Глава 4. Определение иммунофенотипа трансформированных клеток при диагностике и мониторинге онкогематологических
advertisement
Глава 4. Определение иммунофенотипа трансформированных клеток при диагностике и мониторинге онкогематологических заболеваний методом проточной цитометрии. Для диагностики онкогематологических заболеваний необходимо определение суммарного фенотипа трансформированных клеток, и, следовательно, ИЦХ, не позволяющая оценивать коэкспрессию нескольких маркеров на одной клетке, оказывается недостаточно информативным методом ИФТ. С точки зрения организации диагностического процесса, очевидно, что при проведении стернальной пункции планируется практически одновременное получение данных о морфологических, цитогенетических, цитохимических, и по иммунофенотипических, возможности, молекулярно-биологических характеристиках лейкозных бластов. Однако на практике это означает, что ИФТ проводится, и его результаты анализируются, чаще всего в отсутствие другой информации о клеточном составе костного мозга и его морфоцитохимических особенностях. Клиническая же характеристика (возраст пациента и время начала заболевания, размеры периферических, внутригрудных и абдоминальных лимфатических узлов, печени, селезенки) даже в совокупности с данными анализа крови и/или костного мозга не является достаточным основанием для выбора антител конкретных специфичностей. В связи с этим нами проведено ИФТ трансформированных клеток пациентов разных возрастных групп с использованием широкой панели маркеров, в той или иной степени характеризующих практически все ростки кроветворения. Мы рассматривали данные ИФТ как массив информации, корректный анализ которой должен приводить к формулировке диагноза, определению прогноза течения и степени риска развития осложнений, соответствующего т.е. лечения. служить основанием Полноценный ИФТ для назначения диагноз требует определять не только наличие/отсутствие того или иного антигена, но и одновременную экспрессию значимых в диагностическом плане молекул на поверхностной мембране или внутри клетки, т.е. суммарный иммунофенотип современного патологической проточного популяции. цитометра На базовой существует модели возможность одновременно оценивать экспрессию не менее трех маркеров в сочетании с данными о физических параметрах клетки по показателям прямого и бокового светорассеяния. При анализе лейкозной популяции количество антигенов, которые имеют диагностическое значение, значительно больше. Конечно, можно сопоставить информацию о количестве клеток, экспрессирующих маркер А (условное название) из одной комбинации антител (например, А/В/С) и количеством клеток, экспрессирующих маркер D из другой комбинации антител (например, D/E/F). Если количество этих клеток одинаково и совпадает с относительным количеством бластов в образце, то логично предположить, что все опухолевые клетки позитивны по маркерам А и D, т.е. суммарный фенотип клетки, равно как и популяции таких клеток соответствует A+D+. Описанный подход к оценке получаемой информации применяется при реализации ИФТ методами классической световой и люминесцентой ИЦХ, при которых в каждом препарате оценивается экспрессия только одного антигена, а иммунофенотипическом для профиле получения популяции информации суммируются об данные микроскопии достаточно большого количества препаратов. Такой подход к интерпретации данных может быть оправдан при высоком уровне бластоза в исследуемом образце и высокой плотности маркерных молекул на поверхностной мембране клетки, но опасен при относительно небольшом содержании бластов, при наличии бластов с гетерогенным (разным) уровнем экспрессии маркеров разной линейной принадлежности, при наличии нескольких опухолевых популяций. Значительное количество специфических антител и их комбинаций, используемых для диагностики острых лейкозов и хронических лимфопролиферативных заболеваний методом проточной цитометрии, может приводить к увеличению количества таких спекулятивных выводов. Для того, чтобы сделать выводы о суммарном фенотипе опухолевой клетки более основанными на фактах, чем на экстраполяции данных, мы пошли по пути использования нескольких маркеров как якорных. Для этого в разные сочетания антител был включен один и тот же маркер определенной специфичности. Например, предполагая выявление маркера А принципиальным для описания какой-то клеточной линии, мы включали его в комбинации антител, выявляющих клетки этой же клеточной линии (для уточнения уровня дифференцировки) или других клеточных линий (для уточнения направления дифференцировки). Количественное совпадение позитивных по маркеру А клеток в различных сочетаниях антител служило тем якорем, который позволял объективно оценить экспрессию и других антигенов, определить суммарный фенотип популяции (популяций) лейкозных клеток, включая варианты аберрантности фенотипа и частичную коэкспрессию в случае гетерогенности популяции. В качестве якорных антител использованы • панлейкоцитарный маркер CD45 • линейно-специфичные маркеры: o CD19 для характеристики В-клеточного направления дифференцировки; o CD3 (и/ли CD7) для характеристики Т-клеточного направления дифференцировки; o CD13 (и/или CD33) для характеристики миелоидного ряда; • маркеры клеток предшественников CD34, HLA-Dr и Tdt. Выбор именно этих молекул в качестве якорных основан на рекомендациях EGIL (European Group for the Immunological Characterization of Leukemias) по диагностике ОЛ и на характеристике того биологического материала, который обоснованно считается наиболее информативным при диагностике ОЛ и лейкемических форм ХЛПЗ. Таким биологическим материалом является костный мозг, одна из нормальных физиологических функций которого состоит в созревании и дифференцировке В-клеток до уровня наивных лимфоцитов. Соответственно, и якорной молекулой для описания этого клеточного ряда является CD19. С другой стороны, созревание и дифференцировка Тлимфоцитов происходят вне костного мозга, и поэтому в нем не должны выявляться Т-клетки ранних уровней дифференцировки. Определяемые в нормальном костном обладающими мозге известными Т-лимфоциты фенотипическими являются зрелыми, характеристиками и соответствующими функциями иммунного контроля. Поэтому для подтверждения Т-клеточной природы заболевания по возможности был использован не один, а два, относящихся к разным уровням дифференцировки маркера. Для определения информация варианта об ОЛ большое значение активности имеет терминальной дезоксинулеотидилтрансферазы (Tdt), экспрессии CD34 и HLA-Dr, а также о цитоплазматической экспрессии некоторых линейных маркеров (МПО, cyCD3, µ-цепь и др.). Поэтому в сочетания антител для их выявления были включены якорные линейно-ассоциированные молекулы. Положительным контролем ПЦ при работе с клетками лейкоцитарного происхождения является CD45, уровень экспрессии которого значительно отличается для разных популяций лейкоцитов (гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов). Это и обусловило его включение в качестве якорного маркера в сочетания антител для выявления молекул, которые могут быть экспрессированы в отсутствие пан лейкоцитарного маркера, в частности, гликофорина А и CD61. Использование якорных антител, конъюгированных с различными флюорохромами, экспрессия которых учитывается фотоумножителями Fl1, F2 или Fl3, и легло в основу диагностических сочетаний антител. Совершенно очевидно, что применение якорных маркеров приводит к дублированию информации об их экспрессии при оценке информативности сочетаний различных антител при исследовании каждого отдельного образца (рис.17). CD19 A Fl1 Fl2 Fl3 CD19 CD14 CD45 CD10 CD19 CD13 Tdt CD10 CD19 CD19 Б В CD10 Tdt Рис.17. Пример использования CD19 в качестве якорного маркера. А – схема включения якорных маркеров в диагностические сочетания антител. При ИФТ костного мозга сочетаниями антител CD10/CD19/CD13 и Tdt/CD10/CD19 выявлено, что клетки, позитивные по CD19 (якорный маркер), одновременно экспрессируют CD10 (Б) и Tdt (В). Количественная воспроизводимость кластеров CD10+CD19+ и Tdt+CD19+ позволяет описать суммарный фенотип популяции как Tdt+CD10+CD19+. Для анализа каждого образца сочетания антител были подобраны на основании включения якорных маркеров таким образом, чтобы возникала частичная дублированность информации, позволявшая рассматривать количественное совпадение популяций, выявленных на различных гистограммах как воспроизводимость данных внутри одного образца. В качестве уровня достоверности использован уровень расхождения популяций, выявленных на различных гистограммах внутри одного образца до 5%.
