-Г, маркеры апоптоза (bcl-2, p53) и ИГХ Her2 статус. Среди молекулярно-биологических маркеров статистически значимое влияние на выживаемость больных Ак имели следующие факторы (в порядке уменьшения значимости критерия t) (таблица 97): 227 1. площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (t=5,0) 2. ИП Ag-ЯОР-белков (t=4,4) 3. ИМ Ki-67 (t=3,4) 4. ИМ ТороIIα (t=3,3) 5. ПМЦР-Г (t=3,1) 6. КВ Ag-ЯОР-белков (t=3,0) 7. ПП (t=2,3) Таблица 97. Однофакторный регрессионный анализ по Коксу и молекулярно-биологические маркеры при Ак. Фактор прогноза ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 χ2 β 19,4 9,1 11,9 11,2 25,5 5,4 1,8 2,9 3,6 10,0 3,3 0,6 0,2 0,0001 1,17 0,79 0,89 1,0 1,43 0,64 0,34 0,72 0,51 0,81 0,03 0,21 0,07 0,003 Стандартная ошибка 0,27 0,27 0,26 0,29 0,29 0,28 0,25 0,48 0,27 0,26 0,02 0,27 0,18 0,33 t р 4,4 3,0 3,4 3,3 5,0 2,3 1,4 1,5 1,8 3,1 1,7 0,8 0,4 0,01 <0,001 0,003 <0,001 0,001 <0,001 0,02 0,2 0,1 0,06 0,002 0,09 0,4 0,7 1,0 В целом сохранялась такая же тенденция группировки прогностически важных факторов как и при НМКРЛ, за исключением маркеров апоптоза (bcl2, p53) и ИГХ Her2 статуса, в виду отсутствия статистической достоверности. Среди молекулярно-биологических маркеров статистически значимое влияние на выживаемость больных Пк имели следующие факторы (в порядке уменьшения значимости критерия t) (таблица 98): 1. площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (t=5,7) 2. ИП Ag-ЯОР-белков (t=5,7) 3. КВ Ag-ЯОР-белков (t=5,2) 4. ИМ ТороIIα (t=4,9) 228 5. состояние CEP17 (t=2,8) 6. ПП (t=2,7) 7. ПМЦР-Г (t=2,7) 8. ИМ Ki-67 (t=2,2) 9. экспрессия p53 (t=2,1) 10. экспрессия bcl-2 (t=2,1) 11. ИГХ Her2 статус (t=2,1) 12. состояние гена Her2 (t=2,1) В целом также сохранялась тенденция группировки прогностически важных факторов как и при НМКРЛ, кроме того произошло включение данных о состоянии гена Her2 и CEP17, как прогностически важных факторов. Таблица 98. Однофакторный регрессионный анализ по Коксу и молекулярно-биологические маркеры при Пк. Фактор прогноза ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 χ2 β 36,8 29,6 5,1 28,3 37,2 7,7 4,7 4,1 1,0 7,3 2,0 4,2 2,6 6,2 1,63 1,45 0,61 1,58 1,76 0,81 0,56 0,66 0,26 0,71 0,02 0,55 0,74 1,03 Стандартная ошибка 0,28 0,28 0,28 0,32 0,31 0,31 0,26 0,33 0,26 0,27 0,01 0,26 0,37 0,37 t р 5,7 5,2 2,2 4,9 5,7 2,7 2,1 2,1 1,0 2,7 1,5 2,1 2,1 2,8 <0,001 <0,001 0,03 <0,001 <0,001 0,007 0,03 0,04 0,3 0,008 0,1 0,04 0,04 0,005 10.2.2. Многофакторный регрессионный анализ. Многофакторный регрессионный анализ был проведен на четырех моделях. Первая модель включала клинические критерии, вторая модель – клинико-морфологические параметры, третья модель - молекулярно- биологические маркеры, четвертая модель - клинические критерии, клиникоморфологические параметры, молекулярно-биологические маркеры. 229 Первая модель. Среди клинических критериев НМКРЛ статистически значимое влияние на выживаемость больных имел только тип операции, что прослеживалось также при Ак и Пк (таблица 99). Таблица 99. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу и клинические критерии при НМКРЛ, Ак и Пк. Фактор прогноза НМКРЛ (χ2=16,0; р=0,01) Возраст Пол Тип операции Полихимиотерапия Лучевая терапия Полихимио- и лучевая терапия Ак (χ2=9,3; р=0,2) Возраст Пол Тип операции Полихимиотерапия Лучевая терапия Полихимио- и лучевая терапия Пк (χ2=13,0; р=0,04) Возраст Пол Тип операции Полихимиотерапия Лучевая терапия Полихимио- и лучевая терапия β Стандартная ошибка t р 0,18 0,13 0,64 0,32 0,07 0,57 0,19 0,08 0,20 0,32 0,22 0,33 1,0 1,7 3,2 1,0 0,3 1,8 0,3 0,09 0,001 0,3 0,8 0,07 0,05 0,05 0,79 0,78 0,30 0,61 0,26 0,09 0,30 0,42 0,30 0,49 0,2 0,5 2,6 1,9 1,0 1,2 0,9 0,6 0,01 0,06 0,3 0,2 0,37 0,19 0,81 0,13 0,40 0,66 0,29 0,18 0,29 0,53 0,33 0,45 1,3 1,0 2,8 0,3 1,2 1,5 0,2 0,3 0,01 0,8 0,2 0,1 Вторая модель. Среди клинико-морфологических параметров статистически значимое независимое влияние на выживаемость больных НМКРЛ имели показатель N и наибольший размер опухоли (таблица 100). Показатель Т, стадия заболевания, гистогенез и дифференцировка не имели статистически значимого независимого влияния на выживаемость больных НМКРЛ, являясь, таким образом, зависимыми от показателя N и наибольшего размера опухоли. При анализе данной модели при Ак статистически значимым независимым фактором был только наибольший размер опухоли, а при Пк - показатель N (t=4,2) и, в меньшей степени, наибольший размер опухоли (t=2,1), отражая, таким образом, гистогенетические особенности НМКРЛ. 230 Таблица 100. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу и клиникоморфологические параметры при НМКРЛ, Ак и Пк. Фактор прогноза НМКРЛ (χ2=84,1; р<0,001) Показатель Т Наибольший размер Показатель N Стадия Гистогенез Дифференцировка Ак (χ2=38,5; р<0,001) Показатель Т Наибольший размер Показатель N Стадия Дифференцировка Пк (χ2=46,3; р<0,001) Показатель Т Наибольший размер Показатель N Стадия Дифференцировка β Стандартная ошибка t р 0,08 0,85 1,45 0,09 0,16 0,03 0,20 0,24 0,33 0,22 0,09 0,10 0,4 3,5 4,4 0,4 1,8 0,3 0,7 <0,001 <0,001 0,7 0,08 0,8 0,07 0,98 0,89 0,18 0,08 0,29 0,34 0,54 0,34 0,14 0,2 2,9 1,7 0,5 0,6 0,8 0,004 0,1 0,6 0,5 0,25 0,77 1,89 0,26 0,16 0,30 0,36 0,44 0,31 0,16 0,8 2,1 4,2 0,8 1,0 0,4 0,03 <0,001 0,4 0,3 Третья модель. Среди совокупности исследованных молекулярнобиологических маркеров статистически значимое влияние на выживаемость больных НМКРЛ имели следующие факторы (в порядке уменьшения значимости критерия t) (таблица 101): 1. площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (t=5,8) 2. ИМ Ki-67 (t=2,8) 3. КВ Ag-ЯОР-белков (t=2,1) 4. ПМЦР-Г (t=2,0) При НМКРЛ среди молекулярно-биологических маркеров наибольшая прогностическая значимость (разница показателя β более, чем в два раза) была у фактора - площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, как показателя скорости клеточного цикла пролиферирующих клеток. ИМ Ki-67, КВ Ag-ЯОР-белков, ПМЦР-Г также имели независимое влияние на выживаемость больных НМКРЛ, но в меньшей степени по сравнению с площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках. 231 Таблица 101. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу (χ2=94,6; р<0,001) и молекулярно-биологические маркеры при НМКР. Фактор прогноза ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 β 0,25 0,42 0,76 0,44 1,55 0,50 0,10 0,46 0,02 0,39 0,25 0,23 0,13 0,20 Стандартная ошибка 0,24 0,20 0,27 0,24 0,27 0,29 0,19 0,29 0,19 0,19 0,19 0,22 0,17 0,29 t р 1,0 2,1 2,8 1,8 5,8 1,7 0,5 1,6 0,1 2,0 1,3 1,0 0,7 0,7 0,3 0,03 0,005 0,07 <0,001 0,09 0,6 0,1 0,9 0,04 0,2 0,3 0,5 0,5 Среди молекулярно-биологических маркеров статистически значимое влияние на выживаемость больных Ак имели следующие факторы (в порядке уменьшения значимости критерия t) (таблица 102): 1. площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (t=3,2) 2. ИМ ТороIIα (t=2,1) Таблица 102. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу (χ2=50,0; р<0,001) и молекулярно-биологические маркеры при Ак. Фактор прогноза ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 β 0,19 0,09 0,94 0,96 1,70 0,87 0,21 0,82 0,13 0,49 0,04 0,16 0,11 0,04 Стандартная ошибка 0,56 0,40 0,59 0,46 0,54 0,54 0,30 0,52 0,30 0,29 0,30 0,31 0,21 0,40 t р 0,3 0,2 1,6 2,1 3,2 1,6 0,7 1,6 0,4 1,7 0,1 0,5 0,5 0,1 0,7 0,8 0,1 0,04 0,002 0,1 0,5 0,1 0,7 0,09 0,9 0,6 0,6 0,9 232 Сохранялась тенденция наибольшей прогностической значимости фактора площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, однако, вместо факторов ИМ Ki-67 и КВ Ag-ЯОР-белков значимость приобретает ИМ ТороIIα, а фактор ПМЦР-Г теряет свою значимость. Среди молекулярно-биологических маркеров статистически значимое влияние на выживаемость больных Пк имели следующие факторы (в порядке уменьшения значимости критерия t) (таблица 103): 1. ИМ ТороIIα (t=3,9) 2. площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (t=3,3) 3. ПМЦР-Г (t=3,2) 4. КВ Ag-ЯОР-белков (t=2,3) 5. ПМЦР-Л (t=2,3) В целом сохранялась тенденция совокупности прогностически важных факторов как при НМКРЛ, однако, вместо фактора ИМ Ki-67 значимость приобретают факторы ИМ ТороIIα (как при Ак) и ПМЦР-Л. Таблица 103. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу (χ2=94,8; р<0,001) и молекулярно-биологические маркеры при Пк. Фактор прогноза ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 β 0,52 0,78 0,38 1,55 1,35 0,53 0,13 0,17 0,38 0,94 0,72 0,11 0,61 0,53 Стандартная ошибка 0,41 0,34 0,41 0,40 0,41 0,46 0,28 0,39 0,28 0,30 0,31 0,37 0,41 0,49 t 1,3 2,3 0,9 3,9 3,3 1,2 0,5 0,4 1,3 3,2 2,3 0,3 1,5 1,1 р 0,2 0,02 0,4 <0,001 0,001 0,3 0,7 0,7 0,2 0,002 0,02 0,8 0,1 0,3 Четвертая модель. Среди совокупности исследованных клинических критериев, клинико-морфологических параметров, молекулярно-биологических маркеров статистически значимое влияние на выживаемость больных НМКРЛ имели следующие факторы (в порядке уменьшения значимости критерия t) (таблица 104): 233 1. площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках(t=3,6) 2. ПМЦР-Г (t=2,8) 3. КВ Ag-ЯОР-белков (t=2,7) 4. ИМ Ki-67 (t=2,6) 5. показатель N (t=2,3) 6. наибольший размер опухоли (t=2,0) Таблица 104. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу (χ2=141,2; р<0,001) и клинические критерии, клинико-морфологические параметры, молекулярно-биологические маркеры при НМКРЛ. Фактор прогноза Клинические критерии Возраст Пол Тип операции Полихимиотерапия Лучевая терапия Полихимио- и лучевая терапия Клинико-морфологические параметры Показатель Т Наибольший размер Показатель N Стадия Гистогенез Дифференцировка Молекулярно-биологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 β Стандартная ошибка t р 0,05 0,16 0,19 0,33 0,08 0,24 0,20 0,09 0,22 0,31 0,22 0,38 0,3 1,8 0,9 1,1 0,4 0,6 0,8 0,08 0,4 0,3 0,7 0,5 0,04 0,52 0,86 0,14 0,09 0,02 0,22 0,26 0,38 0,25 0,11 0,12 0,2 2,0 2,3 0,6 0,9 0,1 0,9 0,04 0,02 0,6 0,4 0,9 0,14 0,57 0,71 0,21 1,01 0,37 0,14 0,19 0,04 0,56 0,23 0,00 0,16 0,16 0,25 0,21 0,28 0,26 0,28 0,31 0,20 0,30 0,21 0,20 0,20 0,23 0,19 0,30 0,6 2,7 2,6 0,8 3,6 1,2 0,7 0,6 0,2 2,8 1,1 0,0 0,9 0,5 0,6 0,007 0,009 0,4 <0,001 0,2 0,5 0,5 0,8 0,006 0,3 0,9 0,4 0,6 При НМКРЛ среди независимых факторов прогноза сохранилась такая же тенденция как при анализе молекулярно-биологических маркеров (третья 234 модель). Независимыми факторами прогноза явились также клиникоморфологические параметры - показатель N и наибольший размер опухоли. Таблица 105. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу (χ2=80,7; р<0,001) и клинические критерии, клинико-морфологические параметры, молекулярно-биологические маркеры при Ак. Фактор прогноза Клинические критерии Возраст Пол Тип операции Полихимиотерапия Лучевая терапия Полихимио- и лучевая терапия Клинико-морфологические параметры Показатель Т Наибольший размер Показатель N Стадия Дифференцировка Молекулярно-биологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 β Стандартная ошибка t р 0,22 0,17 0,46 0,43 0,35 0,16 0,29 0,12 0,37 0,40 0,35 0,58 0,8 1,5 1,2 1,1 1,0 0,3 0,4 0,1 0,2 0,2 0,3 0,8 0,30 0,74 0,31 0,48 0,22 0,37 0,39 0,62 0,41 0,20 0,8 1,9 0,5 1,2 1,1 0,4 0,06 0,6 0,2 0,3 0,26 0,33 1,55 1,09 1,29 1,68 0,32 1,01 0,07 0,71 0,17 0,55 0,22 0,23 0,65 0,47 0,69 0,50 0,65 0,68 0,33 0,57 0,35 0,31 0,34 0,38 0,23 0,44 0,4 0,7 2,2 2,2 2,0 2,5 1,0 1,8 0,2 2,3 0,5 1,4 0,9 0,5 0,7 0,5 0,02 0,03 0,046 0,01 0,3 0,08 0,8 0,02 0,6 0,2 0,4 0,6 При Ак статистически значимое влияние на выживаемость больных имели следующие факторы (в порядке уменьшения значимости критерия t) (таблица 105): 1. ПП (t=2,5) 2. ПМЦР-Г (t=2,3) 3. ИМ Ki-67 (t=2,2) 4. ИМ ТороIIα (t=2,2) 235 5. площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (t=2,0) При Ак среди независимых факторов прогноза были исключительно молекулярно-биологические маркеры. Таблица 106. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу (χ2=118,6; р<0,001) и клинические критерии, клинико-морфологические параметры, молекулярно-биологические маркеры при Пк. Фактор прогноза Клинические критерии Возраст Пол Тип операции Полихимиотерапия Лучевая терапия Полихимио- и лучевая терапия Клинико-морфологические параметры Показатель Т Наибольший размер Показатель N Стадия Дифференцировка Молекулярно-биологические маркеры ИП Ag-ЯОР-белков КВ Ag-ЯОР-белков ИМ Ki-67 ИМ ТороIIα Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПП p53 bcl-2 bax ПМЦР-Г ПМЦР-Л ИГХ Her2 статус Состояние гена Her2 Состояние CEP17 β Стандартная ошибка t р 0,39 0,33 0,80 0,74 0,45 0,58 0,31 0,25 0,32 0,70 0,42 0,56 1,2 1,3 2,5 1,1 1,1 1,0 0,2 0,2 0,01 0,2 0,3 0,3 0,49 0,71 0,08 0,75 0,16 0,42 0,47 0,59 0,46 0,22 1,2 1,5 0,1 1,6 0,7 0,2 0,1 0,9 0,1 0,5 0,68 0,87 0,63 1,31 1,15 0,61 0,02 0,40 0,33 1,60 0,85 0,22 0,75 0,32 0,43 0,36 0,46 0,50 0,45 0,54 0,32 0,40 0,32 0,40 0,33 0,47 0,45 0,57 1,6 2,4 1,4 2,6 2,6 1,1 0,1 1,0 1,1 4,0 2,6 0,5 1,6 0,6 0,1 0,01 0,2 0,008 0,009 0,3 0,9 0,3 0,3 <0,001 0,009 0,6 0,1 0,6 При Пк статистически значимое влияние на выживаемость больных имели следующие факторы (в порядке уменьшения значимости критерия t) (таблица 106): 1. ПМЦР-Г (t=4,0) 2. ИМ ТороIIα (t=2,6) 3. площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (t=2,6) 236 4. ПМЦР-Л (t=2,6) 5. тип операции (t=2,5) 6. КВ Ag-ЯОР-белков (t=2,4) При Пк среди независимых факторов прогноза сохранилась такая же тенденция как при анализе молекулярно-биологических маркеров (третья модель). Независимым фактором прогноза явился также клинический критерий – тип операции. Таким образом, на основании регрессионного анализа множества данных относящихся к клиническим критериям, клинико-морфологическим параметрам, молекулярно-биологическим маркерам получены совокупности независимых факторов прогноза при НМКРЛ, Ак и Пк. 10.3. Модели прогноза Были определены три модели прогноза для НМКРЛ, Ак и Пк, с использованием метода многофакторного регрессионного анализа по Коксу. На данном этапе было проведено пошаговое включение в многофакторный регрессионный анализ независимых факторов прогноза, из всего множества данных, относящихся к клиническим критериям, клинико-морфологическим параметрам, молекулярно-биологическим маркерам, полученных на предыдущем этапе (см. раздел 10.2.2) - начиная от наиболее значимых и заканчивая менее значимыми (по значению β и значимости t). Таблица 107. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу при НМКРЛ (χ2=122,7; р<0,001). Фактор прогноза Показатель N Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПМЦР-Г Наибольший размер ИМ Ki-67 КВ Ag-ЯОР-белков β 1,19 0,91 0,56 0,57 0,45 0,43 Стандартная ошибка t р 0,19 0,23 0,18 0,20 0,20 0,19 6,2 4,0 3,0 2,9 2,3 2,3 <0,001 <0,001 0,002 0,004 0,02 0,02 237 На основании результатов многофакторного регрессионного анализа (таблица 107) была получена формула, включающая факторы, которые имели прогностическое значение при НМКРЛ: YНМКРЛ = 1,19*X1 + 0,91*X2 + 0,57*X3 + 0,56*X4 + 0,45*X5 + 0,43*X6, где YНМКРЛ – морфобиомолекулярный показатель при НМКРЛ, Х - значение фактора (в баллах): X1 – показатель N (0 баллов – показатель N0 и 2 балла – показатель N1-3), X2 – Ag-ЯОР-белки (MIB-1) (0 баллов – ˂10,47 мкм² и 2 балла – ≥10,47 мкм²), X3 – наибольший размер (0 баллов – ˂3см и 1 балл – ≥3см), X4 – ПМЦР-Г (0 баллов – ˂43 и 1 балл – ≥43), X5 – ИМ Ki-67 (0 баллов – ˂25% и 1 балл – ≥25%), X6 – КВ Ag-ЯОР-белков (0 баллов – ˂30,5% и 1 балл – ≥30,5%). Так как значение β для факторов показатель N и Ag-ЯОРбелки (MIB-1) было примерно в два раза больше по сравнению с факторами ПМЦР-Г, наибольший размер, ИМ Ki-67 и КВ Ag-ЯОР-белков, то для уравнивания результатов факторы показатель N и Ag-ЯОР-белки (MIB-1) принимали значения 0 баллов и 2 балла, а факторы ПМЦР-Г, наибольший размер, ИМ Ki-67 и КВ Ag-ЯОР-белков - 0 баллов и 1 балл. При НМКРЛ YНМКРЛ составил 2,83 (1,01-4,65); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,93, р˂0,001). Минимальное значение выборки составило 0, максимальное – 6,88. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,25) и значительной пологостью вершины (эксцесс -1,21) (рисунок 61). Рисунок 61. Гистограмма распределения YНМКРЛ. 238 Значения медианы, нижнего и верхнего квартилей YНМКРЛ были определены как пороговые значения - соответственно 2,83, 1,01 и 4,65. Выделены четыре прогностические группы, соответственно пороговым значениям YНМКРЛ: 1 группа - с благоприятным прогнозом, YНМКРЛ ˂ 1,01; 2 группа - с относительно благоприятным прогнозом, YНМКРЛ ≥ 1,01 и ˂ 2,83; 3 группа - с относительно неблагоприятным прогнозом, YНМКРЛ ≥ 2,83 и ˂ 4,65; 4 группа с неблагоприятным прогнозом, YНМКРЛ ≥ 4,65. Показатель 5-летней выживаемости больных НМКРЛ составил: 70,6±8,6% - с благоприятным прогнозом, 50,3±8,4% - с относительно благоприятным прогнозом, 29,8±7,3% - с относительно неблагоприятным прогнозом, 0% - с неблагоприятным прогнозом (после операции больные умерли в течение 1000 дней). Между группами отличия показателей выживаемости были статистически значимыми (рисунок 62). При однофакторном регрессионном анализе показатель YНМКРЛ имел влияние на выживаемость больных НМКРЛ (χ2=80,1, β=0,46, стандартная ошибка 0,05, р<0,001), превосходя по значимости клинические, клинико- морфологические и молекулярно-биологические факторы. Рисунок 62. График выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ в зависимости от значения YНМКРЛ. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. 239 Таблица 108. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу при Ак (χ2=63,9; р<0,001). Фактор прогноза Показатель N ИМ Ki-67 Наибольший размер Ag-ЯОР-белки (MIB-1) ПМЦР-Г ПП β 0,96 0,89 0,85 0,73 0,73 0,70 Стандартная ошибка 0,27 0,27 0,28 0,28 0,28 0,28 t 3,5 3,3 3,0 2,6 2,6 2,5 р <0,001 <0,001 0,002 0,008 0,009 0,01 На основании результатов многофакторного регрессионного анализа (таблица 108) была получена формула, включающая факторы, которые имели прогностическое значение при Ак: YАк = 0,96*X1 + 0,89*X2 + 0,85*X3 + 0,73*X4 + 0,73*X5 + 0,70*X6, где YАк – морфобиомолекулярный показатель при Ак, Х - значение фактора (в баллах): X1 – показатель N (0 баллов – показатель N0 и 1 балл – показатель N1-3), X2 – ИМ Ki-67 (0 баллов – ˂20% и 1 балл – ≥20%), X3 – наибольший размер (0 баллов – ˂3см и 1 балл – ≥3см), X4 – Ag-ЯОР-белки (MIB-1) (0 баллов – ˂10,56 мкм² и 1 балл – ≥10,56 мкм²), X5 – ПМЦР-Г (0 баллов – ˂47 и 1 балл – ≥47), X6 – ПП (0 баллов – ˂218,4 и 1 балл – ≥218,4). Рисунок 63. Гистограмма распределения YАк. 240 При Ак YАк составил 2,32 (1,58-3,90); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,95, р=0,001). Минимальное значение выборки составило 0, максимальное – 4,86. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,04) и значительной пологостью вершины (эксцесс -0,99) (рисунок 63). Рисунок 64. График выживаемости по Каплану-Мейеру больных Ак в зависимости от значения YАк. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Значения медианы, нижнего и верхнего квартилей YАк были определены как пороговые значения - соответственно 2,32, 1,58 и 3,90. Выделены четыре прогностические группы, соответственно пороговым значениям YАк: 1 группа - с благоприятным прогнозом, YАк ˂ 1,58; 2 группа - с относительно благоприятным прогнозом, YАк ≥ 1,58 и ˂ 2,32; 3 группа - с относительно неблагоприятным прогнозом, YАк ≥ 2,32 и ˂ 3,90; 4 группа - с неблагоприятным прогнозом, YАк ≥ 3,90. Показатель 5-летней выживаемости больных Ак составил: 61,6±18,1% - с благоприятным прогнозом, 37,5±12,5% - с относительно благоприятным прогнозом, 13,5±8,3% - с относительно неблагоприятным прогнозом, 0% - с неблагоприятным прогнозом (после операции боль- 241 ные умерли в течение 1000 дней). Между группами отличия показателей выживаемости были статистически значимыми (рисунок 64). При однофакторном регрессионном анализе показатель YАк имел влияние на выживаемость больных Ак (χ2=36,2, β=0,65, стандартная ошибка 0,11, р<0,001), превосходя по значимости клинические, клинико-морфологические и молекулярнобиологические факторы. Таблица 109. Многофакторный регрессионный анализ по Коксу при Пк (χ2=98,1; р<0,001). Фактор прогноза ИМ ТороIIα Ag-ЯОР-белки (MIB-1) Показатель N ПМЦР-Г КВ Ag-ЯОР-белков ПМЦР-Л β 1,29 1,20 1,05 1,02 0,94 0,80 Стандартная ошибка 0,34 0,33 0,28 0,28 0,30 0,29 t р 3,8 3,7 3,8 3,7 3,1 2,7 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,002 0,006 На основании результатов многофакторного регрессионного анализа (таблица 109) была получена формула, включающая факторы, которые имели прогностическое значение при Пк: YПк = 1,29*X1 + 1,20*X2 + 1,05*X3 + 1,02*X4 + 0,94*X5 + 0,80*X6, где YПк – морфобиомолекулярный показатель при Пк, Х - значение фактора (в баллах): X1 – ИМ ТороIIα (0 баллов – ˂22% и 1 балл – ≥22%), X2 – Ag-ЯОР-белки (MIB-1) (0 баллов – ˂10,67 мкм² и 1 балл – ≥10,67 мкм²), X3 – показатель N (0 баллов – показатель N0 и 1 балл – показатель N1-3), X4 – ПМЦР-Г (0 баллов – ˂40 и 1 балл – ≥40), X6 – КВ Ag-ЯОР-белков (0 баллов – ˂31,2% и 1 балл – ≥31,2%), X6 – ПМЦР-Л (0 баллов – ˂4 и 1 балл – ≥4). При Пк YПк составил 3,25 (2,09-4,34); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,97, р=0,01). Минимальное значение выборки составило 0, максимальное – 6,3. Гистограмма распределения характеризовалась умеренным сдвигом влево (ассиметрия -0,27) и значительной пологостью вершины (эксцесс -0,57) (рисунок 63). Значения медианы, нижнего и верхнего квартилей YПк были определены как пороговые значения - соответственно 3,25, 2,09 и 4,34. Выделены четыре прогностические группы, соответственно пороговым значениям YПк: 1 242 группа - с благоприятным прогнозом, YПк ˂ 2,09; 2 группа - с относительно благоприятным прогнозом, YПк ≥ 2,09 и ˂ 3,25; 3 группа - с относительно неблагоприятным прогнозом, YПк ≥ 3,25 и ˂ 4,34; 4 группа - с неблагоприятным прогнозом, YПк ≥ 4,34. Рисунок 65. Гистограмма распределения YПк. Рисунок 66. График выживаемости по Каплану-Мейеру больных Пк в зависимости от значения YПк. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. 243 Показатель 5-летней выживаемости больных Пк составил: 84,0±10,3% с благоприятным прогнозом, 53,0±11,5% - с относительно благоприятным прогнозом, 30,2±12,8% - с относительно неблагоприятным прогнозом, 0% - с неблагоприятным прогнозом (после операции больные умерли в течение 1000 дней). Между группами отличия показателей выживаемости были статистически значимыми (рисунок 66). При однофакторном регрессионном анализе показатель YПк имел влияние на выживаемость больных Пк (χ2=57,1, β=0,76, стандартная ошибка 0,01, р<0,001), превосходя по значимости клинические, клинико-морфологические и молекулярно-биологические факторы. Суммируя данные результатов многофакторного анализа следует отметить следующие основные моменты. Неблагоприятными факторами 5-летней выживаемости при НМКРЛ, Пк и Ак по данным однофакторного регрессионного анализа являются клинические критерии (типа операции), клиникоморфологические параметры (показателя Т, наибольшего размера, показателя N, стадии заболевания, гистогенеза) и молекулярно-биологические маркеры (ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателя пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, экспрессии р53, bcl-2, ПМЦР-Г, ИГХ Her2 статуса, амплификации гена Her2). Неблагоприятными факторами 5-летней выживаемости по данным многофакторного регрессионного анализа являются: при НМКРЛ - площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, ПМЦР-Г, КВ Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67, показатель N1-3, наибольший размер опухоли; при Ак - показатель пролиферации, ПМЦР-Г, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках; при Пк - ПМЦР-Г, ИМ ТороIIα, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, ПМЦР-Л), тип операции, КВ Ag-ЯОР-белков. Для индивидуального прогнозирования 5-летней выживаемости больных НМКРЛ, Пк и Ак были определены три модели прогноза, на основании данных предшествующего многофакторного регрессионного анализа. При однофакторном регрессионном анализе морфобиомолекулярные показатели НМКРЛ, Пк и Ак имели наибольшее влияние на выживаемость больных по сравнению с другими факторами прогноза (χ2=36,2-80,1; р<0,001). 244 ЗАКЛЮЧЕНИЕ На сегодняшний день рак легкого является серьезной медицинской и социальной проблемой и несмотря на определенные успехи в диагностике и лечении результаты, в целом, остаются малоутешительными. Международная классификация по системе TNM не лишена недостатков в плане прогнозирования течения заболевания у больным НМКРЛ, так как в один и тот же показатель включаются больные неоднородные по другим факторам, имеющим прогностическое значение. В связи с чем, после хирургического лечения больных НМКРЛ, однородных по системе TNM, наблюдается выздоровление у одних, а у других наступает прогрессирование и рецидивирование. Таким образом, актуальным является исследование молекулярно-биологических маркеров во взаимосвязи клинико-морфологическими параметрами, выживаемостью и другими факторами прогноза при НМКРЛ и гистогенетических вариантах – Ак и Пк. В связи с этим в работе были исследованы «традиционные» клинические и клинико-морфологические параметры, а также молекулярнобиологические маркеры: Ag-ЯОР-белки, маркеры пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα), маркеры апоптоза (p53, bcl-2 и bax), маркеры ангиогенеза (CD34, подопланин), статус белка и гена Her2. Ag-ЯОР-белки. В ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол ИП Ag-ЯОР-белков составил 1,31±0,20, КВ Ag-ЯОР-белков 28,3±3,1%. В эпителии бронхов ИП Ag-ЯОР-белков составил 1,85±0,24, КВ Ag-ЯОР-белков 29,3±3,3%. В НМКРЛ ИП Ag-ЯОР-белков составил 6,52±1,66, КВ Ag-ЯОРбелков - 30,5±4,6%. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое увеличение ИП и КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р<0,001). По литературным данным в неизмененном эпителии бронха и альвеолы количественные показатели Ag-ЯОР-белков минимальны и достигают максимальных значений при раке легкого [Болгова Л.С., Туганова Т.Н., Алексеенко О.И., 2012; Болгова Л.С., Туганова Т.Н., Ярощук Т.М., 2011; Gulati A. et al., 2002; Zaczek M. et al., 1995; FisselerEckhoff A. et al., 1994; Nonomura A. et al., 1993; Abe S. et al., 1992; Boldy DA. et al., 1991]. Дифференциально-диагностическая значимость отличия в Ag- 245 ЯОР-белков между неизмененной тканью и злокачественным новообразованием показаны нами при опухолях желудка [Бобров И.П., 2005; Климачев В.В., 2003], толстой кишки [Лазарев А.Ф. и соавт., 2010; Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Кобяков Д.С., 2006; Кобяков Д.С., 2006] и гладкомышечных опухолях матки [Авдалян А.М., 2013; Авдалян А.М. и соавт., 2009, 2010; Лазарев А.Ф. и соавт., 2008; Бобpов И.П. и соавт., 2008]. Увеличение площади AgЯОР-белков в клетках опухоли по сравнению с неизмененной тканью имеет практическое дифференциально-диагностическое значение и подтверждает факт участия ядрышкового аппарата клетки в процессе канцерогенеза. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с ИП и КВ AgЯОР-белков. Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОРбелков в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским - 6,71±1,63 и 5,69±1,65 соответственно (р=0,002). Также найдено статистически значимое увеличение КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским - 31,03±4,59% и 28,25±3,86% соответственно (р˂0,001). Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. К сожалению, в мировой литературе нет данных о взаимосвязи возрастно-половых характеристик больных НМКРЛ, Ак и Пк с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков. ИП Ag-ЯОР-белков имел умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,34, р<0,001) и размером первичной опухоли (r=0,45, р<0,001). С увеличением размера опухолевого узла наблюдалось увеличение количественных показателей Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли, что указывало на повышение уровня пролиферации в процессе роста опухоли. ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше в группе Т2-3 по сравнению с Т1 - соответственно 6,81±1,68 и 5,89±1,49 (р<0,001). Также при размере первичной опухоли более 3 см ИП Ag-ЯОР-белков был больше, чем в опухоли менее 3 см – соответственно 7,05±1,58 и 5,84±1,54 (р<0,001). С увеличением размера опухолевого узла наблюдалось увеличение гетерогенности ядрышковых организаторов в клетках опухоли, что указывало на неоднородность пролиферативной активности в больших по размеру опухолях. КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше в группе Т2-3 по сравнению с Т1- соответственно 246 31,1±4,6% и 29,5±4,5% (р<0,01). Также при размере первичной опухоли более 3 см КВ Ag-ЯОР-белков был больше, чем в опухоли менее 3 см - соответственно 31,5±4,8% и 29,3±4,0% (р<0,001). КВ Ag-ЯОР-белков имел умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,29, р=0,006) и размером первичной опухоли (r=0,34, р<0,001). Метастатический потенциал НМКРЛ был взаимосвязан с высокими количественными показателями ядрышковых организаторов опухолевых клеток. Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов – соответственно 7,06±1,70 и 6,27±1,59 (р<0,001). Показатель N при НМКРЛ имел умеренную корреляцию с ИП AgЯОР-белков (r=0,34, р<0,001). На ранних этапах опухолевого роста количественные показатели AgЯОР-белков минимальны по сравнению с последующими стадиями процесса. ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше при II и III стадии по сравнению с I стадией – соответственно 6,99±1,64 и 6,23±1,62 (р<0,001). Стадия процесса при НМКРЛ имела умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р<0,001). Не найдено статистически значимого увеличения КВ AgЯОР-белков в НМКРЛ с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов, а также во взаимосвязи с стадией заболевания. Таким образом, метастатический потенциал и стадия НМКРЛ не связаны с гетерогенностью ядрышковых организаторов опухолевых клеток. Гистогенез НМКРЛ имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р<0,001). Таким образом, имелась зависимость количественных показателей Ag-ЯОР-белков от тканевого происхождения опухоли. ИП AgЯОР-белков достоверно больше при Пк по сравнению с Ак - – соответственно 6,99±1,64 и 6,23±1,62 (р<0,001). Также имелась зависимость гетерогенности Ag-ЯОР-белков от тканевого происхождения опухоли. КВ Ag-ЯОРбелков в НМКРЛ достоверно больше в Пк по сравнению с Ак - соответственно 31,2±4,4% и 29,8±4,7% (р=0,02). Гистогенез НМКРЛ имел умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,29, р=0,01). Количественные показатели ядрышковых организаторов возрастали в 247 зависимости от степени дедифференцировки НМКРЛ. В клетках НМКРЛ ИП Ag-ЯОР-белков больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой – соответственно 6,76±1,66 и 5,90±1,54 (р<0,001). Степень дифференцировки НМКРЛ имела умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,33, р<0,001). В клетках НМКРЛ КВ Ag-ЯОР-белков больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой - соответственно 31,0±4,8% и 29,4±3,7% (р=0,02). Степень дифференцировки НМКРЛ имела умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,27, р=0,02). Гетерогенность ядрышковых организаторов возрастала в зависимости от степени дедифференцировки НМКРЛ. В гистогенетических типах (Ак и Пк) и при НМКРЛ прослеживалась аналогичная динамика количественного содержания ИП и КВ Ag-ЯОРбелков в зависимости от клинико-морфологических параметров. Результаты нашего исследования подтверждаются данными мировой литературы. В большинстве исследований найдена взаимосвязь между количественным содержанием Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ: показателем Т и N [Kaneko S. et al., 1991], показателем М [Matheus R.S. et al., 2004], стадией заболевания [Minamoto H. et al., 2003; Antonangelo L. et al., 1997; Bernardi F.D. et al., 1997; Rodrigues O. R. et al., 1997; Oyama T. et al., 1993; Kaneko S. et al., 1991], гистогенезом [Oyama T. et al., 1993; Nonomura A. et al., 1993; Kaneko S. et al., 1991] и дифференцировкой [Cemerikić-Martinović V. et al., 1998; Rodrigues O. R. et al., 1997; Antonangelo L. et al., 1997; Bernardi F.D. et al., 1997; Lee YC. et al., 1997]. Однако, некоторые авторы не находят взаимосвязи между Ag-ЯОР-белками и клиникоморфологическими параметрами НМКРЛ [Mourad W.A. et al., 1997; Abe S. et al., 1992]. ИП Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ имел корреляцию с КВ Ag-ЯОРбелков (r=0,43, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,71, р<0,001), ПП (r=0,43, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,34, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,32, р<0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,24, р<0,01), bcl-2 отрицательной экспрессией (r=-0,22, р<0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,14, р<0,05). КВ Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ был взаимосвязан с большинством молекуляр- 248 но-биологических маркеров: Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,39, р<0,001), ПП (r=0,36, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,35, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,26, р<0,001). Корреляционные взаимосвязи ИП и КВ Ag-ЯОР-белков с молекулярнобиологическими маркерами также были тождественны и при гистогенетических типах НМКРЛ - Ак и Пк. К сожалению, в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют данных о взаимосвязи ИП и КВ Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ, Ак и Пк с маркерами пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα), апоптоза (p53, bcl-2) и статусом гена Her2. При однофакторном регрессионном анализе при НМКРЛ, Ак и Пк имели влияние на выживаемость больных ИП Ag-ЯОР-белков (χ2=19,4-36,8; р<0,001) и КВ Ag-ЯОР-белков (χ2=9,1-29,6; р<0,001). 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от ИП Ag-ЯОР-белков: 49,8±5,2% - при небольшом ИП˂6,52 и 28,6±4,7% - при большом ИП ≥6,52. Также 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от КВ Ag-ЯОР-белков: 50,2±4,9% - при небольшом КВ ˂30,5% и 25,8±4,9% при большом КВ ≥30,5%. Отмечена аналогичная динамика показателя 5летней выживаемости при гистогенетических типах НМКРЛ - Ак и Пк. Выявлена зависимость показателя 5-летней выживаемости при НМКРЛ от взаимной коэкспрессии молекулярно-биологических маркеров - ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, с одной стороны, и ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, с другой стороны, а также между ИП и КВ Ag-ЯОР-белков. Так, наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -ИП Ag-ЯОР-белков/-КВ AgЯОР-белков, тип -ИП Ag-ЯОР-белков/+КВ Ag-ЯОР-белков, тип +ИП AgЯОР-белков/-КВ Ag-ЯОР-белков, тип +ИП Ag-ЯОР-белков/+КВ Ag-ЯОРбелков - показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 53,2±6,0%, 38,5±10,0%, 38,7±9,1% и 20,7±5,2%. При исследовании ИП AgЯОР-белков и ИМ Ki-67 наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -ИП Ag-ЯОР-белков/-ИМ Ki-67, тип -ИП Ag-ЯОРбелков/+ИМ Ki-67, тип +ИП Ag-ЯОР-белков/-ИМ Ki-67, тип +ИП Ag-ЯОРбелков/+ИМ Ki-67 - показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 56,8±7,4%, 43,9±8,1%, 33,8±8,7% и 23,8±5,6%. При исследовании ИП Ag-ЯОР-белков и ИМ ТороIIα наблюдалось последовательное уменьшение 249 выживаемости в ряду: тип -ИП Ag-ЯОР-белков/-ИМ ТороIIα, тип -ИП AgЯОР-белков/+ИМ ТороIIα, тип +ИП Ag-ЯОР-белков/-ИМ ТороIIα, тип +ИП Ag-ЯОР-белков/+ИМ ТороIIα - показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 56,7±7,2%, 47,5±9,3%, 37,5±9,1% и 21,0±5,9%. При исследовании КВ Ag-ЯОР-белков и ИМ Ki-67 наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -КВ Ag-ЯОР-белков/-ИМ Ki-67, тип КВ Ag-ЯОР-белков/+ИМ Ki-67, тип +КВ Ag-ЯОР-белков/-ИМ Ki-67, тип +КВ Ag-ЯОР-белков/+ИМ Ki-67 - показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 57,3±7,1%, 40,5±7,0%, 38,9±9,9% и 18,3±5,5%. При исследовании КВ Ag-ЯОР-белков и ИМ ТороIIα наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -КВ Ag-ЯОР-белков/-ИМ ТороIIα, тип -КВ Ag-ЯОР-белков/+ИМ ТороIIα, тип +КВ Ag-ЯОР-белков/-ИМ ТороIIα , тип +КВ Ag-ЯОР-белков/+ИМ ТороIIα - показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 58,4±7,2%, 45,7±7,9%, 39,1±9,0% и 15,7±6,3%. Таким образом, продолжительность 5-летней послеоперационной выживаемости больных НМКРЛ был взаимосвязан с коэкспрессией молекулярно-биологических маркеров - ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα. Сходные актуариальные кривые выживаемости, на основе взаимного содержания Ag-ЯОР-белков и ИМ Ki-67, получены Lorenzato M. с соавторами (2000) при исследовании рака молочной железы. Райхлин Н.Т. с соавторами (2008) в исследовании 20 «малых» раков легкого (размером до 3 см) показали, что для больных с продолжительностью жизни 3-5 лет характерен тип -Ag-ЯОР/+Ki-67, а с продолжительностью жизни до 2 лет характерен тип +Ag-ЯОР/-Ki-67. В нашем исследовании не получено статистически значимое отличие в выживаемости больных аденокарциномой легкого типов -AgЯОР/+Ki-67 и +Ag-ЯОР/-Ki-67. Поэтому, эти два типа были объединены в один (с противоположными значениями содержания Ag-ЯОР-белков и ИМ Ki-67), в котором выживаемость достоверно отличалась от -Ag-ЯОР/-Ki-67 типа и +Ag-ЯОР/+Ki-67 типа и имела промежуточное значение. Литературные данные подтверждают результаты нашего исследования относительно взаимосвязи между высоким количественным содержанием Ag-ЯОР-белков и короткой продолжительностью послеоперационного периода жизни больных НМКРЛ и значимости Ag-ЯОР-белков как независимого 250 фактора прогноза [Райхлин Н.Т. с соавт., 2008, Carvalho P. E. et al., 2000, Rodrigues O. R. et al., 1997, Antonangelo L. et al., 1997, Bernardi F.D. et al., 1997, Lee Y.C. et al., 1996, Tateishi M. et al., 1995, Ishida T. et al., 1993, Oyama T. et al., 2000, 1993, Kaneko S. et al., 1991, Ogura S. et al., 1992, Abe S. et al., 1992]. В противоположность нашим результатам, некоторые авторы не находят такой взаимосвязи [Boldy D.A. et al., 1997]. Также следует отметить, что только в единичных исследованиях, посвященных изучению Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ, определялась площадь Ag-ЯОР-белков с использованием компьютерного анализа изображений, как объективного стандартизованного метода анализа [Matheus R. S. et al., 2004, Carvalho P. E. et al., 2000, Rodrigues O. R. et al., 1997, Antonangelo L. et al., 1997, Bernardi F.D. et al., 1997]. Кроме того, наряду со стандартизацией исследования Ag-ЯОР-белков (компьютерный анализ изображений и определение ИП и КВ), в нашем исследовании применен стандартизованный метод окрашивания Ag-ЯОР-белков после высокотемпературной обработки и с использованием методики тканевых матриц, что безусловно объективизирует и максимально стандартизирует результаты нашего исследования. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках и показатель пролиферации. В неизмененном эпителии бронха Ag-ЯОР-белки (MIB-1) составила 2,19±0,27 мкм², ПП 8,8±1,1. В неизмененном эпителии альвеолы MIB-1 позитивные клетки отсутствовали. В НМКРЛ Ag-ЯОР-белки (MIB-1) составила 10,47 (8,57-12,69) мкм²; ПП - 304,2 (172,9-476,5). В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП по сравнению с неизмененным эпителием бронхов (р<0,001). Увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП при НМКРЛ по сравнению с неизмененной тканью имеет практическое дифференциально-диагностическое значение и подтверждает факт участия ядрышкового аппарата пролиферирующих клеток в процессе канцерогенеза. Отсутствовала статистически значимая взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с Ag-ЯОР-белками (MIB-1). Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с ПП. Найдено статистически значимое увеличение ПП при НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским – соответственно 323,9 (192,2-531,5) и 137,2 (33,9-333,6) (р˂0,001). Аналогич- 251 ная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. В НМКРЛ Ag-ЯОР-белков (MIB-1) коррелировала с показателем Т (r=0,36, р<0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,44, р<0,001), показателем N (r=0,39, р<0,001), стадией заболевания (r=0,35, р<0,001) и дифференцировкой (r=0,33, р<0,001). Отмечалось увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) в группе Т2-3 по сравнению с Т1 - соответственно 11,08 (8,92-13,16) мкм² и 8,95 (7,60-10,91) мкм² (р˂0,001). При размере первичной опухоли менее 3 см Ag-ЯОР-белки (MIB-1) была меньше, чем в опухоли более 3 см - соответственно 8,93 (7,60-10,92) мкм² и 11,60 (9,37-13,42) мкм² (р˂0,001). Найдено увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) при НМКРЛ с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолью без метастазов - соответственно 11,89 (10,37-14,23) мкм² и 9,43 (8,04-11,88) мкм² (р˂0,001). Ag-ЯОРбелки (MIB-1) меньше в I стадию заболевания по сравнению с II-III стадиями - соответственно 9,35 (7,89-11,87) мкм² и 11,41 (9,21-13,75) мкм² (р˂0,001). Отсутствовало отличие Ag-ЯОР-белков (MIB-1) между Ак и Пк. Ag-ЯОРбелки (MIB-1) больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой - соответственно 11,01 (8,9713,04) мкм² и 8,79 (7,73-10,95) мкм² (р˂0,001). В НМКРЛ ПП имел корреляцию с показателем Т (r=0,29, р=0,006), наибольшим размером опухоли (r=0,39, р<0,001), показателем N (r=0,30, р=0,003), стадией заболевания (r=0,33, р<0,001), гистогенезом (r=0,37, р<0,001) и дифференцировкой (r=0,37, р<0,001). Отмечалось увеличение ПП в группе Т2-3 по сравнению с Т1 - соответственно 330,1 (192,2-531,5) и 222,0 (96,8-409,7) (р=0,006). При размере первичной опухоли менее 3 см ПП был меньше, чем в опухоли более 3 см - соответственно 203,5 (110,6-405,9) и 345,2 (215,0-558,4) (р<0,001). Найдено увеличение ПП при НМКРЛ с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолью без метастазов - соответственно 384,7 (214,1-618,0) и 273,4 (145,3-409,7) (р=0,003). ПП был меньше в I стадию заболевания по сравнению с II-III стадиями (соответственно 248,5 (137,5-404,7) и 357,7 (214,1-575,0), р<0,001), а также при Ак по сравнению с Пк (соответственно 218,4 (80,3-454,1) и 343,3 (222,0-558,4), 252 р<0,001). ПП был больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой - соответственно 343,8 (195,4-532,5) и 192,5 (96,8-330,1) (р<0,001). В гистогенетических типах (Ак и Пк), как и при НМКРЛ прослеживалась аналогичная динамика Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП в зависимости от клинико-морфологических параметров. В других исследованиях также показана взаимосвязь отдельных клинико-морфологических параметров новообразования с Ag-ЯОР-белками (MIB-1). Kidogawa H. с соавторами (2005) при раке молочной железы нашли увеличение количества Ag-ЯОР-белков в MIB1 позитивных клетках в опухоли с наибольшим размером более 2 см по сравнению с опухолью менее 2 см. Tomobe M. с соавторами (1999) при раке мочевого пузыря нашли последовательное увеличение количества Ag-ЯОРбелков в MIB-1 позитивных клетках в группах Т1, Т2, Т3. Nakamura S. (1998) нашел взаимосвязь типа роста и глубины инвазии в стенку при раке толстой кишки. Yamaguchi S. (1994) при НМКРЛ нашел увеличение количества AgЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при Т4 по сравнению с Т1-3 и при N 2, 3 по сравнению с N 0, 1. Однако, результаты в этих работах получены при субъективном анализе (визуальном подсчете количества Ag-ЯОР-белков) в отличие от наших результатов, полученных при объективном анализе (компьютерном анализе изображений). При НМКРЛ Ag-ЯОР-белков (MIB-1) имела корреляцию со следующими молекулярно-биологическими маркерами: ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,71, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,39, р<0,001), ПП (r=0,49, р<0,001), ИМ Ki67 (r=0,27, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,26, р<0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,20, р<0,05), bcl-2 отрицательной экспрессией (r=-0,22, р<0,01) и ИГХ Her2 статусом (r=0,17, р<0,05). Корреляционные взаимосвязи Ag-ЯОРбелков (MIB-1) с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при НМКРЛ и Ак (за исключением экспрессии р53, bcl-2 и ИГХ Her2 статуса – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Ак) и Пк (за исключением ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα и экспрессии р53 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк). ПП при НМКРЛ имел корреляцию со следующими молекулярнобиологическими маркерами: ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,43, р<0,001), КВ Ag- 253 ЯОР-белков (r=0,36, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,49, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,74, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,52, р<0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,25, р<0,001), bax положительной экспрессией экспрессией (r=0,20, р<0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,21, р<0,01). Корреляционные взаимосвязи ПП с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при НМКРЛ и Ак (за исключением экспрессии bax – взаимосвязь с которой отсутствовала при Ак) и Пк (за исключением экспрессии bcl2 – взаимосвязь с которой присутствовала при Пк). При однофакторном регрессионном анализе имели влияние на выживаемость больных НМКРЛ, Ак и Пк Ag-ЯОР-белки (MIB-1) (χ2=25,5-59,3; р<0,001) и ПП (χ2=5,4-11,4; р<0,05). 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от Ag-ЯОР-белков (MIB-1): 61,2±5,4% - при небольшой площади ˂10,47 мкм² и 16,2±4,2% - при большой ≥10,47 мкм². Также 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р<0,001) в зависимости от ПП: 50,2±4,9% - при небольшом ПП˂304,2 и 25,8±4,9% - при большом ≥304,2. Нами отмечена аналогичная динамика показателя 5-летней выживаемости при гистогенетических типах НМКРЛ - Ак и Пк. Выявлена зависимость показателя 5-летней выживаемости при НМКРЛ от взаимной коэкспрессии молекулярно-биологических маркеров - Ag-ЯОРбелков (MIB-1), с одной стороны, и ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, с другой стороны. Так, при исследовании Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ИМ Ki-67 наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -Ag-ЯОР-белки (MIB-1)/-ИМ Ki-67, тип -Ag-ЯОР-белки (MIB-1)/+ИМ Ki-67, тип +Ag-ЯОРбелки (MIB-1)/-ИМ Ki-67, тип +Ag-ЯОР-белки (MIB-1)/+ИМ Ki-67 - показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 65,2±8,1%, 53,6±8,0%, 28,7±7,7% и 9,9±4,2%. При исследовании Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ИМ ТороIIα наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -Ag-ЯОР-белки (MIB-1)/+ИМ ТороIIα, тип -Ag-ЯОР-белки (MIB-1)/-ИМ ТороIIα, тип +Ag-ЯОР-белки (MIB-1)/-ИМ ТороIIα, тип +Ag-ЯОР-белки (MIB1)/+ИМ ТороIIα - показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 61,5±7,2%, 64,7±9,6%, 23,9±8,3% и 8,2±4,7%. Таким образом, продолжительность 5-летней послеоперационной выживаемости при НМКРЛ была 254 взаимосвязана с коэкспрессией молекулярно-биологических маркеров - AgЯОР-белков (MIB-1), ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα. К сожалению, данный раздел научных знаний не освещен ни в отечественной, ни в зарубежной литературе. В мировой литературе работы посвященные исследованию пролиферативного потенциала опухоли с использованием двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки крайне немногочисленны. Тем не менее, показана взаимосвязь количественного содержания Ag-ЯОР-белков в пролиферирующих клетках с выживаемостью при раке молочной железы [Abboud P. et al., 2008; Kidogawa H. et al., 2005; Biesterfeld S. et al., 2001; Lorenzato M. et al., 2000], мочевого пузыря [Tomobe M. et al., 1999] и НМКРЛ [Bigras G. et al., 1996]. В двух исследованиях показана взаимосвязь ПП с клиникоморфологическими параметрами и выживаемостью больных раком молочной железы [Abboud P. et al., 2008; Lorenzato M. et al., 2000]. При НМКРЛ, Ак и Пк отсутствуют литературные данные о взаимосвязи Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП, с одной стороны, с возрастном, полом, клинико-морфологическими параметрами и экспрессией молекулярно-биологических маркеров, с другой стороны. Маркеры пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα). В ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол ИМ Ki-67 и ТороIIα составил менее 1% (единичные положительные клетки). В неизмененном эпителии бронхов ИМ Ki-67 составил 4 (1-8)%, ИМ ТороIIα - менее 1% (единичные положительные клетки). Ki-67 и ТороIIα позитивные клетки определялись в базальном слое и нижней трети эпителия бронха. В НМКРЛ ИМ Ki-67 составил 25 (18-42)%, ИМ ТороIIα - 19 (12-27)%. В клетках НМКРЛ наблюдалось повышение ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р<0,001). Таким образом, неизмененный эпителий бронха и альвеолы имеют относительно низкий пролиферативный уровень. Результаты нашего исследования согласуются с литературными данными [Khojasteh M. et al., 2012; Kim E.S. et al., 2010; Miller Y.E. et al., 2007; Cohen L. et al., 2007; Meert A.P. et al., 2006; Fjellbirkeland L. et al., 2003; Giaccone G. et al., 1995]. Отличия ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα при НМКРЛ по сравнению с неизмененным легким диагностическое значение. имеет практическое дифференциально- 255 Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. Найдено статистически значимое увеличение ИМ Ki-67 в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским – соответственно 30 (19-45)% и 14 (5-22)% (р˂0,001). Также найдено статистически значимое увеличение ИМ ТороIIα в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским – соответственно 20 (13-28)% и 7 (3-17)% (р˂0,001). Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. ИМ Ki-67 при НМКРЛ имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,21, р˂0,01), дифференцировкой (r=0,22, р˂0,01) и умеренную корреляцию с гистогенезом (r=0,31, р˂0,001). Отмечалось увеличение ИМ Ki-67 в группах Т2-3 по сравнению с Т1 (показатель Т), N1-3 по сравнению с N0 (показатель N), II-III по сравнению с I (стадия заболевания); однако, статистически значимого отличия не было получено. Статистически значимые отличия ИМ Ki-67 получены в следующих группах: наибольший размер опухоли до 3 см и более 3 см - соответственно 22 (13-38)% и 30 (21-45)% (р˂0,01), гистогенетический тип Ак и Пк - соответственно 20 (11-38)% и 30 (23-45)% (р˂0,001), высокодифференцированная и умерено, низкодифференцированная опухоль - соответственно 19 (13-32)% и 30 (20-45)% (р˂0,001). Таким образом, пролиферативная активность увеличивается в процессе увеличения размера НМКРЛ и при Пк по сравнению с Ак. В опухолях без солидизации (высокодифференцированные) по сравнению с опухолями с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированные) минимально содержание антигена Ki-67. Отмечалось увеличение ИМ ТороIIα в группах Т2-3 по сравнению с Т1 (показатель Т), N1-3 по сравнению с N0 (показатель N), II-III по сравнению с I (стадия заболевания), однако, статистически значимого отличия не было получено. Статистически значимые отличия ИМ ТороIIα получены в следующих группах: наибольший размер опухоли до 3 см и более 3 см - соответственно 17 (9-22)% и 22 (13-29)% (р˂0,001), гистогенетический тип Ак и Пк соответственно 14 (6-21)% и 22 (16-28)% (р˂0,001), высокодифференцированная и умерено, низкодифференцированная опухоль - соответственно 16 256 (9-23)% и 20 (12-28)% (р˂0,001). Таким образом, ИМ ТороIIα увеличивается в процессе увеличения размера НМКРЛ и при Пк по сравнению с Ак. В опухолях без солидизации (высокодифференцированные) по сравнению с опухолями с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированные) минимально содержание ТороIIα. Вероятно, при Ак, в процессе роста и снижении дифференцировки опухоли происходит увеличение активности ТороIIα, связанное как с увеличением пролиферативной активности опухоли, так и с изменением функциональных процессов мутированной ДНК. По данным мировой литературы, прослеживается взаимосвязь ИМ Ki67 и ИМ ТороIIα с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ: с гистогенезом [Warth A. et al., 2014; Ahn H.K. et al., 2014; Niemiec J. et al., 2005; Haga Y. et al., 2003; Nguyen V.N. et al., 2000], дифференцировкой [Werynska B. et al., 2011; Ludovini V. et al., 2008; Niemiec J. et al., 2005; Li C. et al., 2005] что подтверждает результаты нашего исследования. Однако, в некоторых исследованиях не найдена взаимосвязь экспрессии антигена Ki-67 и ТороIIα с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ [Erguden H.С. et al., 2012; Yan S. et al., 2010; Yoo J. et al., 2007; Fujita Y. et al., 2003] - что не согласуется с результатами нашего исследования. При НМКРЛ ИМ Ki-67 имел корреляцию со следующими молекулярно-биологическими маркерами: ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р<0,001), КВ AgЯОР-белков (r=0,35, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,27, р<0,001), ПП (r=0,74, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,68, р<0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,22, р<0,01), bax положительной экспрессией (r=0,23, р<0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,16, р<0,05). Корреляционные взаимосвязи ИМ Ki-67 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при НМКРЛ и Ак (за исключением экспрессии bax – взаимосвязь с которой отсутствовала при Ак) и Пк (за исключением Ag-ЯОР-белков (MIB-1), экспрессии р53, bax и амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк). При НМКРЛ ИМ ТороIIα имел корреляцию со следующими молекулярно-биологическими маркерами: ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,32, р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,26, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,26, р<0,001), ПП (r=0,52, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,68, р<0,001), р53 положительной экс- 257 прессией (r=0,21, р<0,05), bax положительной экспрессией (r=0,19, р<0,05) и амплификацией гена Her2 (r=0,16, р<0,05). Корреляционные взаимосвязи ИМ ТороIIα с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при НМКРЛ и Ак (за исключением ИП Ag-ЯОР-белков и экспрессии bax – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Ак; однако, при Ак по сравнению с НМКРЛ отмечается корреляция ИМ ТороIIα с экспрессией bcl-2) и Пк (за исключением Ag-ЯОР-белков (MIB-1), экспрессии р53, bax и амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк). К сожалению, в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют комплексные исследования ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами (Ag-ЯОР-белками, маркерами апоптоза (p53, bcl-2 и bax) и статусом гена Her2). При однофакторном регрессионном анализе при НМКРЛ, Ак и Пк имели влияние на выживаемость больных ИМ Ki-67 (χ2=5,1-12,2; р<0,05) и ИМ ТороIIα (χ2=9,6-28,3; р<0,01). 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р<0,01) в зависимости от ИМ Ki-67: 50,3±5,5% - при небольшом ИМ Ki-67˂25% и 31,6±4,7% - при большом ИМ Ki-67≥25%. Также 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р<0,01) в зависимости от ИМ ТороIIα: 53,0±5,5% при небольшом ИМ ТороIIα˂19% и 31,7±5,1% - при большом ИМ ТороIIα≥19%. Нами отмечена аналогичная динамика показателя 5-летней выживаемости при гистогенетических типах НМКРЛ - Ак и Пк. В нашем исследовании показана зависимость показателя 5-летней выживаемости при НМКРЛ от взаимной коэкспрессии молекулярно- биологических маркеров - ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. При исследовании коэкспрессии маркеров пролиферативной активности наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду: тип -ИМ Ki-67/-ИМ ТороIIα, тип +ИМ Ki-67/-ИМ ТороIIα, тип -ИМ Ki-67/+ИМ ТороIIα, тип +ИМ Ki-67/+ИМ ТороIIα - показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 56,4±7,2%, 40,8±15,1%, 41,9±9,4% и 25,0±5,6%. Таким образом, продолжительность 5летней послеоперационной выживаемости при НМКРЛ зависит от взаимной коэкспрессии ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. К сожалению, данный раздел научных знаний не освещен ни в отечественной, ни в зарубежной литературе. 258 Результаты нашего исследования совпадают с той частью литературных источников, в которых найдена взаимосвязь между низким показателем выживаемости больных и неблагоприятным прогнозом при НМКРЛ с высокими значениями ИМ Ki-67 [Warth A. et al., 2014; Tabata K. et al., 2014; Tsoukalas N. et al., 2014; Zhong X. et al., 2014; Ahn H.K. et al., 2014; Berghoff A.S. et al., 2014; Lei B. et al., 2013] и ИМ ТороIIα [Dingemans A.C. et al., 2001]. Однако, в мировой литературе имеются исследования, результаты которых противоположны нашим – авторы не нашли взаимосвязь между неблагоприятным прогнозом при НМКРЛ и высокими значениями ИМ Ki-67 [Werynska B. et al., 2011; Yan S. et al., 2010; Yoo J. et al., 2007; Maounis N.F. et al., 2006; Szelachowska J. et al., 2006] и ИМ ТороIIα [Zhu W.Y. et al., 2012; Erguden H.С. et al., 2012; Woenckhaus M. et al., 2008; Langendijk H. et al., 2000]. Маркеры апоптоза (p53, bcl-2 и bax). В неизмененном эпителии альвеол отсутствовала экспрессия p53, bcl-2 и bax. В неизмененном эпителии бронхов отсутствовали p53-положительные клетки, bcl-2-положительные клетки определялись только в базальном слое (ИМ bcl-2 составил менее 10%), bax-положительные клетки определялись во всех слоях (ИМ bax составил более 90%). В нашем исследовании положительная экспрессия р53 определялась в 44% НМКРЛ, положительная экспрессия bcl-2 определялась в 18% НМКРЛ, положительная экспрессия bax определялась в 55% НМКРЛ. Таким образом, в клетках НМКРЛ наблюдалось повышение экспрессии p53, bcl-2 и bax по сравнению с неизмененным эпителием альвеол (р<0,001), а также повышение экспрессии p53, bcl-2 и снижение экспрессии bax по сравнению с неизмененным эпителием бронхов (р<0,001). Экспрессия p53, bcl-2 и bax при НМКРЛ по сравнению с неизмененным легким имеет дифференциально-диагностическое значение в практической онкоморфологии. Литературные данные подтверждают полученные нами результаты [Porebska I. et al., 2006; Brambilla E. et al., 1998; Walker C. et al., 1994]. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с экспрессией р53, bcl-2 и bax. Пол больных НМКРЛ и Ак имел слабую корреляцию с положительной экспрессией bax (соответственно r=0,18 и r=0,20, р<0,05). Найдено статистически значимое увеличение положительной экспрессии bax при НМКРЛ у лиц женского пола по сравнению с мужским – соответственно 26 259 случаев (76%) и 104 случая (51%) (р=0,006). Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Гистогенетический тип НМКРЛ был взаимосвязан с экспрессией р53 (r=0,15, р˂0,05), bcl-2 (r=0,15, р˂0,05) и bax (r=0,16, р˂0,05), а также показатель N и стадия заболевания с экспрессией bcl-2 (r=0,15, р˂0,05 и r=0,18, р˂0,01 соответственно). При Пк по сравнению с Ак найдено статистически значимое увеличение количества случаев с положительной экспрессией р53 (соответственно 65 случаев (51%) и 39 случаев (36%), р˂0,05) и положительной экспрессией bcl-2 (соответственно 30 случаев (23%) и 13 случаев (12%), р˂0,05). Количество случаев с положительной экспрессией bax достоверно больше в Ак по сравнению с Пк (соответственно 69 случаев (63%) и 61 случай (48%), р˂0,05). Отмечается достоверное увеличение количества случаев с положительной экспрессией bcl-2 в группе опухолей без метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями с наличием метастазов (р˂0,05; соответственно 34 случая (23%) и 9 случаев (10%)), при I стадии заболевания по сравнению со II-III стадиями (р˂0,01; соответственно 30 случаев (25%) и 13 случаев (11%)). Данные мировой литературы также указывают на то, что имеется взаимосвязь гистогенетического типа НМКРЛ с экспрессией p53 [Jeong S.H. et al., 2008; Grossi F. et al., 2003; Laudanski J. et al., 2001], bcl-2 [Shibata Y. et al., 2004; Kren L. et al., 2004; Grossi F. et al., 2003], bax [Jeong S.H. et al., 2008; Porebska I. et al., 2006; Mori S. et al., 2004]; а также показателя N с экспрессией bcl-2 [Groeger A.M. et al., 2004; Ohmura Y. et al., 2000]. В то же время, в противоположность нашим данным, некоторые исследователи не находят взаимосвязи клинико-морфологических параметров НМКРЛ с экспрессией p53, bcl-2 и bax [Porebska I. et al., 2006; Milas I. et al., 2003; Hanaoka T. et al., 2002]. Таким образом, гистогенез НМКРЛ взаимосвязан с экспрессией р53 (выше при Пк), bcl-2 (выше при Пк) и bax (выше при Ак), что вероятно, отражает взаимосвязь особенностей генетических нарушений и гистогенеза опухоли. При возникновении метастатического потенциала и в более поздних стадиях заболевания экспрессия белка bcl-2 снижается, что указывает и на снижение антиапоптотического влияния этого белка. 260 При НМКРЛ экспрессия р53 имела корреляцию со следующими молекулярно-биологическими маркерами: ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,24, р<0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,20, р<0,05), ПП (r=0,25, р<0,001), ИМ Ki-67 (r=0,22, р<0,01), ИМ ТороIIα (r=0,21, р<0,05). В НМКРЛ при положительной экспрессии р53 по сравнению с отрицательной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. Корреляционные взаимосвязи экспрессии р53 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при НМКРЛ и Ак (за исключением Ag-ЯОР-белков (MIB-1) – взаимосвязь с которой отсутствовала при Ак) и Пк (за исключением ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк). Так как не менее чем в 70% р53 положительного НМКРЛ определяются точечные мутации гена р53, то возникновение мутации в гене р53 приводит как к снижению апоптоза, так и увеличению пролиферации, что проявляется в неблагоприятном прогнозе НМКРЛ. При НМКРЛ экспрессия bcl-2 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,22, р<0,01) и Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,24, р<0,01). В НМКРЛ при отрицательной экспрессии bcl-2 по сравнению с положительной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков и Ag-ЯОР-белков (MIB-1). При Ак корреляционные взаимосвязи экспрессии bcl-2 с молекулярно-биологическими маркерами имели отличия от НМКРЛ при Ак по сравнению с НМКРЛ отсутствовала взаимосвязь с Ag-ЯОРбелками (MIB-1) и была взаимосвязь с ИМ ТороIIα (р=0,04). Корреляционные взаимосвязи экспрессии bcl-2 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ; однако, при Пк по сравнению с НМКРЛ отмечается взаимосвязь с ПП (р=0,006). Для bcl-2 положительного НМКРЛ характерны небольшие количественные показатели ИП Ag-ЯОРбелков и Ag-ЯОР-белков (MIB-1). Полученные данные согласуются с благоприятным прогнозом bcl-2 положительного НМКРЛ. Данный факт, а также высокая экспрессия bcl-2 при N0 и I стадии являются труднообъяснимыми, поскольку bcl-2 - это антиапоптотический белок. Поэтому наши данные в какой-то степени объясняют данный феномен. При НМКРЛ экспрессия bax имела корреляцию с ПП (r=0,20, р<0,01), 261 ИМ Ki-67 (r=0,23, р<0,001), ИМ ТороIIα (r=0,19, р<0,05). В НМКРЛ при положительной экспрессии bax по сравнению с отрицательной экспрессией отмечались более высокие значения ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. Корреляционные взаимосвязи экспрессии bax с молекулярно-биологическими маркерами имели отличия при гистогенетических вариантах НМКРЛ – при Ак и Пк отсутствовала взаимосвязь с ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα по сравнению с НМКРЛ. Для bax положительного НМКРЛ характерны большие значения ПП и пролиферативной активности (по изучению ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα), что проявляется в повышении пролиферации и неблагоприятном прогнозе НМКРЛ. При однофакторном регрессионном анализе при НМКРЛ и Пк имели влияние на выживаемость больных экспрессия р53(χ2=4,6-4,7; р<0,05) и bcl-2 (χ2=4,1-8,5; р<0,05). Экспрессия р53 и bcl-2 не была взаимосвязана с выживаемостью больных Ак при однофакторном регрессионном анализе. Также при однофакторном регрессионном анализе не обнаружена зависимость выживаемости больных НМКРЛ, Ак и Пк с экспрессией bax. 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие в зависимости от экспрессии р53 (р=0,03): 46,2±4,7% – при отрицательной экспрессии и 32,4±5,1% - при положительной экспрессии. Также 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие в зависимости от экспрессии bcl-2 (р=0,004): 35,6±3,8% – при отрицательной экспрессии и 58,4±8,8% - при положительной экспрессии. Выживаемость больных НМКРЛ при положительной экспрессии bax была ниже по сравнению с отрицательной экспрессией (36,8±4,7% и 44,8±5,2% соответственно), однако, отличие не достоверно (р=0,7). Нами отмечена аналогичная динамика показателя 5летней выживаемости при Пк; однако, при Ак отсутствовала взаимосвязь показателя 5-летней выживаемости с экспрессией р53 и bcl-2. В нашем исследовании показана зависимость показателя 5-летней выживаемости при НМКРЛ от взаимной коэкспрессии молекулярно- биологических маркеров апоптоза p53, bcl-2 и bax. Выживаемость больных НМКРЛ уменьшалась в ряду иммунофенотипов опухоли: 1) тип -p53/+bcl-2, тип -p53/-bcl-2, тип +p53/+bcl-2 и тип +p53/-bcl-2 - показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 70,1±12,5%, 38,9±5,1%, 32,6±12,7% и 262 30,3±5,6%; 2) тип -p53/-bax, тип -p53/+bax, тип +p53/-bax и тип +p53/+bax показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 47,4±7,3%, 43,5±6,4%, 38,8±7,5% и 25,3±6,8%; 3) тип +bcl-2/-bax, тип +bcl-2/+bax, тип bcl-2/-bax и тип -bcl-2/+bax - показатель 5-летней выживаемости составил соответственно 58,9±13,3%, 56,2±10,8%, 39,5±5,7% и 32,4±5,1%. Таким образом, имелась взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ с коэкспрессией маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax). Выживаемость больных НМКРЛ благоприятнее в +bcl-2 опухолях, хуже в +p53 опухолях и имеет тенденцию к укорочению в +bax опухолях. Наши результаты изучения экспрессии p53, bcl-2 и bax при НМКРЛ, Ак и Пк совпадают с литературными данными. По литературным данным неблагоприятными прогностическими факторами при НМКРЛ являются положительная экспрессия р53 [Ahn H.K. et al., 2014; Tsubochi H. et al., 2006; Maddau C. et al., 2006; Grossi F. et al., 2003; Han H. et al, 2002], отрицательная экспрессия bcl-2 [Biesaga B. et al., 2014; Yoo J. et al., 2007; Ludovini V. et al., 2004; Kren L. et al., 2004; Tomita M. et al., 2003] и положительная экспрессия bах [Jeong S.H. et al., 2008; Gessner C. et al., 2002]. Однако, имеются сообщения и противоположного характера – об отсутствии взаимосвязи выживаемости больных НМКРЛ с экспрессией p53 [Mohamed S. et al., 2007; Ulukus E.C. et al., 2007; Shibata Y.et al., 2004], bcl-2 [Ulukus E.C. et al., 2007; Yaren A. et al., 2006; Gregorc V. et al., 2003] и bax [Ulukus E.C. et al., 2007; Groeger A.M. et al., 2004]. ПМЦР-Г и ПМЦР-Л. В неизмененных альвеолах ПМЦР-Г составила 86 (73-102). Лимфатические сосуды в стенке альвеол отсутствовали и определялись в межальвеолярной соединительной ткани, около кровеносных сосудов, вне состава микроциркуляторного русла. В альвеолах найдена высокая плотность кровеносных и отсутствие лимфатических сосудов, что связано с наличием газотранспортной функции и отсутствием лимфатической дренажной функции. В неизмененных бронхах ПМЦР-Г составила 22 (17-31), ПМЦР-Л – 4 (2-7). В бронхах плотность кровеносных сосудов меньше по сравнению с альвеолами и присутствуют лимфатические сосуды, обеспечивая трофическую и дренажную функцию. При НМКРЛ ПМЦР-Г составила 43 (34-60), ПМЦР-Л - 4 (2-9). В НМКРЛ наблюдалось снижение ПМЦР-Г по 263 сравнению с альвеолами и повышение по сравнению с бронхами (р<0,001), а также повышение ПМЦР-Л по сравнению с альвеолами (р<0,001) и отсутствие отличия по сравнению с бронхами. Данные мировой литературы согласуются с результатами нашего исследования [Meert AP. et al., 2007; Hiroshima K. et al., 2002; Keith RL. et al., 2002; Fontanini G. et al., 1999, 1996]. Динамика изменений ПМЦР-Г и ПМЦР-Л от неизмененного легкого до НМКРЛ имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Отсутствовала статистически значимая взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с ПМЦР-Г и ПМЦР-Л. К сожалению, в мировой литературе нет данных о взаимосвязи возрастно-половых характеристик больных НМКРЛ, Ак и Пк с ПМЦР-Г и ПМЦР-Л. Не найдено статистически значимого отличия и корреляции ПМЦР-Г и ПМЦР-Л в зависимости от клинико-морфологических параметров НМКРЛ – показателя Т, наибольшего размера опухоли, показателя N, стадии заболевания и дифференцировки. Отмечается статистически значимое увеличение ПМЦР-Г при Ак по сравнению с Пк (р=0,01); однако, ПМЦР-Л не имела отличий. Результаты нашего исследования по изучению ПМЦР-Г подтверждаются данными полученными Ozbudak I.H. с соавторами (2009) и Mineo T.C. с соавторами (2004). При НМКРЛ, Ак и Пк отсутствовали статистически значимые связи ПМЦР-Л и экспрессии молекулярно-биологических маркеров. Также при НМКРЛ и Пк отсутствовали статистически значимые связи ПМЦР-Г и экспрессии молекулярно-биологических маркеров. В Ак при большой ПМЦР-Г по сравнению с небольшой отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков и Ag-ЯОР-белков (MIB-1). При Ак ПМЦР-Г имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,21, р<0,05) и Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,23, р<0,05). К сожалению, в мировой литературе нет данных о взаимосвязи ПМЦР-Г и ПМЦР-Л с экспрессией молекулярно-биологических маркеров. 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие в зависимости от ПМЦР-Г: 49,8±5,2% - при небольшой ПМЦРГ˂43 и 29,8±4,8% - при большой ПМЦР-Г≥43. Нами отмечена аналогичная динамика показателя 5-летней выживаемости при Ак и Пк в зависимости от 264 ПМЦР-Г. Также 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие в зависимости от ПМЦР-Л: 48,3±5,5% - при небольшой ПМЦР-Л˂4 и 34,0±4,6% - при большой ПМЦР-Л≥4 (р=0,03). Нами отмечена аналогичная динамика показателя 5-летней выживаемости при Пк; однако, при Ак отсутствовала взаимосвязь показателя 5-летней выживаемости с ПМЦР-Л. При однофакторном регрессионном анализе ПМЦР-Г имела влияние на выживаемость больных НМКРЛ, Ак и Пк (χ2=7,3-10,0; р<0,01). В тоже время, при однофакторном регрессионном анализе не обнаружена взаимосвязь ПМЦР-Л с выживаемостью больных НМКРЛ, Ак и Пк. Наши результаты подтверждаются данными литературы о взаимосвязи высокой ПМЦР-Г с неблагоприятным прогнозом и низким показателем выживаемости больных НМКРЛ [Колесник А.П. и соавт., 2013; Lu M. et al., 2014; Tang H. et al., 2014; Lu M. et al., 2014; Kuang BH. et al., 2013; Wu S. et al., 2012; Li SH. et al., 2011; Yoo J. et al., 2007]. Однако, имеются исследования, сообщающие о противоположных результатах – отсутствии прогностической значимости ПМЦР-Г при НМКРЛ [Sardari Nia P. et al., 2010; Kim S.J. et al., 2010; Donnem T. et al., 2007; Wang Y. et al., 2006; Chen F. et al., 2004]. Также наши данные подтверждают предположение о том, что интратуморальные лимфатические капилляры являются преимущественно не функциональными и не взаимосвязаны с клинико-морфологическими параметрами [Li M. et al., 2010; Faoro L. et al., 2008], а также выживаемостью больных и прогнозом при НМКРЛ [Faoro L. et al., 2008]. В нашем исследовании показана зависимость показателя 5-летней выживаемости при НМКРЛ в зависимости от соотношения ПМЦР-Г и ПМЦР-Л. Выживаемость больных НМКРЛ уменьшалась в ряду иммунофенотипов опухоли: -ПМЦР-Г/-ПМЦР-Л, -ПМЦР-Г/+ПМЦР-Л, +ПМЦР-Г/-ПМЦР-Л и +ПМЦР-Г/+ПМЦР-Л – соответственно 59,7±7,5%, 38,9±7,7%, 35,8±7,3% и 25,7±6,0%. Однако, статистически значимые отличия выживаемости больных получены только для иммунофенотипа -ПМЦР-Г /-ПМЦР-Л (р˂0,05). К сожалению, в мировой литературе нет данных о взаимосвязи выживаемости больных НМКРЛ в зависимости от соотношения ПМЦР-Г и ПМЦР-Л. Статус белка и гена Her2. В неизмененном эпителии альвеол и бронхов отсутствовала положительная экспрессия белка Her2. В неизмененном 265 эпителии бронхов определялось фрагментарное мембранное ИГХ окрашивание на Her2 в единичных клетках (до 10%). При НМКРЛ положительная экспрессия белка Her2 определена в 106 случаях (49%). При НМКРЛ наблюдалось повышение экспрессии белка Her2 по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р<0,001). В ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол и бронхов определялись от 1 до 2 гранул черного цвета (ген Her2) чаще одна, от 1 до 2 гранул красного цвета (СЕР17) - чаще одна; соотношение Her2/CEP17 не превышало значения 1,8. Хромогенная гибридизация in situ показала, что амплификация гена Her2 была в 19 (9%) случаях, увеличение CEP17 в 26 (12%) случаях НМКРЛ. В 4 случаях (2%) Ак амплификация гена Her2 (без увеличения CEP17) определялась в виде кластеров (12 и более копий) и соответствовала высокому уровню амплификации. В остальных 15 случаях (7%) амплификация гена Her2 определялась в виде отдельных множественных копий (от 4 до 8) и соответствовала низкому уровню амплификации, из которых, в 7 (3%) случаях – низкий уровень амплификации гена Her2 совместно с увеличением CEP17 и в 8 (4%) случаях - низкий уровень амплификации гена Her2 и отсутствие увеличения CEP17. В одном из четырех случаев Ак с высоким уровнем амплификации гена Her2 найдена неоднородность амплификации гена Her2: в участках опухоли с железистоподобным строением отмечался низкий уровень амплификации гена Her2, а в участках солидизации - высокий уровень амплификации гена Her2. Таким образом, в клетках НМКРЛ наблюдалось повышение амплификации гена Her2 и увеличения CEP17 по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р<0,001). Marchio C. с соавторами (2009) показали, что из 18 случаев рака молочной железы с увеличением количества метки CEP17 по данным FISH анализа только в одном случае была полисомия 17 хромосомы. При НМКРЛ в 26 (12%) случаях нами было найдено увеличение CEP17, во всех случаях - незначительной степени. Nakamura H. с соавторами (2003) указывают на более высокие значения увеличения CEP17 при НМКРЛ – 44%. Вероятно, при НМКРЛ, как и в раке молочной железы, увеличение CEP17 связано с изменениями в центромерном участке 17 хромосомы, а не с полисомией 17 хромосомы. Во всех случаях увеличения CEP17 была положительная экспрессия 266 белка Her2, что может указывать на не транскрипционную регуляцию белка Her2 в клетках. Наши результаты совпадают с данными мировой литературы [Xu YJ. et al., 2011; Radoviс S. et al., 2007; Tan D. et al., 2003; Meert A.P. et al., 2005; Piyathilake C.J. et al., 2002; Scheurle D. et al., 2000; al Moustafa A.E. et al., 1999]. Отсутствовала взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с положительной экспрессией белка Her2. Найдено статистически значимое увеличение количества случаев с амплификацией гена Her2 при НМКРЛ у лиц женского пола по сравнению с мужским – соответственно 6 случаев (18%) и 13 случаев (7%), р=0,04. Однако, при Ак и Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан со статусом гена Her2, CEP17. При НМКРЛ положительная экспрессия белка Her2 была взаимосвязана с показателем N (r=0,14, р=0,04) и гистогенезом (r=0,24, р<0,001). Отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с положительной экспрессией Her2 в группе опухолей с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями без метастазов - соответственно 44 (58%) и 62 (44%) случаев (р=0,048), а также при Ак по сравнению с Пк - соответственно 61 (62%) и 45 (38%) случаев (р<0,001). Таким образом, содержание белка Her2 в НМКРЛ взаимосвязано с гистогенезом и метастатическим потенциалом опухоли. Некоторые отличия имелись в экспрессии белка Her2 при гистогенетических вариантах НМКРЛ: при Ак положительная экспрессия белка Her2 коррелировала с наибольшим размером опухоли (r=0,21, р=0,03), при Пк – с показателем N (r=0,31, р=0,006) и стадией заболевания (r=0,21, р=0,03). Состояние гена Her2 коррелировало с гистогенезом опухоли (r=0,24, р<0,001), а состояние CEP17 - с показателем N (r=0,15, р=0,03). Количество случаев с амплификацией гена Her2 достоверно больше при Ак по сравнению с Пк - соответственно 16 (16%) и 3 (3%) случая (р<0,001). Отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с увеличением CEP17 в группе опухолей с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями без метастазов - соответственно 14 (18%) и 12 (8%) случаев 267 (р=0,047). Таким образом, при НМКРЛ состояние гена Her2 взаимосвязано с гистогенезом, а состояние CEP17 - с метастатическим потенциалом опухоли. В доступных литературных источниках, имеются сообщения о взаимосвязи экспрессии белка Her2 с гистогенезом [Xia Q. et al., 2012; Toh C.K. et al., 2010; Radoviс S. et al., 2007; Mukohara T. et al., 2004] и показателем N [Panagiotou I. et al., 2012; Gomez A.M. et al., 2014; Ludovini V. et al., 2008], что согласуется с результатами нашего исследовавния. При НМКРЛ амплификация гена Her2 определялась чаще в Ак по сравнению с Пк, что соответствует одним литературным данным [Grob T.J. et al., 2012] и противоречит другим [Hirsch F.R. et al., 2002]. Увеличение CEP17 чаще определялось в опухолях с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями без метастазов. Аналогичную взаимосвязь показали Ma J. с соавторами (2006), которые нашли корреляцию изменения хромосомного локуса 17q12-22 с метастатическим потенциалом Пк. При НМКРЛ и Пк экспрессия белка Her2 коррелировала с Ag-ЯОРбелками (MIB-1) - соответственно r=0,17, р<0,05 и r=0,21, р<0,01. В НМКРЛ и Пк при положительной экспрессии белка Her2 отмечались достоверно большие значения Ag-ЯОР-белков (MIB-1); в Ак данные отличия были не достоверны. При НМКРЛ амплификации гена Her2 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,14, р<0,05), ПП (r=0,21, р<0,01), ИМ Ki-67 (r=0,16, р<0,05), ИМ ТороIIα (r=0,16, р<0,05). При Ак амплификации гена Her2 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,24, р<0,05), ПП (r=0,26, р<0,05), ИМ Ki-67 (r=0,21, р<0,05), ИМ ТороIIα (r=0,22, р<0,05). В НМКРЛ и Ак при амплификации гена Her2 отмечались достоверно большие значения ИП AgЯОР-белков, ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα. При Пк данные отличия были не достоверны. При НМКРЛ, Пк и Ак отмечалась умеренная корреляция между положительной экспрессией белка Her2 и амплификацией гена Her2 - соответственно r=0,32, р<0,001, r=0,48, р<0,001 и r=0,23; р<0,05. В НМКРЛ, Пк и Ак только при положительной экспрессии белка Her2отмечалась амплификация гена Her2, при отрицательной экспрессии белка Her2отсутствовала амплификация гена Her2. В других исследованиях также отмечается корреляция между экспрессией белка и амплификацией гена Her2 при НМКРЛ[Al-Saad S. et al., 2010; Kuyama S. et al., 2008; Hirsch FR. et al., 2007; Soh J. et al., 2007; 268 Pelosi G. et al.,2005; Meert AP. et al.,2005]. К сожалению, в мировой литературе отсутствуют данные о взаимосвязи молекулярно-биологических параметров с экспрессией белка Her2, амплификацией гена Her2 и увеличением CEP17 при НМКРЛ. 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие в зависимости от экспрессии белка Her2 (р=0,02): 46,8±5,2% – при отрицательной и 30,9±5,0% - при положительной экспрессии. Аналогичная взаимосвязь показателя 5-летней выживаемости прослеживается только при Пк, при Ак - отсутствует. 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ при наличии амплификации гена Her2 была ниже по сравнению с опухолями, в которых отсутствовала амплификация гена Her2 (31,0±11,5% и 39,9±3,8% соответственно), однако, отличие не достоверно (р=0,5). Выживаемость больных НМКРЛ при наличии увеличения CEP17 была ниже по сравнению с опухолями, в которых отсутствовало увеличение CEP17 (25,6±8,9% и 42,3±3,8% соответственно), однако, имеется только тенденция к статистической достоверности (р=0,07). При анализе выживаемости больных НМКРЛ с четырьмя типами опухоли выявлено отсутствие отличий между типами N и AP (р=0,3; выживаемость соответственно 44,6±4,0% и 55,1±19,6%) и между типами A и P (р=0,7; выживаемость соответственно 9,2±8,8% и 9,5±7,0%). Наблюдалось статистически значимое снижение выживаемости больных с типами A и P, с одной стороны, по сравнению с типами N и AP, с другой стороны. При гистогенетических типах НМКРЛ – Ак и Пк – прослежена сходная взаимосвязь показателя 5-летней выживаемости с амплификацией гена Her2 и увеличением CEP17. При однофакторном регрессионном анализе положительная экспрессия белка Her2 имела влияние на выживаемость больных НМКРЛ и Пк (соответственно χ2=5,8 и χ2=4,2; р<0,05); при Ак статистически значимая взаимосвязь отсутствовала. При однофакторном регрессионном анализе амплификация гена Her2 имела влияние на выживаемость больных Пк (χ2=2,6; р<0,05); при НМКРЛ и Ак статистически значимая взаимосвязь отсутствовала. При однофакторном регрессионном анализе увеличение СЕР17 имело влияние на выживаемость больных Пк (χ2=6,2; р<0,01); при НМКРЛ и Ак статистически значимая взаимосвязь отсутствовала. 269 Наши результаты совпадают с литературными данными, в которых сообщается о взаимосвязи положительной экспрессии белка Her2 с неблагоприятным прогнозом и низким показателем выживаемости больных НМКРЛ [Xia Q. et al., 2012; Takenaka M. et al., 2011; Toh C.K. et al., 2010; Hirsch F.R. et al., 2009; Calikusu Z. et al., 2009; Kashihara M. et al., 2009]. В тоже время, в отличие от наших результатов, имеются исследования в которых не найдено такой взаимосвязи [Aleric I. et al., 2012; Xu Y.J. et al., 2011; Feng X.L.et al., 2011; Grossi F.et al., 2010; Tiseo M. et al., 2010; Al-Saad S. et al., 2010]. В настоящее время, по литературным источникам, прогностическая значимость амплификации гена Her2 при НМКРЛ четко не определена. Наши результаты совпадают с исследованиями, в которых обнаружено, что амплификация гена Her2 является неблагоприятным фактором, связанным с низким показателем выживаемости больных НМКРЛ [Al-Saad S. et al., 2010; Meert A.P. et al., 2005; Tan D. et al., 2003]. Многофакторный анализ и модели прогноза. Существующие в настоящее время модели прогнозирования течения онкологических заболеваний сочетают в себе клинические, клинико-морфологические и молекулярно-биологические факторы, которые оценивались отдельно друг от друга или разрабатывались комбинированные модели. Общим мнением, совпадающим с нашим, является мнение о большей значимости именно комбинированной модели проноза [Юрин А.Г., 2009; Frank I et al., 2002, 2010]. Проведенный многофакторный регрессионный анализ по Коксу с включением широкого спектра клинических критериев, клинико-морфологических и молекулярно-биологическим параметров показал нижеследующие совокупности факторов прогноза. При НМКРЛ неблагоприятными факторами 5-летней выживаемости являются: Ag-ЯОР-белки (MIB-1) 10,47 мкм² и более (β=1,01, стандартная ошибка=0,28, р<0,001), ПМЦР-Г 43 и более (β=0,56, стандартная ошибка=0,20, р=0,006), КВ Ag-ЯОР-белков 30,5 и более (β=0,57, стандартная ошибка=0,21, р=0,007), ИМ Ki-67 25% и более (β=0,71, стандартная ошибка=0,28, р=0,009), показатель N1-3 (β=0,86, стандартная ошибка=0,38, р=0,02), наибольший размер опухоли 3 см и более (β=0,52, стандартная ошибка=0,26, р=0,04). 270 При Ак неблагоприятными факторами 5-летней выживаемости являются: ПП 218,4 и более (β=1,68, стандартная ошибка=0,68, р=0,01), ПМЦР-Г 47 и более (β=0,71, стандартная ошибка=0,31, р=0,02), ИМ Ki-67 20% и более (β=1,55, стандартная ошибка=0,69, р=0,02), ИМ ТороIIα 14% и более (β=1,09, стандартная ошибка=0,50, р=0,03), Ag-ЯОР-белки (MIB-1) 10,56 мкм² и более (β=1,29, стандартная ошибка=0,65, р=0,046). При Пк неблагоприятными факторами 5-летней выживаемости являются: ПМЦР-Г 40 и более (β=1,60, стандартная ошибка=0,40, р<0,001), ИМ ТороIIα 22% и более (β=1,31, стандартная ошибка=0,50, р=0,008), Ag-ЯОРбелки (MIB-1) 10,67 мкм² и более (β=1,15, стандартная ошибка=0,45, р=0,009), ПМЦР-Л 4 и более (β=0,85, стандартная ошибка=0,33, р=0,009), тип операции пневмонэктомия (β=0,80, стандартная ошибка=0,32, р=0,01), КВ Ag-ЯОР-белков 31,2 и более (β=0,87, стандартная ошибка=0,36, р=0,01). Нами были разработаны три модели прогноза для НМКРЛ, Ак и Пк, с использованием метода многофакторного регрессионного анализа по Коксу с пошаговым включением в многофакторный регрессионный анализ независимых факторов прогноза, из всего множества данных, относящихся к клиническим критериям, клинико-морфологическим и молекулярно-биологическим параметрам, полученных на предыдущем этапе - начиная от наиболее значимых и заканчивая менее значимыми. В разработанных моделях прогноза, по совокупности факторов определялось количественное значение морфобиомолекулярного показателя для НМКРЛ, Ак и Пк. При однофакторном регрессионном анализе морфобиомолекулярный показатель имел влияние на выживаемость больных НМКРЛ (χ2=80,1, β=0,46, стандартная ошибка 0,05, р<0,001), Ак (χ2=36,2, β=0,65, стандартная ошибка 0,11, р<0,001) и Пк (χ2=57,1, β=0,76, стандартная ошибка 0,01, р<0,001), превосходя по значимости клинические, клинико-морфологические и молекулярно-биологические факторы. При оценке морфобиомолекулярного показателя 5-летняя выживаемость больных составила: при НМКРЛ 70,6±8,6% - с благоприятным прогнозом, 50,3±8,4% - с относительно благоприятным прогнозом, 29,8±7,3% - с относительно неблагоприятным прогнозом, 0% - с неблагоприятным прогнозом; при Ак 61,6±18,1% - с благоприятным прогнозом, 37,5±12,5% - с относительно благоприятным прогнозом, 271 13,5±8,3% - с относительно неблагоприятным прогнозом, 0% - с неблагоприятным прогнозом; при Пк 84,0±10,3% - с благоприятным прогнозом, 53,0±11,5% - с относительно благоприятным прогнозом, 30,2±12,8% - с относительно неблагоприятным прогнозом, 0% - с неблагоприятным прогнозом. Таким образом, молекулярно-биологические параметры имеют высокую прогностическую значимость, что в совокупности с «классическими» клинико-морфологическими параметрами позволяет более точно характеризовать закономерности опухолевого процесса при НМКРЛ, Ак и Пк, объективизировать и стандартизировать определение выживаемости и прогноза больных. 272 ВЫВОДЫ 1. Между неизмененным легким и НМКРЛ были отличия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров (р<0,001): ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателе пролиферации, экспрессии р53, bcl-2 и bax, ПМЦР-Г, ПМЦРЛ, экспрессии белка Her2 и амплификации гена Her2. 2. При НМКРЛ отмечались гендерные отличия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров. При мужском поле по сравнению с женским отмечались большие значения ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, показателя пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, а также меньшая частота положительной экспрессии bax и амплификации гена Her2. 3. Показатель Т НМКРЛ достоверно коррелировал с ИП и КВ Ag-ЯОРбелков, площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателем пролиферации (r=0,29-0,46; р<0,001). При показателе Т2-3 по сравнению с Т1 статистически значимо возрастали ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, площадь AgЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках и показатель пролиферации. 4. Показатель N НМКРЛ был взаимосвязан с ИП Ag-ЯОР-белков, площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателем пролиферации, экспрессией bcl-2, экспрессией белка Her2 и состоянием СЕР17 (r=0,14-0,39; р<0,05). При показателе N1-3 по сравнению с показателем N0 отмечались большие количественные значения ИП Ag-ЯОР-белков, площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателя пролиферации, а также большая частота отрицательной экспрессии bcl-2, положительной экспрессии белка Her2 и увеличение СЕР17. 5. Стадия НМКРЛ была взаимосвязана с ИП Ag-ЯОР-белков, площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателем пролиферации и экспрессией bcl-2 (r=0,18-0,35; р<0,01). При стадии I-II по сравнению со стадией I отмечались большие количественные значения ИП Ag-ЯОР-белков, площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателя пролиферации, а также большая частота отрицательной экспрессии bcl-2. 6. Гистогенетический тип НМКРЛ был взаимосвязан с ИП и КВ AgЯОР-белков, показателем пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, экспресси- 273 ей р53, bcl-2, bax, ПМЦР-Г, экспрессией белка Her2 и амплификация гена Her2 (r=0,15-0,38; р<0,05). При Пк по сравнению с Ак отмечались большие количественные значения ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, показателя пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, а также большая частота положительной экспрессии р53, bcl-2 и меньшая частота положительной экспрессии bax, положительной экспрессии белка Her2 и амплификации гена Her2. 7. Наибольший размер и степень гистологической дифференцировки НМКРЛ были взаимосвязаны с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, площадью AgЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателем пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα (r=0,21-0,45; р<0,01). При наибольшем размере опухоли более 3 см по сравнению с опухолью менее 3 см, а также при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной опухолью отмечались большие количественные значения ИП и КВ Ag-ЯОРбелков, площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателя пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα. 8. При НМКРЛ разнонаправленные характеристики пролиферации - ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показатель пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα - являются взаимосвязанными, отражая единый процесс повышения пролиферативного уровня. Также имелись взаимосвязи отдельных характеристик пролиферации с экспрессией р53, bcl-2, bax, белка Her2 и состоянием гена Her2. 9. Общая 5-летняя выживаемость больных НМКРЛ составила 41,3±3,5%. Показатель 5-летней выживаемости при НМКРЛ, Ак и Пк был статистически значимо взаимосвязан с рядом клинико-морфологических и молекулярнобиологических параметров опухоли: типом операции (р<0,01), показателем Т (р<0,05), наибольшим размером (р<0,001), показателем N (р<0,001), стадией заболевания (р<0,05), гистогенезом (р<0,05), дифференцировкой (р<0,001), ИП Ag-ЯОР-белков (р<0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (р<0,001), площадью AgЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (р<0,001), показателем пролиферации (р<0,001), ИМ Ki-67 (р<0,01), ИМ ТороIIα (р<0,01), экспрессией р53 (р<0,05), bcl-2 (р<0,05), ПМЦР-Г (р<0,05), ПМЦР-Л (р<0,05), экспрессией белка Her2 (р<0,05), амплификацией гена Her2 (р<0,05), увеличением СЕР17 (р<0,05). 274 10. Показатель 5-летней выживаемости больных НМКРЛ был взаимосвязан с коэкспрессией молекулярно-биологических маркеров - Ag-ЯОР-белков, маркеров пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза IIα) и Ag-ЯОРбелков в MIB-1 позитивных клетках; в меньшей степени с коэкспрессией маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) и ангиогенеза (ПМЦР-Г, ПМЦР-Л). 11. Неблагоприятными факторами 5-летней выживаемости по данным многофакторного регрессионного анализа являются: при НМКРЛ - площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках 10,47 мкм² и более (β=1,01, р<0,001), ПМЦР-Г 43 и более (β=0,56, р=0,006), КВ Ag-ЯОР-белков 30,5 и более (β=0,57, р=0,007), ИМ Ki-67 25% и более (β=0,71, р=0,009), показатель N13 (β=0,86, р=0,02), наибольший размер опухоли 3 см и более (β=0,52, р=0,04); при Ак - показатель пролиферации 218,4 и более (β=1,68, р=0,01), ПМЦР-Г 47 и более (β=0,71, р=0,02), ИМ Ki-67 20% и более (β=1,55, р=0,02), ИМ ТороIIα 14% и более (β=1,09, р=0,03), площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках 10,56 мкм² и более (β=1,29, р=0,046); при Пк - ПМЦР-Г 40 и более (β=1,60, р<0,001), ИМ ТороIIα 22% и более (β=1,31, р=0,008), площадь AgЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках 10,67 мкм² и более (β=1,15, р=0,009), ПМЦР-Л 4 и более (β=0,85, р=0,009), тип операции пневмонэктомия (β=0,80, р=0,01), КВ Ag-ЯОР-белков 31,2 и более (β=0,87, р=0,01). 12. При однофакторном регрессионном анализе морфобиомолекулярный показатель был прямо взаимосвязан с выживаемостью больных НМКРЛ (χ2=80,1, β=0,46, стандартная ошибка 0,05, р<0,001), Ак (χ2=36,2, β=0,65, стандартная ошибка 0,11, р<0,001) и Пк (χ2=57,1, β=0,76, стандартная ошибка 0,01, р<0,001). На основании оценки морфобиомолекулярного показателя 5-летняя выживаемость больных составила: при НМКРЛ 70,6±8,6% - с благоприятным прогнозом, 50,3±8,4% - с относительно благоприятным прогнозом, 29,8±7,3% - с относительно неблагоприятным прогнозом, 0% - с неблагоприятным прогнозом; при Ак 61,6±18,1% - с благоприятным прогнозом, 37,5±12,5% - с относительно благоприятным прогнозом, 13,5±8,3% - с относительно неблагоприятным прогнозом, 0% - с неблагоприятным прогнозом; при Пк 84,0±10,3% - с благоприятным прогнозом, 53,0±11,5% - с относительно благоприятным прогнозом, 30,2±12,8% - с относительно неблагоприятным прогнозом, 0% - с неблагоприятным прогнозом. 275 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При исследовании операционно-биопсийного материала с дифференциально-диагностической целью между неизмененным легким и НМКРЛ необходимо исследовать следующие молекулярно-биологические маркеры: ИП Ag-ЯОР-белков, КВ Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показатель пролиферации, экспрессию р53, bcl-2, bax, ПМЦР-Г, ПМЦР-Л, экспрессию белка Her2, амплификацию гена Her2. 2. Для оптимизации индивидуального послеоперационного прогноза и при динамическом наблюдении за больными НМКРЛ, Ак и Пк, помимо традиционных клинических данных и клинико-морфологических параметров, в группу интенсивного диспансерного наблюдения необходимо включать больных с неблагоприятными молекулярно-биологическими факторами прогноза: ИП Ag-ЯОР-белков (при НМКРЛ ≥6,52, при Ак ≥6,05, при Пк ≥6,96), КВ Ag-ЯОР-белков (при НМКРЛ ≥30,5%, при Ак ≥29,8%, при Пк ≥31,2%), площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (при НМКРЛ ≥10,47 мкм², при Ак ≥10,56 мкм², при Пк ≥10,67 мкм²), показатель пролиферации (при НМКРЛ ≥304,2, при Ак ≥218,4, при Пк ≥343,3), ИМ Ki-67 (при НМКРЛ ≥25%, при Ак ≥20%, при Пк ≥30%), ИМ ТороIIα (при НМКРЛ ≥19%, при Ак ≥14%, при Пк ≥22%), положительной экспрессией р53, отрицательной экспрессией bcl-2, ПМЦР-Г (при НМКРЛ ≥43, при Ак ≥47, при Пк ≥40), ПМЦРЛ (при НМКРЛ и Пк ≥4), положительной экспрессией белка Her2, амплификацией гена Her2, увеличением СЕР17. 3. Для индивидуального прогнозирования 5-летней выживаемости больных НМКРЛ необходимо учитывать следующие факторы: показатель N, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, наибольший размер опухоли, ПМЦР-Г, ИМ Ki-67, КВ Ag-ЯОР-белков. Расчет следует производить по следующей формуле: YНМКРЛ = 1,19*X1 + 0,91*X2 + 0,57*X3 + 0,56*X4 + 0,45*X5 + 0,43*X6, где YНМКРЛ – морфобиомолекулярный показатель при НМКРЛ, Х - значение фактора (в баллах): X1 – показатель N (0 баллов – показатель N0 и 2 балла – показатель N1-3), X2 – площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных 276 клетках (0 баллов – ˂10,47 мкм² и 2 балла – ≥10,47 мкм²), X3 – наибольший размер (0 баллов – ˂3см и 1 балл – ≥3см), X4 – ПМЦР-Г (0 баллов – ˂43 и 1 балл – ≥43), X5 – ИМ Ki-67 (0 баллов – ˂25% и 1 балл – ≥25%), X6 – КВ AgЯОР-белков (0 баллов – ˂30,5% и 1 балл – ≥30,5%). 4. Для индивидуального прогнозирования 5-летней выживаемости больных Ак необходимо учитывать следующие факторы: показатель N, ИМ Ki67, наибольший размер опухоли, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, ПМЦР-Г, показатель пролиферации. Расчет следует производить по следующей формуле: YАк = 0,96*X1 + 0,89*X2 + 0,85*X3 + 0,73*X4 + 0,73*X5 + 0,70*X6, где YАк – морфобиомолекулярный показатель при Ак, Х - значение фактора (в баллах): X1 – показатель N (0 баллов – показатель N0 и 1 балл – показатель N1-3), X2 – ИМ Ki-67 (0 баллов – ˂20% и 1 балл – ≥20%), X3 – наибольший размер (0 баллов – ˂3см и 1 балл – ≥3см), X4 – площадь Ag-ЯОРбелков в MIB-1 позитивных клетках (0 баллов – ˂10,56 мкм² и 1 балл – ≥10,56 мкм²), X5 – ПМЦР-Г (0 баллов – ˂47 и 1 балл – ≥47), X6 – показатель пролиферации (0 баллов – ˂218,4 и 1 балл – ≥218,4). 5. Для индивидуального прогнозирования 5-летней выживаемости больных Пк необходимо учитывать следующие факторы: ИМ ТороIIα, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показатель N, ПМЦР-Г, КВ AgЯОР-белков, ПМЦР-Л. Расчет следует производить по следующей формуле: YПк = 1,29*X1 + 1,20*X2 + 1,05*X3 + 1,02*X4 + 0,94*X5 + 0,80*X6, где YПк – морфобиомолекулярный показатель при Пк, Х - значение фактора (в баллах): X1 – ИМ ТороIIα (0 баллов – ˂22% и 1 балл – ≥22%), X2 – площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (0 баллов – ˂10,67 мкм² и 1 балл – ≥10,67 мкм²), X3 – показатель N (0 баллов – показатель N0 и 1 балл – показатель N1-3), X4 – ПМЦР-Г (0 баллов – ˂40 и 1 балл – ≥40), X6 – КВ Ag-ЯОР-белков (0 баллов – ˂31,2% и 1 балл – ≥31,2%), X6 – ПМЦР-Л (0 баллов – ˂4 и 1 балл – ≥4). 277 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ НМКРЛ – немелкоклеточный рак легкого Ак – аденокарцинома легкого Пк – плоскоклеточный рак легкого ПМЦР-Г – плотность микроциркуляторного русла кровеносных сосудов ПМЦР-Л – плотность микроциркуляторного русла лимфатических сосудов ПП – показатель пролиферации ИГХ – иммуногистохимический метод ИМ – индекс метки ИП – индекс площади КВ – коэффициент вариации Ag-ЯОР-белки – аргирофильные белки ядрышкообразующих районов Ag-ЯОР-белки (MIB-1) – площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках SISH (silver in situ hybridization) – метод хромогенной гибридизации in situ фирмы Ventana ТороIIα – белок топоизомераза IIα «-» – небольшая или отрицательная экспрессия маркера – меньше порогового значения для соответствующего маркера «+» – большая или положительная экспрессия маркера – больше порогового значения для соответствующего маркера М ± с.о. – среднее ± стандартное отклонение Ме (и.и.) – медиана (интерквартильный интервал) 278 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Авдалян, А.М. Патоморфологический и иммуногистохимический ана-лиз лейомиомы и лейомиосаркомы тела матки: дифференциальная диагностика и прогноз.: автореф. дис. ... д-ра мед. наук.: 14.03.02 / Авдалян Ашот Меружанович - Новосибирск, 2013. – 35 с. 2. Авдалян, А.М. Активность Topoisomerase IIα и уровень пролиферативной активности по степени бромдезоксиуридиновой (Brdu) метки в лейомиосаркоме тела матки. / А.М. Авдалян, И.П. Бобров, В.В. Климачев, А.Ф. Лазарев // Арх. патол. – 2011. – N 1. – С. 24–29. 3. Авдалян, А.М. Экспрессия рецепторов половых гормонов и активность аргирофильных белков области ядрышковых организаторов в клетках неизмененного миометрия и лейомиоме тела матки. / А.М. Авдалян, И.П. Бобров, В.В. Климачев, А.Ф. Лазарев // Морфология. – 2010. – N 2. – С. 23–29. 4. Авдалян, А.М. Прогностическое значение исследования плотности сосудов микроциркуляторного русла в опухоли и перитуморозной зоне по данным выявления белка СD31 и количества аргирофильных белков области ядрышкового организатора (AgNOR) в эндотелии при лейомиосаркоме тела матки. / А.М. Авдалян, И.П. Бобров, В.В. Климачев и др. // Фундам. исслед. – 2010. – N 5. – С. 12–20. 5. Авдалян, А.М. Связь экспрессии рецепторов к прогестерону и эстрогену α и активность аргирофильных белков области ядрышковых организаторов в гладкомышечных опухолях тела матки / А.М. Авдалян, И.П. Бобров, В.В. Климачев и др. // Арх. патол. – 2009. – N 4. – С. 50–54. 6. Авдалян, А.М. Коадаптация ферментных систем и уровня кровоснабжения в гладкомышечных опухолях тела матки. / А.М. Авдалян, И.П. Бобров, В.В. Климачев, А.Ф. Лазарев // Вопр. онкол. – 2008. – N 5. – С. 606–610. 7. Автандилов, Г.Г. Основы количественной патологоанатомической анатомии. / Г.Г. Автандилов. – М.: Медицина, 2002. – 238 с. 8. Автандилов, Г.Г. Основы патологоанатомической практики. / Г.Г. Автандилов. - М.: РМАПО, 1994. – 512 с. 9. Агеев, А.А. Особенности распространения рака легкого в Алтайском крае с учетом экзогенных факторов и риска полинеоплазий.: автореф. дисс. ... канд. мед. наук.: 14.00.27 / Агеев Александр Григорьевич - Барнаул, 2005 – 25 с. 10. Адамян, Л.В. Подавление ангиогенеза и продукции факторов роста в сочетании с индукцией активности металлопротеиназ в лейомиомах матки после курса 279 терапии улипристалом. / Л.В. Адамян, О.В. Зайратьянц, И.Б. Манухин и др. // Пробл. репродукции. – 2014. – N 4. – С.28–33. 11. Акопов, А.Л. Опухолевая инвазия сосудов при отсутствии метастазов в регионарные лимфатические узлы у больных местнораспространенным немелкоклеточным раком легкого. / А.Л. Акопов, И.В. Двораковская, // Вопр. онкол. – 2004. – N 4. – С. 417–420. 12. Аничков, Н.М Морфологические маркеры прогноза базально–клеточного рака кожи. / Н.М Аничков, И.Н. Чупров, // Мед. академ. журн. – 2011.– N 1. – С. 3– 11. 13. Бабиченко, И.И. Иммуногистохимические особенности уротелиальных опухолей мочевого пузыря. / И.И. Бабиченко, М.В. Самойлов, Л.В. Кудрявцева // Арх. патол. – 2012.– N 3.– С. 7–10. 14. Бабиченко, И.И. Экспрессия промежуточных филаментов и регуляторов клеточного цикла в уротелиальных опухолях мочевого пузыря. / И.И. Бабиченко, М.В. Самойлов, С.А. Осипов, И.А. Шалавин // Вестник Росс. универ. дружбы народов. – 2008.– N 3.– С.87–91. 15. Банин, В.В. Роль внеклеточного матрикса в регуляции ангиогенеза. / В.В. Банин, // Регион. кровообр. и микроцирк. – 2006. – N 1.– С. 13–19. 16. Барчук, A.C. Клинико–морфологические параллели при бронхоальвеолярном раке легкого. / A.C. Барчук, А.И. Арсентьев, K.M. Пожарисский // Вопр. онкол. – 2003. – Т. 49, N 3. – С. 316–332. 17. Барышников, А.Ю. Экспрессия маркеров апоптоза (р53, bcl–2, вах) и их прогностическое значение при эпителиальных новообразованиях яичников ранних стадий. / А.Ю. Барышников, В.В. Кузнецов, Е.В. Степанова и др. // Росс. биотер. журн. – 2011. – N 2. – С. 45–49. 18. Бобров, И.П. Модификация гистохимического метода выявления ядрышковых организаторов на гистологических срезах. / И.П. Бобров, А.М. Авдалян, В.В. Климачев и др. // Арх. патол. – 2010.– N 3.– С. 35–37. 19. Бобpов, И.П. Морфофункциональная характеристика белков областей ядрышковых организаторов при гладкомышечных опухолях матки. / И.П. Бобpов, A.M. Авдалян, A.Ф. Лазаpев и др. // Арх. патол. – 2008. – N 3. – С. 18–23. 20. Бобров, И.П. Морфофункциональная характеристика ядрышкового аппарата клеток при фоновых, предраковых и злокачественных заболеваниях желудка.: автореф. дис. ... канд. мед. наук.: 14.00.14 / Бобров Игорь Петрович - Томск, 2005. – 25 с. 280 21. Болгова, Л.С. Исследование ядрышковых организаторов хромосом в эпителии паренхимы легкого для уточнения гистогенеза железистого рака. / Л.С. Болгова, Т.Н. Туганова, Т.М. Ярощук // Онкология, 2011. – N 1. – С. 17–21. 22. Болгова, Л.С. Исследование ядрышкообразующих регионов хромосом в оценке неоадъювантной лучевой и сочетанной терапии железистого рака молочной железы. / Л.С. Болгова, Т.Н. Туганова, О.И. Алексеенко, М.Г. Махортова // Клин. лаб. диагн. – 2010.– N 11.– С. 35–40. 23. Болгова, Л.С. Цитологическая диагностика дисплазии и плоскоклеточного рака шейки матки при исследовании ядрышкообразующих регионов хромосом. / Л.С. Болгова, Т.Н. Туганова, О.И. Алексеенко // Клин. лаб. диагн. – 2012.– N 11.– С. 36–41. 24. Боровиков, В.П. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере (с CD-ROM), 2 издание. / В.П. Боровиков. - Питер, 2003. - 688 с. 25. Боровиков, В.П. Популярное введение в программу Statistica. / В.П. Боровиков. - КомпьютерПресс, 2000. - 288 с. 26. Боровиков, В.П. Прогнозирование в системе Statistica в среде Windows. / В.П. Боровиков, Г.И. Ивченко. - Финансы и статистика, 2000. - 368 с. 27. Боровиков, В.П. STATISTICA - Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. / В.П. Боровиков. - М.:Филинъ, 1998. - 608 с. 28. Букаева, И.А. Значение аргирофильных белков области ядрышковых организаторов в разграничении доброкачественного и злокачественного роста эпителиальных опухолей щитовидной железы. / И.А. Букаева, Е.А. Смирнова, А.И. Павловская и др. // Арх. патол. – 2001.– N 3.– С. 15–18. 29. Булычева, И.В. Экспрессия молекулярных маркеров в опухоли и прогноз выживаемости при остеосаркоме. / И.В. Булычева, Ю.Н. Соловьев, Н.Е. Кушлинский, А.Н. Махсон // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2010.– N 8.– С. 202–207. 30. Валиус, Л. Влияние прогностических показателей и лучевой терапии на продолжительность жизни больных раком легких. / Л. Валиус, А. Инчюра, Р. Сакалаускас, Э. Юозайтите // Тер. архив. – 2004.– N 10. – С. 17–23. 31. Владимирова, Л.Ю. Роль гистологического и молекулярного анализа в выборе метода лечения немелкоклеточного рака легкого поздних стадий. / Л.Ю. Владимирова, О.И. Кит, Е.А. Шолохова // Фарматека. – 2012. – N 8. – С.9–22. 32. Волченко, Н.Н. Значение аргентофильных белков областей ядрышковых организаторов в цитологической диагностике рака почки. / Н.Н. Волченко, Е.Н. Славнова, И.Н. Спиридонов и др. // Росс. онкол. журн. – 2007. – N 5. – С. 37–39. 281 33. Воропаева, О.Ф. Математическое моделирование регуляции биологической системы белков p53–Mdm2. / О.Ф. Воропаева, Ю.И. Шокин, Л.М. Непомнящих, С.Р. Сенчукова // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2014.– N 4.– С. 539–542. 34. Вуколов, Э.А. Основы статистического анализа.Практикум по статистическим методам и исследованию операций с использованием пакетов "Statistica" и "Excel"". / Э.А. Вуколов. - М.: Форум, 2004 - 464 с. 35. Гагуа, P.O. 20–летний опыт хирургического лечения рака легкого. / P.O. Гагуа, В.О. Кучава, Д.М. Гиоргадзе и др. // Онкология. – 2000. – С. 493. 36. Глухов, А.И. Экспрессия молекулярно–биологических маркеров в опухолях щитовидной железы. / А.И. Глухов, Л.И. Ипполитов, О.В. Зимник и др. // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. – 2009.– N 3. – С.27–31. 37. Головин, Д.И. Ошибки и трудности гистологической диагностики опухолей. / Д.И. Головин. - Л.: Медицина, 1982.- 304 с. 38. Горбунова, В. Немелкоклеточный рак легкого (современные подходы к лечению). / В. Горбунова, А. Маренич, М. Давыдов, К. Локтионов // Врач. – 2007.– N 1. – С. 24–27. 39. Давыдов, М.И. Рак легкого./ М.И. Давыдов, Б.Е. Полоцкий. - Москва, 2004. - 207 с. 40. Давыдов, М.И. Систематическая медиастинальная лимфатическая диссекция – стандарт в хирургическом лечении больных немелкоклеточным раком легкого I, II и IIIA стадии. / М.И. Давыдов, Б.Е. Полоцкий, А.К. Аллахвердиев // Пульмонология. – 2007. – N 3. – С. 72–76. 41. Давыдов, М.И. Современная стратегия торакоабдоминальной хирургии. / М.И. Давыдов, // Казанский мед. журнал. – 2000. – N 4. – С. 254–258. 42. Давыдов, М.И. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2009г. / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель, // Вестник РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. – 2011. – т. 22, N 3 (прил. 1) – С. 172. 43. Давыдов, М.И. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 г. / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель. - М.: Издательская группа РОНЦ, 2014 - 226 с. 44. Дарьялова, СЛ. Современные возможности лучевой терапии злокачественных опухолей / СЛ. Дарьялова, A.B. Бойко, A.B. Черниченко // Росс. онкол. журн. – 2000. – N 1. – С. 48–55. 45. Делекторская, В.В. Плоскоклеточный рак пищевода: определение статуса рецепторов эпидермального фактора роста (egfr и her–2) методами иммуногисто- 282 химии и in situ гибридизации. / В.В. Делекторская, Г.Ю. Чемерис, Л.Э. Завалишина и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2010.– N 5.– С. 549–554. 46. Демидова, И.А. Исследование молекулярно–генетических нарушений у больных аденокарциномой легких. / И.А. Демидова, А.А. Баринов, Н.А. Савелов и др. // Онкология, 2012. – N 2. – С. 28–34. 47. Жуков, Н.В. Современное состояние антиангиогенной терапии. Целевая терапия без мишени? / Н.В. Жуков, // Практ. онкология. – 2007. – Т.8, N 3. – С. 164– 172. 48. Заботина, Т.Н. Роль тканевых маркёров апоптоза и пролиферации в дополнительной дифференциальной диагностике папиллярного и фолликулярного рака щитовидной железы. / Т.Н. Заботина, С.П. Казаков, Н.Б. Кушлинский // Военно–мед. журнал. – 2010.– N 7. – С.48–50. 49. Завалишина, Л.Э. Особенности амплификации генов на длинном плече 17–й хромосомы в различных молекулярно–генетических подтипах рака молочной железы. / Л.Э. Завалишина, Н.В. Данилова, А.Э. Мационис, И.А. Павленко // Арх. патол. – 2014.– N 2.– С. 8–12. 50. Завалишина, Л.Э. НЕR2–тестирование методами иммуногистохимии, флуоресцентной (FISH) и хромогенной (SISH) in situ гибридизации при раке желудка и пищеводно–желудочного перехода. / Л.Э. Завалишина, А.А. Рязанцева, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Совр. онкол. – 2012. – N 1. – С. 27–31. 51. Завалишина, Л.Э. Определение возможности таргетной терапии рака желудка. / Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Арх. патол. – 2012.– N 4.– С. 21–26. 52. Завалишина, Л.Э. Исследование НЕR2– статуса рака молочной железы. Методические аспекты. / Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, А.А. Рязанцева, Г.А. Франк // Арх. патол. – 2011.– N 1.– С. 51–54. 53. Завалишина, Л.Э. Методические рекомендации по проведению НЕR2 тестирования рака молочной железы. / Л.Э. Завалишина, А.А. Рязанцева, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Арх. патол. – 2011.– N 2 (Приложение). – С. 38. 54. Завалишина, Л.Э. Сравнительное иммуногистохимическое исследование her–2 статуса рака молочной железы с помощью стандартного набора "HERCEPTEST" и антител к с–егbВ–2. / Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, М.В. Батева, Г.А. Франк // Арх. патол. – 2008.– N 2.– С. 25–27. 55. Завалишина, Л.Э. Сравнительное исследование определения Her–2– статуса при раке молочной железы методами флюоресцентной и хромогенной in 283 situ гибридизации. / Л.Э. Завалишина, А.А. Рязанцева, М.В. Батева и др. // Арх. патол. – 2008.– N 3.– С. 9–11. 56. Захарычев, В.Д. Целенаправленная терапия молекулярного действия при немелкоклеточном раке легкого. / В.Д. Захарычев, // Онкология, 2010. – N 1. – С. 22–25. 57. Зенит–Журавлева, Е.Г. Ингибирование роста меланомы b16/f10 дикарбамином, обусловленное его способностью регулировать содержание маркеров пролиферации ki–67, в23/нуклеофоэмина и с23/нуклеолина. / Е.Г. Зенит–Журавлева, Л.А. Седакова, Н.Т. Райхлин и др. // Вестник РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. – 2013. – N 3.– С. 17–22. 58. Иванцов, А.О. Особенности экспрессии молекулярно–биологических маркеров пролиферации и апоптоза у больных раком легкого с мутацией рецептора эпидермального фактора роста. / А.О. Иванцов, Е.Н. Имянитов, В.М. Моисеенко, Д.Е. Мацко // Арх. патол. – 2009.– N 6.– С. 9–12. 59. Имянитов, Е.Н. Ангиогенез как мишень для противоопухолевой терапии. / Е.Н. Имянитов, // Совр. онкол. – 2014. – N 2. – С. 28–33. 60. Имянитов, Е.Н. Спорные аспекты HER2–диагностики. / Е.Н. Имянитов, // Совр. онкол. – 2010. – N 3. – С. 15–19. 61. Имянитов, Е.Н. Онкоген erbb2/her2: от молекулярной к клинической онкологии. / Е.Н. Имянитов, К.П. Хансон, // Вопр. онкол. – 2002. – N 2. – С. 137–145. 62. Казаков, С.П. Исследование основных тканевых маркёров апоптоза и пролиферации, их диагностической эффективности при заболеваниях щитовидной железы. / С.П. Казаков, // Военно–мед. журнал. – 2010.– N 9. – С.73–77. 63. Казачков, Е.Л. Характеристика активности ядрышковых организаторов и генома клеток рака легкого, развившегося у работников плутониевого производства. / Е.Л. Казачков, М.В. Белосохов, // Уральский мед. журн. – 2013. – N 3. – С. 5– 10. 64. Каприн, А.Д. Злокачественные новообразования в России в 2012 году (заболеваемость и смертность). / А.Д. Каприн, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. - М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России, 2014. - 250 с. 65. Климачев В.В. Рак желудка: клиническая морфология, патоморфоз и факторы прогноза. Автореф. дис. д-ра. мед. наук. - Барнаул, 2003. - 44 с. 66. Кобяков, Д.С. Сравнительный анализ пролиферативной активности эпителиальных клеток аденомы и рака толстой кишки.: автореф. дис. ... канд. мед. наук.: 14.00.14 / Кобяков Дмитрий Сергеевич - Томск, 2006. – 25 с. 284 67. Коваленко, В.Л Оценка прогностического значения маркеров пролиферации, межклеточной адгезии и плотности микрососудов при железистом раке легкого. / В.Л Коваленко, С.И. Швец, В.А. Тазалов, Ю.В. Соболева // Дальневост. мед. журн. – 2006.– N 1.– С. 69–73. 68. Коваленко, В.Л Прогностическое значение иммуногистохимического маркера пролиферирующих клеток Ki– 67 при плоскоклеточном раке легкого (проспективное исследование). / В.Л Коваленко, В.А. Тазалов, С.И. Швец, Ю.В. Соболева // Здравоохр. Дальнего Востока. – 2002.– N 1.– С. 27–28. 69. Коган, Е.А. Оценка степени злокачественности плоскоклеточного рака легкого на основе клинико–морфологического, иммуногистохимического и прогностического исследования онкомаркеров. / Е.А. Коган, В.Л. Коваленко, С.И. Швец, Ю.В. Соболева // Вопр. онкол. – 2009. – N 6. – С. 746–750. 70. Коган, Е.А. Соотношение процессов пролиферации, апоптоза, ангиогенеза и метастазирования в различных гистогенетических типах рака легкого (иммуногистохимическое исследование). / Е.А. Коган, С.И. Швец, В.Л Коваленко, Ю.В. Соболева // Арх. патол. – 2004.– N 6.– С. 33–38. 71. Кожемяко, О.В О биологических различиях центрального и периферического плоскоклеточного рака легкого. / О.В Кожемяко, Ю.В. Соболева, // Врач. – 2008.– N 11.– С. 58–60. 72. Козаченко, В.П. Морфологическая характеристика рака эндометрия II стадии. / В.П. Козаченко, М.А. Шабанов, Л.И. Бокина и др. // Росс. биотер. журн. – 2006. – N 2. – С. 58–65. 73. Колбанов, К.И. Современные возможности хирургического лечения больных немелкоклеточным раком легкого I—III стадии. / К.И. Колбанов, А.Х. Трахтенберг, Г.А. Франк и др. // Онкология, 2012. – N 2. – С. 4–11. 74. Колбанов, К.И. Факторы прогноза при хирургическом лечении больных немелкоклеточным раком легкого (обзор литературы). / К.И. Колбанов, // Росс. онкол. журн. – 2011. – N 4. – С. 50–55. 75. Колбанов, К.И. Факторы прогноза, результаты хирургического и комбинированного лечения больных с различными морфологическими типами немелкоклеточного рака легкого. / К.И. Колбанов, А.Х. Трахтенберг, Г.А. Франк и др. // Онкология, 2013. – N 3. – С. 11–16. 76. Колесник, А.П. Влияние Е–кадхерина на прогноз немелкоклеточного рака легкого. / А.П. Колесник, А.И. Шевченко, В.А. Туманский, А.В. Евсеев // Арх. патол. – 2013.– N 5.– С. 30–33. 285 77. Колесник, А.П. Влияние плотности микрососудов в опухоли на прогноз у больных с I–II стадией немелкоклеточного рака лёгкого после проведенного хирургического лечения. / А.П. Колесник, А.И. Шевченко, В.А. Туманский и др. // Вопр. онкол. – 2013. – N 6. – С. 735–739. 78. Колесник, А.П. Оценка n–статуса у больных раком легкого: проблемы и пути решения (обзор литературы). / А.П. Колесник, В.А. Кузьменко, // Клин. онкол. – 2013.– N 2.– С. 20–23. 79. Колотов, К.А. Иммуногистохимические особенности глиальных опухолей головного мозга. / К.А. Колотов, О.В. Машковцев, Б.Н. Бейн // Мед. альманах. – 2012.– N 4. – С. 66–69. 80. Коненков, В.И. Молекулярные маркеры лимфатических и кровеносных сосудов при развитии опухоли и мишени блокирования метастазов. / В.И. Коненков, Ю.И. Бородин, Н.П. Бгатова // Вопр. онкол. – 2011. – N 3. – С. 295–301. 81. Краевский, Н.А. Патологоанатомическая диагностика опухолей человека: Рук-во в 2 томах. Т. 1 // Н.А. Краевский, А.В. Смольянников, Д.С. Саркисов. – М.: Медицина, 1993. – С. 458-505. 82. Кушлинский, Н.Е. Молекулярно–биологические характеристики злокачественных новообразований. / Н.Е. Кушлинский, М.В. Немцова, // Вестник РАМН. – 2014.– N 1.– С. 5–15. 83. Кушлинский, Н.Е. Экспрессия молекулярно–биологических маркеров в остеосаркомах костей. / Н.Е. Кушлинский, А.Н. Махсон, Ю.Н. Соловьев и др. // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. – 2011.– N 2. – С.55–61. 84. Лазарев, А.Ф. Индивидуальный прогноз при лейомиосаркоме тела матки I и II стадии (по критериям FIGO): комбинированная биомолекулярная и клинико– морфологическая модель 10–летней выживаемости. / А.Ф. Лазарев, А.М. Авдалян, // Сиб. онкол. журн. – 2011. – N 5. – С. 29–34. 85. Лазарев, А.Ф. Аргирофильные белки районов ядрышковых организаторов в аденомах с различной степенью дисплазии и аденокарциноме толстой кишки. / А.Ф. Лазарев, Д.С. Кобяков, В.В. Климачев и др. // Арх. патол. – 2010.– N 4.– С. 16–20. 86. Лазарев, А.Ф. Модифицированный метод выявления аргирофильных белков области ядрышкового организатора на парафиновых срезах. / А.Ф. Лазарев, В.М. Брюханов, В.В. Климачев и др. // Морфология. – 2010.– N 5.– С. 65–67. 87. Лазарев, А.Ф. Особенности маркеров ki–67, pcna, р53 и активности неоангиогенеза в прогнозе рака желудка. / А.Ф. Лазарев, И.П. Бобров, В.В. Климачев и 286 др. // Росс. биотер. журн. – 2010. – N 4. – С. 117–122. 88. Лазарев, А.Ф. Активность НАД(Ф)–зависимых дегидрогеназ, рибосомальных белков и развитие микроциркулярного русла в гладкомышечных опухолях матки: клинико–морфологические параллели и дифференциальная диагностика. / А.Ф. Лазарев, А.М. Авдалян, И.П. Бобров и др. // Сиб. онкол. журн. – 2008. – N 5. – С. 41–45. 89. Лазарев, А.Ф. Количественный анализ аргирофильных белков районов ядрышковых организаторов в аденомах толстой кишки и морфологические критерии риска малигнизации. / А.Ф. Лазарев, В.В. Климачев, Д.С. Кобяков // Росс. журн. гастроэнт., гепатол., колопрокт. – 2006. – N 5. – С. 31–37. 90. Лапина, Т.В. Малый рак легкого: современные тенденции выбора оперативного метода лечения. / Т.В. Лапина, А.А. Вишневский, // Анналы хирургии. – 2008.– N 3.– С.5–9. 91. Лапшина, А.М. Гистологические и иммуногистохимические характеристики АКТГ–секретирующих опухолей. / А.М. Лапшина, И.А. Воронкова, Е.И. Марова // Арх. патол. – 2013.– N 3.– С. 8–13. 92. Лилли, Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия: Пер. с англ. / Р. Лилли. - М.: Мир, 1969. – 845 с. 93. Лисачев, П.Д. Мdm2–зависимая регуляция экспрессии р53 при долговременной потенциации. / П.Д. Лисачев, В.О. Пустыльняк, М.Б. Штарк // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2014.– N 9.– С. 317–319. 94. Лоскутова, К.С. Иммуногистохимическое исследование маркера апоптоза р53 как прогностического фактора при раке молочной железы. / К.С. Лоскутова, М.П. Кириллина, Е.Л. Лушникова, Л.М. Непомнящих // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2014.– N 7.– С. 94–97. 95. Лысенко, О.В. Фактор роста эндотелия сосудов при гиперпластических процессах, полипах, раке эндометрия в различные возрастные периоды. / О.В. Лысенко, // Пробл. репродукции. – 2014. – N 4. – С.15–20. 96. Мационис, А.Э. Исследование численных нарушений генов при раке молочной железы методом мультиплексной лигазозависимой амплификации зондов. / А.Э. Мационис, А.В. Петров, М.З. Горелик, Л.Э. Завалишина // Арх. патол. – 2014.– N 4.– С. 15–17. 97. Мационис, А.Э. Тестирование her2–cтатуca при раке молочной железы иммуноцитохимическим методом. / А.Э. Мационис, И.А. Павленко, А.В. Петров, П.Е. Повилайтите // Арх. патол. – 2012.– N 2.– С. 42–45. 287 98. Мерабишвили, В.М. Статистика рака легкого (заболеваемость, смертность, выживаемость). / В.М. Мерабишвили, О.Т. Дятченко, // Практ. онкология. – 2000. – N 3. – С. 3–7. 99. Меркулов, Г.А. Курс патологогистологической техники. / Г.А. Меркулов. – Л.: Медицина, 1969. – 424 с. 100. Миннебаев, М.М. Современные представления о функционировании лимфатической системы в норме и патологии. / М.М. Миннебаев, Ф.И. Мухутдинова, Д.А. Мухутдинов, Д.Р. Тагирова // Казанский мед. журн. – 2006.– N 1.– С. 43– 47. 101. Наврузов, С.Н. Значение маркерных белков р53, bcl–2, ki–67 в прогнозировании эффективности терапии при остеогенной саркоме трубчатых костей. / С.Н. Наврузов, Д.Ш. Полатова, М.А. Гафур–Ахунов, Х.Г. Абдикаримов // Вопр. онкол. – 2012. – N 5. – С. 691–693. 102. Наврузов, С.Н. Прогнозирование результатов лечения больных колоректальным раком с множественными метастазами в печени. / С.Н. Наврузов, М.С. Гильдиева, С.Б. Абдужаббаров, Х.Д. Исламов // Росс. онкол. журн. – 2010. – N 5. – С. 37–39. 103. Новик, А.А. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза. / А.А. Новик, Т.А. Камилова, В.Н. Цыган. Под общей ред. акад. РАМН Шевченко Ю.Л. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 224 с. 104. Опаленов, К.В. Особенности экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и her–2 клетками рака молочной железы. / К.В. Опаленов, С.В. Колобов, И.Г. Акопян и др. // Арх. патол. – 2004.– N 5.– С. 9–12. 105. Пак, Л.Б. Апоптоз и патология почек. / Л.Б. Пак, А.И. Дубиков, Т.А. Кабанцева и др. // Нефрология. – 2013.– N 4.– С. 36–43. 106. Панкратов, В.А. Экспрессия антигена ki–67 и белка р53 как показателей агрессивности течения плоскоклеточного рака гортани. / В.А. Панкратов, В.П. Тен, Н.А. Горбань // Вопр. онкол. – 2007. – N 6. – С. 668–673. 107. Переводчикова, Н.И. Новое в терапии рака легкого (терапия рака легкого начала XXI века). / Н.И. Переводчикова. - Москва, 2003. - 230 с. 108. Петров, С.Б. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в динамике прогрессирования рака яичника. / С.Б. Петров, И.И. Антонеева, // Онкология, 2008. – N 2. – С. 234–237. 109. Петров, С.В Количественное иммуногистохимическое исследование маркеров клеточного цикла — возможная альтернатива чип–диагностике рака молоч- 288 ной железы. / С.В Петров, Р.Ш. Хасанов, Р.В. Орлова, Г.А. Раскин // Вопр. онкол. – 2007. – N 5. – С. 526–530. 110. Петров, С.В. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / С.В. Петров, Н.Т. Райхлин. – Казань, 2004. – 541 с. 111. Пикин, О.В. Хирургическое лечение больных немелкоклеточным раком легкого с резектабельными отдаленными метастазами. / О.В. Пикин, А.Х. Трахтенберг, В.А. Глушко и др. // Онкология, 2014. – N 4. – С. 11–18. 112. Пирс, Э. Гистохимия: Пер. с англ. / Э. Пирс. - М.: Издательство иностранной литературы, 1962.- 964 с. 113. Плосконос, М. Экспрессия белков, контролирующих апоптоз, у больных раком предстательной железы. / М. Плосконос, А.А. Николаев, // Пробл. репродукции. – 2013. – N 6. – С.14–17. 114. Поддубная, И.В. Изучение биологических особенностей карциносаркомы матки. / И.В. Поддубная, К.М. Пожарисский, Л.Е. Ротобельская и др. // Вопр. онкол. – 2009. – N 6. – С. 751–756. 115. Попов, А.В. Лимфодиссекция в хирургическом лечении немелкоклеточного рака легкого. / А.В. Попов, Е.В. Левченко, А.А. Тришин, В.А. Шутов // Росс. онкол. журн. – 2005. – N 1. – С. 18–23. 116. Пржияловская, Е.Г. Прогностическое значение экспрессии Ki–67, CD31 и VEGF в соматотропиномах. / Е.Г. Пржияловская, А.Ю. Абросимов, А.Ю. Григорьев и др. // Арх. патол. – 2010. – N 1. – с. 35–38. 117. Райхлин, Н.Т. Пролиферативная активность, степень злокачественности и прогноз при карциноидных опухолях легких. / Н.Т. Райхлин, И.А. Букаева, Е.А. Смирнова и др. // Вестник РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. – 2012. – N 4.– С. 17–23. 118. Райхлин, Н.Т. Значение оценки пролиферативного потенциала (соотношение количества пролиферирующих клеток и длительности митотического цикла) в определении степени злокачественности и прогноза при адренокортикальном раке. / Н.Т. Райхлин, И.А. Букаева, А.В. Филимонюк и др. // Арх. патол. – 2011.– N 5.– С. 43–47. 119. Райхлин, Н.Т. Прогностическое значение исследования степени экспрессии аргирофильных белков областей ядрышковых организаторов на примере папиллярного рака щитовидной железы. / Н.Т. Райхлин, И.А. Букаева, Е.А. Смирнова и др. // Арх. патол. – 2010.– N 4.– С. 49–52. 120. Райхлин, Н.Т. Значение экспрессии ядрышковых аргирофильных белков и антигена Ki–67 в определении пролиферативной активности клеток и прогноза 289 "малого" (Т1) рака легкого. / Н.Т. Райхлин, И.А. Букаева, Е.А. Смирнова и др. // Арх. патол. – 2008.– N 3.– С. 15–18. 121. Райхлин, Н.Т. Аргирофильные белки областей ядрышковых организаторов – маркеры скорости клеточной пролиферации. / Н.Т. Райхлин, И.А. Букаева, Н.А. Пробатова, Е.А. Смирнова // Арх. патол. – 2006.– N 3.– С. 47–51. 122. Райхлин, Н.Т. Экспрессия аргирофильных белков областей ядрышкового организатора как показатель степени зрелости доброкачественных и злокачественных опухолей надпочечника. / Н.Т. Райхлин, И.А. Букаева, А.А. Баронин и др. // Арх. патол. – 2002.– N 3.– С. 26–30. 123. Райхлин, Н.Т. Значение аргирофильных белков области ядрышковых организаторов в формировании опухолевого фенотипа неходжкинских злокачественных лимфом, их дифференциальной диагностике и в определении прогноза. / Н.Т. Райхлин, Н. Пробатова, И.А. Букаева // Гемат. и трансфуз. – 2000.– N 3.– С. 52–55. 124. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. / О.Ю. Реброва. – М.: МедиаСфера, 2002. – 437 с. 125. Рябчикова, Е.И. Особенности экспрессии онкоассоциированных белков при paкe легкого. / Е.И. Рябчикова, Н.В. Чердынцева, Е.М. Малкова и др. // Пульмонология. – 2003. – N 3. – С. 59–61. 126. Сапожников, А.Г. Гистологическая и микроскопическая техника. Руководство. / А.Г. Сапожников, А.Е. Доросевич. - Смоленск: «САУ», 2000.- 476 с. 127. Саркисов, Д.С. Микроскопическая техника. Руководство. / Д.С. Саркисов, Ю.Л. Перов. - М.: Медицина, 1996. – 544 с. 128. Смирнова, Е.А. Значение аргирофильных белков областей ядрышковых организаторов как маркеров степени злокачественности анапластической крупноклеточной лимфомы и лимфомы ходжкина. / Е.А. Смирнова, Н.Т. Райхлин, Н.Н. Тупицин и др. // Арх. патол. – 2004.– N 5.– С. 30–34. 129. Соболева, Ю.В. Некоторые биологические различия центральной и периферической форм плоскоклеточного рака легкого. / Ю.В. Соболева, О.В. Кожемяко, // Дальневост. мед. журн. – 2008.– N 3.– С. 47–48. 130. Соболева, Ю.В. Сравнительный анализ взаимодействия процессов пролиферации, апоптоза и межклеточной адгезии при центральном и периферическом плоскоклеточном раке легкого. / Ю.В. Соболева, // Тихоок. мед. журнал. – 2009. – N 1. – С. 61–62. 131. Сокуренко, В.П. Скрытая прогностическая неоднородность онкологиче- 290 ских больных. / В.П. Сокуренко, Л.П. Екимова, А.Н. Шутко и др. // Вопр. онкол. – 2008. – N 4. – С. 480–482. 132. Стариков, В.И. Роль молекулярных маркеров в диагностике распространенности рака легкого и прогностическое значение опухолевых клеток в костном мозге. / В.И. Стариков, А.С. Ходак, В.И. Белый // Онкология, 2010. – N 2. – С. 133– 136. 133. Тарасова, М.В. Пролиферативные свойства и регуляторы фаз митотического цикла клеток аденокарциномы предстательной железы. / М.В. Тарасова, К.М. Пожарисский, В.П. Тен и др. // Арх. патол. – 2009.– N 6.– С. 20–23. 134. Трахтенберг, А.Х. Хирургическое лечение больных немелкоклеточным раком лёгкого. / А.Х. Трахтенберг, К.И. Колбанов, О.В. Пикин // Туберкулез и болезни легких. – 2010.– N 12. – С. 12–20. 135. Уханова, Е.М. Экспрессия маркеров пролиферации ki–67, с23 нуклеолина и в23/нуклеофозмина в ксенографтах рака легкого человека с разной скоростью роста и чувствительностью к химиотерапии у иммунодефицитных мышей. / Е.М. Уханова, С.Ш. Каршиева, Е.Г. Зенит–Журавлева и др. // Вестник РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. – 2013. – N 3.– С. 23–28. 136. Франк, Г.А. Морфологическое исследование her2–cтатусa рака молочной железы и желудка. Методические рекомендации и атлас. / Г.А. Франк, Л.Э. Завалишина, Н.В. Данилова, Ю.Ю. Андреева // Арх. патол. – 2013.– N2 (выпуск 2). – С. 63. 137. Франк, Г.А. 10 лет тестирования НЕR2–статуса рака молочной железы в России. / Г.А. Франк, Ю.Ю. Андреева, И.Ю. Виноградов и др. // Арх. патол. – 2012.– N 5.– С. 3–6. 138. Хабаров, Ю.А. Использование математического моделирования для раннего прогнозирования исходов у больных, оперированных по поводу немелкоклеточного рака легкого. / Ю.А. Хабаров, // Военно–мед. журнал. – 2010.– N 3. – С.69– 70. 139. Франк, Г.А. Сравнительное исследование определения НЕR2–статуса рака молочной железы методами иммуногистохимии и in situ гибридизации. / Г.А. Франк, Ю.Ю. Андреева, Л.Э. Завалишина и др. // Совр. онкол. – 2009. – N 2. – С. 6– 9. 140. Франк, Г.А. Сравнительное исследование определения НЕR2–статуса рака молочной железы методами иммуногистохимии и in situ гибридизации. / Г.А. Франк, Ю.Ю. Андреева, Л.Э. Завалишина и др. // Совр. онкол. – 2007. – N 2. – С. 32–36. 291 141. Халафян, А.А. SТАТISТIСА 6. Статистический анализ данных. 3-е изд. / А.А. Халафян. - М.: 000 «Бином-Пресс», 2007 г. — 512 с. 142. Харченко, Е.П. Некоторые иммунологические аспекты канцерогенеза. / Е.П. Харченко, // Онкология, 2013. – N 5. – С. 70–74. 143. Хлебникова, А.Н. Особенности ангиогенеза в очагах базально– клеточного рака кожи. / А.Н. Хлебникова, Н.В. Новоселова, // Вестник дерматол.и венерол. – 2014.–N 3.– С. 60–64. 144. Шацева, Т.А Антиген Ki–67 в оценке опухолевой пролиферации. Его структура и функция. / Т.А Шацева, М.С. Мухина, // Вопр. онкол. – 2004. – Т. 50, N 2. – С. 157–164. 145. Шикеева, А.А. Аллельные нарушения у пациентов немелкоклеточным раком легкого. / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина и др. // Арх. патол. – 2013.– N 2.– С. 3–8. 146. Шикеева, А.А. Аллельные нарушения у пациентов немелкоклеточным раком легкого. / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина и др. // Арх. патол. – 2013.– N 2.– С. 3–8. 147. Шикеева, А.А. Молекулярно–генетические аспекты немелкоклеточного рака легкого. / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина и др. // Онкология, 2013. – N 5. – С. 56–61. 148. Шикеева, А.А. Эпигенетические изменения при немелкоклеточном раке легкого. / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина и др. // Онкология, 2013. – N 5. – С. 19–25. 149. Шляхтунов, Е.А. Молекулярно–генетическая диагностика некоторых злокачественных солидных опухолей. / Е.А. Шляхтунов, В.М. Семенов, // Новости хирургии. – 2014.– N 4. – С. 481–487. 150. Юрин, А.Г. Анализ выживаемости больных и модели прогноза при неметастатическом светлоклеточном раке почек. / А.Г. Юрин, Б.Г. Ковальский, // Арх. патол. – 2009. – N 6. – с. 15–20. 151. Юрин, А.Г. Математическое моделирование для определения прогноза при раке почек. / А.Г. Юрин, // Арх. патол. – 2009. – N 6. – с. 49–55. 152. Юрин, А.Г. Неметастатический светлоклеточный рак почек: прогностическая значимость морфометрических и биомолекулярных факторов. / А.Г. Юрин, // Вопр. онкол. – 2009. – N 2. – С. 177–182. 153. Abboud, P. Prognostic value of a proliferation index including MIB1 and argyrophilic nucleolar organizer regions proteins in node-negative breast cancer. / P. Abboud, 292 M. Lorenzato, D. Joly et al. // Am J Obstet Gynecol. - 2010. - Vol. 5, N 10. - P. 1536– 1543. 154. Abe, S. Nucleolar organiser regions as a marker of growth rate in squamous cell carcinoma of the lung. / S. Abe, N. Sukoh, S. Ogura et al. // Thorax. - 2011. - Vol. 458, N 3. - P. 331–340. 155. Acehan, D. Three-dimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. / D. Acehan, X. Jiang, D.G. Morgan et al. // Mol Cell. - 1997. - Vol. 111, N 1. - P. 110–114. 156. Ahn, H.K. Clinical significance of Ki-67 and p53 expression in curatively resected non-small cell lung cancer. / H.K. Ahn, M. Jung, S.Y. Ha et al. // Tumour Biol. 1997. - Vol. 15, N 6. - P. 2456–2466. 157. Ahrendt, S.A. p53mutations and survival in stage I non-small cell lung cancer: results of a prospective study. / S.A. Ahrendt, Y. Hu, M. Buta et al. // J Natl Cancer Inst. - 2003. - Vol. 97, N 2. - P. 457–464. 158. Akcerman, S. Surgical pathology. / S. Akcerman. – Mosby On Line, 1995. – 1200 р. 159. Akita, K. p185(HER-2/neu) and p21(CIP1/WAF1) expression in primary tumors and lymph node metastases in non-small cell lung cancer. / K. Akita, H. Inagaki, S. Sato et al. // Jpn J Cancer Res. - 2004. - Vol. 204, N 1. - P. 101–109. 160. al Moustafa, A.E. Expression of P185erbB-2, P160erbB-3, P180erbB-4, and heregulin alpha in human normal bronchial epithelial and lung cancer cell lines. / A.E. al Moustafa, M. Alaoui-Jamali, J. Paterson, M. O'Connor-McCourt // Anticancer Res. 2004. - Vol. 49. - P. 256–261. 161. Aleric, I. HER-2/neu oncogene and estrogen receptor expression in non small cell lung cancer patients. / I. Aleric, J.J. Razumovic, B. Koprivica // Med Pregl. - 2010. Vol. 67, N 3. - P. 355–360. 162. Alitalo, A. Interaction of tumor cells and lymphatic vessels in cancer progression. / A. Alitalo, M. Detmar // Oncogene. - 2010. - Vol. 5, N 1. - P. 17–22. 163. Allen, J.W. Quality of surgical resection for nonsmall cell lung cancer in a US metropolitan area. / J.W. Allen, A. Farooq, T.F. O'Brien, R.U. Osarogiagbon // Cancer. 2014. - Vol. 14. - P. 23. 164. Al-Saad, S. Clinical significance of epidermal growth factor receptors in nonsmall cell lung cancer and a prognostic role for HER2 gene copy number in female patients. / S. Al-Saad, K. Al-Shibli, T. Donnem et al. // J Thorac Oncol. - 1994. - Vol. 16, N 3. - P. 211–218. 293 165. Anagnostou, V.K. Multiplexed analysis of angiogenesis and lymphangiogenesis factors predicts outcome for non-small cell lung cancer patients. / V.K. Anagnostou, D.G. Tiniakos, M. Fotinou et al. // Virchows Arch. - 1994. - Vol. 140, N 1. - P. 107–108. 166. Antonangelo, L. Morphometric evaluation of argyrophilic nucleolar organizer region is useful in predicting long-term survival in squamous cell carcinoma of the lung. / L. Antonangelo, Fdel.C.. Bernardi, V.L. Capelozzi et al. // Chest. - 2012. - 594512 [Epub]. 167. Apolinario, R.M. Prognostic value of the expression of p53, bcl-2, and bax oncoproteins, and neovascularization in patients with radically resected non-small-cell lung cancer. / R.M. Apolinario, P. van der Valk, J.S. de Jong et al. // J Clin Oncol. - 2002. Vol. 50, N 1. - P. 55–58. 168. Arinaga, M. Clinical significance of vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with nonsmall cell lung carcinoma. / M. Arinaga, T. Noguchi, S. Takeno et al. // Cancer. - 1999. - Vol. 195, N 4. - P. 219–229. 169. Au, N.H. Evaluation of immunohistochemical markers in non-small cell lung cancer by unsuper-vised hierarchical clustering analysis: a tissue microarray study of 284 cases and 18 markers. / N.H. Au, M. Cheang, D.G. Huntsman et al. // J Pathol. - 2000. Vol. 7, N 3. - P. 14. 170. Aubele, M. Guidelines of AgNOR quantitation. / M. Aubele, S. Bieterferd, M. Derenzini et al. // Zentralbl Pathol. - 2005. - Vol. 49, N 3. - P. 371–376. 171. Aubele, M. Prognostic value of quantitatively measured AgNORs in ductal mammary carcinoma. / M. Aubele, G. Auer, U. Jütting et al. // Anal Quant Cytol Histol. 1997. - Vol. 19, N 2. - P. 139–144. 172. Avdalyan, A. Prognostic Value of Microvessel Density in Tumor and Peritumoral Area as Evaluated by CD31 Protein Expression and Argyrophilic Nucleolar Organizer Region Count in Endothelial Cells in Uterine Leiomyosarcoma. / A. Avdalyan, A. Lazarev, I. Bobrov, V. Klimatchev // Sarcoma. - 2012. - Vol. 47, N 3. - P. 237–242. 173. Bakir, K. Prognostic factors and c-erbB-2 expression in non-small-cell lung carcinoma (c-erbB-2 in non-small cell lung carcinoma). / K. Bakir, R. Uçak, B. Tunçözgür, L. Elbeyli // Thorac Cardiovasc Surg. - 2012. - Vol. 31, N 42. - P. 4499– 4508. 174. Bànkfalvi, A. Standardized in situ AgNOR analysis in breast pathology: diagnostic and cell kinetic implications. / A. Bànkfalvi, D. Ofner, K.W. Schmid et al. // Pathol Res Pract. - 2006. - Vol. 8, N 6. - P. 216. 294 175. Beecken, W.D. Tumorangiogenese und Antiangiogenese therapie maligner Tumore. / W.D. Beecken, Y. Shing // Urol und Urogyn. - 2003. - Vol. 29, N 8. - P. 654– 657. 176. Bellotti, M. Morphometric determination of AgNORs in breast carcinoma. Correlation with flow cytometry and proliferating cell nuclear antigen. / M. Bellotti, B. Elsner, A. Kahn et al. // Anal Quant Cytol Histol. - 2014. - Vol. 190, N 7. - P. 676–685. 177. Berardi, R. Perioperative anemia and blood transfusions as prognostic factors in patients undergoing resection for non-small cell lung cancer. / R. Berardi, A. Brunelli, T. Tamburrano et al. // Lung Cancer. - 2013. - Vol. 52, N 6. - P. 1189–1194. 178. Beresford, M.J. Measuring proliferation in breast cancer: practicalities and applications. / M.J. Beresford, G.D. Wilson, A. Makris // Breast Cancer Res. - 1999. - Vol. 162, N 1. - P. 63–68. 179. Berghoff, A.S. Prognostic significance of Ki67 proliferation index, HIF1 alpha index and microvascular density in patients with non-small cell lung cancer brain metastases. / A.S. Berghoff, A. Ilhan-Mutlu, A. Wöhrer et al. // Strahlenther Onkol. - 1997. Vol. 10, N 10. - P. 992–1000. 180. Bergman, P. Validation of the 7th TNM classification for non-small cell lung cancer: a retrospective analysis on prognostic implications for operated node-negative cases. / P. Bergman, D. Brodin, R. Lewensohn, L. de Petris // Acta Oncol. - 1999. - Vol. 19, N 1. - P. 481–486. 181. Bernardi, F.D. A prognostic model of survival in surgically resected squamous cell carcinoma of the lung using clinical, pathologic, and biologic markers. / F.D. Bernardi, L. Antonângelo, R. Beyruti et al. // Mod Pathol. - 2001. - Vol. 438, N 5. - P. 478– 484. 182. Biesterfeld, S. Improvement of breast cancer prognostication using cell kinetic-based silver-stainable nucleolar organizer region quantification of the MIB-1 positive tumor cell compartment. / S. Biesterfeld, F. Farokhzad, D. Klüppel et al. // Virchows Arch. - 1996. - Vol. 11, N 3. - P. 183–198. 183. Bigras, G. Interest of targeting AgNORs measurement in cycling cells: in vivo cell kinetic evaluation of non-small cell lung cancer. / G. Bigras, R. Marcelpoil, E. Brambilla, G. Brugal // Anal Cell Pathol. - 2014. - Vol. 35, N 6. - P. 5735–5740. 184. Boldy, D.A. Interphase nucleolar organiser regions and survival in squamous cell carcinoma of the bronchus: a 10 year follow up study of 138 cases. / D.A. Boldy, J.G. Ayres, J. Crocker et al. // Thorax. - 1991. - Vol. 46, N 12. - P. 871–877. 185. Brambilla, E. p53 mutant immunophenotype and deregulation of p53 transcrip- 295 tion pathway (Bcl2, Bax, and Waf1) in precursor bronchial lesions of lung cancer. / E. Brambilla, S. Gazzeri, S. Lantuejoul et al. // Clin Cancer Res. - 1998. - Vol. 4, N 7. - P. 1609–1618. 186. Breiteneder-Geleff, S. Angiosarcomas ex-press mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. / S. Breiteneder-Geleff, A. Soleiman, H. Kowalski et al. // Am J Pathol. - 1999. Vol. 154, N 2. - P. 385–394. 187. Breuer, R.H. Suprabasal p53 immunostaining in premalignant endobronchial lesions in combination with histology is associated with bronchial cancer. / R.H. Breuer, P.J. Snijders, T.G. Sutedja et al. // Lung Cancer. - 2003. - Vol. 40, N 2. - P. 165–172. 188. Brown, D.C. Ki67 protein: the immaculate deception?. / D.C. Brown, K.C. Gatter // Histopathology. - 2002. - Vol. 43, N 4. - P. 539–544 . 189. Bubb, R.S. Association of Ki-67, p53, and Bcl-2 expression of the primary non-small cell lung cancer lesion with brain metastatic lesion. / R.S. Bubb, R. Komaki, T. Hachiya et al. // Int J Radiat Oncol Biol Phys. - 2002. - Vol. 40, N 1. - P. 2–11. 190. Bubendorf, L. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. / L. Bubendorf, A. Nocito, H. Moch et al. // J Pathol. - 2002. - Vol. 53, N 5. - P. 1216–1224. 191. Bullwinkel, J. Ki-67 protein is associated with ribosomal RNA transcription in quiescent and proliferating cells. / J. Bullwinkel, B. Baron-Luhr, A. Ludemann et al. // J Cell Physiol. - 2001. - Vol. 195, N 1. - P. 72–79. 192. Buttitta, F. Mutational analysis of the HER2 gene in lung tumors from Caucasian patients: mutations are mainly present in adenocarcinomas with bronchioloalveolar features. / F. Buttitta, F. Barassi, G. Fresu et al. // Int J Cancer. - 2006. - Vol. 206, N 3. P. 624–635. 193. Caie, P.D. Quantification of tumour budding, lymphatic vessel density and invasion through image analysis in colorectal cancer. / P.D. Caie, A.K. Turnbull, S.M. Farrington et al. // J Transl Med. - 2006. - Vol. 119, N 11. - P. 2586–2591. 194. Caldarella, A. Gender differences in non-small cell lung cancer: a population study. / A. Caldarella, E. Crocetti, C.E. Comin et al. // Eur J Surg Oncol. - 2014. - Vol. 12. - P. 156. 195. Calikusu, Z. Prognostic significance of the C-erbB-2 expression in turkish nonsmall cell lung cancer patients. / Z. Calikusu, Y. Yildirim, Z. Akcali et al. // Asian Pac J Cancer Prev. - 2007. - Vol. 33, N 6. - P. 763–768. 196. Canet, V. Correlation between silver-stained nucleolar organizer region area 296 and cell cycle time. / V. Canet, M. Montmasson, Y. Usson et al. // Cytometry. - 2009. Vol. 10, N 3. - P. 479–482. 197. Cappuzzo, F. Increased HER2 gene copy number is associated with response to gefitinib therapy in epidermal growth factor receptor-positive non-small-cell lung cancer patients. / F. Cappuzzo, M. Varella-Garcia, H. Shigematsu et al. // J Clin Oncol. 2001. - Vol. 43, N 2. - P. 110–116. 198. Cappuzzo, F. p95HER2 truncated form in resected non-small cell lung cancer. / F. Cappuzzo, Y.G. Cho, A. Sacconi et al. // J Thorac Oncol. - 2005. - Vol. 23, N 22. - P. 5007–5018. 199. Carbognani, P. Biological markers in non-small cell lung cancer. Retrospective study of 10 year follow-up after surgery. / P. Carbognani, G. Tincani, P. Crafa et al. // J Cardiovasc Surg (Torino). - 2012. - Vol. 7, N 3. - P. 520–527. 200. Carvalho, P.E. Useful prognostic panel markers to express the biological tumor status in resected lung adenocarcinomas. / P.E. Carvalho, L. Antonãngelo, F.D. Bernardi et al. // Jpn J Clin Oncol. - 2002. - Vol. 43, N 4. - P. 545–548. 201. Cemerikić-Martinović, V. Correlations between mitotic and apoptotic indices, number of interphase NORs, and histological grading in squamous cell lung cancer. / V. Cemerikić-Martinović, D. Trpinac, M. Ercegovac // Microsc Res Tech. - 2006. - Vol. 14, N 3. - P. 314–323. 202. Ceppi, P. Excision repair cross complementing-1 and topoisomerase IIalpha gene expression in small-cell lung cancer patients treated with platinum and etoposide: a retrospective study. / P. Ceppi, M. Longo, M. Volante et al. // J Thorac Oncol. - 2000. Vol. 30, N 11. - P. 478–486. 203. Chang, C. RNAi analysis reveals an unexpected role for topoisomerase II in chromosome arm congression to a metaphase plate. / C. Chang, S. Goulding, W. Ernshawn, M. Carmena // J Cell Scien. - 2003. - Vol. 95, N 13. - P. 961–970. 204. Chansky, K. The International Association for the Study of Lung Cancer Staging Project: prognostic factors and pathologic TNM stage in surgically managed nonsmall cell lung cancer. / K. Chansky, J.P. Sculier, J.J. Crowley et al. // J Thorac Oncol. 1998. - Vol. 40, N 5. - P. 408–417. 205. Chen, B. The prognostic implications of microvascular density and lymphatic vessel density in esophageal squamous cell carcinoma: Comparative analysis between the traditional whole sections and the tissue microarray. / B. Chen, W.K. Fang, Z.Y. Wu et al. // Acta Histochem. - 2008. - Vol. 3, N 6. - P. 583–589. 206. Chen, F. Flt-4-positive endothelial cell density and its clinical significance in 297 non-small cell lung cancer. / F. Chen, K. Takenaka, E. Ogawa et al. // Clin Cancer Res. 2003. - Vol. 116, N 23. - P. 4715–4726. 207. Chen, X. Increased IL-17-producing cells correlate with poor survival and lymphangiogenesis in NSCLC patients. / X. Chen, J. Wan, J. Liu et al. // Lung Cancer. 2009. - Vol. 4, N 7. - P. 792–801. 208. Chen, Y.Y. Lymphovascular space invasion and tumor differentiation are predictors for postoperative recurrence in patients with pathological stage I nonsmall cell lung cancer. / Y.Y. Chen, T.W. Huang, W.C. Tsai et al. // J Chin Med Assoc. - 2014. Vol. 116, N 4. - P. 646–653. 209. Cheng, L. Molecular pathology of lung cancer: key to personalized medicine. / L. Cheng, R.E. Alexander, G.T. Maclennan et al. // Mod Pathol. - 2004. - Vol. 10, N 24. P. 8548–8553. 210. Chipuk, J.E. Direct activation of Bax by p53 mediates mitochondrial membrane permeabilization and apoptosis. / J.E. Chipuk, T. Kuwana, L. Bouchier-Hayes et al. // Science. - 2010. - Vol. 69, N 3. - P. 348–354. 211. Choi, P.J. Prognosis of recurrence after complete resection in early-stage nonsmall cell lung cancer. / P.J. Choi, S.S. Jeong, S.S. Yoon // Korean J Thorac Cardiovasc Surg. - 2000. - Vol. 31, N 2. - P. 127–131. 212. Christiansen, A. Lymphangiogenesis and cancer. / A. Christiansen, M. Detmar // Genes Cancer. - 1998. - Vol. 2, N 4. - P. 261–270. 213. Cohen, L. Epithelial cell proliferation contributes to airway remodeling in severe asthma. / L. Cohen, X. E, J. Tarsi et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 2014. - Vol. 77, N 8. - P. 416–421. 214. Coleman, M.P. Cancer survival in Australia, Canada, Denmark, Norway, Sweden, and the UK, 1995-2007 (the International Cancer Benchmarking Partnership): an analysis of population-based cancer registry data. / M.P. Coleman, D. Forman, H. Bryant et al. // Lancet. - 2012. - Vol. 25, N 3. - P. 347–369. 215. Cooper, W.A. Molecular biology of lung cancer. / W.A. Cooper, D.C.L. Lam, S.A. O’Toole, J.D. Minna // J Thorac Dis. - 2009. - Vol. 28. - P. 21. 216. Cox, G. A biological staging model for operable non-small cell lung cancer. / G. Cox, J.L. Jones, A. Andi et al. // Thorax. - 2004. - Vol. 303, N 5660. - P. 1010–1014. 217. Dai, C.H. Molecular diagnosis and prognostic significance of lymph node micrometastasis in patients with histologically node-negative non-small cell lung cancer. / C.H. Dai, J. Li, L.C. Yu et al. // Tumour Biol. - 2013. - Vol. 46, N 6. - P. 449–456. 218. Darling, G.E. Number of lymph nodes harvested from a mediastinal lymphad- 298 enectomy: results of the randomized, prospective American College of Surgeons Oncology Group Z0030 trial. / G.E. Darling, M.S. Allen, P.A. Decker et al. // Chest. - 2011. Vol. 2, N 12. - P. 1146–1158. 219. David, E. Visceral pleural invasion is not predictive of survival in patients with lung cancer and smaller tumor size. / E. David, P.F. Thall, N. Kalhor et al. // Ann Thorac Surg. - 2007. - Vol. 176, N 2. - P. 138–145. 220. David, O. Phospho-Akt overexpression in non-small cell lung cancer confers significant stage-independent survival disadvantage. / O. David, J. Jett, H. LeBeau et al. // Clin Cancer Res. - 2011. - Vol. 377, N 9760. - P. 127–138. 221. Davidson, M.R. The pivotal role of pathology in the management of lung cancer. / M.R. Davidson, A.F. Gazdar, B.E. Clarke // J Thorac Dis. - 2007. - Vol. 8. - P. 488– 499. 222. de Graeff, P. Modest effect of p53, EGFR and HER-2/neu on prognosis in epithelial ovarian cancer: a meta-analysis. / P. de Graeff, A.P. Crijns, S. de Jong et al. // Br J Cancer. - 2013. - Vol. 5, N S5. - P. 479–490. 223. Demarchi, L.M. Prognostic values of stromal proportion and PCNA, Ki-67, and p53 proteins in patients with resected adenocarcinoma of the lung. / L.M. Demarchi, M.M. Reis, S.A. Palomino et al. // Mod Pathol. - 2001. - Vol. 56, N 7. - P. 561–566. 224. Derenzini, M. The AgNORs. / M. Derenzini // Micron. - 2014. - Vol. 28, N 3. P. 375–381. 225. Derenzini, М. Interphase Nucleolar Organiser Regions in Tumour Pathology In: Molecular Biology in Cellular Pathology. / M. Derenzini, D. Trere, M. O’Donohue, D. Ploton. Ed. by J. Crocker and P.G. Murray. - J. Wiley&Sons Ltd, 2003. – 137-152 рр. 226. Dingemans, A.C. Topoisomerase IIalpha and other drug resistance markers in advanced non-small cell lung cancer. / A.C. Dingemans, J. van Ark-Otte, S. Span et al. // Lung Cancer. - 2013. - Vol. 34, N 2. - P. 1245–1253. 227. Donizy, P. Intratumoral but not peritumoral lymphatic vessel density measured by D2-40 expression predicts poor outcome in gastric cancer-ROC curve analysis to find cut-off point. / P. Donizy, J. Rudno-Rudzinska, A. Halon et al. // Anticancer Res. - 2011. - Vol. 139, N 5. - P. 1124–1129. 228. Donnem, T. Co-expression of PDGF-B and VEGFR-3 strongly correlates with lymph node metastasis and poor survival in non-small-cell lung cancer. / T. Donnem, S. Al-Saad, K. Al-Shibli et al. // Ann Oncol. - 2013. - Vol. 95, N 6. - P. 1872–1877. 229. Donnem, T. Inverse prognostic impact of angiogenic marker expression in tumor cells versus stromal cells in non small cell lung cancer. / T. Donnem, S. Al-Saad, K. 299 Al-Shibli et al. // Clin Cancer Res. - 2004. - Vol. 10, N 20. - P. 6865–6871. 230. Dowsett, M. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. / M. Dowsett, T.O. Nielsen, R. A’Hern et al. // J Natl Cancer Inst. - 2013. - Vol. 5, N 5. - P. 463–478. 231. Du, Y. The role of topoisomerase IIα in predicting sensitivity to anthracyclines in breast cancer patients: a meta-analysis of published literatures. / Y. Du, Q. Zhou, W. Yin et al. // Breast Cancer Res Treat. - 2009. - Vol. 101, N 1. - P. 149 –159. 232. Duong, T. Tumor lymphangiogenesis as a potential therapeutic target. / T. Duong, P. Koopman, M. Francois // J Oncol. - 2006. - Vol. 82, N 4. - P. 1198–1204. 233. Endl, E. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. / E. Endl, J. Gerdes // Exp Cell Res. - 2013. - Vol. 146, N 3. - P. 580–585. 234. Enholm, B. Adenoviral expression of vascular endothelial growth factor-C induces lymphangiogenesis in the skin. / B. Enholm, T. Karpanen, M. Jeltsch et al. // Circ Res. - 2000. - Vol. 13, N 5. - P. 511–520. 235. Erguden, H.С. The association of topoisomerase 2α expression with prognosis in surgically resected non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. / H.С. Erguden, D. Koksal, F. Demirag et al. // J Thorac Dis. - 2000. - Vol. 31, N 2. - P. 117–120. 236. Evangelou, E. Comparison of the diagnostic accuracy of lymphatic endothelium markers: Bayesian approach. / E. Evangelou, P.A. Kyzas, T.A. Trikalinos // Mod Pathol. - 2007. - Vol. 55, N 2. - P. 195–203. 237. Faoro, L. Lymphatic vessel density is not associated with lymph node metastasis in non-small cell lung carcinoma. / L. Faoro, J.Y. Hutto, R. Salgia et al. // Arch Pathol Lab Med. - 2001. - Vol. 32, N 2. - P. 117–128. 238. Feng, X.L. Overexpression of c-erbB-2 and loss of p16 have molecular diagnostic relevance but no prognostic value in lung cancer. / X.L. Feng, L. Li, Y.N. Gao et al. // Med Oncol. - 2014. - Vol. 34, N 6. - P. 3113–3118. 239. Feng, Y. Expression of VEGF-C and VEGF-D as significant markers for assessment of lymphangiogenesis and lymph node metastasis in non-small cell lung cancer. / Y. Feng, W. Wang, J. Hu et al. // Anat Rec (Hoboken). - 2010. - Vol. 21, N 2. - P. 223– 231. 240. Ferlay, J. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. / J. Ferlay, H.R. Shin, F. Bray et al. // Int J Cancer . - 2007. - Vol. 13, N 22. - P. 6649–6657. 241. Fibla, J.J. Re-evaluation of the prognostic value of visceral pleura invasion in Stage IB non-small cell lung cancer using the prospective multicenter ACOSOG Z0030 300 trial data set. / J.J. Fibla, S.D. Cassivi, A. Brunelli et al. // Lung Cancer. - 2011. - Vol. 103, N 22. - P. 1656–1664. 242. Fisseler-Eckhoff, A. AgNOR counts in preneoplastic lesions of the bronchus. / A. Fisseler-Eckhoff, T. Becker, H. Sudhoff, K.M. Müller // Pathol Res Pract. - 2006. Vol. 131, N 5. - P. 1014–1020. 243. Fjellbirkeland, L. Integrin alphavbeta8-mediated activation of transforming growth factor-beta inhibits human airway epithelial proliferation in intact bronchial tissue. / L. Fjellbirkeland, S. Cambier, V.C. Broaddus et al. // Am J Pathol. - 2011. - Vol. 129, N 3. - P. 839–848. 244. Folkman, J. Angiogenesis and breast cancer. / J. Folkman // J Clin Oncol. 2007. - Vol. 15, N 1. - P. 31–37. 245. Fontanini, G. Modulation of neoangiogenesis in bronchial preneoplastic lesions. / G. Fontanini, A. Calcinai, L. Boldrini et al. // Oncol Rep. - 2012. - 204946 [Epub]. 246. Fontanini, G. Neoangiogenesis: a putative marker of malignancy in non-smallcell lung cancer (NSCLC) development. / G. Fontanini, S. Vignati, D. Bigini et al. // Int J Cancer. - 2000. - Vol. 257, N 2. - P. 231–237. 247. Fujita, Y. The diagnostic and prognostic relevance of human telomerase reverse transcriptase mRNA expression detected in situ in patients with nonsmall cell lung carcinoma. / Y. Fujita, T. Fujikane, S. Fujiuchi et al. // Cancer. - 2001. - Vol. 88, N 6. - P. 623–629. 248. Fukumoto, K. The preoperative plasma D-dimer level is an independent prognostic factor in patients with completely resected non-small cell lung cancer. / K. Fukumoto, T. Taniguchi, N. Usami et al. // Surg Today. - 2012. - Vol. 4, N 4. - P. 4352–4357. 249. Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. / D. Fukumura, D.G. Duda, L.L. Munn, R.K. Jain // Microcirculation. - 2013. - Vol. 146, N 4. - P. 788–795. 250. Funaki, S. Significance of tumour vessel invasion in deter-mining the morphology of isolated tumour cells in the pulmonary vein in non-small-cell lung cancer. / S. Funaki, N. Sawabata, A. Abulaiti et al. // Eur J Cardiothorac Surg. - 2005. - Vol. 18, N 11. - P. 1490–1497. 251. Gasinska, A. Clinical significance of biological differences between cavitated and solid form of squamous cell lung cancer. / A. Gasinska, L. Kolodziejski, J. Niemiec et al. // Lung Cancer. - 2008. - Vol. 132, N 12. - P. 1882–1888. 252. Gessner, C. BAX and p16INK4A are independent positive prognostic markers 301 for advanced tumour stage of nonsmall cell lung cancer. / C. Gessner, U. Liebers, H. Kuhn et al. // Eur Respir J. - 2011. - Vol. 28, N 1. - P. 336–341. 253. Giaccone, G. Differential expression of DNA topoisomerases in non-small cell lung cancer and normal lung. / G. Giaccone, J. van Ark-Otte, G. Scagliotti et al. // Biochim Biophys Acta. - 2010. - Vol. 293, N 5. - P. 802–812. 254. Giuffrè, G. Standardized AgNOR analysis as a prognostic parameter in endometrial carcinoma, endometrioid type. / G. Giuffrè, E. Fulcheri, M. Gualco et al. // Anal Quant Cytol Histol. - 2010. - Vol. 15, N 127. - P. 2893–2917. 255. Goldstraw, P. The IASLC Lung Cancer Staging Project: proposals for the revision of the TNM stage groupings in the forthcoming (seventh) edition of the TNM Classification of malignant tumours. / P. Goldstraw, J. Crowley, K. Chansky et al. // J Thorac Oncol. - 2012. - Vol. 78, N 3. - P. 259–262. 256. Gomez, A.M. Relationship of immunohistochemical biomarker expression and lymph node involvement in patients undergoing surgical treatment of NSCLC with longterm follow-up. / A.M. Gomez, J.R. Jarabo Sarceda, J.A. García-Asenjo et al. // Tumour Biol. - 1994. - Vol. 190, N 4. - P. 389–393. 257. Goodpasture, C. Visualization of nucleolar organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining. / C. Goodpasture, S.E. Bloom // Chromosoma. 2001. - Vol. 34, N 2. - P. 233–241. 258. Gregorc, V. Relevance of p53, bcl-2 and Rb expression on resistance to cisplatin-based chemotherapy in advanced nonsmall cell lung cancer. / V. Gregorc, V. Ludovini, L. Pistola et al. // Lung Cancer . - 1994. - Vol. 12, N 3. - P. 454–466. 259. Gregorc, V. The clinical relevance of Bcl-2, Rb and p53 expression in advanced non-small cell lung cancer. / V. Gregorc, S. Darwish, V. Ludovini et al. // Lung Cancer. - 2003. - Vol. 163, N 2. - P. 533–542. 260. Grob, T.J. Heterogeneity of ERBB2 amplification in adenocarcinoma, squamous cell carcinoma and large cell undifferentiated carcinoma of the lung. / T.J. Grob, I. Kannengiesser, M.C. Tsourlakis et al. // Mod Pathol. - 1999. - Vol. 6, N 4. - P. 813–817. 261. Groeger, A.M. Prognostic value of immunohistochemical expression of p53, bax, Bcl-2 and Bcl-x in resected non-small cell lung cancers. / A.M. Groeger, V. Esposito, A. De Luca et al. // Histopathology . - 1996. - Vol. 67, N 5. - P. 615–619. 262. Grossi, F. Prognostic significance of Kras, p53, bcl-2, PCNA, CD34 in radically resected non-small cell lung cancers. / F. Grossi, M. Loprevite, M. Chiaramondia et al. // Eur J Cancer. - 2003. - Vol. 98, N 5. - P. 1008–1013. 263. Grossi, F. Prognostic stratification of stage IIIA pN2 non-small cell lung can- 302 cer by hierarchical clustering analysis of tissue microarray immunostaining data: an Alpe Adria Thoracic Oncology Multidisciplinary Group study (ATOM 014). / F. Grossi, R. Spizzo, D. Bordo et al. // J Thorac Oncol. - 2014. - [Epub ahead of print]. 264. Gulati, A. Evaluation of AgNORs in pulmonary lesions: a cytohistopathological correlation. / A. Gulati, J. Sharma, B.B. Sharma et al. // Indian J Pathol Microbiol. - 2010. - Vol. 17, N 3. - P. 206–225. 265. Guo, X. Prognostic significance of VEGF-C expression in correlation with COX-2, lymphatic microvessel density, and clinicopathologic characteristics in human non-small cell lung cancer. / X. Guo, Y. Chen, Z. Xu et al. // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). - 2013. - Vol. 43, N 6. - P. 1126–1130. 266. Gupta, M.K. Mechanism and its regulation of tumor-induced angiogenesis. / M.K. Gupta, R.Y. Qin // World J Gastroenterol. - 2004. - Vol. 44, N 2. - P. 97–108. 267. Haga, Y. Ki-67 expression and prognosis for smokers with resected stage I non-small cell lung cancer. / Y. Haga, K. Hiroshima, A. Iyoda et al. // Ann Thorac Surg. 2005. - Vol. 49, N 2. - P. 171–179. 268. Hajra, K.M. Apoptosome dysfunction in human cancer. / K.M. Hajra, J.R. Liu // Apoptosis. - 2006. - Vol. 95, N 12. - P. 1611–1625. 269. Han, H. Prognostic value of immunohistochemical expressions of p53, HER2/neu, and bcl-2 in stage I non-small-cell lung cancer. / H. Han, R.J. Landreneau, T.S. Santucci et al. // Hum Pathol. - 2002. - Vol. 19, N 1. - P. 134–140. 270. Hanaoka, T. Immunohistochemical demonstration of apoptosis-regulated proteins, Bcl-2 and Bax, in resected non-small-cell lung cancers. / T. Hanaoka, J. Nakayama, M. Haniuda, T.A. Sato // Int J Clin Oncol. - 2006. - Vol. 15, N 2. - P. 437–442. 271. Hansen, T.F. Microvessel density and the association with single nucleotide polymorphisms of the vascular endothelial growth factor receptor 2 in patients with colorectal cancer. / T.F. Hansen, F.B.. Sorensen, K.G.. Spindler et al. // Virch Arch. - 1995. Vol. 1264, N 3. - P. 337–346. 272. Hernandez-Verdun, D. The nucleolus: structure/function relationship in RNA metabolism. / D. Hernandez-Verdun, P. Roussel, M. Thiry et al. // Wiley Interdiscip Rev RNA. - 2001. - Vol. 23, N 1. - P. 31–39. 273. Hiroshima, K. Evidence of neoangiogenesis and an increase in the number of proliferating cells within the bronchial epithelium of smokers. / K. Hiroshima, A. Iyoda, K. Shibuya et al. // Cancer. - 2007. - Vol. 2, N 8. - P. 706–714. 274. Hirsch, F.R. Combination of EGFR gene copy number and protein expression predicts outcome for advanced non-small cell lung cancer patients treated with gefitinib. / 303 F.R. Hirsch, M. Varella-Garcia, F. Cappuzzo et al. // Ann Oncol. - 2014. - Vol. 35, N 5. P. 4551–4559. 275. Hirsch, F.R. Evaluation of HER-2/neu gene amplification and protein expression in non-small cell lung carcinomas. / F.R. Hirsch, M. Varella-Garcia, W.A. Franklin et al. // Br J Cancer. - 1975. - Vol. 53, N 1. - P. 37–50. 276. Hirsch, F.R. Predictive value of EGFR and HER2 overexpression in advanced non-small cell lung cancer. / F.R. Hirsch, M. Varella-Garcia, F. Cappuzzo // Oncogene. 2009. - Vol. 4, N 3. - P. 318 –325. 277. Hommura, F. Prognostic significance of p27KIP1 protein and Ki-67 growth fraction in nonsmall cell lung cancers. / F. Hommura, H. Dosaka-Akita, T. Mishina et al. // Clin Cancer Res. - 2003. - Vol. 42, N 3. - P. 275–281. 278. Howell, W.M. Controlled silver staining of nucleolus organiser regions with a protective colloidal developer: a one step method. / W.M. Howell, D.A. Black // Experientia. - 2009. - Vol. 115, N 4. - P. 851–858. 279. Hu, Z. Prognostic value of lymphangiogenesis and lymphatic vessel invasion in non-small cell lung cancer. / Z. Hu, W. Wang, J. Zhang et al. // Zhongguo Fei Ai Za Zhi. - 2003. - Vol. 39, N 1. - P. 41–48. 280. Huang, C. Clinical application of biological markers for treatments of resectable non-small cell lung cancers. / C. Huang, D. Liu, D. Masuya et al. // Br J Cancer. 2012. - Vol. 25, N 12. - P. 1566–1573. 281. Huang, C. Mutations in exon 7 and 8 of p53as poor prognostic factors in patients with non-small cell lung cancer. / C. Huang, T. Taki, M. Adachi et al. // Oncogene. - 2004. - Vol. 44, N 1. - P. 54–63. 282. Huang, L. MET expression plays differing roles in non-small cell lung cancer patients with or without EGFR mutation. / L. Huang, S.J. An, Z.H. Chen et al. // J Thorac Oncol. - 2003. - Vol. 39, N 9. - P. 1242–1250. 283. Hudis, C.A. Trastuzumab–mechanism of action and use in clinical practice. / C.A. Hudis // N Engl J Med. - 2000. - Vol. 256, N 1. - P. 58–66. 284. Hwang, J.H. Apoptosis and bcl-2 expression as predictors of survival in radiation-treated non-small cell lung cancer. / J.H. Hwang, S.C. Lim, Y.C. Kim et al. // Int J Radiat Oncol Biol Phys. - 2010. - Vol. 5, N 9. - P. 1354–1360. 285. Imai, H. l-type amino acid transporter 1 expression is a prognostic marker in patients with surgically resected stage I non-small cell lung cancer. / H. Imai, K. Kaira, N. Oriuchi et al. // Histopathology. - 2002. - Vol. 45, N 3. - P. 289–292. 286. Inoue, M. Clinicopathologic factors influencing postoperative prognosis in pa- 304 tients with small-sized adenocarcinoma of the lung. / M. Inoue, T. Takakuwa, M. Minami et al. // J Thorac Cardiovasc Surg. - 2009. - Vol. 41, N 3. - P. 217–222. 287. Inoue, M. Clinicopathological characteristics and surgical results of lung cancer patients aged up to 50 years: the Japanese Lung Cancer Registry Study 2004. / M. Inoue, M. Okumura, N. Sawabata et al. // Lung Cancer. - 2003. - Vol. 9, N 3. - P. 1144– 1155. 288. Ishida, T. Proliferating cell nuclear antigen expression and argyrophilic nucleolar organizer regions as factors influencing prognosis of surgically treated lung cancer patients. / T. Ishida, S. Kaneko, K. Akazawa et al. // Cancer Res. - 2003. - Vol. 75, N 6. - P. 1727–1732. 289. Iwakiri, S. D2-40-positive lymphatic vessel density is a poor prognostic factor in squamous cell carcinoma of the lung. / S. Iwakiri, S. Nagai, H. Katakura et al. // Ann Surg Oncol. - 2004. - Vol. 9, N 6. - P. 691–704. 290. Izar, B. The impact of EGFR mutation status on outcomes in patients with resected stage I non-small cell lung cancers. / B. Izar, L. Sequist, M. Lee et al. // Ann Thorac Surg. - 2002. - Vol. 33, N 1. - P. 105–110. 291. Jakobsen, J.N. Clinical impact of Ki-67 labeling index in non-small cell lung cancer. / J.N. Jakobsen, J.B. Sоrensen // Lung Cancer. - 1995. - Vol. 72, N 1. - P. 164– 169. 292. Jakobsen, J.N. Intratumour variation of biomarker expression by immunohistochemistry in resectable non-small cell lung cancer. / J.N. Jakobsen, E. SantoniRugiu, J. Ravn, J.B. Sørensen // Eur J Cancer. - 2006. - Vol. 106, N 3. - P. 648–653. 293. Järvinen, T.A. Simultaneous amplification of HER-2 (ERBB2) and topoisomerase IIalpha (TOP2A) genes-molecular basis for combination chemotherapy in cancer. / T.A. Järvinen, E.T. Liu // Curr Cancer Drug Targets. - 1994. - Vol. 70, N 2. - P. 297– 303. 294. Javid, J. CC genotype of anti-apoptotic gene BCL-2 (-938 C/A) is an independent prognostic marker of unfavorable clinical outcome in patients with non-smallcell lung cancer. / J. Javid, R. Mir, M. Mirza et al. // Clin Transl Oncol. - 2002. - Vol. 7, N 3. - P. 152–158. 295. Jemal, A. Global cancer statistics. / A. Jemal, F. Bray, M.M. Center et al. // CA Cancer J Clin. - 2010. - Vol. 456, N 3. - P. 251–256. 296. Jeong, S.H. Low expression of Bax predicts poor prognosis in resected nonsmall cell lung cancer patients with non-squamous histology. / S.H. Jeong, H.W. Lee, J.H. Han et al. // Jpn J Clin Oncol. - 2010. - Vol. 1, N 3. - P. 415–431. 305 297. Jiang, L. Reduced expression of liver kinase B1 and Beclin1 is associated with the poor survival of patients with non-small cell lung cancer. / L. Jiang, X. Liang, M. Liu et al. // Oncol Rep. - 2002. - Vol. 95, N 7. - P. 1539–1545. 298. Jin, S. Clinicopathological significance of lymphatic vessel density marked by D2-40 and E-cadherin expression in non-small-cell lung cancer. / S. Jin, W. Zhu, Q. Shi et al. // Med Oncol. - 2007. - Vol. 18, N 4. - P. 752–760. 299. Jonnalagadda, S. The number of lymph node metastases as a prognostic factor in patients with N1 non-small cell lung cancer. / S. Jonnalagadda, C. Smith, G. Mhango, J.P. Wisnivesky // Chest. - 2014. - [Epub ahead of print]. 300. Jorissen, R.N. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling. / R.N. Jorissen, F. Walker, N. Pouliot et al. // Exp Cell Res. - 2009. - Vol. 28, Suppl 1. - P. 32–37. 301. Jubelirer, S.J. Does sex make a difference in survival of patients undergoing resection for early stage non-small cell lung cancer (NSCLC)?. / S.J. Jubelirer, N.L. Varela, C.A. Welch, M.K. Emmett // W V Med J. - 2011. - Vol. 117, N 1. - P. 134–142. 302. Kadota, K. The clinical significance of lymphangiogenesis and angiogenesis in non-small cell lung cancer patients. / K. Kadota, C.L. Huang, D. Liu et al. // Eur J Cancer. - 2000. - Vol. 6, N 10. - P. 4073–4081. 303. Kadota, K. The clinical significance of the tumor cell D2-40 immunoreactivity in non-small cell lung cancer. / K. Kadota, C.L. Huang, D. Liu et al. // Lung Cancer. 2002. - Vol. 86, N 9. - P. 1449–1456. 304. Kaira, K. Prognostic and predictive factors in resected non-small cell lung cancer. / K. Kaira, N. Yamamoto // Expert Opin Med Diagn. - 2012. - Vol. 39, N 5. - P. 5331–5338. 305. Kaira, K. Prognostic significance of L-type amino acid transporter 1 expression in resectable stage I-III nonsmall cell lung cancer. / K. Kaira, N. Oriuchi, H. Imai et al. // Br J Cancer. - 1980. - Vol. 36. - P. 1014–1015. 306. Kaneko, S. Nucleolar organizer regions as a prognostic indicator for stage I non-small cell lung cancer. / S. Kaneko, T. Ishida, K. Sugio et al. // Cancer Res. - 2012. Vol. 15, N 11. - P. 656–662. 307. Kanou, T. Prognosis associated with surgery for non-small cell lung cancer and synchronous brain metastasis. / T. Kanou, J. Okami, T. Tokunaga et al. // Surg Today. - 2005. - Vol. 92, N 7. - P. 1231–1239. 308. Karunagaran, D. ErbB-2 is a common auxiliary subunit of NDF and EGF receptors: Implications for breast cancer. / D. Karunagaran, E. Tzahar, R.R. Beerli et al. // 306 EMBO J. - 1998. - Vol. 16, N 19. - P. 2469–2477. 309. Kashihara, M. Nuclear Y-box binding protein-1, a predictive marker of prognosis, is correlated with expression of HER2/ErbB2 and HER3/ErbB3 in non-small cell lung cancer. / M. Kashihara, K. Azuma, A. Kawahara et al. // J Thorac Oncol. - 2014. Vol. 9, N 5. - P. 725–728. 310. Kawai, H. Smoking history before surgery and prognosis in patients with Stage IA non-small cell lung cancer—a multicenter study. / H. Kawai, A. Tada, M. Kawahara et al. // Lung Cancer. - 2007. - Vol. 357, N 1. - P. 39 –51. 311. Kawase, A. Visceral pleural invasion classification in non-small-cell lung cancer in the 7th edition of the tumor, node, metastasis classification for lung cancer: validation analysis based on a large-scale nationwide database. / A. Kawase, J. Yoshida, E. Miyaoka et al. // J Thorac Oncol. - 2001. - Vol. 50, N 1. - P. 13–18. 312. Kaye, P.V.. Expression of p53, Bcl-2, Ki-67 (MIB-1) and p21 waf1/cip1 in gastric carcinoma: lack of inter-relationship, or correlation with prognosis. / P.V.. Kaye, K. Radebold, D.M.. Dent // Cancer. - 2013. - Vol. 8, N 11. - P. e78070. 313. Keith, R.L. Angiogenic squamous dysplasia in bronchi of individuals at high risk for lung cancer. / R.L. Keith, Y.E. Miller, R.M. Gemmill et al. // Clin Cancer Res. 2009. - Vol. 54, N 7. - P. 804–813. 314. Khan, A.J. Characterization of the HER-2/neu oncogene by immunohistochemical and fluorescence in situ hybridization analysis in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma. / A.J. Khan, B.L. King, B.D. Smith et al. // Clin Cancer Res. 2008. - Vol. 135, N 4. - P. 830–836. 315. Khojasteh, M. A frame-work for quantitative assessment of Ki67 distribution in preneoplastic bronchial epithelial lesions. / M. Khojasteh, T.P. Buys, J. LeRiche et al. // Anal Quant Cytol Histol. - 2014. - Vol. 83, N 2. - P. 246–251. 316. Kidogawa, H. Clinical significance of double staining of MIB-1 and AgNORs in primary breast carcinoma. / H. Kidogawa, A. Nanashima, H. Yano et al. // Anticancer Res. - 1993. - Vol. 53, N 20. - P. 5000–5003. 317. Kim, E.S. Biological activity of celecoxib in the bronchial epithelium of current and former smokers. / E.S. Kim, W.K. Hong, J.J. Lee et al. // Cancer Prev Res (Phila). - 2009. - Vol. 16, N 6. - P. 1678–1685. 318. Kim, M.K. Expression of microRNA miR-126 and miR-200c is associated with prognosis in patients with non-small cell lung cancer. / M.K. Kim, S.B. Jung, J.S. Kim et al. // Virchows Arch. - 2013. - Vol. 96, N 3. - P. 962–968. 319. Kim, S.J. Carbonic anhydrase IX in early-stage non-small cell lung cancer. / 307 S.J. Kim, Z.N. Rabbani, R.T. Vollmer et al. // Clin Cancer Res. - 2013. - Vol. 79, N 1. P. 1–7. 320. Kim, S.J. Phosphorylated epidermal growth factor receptor and cyclooxygenase-2 expression in localized non-small cell lung cancer. / S.J. Kim, Z.N. Rabbani, F. Dong et al. // Med Oncol. - 2013. - Vol. 49, N 11. - P. 2494–2503. 321. Klikovits, T. Effects of reclassification from the TNM-6 into the TNM-7 staging system in bronchoplastic resection for non-small cell lung cancer. / T. Klikovits, A. End, G. Riedl et al. // Interact Cardiovasc Thorac Surg. - 2006. - Vol. 6, N 7. - P. 579– 602. 322. Klimstra, D.S. The pathologic classification of neuroendocrine tumors: a review of nomenclature, grading, and staging systems. / D.S. Klimstra, I.R. Modlin, D. Coppola et al. // Pancreas. - 2014. - [Epub ahead of print]. 323. Kobayashi, N. Risk factors for recurrence and unfavorable prognosis in patients with stage I non-small cell lung cancer and a tumor diameter of 20 mm or less. / N. Kobayashi, S. Toyooka, J. Soh et al. // J Thorac Oncol. - 2011. - Vol. 61, N 2. - P. 69–90. 324. Kojima, H. Clinical significance of vascular endothelial growth factor-C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with T1 lung adenocarcinoma. / H. Kojima, N. Shijubo, G. Yamada et al. // Cancer. - 2008. - Vol. 38, N 10. - P. 661–669. 325. Kononen, J. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. / J. Kononen, L. Bubendorf, A. Kallioniemi et al. // Nat Med. - 2014. Vol. 32, N 5. - P. 1931–1938. 326. Kratz, J.R. A practical molecular assay to predict survival in resected nonsquamous, non-small cell lung cancer: development and international validation studies. / J.R. Kratz, J. He, S.K. Van Den Eeden et al. // Lancet. - 2012. - Vol. 29, N 5. - P. 3157–3161. 327. Kren, L. Prognostic significance of antiapoptosis proteins survivin and bcl-2 in non-small cell lung carcinomas: a clinicopathologic study of 102 cases. / L. Kren, J. Brazdil, M. Hermanova et al. // Appl Immunohistochem Mol Morphol. - 2011. - Vol. 140, N 2. - P. 433–440. 328. Kreuter, M. Prognostic relevance of angiogenesis in stage III NSCLC receiving multimodality treatment. / M. Kreuter, M. Kropff, A. Fischaleck et al. // Eur Respir J. - 2003. - Vol. 284, N 1. - P. 31–53. 329. Krug, L. Bcl-2 and bax expression in advanced non-small cell lung cancer: lack of correlation with chemotherapy response and survival in patients treated with docetaxel plus vinorelbine. / L. Krug, V.A. Miller, D.A. Filippa et al. // Lung Cancer. 2009. - Vol. 105, N 4. - P. 18–22. 308 330. Kuang, B.H. The prognostic value of platelet endothelial cell adhesion molecule-1 in non-small cell lung cancer patients. / B.H. Kuang, X.Z. Wen, Y. Ding et al. // Med Oncol. - 2010. - Vol. 70, N 1. - P. 88–93. 331. Kuo, S.W. Prognostic significance of histologic differentiation, carcinoembryonic antigen value, and lymphovascular invasion in stage I non-small cell lung cancer. / S.W. Kuo, J.S. Chen, P.M. Huang et al. // J Thorac Cardiovasc Surg. - 2008. - Vol. 44, N 7. - P. 1057–1067. 332. Kuyama, S. Impact of HER2 gene and protein status on the treatment outcome of cisplatin-based chemoradiotherapy for locally advanced non-small cell lung cancer. / S. Kuyama, K. Hotta, M. Tabata et al. // J Thorac Oncol. - 2008. - Vol. 98, N 4. - P. 742– 748. 333. Lai, R.S. Prognostic evaluation of the expression of p53 and bcl-2 oncoproteins in patients with surgically resected non-small cell lung cancer. / R.S. Lai, J.S. Wang, H.K. Hsu et al. // Jpn J Clin Oncol. - 2010. - Vol. 4, N 5. - P. 373–381. 334. Lakha, S. Prognostic Significance of Visceral Pleural Involvement in Early Stage Lung Cancer. / S. Lakha, J.E. Gomez, R.M. Flores, J.P. Wisnivesky // Chest. 2013. - Vol. 185, N 1. - P. 250–254. 335. Landi, L. HER2 and lung cancer. / L. Landi, F. Cappuzzo // Expert Rev Anticancer Ther. - 2002. - Vol. 15, N 2. - P. 137–145. 336. Langendijk, H. Cell proliferation and apoptosis in stage III inoperable nonsmall cell lung carcinoma treated by radiotherapy. / H. Langendijk, E. Thunnissen, J.W. Arends et al. // Radiother Oncol. - 1991. - Vol. 51, N 15. - P. 4008–4011. 337. Lara, M.S. Predictors of survival for younger patients less than 50 years of age with non-small cell lung cancer (NSCLC): a California Cancer Registry analysis. / M.S. Lara, A. Brunson, T. Wun et al. // Lung Cancer. - 2014. - Vol. 44, N 7. - P. 1321–1327. 338. Latif, Z. HER2/neu overexpression in the development of muscle-invasive transitional cell carcinoma of the bladder. / Z. Latif, A.D. Watters, I. Dunn et al. // Br J Cancer. - 1996. - Vol. 15, N 2. - P. 254–264. 339. Laudanski, J. Prognostic significance of p53 and bcl-2 abnormalities in operable nonsmall cell lung cancer. / J. Laudanski, W. Niklinska, T. Burzykowski et al. // Eur Respir J. - 2009. - Vol. 4, N 9. - P. 1066 –1074. 340. Lee, C.H. Differential expression of hypoxia inducible factor-1 alpha and tumor cell proliferation between squamous cell carcinomas and adenocarcinomas among operable non-small cell lung carcinomas. / C.H. Lee, M.K. Lee, C.D. Kang et al. // J Korean Med Sci. - 2005. - Vol. 49, N 1. - P. 63–70. 309 341. Lee, J.A. D2-40, Podoplanin, and CD31 as a Prognostic Predictor in Invasive Ductal Carcinomas of the Breast. / J.A. Lee, JW. Bae, S.U. Woo et al. // J Breast Cancer. - 2013. - Vol. 8, N 5. - P. 606–611. 342. Lee, J.J. Long-term impact of smoking on lung epithelial proliferation in current and former smokers. / J.J. Lee, D. Liu, J.S. Lee et al. // J Natl Cancer Inst. - 2005. Vol. 12. - P. 2581–2587. 343. Lee, Y.C. AgNORs in lung cancer: correlation with DNA ploidy and degree of differentiation. / Y.C. Lee, J.H. Chern, W.Y. Li et al. // Anal Quant Cytol Histol. - 2002. Vol. 8, N 2. - P. 540–548. 344. Lee, Y.C. Nucleolar organizer regions as a prognostic factor in surgically treated lung cancer patients. / Y.C. Lee, D.B. Chang, J.M. Lee et al. // Thorac Cardiovasc Surg. - 2000. - Vol. 6, N 5. - P. 1616–1625. 345. Lei, B. PBK/TOPK expression in non-small-cell lung cancer: its correlation and prognostic significance with Ki67 and p53 expression. / B. Lei, S. Liu, W. Qi et al. // Histopathology. - 2012. - Vol. 34, N 3. - P. 120–138. 346. Lei, Y. The prognostic value of micrometastasis in non-small cell lung cancer. / Y. Lei, Y. Wu // Zhongguo Fei Ai Za Zhi. - 2006. - Vol. 29, N 11. - P. 758–761. 347. Li, C. Expression of multiple drug resistance-associated proteins in non-small cell lung cancer tissues and its clinical significance. / C. Li, M. Hou, Y. Zhao, Q. Zhou // Zhongguo Fei Ai Za Zhi. - 2013. - Vol. 88, N 1. - P. 123–133. 348. Li, L. Vascular endothelial growth factor D and intratumoral lymphatics as independent prognostic factors in epithelial ovarian carcinoma. / L. Li, B. Liu, X. Li et al. // Anat Rec (Hoboken). - 2005. - Vol. 25, N 6. - P. 3957–3962. 349. Li, M. Caveolin-1 and VEGF-C promote lymph node metastasis in the absence of intratumoral lymphangiogenesis in non-small cell lung cancer. / M. Li, H. Chen, L. Diao et al. // Tumori. - 2010. - Vol. 3, N 2. - P. 148–159. 350. Li, S.H. Gene diagnosis and prognostic signifi-cance of lymph node micrometastasis after complete resection of histologically node-negative non-small cell lung cancer. / S.H. Li, Z. Wang, X.Y. Liu, F.Y. Liu // World J Surg. - 2011. - Vol. 135, N 4. - P. 611–618. 351. Li, S.H. Overexpression of metastasis-associated protein 1 is significantly correlated with tumor angiogenesis and poor survival in patients with early-stage non-small cell lung cancer. / S.H. Li, H. Tian, W.M. Yue et al. // Ann Surg Oncol. - 2014. - Vol. 465, N 4. - P. 463–471. 352. Li, Z. Analysis of the T descriptors and other prognosis factors in pathologic 310 stage I non-small cell lung cancer in China. / Z. Li, Y. Yu, J. Lu et al. // J Thorac Oncol. 2010. - Vol. 27, N 1. - P. 91–97. 353. Li, Z.M. Prognostic significance of the extent of lymph node involvement in stage II-N1 non-small cell lung cancer. / Z.M. Li, Z.P. Ding, Q.Q. Luo et al. // Chest. 2004. - Vol. 10, N 23. - P. 7925–7933. 354. Lindboe, C.F. Comparison of Ki-67 equivalent antibodies. / C.F. Lindboe, S.H. Torp // J Clin path. - 2004. - Vol. 26, N 6. - P. 369–372. 355. Liu, C.Y. Prognostic factors in resected pathological N1-stage II nonsmall cell lung cancer. / C.Y. Liu, J.J. Hung, B.Y. Wang et al. // Eur Respir J. - 2011. - Vol. 13, N 1. - P. 29–34. 356. Liu, L. The role of human epidermal growth factor receptor 2 as a prognostic factor in lung cancer: a meta-analysis of published data. / L. Liu, X. Shao, W. Gao et al. // J Thorac Oncol. - 2010. - Vol. 39, N 6. - P. 707–712. 357. Lopez Guerra, J.L. Risk factors for local and regional recurrence in patients with resected N0-N1 non-small cell lung cancer, with implications for patient selection for adjuvant radiation therapy. / J.L. Lopez Guerra, D.R. Gomez, S.H. Lin et al. // Ann Oncol. - 2007. - Vol. 2, N 9. - P. 808–812. 358. López-Encuentra, A. Composite anatomical-clinical-molecular prognostic model in non-small cell lung cancer. / A. López-Encuentra, F. López-Ríos, E. Conde et al. // Eur Respir J. - 2005. - Vol. 104, N 8. - P. 1668–1677. 359. Lorenzato, M. Proliferation assessment in breast cancer: a double-staining technique for AgNOR quantification in MIB-1 positive cells especially adapted for image cytometry. / M. Lorenzato, P. Abboud, C. Lechki et al. // Micron. - 1998. - Vol. 4, N 7. P. 844–847. 360. Lu, M. GOLPH3, a good prognostic indicator in early-stage NSCLC related to tumor angiogenesis. / M. Lu, Y. Tian, W.M. Yue et al. // Asian Pac J Cancer Prev. 2004. - Vol. 12, N 1. - P. 44–49. 361. Lu, M. TFIIB-related factor 2 over expression is a prognosis marker for earlystage non-small cell lung cancer correlated with tumor angiogenesis. / M. Lu, H. Tian, W. Yue et al. // PLoS One. - 2012. - Vol. 379, N 9818. - P. 823–832. 362. Ludovini, V. Biological markers and DNA flow cytometric analysis in radically resected patients with non-small cell lung cancer. A study of the Perugia Multidisciplinary Team for Thoracic Tumors. / V. Ludovini, L. Pistola, V. Gregorc et al. // Tumori. - 2003. - Vol. 39, N 2. - P. 139–143. 363. Ludovini, V. Vascular endothelial growth factor, p53, Rb, Bcl-2 expression 311 and response to chemotherapy in advanced nonsmall cell lung cancer. / V. Ludovini, V. Gregorc, L. Pistola et al. // Lung Cancer. - 2009. - Vol. 33, N 6. - P. 1383–1388. 364. Ludwig, M.S. Postoperative survival and the number of lymph nodes sampled during resection of node-negative non-small cell lung cancer. / M.S. Ludwig, M. Goodman, D.L. Miller, P.A. Johnstone // Chest. - 2014. - Vol. 14, N 3. - P. 159–172. 365. Lyons, G. Analysis of survival in 400 surgically resected non-small cell lung carcinomas: towards a redefinition of the T factor. / G. Lyons, S. Quadrelli, C. Silva et al. // J Thorac Oncol. - 2013. - Vol. 30, N 2. - P. 536. 366. Lyu, J. Prognosis of R1-resection at the bronchial stump in patients with nonsmall cell lung cancer. / J. Lyu, X. Hao, Z. Hui et al. // Chin Med J (Engl). - 2014. - Vol. 148, N 4. - P. 1200–1207. 367. Ma, J. Gain of 1q25-32, 12q23-243, and 17q12-22 facilitates tumorigenesis and progression of human squamous cell lung cancer. / J. Ma, M. Gao, Y. Lu et al. // J Pathol. - 2008. - Vol. 3, N 5. - P. 477–482. 368. Maddau, C. Prognostic significance of p53 and Ki-67 antigen expression in surgically treated non-small cell lung cancer: immunocytochemical detection with imprint cytology. / C. Maddau, M. Confortini, S. Bisanzi et al. // Am J Clin Pathol. - 2002. Vol. 32, N 10. - P. 393–397. 369. Maeda, R. Long-term survival and risk factors for recurrence in stage I nonsmall cell lung cancer patients with tumors up to 3 cm in maximum dimension. / R. Maeda, J. Yoshida, G. Ishii et al. // Chest. - 2014. - [Epub ahead of print]. 370. Maounis, N.F. Prognostic impact of Deoxyribonucleic acid (DNA) image analysis cytometry and immunohistochemical expression of Ki67 in surgically resected non-small cell lung cancers. / N.F. Maounis, M. Chorti, E. Apostolakis et al. // Cancer Detect Prev. - 2013. - Vol. 13, N 10. - P. 1219–1228. 371. Marchevsky, A.M. Problems in pathologic staging of lung cancer. / A.M. Marchevsky // Arch Pathol Lab Med. - 2014. - Vol. 111, N 6. - P. 1222–1229. 372. Marchio, C. Does chromosome 17 centromere copy number predict polysomy in breast cancer? A fluorescence in situ hybridization and microarray-based CGH analysis. / C. Marchio, M.B. Lambros, P. Gugliotta et al. // J Pathol. - 2000. - Vol. 56, N 2. - P. 197–207. 373. Martin, B. Ki-67 expression and patients survival in lung cancer: systematic review of the literature with meta-analysis. / B. Martin, M. Paesmans, C. Mascaux et al. // Br J Cancer. - 2003. - Vol. 89, N 7. - P. 1305–1309. 374. Martin, B. Role of Bcl-2 as a prognostic factor for survival in lung cancer: a 312 systematic review of the literature with meta-analysis. / B. Martin, M. Paesmans, T. Berghmans et al. // Br J Cancer. - 2014. - Vol. 85, N 2. - P. 264–269. 375. Martin, V. HER2 in solid tumors: more than 10 years under the microscope; where are we now?. / V. Martin, F. Cappuzzo, L. Mazzucchelli, M. Frattini // Future Oncol. - 2008. - Vol. 129, N 1. - P. 13–31. 376. Matheus, R.S. Nuclear markers (star volume, mitotic index, AgNOR and Ki67) of the primary tumor and its metastasis in non-small cell lung carcinomas. / R.S. Matheus, Fdel.C.. Bernardi, C.P. Gallo et al. // Pathol Res Pract. - 2001. - Vol. 17, N 4. P. 660–666. 377. Mazza, F. Pleural lavage cytology predicts recurrence and survival, even in early non-small cell lung cancer. / F. Mazza, E. Ferrari, P. Maineri et al. // Surg Today. 2003. - Vol. 18, N 2. - P. 196–203. 378. Meert, A.P. Angiogenesis in preinvasive, early invasive bronchial lesions and micropapillomatosis and correlation with EGFR expression. / A.P. Meert, F. Feoli, B. Martin et al. // Histopathology. - 2011. - Vol. 14, N 2. - P. 104–111. 379. Meert, A.P. Does c-erbB-2 play a role in the first steps of lung carcinogenesis?. / A.P. Meert, B. Martin, J.M. Verdebout et al. // Anticancer Res. - 2013. - Vol. 16, N 9. - P. 492–498. 380. Meert, A.P. EGFR, c-erbB-2 and ki-67 in NSCLC and preneoplastic bron-chial lesions. / A.P. Meert, B. Martin, J.M. Verdebout et al. // Anticancer Res. - 2013. - Vol. 63, N 5. - P. 696–703. 381. Meert, A.P. Is there a relationship between c-erbB-1 and c-erbB-2 amplification and protein overexpression in NSCLC?. / A.P. Meert, B. Martin, J.M. Verdebout et al. // Lung Cancer. - 1996. - Vol. 44, N 4. - P. 204–207. 382. Meert, A.P. The role of HER-2/neu expression on the survival of patients with lung cancer: a systematic review of the literature. / A.P. Meert, B. Martin, M. Paesmans et al. // Br J Cancer. - 2001. - Vol. 93, N 14. - P. 1081–1088. 383. Meert, A.P. The role of microvessel density on the survival of patients with lung cancer: a systematic review of the literature with meta-analysis. / A.P. Meert, M. Paesmans, B. Martin et al. // Br J Cancer. - 1997. - Vol. 19, N 3. - P. 271–276. 384. Midgley, C.A. p53 protein stability in tumor cells is not determined by mutation but is dependent on Mdm2 binding. / C.A. Midgley, D.P. Lane // Oncogene. - 2012. Vol. 22, N 8. - P. 1442–1448. 385. Mihara, M. p53 has a direct apoptogenic role at the mitochondria. / M. Mihara, S. Erster, A. Zaika et al. // Mol Cell. - 2005. - Vol. 8, N 6. - P. 523–526. 313 386. Milas, I. Epidermal growth factor receptor, cyclooxygenase-2, and BAX expression in the primary non-small cell lung cancer and brain metastases. / I. Milas, R. Komaki, T. Hachiya et al. // Clin Cancer Res. - 2009. - Vol. 292, N 4. - P. 562–569. 387. Miller, Y.E. Bronchial epithelial Ki-67 index is related to histology, smoking, and gender, but not lung cancer or chronic obstructive pulmonary disease. / Y.E. Miller, P. Blatchford, D.S. Hyun et al. // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. - 2010. - Vol. 96, N 5. - P. 734–743. 388. Mimura, K. Frequencies of HER-2/neu expression and gene amplification in patients with oesophageal squamous cell carcinoma. / K. Mimura, K. Kono, M. Hanawa et al. // British Journal of Cancer. - 2011. - Vol. 18, N 7. - P. 2048–2056. 389. Min, K.H. Clinical usefulness of D2-40 in non-small cell lung cancer. / K.H. Min, S.J. Park, K.S. Lee et al. // Lung. - 2008. - Vol. 32, N 8. - P. 1651–1656. 390. Minami, K.I. Prognostic significance of p53, Ki-67, VEGF and Glut-1 in resected stage I adenocarcinoma of the lung. / K.I. Minami, Y. Saito, H. Imamura, A. Okamura // Lung Cancer. - 2014. - Vol. 82, N 5. - P. 422–429. 391. Minamoto, H. Tumour cell and stromal features in metastatic and nonmetastatic non-small cell lung carcinomas. / H. Minamoto, L. Antonângelo, A.G. da Silva et al. // Histopathology. - 2009. - Vol. 4, N 6. - P. 702–709. 392. Mineo, T.C. Prognostic impact of VEGF, CD31, CD34, and CD105 expression and tumour vessel invasion after radical surgery for IB-IIA non-small cell lung cancer. / T.C. Mineo, V. Ambrogi, A. Baldi et al. // J Clin Pathol. - 2013. - Vol. 144, N 4. - P. 1253–1260. 393. Mitsudomi, T. Prognostic significance of p53 alterations in patients with nonsmall cell lung cancer: a meta-analysis. / T. Mitsudomi, N. Hamajima, M. Ogawa, T. Takahashi // Clin Cancer Res. - 2014. - Vol. 31, N 6. - P. 974. 394. Mlika, M. About the necessity of improving the current nodal classification of non-small cell lung carcinoma. / M. Mlika, A. Ayadi-Kaddour, S. Boudaya et al. // Pathologica. - 2002. - Vol. 55, N 6. - P. 467–471. 395. Moasser, M.M. The oncogene HER2: Its signaling and transforming functions and its role in human cancer pathogenesis. / M.M. Moasser // Oncogene. - 2001. - Vol. 292, N 5517. - P. 727–730. 396. Mohamed, S. Prognostic implications of cell cycle-related proteins in primary resectable pathologic N2 nonsmall cell lung cancer. / S. Mohamed, K. Yasufuku, K. Hiroshima et al. // Cancer. - 2013. - Vol. 41, N 3. - P. 649–655. 397. Moldvay, J. Predictive survival markers in patients with surgically resected 314 non-small cell lung carcinoma. / J. Moldvay, P. Scheid, P. Wild et al. // Clin Cancer Res. - 2010. - Vol. 5, N 12. - P. 1922–1932. 398. Montanaro, L. Nucleolus, ribosomes, and cancer. / L. Montanaro, D. Treré, M. Derenzini // Am J Pathol. - 2011. - Vol. 6, N 2. - P. 310–318. 399. Moran, С. Importance of Molecular Features of Non–Small Cell Lung Cancer for Choice of Treatment. / С. Moran // Am J pathol. - 2011. - Vol. 31, N 9. - P. 2833– 2839. 400. Morgensztern, D. Prognostic significance of tumor size in patients with stage III non-small-cell lung cancer: a surveillance, epidemiology, and end results (SEER) survey from 1998 to 2003. / D. Morgensztern, S. Waqar, J. Subramanian et al. // J Thorac Oncol. - 2013. - Vol. 24, N 1. - P. 67–74. 401. Mori, S. p53 apoptotic pathway molecules are frequently and simultaneously altered in non-small cell lung carcinoma. / S. Mori, G. Ito, N. Usami et al. // Cancer . 2011. - Vol. 37, N 1. - P. 136–142. 402. Morrison, C. HER-2 is an independent prognostic factor in endometrial cancer: association with outcome in a large cohort of surgically staged patients. / C. Morrison, V. Zanagnolo, N. Ramirez et al. // J Clin Onc. - 2000. - Vol. 31, N 2. - P. 2151–2159. 403. Mourad, W.A. Cell kinetics analysis of surgically resected non-small cell carcinoma of the lung using the AgNOR silver stain. / W.A. Mourad, E. Vallieres, J. Chuen, A. Alrobaish // Ann Saudi Med. - 2008. - Vol. 199, N 2. - P. 146–153. 404. Mukohara, T. Activated Akt expression has significant correlation with EGFR and TGF-alpha expressions in stage I NSCLC. / T. Mukohara, S. Kudoh, K. Matsuura et al. // Anticancer Res. - 2014. - Vol. 9, N 2. - P. e88032. 405. Munakata, S. A multilabeling technique for simultaneous demonstration and quantitation of Ki-67 and nucleolar organizer regions (AgNORs) in paraffin-embedded tissue. / S. Munakata, J.B. Hendricks // J Histochem Cytochem. - 2012. - Vol. 177, N 2. P. 185–190. 406. Nakamura, H. Association of HER-2 overexpression with prognosis in nonsmall cell lung carcinoma: a metaanalysis. / H. Nakamura, N. Kawasaki, M. Taguchi, K. Kabasawa // Cancer. - 2001. - Vol. 18, N 4. - P. 705–719. 407. Nakamura, H. Correlation between encoded protein overexpression and copy number of the HER2 gene with survival in non-small cell lung cancer. / H. Nakamura, H. Saji, A. Ogata et al. // Int J Cancer. - 2014. - Vol. 15, N 14. - P. 5793–5798. 408. Nakamura, S. Studies of the Cell Proliferating Ability of flat type colorectal cancer by using CD44 immunostaining method and double staining method of Ki67- 315 AgNORs. / S. Nakamura // Acta Medica Nagasakiensia. - 2011. - Vol. 92, N 6. - P. 1943– 1950. 409. Nentwich, M.F. Lymphatic invasion predicts survival in patients with early node-negative non-small cell lung cancer. / M.F. Nentwich, B.A. Bohn, F.G. Uzunoglu et al. // J Thorac Cardiovasc Surg. - 2004. - Vol. 46, N 1. - P. 77–85. 410. Nguyen, V.N. Expression of cyclin D1, Ki-67 and PCNA in non-small cell lung cancer: prognostic significance and comparison with p53 and bcl-2. / V.N. Nguyen, P. Mirejovsky, T. Mirejovsky et al. // Acta Histochem. - 2008. - Vol. 94, N 3. - P. 398– 405. 411. Nguyen, X.C. FDG uptake, glucose transporter type 1, and Ki-67 expressions in non-small-cell lung cancer: correlations and prognostic values. / X.C. Nguyen, W.W. Lee, J.H. Chung et al. // Eur J Radiol. - 2005. - Vol. 128, N 3. - P. 1545–1550. 412. Ni, S.S. ADAM17 is overexpressed in non-small cell lung cancer and its expression correlates with poor patient survival. / S.S. Ni, J. Zhang, W.L. Zhao et al. // Tumour Biol. - 2008. - Vol. 3, N 9. - P. 989–993. 413. Niemiec, J. EGFR LI and Ki-67 LI are inde-pendent prognostic parameters influencing survivals of surgically treated squamous cell lung cancer patients. / J. Niemiec, L. Kolodziejski, S. Dyczek // Neoplasma. - 2008. - Vol. 39, N 1. - P. 126–136. 414. Nitiss, J.L. DNA topoisomerase II and its growing repertoire of biological functions. / J.L. Nitiss // Nat Rev Cancer. - 2009. - Vol. 65, N 3. - P. 355–362. 415. Nonomura, A. Demonstration of nucleolar organizer regions in lung carcinoma by silver staining. / A. Nonomura, Y. Mizukami, M. Oda et al. // Surg Today. - 2014. Vol. 127, N 16. - P. 2918–2923. 416. Ofner, D. Demonstration of silver-stained nucleolar organizer region associated proteins (AgNORs) after wet auto-clave pretreatment in breast carcinoma: correlation to tumor stage and long-term survival. / D. Ofner, B. Bier, S. Heinrichs et al. // Breast Cancer Res Treat. - 2006. - Vol. 210, N 2. - P. 205–213. 417. Ofner, D. Standardized AgNOR analysis: its usefulness in surgical oncology. / D. Ofner, K.W. Schmid // Histochem Cell Biol. - 2011. - Vol. 11, N 2. - P. 110–111. 418. Ogura, S. Correlation between nucleolar organizer regions visualized by silver staining and the growth rate in lung adenocarcinoma. / S. Ogura, S. Abe, N. Sukoh et al. // Cancer. - 2006. - Vol. 125, N 3. - P. 425–431. 419. Ohmura, Y. Telomerase activity and Bcl-2 expression in non-small cell lung cancer. / Y. Ohmura, M. Aoe, A. Andou, N. Shimizu // Clin Cancer Res. - 2003. - Vol. 12, N 4. - P. 201–211. 316 420. Okudera, K. Small adenocarcinoma of the lung: prognostic significance of central fibrosis chiefly because of its association with angiogenesis and lymphangiogenesis. / K. Okudera, Y. Kamata, S. Takanashi et al. // Pathol Int. - 2010. - Vol. 138, N 2. - P. 357–362. 421. Onn, A. Synchronous overexpression of epidermal growth factor receptor and HER2-neu protein is a predictor of poor outcome in patients with stage I non-small cell lung cancer. / A. Onn, A.M. Correa, M. Gilcrease et al. // Clin Cancer Res. - 2006. - Vol. 30, N 6. - P. 507–514. 422. Osarogiagbon, R.U. Objective review of mediastinal lymph node examination in a lung cancer resection cohort. / R.U. Osarogiagbon, J.W. Allen, A. Farooq, J.T. Wu // J Thorac Oncol. - 1995. - Vol. 21, N 4. - P. 398–402. 423. Osarogiagbon, R.U. Outcome of surgical resection for pathologic N0 and Nx non-small cell lung cancer. / R.U. Osarogiagbon, J.W. Allen, A. Farooq et al. // J Thorac Oncol. - 2006. - Vol. 130, N 3. - P. 292–302. 424. Osarogiagbon, R.U. Predicting survival of patients with resectable non-small cell lung cancer: Beyond TNM. / R.U. Osarogiagbon // J Thorac Dis. - 2012. - Vol. 12. P. 535. 425. Ou, S.H. Prognostic significance of the number of lymph nodes removed at lobectomy in stage IA non-small cell lung cancer. / S.H. Ou, J.A. Zell // J Thorac Oncol. 2012. - Vol. 33, N 5. - P. 1719–1725. 426. Ou, S.H.I. Prognostic factors for survival of Stage I non-small cell lung cancer patients: a populationbased analysis of 19,702 Stage I patients in the California Cancer Registry from 1989–2003. / S.H.I. Ou, J.A. Zell, A. Ziogas, H. Anton-Culver // Cancer. 1992. - Vol. 47, N 10. - P. 778–780. 427. Ouyang, W.W. Detection of regional lymph node micrometastasis and its impact on long-term survival of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. / W.W. Ouyang, B. Lu, H.Y. Fu et al. // Ai Zheng. - 2009. - Vol. 219, N 1. - P. 16–24. 428. Oven Ustaalioglu, B.B. Prognostic factors for lymph node negative stage I and IIA non-small cell lung cancer: multicenter experiences. / B.B. Oven Ustaalioglu, O.U. Unal, N. Turan et al. // Asian Pac J Cancer Prev. - 2003. - Vol. 89, N 1. - P. 55–64. 429. Oyama, T. Evaluations of p53 immunoreactivity, nucleolar organizer regions, and proliferating cell nuclear antigen in non-small cell lung carcinoma. / T. Oyama, T. Osaki, N. Nose et al. // Anticancer Res. - 2014. - Vol. 10, N 8. - P. 1469–1486. 430. Oyama, T. Nucleolar organizer regions are independently associated with a shortened survival in patients with non-small cell lung cancer. / T. Oyama, T. Mitsudomi, 317 Y. Yoshida et al. // Surg Oncol. - 2004. - Vol. 91, N 12. - P. 2018–2025. 431. Ozbudak, I.H. Vascular endothelial growth factor expression and neovascularization in non-small cell lung carcinoma. / I.H. Ozbudak, G. Ozbilim, I. Kucukosmanoglu et al. // Int J Surg Pathol. - 2004. - Vol. 200, N 1. - P. 13–23. 432. Packeisen, J. Demystified … Tissue microarray technology. / J. Packeisen, Е. Korsching, Н. Herbst et al. // Mol Pathol. - 2014. - [Epub ahead of print]. 433. Padera, T.P.. Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics. / T.P.. Padera, А. Kadambi, Е. Di Tomaso et al. // Science. - 2007. - Vol. 50, N 3. - P. 311–317. 434. Panagiotou, I. Impact of HER2 and PTEN simultaneous deregulation in nonsmall cell lung carcinoma: correlation with biological behavior. / I. Panagiotou, S.N. Georgiannos, E. Tsiambas et al. // Asianac J Cancer rev. - 2003. - Vol. 89, N 6. - P. 959– 965. 435. Parra, E.R. Prognostic index expression of cyclin-D1, cerbB-2 and VEGF: metastases vs corresponding primary cancers and metastatic vs non-metastatic adenocarcinomas. / E.R. Parra, J.Y. Park, D.M. Saito et al. // Histol Histopathol. - 2005. - Vol. 47, N 3. - P. 325–336. 436. Patel, P.H. Targeting von Hippel-Lindau pathway in renal cell carcinoma. / P.H. Patel, R.S.V. Chadalavada, R.S.K. Chaganti et al. // Clin Cancer Res. - 2002. - Vol. 87, N 7. - P. 694–701. 437. Pelletier, M.P. Prognostic markers in resectable non-small cell lung cancer: a multivariate analysis. / M.P. Pelletier, M.D. Edwards, R.P. Michel et al. // Can J Surg. 2006. - Vol. 26, N 1. - P. 135–138. 438. Pelosi, G. Lack of prognostic implications of HER-2/neu abnormalities in 345 stage I non-small cell carcinomas (NSCLC) and 207 stage I-III neuroendocrine tumours (NET) of the lung. / G. Pelosi, B. Del Curto, P. Dell'Orto et al. // Int J Cancer. - 2005. Vol. 25, N 3. - P. 2005–2008. 439. Petrelli, F. Role of HER2-neu as a prognostic factor for survival and relapse in pT1a-bN0M0 breast cancer: a systematic review of the literature with a pooled-analysis. / F. Petrelli, S. Barni // Med Oncol. - 2009. - Vol. 135, N 6. - P. 771–782. 440. Pich, A. Prognostic relevance of AgNORs in tumor pathology. / A. Pich, L. Chiusa, E. Margaria // Micron. - 2011. - Vol. 137, N 12. - P. 1841–1848. 441. Piffkò, J. Standardized AgNOR analysis of the invasive tumour front in oral squamous cell carcinomas. / J. Piffkò, A. Bànkfalvi, D. Ofner et al. // J Pathol. - 1997. Vol. 15, N 10. - P. 1179–1189. 318 442. Piyathilake, C.J. Differential expression of growth factors in squamous cell carcinoma and precancerous lesions of the lung. / C.J. Piyathilake, A.R. Frost, U. Manne et al. // Clin Cancer Res. - 2003. - Vol. 11, N 3. - P. 577–590. 443. Ploton, D. Improvement in the staining and in the visualization of the argyrophilic proteins of the nucleolar organizer region at the optical level. / D. Ploton, M. Ménager, P. Jeannesson et al. // Histochem J. - 2003. - Vol. 9, N 3. - P. 1070–1076. 444. Poleri, C. Risk of recurrence in patients with surgically resected stage I nonsmall cell lung carcinoma: histopathologic and immunohistochemical analysis. / C. Poleri, J.L. Morero, B. Nieva et al. // Chest. - 2007. - Vol. 16, N 11. - P. 2425–2431. 445. Porebska, I. Apoptotic markers p53, Bcl-2 and Bax in primary lung cancer. / I. Porebska, E. Wyrodek, M. Kosacka et al. // In Vivo. - 2005. - Vol. 92, N 7. - P. 1253– 1260. 446. Pugsley, J.M. The Ki-67 index and survival in non-small cell lung cancer: a review and relevance to positron emission tomography. / J.M. Pugsley, R.A. Schmidt, H. Vesselle // Cancer J. - 1994. - Vol. 39, N 4. - P. 147–152. 447. Radoviс, S. Non-small cell lung carcinoma: cyclin D1, bcl-2, p53, Ki-67 and HER-2 proteins expression in resected tumors. / S. Radoviс, M. Babiс, M. Doriс et al. // Bosn J Basic Med Sci. - 2011. - Vol. 189, N 1. - P. 57–63. 448. Rahmanzadeh, R. Chromophore-assisted light inactivation of pKi-67 leads to inhibition of ribosomal RNA synthesis. / R. Rahmanzadeh, G. Huttmann, J. Gerdes, T. Scholzen // Cell Prolif. - 2011. - Vol. 31, N 12. - P. 4631–4636. 449. Reed, J.C. Remodeling for demolition: changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis. / J.C. Reed, D.R. Green // Moll Cell. - 2011. - Vol. 17, N 4. - P. 341–346. 450. Rena, O. Metastasis to subsegmental and segmental lymph nodes in patients resected for non-small cell lung cancer: prognostic impact. / O. Rena, R. Boldorini, E. Papalia et al. // Ann Thorac Surg. - 2003. - Vol. 43, N 5. - P. 427–443. 451. Rena, O. Non-small cell lung cancer in surgically treated women. / O. Rena, F. Massera, R. Boldorini et al. // Tumori. - 2002. - Vol. 38, N 1. - P. 51–57. 452. Renyi-Vamos, F. Lymphangiogenesis correlates with lymph node metastasis, prognosis, and angiogenic phenotype in human non-small cell lung cancer. / F. RenyiVamos, J. Tovari, J. Fillinger et al. // Clin Cancer Res. - 2004. - Vol. 57, N 6. - P. 591–597. 453. Rigau, V. Blood vessel invasion in resected nonsmall cell lung carcinomas is predictive of metastatic occurrence. / V. Rigau, T.J. Molina, C. Chaffaud et al. // Lung Cancer. - 2000. - Vol. 6, N 10. - P. 4055–4063. 454. Riquet, M. Place and role of the pleura in non-small cell lung cancer dissemi- 319 nation. / M. Riquet, C. Rivera, C. Pricopi et al. // Rev Pneumol Clin. - 2007. - Vol. 109, N 12. - P. 2506–2514. 455. Riquet, M. Prognostic value of histology in resected lung cancer with emphasis on the relevance of the adenocarcinoma subtyping. / M. Riquet, C. Foucault, P. Berna et al. // Ann Thorac Surg. - 2013. - Vol. 105, N 4. - P. 117–121. 456. Riquet, M. Prognostic value of T and N in nonsmall cell lung cancer three centimeters or less in diameter. / M. Riquet, D. Manac’h, F. Le Pimpec Barthes et al. // Eur J Cardiothorac Surg. - 2007. - Vol. 26, N 45. - P. 6469–6487. 457. Rissanen, T.T. VEGF-D is the strongest angiogenic and lymphangiogenic effector among VEGFs delivered into skeletal muscle via adenoviruses. / T.T. Rissanen, J.E. Markkanen, M. Gruchala et al. // Circ Res. - 2000. - Vol. 6, N 3. - P. 1125–1134. 458. Rita, R.G. NSCLC & HER2: between lights and shadows. / R.G. Rita, R. Alessandro, F. Tindara et al. // J Thorac Oncol. - 2008. - Vol. 173, N 2. - P. 301–310. 459. Rodrigues, O.R. Prognostic significance of argyrophilic nucleolar organizer region (AgNOR) in resected non-small cell lung cancer (NSCLC). / O.R. Rodrigues, L. Antonangelo, N. Yagi et al. // Jpn J Clin Oncol. - 2011. - Vol. 178, N 5. - P. 1940–1948. 460. Rose-James, A. Molecular Markers with Predictive and Prognostic Rele-vance in Lung Cancer. / A. Rose-James, S. TT // Lung Cancer Int. - 2010. - Vol. 10. - P. 621. 461. Roskoski, R.Jr. The ErbB/HER receptor protein-tyrosine kinases and cancer. / R.Jr. Roskoski // Biochem Biophys Res Commun. - 2006. - Vol. 6. - P. 203. 462. Rusch, V.W. A proposal for a new international lymph node map in the forthcoming seventh edition of the TNM classification for lung cancer. / V.W. Rusch, H. Asamura, H. Watanabe et al. // J Thorac Oncol. - 2012. - Vol. 7, N 10. - P. 1479–1484. 463. Rusch, V.W. The IASLC Lung Cancer Staging Project: proposals for the revision of the N descriptors in the forthcoming seventh edition of the TNM classification for lung cancer. / V.W. Rusch, J. Crowley, D.J. Giroux et al. // J Thorac Oncol. - 2004. - Vol. 100, N 8. - P. 1673–1682. 464. Ruschoff, J. AgNOR cytometry by means of automatic image analysis-a contribution to standardization. / J. Ruschoff, K.H. Plate, H. Contractor et al. // Verh Dtsch Gesathol. - 2006. - Vol. 24, N 15. - P. 2376–2385. 465. Saad, R.S. Prognostic significance of HER2/neu, p53, and vascular endothelial growth factor expression in early stage conventional adenocarcinoma and bronchioloalveolar carcinoma of the lung. / R.S. Saad, Y. Liu, H. Han et al. // Mod Pathol. - 1997. - Vol. 17, N 2. - P. 161–166. 466. Sah, S.P. Nucleolar organizer regions as a prognostic indicator in epithelial 320 cancers of the ovary. / S.P. Sah, R. Dawar, L. Kumar, S.D. Gupta // Int J Gynecol Pathol. - 2000. - Vol. 31, N 2. - P. 121–126. 467. Saji, H. A proposal for combination of total number and anatomical location of involved lymph nodes for nodal classification in non-small cell lung cancer. / H. Saji, M. Tsuboi, Y. Shimada et al. // Chest. - 2004. - Vol. 24, N 1. - P. 11–17. 468. Sánchez de Cos Escuín, J. Tumor, node and metastasis classification of lung cancer-M1a versus M1b-analysis of M descriptors and other prognostic factors. / J. Sánchez de Cos Escuín, J. Abal Arca, R. Melchor Iniguez et al. // Lung Cancer. - 1994. Vol. 42, N 6. - P. 789–783. 469. Sardari Nia, P. Prognostic value of a biologic classification of non-small cell lung cancer into the growth patterns along with other clinical, pathological and immunohistochemical factors. / P. Sardari Nia, E. Van Marck, J. Weyler, P. Van Schil // Eur J Cardiothorac Surg. - 2013. - Vol. 5. - P. 77–84. 470. Schacht, V. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. / V. Schacht, M.I. Ramirez, Y.K. Hong et al. // EMBO J. - 2003. - Vol. 103, N 1. - P. 61– 66. 471. Scheurle, D. HER-2/neu expression in archival non-small cell lung carcinomas using FDA-approved Hercep test. / D. Scheurle, M. Jahanzeb, R.S. Aronsohn et al. // Anticancer Res. - 2005. - Vol. 103, N 9. - P. 1865–1873. 472. Schindlbeck, C. Topoisomerase IIalpha expression rather than gene amplification predicts responsiveness of adjuvant anthracycline-based chemotherapy in women with primary breast cancer. / C. Schindlbeck, D. Mayr, C. Olivier et al. // J Cancer Res Clin Oncol. - 1998. - Vol. 43. - P. 34–39. 473. Scholzen, T. The Ki -67 protein: from the known and the unknown. / T. Scholzen, J. Gerdes // J Cell Physiol. - 2013. - Vol. 8, N 9. - P. e73220. 474. Shabnam, M.S. Expression of p53 protein and the apoptotic regulatory molecules Bcl-2, Bcl-XL and Bax in locally advanced squamous cell carcinoma of the lung. / M.S. Shabnam, R. Srinivasan, A. Wali et al. // Lung Cancer. - 2013. - Vol. 146, N 4. - P. 781–787. 475. Shao, W. Long-term survival outcomes of video-assisted thoracic surgery for patients with non-small cell lung cancer. / W. Shao, X. Xiong, H. Chen et al. // Chin J Cancer Res. - 2000. - Vol. 102, N 3. - P. 323–338. 476. Shibata, Y. Bcl-2 protein expression correlates with better prognosis in patients with advanced non-small cell lung cancer. / Y. Shibata, S. Hidaka, Y. Tagawa, T. Nagayasu // Anticancer research. - 2006. - Vol. 26, N 5В. - P. 3871–3876. 321 477. Shimada, Y. Pathological vascular invasion and tumor differentiation predict cancer recurrence in stage IA non-small-cell lung cancer after complete surgical resection. / Y. Shimada, H. Saji, K. Yoshida et al. // J Thorac Oncol. - 2007. - Vol. 62, N 2. P. 214–219. 478. Shou, Y. Influence of angiogenetic factors and matrix metalloproteinases upon tumour progression in non-small-cell lung cancer. / Y. Shou, T. Hirano, Y. Gong et al. // Br J Cancer. - 2013. - Vol. 34, N 3. - P. 1813–1818. 479. Siegel, R. Cancer statistics, 2012. / R. Siegel, D. Naishadham, A. Jemal // CA Cancer J Clin. - 2006. - Vol. 15, N 1. - P. 65–71. 480. Sirri, V. Nucleolus: the fascinating nuclear body. / V. Sirri, S. UrcuquiInchima, P. Roussel, D. Hernandez-Verdun // Histochem Cell Biol. - 2007. - Vol. 121, N 5. - P. 1162–1167. 481. Sirri, V. The AgNOR proteins: qualitative and quantitative changes during the cell cycle. / V. Sirri, P. Roussel, D. Hernandez-Verdun // Micron. - 2010. - Vol. 5, N 1. P. 45–48. 482. Sobin, L. TNM classification of malignant tumours 7th edition Oxford. / L. Sobin, M. Gospodarowicz, C. Wittekind. - Wiley-Blackwell, 2009. - 138-146 рр. 483. Soh, J. Impact of HER2 and EGFR gene status on gefitinib-treated patients with non-smallcell lung cancer. / J. Soh, S. Toyooka, S. Ichihara et al. // Int J Cancer. 2005. - Vol. 52, N 3. - P. 231–237. 484. Sonobe, M. Prognostic factors after complete resection of pN2 non-small cell lung cancer. / M. Sonobe, H. Date, H. Wada et al. // J Thorac Cardiovasc Surg. - 2009. Vol. 9, N 5. - P. 327–337. 485. Stacker, S.A. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. / S.A. Stacker, S.P. Williams, T. Karnezis et al. // Nat Rev Cancer. - 1993. - Vol. 23, N 6. - P. 486–490. 486. Steels, E. Role of p53as a prognostic factor for survival in lung cancer: a systematic review of the literature with a meta-analysis. / E. Steels, M. Paesmans, T. Berghmans et al. // Eur Respir J. - 1996. - Vol. 39, N 2. - P. 165–176. 487. Sterlacci, W. The elderly patient with surgically resected non-small cell lung cancer-a distinct situation?. / W. Sterlacci, R. Stockinger, T. Schmid et al. // Exp Gerontol. - 1996. - Vol. 106, N 2. - P. 193–196. 488. Sterlacci, W. The prognostic impact of sex on surgically resected non-small cell lung cancer depends on clinicopathologic characteristics. / W. Sterlacci, A. Tzankov, L. Veits et al. // Am J Clin Pathol. - 1992. - Vol. 70, N 1. - P. 63–68. 322 489. Sun, J.G. Detection of lymphangiogenesis in non-small cell lung cancer and its prognostic value. / J.G. Sun, R.X. Liao, J. Qiu et al. // J Exp Clin Cancer Res . - 2000. Vol. 6, N 8. - P. 2980–2987. 490. Sun, Z. Histologic grade is an independent prognostic factor for survival in non-small cell lung cancer: an analysis of 5018 hospital and 712 population-based cases. / Z. Sun, M.C. Aubry, C. Deschamps et al. // J Thorac Cardiovasc Surg. - 2006. - Vol. 56, N 9. - P. 494–502. 491. Syrigos, K.N. Tumors of the Chest: Biology, Diagnosis and Management. / K.N. Syrigos, C.M. Nutting, C. Roussos. - Springer, 2006. - 711 р. 492. Szelachowska, J. Laminin, Her2/neu and Ki-67 as prognostic factors in nonsmall cell lung cancer. / J. Szelachowska, M. Jeleń // Rocz Akad Med Bialymst. - 2006. Vol. 60, N 6. - P. 675–682. 493. Szelachowska, J. Prognostic significance of intracellular laminin and Her2/neu overexpression in non-small cell lung cancer. / J. Szelachowska, M. Jelen, J. Kornafel // Anticancer Res. - 2001. - Vol. 2, N 2. - P. 127–137. 494. Szturmowicz, M. Prognostic value of serum C-reactive protein (CRP) and cytokeratin 19 fragments (Cyfra 21-1) but not carcinoembryonic antigen (CEA) in surgically treated patients with non-small cell lung cancer. / M. Szturmowicz, P. Rudziński, A. Kacprzak et al. // Pneumonol Alergol Pol. - 2004. - Vol. 10, N 11. - P. 136–143. 495. Tabata, K. Ki-67 is a strong prognostic marker of non-small cell lung cancer when tissue heterogeneity is considered. / K. Tabata, T. Tanaka, T. Hayashi et al. // BMC Clin Pathol. - 2010. - Vol. 5, N 2. - P. 191–196. 496. Takanami, I. Lymphatic microvessel density using D2-40 is associated with nodal metastasis in non-small cell lung cancer. / I. Takanami // Oncol Rep. - 1998. - Vol. 68, N 1. - P. 11–18. 497. Takenaka, M. The prognostic significance of HER2 overexpression in nonsmall cell lung cancer. / M. Takenaka, T. Hanagiri, S. Shinohara et al. // Anticancer Res. - 2012. - Vol. 7, N 2. - P. 390–396. 498. Tan, D. HER-2/neu protein expression and gene alteration in stage I-IIIA nonsmall-cell lung cancer: a study of 140 cases using a combination of high throughput tissue microarray, immunohistochemistry, and fluorescent in situ hybridization. / D. Tan, G. Deeb, J. Wang et al. // Diagn Mol Pathol. - 2012. - Vol. 4, N 2. - P. 214–216. 499. Tanaka, R. Expression of the Bax inhibitor-1 gene in pulmonary adenocarcinoma. / R. Tanaka, T. Ishiyama, T. Uchihara et al. // Cancer. - 2008. - Vol. 3, N 8. - P. 880–886. 323 500. Tang, H. Overexpression of LAPTM4B is correlated with tumor angiogenesis and poor prognosis in non-small cell lung cancer. / H. Tang, H. Tian, W. Yue et al. // Med Oncol. - 2007. - Vol. 110, N 7. - P. 1532–1541. 501. Tantraworasin, A. Prognostic factors of tumor recurrence in completely resected non-small cell lung cancer. / A. Tantraworasin, S. Saeteng, N. Lertprasertsuke et al. // Cancer Manag Res. - 2008. - Vol. 27, N 7. - P. 756–760. 502. Tanvetyanon, T. Prognostic Nomogram to Predict Survival after Surgery for Synchronous Multiple Lung Cancers in Multiple Lobes. / T. Tanvetyanon, D.J. Finley, T. Fabian et al. // J Thorac Oncol. - 2013. - Vol. 14, N 11. - P. 6287–6292. 503. Tao, H. Prognostic impact of lymphovascular invasion compared with that of visceral pleural invasion in patients with pN0 non-small-cell lung cancer and a tumor diameter of 2 cm or smaller. / H. Tao, T. Hayashi, F. Sano et al. // J Surg Res. - 1993. Vol. 2, N 6. - P. 341–347. 504. Tateishi, M. The close relationship between growth factors and the nucleolar organizer regions in adenocarcinoma of the lung. / M. Tateishi, S. Kaneko, Y. Fukuyama et al. // Eur J Surg Oncol. - 2000. - Vol. 20, N 1. - P. 505–510. 505. Thibault, C. HER2 status for prognosis and prediction of treatment efficacy in adenocarcinomas: a review. / C. Thibault, W. Khodari, M. Lequoy et al. // Crit Rev Oncol Hematol. - 2009. - Vol. 17, N 5. - P. 390–395. 506. Tiseo, M. Predictors of gefitinib outcomes in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC): study of a comprehensive panel of molecular markers. / M. Tiseo, G. Rossi, M. Capelletti et al. // Lung Cancer. - 2003. - Vol. 56, N 4. - P. 198–204. 507. Toh, C.K. Correlation between epidermal growth factor receptor mutations and expression of female hormone receptors in East-Asian lung adenocarcinomas. / C.K. Toh, B. Ahmad, R. Soong et al. // J Thorac Oncol. - 2002. - Vol. 296, N 5574. - P. 1883–1886. 508. Tomashefski, J.F. Dail and Hammar's Pulmonary Pathology Volume II: Neoplastic Lung Disease. / J.F. Tomashefski. - New York: Springer, 2008 - 869 р. 509. Tomita, M. Prognostic significance of bcl-2 expression in resected pN2 nonsmall cell lung cancer. / M. Tomita, Y. Matsuzaki, M. Edagawa et al. // EJSO. - 2012. Vol. 13, N 12. - P. 6311–6318. 510. Tomobe, M. Argyrophilic nucleolar organizer region in proliferating cell has a predictive value for local recurrence in superficial bladder tumor. / M. Tomobe, T. Shimazui, K. Uchida et al. // J Urol. - 2008. - Vol. 23, N 8. - P. 987–993. 511. Torre, W. Postoperative complications of lung resection after induction chemotherapy using Paclitaxel (and radiotherapy) for advanced non-small lung cancer. / 324 W. Torre, A. Sierra // J Cardiovasc Surg (Torino). - 2007. - Vol. 22, N 2. - P. 318–325. 512. Travis, W.D. World Health Organization Classification of Tumours Pathology and Genetics of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. / W.D. Travis, E. Brambilla, H.K. Muller-Hermelink, C.C. Harris. - IARC Press: Lyon, 2004. - 9-124 рр. 513. Trere, D. AgNOR staining and quantification. / D. Trere // Micron. - 2013. Vol. 21, N 6. - P. 693–699. 514. Treré, D. Cell proliferation in breast cancer is a major determinant of clinical outcome in node-positive but not in node-negative patients. / D. Treré, C. Ceccarelli, M. Migaldi et al. // Appl Immunohistochem Mol Morphol. - 2006. - Vol. 12, N 24. - P. 7215–7220. 515. Trerè, D. Quantitative analysis of AgNOR proteins: a reliable marker of the rapidity of cell duplication and a significant prognostic parameter in tumour pathology. / D. Trerè // Adv Clin Path. - 2012. - Vol. 25, Suppl 1. - P. 11–17. 516. Trivella, M. Microvessel density as a prognostic factor in non-small cell lung carcinoma: a meta-analysis of individual patient data. / M. Trivella, F. Pezzella, U. Pastorino et al. // Lancet Oncol. - 2001. - Vol. 44, N 3. - P. 180 –188. 517. Tsoukalas, N. The clinical and pathological significance of RCAS1 expression as a prognostic biomarker in non-small cell lung cancer. / N. Tsoukalas, I.D. Kostakis, S. Siakavellas et al. // In Vivo. - 2005. - Vol. 113, N 1. - P. 101–108. 518. Tsubochi, H. Combined analysis of cyclooxygenase-2 expression with p53 and Ki-67 in nonsmall cell lung cancer. / H. Tsubochi, N. Sato, M. Hiyama et al. // Ann Thorac Surg. - 2012. - Vol. 29, N 4. - P. 2586–2593. 519. Tsutani, Y. The prognostic role of pathologic invasive component size, excluding lepidic growth, in stage I lung adenocarcinoma. / Y. Tsutani, Y. Miyata, T. Mimae et al. // J Thorac Cardiovasc Surg. - 2000. - Vol. 31, N 2. - P. 133–141. 520. Tsutsumida, H. MUC4 expression correlates with poor prognosis in smallsized lung adenocarcinoma. / H. Tsutsumida, M. Goto, S. Kitajima et al. // Lung Cancer. - 1997. - Vol. 182, N 4. - P. 450–456. 521. Ulukus, E.C. Survivin expression in non-small-cell lung carcinomas: correlation with apoptosis and other apoptosis-related proteins, clinicopathologic prognostic factors and prognosis. / E.C. Ulukus, H.A. Kargi, B. Sis et al. // Appl Immunohistochem Mol Morphol. - 2002. - Vol. 8, N 3. - P. 734–744. 522. Ushijima, C. High vascularity in the peripheral region of non-small cell lung cancer tissue is associated with tumor progression. / C. Ushijima, S. Tsukamoto, K. Yamazaki et al. // Lung Cancer. - 1986. - Vol. 18, N 1. - P. 5–14. 325 523. van de Rijn, M. Applications of microarrays to histopathology. / M. van de Rijn, C.B. Gilks // Histopathology. - 1995. - Vol. 33, N 2. - P. 83–88. 524. Van der Auwera, I. First international consensus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid human tumours. / I. Van der Auwera, Y. Cao, J.C. Tille et al. // Br J Cancer. - 2003. - Vol. 123, N 6. - P. 1858–1867. 525. Varella-Garcia, M. EGFR and HER2 genomic gain in recurrent non-small cell lung cancer after surgery: impact on outcome to treatment with gefitinib and association with EGFR and KRAS mutations in a Japanese cohort. / M. Varella-Garcia, T. Mitsudomi, Y. Yatabe et al. // J Thorac Oncol. - 2006. - Vol. 20, N 5. - P. 599–604. 526. Varlotto, J.M. Extent of lymphadenectomy and outcome for patients with stage I nonsmall cell lung cancer. / J.M. Varlotto, A. Recht, M. Nikolov et al. // Cancer. - 2002. - Vol. 8, N 3. - P. 222–233. 527. Walczak, H. The CD95 (APO-1/Fas) and the TRAIL (APO-2L) apoptosis systems. / H. Walczak, P.H. Krammer // Exp Cell Res. - 2012. - Vol. 3, N 4. - P. 636–640. 528. Walker, C. Expression of the BCL-2 protein in normal and dysplastic bronchial epithelium and in lung carcinomas. / C. Walker, L. Robertson, M.W. Myskow, G.R. Dixon // Br J Cancer . - 2012. - Vol. 65, N 5. - P. 210–215. 529. Walker, C. p53 expression in normal and dysplastic bronchial epithelium and in lung carcinomas. / C. Walker, L.J. Robertson, M.W. Myskow et al. // Br J Cancer . 2007. - Vol. 7, N 3. - P. 205–211. 530. Wang, J. Lymphatic microvessel density as a prognostic factor in non-small cell lung carcinoma: a meta-analysis of the literature. / J. Wang, K. Li, B. Wang, J. Bi // Mol Biol Rep. - 2002. - Vol. 9, N 2. - P. 423–432. 531. Wang, J. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients: a meta-analysis. / J. Wang, K. Wang, J. Xu et al. // PLoS One. 2007. - Vol. 40, N 3. - P. 422–430. 532. Wang, S. Aneusomy 17 in breast cancer: its role in HER-2/neu protein expression and implication for clinical assessment of HER-2/neu status. / S. Wang, M. Hossein Saboorian, E.P. Frenkel et al. // Mod Pathol. - 2002. - Vol. 9, N 1. - P. 1–3. 533. Wang, Y. Clinical and prognostic significance of podoplanin-positive lymphatic vessel density in non-small cell lung carcinoma. / Y. Wang, J.G. Sun, M.F. Ye, Z.T. Chen // Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. - 2002. - Vol. 93, N 9. - P. 1007–1011. 534. Wang, Y. Prognostic value of expression of FASE, HER-2/neu, bcl-2 and p53 in stage I non-small cell lung cancer. / Y. Wang, X.R. Zhang, J. Fu et al. // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. - 2013. - Vol. 99, N 6. - P. 661–666. 326 535. Warth, A. Tumour cell proliferation (Ki-67) in non-small cell lung cancer: a critical reappraisal of its prognostic role. / A. Warth, J. Cortis, A. Soltermann et al. // Br J Cancer. - 2014. - Vol. 97, N 3. - P. 987–992. 536. Weber, S.K. Detection of lymphovascular invasion by D2-40 (podoplanin) immunoexpression in endometrial cancer. / S.K. Weber, A. Sauerwald, M. Pölcher et al. // Int J Gynecol Cancer. - 2005. - Vol. 11, N 20. - P. 7344–7353. 537. Wei, M.C. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. / M.C. Wei, W.X. Zong, E.H. Cheng et al. // Science. - 2002. Vol. 38, N 2. - P. 169–176. 538. Wei, S. Which is the better prognostic factor for resected non-small cell lung cancer: the number of metastatic lymph nodes or the currently used nodal stage classification?. / S. Wei, H. Asamura, R. Kawachi et al. // J Thorac Oncol. - 2006. - Vol. 81, N 6. - P. 1988–1995. 539. Werynska, B. Correlation between expression of metallothionein and expression of Ki-67 and MCM-2 proliferation markers in non-small cell lung cancer. / B. Werynska, B. Pula, B. Muszczynska-Bernhard et al. // Anticancer Res. - 1997. - Vol. 11. - P. 440–444. 540. Whitson, B.A. Survival after lobectomy versus segmentectomy for stage I nonsmall cell lung cancer: a population-based analysis. / B.A. Whitson, S.S. Groth, R.S. Andrade et al. // Ann Thorac Surg. - 2003. - Vol. 92, N 10. - P. 1098–1106. 541. Whitson, B.A. T1/T2 non-small-cell lung cancer treated by lobectomy: does tumor anatomic location matter?. / B.A. Whitson, S.S. Groth, R.S. Andrade et al. // J Surg Res. - 2014. - Vol. 70, N 5. - P. 269–278. 542. Woenckhaus, M. Prognostic value of FHIT, CTNNB1, and MUC1 expression in non-small cell lung cancer. / M. Woenckhaus, J. Merk, R. Stoehr et al. // Hum Pathol. 2014. - [Epub ahead of print]. 543. Woo, T. Prognostic value of KRAS mutations and Ki-67 expression in stage I lung adenocarcinomas. / T. Woo, K. Okudela, T. Yazawa et al. // Lung Cancer. - 1997. Vol. 27, N 5. - P. 298–304. 544. Woolhouse, I. Variation in lung cancer outcomes in the UK and Europe. / I. Woolhouse // Clin Med. - 2008. - Vol. 27, N 2. - P. 83–90. 545. Wu, S. Aberrant expression of CD133 in non-small cell lung cancer and its relationship to vasculogenic mimicry. / S. Wu, L. Yu, D. Wang et al. // BMC Cancer. 2012. - 729532 [Epub]. 546. Xia, Q. Expression and association of HER2 with prognosis in early-stage (T1- 327 T2N0M0) non-small cell lung cancer. / Q. Xia, Z. Zhu, J. Wang et al. // Tumour Biol. 2004. - Vol. 319, N 1. - P. 1–11. 547. Xu, J.M. EGFR mutations and HER2/3 protein expression and clinical outcome in Chinese advanced non-small cell lung cancer patients treated with gefitinib. / J.M. Xu, Y. Han, H.Q. Duan et al. // J Cancer Res Clin Oncol. - 2009. - Vol. 4, N 5. - P. 568–577. 548. Xu, Y.J. Expression and clinical significance of leptin, the functional receptor of leptin (OB-Rb) and HER-2 in non-small cell lung cancer: a retrospective analysis. / Y.J. Xu, Y.F. Shao, X. Zhao et al. // J Cancer Res Clin Oncol. - 2007. - Vol. 2, N 7. - P. 603–612. 549. Yamaguchi, S. Relationship between the Responses to Simultaneous Double Staining for Ki-67 and AgNOR and the Clinicopathological Features of Non-Small Cell Pulmonary Carcinoma. / S. Yamaguchi // Acta Med Nagasaki. - 2014. - Vol. 35, N 7. - P. 7155–7162. 550. Yamashita, S. Ki-67 labeling index is associated with recurrence after segmentectomy under video-assisted thoracoscopic surgery in stage I non-small cell lung cancer. / S. Yamashita, T. Moroga, K. Tokuishi et al. // Ann Thorac Cardiovasc Surg. 1990. - Vol. 74. - P. 248–252. 551. Yan, S. Topoisomerase II alpha expression and the benefit of adjuvant chemotherapy for postoperative patients with non-small cell lung cancer. / S. Yan, J. ShunChang, C. Li et al. // BMC Cancer. - 2004. - Vol. 17, N 10. - P. 1235–1242. 552. Yang, J. Prognostic significance of MCM2, Ki-67 and gelsolin in non-small cell lung cancer. / J. Yang, N. Ramnath, K.B. Moysich et al. // BMC Cancer. - 2004. Vol. 23, N 4. - P. 347–353. 553. Yang, M. The number of resected lymph nodes (nLNs) combined with tumor size as a prognostic factor in patients with pathologic N0 and Nx non-small cell lung cancer. / M. Yang, H. Cao, X. Guo et al. // PLoS One. - 2013. - Vol. 143, N 6. - P. 1618– 1625. 554. Yano, T. Comparison of HER2 gene amplification assessed by fluorescence in situ hybridization and HER2 protein expression assessed by immunohistochemistry in gastric cancer. / T. Yano, T. Doi, A. Ohtsu et al. // Oncology Reports. - 2014. - Vol. 84, N 2. - P. 182–189. 555. Yano, T. Verification of the newly proposed T category (seventh edition of the tumor, node, and metastasis classification) from a clinicopathological viewpoint in nonsmall cell lung cancer-special reference to tumor size. / T. Yano, Y. Morodomi, K. Ito et 328 al. // J Thorac Oncol. - 2010. - Vol. 38, N 5. - P. 628–636. 556. Yarden, Y. Untangling the ErbB signalling network. / Y. Yarden, M.X. Sliwkowski // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2012. - Vol. 295, N 2. - P. 208–214. 557. Yaren, A. Bax, bcl-2 and c-kit expression in non-small-cell lung cancer and their effects on prognosis. / A. Yaren, I. Oztop, A. Kargi et al. // Int J Clin Pract. - 2003. Vol. 22, N 14. - P. 3546–3556. 558. Yasunaga, Y. Prognostic factors of renal cell carcinoma: a multivariate analysis. / Y. Yasunaga, M. Shin, T. Miki et al. // J Surg Oncol. - 2000. - Vol. 20, N 3. - P. 2091–2096. 559. Yoo, J. Immunohistochemical analysis of non-small cell lung cancer: correlation with clinical parameters and prognosis. / J. Yoo, J.H. Jung, M.A. Lee et al. // J Korean Med Sci. - 2010. - Vol. 136, N 7. - P. 1029–1037. 560. Yoshida, Y. Validation of 7th TNM staging system for lung cancer, based on surgical outcomes. / Y. Yoshida, T. Murayama, Y. Sato et al. // Asian Cardiovasc Thorac Ann. - 2000. - Vol. 182, N 3. - P. 311–322. 561. Yousem, S.A. Role of molecular studies in the diagnosis of lung adenocarcinoma. / S.A. Yousem // Modern Pathology. - 2005. - Vol. 24, N 7. - P. 865–869. 562. Zaczek, M. Silver-binding nucleolar organizer regions (AgNORs) in bronchial tumors. / M. Zaczek, Z. Chłap, W. Szot et al. // Folia Histochem Cytobiol. - 2004. - Vol. 45, N 2. - P. 181–188. 563. Zhang, B.C. Peritumoral lymphatic microvessel density is related to poor prognosis in lung adenocarcinoma: A retrospective study of 65 cases. / B.C. Zhang, S. Guan, Y.F. Zhang et al. // Exp Ther Med. - 2014. - Vol. 26, N 4. - P. 391–398. 564. Zhao, H. DNA topoisomerase II-alpha as a proliferation marker in human gliomas: correlation with PCNA expression and patient survival. / H. Zhao, H. Yu, Y. Liu et al. // Clin Neuropathol. - 2004. - Vol. 24, N 3. - P. 1925–1928. 565. Zhong, X. Examining Nek2 as a better proliferation marker in non-small cell lung cancer prognosis. / X. Zhong, X. Guan, Q. Dong et al. // Tumour Biol. - 2012. - Vol. 7, N 8. - P. 1263–1270. 566. Zhu, W.Y. Prognostic evaluation of CapG, gelsolin, P-gp, GSTP1, and Topo-II proteins in non-small cell lung cancer. / W.Y. Zhu, Y.Y. Hunag, X.G. Liu et al. // Anat Rec (Hoboken). - 2001. - Vol. 85, N 11. - P. 1706 –1712. 567. Zhu, Z.H. Vascular endothelial growth factor expression and microvessel density in stage I-II non-small cell lung cancer and their prognostic significances. / Z.H. Zhu, T.H. Rong, C.G. Zeng et al. // Ai Zheng. - 2012. - Vol. 62, N 1. - P. 10–29.
