На правах рукописи ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ
advertisement
На правах рукописи АЙЗЕНШТАДТ АЛЕКСАНДРА АНДРЕЕВНА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНОГО ТКАНЕВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» Научный руководитель: Доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна, ведущий научный сотрудник Лаборатории гибридомной технологии ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» МЗ РФ (г. Санкт-Петербург). Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук Галагудза Михаил Михайлович, директор Института экспериментальной медицины ФГБУ «Северо-Западный федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» МЗ РФ (г. Санкт-Петербург) Кандидат биологических наук Алексеенко Лариса Леонидовна, младший научный сотрудник отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта ФГБУН Институт цитологии Российской академии наук (г. СанктПетербург) Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины», г. Санкт-Петербург Защита диссертации состоится « » __________ 2015 г. в часов на заседании совета Д 212.232.12. по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный университет» по адресу: 199034, г. СанктПетербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биологический факультет. С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке им. М. Горького СанктПетербургского Государственного университета и на сайте Санкт-Петербургского государственного университета (http://spbu.ru/). Автореферат разослан « » _______________ 2015 г. Ученый секретарь Диссертационного совета Д 212.232.12 доктор биологических наук Людмила Андреевна Мамон 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Введение Мезенхимные стромальные (стволовые) клетки (МСК) – это недифференцированные клетки, происходящие из мезодермального зародышевого листка, обладающие способностью к самоподдержанию популяции и дифференцировке в клетки мезенхимного ряда (Deans et al., 2000; Rossant, 2001). Впервые МСК были описаны как клетки костного мозга с фибробласто-подобной морфологией, способные прикрепляться к поверхности культурального пластика и формировать колонии in vitro, а также дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях (Фриденштейн и др., 1968; Pittenger et al., 1999). В более поздних работах также была продемонстрирована способность МСК дифференцироваться в клетки эндотелия (Oswald et al., 2004), кардиомиоциты (Tokcaer-Keskin et al., 2009), нейроны и астроциты (Jori et al, 2005). В целостном организме МСК выполняют гомеостатические функции и служат для восполнения утраченных элементов кровеносных сосудов и опорно-двигательного аппарата, для заживления ран, для построения сосудистой сети плода и плаценты (Паюшина, 2015; Bielby et al., 2007; Glenn et al., 2014). Осуществление перечисленных функций МСК обеспечивается экспрессией генов, кодирующих широкий спектр адгезионных молекул, цитокинов, хемокинов и их рецепторов. Таким образом, МСК генетически детерминированы к процессам миграции, взаимодействия с другими клеточными элементами и межклеточным матриксом. При перемещении по сосудистому руслу и в интерстициальных пространствах МСК контактируют как с подвижными клетками (например, лейкоцитами), так и с резидентными элементами (эндотелиоцитами, фибробластами, межклеточным матриксом). Взаимодействия с ними требуют реализации различных программ миграции, пролиферации и дифференцировки. С этими свойствами, а также с возможностью культивирования МСК in vitro, связано их интенсивное изучение и применение в качестве основы для клеточной терапии различных заболеваний. В международной базе клинических испытаний на данный момент зафиксировано более 450 исследований с использованием МСК (https://clinicaltrials.gov). Результаты мета-анализа проводимых клинических исследований свидетельствуют об отсутствии серьезных побочных эффектов при введении МСК (Lalu et al., 2012). Несмотря на наличие многообещающих результатов доклинических и ограниченных клинических исследований, анализ действия МСК по сравнению с плацебо для большой выборки пациентов (III/IV фазы клинических испытаний) не дал однозначных результатов об эффективности их применения, в частности, для лечения реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) (Galipeau, 2013). Недостаточно высокая эффективность клинического применения МСК во многом обусловлена нехваткой знаний о свойствах МСК, а также неразработанностью методов предварительного тестирования клеток в соответствии с целями их использования. На сегодняшний день дискуссионными остаются вопросы о значимости различий в свойствах МСК, обусловленных характеристиками ткани, из которой были выделены клетки, а также индивидуальными особенностями донора биологического материала (Крылова и др., 2014; Payne et al., 2013; Rebelatto et al., 2008; Siegel et al., 2013). В течение более чем 30 лет после открытия основным источником материала для исследований МСК оставался костный мозг человека и лабораторных животных, но, начиная с конца 90-х годов 20 века, клетки с характеристиками, соответствующими МСК, были найдены в большинстве органов млекопитающих. Последнее время все больше внимания исследователей привлекают МСК, выделенные из жировой ткани (Zuk et al., 2002), из плаценты (Fukuchi et al., 2004) и ткани пупочного канатика (Covas et al., 2003; Wang et al., 2004). 3 Логически МСК, находящиеся в столь разных с физиологической точки зрения нишах, должны были бы различаться набором важных биологических характеристик. Тем не менее, при изучении МСК, выделенных из разных тканей, отмечали несомненное сходство между ними по экспрессии мембранных антигенов, по пролиферативному и дифференцировочному потенциалу (Covas et al., 2008; Musina et al., 2005; Vishnubalaji et al., 2012). Вместе с тем функциональные особенности МСК различного тканевого происхождения остаются малоизученными. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы в пределах одного исследования, с помощью стандартизованных методических приемов сравнить функциональные характеристики МСК, выделенных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика человека. В соответствии с указанной целью в работе были поставлены следующие задачи: 1. Получить первичные культуры МСК из костного мозга, жировой ткани и периваскулярного пространства пупочного канатика человека и сравнить их ростовые характеристики. 2. Сопоставить иммунофенотипичесикие характеристики МСК, выделенных из указанных источников. 3. Изучить функциональную активность МСК из разных источников в системах контактного сокультивирования с Т-лимфоцитами. 4. Исследовать проявления функциональной активности МСК по отношению к Влимфоидным клеткам. 5. Изучить влияние МСК из разных источников на аллерген-специфические эффекторные реакции в модельной системе in vitro. 6. Оценить изменение функционального состояния МСК при их взаимодействии с иммунокомпетентными клетками и под влиянием лимфоцитарных митогенов. Научная новизна Основной особенностью проведенного исследования является сопоставление морфо-функциональных свойств МСК различного тканевого происхождения с использованием набора методических приемов в стандартизованных экспериментальных условиях. Оценку морфологических, иммунофенотипических и ростовых характеристик проводили на большой выборке клеточных культур МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Это позволило сделать вывод о более высокой пролиферативной активности МСК пупочного канатика по сравнению с МСК костного мозга, а также выявить различия в экспрессии CD10, CD13, CD90 и CD105 на поверхности МСК в зависимости от их тканевого происхождения. Анализ функциональной активности МСК из разных источников в экспериментальных системах с использованием в качестве тест-объектов Т- и Влимфоцитов, либо В-лимфоидных клеточных линий показал меньшую выраженность иммуномодулирующего действия МСК костного мозга, по сравнению с МСК жировой ткани и пупочного канатика. В модельных экспериментах in vitro было продемонстрировано супрессорное влияние МСК различного тканевого происхождения на аллерген-специфические реакции лимфоидных клеток. Кроме того, было показано, что МСК оказывают разнонаправленное действие на продукцию IL-4 в зависимости от стимулирующего агента, предъявляемого иммуннокомпетентным клеткам, и соответственно, типа иммунного ответа. Впервые проведено сопоставление изменения функционального состояния МСК под воздействием лимфоцитарных митогенов и стимулированных этими митогенами лимфоидных клеток. Были описаны эффекты прямого действия на МСК Тлимфоцитарного митогена ФГА. Теоретическая и практическая значимость работы. Использование разных условий сокультивирования клеток позволило определить параметры экспериментальных систем, которые являются значимыми для выявления различий в свойствах МСК, 4 обусловленных индивидуальными особенностями доноров. Полученные данные могут быть использованы в качестве основы для создания алгоритмов контроля качества МСК конкретных пациентов/доноров, включающих в себя оценку функциональной активности этих клеток. Результаты работы свидетельствуют о том, что МСК периваскулярного пространства пупочного канатика могут являться перспективным источником для клинического применения. Показано, что в этой нише МСК содержатся в большом количестве, сопоставимом с получаемым при выделении МСК из 50-70 мл костного мозга, либо из 3-5 мл жировой ткани. Количество жизнеспособных и пролиферирующих МСК, которые можно получить из образца пупочного канатика, зависит от величины временного промежутка между родами и началом обработки материала. Была создана и охарактеризована коллекция первичных культур МСК пупочного канатика, насчитывающая 60 образцов, которые могут быть использованы в клинической практике. Положения, выносимые на защиту 1. МСК, выделенные из пупочного канатика и жировой ткани, как основа для клеточной терапии, обладают рядом преимуществ по сравнению с МСК костного мозга. 2. Общим свойством всех МСК является их способность влиять на функциональную активность лимфоидных клеток, но проявления иммуномодулирующего действия МСК зависят от параметров экспериментальных систем. 3. МСК из костного мозга, пупочного канатика и жировой ткани способны ингибировать проявления ряда аллерген-специфических эффекторных реакции in vitro. 4. Взаимодействие МСК и клеток иммунной системы в присутствии лимфоцитарных митогенов сопровождается активацией в МСК сигнальных путей, опосредованных транскрипционным фактором NFkB. Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на V Российской научно-практической конференции «Аллергические и иммунопатологические заболевания – проблема 21 века» (Санкт-Петербург, 2014), Международной научно-практической конференции «Регенеративная терапия и клеточные технологии» (Санкт-Петербург, 2013), Объединенном иммунологическом форуме (Н.Новгород, 2013). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня ВАК РФ. Личный вклад автора. Основная часть экспериментальной работы, планирование экспериментов, описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно. Измерения концентрации цитокинов методом ИФА осуществлялись совместно с Супильниковой О.В., что нашло отражение в совместных публикациях. Мононклональные антитела для выявления внутриклеточных иммуноглобулинов были получены из Лаборатории гибридомной технологии ФГБУ РНЦРХТ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение полученных результатов и их обсуждение, выводы и список литературы. Текст диссертации, сопровождается 54 рисунками и 6 таблицами. Список литературы содержит 297 источника, из них 281 на иностранном языке. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований. Получение, культивирование и морфологическая характеристика МСК. Образцы костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика получали при наличии информированного согласия доноров. Костный мозг получали в ходе пункции подвздошной кости у здоровых доноров (12 человек). Фракцию мононуклеарных клеток выделяли центрифугированием на градиенте фиколла. Клетки переносили в полную ростовую среду, которая состояла из Advanced 5 Stem Media и 20 % заменителя сыворотки HyClone, затем высевали во флаконы при плотности 100-200 тыс. кл/см2. Неприлипающие клетки удаляли через 3 суток. Образцы подкожной жировой ткани были получены от 13 здоровых доноров. Ткань механически измельчали, затем инкубировали в растворе коллагеназы I типа. Диссоциированные клетки переносили в полную ростовую среду и высевали во флаконы при плотности 100–200 тыс. кл/см2. Неприлипающие клетки удаляли через 24 ч. Образцы пупочных канатиков были получены при неосложненных родах. Сосуды канатика промывали раствором Версена, заполняли 0,2 % раствором коллагеназы IV типа, промывали и повторно заполняли раствором коллагеназы, затем клеммировали с двух сторон и инкубировали в течение 30 мин при 37 ºС. Полученную взвесь клеток отмывали от фермента центрифугированием (400 g, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности 100–400 тыс. кл/см2. Смену среды проводили через 3 сут. Было проанализировано 78 культур МСК, полученных из пупочного канатика. При достижении 70–80 % конфлюентности монослоя МСК снимали с поверхности раствором трипсин-версена и пересевали при плотности 5 тыс. кл/см2. Клетки культивировали при 37оС в атмосфере 5% СО2 и 20% (условия нормоксии) или 5% О2 (условия гипоксии) с использованием мультигазовых инкубаторов (BBD 6220, Thermo Scientific, США). Поверхностные маркеры МСК выявляли с помощью меченных флуорохромами антител против CD34, CD45, CD90, CD105 и CD73 на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, США) в соответствии с инструкцией производителя. Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения СХР. Подсчет клеток, определение их жизнеспособности и средних размеров осуществляли на автоматическом счетчике частиц (Beckman Coulter, США). Морфологическую характеристику МСК проводили с использованием программы CapturePro v2.8.8. при анализе фотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового инвертированного микроскопа Axiovert 40C, оснащенного системой анализа изображения Progress CT3 (Zeiss, Германия). Для оценки пролиферативной активности МСК определяли среднее время удвоения популяции Td по формуле Td=(log22)*t/[log2(Nt/N0)], где t – время прироста популяции, Nt – количество клеток через время t, N0 – исходное количество клеток. Получение и активация клеток мононуклеарной фракции. В исследовании использовали образцы венозной крови 5 здоровых доноров, а также 16-ти доноровдобровольцев, в анамнезе которых были зафиксированы клинические проявления гиперчувствительности (аллергический ринит, атопический дерматит, острая крапивница, гастроэнтерологические расстройства, атопическая бронхиальная астма, анафилаксия). В 4-х случаях реакции развивались после приема пищевых продуктов, в 3-х – после применения лекарственных препаратов, в остальных – после контакта с бытовыми и с пыльцевыми аллергенами (4 и 5 случаев соответственно). Все доноры в момент сбора образцов крови находились в состоянии ремиссии и не имели клинических проявлений аллергических реакций. Клетки мононуклеарной фракции выделяли на градиенте фиколла по стандартной методике. Клеточный состав лейкоцитарной фракции определяли с помощью гематологического анализатора Beckman-Coulter ACT Diff2. В-клеточные линии Namalva и U266 были были получены из Коллекции клеточных культур ИНЦ РАН. Клетки выращивали в среде IMDM с добавлением 7 % сыворотки эмбрионов коров HyClone. Сокультивирование МСК и клеток мононуклеарной фракции периферической крови. Использовали культуры МСК 2-3 пассажей, в фазе логарифмического роста (30-60% конфлюентности). Для этого МСК рассевали в ячейки 6-луночного планшета по 30 тыс кл/см2, через 24 ч в те же ячейки вносили разное количество клеток мононуклеарной фракции. Растворы аллергенов, либо ЛПС, либо ФГА вносили одновременно с началом 6 сокультивирования МСК и мононуклеаров. Сокультивирование проводили в среде RPMI с 10% сыворотки эмбрионов коров. Сокультивирование МСК и клеток линий Namalva либо U266. МСК рассевали в лунки 6-ти луночного планшета в концентрации 10 или 60 тыс кл/см2 в зависимости от требуемой плотности культуры. Через сутки в лунки с МСК вносили клетки линии Namalva либо линии U266. Сокультивирование проводили в среде IMDM с добавлением 7% сыворотки эмбрионов коров в течение 72 ч. Контролем служили клетки линий Namalva и U266, культивируемые без МСК. Оценка пролиферации лимфоцитов. Определение количества делений лимфоцитов проводили с помощью окраски витальным красителем карбоксифлуоресцеин сукцинимидным эфиром (CFSE). Количество поделившихся клеток оценивали по изменению интенсивности флуоресценции CFSE после окончания культивирования с помощью проточного цитофлуориметра FC500 (Beckman Coulter). Иммунофенотипирование лимфоцитов. С помощью проточной цитофлуорометрии выявляли популяции B-лимфоцитов (CD19+), естественных киллеров (CD3-, CD16+, CD56+), Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+), а также регуляторных Т-клеток (CD3+, CD4+, CD127low) и Т-лимфоцитов, экспрессирующих ранний (CD69+) и поздний (HLA-DR) маркеры активации. Анализ выполняли на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, США). Все эксперименты были поставлены в 4 повторностях. Иммуноферментный анализ. Определение концентрации IgE и цитокинов IL-4, IL-10, IL-6 в культуральной среде проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческих наборов (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции производителя. Оценку уровня продукции иммуноглобулинов в В-клеточных линиях осуществляли с помощью проточной цитофлуорометрии с окраской иммуноглобулинов меченными флуоресцеином моноклональными антителами, полученными в лаборатории гибридомной технологии ФГБУ РНЦРХТ. Для детекции IgE в клетках линии U266 использовали антитела E-5D4, для определения IgM в клетках линии Namalva – антитела M-2В9. Для сравнения результатов сокультивирования были использованы средние значения интенсивности флуоресценции в относительных единицах (Хсредн). Каждый вариант сокультивирования проводили в четырех повторах. Иммунофлуоресцентная микроскопия МСК высевали в концентрации 10 тыс кл/см2 в лунки 6-ти луночных планшетов, на дно которых помещали покровные стекла. Сокультивирование с клетками мононуклеарной фракции проводили, как описано выше, в течение 30, 60, 90, 180 мин или 24 ч в присутствии ФГА (10 нг/мл), ЛПС (10 нг/мл) или соответствующего анамнезу донора периферической крови аллергена. Для определения локализации в МСК субъединицы р65/RelA транскрипционного фактора NFkB препараты последовательно инкубировали с первыми кроличьими поликлональными антителами против р65 субъединицы NF-кВ (Abcam, США) в течение 45 мин и вторыми антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa 488 (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика; Abcam, США) в течение 60 мин, после каждой инкубации стекла промывали 0,1 % Tween в ФСР. Для выявления структуры актинового цитоскелета распластанных клеток проводили окраску родамин-фаллоидином (Sigma, USA) Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа AxioScope A1 (Zeiss, ФРГ). Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ “Excel” для WinXP и Graph Pad Prism 5.0. В качестве характеристик использовали среднее и стандартное отклонение. В экспериментах по изучению влияния МСК на аллерген-специфические реакции лейкоцитов оценивали межгрупповые различия с помощью U критерия Манна-Уитни при выбранном уровне значимости p< 0,05. 7 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. В пупочном канатике выделяют 2 ниши МСК: Вартонов студень и периваскулярное пространство пупочной вены. МСК, полученные из этих ниш представляют две отдельные популяции с различными свойствами (Carvalho et al., 2011; Ishige et al., 2009). Из периваскулярного пространства после 1 пассажа возможно получение в среднем 3,1 млн МСК (с минимумом – 0,7 и максимумом – 5,4) на каждые 10 см длины образца. Получение жизнеспособных и пролиферирующих МСК из пупочного канатика возможно в течение 24 после родов, но их количество снижается при транспортировке образца более 12 ч. В тоже время количество МСК не зависело от возраста роженицы и срока гестации (37-41 неделя). Известно, что во всех тканях, из которых были получены МСК, концентрация кислорода ниже, чем в атмосфере (Pasarica et al., 2009; Simon et al., 2008; Snow et al., 2002). Поэтому исследование характеристик МСК также целесообразно проводить при пониженном содержании кислорода. В ходе серии предварительных экспериментов было показано, что культивирование МСК из разных источников в условиях гипоксии приводит к повышению их пролиферативного потенциала (Рис. 1.) при сохранении морфологических характеристик клеток. А Б В Рисунок 1. Среднее время удвоения популяции МСК, полученных из костного мозга (А), жировой ткани (Б) и пупочного канатика (В), при их культивировании в условиях гипоксии (светло-серые столбцы) и нормоксии (темно-серые столбцы). По оси абсцисс – количество пассажей, по оси ординат – время удвоения популяции. Указано стандартное отклонение. МСК из пупочного канатика, обладают большей пролиферативной активностью, чем МСК костного мозга. Аналогичные результаты были получены ранее (Baksh et al., 2007). При длительном культивировании показано, что МСК пупочного канатика на поздних пассажах (с 6 пассажа) характеризовались меньшим временем удвоения популяции, чем МСК жировой ткани. Пролиферативная активность МСК пупочного канатика сохранялась в течение максимального количества пассажей по сравнению с МСК, полученными из других источников. Время удвоения популяции МСК пупочного канатика для проанализированных культур было практически одинаковым на 3-5 пассажах, но с 6 пассажа существенно различалось между культурами, полученными от разных доноров (от 52 до 194 ч) (Рис.1.). МСК, полученные из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, характеризовались способностью дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях. При иммунофенотипировании клеточных культур МСК костного мозга (25 образцов), жировой ткани (13) и пупочного канатика (32) показано что, процентное содержание клеток, экспрессирующих антигены CD90, CD105, CD44, CD73, и отрицательных по экспрессии CD45, CD34, CD117, CD14, во всех культурах превышало 90%. МСК пупочного канатика на ранних пассажах были гетерогенны по экспрессии CD10 (нейтральная эндопептидаза) и CD13 (аминопептидаза N) – в популяции присутствовало значительное количество клеток, не экспрессирующих эти антигены (Таблица 1.). При дальнейшем культивировании (с 3 пассажа) CD10 и CD13 экспрессировали 83 ± 10% и 71 ± 12,5 % клеток, соответственно. CD10 и CD13 вовлечены в регуляцию миграции и клеточной адгезии (Mina-Osorio et al., 2008; Subramani et al., 2013; Sumitomo et al., 2005), способность к которым является значимой при системном применении МСК. 8 Таблица 1. Доля клеток, экспрессирующих поверхностные антигены, в культурах МСК (2 пассаж), полученных из разных источников. Антиген СD90+ CD 105+ CD 73+ CD 10+ CD 13+ CD 44+ HLA-ABC CD 45CD14CD117CD34- Источник МСК Жировая ткань 99,3 ± 0,4 99 ± 0,8 98,2 ± 0,6 81 ± 13,5 97,3± 2,1 99,8 ± 0,05 99,8 ± 0,1 2,5 ± 1,2 2,4 ± 1,6 1,8 ± 0,5 3,4 ± 2,1 Пупочный канатик 99,2 ± 0,5 99,7 ± 0,2 99,3 ± 0,7 57,8 ± 17,1 34,6 ± 14,5 99 ± 0,9 99,5 ± 0,2 3 ± 2,4 3,8 ± 3,5 4,2 ± 3,8 2,1 ± 1,8 Костный мозг 99 ±0,4 99,3 ± 0,5 90 ± 6,2 98 ± 0,9 96,1 ± 1,9 97.5 ± 2,3 99,2 ± 0,1 1,9 ± 1,6 1,5 ± 0,8 1,1 ± 0,4 3,1 ± 2,8 Полужирным шрифтом выделены маркеры, по экспрессии которых выявлены достоверные различия между МСК пупочного канатика и МСК, выделенными из жировой ткани и костного мозга. Для проверки представления о низком уровне экспрессии HLA I на МСК (Климович, 2014; Franquesa et al., 2012; Newman et al., 2009) сравнивали среднюю интенсивность флуоресценции МСК жировой ткани и лимфоцитов периферической крови, полученных от одних и тех же доноров (3 здоровых донора). Средняя интенсивность флуоресценции МСК и лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих HLA I, практически не отличается (Рис.2.), что согласуется с работой Crop с соавторами, в которой высокий уровень экспрессии HLA I в МСК был продемонстрирован с помощью микрочипов (Crop et al., 2010). Б А Единицы относительной экспрессии, % Рисунок 2. Уровень экспрессии HLA I на МСК и лимфоцитах периферической крови. А Гистограмма интенсивности флуоресценции МСК жировой ткани (гистограмма с серым фоном) и лимфоцитов периферической крови (черная линия), экспрессирующих HLA I. Пунктирная линия – изотипический контроль. Б – Средняя интенсивность флуоресценции МСК и лимфоцитов периферической крови. Указано стандартное отклонение. 400 400 450 400 350 200 150 жировая ткань пупочный канатик 300 300 * * * * * * * * * 200 200 100 100 00 300 250 костный мозг ЛПС ФГА лейкоциты лейкоциты+ЛПС лейкоциты+ЛПС ФНОα Рисунок 3. Изменение средней интенсивности флуоресценции культур МСК, экспрессирующих HLA I, в присутствии митогенов (ЛПС и ФГА), либо ФНОα, либо при сокультивировании с интактными лейкоцитами или митоген-активированными лейкоцитами. По оси ординат отложены изменения средней интенсивности флуоресценции относительно значений в контроле, принятых за 100%. Указано стандартное отклонение.* – достоверные различия от контроля при р<0,05. 100 50 9 0 ЛПС ФГА лейкоциты лейкоциты+ЛПС лейкоциты+ФГА ФНОα Средняя интенсивность флуоресценции, отн.ед Уровень экспрессии HLA I на поверхности МСК, выделенных из всех источников, может индуцибельно возрастать при сокультивировании МСК с мононуклеарной фракцией периферической крови здоровых доноров в присутствии ФГА либо ЛПС, а также под воздействием провоспалительного цитокина ФНОα (Рис.3). Усиление экспрессии HLA потенциально делает МСК более иммуногенными, что может оказывать влияние на исход клинического применения аллогенных МСК. МСК костного мозга характеризовались более низкими значениями средней интенсивности флуоресценции клеток, экспрессирующих CD90, чем МСК пупочного канатика и жировой ткани, что свидетельствует о различной плотности изучаемого антигена на поверхности клеток, полученных из этих источников (Рис.4.). Ранее была показана корреляция между уровнем экспрессия CD90 на поверхности МСК и уровнем их иммуносупрессорной активности, что, возможно, опосредовано снижением продукции неклассического антигена HLA-G и цитокина IL-10 (Campioni et al., 2009). костный мозг жировая ткань пупочный канатик Рисунок 4. Средняя интенсивность флуоресценции культур МСК, экспрессирующих антиген CD90, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Указаны стандартные отклонения. * – достоверные различия при р<0,05. Таким образом, МСК из различных источников, имеют в целом, сходный иммунофенотип, но существуют различия в экспрессии CD10, CD13 и CD90. Это, возможно, влияет на функциональную активность МСК (либо указывает на ее уровень), что в свою очередь, может сказываться на проявлении свойств МСК in vivo. Исследование активности МСК при сокультивировании с лимфоидными клетками. Функциональную активность МСК, выделенных из разных источников, оценивали по их влиянию на эффекторные клетки при контактном сокультивировании в условиях гипоксии. В качестве эффекторных клеток использовали Т- и В-лимфоциты в составе мононуклеарной фракции, либо изолированные В-лимфоциты, а также клетки Влимфоидных клеточных линий Namalva и U266. Клетки мононуклеарной фракции стимулировали ФГА, либо ЛПС, которые являются митогенами для Т- и В-лимфоцитов, соответственно. Изучение влияния МСК на Т-лимфоциты. Согласно существующим в литературе данным, МСК могут влиять на процессы, происходящие на каждом из этапов Тклеточного ответа: при активации Т-клеток, пролиферации и осуществлении эффекторных функций. В ходе данной работы было показано, что МСК из всех источников стимулируют раннюю активацию Т-лимфоцитов. Внесение ФГА в смешанную культуру аддитивно увеличивало количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих СD69 (Рис.5.А.). При более длительном сокультивировании клеток мононуклеарной фракции с ФГА, наоборот, наблюдали подавление ФГА-индуцированного повышения экспрессии позднего маркера активации (HLA-DR) (Рис.5.Б.). 10 *#*#*# А * * * * без стимула ФГА HLA-DR+ Т-лимфоциты, % CD69+ Т-лимфоциты, % МНК 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 костный мозг жировая ткань Б 20 пупочный канатик * 15 10 # # # 5 0 без стимула ФГА Рисунок 5. А. Содержание CD69+ Т-лимфоцитов относительно общего количества Т-клеток. Б.Содержание HLA-DR+ Т-лимфоцитов относительно общего количества Т-клеток. *-данные, достоверно отличные от контроля (мононуклеарная фракция без стимула), # - данные, достоверно отличные от показателей в мононуклеарной фракции в присутствии ФГА(Р<0,05). А Доля поделившихся клеток, % Таким образом, МСК оказывали противоположное влияние на содержание Тлимфоцитов, несущих ранний и поздний маркеры активации, стимулируя экспрессию СD69, но подавляя индуцированную ФГА экспрессию HLA-DR. Поскольку увеличение содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих СD69, характерно для пациентов с ревматоидным артритом (Laffon et al., 1991) и РТПХ, а HLA-DR – с болезнью Крона, атопическим дерматитом и также РТПХ (Funderburg et al., 2012; Morante et al., 2006), для клинического применения МСК необходимо анализировать характер их влияния на активацию Т-лимфоцитов пациента. Влияние МСК, полученных из разных источников, на пролиферацию Т-лимфоцитов Подавление пролиферации Т-лимфоцтов в смешанной культуре клеток мононуклеарной фракции или лимфоцитов с МСК ранее было показано во многих работах (Di Nikola et al., 2003; Duffy et al., 2011), и может на данный момент рассматриваться как тестовая система для оценки иммуносупрессорных свойств разных культур МСК. МСК из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, одинаково эффективно подавляли пролиферацию Т-лимфоцитов при соотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции 1:1 и 1:10 (Рис.8). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 костный мозг жировая ткань пупочный канатик Б * * МНК * 1:1 * * * 1:10 * * 1:100 Рисунок 6. А. Пример диаграммы распределения стимулированных ФГА Т-лимфоцитов по интенсивности флуоресценции CFSE при их сокультивировании с МСК пупочного канатика в соотношении 1:1 (1) и без сокультивирования (2). Б. Доля поделившихся Т-лимфоцитов в мононуклеарной фракции после стимуляции ФГА при их сокультивировании с МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика и без сокультивирования (МНК). По осиординат– доля поделившихся Т-лимфоцитов относительно общего количества Т-лимфоцитов. *–данные, достоверно отличные от показателей в контроле. При соотношении 1:100, МСК костного мозга обладали менее выраженным супрессорным действием по сравнению с МСК жировой ткани и пупочного канатика Влияние МСК, полученных из разных источников, на пролиферацию В-лимфоцитов. Влияние МСК на пролиферативную активность В-лимфоцитов изучено менее полно по сравнению Т-лимфоцитами. Более того, накоплено значительное количество данных, противоречащих друг другу (Климович, 2014). В первой серии экспериментов – при сокультивировании МСК костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика с клетками мононуклеарной фракции в течение 72ч показано, что МСК подавляют пролиферацию В-лимфоцитов при равном 11 соотношении компонентов смешанной культуры. Соотношение МСК и В-лимфоцитов при этом составляет порядка 20:1. При уменьшении доли МСК (соотношение с клетками мононуклеарной фракции 1:10) достоверное снижение пролиферации В-лимфоцитов наблюдали только при сокультивировании с МСК жировой ткани и пупочного канатика, а супрессорное действие МСК костного мозга было выражено слабо (Рис.7). Доля поделившихся клеток, % Ряд1 А 100 костный мозг жировая ткань пупочный канатик Б 80 60 * 40 * * 20 * * 0 МНК 1:1 1:10 Рисунок 7. А. Пример диаграммы распределения стимулированных ЛПС лимфоцитов по интенсивности флуоресценции CFSE при их сокультивировании с МСК пупочного канатика в соотношении 1:10 (1) и без сокультивирования (2). Б. Доля поделившихся ЛПС-стимулированных В-лимфоцитов при сокультивировании мононуклеарной фракции с МСК, полученными из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, и без сокультивирования (МНК). Обозначения те же, что на Рис 6. При соотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции равном 1:100 наблюдали индивидуальную вариабельность влияния МСК на пролиферацию Влимфоцитов. Не было показано корреляции между характером действия МСК на Влимфоциты и источником получения МСК, возможно, из-за небольшого количества проанализированных культур (Рис.8). Рисунок 8. Доля поделившихся ЛПС-стимулированных В-лимфоцитов при сокультивировании МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика (+МСК) в соотношении МСК/ лейкоциты = 1:100 и без сокультивирования (МНК). Доля поделившихся клеток, % Во второй серии экспериментов, с использованием в качестве эффекторных клеток популяции выделенных с помощью иммунномагнитной сепарации В-лимфоцитов (чистота популяции более 95%), показано, что МСК подавляют пролиферацию В лимфоцитов только при соотношении клеток в культуре 1:1. При увеличении доли МСК (соотношение МСК/В-лимфоциты равное 10:1) не происходило подавления пролиферации В-лимфоцитов, а в части экспериментов количество клеток прошедших серию удвоений возрастало (Рис.9.). костный мозг жировая ткань пупочный канатик 100 80 Контроль 60 МСК костного мозга 40 МСК жировой ткани 20 МСК пупочного канатика 0 МНК 10:1 1:1 1:10 Рисунок 9. Доля поделившихся ЛПС-стимулированных В-лимфоцитов при их сокультивировании с МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика и без сокультивирования (МНК). Обозначения, как на Рис8. 12 Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о зависимости характера взаимодействия МСК и В-лимфоцитов от условий постановки эксперимента: наличия в смешанной культуре других иммунокомпетентных клеток, а также соотношения МСК и лимфоцитов. При сокультивировании МСК и клеток мононуклеарной фракции в соотношении 1:100 проявлялась индивидуальная вариабельность взаимодействия культур МСК и В-лимфоцитов. Учитывая неоднородность результатов, полученных при анализе влияния МСК на пролиферацию В-лимфоцитов, для оценки воздействия МСК на продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами в качестве эффекторных клеток выбрали В-клеточные линии Namalva и U266. Их преимуществом в качестве тест-объектов, является стабильная пролиферация, однородность состава популяции и конститутивная продукция иммуноглобулинов (Ig) на относительно постоянном уровне. МСК могут по-разному влиять на продукцию Ig в лимфобластоидных (Namalva) и миеломных (U266) клетках. На лимфобластоидные клетки МСК жировой ткани и пупочного канатика оказывали стимулирующее действие, а МСК костного мозга не оказывали эффекта (Рис.10.а). Действие МСК на миеломные клетки могло проявляться как в усилении, так и в подавлении продукции IgE. Факторы, стимулирующие накопление IgE, продуцировали пролиферирующие МСК жировой ткани и пупочного канатика. Культуры МСК из этих источников, прекратившие пролиферацию вследствие достижения 100%-ного монослоя, оказывали слабое подавляющее действие на накопление IgE. МСК костного мозга, не оказывали влияния на уровень продукции IgE клетками линии U266 (Рисунок 10.б.). Таким образом, МСК могут по-разному влиять на продукцию Ig лимфобластоидными и миеломными клетками в зависимости от источника получения и фазы роста культуры МСК. МСК из костного мозга, вне зависимости от фазы роста культур, не влияли на синтез IgM и IgE. Представленные результаты могут объяснять ряд имеющихся в литературе противоречий, касающихся способности МСК влиять на продукцию Ig клетками B-лимфоидного ряда. В частности, расхождения в оценке действия МСК жировой ткани на содержание Ig в клетках Namalva и U266 с данными, описанными ранее (Самойлович и др., 2013), могут быть связаны с различиями в фазах роста культур МСК, численном соотношении МСК и лимфоидных клеток, а также в сроках сокультивирования. Б А Рисунок 10. А.Уровень внутриклеточного IgM в клетках линии Namalva (А) и IgE в клетках линии U266 (Б) при сокультивировании с МСК в экспоненциальной (черные столбики) или стационарной фазах роста (серые столбики). Группы столбиков: 1 – МСК костного мозга, 2 – МСК жировой ткани, 3 – МСК пупочного канатика. Белые столбики – контроль. Указаны ошибки среднего.*– значения, достоверно отличные от контроля (р<0,05). При оценке влияния МСК на продукцию Ig также надо принимать во внимание, что лимфоидные клетки, представляющие разные стадии дифференцировки, могут стимулировать МСК к выработке разных цитокинов и ростовых факторов. Этот аспект взаимодействия МСК и B-лимфоидных клеток остается наименее изученным и требует дальнейших исследований. Влияние МСК на аллерген-специфические реакции лейкоцитов при атопической гиперчувствительности. Функциональную активность МСК изучали в экспериментах, в которых моделировали одно из звеньев эффекторной фазы аллергических реакций изменение состояния культивируемых клеток сенсибилизированного организма при повторном контакте с аллергеном. Клетки 13 мононуклеарной фракции были получены из образцов периферической крови 16 доноров с проявлениями гиперчувствительности в анамнезе. Клетки мононуклеарных фракций после выделения на градиенте фиколла содержали наряду с лимфоцитами моноциты и гранулоциты, т.е. все клеточные типы, которые ответственны за появление изменений, наблюдаемых при культивировании в присутствии аллергенов. При культивировании клеток мононуклеарной фракции в течение 72 ч в присутствии специфического аллергена в 13 образцах из 16 наблюдали рост содержания Тлимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR+, в 1,5-3 раза. Аллогенные МСК из всех источников предотвращали индуцированное аллергеном увеличение относительного содержания HLA-DR+ Т-клеток. В тех образцах, где инкубация с аллергеном не вызвала изменения содержания активированных Т-лимфоцитов, присутствие МСК не влияло на этот показатель. (Рис. 11.А.). Сокультивирование клеток мононуклеарных фракций с МСК из разных источников приводило к росту количества регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+ CD127low (Рис.11.Б.), что также сопровождалось повышением концентрации IL-10 в культуральной среде. Само присутствие аллергена в лейкоцитарных культурах не оказывало влияния на численность Т-регуляторных клеток и концентрацию IL-10. А Б * * * * Рисунок 11. Содержание активированных HLA-DR+ Т-лимфоцитов (А) и регуляторных Тлимфоцитов (CD4+,CD25+,CD127low) (Б) относительно Т-клеток в составе мононуклеарных фракций после их культивирования в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК костного мозга (МСК КМ), жировой ткани (МСК ЖТ) и МСК пупочного канатика (МСК ПК) в присутствии аллергенов. * - данные, достоверно отличные от контроля. Формирование популяции Т-регуляторных клеток под влиянием МСК может опосредовать иммуносупрессорное действие МСК на компоненты аллергических реакций. Увеличение концентрации IL-10 является одним из возможных механизмов снижения доли HLA-DR+ Т-лимфоцитов (Ebert et al., 2005). Внесение аллергенов в среду культивирования всех 16-ти образцов клеток мононуклеарных фракций индуцировало достоверное увеличение концентраций IL-4 и IgE. Сокультивирование лейкоцитарных фракций с МСК блокировало индуцированные аллергенами проявления гиперчувствительности: в присутствии МСК не происходило роста концентраций IgE и IL-4 (Рис. 12.А.и 12.Б., соответственно). А * Б * Рисунок 12. Концентрация IgE (А) и IL-4 (Б) в среде после культивирования клеток мононуклеарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из разных источников в присутствии аллергенов. Обозначения как на Рис.11. 14 1 0 -1 контроль аллерген 5 4 3 ФГА Концентрация ИЛ-4, пг/мл 2 Концентрация ИЛ-4, пг/мл Концентрация ИЛ-4, пг/мл В тоже время, при воздействии ФГА на клетки мононуклеарной фракции, сокультивирование с МСК приводило к незначительному увеличению концентрации IL-4 МНК костный мозг жировая ткань пупочный канатик в культуральной среде в экспериментах с материалом всех доноров (Рис.13). 5 * 4 * МНК костный мозг жировая ткань пупочны * * . * 3 МНК костный мозг жировая ткань пупочный канатик 5 4 3 2 Рисунок 13. Содержание IL-4 при сокультивировании МСК из костного мозга, жировой ткани и 1 2 пупочного канатика, с клетками мононуклеарной фракции периферической крови в присутствии 0 1 от контроля (Р<0,05). ФГА. * - данные, достоверно отличные контроль аллерген MFI, отн.ед. -1 0 Таким образом, МСК предотвращали увеличение концентрации IL-4 при контроль аллерген ФГА в присутствии стимулировании лимфоцитов аллергеном, но не подавляли продукцию IL-4 -1 ФГА. Характер влияния МСК на уровень продукции IL-4 зависит от стимулирующего агента, предъявляемого иммуннокомпетентным клеткам. Суммируя представленные результаты, можно сделать вывод, что проявление иммуномодулирующих свойств МСК в целом сходны у клеток из разных источников. Различия, обусловленные тканевой принадлежностью или индивидуальными особенностями донора, наблюдали относительно влияния МСК на пролиферацию Т- и Влимфоцитов при низкой концентрации МСК, продукцию иммуноглобулинов Вклеточными линиями и изменение концентрации IL-10. МСК из костного мозга имели менее выраженное влияние, чем МСК пупочного канатика и жировой ткани. Влияние клеток мононуклеарной фракции и лимфоцитарных митогенов на функциональное состояние МСК. В последние годы появился ряд работ, согласно которым, взаимодействие МСК с иммунокомпетентными клетками сопровождается включением в МСК сигнальных путей, опосредованных Toll-подобными рецепторами (TLR) и транскрипционным фактором NFkB (Dorronsoro et al., 2014; Romieu-Mourez et al., 2009). Изменение функционального состояния МСК оценивали по уровню экспрессии TLR3 и TLR4, характеру внутриклеточного распределения NF-κB с помощью методов проточной цитофлуорометрии и иммуноцитохимии. Экспрессия Toll-подобных рецепторов на мембране МСК. МСК из разных источников характеризуются низким уровнем экспрессии TLR4, что было показано методом проточной цитофлуорометрии (Рис.14.). МСК конститутивно экспрессируют TLR3. Уровень экспрессии TLR3 на поверхности МСК выше, чем на поверхности лимфоцитов периферической крови35(CD45+) (Рис.14.а). костный мозг жиров ая ткань пупочный канатик * 30 ** * * Контроль * А Б 25 МСК костного мозга 20 * ** МСК жировой ткани 15 МСК пупочного канатика 10 5 0 контроль ФГА ЛПС МНК МНК+ФГА МНК+ЛПС Рисунок 14. А. Гистограмма интенсивности флуоресценции МСК костного мозга (черная линия) и лимфоцитов периферической крови (гистограмма с серым фоном), экспрессирующих TLR3. Пунктирная линия – изотипический контроль. Б. Средняя интенсивность флуоресценции МСК, экспрессирующих TLR3, в присутствии митогенов (ЛПС либо ФГА), либо при сокультивировании с интактными лейкоцитами (МНК) или митоген-активированными лейкоцитами. Указано стандартное отклонение. * – достоверные различия от контроля при р<0,05. 15 ФГА Показано индуцибельное усиление экспрессии TLR3 на поверхности МСК. Наибольшее увеличение средней интенсивности флуоресценции МСК, экспрессирующих TLR3, наблюдали при их сокультивировании с клетками мононуклеарной фракции в присутствии лимфоцитарных митогенов: ФГА или ЛПС. Воздействие ЛПС на монокультуру МСК также приводило к увеличению интенсивности флуоресценции МСК, экспрессирующих TLR3, на 29,5±11,3 %. Уровень экспрессии TLR3 и степень его изменения не зависели от источника МСК. (Рис.14.б) Анализ локализации транскрипционного фактора NFkB в МСК. Анализировали изменение локализации транскрипционного фактора NF-kB в МСК при сокультивировании с активированными ФГА или ЛПС клетками мононуклеарной фракции. Контролем служили монокультуры МСК, которые инкубировали с ФГА или с ЛПС. В интактных МСК NFkB находится в цитоплазме и не обнаруживается в ядре (Рис.15). Рисунок 15. Распределение транскрипционного фактора NFkB в интактных МСК. Красным отмечены структуры актинового цитоскелета, окрашенные родамин-фаллоидином (RhPH), зеленым – антитела к субъединице p65 и вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa-488, синим – ядра клеток, окрашенные DAPI. Флуоресцентная микроскопия. Масштабный отрезок – 10 мкм. 24 ч 30 мин Контактное сокультивирование МСК с интактными лимфоцитами не индуцировало транслокацию NFkB в МСК. Ядерный импорт транскрипционного фактора наблюдали под влиянием ЛПС. Через 30 мин инкубации МСК с ЛПС NFkB был локализован в ядре во всех клетках, после 24 ч ядерная локализация NFkB сохранялась в 80% МСК (Рис.16.). Рисунок 16. Локализация транскрипционного фактора NFkB в МСК при инкубации с ЛПС в течение 30 мин и 24ч. Масштабный отрезок – 5 мкм. Обозначения как на Рис. 15. Воздействие ФГА также вызывало транслокацию NFkB в ядро МСК в течение 30 мин. Кроме того, при инкубации с ФГА наблюдали обратимую перестройку актинового цитоскелета в течение 15-30 минут, а также изменение морфологии клеток (Рис.17.). После 24 ч инкубации с ФГА ядерная локализация NFkB сохранялась в 60% МСК. Рисунок 17. Локализация транскрипционного фактора NFkB в МСК при инкубации с ФГА в течение 24 ч. Масштабный отрезок – 5 мкм. Обозначения те же, что на Рис. 15. При контактном сокультивировании МСК и активированных митогеном (ФГА или ЛПС) клеток мононуклеарной фракции через 30 минут NFkB обнаруживали в ядре в 30% популяции МСК (у 70% МСК транскрипционный фактор оставался в цитоплазме). Транлокация NFkB в ядро во всех клетках завершалась через 60-90 мин (Рис.18.). 16 1 3 2 4 1 2 4 90 мин 30 мин 3 Рисунок 18. Распределение NFkB в МСК при контактном сокультивировании с лейкоцитами в присутствии ЛПС в течение 30 мин и 90 мин. Стрелками показаны лимфоциты на поверхности МСК. 1,2 – ядра МСК, в которых завершилась транслокация NFkB в ядро, 3,4 – ядра МСК, в которых NFkB локализован преимущественно в цитоплазме. Обозначения те же, что на Рис. 15. Таким образом, воздействие ЛПС – лиганда TLR4 – вызывает транслокацию NFkB в ядро МСК. Аналогичный процесс наблюдали при инкубации с ФГА – митогеном Тлимфоцитов, который также может выступать в качестве лиганда TLR4 (Unitt et al., 2011). Однако, как было описано выше, TLR4 на поверхности МСК является трудно-детектируемым с помощью проточной цитофлуорометрии, что свидетельствует об очень низкой плотности этого рецептора на поверхности МСК, что, возможно компенсируется высоким аффинитетом связывания TLR4 c ЛПС. В свою очередь ФГА частично может взаимодействовать с гетеродимером TLR2/6 (Unitt et al., 2011), который экспрессируется в МСК (Grote et al., 2013). При сокультивировании с активированными ЛПС или ФГА клетками мононуклеарной фракции транслокация NFkB в МСК происходит значительно позже, что может свидетельствовать об активации NFkB-опосредованных сигнальных путей в МСК в ответ на медиаторы, продуцируемые иммуннокомпетентными клетками. Для проверки такого предположения локализацию NFkB в МСК анализировали при воздействии TNFα. TNFα индуцировал импорт транскрипционного фактора в ядро в течение 30 минут после начала воздействия. Ядерная локализация сохранялась в течение 4 часов, после чего NFkB 2 Перераспределение NFобнаруживался преимущественно в цитоплазме клеток (Рис.19). κB в МСК происходило одинаково во всех проанализированных культурах МСК, 30 мин полученных из костного мозга, жировой ткани, и пупочного канатика. Временные 12 ч 30 мин 12 ч 1 ч 4 ч 30 мин 1ч Рисунок 19. Распределение NFkB в МСК при инкубации с TNFα. Обозначения как на Рис. 15. интервалы, в которые наблюдали транслокацию NF-κB, также были схожими для всех культур МСК. Изменение функционального состояния МСК непосредственно под влиянием как ЛПС, так и ФГА, может являться одним из вероятных объяснений расхождения результатов, полученных in vitro при сокультивировании МСК с имммунокомпетентными клетками, стимулированными различными стимулами, а также с данными о процессах, происходящих под воздействием на МСК отдельных провоспалительных цитокинов. Локализацию NFkB в МСК анализировали также в смешанной культуре со стимулированными специфическими аллергенами клетками мононуклеарной фракции крови пациентов с проявлениями гиперчувствительности. В течение всего процесса сокультивирования, транскрипционный фактор NFkВ был локализован в цитоплазме МСК (Рис. 20.). При этом проанализированные культуры МСК ингибировали проявления аллерген-специфических эффекторных реакций в условиях in vitro. Рисунок 20. Локализация NFkB в МСК при сокультивировании с лейкоцитами в присутствии аллергена в течение 90 мин. Обозначения те же, что на Рис. 15. 17 Таким образом, модуляция МСК активности аллерген-активированных лимфоцитов происходит с вовлечением сигнальных путей, не связанных с транскрипционным фактором NFκB. Наши наблюдения могут быть свидетельством того, что лабильность иммуномодулирующего действия МСК обусловлена активацией в них различных сигнальных путей под воздействием соответствующих медиаторов, продуцируемых иммуннокомпетентными клетками. Заключение. Сравнение костного мозга, жировой ткани и периваскулярного пространства пупочного канатика по количеству выделяемых из них МСК и их характеристикам показало, что использование пупочного канатика как источника МСК имеет ряд преимуществ. Это связано с тем, что для получения пупочного канатика не требуется инвазивных процедур, при этом периваскулярное пространство пупочного канатика характеризуется высоким содержанием МСК, которые обладают большим пролиферативным потенциалом, чем МСК из других источников. В использованных экспериментальных моделях было показано, что функциональная активность МСК пупочного канатика относительно лимфоидных клеток сходна с МСК жировой ткани и в части экспериментальных систем превышает таковую МСК костного мозга. Проявление функциональной активности МСК по отношению к компонентам иммунной системы зависит от ряда факторов. Учитывая лабильность взаимодействия МСК и эффекторных клеток, можно говорить о том, что многочисленные данные, накопленные в литературе на данный момент, могут рассматриваться не как противоречащие, а как дополняющие друг друга. Поэтому использование различных экспериментальных систем как in vitro, так и in vivo при исследовании функциональной активности МСК является необходимым для эффективного и безопасного применения МСК в клинической практике. При этом необходима разработка функциональных тестов для культур МСК в зависимости от нозологии, при которой планируется их применение. Подобные тесты необходимо проводить с клеточным материалом конкретного пациента, для которого планируется такое лечение. ВЫВОДЫ 1. Из периваскулярного пространства пупочного кантика и жировой ткани можно получить МСК в большем количестве и с более высоким пролиферативным потенциалом, чем из аспирата костного мозга. 2. Культуры МСК из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика сходны по морфологическим признакам, обладают одинаковым содержанием клеток, несущих МСКассоциированные маркеры, за исключением CD10 и CD13, но отличаются по уровню экспрессии CD90. 3. Модулирующее действие МСК на Т-лимфоциты является общим свойством МСК, выделенных из разных источников, которое проявляется в дозозависимом подавлении пролиферации Т-лимфоцитов, стимуляции экспрессии раннего маркера активации, а также блокировании индуцированного увеличения экспрессии позднего маркера активации Т-лимфоцитов. Проявления функциональной активности МСК в экспериментальных моделях с использованием в качестве тест-объектов В-лимфоидных клеток зависит от ряда факторов, таких как соотношение МСК и эффекторных клеток, присутствие в смешанной культуре других иммунокомпетентных клеток, стадия дифференцировки В-клеток, а также источник получения и фаза роста культуры МСК. 4. При моделировании эффекторной фазы аллергических реакций in vitro аллогенные МСК вне зависимости от тканевого происхождения блокируют индуцированную аллергенами продукцию IgE и IL-4 и предотвращают увеличение относительного содержания Т-лимфоцитов, несущих поздний маркер активации HLA-DR. 5. Под влиянием лимфоцитарных митогенов, а также в ходе взаимодействия МСК с иммунокомпетентными клетками, активированными этими митогенами, в МСК происходит изменение функционального состояния, которое проявляется в транслокации транскрипционного фактора NFkB и изменении уровня экспрессии TLR3. 18 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи: 1. А.А. Айзенштадт, Н.А. Иванова, В.В. Багаева, А.Б. Смолянинов, М.П. Самойлович, В.Б. Климович. Внутрикличеточные иммуноглобулины в линиях Namalva и U266 при сокультивировании с мезенхимными клетками // Цитология – 2014 – Т.56. – С. 117-121. 2. А.А.Пиневич, М.П.Самойлович, О.А.Шашкова, Н.Л.Вартанян, В.Н.Полысалов, Л.Н.Киселева, А.В.Карташев, А.А.Айзенштадт, В.Б.Климович. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток при раке молочной железы // Клеточные технологии в биологии и медицине – 2014 – Т.2. – С.84-91. 3. А.А.Айзенштадт, О. В. Супильникова, А. Б. Смолянинов. Влияние мезенхимных стволовых клеток на продукцию IL-4 и IgE активированными аллергеном лимфоцитами. // Вестник СЗГМУ им. И.И. Мечникова – 2014 – Т.6. – С.43-48. 4. А.А.Айзенштадт, О.В. Супильникова В.В., Багаева, А.Б. Смолянинов, М.П. Самойлович, В.Б. Климович. Влияние мезенхимных стволовых клеток на аллергенспецифические реакции лейкоцитов при атопической гиперчувствительности // Цитология – 2014 – Т.57. – С. 197-203. Опубликованные тезисы. 1. Айзенштадт А. А., Кананыхина Е. Ю., Климович В. Б., Смолянинов А. Б. 2011. Культивирование мезенхимальных клеток пуповинной крови человека и сравнение их свойств с мезенхимальными клетками костного мозга человека. Сборник тезисов с конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» IV Всероссийская научная школа-конференция», стр.40. 2. Irina Trofimova, Alexandra Aizenstadt, Alexandrina Khrupina, Alexander Smolyaninov. Karyotyping analysis of mesenchymal stem cells in stem cell bank Pokrovsky // Chromosome Research. The Biology of Chromatin and Chromosomes. European Cytogeneticists Association (E.C.A.) «8th European Cytogenetics Conference», Porto, Portugal 2-5 July 2011. - Vol. 19, Suppl. 1, 2011. – P. S126 - S127 3. Айзенштадт А.А., Могиленко Д.А., Климович В.Б. 2011. Изменение содержания ICAM1 на поверхности мезенхимальных стволовых клеток в ответ на действие провоспалительных цитокинов. Медицинская иммунология. т.13: стр.304. 4. Айзенштадт А.А., Хрупина А.С., Трофимова И.Л., Адылов Ш.Ф., Фатеев Д.А., Смолянинов А.Б. 2011. Подготовка мезенхимальных стволовых клеток к тарнсплантациии: контроль качества при культивировании Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины (Сборник тезисов). С. 13-14 5. Айзенштадт А.А., Климович В.Б., Кананыхина Е.Ю., Смолянинов А.Б. Динамика изменений содержания ICAM-1 на поверхности мезенхимальных стволовых клеток пуповинной крови в ответ на действие противовоспалительных цитокинов // Здоровый образ жизни и вредные для здоровья факторы. Материалы седьмой международной конференции 15-16 декабря 2011г 6. А. А. Айзенштадт, А.С. Хрупина, А.Б. Смолянинов, М.П. Самойлович, В.Б. Климович. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на лимфоциты, активированные аллергеном // Российский иммунологический журнал – 2013 – том 7 (16), №2-3 – с. 171. 7. А. А. Айзенштадт, А. С. Хрупина, С. А. Смирнова, А. Б. Смолянинов, М. П. Самойлович, В. Б. Климович. Иммуносупрессивное влияние мезенхимальных стволовых клеток при сокультивировании с лимфоцитами, автивированными аллергеном // Тезисы докл. Всерос. симп. и школы-конференции для молодых ученых по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 23-25 октября 2013 г.). - Цитология. – 2013. – Т. 55, № 9. – С. 627. 19
