С. А. Пушкарёв, А. В. Аклеев АДАПТАЦИОННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

С. А. Пушкарёв, А. В. Аклеев
АДАПТАЦИОННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ
ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
У ЛИЦ, ПОДВЕРГШИХСЯ ХРОНИЧЕСКОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ
ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ
При использовании нейтрального варианта метода ДНК-комет оценивалась
эффективность репарации ДНК и регуляции апоптоза в лимфоцитах периферической крови у людей, подвергшихся хроническому облучению, а также способность лимфоцитов этих людей формировать адаптивный ответ. В группе облученных по сравнению с контролем отмечена тенденция к снижению уровней всех
параметров комет и частоты апоптоза. Как в контроле, так и в опыте не было
отмечено достоверных изменений степени фрагментации ДНК в пробах до облучения клеток в дозе 1 Гр, непосредственно после облучения и два часа спустя.
Однако в обеих группах наблюдались отдельные случаи достоверного адаптивного
ответа или повышения радиочувствительности в вышеуказанные моменты времени после облучения. Высказано предположение, что в каждом отдельном случае активность защитных систем репарации и регуляции апоптоза различна и зависит от тех или иных индивидуальных особенностей обследованного человека.
В результате загрязнения реки Течи радиоактивными отходами ПО «Маяк» около
30 000 человек, проживавших в прибрежных селах в 1950-1960 гг., подверглись хроническому радиационному воздействию [1; 2]. Многолетние медицинские и эпидемиологические исследования позволили выявить у этих людей ряд отдаленных последствий облучения, выражающихся в изменении различных гематологических параметров, а также
в изменении частоты опухолеобразования [1; 2]. Эти данные особенно актуальны в связи с возросшим в настоящее время интересом к так называемым эффектам малых доз и
последствиям хронического низкоинтенсивного воздействия радиации. Открытие таких
эффектов малых доз (ЭМД), как адаптивный ответ (АО) и повышение радиочувствительности (ПЧ) после облучения в малых дозах, эффект свидетеля и нестабильность генома,
привели к возникновению новых взглядов на формирование отдаленных эффектов малых доз радиации. Предполагается, что наряду с непосредственным повреждением ДНК
в результате воздействия излучения на клетку важную роль в реализации последствий
облучения и формировании отдаленных эффектов играет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза [3-5].
А_
аЛ/ГТТ
Одной из важнейших таких систем, участвующих в формировании АО и других ЭМД,
является система репарации, и в первую очередь механизмы репарации двунитевых разРывов (ДР) ДНК. Согласно одной из гипотез, именно инициация репарации ДР является
ключевым событием в формировании АО [6]. Другая гипотеза решающую роль в формировании АО отводит селективной гибели наиболее радиочувствительных клеток по
~7о^
что позволяет использовать для их оценки метод Д^-комет
основании степени фр
ИФ«и
механизмов репарации ДНК и р е г у л я ц и и , — в
в
и У людей, подвергшихся хроническому облучению,
э
тих людей формировать АО.
^
^
^
^
^
95
Материалы и методика. В ходе эксперимента была обследована группа из 21 человека. Из них 11 составили группу лиц, подвергшихся хроническому облучению, 10 —
группу сравнения.
Первая группа была представлена людьми, проживающими в окрестностях реки Течи
и имеющими реконструированную дозу облучения красного костного мозга (ККМ). В
состав группы сравнения входили лица, проживающие на близлежащих территориях, не
подвергшихся радиоактивному загрязнению и имеющие сходные социальные и медицинские условия с первой группой. Обе группы сопоставимы по национальному составу
(преобладало тюркское население) и среднему возрасту (66,4 года — группа облученных
и 68,2 года — контрольная группа). Группа облученных состояла из 9 женщин и 2 мужчин, контрольная группа — из 10 женщин. Средняя доза облучения на красный костный
мозг для группы облученных людей составляла 1,07 ± 0,22 Гр, при этом минимальная
доза — 0,08 Гр, а максимальная — 2,26 Гр.
Используя нейтральный вариант метода ДНК-комет (Comet assay) или гель-электрофореза единичных клеток [8; 9], оценивали степень фрагментации ДНК, а следовательно,
и количество двунитевых разрывов ДНК, в лимфоцитах крови.
Критериями оценки состояния ДНК в клетке являлись длина хвоста кометы, доля
мигрировавшей ДНК и интегральный показатель — момент хвоста. Анализировалась
также частота апоптоза; апоптотическими считались кометы, доля мигрировавшей ДНК
в которых превышала 40 %.
Оценивали фоновые уровни данных показателей, уровни в активированных ФГА лимфоцитах непосредственно после облучения клеток in vitro в дозе 1Гр у-излучения (Csl37;
мощность дозы — 0,71 Гр/мин), а также спустя 2 и 24 ч после него. В те же интервалы
времени анализировали пробы, предварительно, за 4 ч до воздействия дозы в 1 Гр, облученные в дозе 0,05 Гр. Оценивались и исходные уровни фрагментации на первые и
вторые сутки инкубации лимфоцитов, а также непосредственно после облучения в дозе
0,05 Гр и спустя 2, 4 и 24 ч. Статистическая обработка материала осуществлялась с использованием программы Statistica 6.0, а также пакета статистического анализа MS Excel.
Сопоставление средних величин оцениваемых параметров комет производилось по критерию Уилкоксона-Манна.
Достоверность различий между величинами какого-либо из параметров комет или
частотами апоптоза в различные сроки после облучения в дозе 1 Гр в пробах, предварительно облучённых в дозе 0,05 Гр, и пробах, не подвергавшихся такому облучению, служила критерием наличия у человека адаптивного ответа или повышения радиочувствительности. Сопоставление групп по количеству случаев тех или иных типов адаптивных
реакций осуществлялось с использованием критерия Пирсона (Хи-квадрат).
Результаты и обсуждение. Было выявлено, что фоновые величины таких параметров, как длина и момент хвоста ДНК-комет, в группе облученных достоверно ниже, чем
в контрольной группе. Это хорошо согласуется с достоверно более низкими фоновыми
значениями апоптоза у облученных.
Средние значения длины хвоста и момента хвоста спустя 2 ч после облучения в дозе
1 Гр в группе облученных также достоверно ниже аналогичных показателей в контроле.
Однако достоверных отличий по частоте апоптоза в тот же период после воздействия
дозы 1 Гр не выявлено.
сутки инкубации ни по одному из показателей достоверных отличий между опытом и
контролем обнаружено не было.
96
В группе лиц, подвергшихся хроническому облучению, уровни показателей непосредственно после облучения лимфоцитов в дозе 1 Гр и через 2 ч после ее воздействия не отличались друг от друга, а также от исходного уровня в первые сутки инкубации клеток. Однако эти уровни достоверно ниже тех, что наблюдаются через 24 ч
после облучения в дозе 1 Гр. Кроме того, исходные уровни мигрировавшей ДНК, величины момента хвоста, частота апоптоза, а также уровни этих показателей, наблюдаемые спустя 2 ч после воздействия, 1 Гр у-излучения были достоверно ниже исходных на вторые сутки инкубации. Частота апоптоза на вторые сутки инкубации также
была достоверно выше уровня, наблюдавшегося непосредственно после облучения в
дозе 1 Гр. При этом ни для одного из показателей в исходной пробе на вторые сутки
не было выявлено достоверных отличий от уровня через 24 ч после облучения в дозе
1 Гр. По всей видимости, в случае с лимфоцитами, взятыми из периферической крови людей, подвергшихся хроническому облучению, основное влияние на величины
оцениваемых показателей комет на вторые сутки инкубации лимфоцитов независимо
от наличия или отсутствия за 24 ч до этого острого облучения в дозе 1 Гр оказывают
сами условия инкубации.
Подобное влияние инкубации на оцениваемые показатели для клеток, взятых у лиц
контрольной группы, имеет менее выраженный характер. Как и в группе облученных
лиц, уровни в первые сутки, а также непосредственно после облучения в дозе 1 Гр и
спустя 2 ч после этого не имели достоверных отличий, однако в контроле не наблюдалось отличий между показателями в данных пробах и исходными уровнями на вторые
сутки инкубации. Такие отличия имели место лишь при сопоставлении с величинами,
наблюдавшимися через 24 ч после облучения в дозе 1 Гр, где все показатели оказались
значимо выше, нежели в упомянутых пробах. При этом уровни через сутки после облучения клеток не отличались достоверно от уровней на вторые сутки инкубации.
Оценка параметров комет и частоты апоптоза для клеток, подвергшихся облучению
в дозе 0,05 Гр, выявила достоверно более низкие величины длины и момента хвоста по
сравнению с контролем непосредственно после облучения, а спустя два часа после воздействия дозы 0,05 Гр достоверно более низкие по сравнению с контролем величины отмечались для всех оцениваемых показателей.
Отличия от контроля наблюдались и после 4 ч инкубации лимфоцитов облученных
в дозе 0,05 Гр, и после их повторного облучения в дозе 1 Гр, а также спустя 2 ч после
воздействия повторной дозы. Во всех трех случаях у лимфоцитов людей, подвергшихся
хроническому облучению, отмечались достоверно меньшие величины длины хвоста комет, а непосредственно после облучения отмечались также достоверно меньший процент
мигрировавшей ДНК и более низкая частота апоптоза, нежели в контроле.
В группе лиц, подвергшихся хроническому облучению, было отмечено, что для клеток, предварительно облученных в дозе 0,05 Гр, уровни всех оцениваемых показателей
через 24 ч после облучения в дозе 1 Гр достоверно выше уровней через 4 ч после облучения в дозе 0,05 Гр, а также уровней непосредственно и через 2 ч после воздействия облучения в дозе 1 Гр. Аналогичная картина наблюдалась и в контрольной группе.
Более в^окнеуровниповсемпоказате™^^
облучения в дозе 0,05 Гр, а также непосредственно после воздействия « М " " *
.1 Гр отмечались и ч е р Л ч после облучения в дозе 0,05 Гр. В
^
^
Добное 0 Т Л ичие наблюдалось только по величине момента«
нии с показателем непосредственно после облучения в дозе 1
р
конотличались
тролев от уровней
ы через 24
не
_
„
^ ^ z
в контроле, так и в опыте показатели комет всех инкубированных лимфоцитов независимо от наличия или отсутствия дополнительного острого облучения с высокой степенью
достоверности отличались от фоновых уровней.
Сравнение средних величин оцениваемых показателей в разные сроки после облучения в дозе 1 Гр в пробах, подвергавшихся предварительному облучению в дозе 0,05 Гр и
не подвергавшихся такому воздействию, не выявило достоверных отличий ни в группе
облученных лиц, ни в контрольной группе.
Отдельные случаи адаптивного ответа или повышения радиочувствительности по
различным критериям в различные сроки после воздействия разрешающей дозы 1 Гр
отмечались в обеих группах. Однако ни по одному из критериев не было выявлено достоверных отличий между частотой случаев данных адаптивных реакций в группе лиц,
подвергшихся хроническому облучению, и в контрольной группе в рассмотренные промежутки времени после воздействия разрешающей дозы 1 Гр.
Таким образом, результаты данной работы указывают на наличие достоверно более
низких фоновых показателей длины хвоста и момента хвоста в группе облученных по
сравнению с контролем. Подобные же отличия по частоте апоптоза позволяют предположить, что именно апоптотические клетки оказывают основное влияние на средние
величины фонрвых параметров комет.
Тенденция к сохранению более низких уровней оцениваемых показателей в группе
облученных отмечалась во всех пробах по всем параметрам комет и частоте апоптоза.
Чаще всего достоверные отличия выявлялись по длине хвоста комет.
Вероятно, на анализируемые параметры оказывают влияние и условия инкубации.
На вторые сутки все показатели в обеих группах превышают уровни в первые сутки независимо от наличия или отсутствия дополнительного острого облучения. Следует также
отметить, что уровни во всех анализируемых пробах значительно выше фоновых. Здесь,
по-видимому, имеет место эффект стимуляции инкубируемых лимфоцитов ФГА.
Как в контроле, так и в опыте не было отмечено достоверных изменений степени
фрагментации ДНК в пробах до облучения в дозе 1 Гр, непосредственно после и 2 ч
спустя. Это говорит либо об отсутствии ДР в ДНК облученных клеток (что идет вразрез
с литературными данными [10; 12]), либо о невозможности зафиксировать их вследствие
быстрой репарации. Однако репарация данного типа повреждений требует большого количества времени [10-12]. Можно предположить, что в каждом отдельном случае активность защитных систем репарации и регуляции апоптоза различна и зависит от тех или
иных индивидуальных особенностей человека. Об этом свидетельствуют наблюдаемые
как в контроле, так и в опыте случаи достоверного адаптивного ответа или повышения
радиочувствительности в указанные моменты времени после облучения.
Список литературы
1. Аклеев, А. В. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Теча / А. В. Аклеев, М. Ф. Киселев. М.: Медбиоэкстрем, 2001. 531 с.
2. Krestinina, L. Yu. Protracted Radiation Exposure and Cancer Mortality in the Techa
River Cohort / L. Yu. Krestinina [et al.] // Radiation Research. 2005. Vol. 164. P. 602-611.
3. Пелевина, И. И. Феномен повышения радиочувствительности после облучения
лимфоцитов в малых адаптирующих дозах / И. И. Пелевина [и др.] // Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 5. С. 544-548.
4. Аклеев, А. В. Адаптивные способности лимфоцитов крови у жителей Южного
Урала, подвергшихся хроническому облучению / А. В. Аклеев [и др.] // Радиационная
биология. Радиоэкология. 2004. Т. 44, № 4. С. 426-431.
98
5. Серебряный, А. М. О новом механизме формирования адаптивного ответа
/А. М. Серебряный [и др.] // Радиационная биология. Радиоэкология. 2004. Т 44 № 6
С. 653-656.
6. Спитковский, Д. М. Теоретические и экспериментальные подходы к проблеме
индуцируемых адаптирующими дозами ионизирующей радиации изменений функциональных возможностей клеток / Д. М. Спитковский, И. В. Кузьмина // Радиационная
биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 599-605.
7. Бондарчук, И. А. Анализ роли репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и
апоптоза в радиационно-индуцированном адаптивном ответе клеток млекопитающих
/И. А. Бондарчук // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43, № 1. С. 19-28.
8. Тронов, В. А. Метод ДНК-комет индивидуальных клеток. Принцип и применение
метода / В. А. Тронов, И. И. Пелевина // Цитология. 1996. Т. 38, № 4/5. С. 427-439.
9. Тронов, В. А. ДНК-кометы как маркер клеточной гибели / В. А. Тронов [и др.]
// Биофизика. 1999. Т. 44, № 2. С. 288-295.
10. Газиев, А. И. Повреждение ДНК в клетках под действием ионизирующей радиации / А. И. Газиев // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39, № 6. С. 175183.
11. Шарова, Н. П. Как клетка восстанавливает повреждённую ДНК? / Н. П. Шарова
// Биохимия. 2005. Т. 70, вып. 3.
12. Пелевина, И. И. Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК / И. И. Пелевина [и др.]. М., 1985.
Е. А. Блинова, Г. А. Веремеева
АПОПТОЗ ЛИМФО1ЩТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
У ХРОНИЧЕСКИ ОБЛУЧЁННЫХ ЛЮДЕЙ
На основе анализа литературных данных и результатов собственных исследований рассмотрено влияние хронического облучения человека на апоптоз лимфоцитов периферической крови. Исследованы методом TUNEL с использованием
проточной цитофлуориметрии исходный уровень апоптоза и уровень апоптоза
после дополнительной нагрузки (инкубация 24 часа, инкубация 24 часа и облучение
е дозе 1 Гр). Отмечено увеличение исходного уровня апоптоза и уровня апоптоза
после 24-часовой инкубации в группе лиц, подвергшихся хроническому раоиационному воздействию, по сравнению с контролем.
Апоптоз способствует защите организма от п р о л и ф е р а ц и и , J » ™ * ™ ' * ' ™ ^
чиально опасные для организма генетические изменения [1].
™™^^™J^™
тается основным событием канцерогенеза, апоптоз можно отнести.важным барьерам,
поящим на пути канцерогенеза, в частности радиационно и н д у « ' « ^ .
ч» хроническое облучение организма человека увеличивает вероятность развития