Click Me

КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ОСНОВЫ КЛИНИЧЕСКОЙ
ИММУНОЛОГИИ
И МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ
ПОДХОДЫ
К ОЦЕНКЕ ИММУННОГО
СТАТУСА
Калининград
1997
КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ОСНОВЫ КЛИНИЧЕСКОЙ
ИММУНОЛОГИИ
И МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
К ОЦЕНКЕ ИММУННОГО СТАТУСА
Практикум
Калининград
1997
Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса: Практикум / А.Г. Гончаров; И.С. Фрейдлин; В.С. Смирнов и др.; Под общей редакцией М.Г. Романцова / Калинингр. ун-т. - Калининград, 1997. - 73 с.
ISBN 5-88874-084-5
Современная иммунология - одна из наиболее бурно развивающихся наук. Возникнув как учение о невосприимчивости к инфекционным болезням, она является одной из
наиболее важных биологических дисциплин, дав жизнь ряду совершенно новых наук,
таких как иммунохимия, иммуногенетика, иммунофармакология и др.
Установлено, что иммунная система играет ведущую роль в поддержании антигенного гомеостаза организма, то есть защищает его от живых тел и веществ, несущих генетически чужеродную информацию (бактерий, вирусов, опухолевых клеток и продуктов их жизнедеятельности). Кроме того, иммунологические реакции лежат в основе
развития аллергии и несовместимости тканей при пересадке органов.
Цель настоящего пособия - дать представление о методах изучения иммунной системы и методологических подходах к оценке их результатов.
Адресовано студентам-биологам, врачам-лаборантам.
Авторский коллектив: А.Г. Гончаров, канд. мед. наук; И.С. Фрейдлин, доктор мед.
наук; В.С. Смирнов, доктор мед. наук, профессор; В.В. Ботвиньева, доктор мед. наук,
профессор; В.В. Щупленцева; Р.Ю. Ариненко.
Общая редакция - М.Г. Романцова, доктора мед. наук, профессора Калининградского государственного университета.
Рецензенты: А.Н. Наровлянский, доктор биол. наук, профессор; В.В. Малиновская,
доктор биол. наук, профессор НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Печатается по решению редакционно-издательского Совета Калининградского государственного университета.
ISBN 5-88874-084-5
© Калининградский государственный
университет, 1997
Основы клинической иммунологии и методологические подходы
к оценке иммунного статуса
Практикум
Лицензия № 020345 от 14.01.1997 г.
Редактор Н.Н. Мартынюк.
Оригинал-макет подготовлен Д.В. Голубиным.
Подписано в печать 25.09.1997 г. Формат 60×90 1/16.
Бумага для множительных аппаратов. Ризограф. Усл. печ. л. 4,6.
Уч.-изд. л. 5,0. Тираж 150 экз. Заказ
.
Калининградский государственный университет,
236041, г. Калининград, ул. А. Невского, 14.
ВВЕДЕНИЕ
Иммунную систему организма наиболее полно можно охарактеризовать как
систему, контролирующую качественное постоянство генетически предетерминированного клеточного и гуморального состава организма.
Иммунная система обеспечивает защиту организма от внедрения чужеродных клеток и от возникших в организме модифицированных (злокачественных)
клеток; обеспечивает уничтожение старых, дефектных, поврежденных собственных клеток, а также клеточных элементов, нехарактерных для данной фазы развития организма; нейтрализацию с последующей элиминацией (выведением)
всех генетически чужеродных для данного организма высокомолекулярных веществ биологической природы (см.: Лебедев К. Иммунограмма в клинической
практике. М., 1990).
1. Главные принципы функционирования иммунной системы
Иммунная система (система защиты) - это система организма, которая контролирует постоянство клеточного и гуморального состава организма, то есть
уничтожению иммунной системой подлежит не только генетически чужеродное
( все, что генетически не запрограммировано в данном организме; к чужеродному относятся клетки другого организма, поврежденные клетки собственного организма, микробные клетки, молекулы, к которым образуются антитела). Уничтожению также подлежит и “генетически свое”, которое становится старым, либо представляет клетки или белки начальных этапов эмбрионального развития
человека. К компетенции иммунной системы относят и уничтожение клеток и
белков собственного организма, возникающих при нормальном, физиологическом функционировании организма в экстремальных условиях - при травмах.
При любом состоянии организма иммунная система постоянно работает, хотя с разной степенью активности.
Иммунная система многокомпонентна, но работает как единое целое. Она
включает в себя многочисленные эволюционно древние, малоспецифические
компоненты и эволюционно новые, определяющие высокую специфичность иммунных реакций. Все эти компоненты работают в тесной взаимосвязи, и, что
особенно важно, каждый неспецифический компонент за счет связей системы
функционирует, по сути, как специфический.
Основной клеткой организма, определяющей работу иммунной системы (и
производящей большинство иммунологических молекул), является лейкоцит во
всем многообразии его популяций и субпопуляций. Специфичность иммунной
реакции определяется лимфоцитами и продуцируемыми специфическими антителами (иммуноглобулинами). Неспецифические функции выполняют клетки
моноцитарного и гранулоцитарного рядов, многочисленные гуморальные факторы, синтезируемые этими клетками.
3
По выражению А. Райта, на каждом этапе иммунной реакции “неспецифика
соединена со спецификой”, то есть опсонизирована и работает с ней как единое
целое. Поэтому оценивать функционирование иммунной системы можно лишь в
комплексе всех ее основных компонентов, по ее конечной эффективности, то
есть по клиническому эффекту.
Функционирование иммунной системы включает два процесса: новообразование иммунокомпетентных клеток и секрецию гуморальных продуктов для распознавания и уничтожения чужеродного. Процесс новообразования всех иммунокомпетентных клеток происходит в кроветворных органах (рис. 1). Эффекторной функцией иммунной системы является распознавание чужеродного (или
дефектного своего) и его уничтожение. Происходят эти процессы преимущественно в локальном участке (очаге) внедрения или появления чужеродного.
Рис.1 Основные направления развития лимфоцитов
4
Иммунокомпетентные клетки поступают из места образования в местный
(локальный) очаг воспаления через кровоток. В кровоток выбрасывается вся
масса регуляторных веществ (стимуляторов, супрессоров) из воспалительного
очага и органов кроветворения. Следовательно, кровь является транзитом иммунокомпетентных клеток, где проявляется эффект изменения активности иммунной системы в процессе борьбы с чужеродным. Именно поэтому кровь является
незаменимым материалом для получения информации о полноценности работы
иммунной системы при самых различных заболеваниях человека.
Основной целью функционирования иммунной системы является контроль
над постоянством клеточной и гуморальной среды организма, уничтожение всего генетически чужеродного или дефектного своего. Поэтому представить иммунную систему в нерабочем состоянии невозможно. При полноценной работе
иммунной системы даже самые большие изменения ее параметров, по сравнению с нормой здоровых лиц, будут характеризовать переход ее на новый, активный режим работы, а изменения этих показателей будут характеризовать стадию, тяжесть и характер течения патологического процесса.
2. Структура иммунной системы
(центральные и периферические органы)
Лимфоидные клетки, с которыми связаны все иммунные механизмы, появляются, созревают и функционируют в определенных органах. Органы иммунной системы разделяют на два типа: первичные (центральные) и вторичные (периферические). В центральных органах созревание лимфоцитов происходит без
влияния антигенов. К ним относится вилочковая железа (тимус, зобная железа) и
сумка Фабрициуса - у животных; у человека роль сумки Фабрициуса выполняет
костный мозг, который поставляет стволовые клетки - предшественники лимфоцитов. Оба центральных органа иммунной системы являются местами дифференцировки определенных популяций лимфоцитов.
Периферическими лимфоидными органами следует считать: селезенку, лимфатические узлы, миндалины. Периферические органы иммунной системы заселяются Т- и В-лимфоцитами из центральных органов, при этом каждая популяция лимфоцитов мигрирует в определенную область периферических органов,
которые называются тимусзависимыми и тимуснезависимыми зонами.
Вилочковая железа (тимус, зобная железа) развивается из третьего и четвертого глоточных карманов. У человека органопоэз вилочковой железы заканчивается уже в период внутриутробного развития, после 20-й недели внутриутробного развития она окончательно формируется как орган. Вилочковая железа состоит из множества мелких долек, в каждой из которых можно различить корковый
и мозговой слои. Практически все лимфоциты находятся в корковом слое, густо
заполняя его. Оба слоя пронизаны кровеносными сосудами. Лимфоциты в корковом слое имеют разные размеры. Большие лимфоциты находятся во внешней
5
зоне коры, куда приходят и стволовые клетки, здесь происходит процесс пролиферации, о чем свидетельствует высокая митотическая активность клеток в этой
зоне.
В мозговом слое содержится небольшое количество лимфоцитов, преимущественно это зрелые тимусзависимые лимфоциты, они должны покинуть вилочковую железу и включиться в циркуляцию. В вилочковой железе существует
барьер между циркулирующей кровью и корковым слоем, вследствие этого в
контакт с антигеном вступают только клетки мозгового слоя.
Возрастная инволюция железы начинается в период полового созревания.
Атрофия этого органа начинается с корковой зоны с зарастания паренхимы жировой тканью, хотя активность в паренхимальных островках сохраняется до глубокой старости.
Костный мозг не является непосредственным лимфоидным органом иммунной системы, но его следует рассматривать как орган иммунной системы. В костном мозге протекают специфические иммунные реакции, например, реакции,
связанные с синтезом антител (иммуноглобулинов). Гемопоэз у человека начинается на 10-й неделе внутриутробного развития, примерно через 4,5 месяца
достигается его максимальная активность; гемопоэз в костном мозге охватывает
все типы клеток, циркулирующие в крови. Наряду с уже сформировавшимися
клетками в костном мозге можно встретить клетки-предшественники эритроцитов, гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов.
Селезенка играет важную роль и как фильтрующий орган, она улавливает
циркулирующие в крови частицы и обломки клеток. Заселение ее лимфоцитами
происходит в позднем эмбриональном периоде и после рождения ребенка. Лимфоциты являются предшественниками белой пульпы селезенки с характерным
расположением лимфоидных клеток и артериальных сосудов. Красная пульпа
селезенки состоит из венозных сосудов и синусов, здесь находится большое количество клеточных элементов - макрофагов, лимфоцитов, эритроцитов, гранулоцитов, состав которых зависит от функционального состояния селезенки.
Иммунные реакции, происходящие в организме, приводят к существенным
морфологическим изменениям в селезенке. Изменения происходят как в тимусзависимой зоне (образование лимфобластов), так и в тимуснезависимой зоне
(образование плазматических клеток, пролиферация лимфоцитов).
Лимфатические узлы расположены вдоль лимфатических протоков шарообразной и/или почковидной формы. Состоят из паренхимы, содержащей лимфоциты. Лимфатические узлы связаны как с лимфатическими протоками, так и системой кровообращения. Паренхима лимфатических узлов состоит из большого
количества клеток: лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов. Также в
лимфатическом узле различают корковый и мозговой слои. В паренхиме мозгового слоя находятся различные типы клеток (макрофаги, лимфоциты, плазматические клетки), мигрирующие в лимфатические сосуды.
Тимусзависимой зоной лимфатического узла является паракортикальная зона. Пролиферация Т-клеток продолжается несколько дней, при этом объем паракортикальной зоны увеличивается, мозговой слой сжимается, антиген быстро
6
накапливается на ретикулярных клетках лимфоидного фолликула и индуцирует
пролиферацию в зародышевых центрах. Через несколько дней начинается миграция плазматических клеток из корковой зоны в мозговую.
3. Основные положения концепции
об иммунологическом надзоре
Современная иммунология - одна из наиболее бурно развивающихся наук относится к быстропрогрессирующим направлениям современного естествознания. За последние 20 лет иммунология превратилась в фундаментальную биологическую науку, а ее область - клиническая иммунология - стала самостоятельной дисциплиной.
Особенность современной иммунологии - широкое внедрение ее достижений
в практику здравоохранения, что нашло отражение и в современном определении иммунологии, предметом изучения которой служит иммунная система, ее
структуры и функции в норме и при развитии патологии. Прогресс в иммунологии обусловлен использованием методов и достижений молекулярной биологии,
биофизики, генетики, математики и других наук.
К важнейшему положению современной иммунологии относится концепция
об иммунологическом надзоре Бернета. Суть этой концепции заключается в следующем: главная функция иммунной системы - распознавание своего и чужого.
Аргументами в пользу этой концепции служат данные по расчету возможного
числа случайных изменений гена - мутаций. Клетка, в которой произошла мутация гена, становится мутантом и в определенных условиях может быть чужеродной для организма. Мутация явление редкое, но среди клеточных скоплений
всегда есть мутанты, в организме их число может достигать 10 млн. мутантных
клеток с измененными (патологическими) свойствами. Число клеток возрастает
под влиянием различных факторов: радиации, токсических и химических веществ и других неблагоприятных факторов. За выведение (элиминацию) из организма измененных мутантных клеток отвечает специализированная система иммунная. Она через иммунитет распознает чужое, даже если этот носитель чужого отличается лишь одним геном. К этому сводится иммунологический надзор. С этих позиций иммунитет следует считать одним из проявлений охраны
биологической индивидуальности. Наследственность же обеспечивает
сохранение индивидуальности от поколения к поколению, а иммунитет - на
протяжении жизни каждого индивидуума.
Таким образом, основная задача иммунной системы - контроль за генетическим постоянством внутренней среды организма. В случаях ослабления или повреждений иммунной системы появляются различные болезни: инфекционные,
аутоиммунные; возрастает вероятность возникновения рака в сотни и тысячи
раз.
Следует знать, что иммунная система выполняет не только защитные функции, но в определенных ситуациях может вызвать развитие серьезных патологи7
ческих состояний по типу аутоиммунных расстройств, в результате выработки
излишка растворимых факторов - цитокинов, обладающих и повреждающими
свойствами тоже.
В последние годы накапливается все больше факторов, свидетельствующих
о том, что иммунная система оказывает регуляторное влияние и на другие системы организма. Оказалось, что растворимые продукты иммунной системы цитокины - являются мощными регуляторными факторами, действующими на
функции органов кроветворения, нервную, эндокринную и другие системы. От
того, насколько полноценно функционирует иммунная система, зависят многие
процессы жизнедеятельности организма. Эта функция может быть непосредственно не связана с иммунитетом, но в процессе иммунной реакции выработка
цитокинов возрастает, и их действие распространяется на реализацию регуляторных воздействий как внутри, так и за пределами иммунной системы.
Предметом исследования клинических иммунологов является иммунный
(антигенно-структурный) гомеостаз, его регуляция в условиях нормы и патологии, а также патологические процессы, различные заболевания, обусловленные
нарушением этой гомеостатической функции, которые можно определить как
болезни иммунной системы или иммунопатологию.
В настоящее время экспертами ВОЗ выделено пять групп заболеваний, связанных непосредственно с нарушением функционирования и патологией иммунной системы:
- первая - болезни, вызванные недостаточностью иммунной системы (первичные, вторичные, транзиторные иммунодефициты);
- вторая - заболевания, обусловленные избыточным реагированием иммунной системы (аутоиммунные, аллергические);
- третья - инфекции иммунной системы с локализацией возбудителя в иммунокомпетентных клетках;
- четвертая - опухоли иммунной системы;
- пятая - болезни иммунных комплексов.
Проблему развития патологических состояний, нарушений и повреждений
со стороны иммунной системы следует рассматривать с позиций надежности
иммунной системы. Надежность - это фундаментальное свойство биологических
объектов, определяющее устойчивое и эффективное их функционирование во
времени и условиях внешней среды. Надежность любой сложной системы может
быть обеспечена либо высоконадежными элементами, либо специальными системами, механизмами, обеспечивающими ее надежность.
4. Механизмы, обеспечивающие надежность
иммунной системы
1. Структурная организация иммунной системы, представленная центральными и периферическими органами, тесно взаимодействующими между собой.
8
2. Механизмы внутрисистемной и межсистемной (нейроэндокринной) регуляции иммунного ответа.
3. Клонально-селекционный принцип специфического иммунного ответа и
разнообразие репертуара иммуноглобулинов.
4. Механизмы репарации ДНК, обусловливающие восстановление клеточных структур.
5. Наличие субпопуляций клеток, цитокинов, выполняющих дублирующие
функции.
Принцип дублирования является универсальным и присущ любой гомеостатической системе организма, в том числе и иммунной. Наличие цитокинов, синтезируемых различными клеточными популяциями, но обладающих сходными
функциями, делает систему надежной.
Проблема надежности иммунной системы тесно связана с проблемой компенсации нарушаемых функций. Какими бы ни были причины, приводящие к
нарушению функции системы, они неизбежно стимулируют цепь компенсаторных процессов, которые при благоприятных условиях восстанавливают измененные функции или способствуют их замене другими, близкими к ним. Компенсация невозможна, если система ненадежна и не обладает перечисленными
выше механизмами надежности.
Таким образом, иммунная система обладает надежностью, свойством присущим всем гомеостатическим системам, которая обеспечивается множеством
различных механизмов.
5. Иммунитет
Р.В. Петров дает такое определение понятия иммунитета: “Иммунитет это
способ защиты организма от живых тел и веществ, несущих в себе признаки чужеродной информации” (Петров Р.В. Иммунология: Учебник для мединститутов. М., 1987). Строго индивидуальный для каждого человека набор антигенов
сохраняется на протяжении всей жизни, претерпевая лишь незначительные возрастные изменения.
Современная иммунология изучает генетические, молекулярные и клеточные механизмы реагирования и внедряет в медицинскую практику способы диагностики, лечения и профилактики нарушений иммунного гомеостаза. Эти отклонения могут иметь самостоятельное значение в этиопатогенезе некоторых
инфекционных заболеваний, иммунодефицитных и аутоиммунных состояний, а
также при аллергических процессах. В других случаях они только осложняют
течение основного заболевания.
Основными участниками иммунологических реакций являются антиген и
антитело.
Антиген (АГ) - это вещество, несущее признаки генетически чужеродной
информации и вызывающее при введении в организм развитие специфических
иммунных реакций. Антигенам присущи следующие свойства: чужеродность, то
есть наличие чуждой для данного организма генетической информации; анти9
генность, то есть способность вызывать по крайней мере один из пяти иммунных ответов; иммуногенность - способность создавать иммунитет.
Антитело (АТ) - это один из основных специфических факторов иммунитета,
направлен именно против той чужеродной субстанции, которая была причиной
его возникновения. Антитела имеют две функции: специфическое соединение с
антигеном и обеспечение распространения “сигнала”, приводящего к тому, что
на “сцену” выходят эффективные механизмы, осуществляющие нейтрализацию
или удаление чужеродных субстанций. В частности, особые антитела - опсонины - усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов.
В иммунохимическом отношении антитела представляют собой гетерогенную семью сывороточных иммуноглобулинов, мигрирующих в электрическом
поле в составе гамма-глобулинов. В соответствии с Международной классификацией, совокупность сывороточных белков, обладающих свойствами антител,
получила название иммуноглобулинов (ИГ) (прежнее название - гаммаглобулины).
Человек обладает сложной и высокоорганизованной системой защиты от
чужеродных для организма антигенов. Способность организма отвечать на проникновение антигенов развитием защитных реакций принято называть иммунологической реактивностью.
Механизм сохранения антигенного гомеостаза можно подразделять на пассивный и активный, неспецифический и специфический. Пассивные механизмы
защиты наиболее прочные, они передаются от родителей потомкам и определяют неспецифическую видовую невосприимчивость человека ко многим бактериям, вирусам. Эту форму неспецифической резистентности прежде называли
«“видовой” иммунитет» (врожденный, конституциональный). К механизмам
пассивной защиты можно отнести генетический контроль синтеза клеточных
структур, генетический контроль развития стволовых клеток и т.д.
Для возникновения заболевания важное значение наряду со свойствами возбудителя имеет состояние макроорганизма в момент его заражения. Оно определяется сложным комплексом факторов и механизмов, тесно связанных между
собой, и характеризуется как восприимчивость (резистентность).
Неспецифическая резистентность - это способность организма противостоять действию чужеродных агентов. Эта форма защиты возникла гораздо раньше,
чем факторы специфической защиты. Неспецифическая защита тесно связана с
иммунным ответом и является основой для выработки полноценного иммунитета.
6. Гуморальные факторы иммунной системы
Важнейшим компонентом иммунной системы является фракция растворимых сывороточных белков, выполняющих функции антител, специфических к
определенным антигенам (то есть гуморальным носителям специфичности), которые продуцируются плазматическими клетками; на основе различий в моле10
кулярной массе, химических свойствах и биологической функции выделяют
пять классов иммуноглобулинов: G, M, A, E, D.
Иммуноглобулины класса G составляют 75% всех иммуноглобулинов сыворотки крови человека. Молекулярная масса минимальна - 150000 дальтон, что
обеспечивает возможность проникновения через плаценту от матери к плоду.
Молекулы иммуноглобулина G наиболее долгоживущие из всех иммуноглобулинов (23 суток). У человека находят иммуноглобулины G четырех субклассов:
G1, G2, G3, G4, различающихся по аминокислотному составу.
Иммуноглобулины класса M - эволюционно самый старый класс иммуноглобулинов, содержание его в сыворотке крови составляет 5-10% от общего
числа иммуноглобулинов.
Иммуноглобулины A составляют 10-15% от всех иммуноглобулинов сыворотки крови, являются преобладающими иммуноглобулинами секретов (слизистых выделений дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, слюны, слез,
молозива и женского молока). Секреторный иммуноглобулин A находится в виде димера, состоит из двух молекул иммуноглобулина A и называется секреторным компонентом. Молекулярная масса около 400000 дальтон. Секреторный
компонент образуется в эпителиальных клетках и выходит на их поверхность,
где присутствует в виде рецептора. Иммуноглобулин A, выходя из кровотока,
проникает через эпителиальный слой и соединяется с секреторным компонентом. Образовавшийся секреторный иммуноглобулин A остается либо на поверхности эпителиальной клетки, либо сползает в слой слизи над эпителием и выполняет свою основную защитную функцию.
Новорожденным в первые дни жизни секреторный иммуноглобулин A поступает с молозивом матери, защищая их бронхолегочный и желудочнокишечный тракты до тех пор, пока не сформируются собственные механизмы
образования секреторного иммуноглобулина A и собственная микрофлора.
Иммуноглобулины E являются минорным классом иммуноглобулинов, содержание иммуноглобулина E составляет около 0,2% от всех сывороточных иммуноглобулинов. Молекулярная масса 200000 дальтон. Иммуноглобулин E накапливается преимущественно в тканях, слизистых и кожных оболочках, где
собирается на поверхности тучных клеток, базофилов, эозинофилов. Период
жизни составляет 2,5 суток.
Иммуноглобулины D также представляют минорный класс иммуноглобулинов, молекулярная масса 180000 дальтон, отличается от молекулы иммуноглобулина G тонкими деталями структуры молекулы. Период жизни 3 суток. О
гуморальных функциях этого иммуноглобулина известно мало.
Таблица 1
Функции иммуноглобулинов
Показатель
Иммуноглобулин М
Функции иммуноглобулинов
Осуществляет иммунную защиту против
кишечных инфекций (энтеробактерий);
обеспечивает бактерицидную активность
11
сыворотки крови
Окончание табл. 1
Показатель
Иммуноглобулин С
Функции иммуноглобулинов
Обеспечивает противоинфекционную и
антитоксическую защиту
Иммуноглобулин А
Блокирует ферментативную активность
микробов, защищает организм от кариеса,
от респираторных заболеваний и кишечных инфекций
Иммуноглобулин Е
Запускает аллергические реакции за счет
секреции биологически активных веществ
Иммуноглобулин О
Запускает в организме развитие аутоиммунных процессов
Изменения содержания иммуноглобулинов у различных возрастных групп
представлены на рис. 2.
12
Рис. 2. Изменение содержания иммуноглобулинов в детском возрасте
Таблица 2
Показатели иммуноглобулинов у здоровых детей различного возраста
Показатель
Иммуноглобулин А (г/л)
Иммуноглобулин М
(г/л)
Иммуноглобулин G (г/л)
3-12 мес.
0,34±0,3
(0,09-0,7)
0,62±0,04
(0,15-1,73)
4,24±0,15
(1,21-6,34)
Возраст детей
1-3 года
8-10 лет
0,81±0,05
0,91±0,08
(0,02-1,88)
(0,30-2,10)
0,86±0,05
0,83±0,08
(0,31-1,70)
(0,40-1,85)
9,45±0,27
7,82±0,35
(4,20-13,1)
(4,50-11,6)
12-14 лет
1,12±0,09
(0,00-2,20)
1,00±0,09
(0,52-1,90)
9,25±0,38
(5,60-12,0)
Комплемент-термолабильная система представляет собой многокомпонентную систему белков, играющих одну из главных ключевых ролей в поддержании
иммунного гомеостаза. Активируется в процессе само сборки, то есть последовательного присоединения отдельных белков, которые называются фракциями,
или компонентами комплемента. Комплемент-система состоит из 11 белков сыворотки крови, состоящих из 9 компонентов. Активируется комплексом антигенантитело (АГ-АТ) в такой последовательности: С1, С4, С2 и С3, С5, С6, С7, С8,
С9.
Комплемент вызывает бактериолиз, стимулирует фагоцитоз, вызывает изменения в мембране, активацию факторов, участвующих в воспалительных реакциях, что ведет к повреждению клеток. Биологические свойства комплемента (С)
сводятся к следующему:
- С1-С4 - нейтрализация вирусов;
- С1-С5 - образование гистаминосвобождающих факторов (анафилотоксинов), усиление реакций фагоцитоза;
- С5-С9 - участие в реакциях цитолиза, бактериолиза, в реакциях отторжения
трансплантанта.
7. Клеточные факторы иммунной реакции
Среди клеточных элементов иммунной системы лидерство как по количественным, так и по функциональным параметрам принадлежит Т-лимфоцитам.
Именно Т-лимфоциты определяют полный спектр клеточных реакций иммунитета.
Лимфоциты - популяция иммунокомпетентных клеток, определяющая высокую специфичность ответа иммунной системы на чужеродное. Имеется два основных типа лимфоцитов, обладающих различной функцией: Т-лимфоциты
обеспечивают клеточный иммунитет, В-лимфоциты отвечают за антителообразование (см. разд.: “Гуморальные факторы иммунной реакции”).
Есть принципиально особая группа лимфоцитов, отличная от Т- и В-лимфоцитов, - нормальные (естественные) киллеры.
13
Образование Т-лимфоцитов - процесс сложный и многоступенчатый; он
включает две фазы: антигеннезависимую и антигензависимую. Антигеннезависимая фаза образования Т-клеток осуществляется последовательно в двух органах - костном мозге и в тимусе (вилочковой железе). Созревшие Т-лимфоциты
мигрируют через кровоток во вторичные лимфоидные органы, где происходят
антигензависимая фаза дифференцировки Т-клеток и активация Т-лимфоцитов с
размножением клона клеток, что приводит к увеличению Т-лимфоцитов на 4-5
сутки (первичный иммунный ответ) или на 3-4 сутки после внедрения чужеродного агента (вторичный иммунный ответ).
Т-лимфоциты выполняют в организме две функции: эффекторную и регуляторную. Основной эффекторной функцией Т-лимфоцитов является специфическая цитотоксичность в отношении чужеродных клеток, атакуются собственные
клетки организма, зараженные вирусом или другим чужеродным агентом. Главная роль принадлежит здесь Т-лимфоцитам-киллерам, которые разрушают клетки при непосредственном контакте с мишенью (пораженная клетка), происходит
выброс окислительных ферментов, которые приводят к лизису (растворению)
клетки-мишени и ее гибели.
Одной из важных регуляторных функций Т-лимфоцитов является способность вырабатывать различные биологически активные вещества; важнейшая
регуляторная роль принадлежит субпопуляциям Т-лимфоцитов: Т-хелперам и Тсупрессорам.
Т-лимфоциты-хелперы (помощники) способны стимулировать к дифференцировке антителообразующие клетки (В-лимфоциты) в ответ на антигенный
стимул. Действие Т-хелперов осуществляется за счет прямого взаимодействия
Т-хелперов с В-клетками, либо за счет активации В-клеток в результате образования Т-хелперами растворимых неспецифических факторов (лимфокинов), в
частности интерлейкина-2.
Т-лимфоциты-супрессоры способны угнетать иммунный ответ. Активация
Т-супрессоров проходит ряд фаз (в которых участвуют и Т-хелперы) и связана с
чужеродным антигеном (специфическая) и может быть с ним не связана (неспецифическая). Активированные Т-супрессоры подавляют активность Т-хелперов.
Следовательно, система Т-хелперы-Т-супрессоры, осуществляет контроль
интенсивности развития специфической реакции иммунной системы на чужеродное.
Естественные (нормальные) киллеры образуются из стволовых предшественников Т-лимфоцитов в костном мозге, где они и созревают, после чего выходят в кровоток и мигрируют в ткани организма. Основной их функцией является
цитотоксическое действие на чужеродные клетки.
Моноциты - популяция иммунокомпетентных клеток, являющаяся основой
всей моноцитарно-макрофагальной системы организма. Моноциты образуются в
костном мозге (рис. 3), после чего выбрасываются в кровь и разносятся по всем
органам и тканям. В последние годы все большее распространение приобрел
термин “моноцитарно-макрофагальная система”, или “система мононуклеарных
фагоцитов”. Наиболее многочисленной и функционально важной клеткой этой
14
системы является тканевой макрофаг, обладающий высокой фагоцитарной активностью и подвижностью в тканях.
1 стр. в альбомной ориентации
15
К основным функциям клеток СМФ относится: секреция биологически активных веществ, регулирующих образование других иммунокомпетентных клеток; защита организма от чужеродных микроорганизмов путем киллинга (убийства) и переваривания их, особенно это касается внутриклеточных микроорганизмов (вирусов). Эти клетки в организме также выполняют роль “клетокмусорщиков”, разрушающих и убивающих собственные клетки организма - поврежденные, дефектные или старые; киллинг и разрушение собственных клеток
организма, несущих на своей поверхности генетически чужеродную информацию. Участие в двусторонних регуляторных взаимодействиях с лимфоцитами и
презентация им чужеродного антигена.
16
Рис. 4. Схема образования нейтрофила (сегментоядерного)
Нейтрофилы - полиморфно-ядерные лейкоциты, наиболее объемная популяция лейкоцитов, неоднородна, клетки различаются по физиологической активности и рецепторному составу мембран. Местом образования нейтрофилов
является костный мозг, образуются из стволовой мультипотентной
кроветворной клетки (см. рис. 4 на с. 16). Созревшие нейтрофилы попадают в
кровоток, общий пул нейтрофилов в кровотоке составляет - 10% от всех
созревших клеток, среди которых 70% не циркулируют, а прикреплены к
эндотелию сосудов. Срок пребывания нейтрофилов в кровотоке 6,5 часов, далее
клетки проникают в ткани, где в течение трех - пяти дней заканчивают свой
жизненный
Основной
цикл.
функцией нейтрофила является фагоцитоз - уничтожение чужеродных клеток или агрегатов; также нейтрофил осуществляет киллинг чужеродных клеток. Важнейшей характеристикой нейтрофила является формирование
вместе с другими клетками очага воспаления, при этом нейтрофил влияет на все
основные механизмы воспалительной реакции.
Эозинофилы образуются в костном мозге, там же происходят все стадии
дифференцировки до зрелой клетки. Количество эозинофилов, циркулирующих
в кровотоке, не превышает 1% от общего числа этих клеток в организме; в крови
циркулируют 10 часов, затем мигрируют в ткани, где живут 48 часов и гибнут
после дегрануляции.
Эозинофилы контролируют выделение гистамина и других биологически активных веществ, нейтрализуя избыточное их количество. Эта функция очень
важна в процессе защиты организма при гельминтозах и в развитии аллергической реакции. Также эозинофилы обладают способностью к фагоцитозу, хотя
это не первостепенная их функция.
Таблица 3
Показатели периферической крови здоровых детей
различных возрастных групп
Показатель
9/л
Лейкоциты (10 )
Лимфоциты (%)
Лимфоциты (109/л)
Нецгрофилы (%):
палочкоадерные
сегментоядарные
Моноциты (%)
Эозинофилы (%)
3-12 мес.
10,3±0,21
(6,5-16,9)
56,3±1,34
(30-76)
5,80±0,22
(2,1-11,2)
Возраст детей
1-3 года
8-10 лет
9,3±0,23
7,3±0,24
(4,8-15,6)
(3,1-10,0)
50,0±1,2
41,0±1,05
(28-72)
(20-55)
4,65±1,4
3,0±0,19
(1,56-9,12)
(1,06-4,90)
3,3±0,04
(1-6)
25,9±1,1
(14-54)
11,2±0,62
(4-17)
2,1±0,02
3,6±0,04
(1-7)
34,1±1,01
(17-62)
10,2±0,57
(3-15)
1,8±0,02
2,4±0,03
(1-6)
45,6±1,17
(32-66)
8,6±0,43
(3-15)
2,0±0,02
12-14 лет
7,48±0,28
(3,0-9,8)
33,2±1,12
(18,-52)
2,50±0,18
(0,95-4,68)
2,5±0,03
(1-6)
53,0±1,3
(36-70)
8,6±0,43
(3-12)
2,2±0,02
17
(1-5)
Показатель
Т-лимфоциты (%)
Т-лимфоциты (109/л)
В-лимфоциты (%)
В-лимфоциты (109/л)
3-12 мес.
48,8±1,1
(21-83)
2,83±0,06
(0,82-8,2)
19,8±0,95
(4-55)
1,15±0,03
(0,09-3,21)
(1-5)
(1-5)
(1-5)
Окончание табл. 3
Возраст детей
1-3 года
8-10 лет
62,5±0,86
63,0±1,33
(30-85)
(34-80)
2,91±0,07
1,89±0,09
(0,74-6,72)
(0,66-3,53)
15,6±0,60
12,9±0,83
(4-42)
(3-27)
0,72±0,03
0,39±0,02
(0,07-2,96)
(0,05-1,15)
12-14 лет
62,6±1,18
(40-81)
1,56±0,08
(0,68-3,34)
12,6±0,80
(3-22)
0,32±0,02
(0,05-1,0)
Примечание. Сост. по: Лебедев К.А. Иммунограмма в клинической практике. М.,
1990.
8. Факторы неспецифической резистентности
Неспецифическая резистентность осуществляется клеточными и гуморальными факторами, тесно взаимодействующими в достижении конечного эффекта
- катаболизма чужеродной субстанции: макрофагами, нейтрофилами, комплементом и другими клетками и растворимыми факторами.
К гуморальным факторам неспецифической резистентности принадлежат
лейкины - вещества, полученные из нейтрофилов, проявляющие бактерицидное
действие в отношении ряда бактерий; эритрин - вещество, полученное из эритроцитов, бактерицидное в отношении дифтерийной палочки; лизоцим - фермент,
продуцируемый моноцитами, макрофагами, лизирует бактерии; пропердин - белок, обеспечивающий бактерицидные, вируснейтрализующие свойства сыворотки крови; бетта-лизины - бактерицидные факторы сыворотки крови, выделяемые
тромбоцитами.
Факторами неспецифической резистентности также являются кожа и слизистые оболочки организма - первая линия защиты, где вырабатываются вещества,
оказывающие бактерицидное действие. Также подавляют рост и размножение
микробов слюна, желудочный сок, пищеварительные ферменты.
В 1957 году английский вирусолог Айзекс и швейцарский вирусолог Линденманн, изучая явление взаимного подавления (интерференции) вирусов в куриных эмбрионах, опровергли связь процесса интерференции с конкуренцией
между вирусами. Оказалось, что интерференция обусловлена формированием в
клетках конкретного низкомолекулярного белкового вещества, которое удалось
выделить в чистом виде. Ученые назвали этот белок интерфероном (ИФН), поскольку он подавлял репродукцию вирусов, создавая в клетках состояние резистентности к их последующему реинфицированию.
18
Интерферон образуется в клетках в ходе вирусной инфекции и обладает хорошо выраженной видовой специфичностью, то есть проявляет свое действие
только в том организме, в клетках которого образовался.
При встрече организма с вирусной инфекцией именно продукция интерферона является наиболее быстрой ответной реакцией на заражение. Интерферон
формирует защитный барьер на пути вирусов намного раньше специфических
защитных реакций иммунитета, стимулируя клеточную резистентность , делает
клетки непригодными для размножения вирусов.
В 1980 году Комитетом экспертов ВОЗ была принята и рекомендована новая
классификация, согласно которой все интерфероны человека разделяются на три
класса:
- альфа-интерферон (лейкоцитарный) - основной препарат для лечения вирусных и раковых заболеваний. Получают его в культуре лейкоцитов крови доноров, используя в качестве интерфероногенов вирусы, не представляющие
опасности для людей (вирус Сендай);
- бета-интерферон - фибробластный, продуцируется фибробластами, у этого
типа интерферона противоопухолевая активность превалирует над противовирусной;
- гамма-интерферон - иммунный, вырабатывается сенсибилизированными
лимфоцитами Т-типа при повторной встрече с “известным” им антигеном, а также при стимуляции лейкоцитов (лимфоцитов) митогенами - ФГА и другими лектинами. Обладает выраженным иммуномодулирующим действием.
Все интерфероны отличаются друг от друга по набору аминокислот и антигенным свойствам, а также по выраженности тех или иных форм биологической
активности. Описаны следующие свойства интерферонов: антивирусные, иммуномодулирующие, противоопухолевые; помимо этого интерфероны подавляют
рост клеток, изменяют проницаемость клеточных мембран, активируют макрофаги, усиливают цитотоксичность лимфоцитов, активируют последующий синтез интерферона, а также обладают “гормоноподобной” активацией жизнедеятельности клеток.
Во всех звеньях взаимодействия компонентов иммунной системы как на
уровне образования, активации и проявления их функций остается много белых
пятен для того, чтобы создать рабочую схему действия иммунной системы и на
этой основе прогнозировать развитие дальнейших событий в организме.
9. Концептуальная модель организации и функционирования
иммунной системы
Каждый индивидуальный цитокин играет какую-то конкретную роль и вносит свой вклад в общую регуляцию гемопоэза, воспаления или иммунного ответа. Другие цитокины, участвующие в регуляции того же биологического процесса, могут дублировать роль первого цитокина, выступать по отношению к нему в
качестве синергистов или антогонистов. Так, в регуляции синтеза антител могут
принимать участие более 10 различных цитокинов: факторы роста и дифферен19
цировки В-лимфоцитов, стимуляторы плазматических клеток; факторы, усиливающие продукцию или секрецию отдельных классов подклассов иммуноглобулинов (табл. 4). Среди тех же медиаторов одни могут выступать антогонистами
других: IFNу ингибирует продукцию IL-4, IL-10, IL-13, а те в свою очередь, ингибируют продукцию IFNу.
Стволовые клетки крови.
Самоподдерживающиеся, по-видимому, путем регулируемого слияния и деления мультипотентных клеток
Заселение клетками костного мозга первичных лимфоидных органов и тканей
Эквивалент “сумки”
у млекопитающих
Тимус
Селезенка,
лимфоузлы, ткани
Индуктивное влияние (возможно, путем слияния с определенным классом
специализированных клеток и последующей пролиферации), образование
специализированных иммунокомпетентных клеток
Тимуснезависимые
В-лимфоциты
Тимусзависимые
Т-лимфоциты
Моноциты/макрофаги,
другие вспомогательные
клетки (клетки Лангерганса, дендритные и др.
Периферическая лимфоидная система
Реакция иммунокомпетентных клеток на чужеродные антигены
Первичный ответ на антиген
В соответствии с неоднородностью доз антигена, получаемых отдельными клетками, - гетерогенная по интенсивности и срокам выявления специфическая бласттрансформация Т- и В-лимфоцитов. В зависимости от вида антигена бласттрансформации
подвергаются преимущественно Т-лимфоциты или В-лимфоциты, либо те и другие,
что приводит к формированию либо клеточного, либо гуморального иммунитета. По
завершении процесса бласттрансформации происходит формирование пула клеток
“памяти” Т- и В-лимфоцитов. Периодическая активация клеток “памяти” неспецифическими поликлональными активаторами и вследствие “свидетельского эффекта” в
лимфоидных органах (интерлейкины и др.) способствует их функционированию (поддержание гуморального иммунитета) и жизнеспособности.
Вторичный ответ на антиген
1. Специфическая активация антигеном клеток “памяти”, параллельно протекающая
первичная бласттрансформация антигеном не сенсибилизированных ранее лимфоцитов. Выделение медиаторов (интерлейкинов, хелперных и супрессорных факторов)
активированными Т-клетками, синтез специфических антител активированными
20
В-клетками.
2. Контактное взаимодействие Т-лимфоцитов с В-лимфоцитами и макрофагами,
опосредованное специфическим антигеном и комплексом МНС I или МНС II:
а) Тс-клетки МНС I вызывают лизис антигенспецифических соматических клеток,
макрофагов и В-клеток с комплексом МНС I, выделяют супрессорные факторы, подавляющие иммунный ответ;
б) Тх-клетки МНС II в зависимости от условий (вид антигена, наличие или отсутствие достаточного количества специфически активированных В-клеток) взаимодействуют преимущественно с В-клетками (гуморальный иммунитет) или (при их отсутствии) с макрофагами (клеточный иммунитет).
В первом случае антигенспецифическое взаимодействие Тх-клеток МНС II с Вклетками МНС II приводит, по-видимому, к их слиянию и последующему делению с
образованием тупиковых короткоживущих секретирующих специфические антитела
плазматических клеток. Развивается гуморальный иммунитет. Во втором случае
Тх-клетки МНС II взаимодействуют в основном с макрофагами МНС II. Пролиферирующие макрофаги в зависимости от условий участвуют в феномене ГЗТ, в образовании гранулем, в формировании “клеточного иммунитета”.
Многократное воздействие одного и того же антигена способствует увеличению
уровня гуморального иммунитета за счет увеличения пула клеток “специфической памяти” и за счет образования короткоживущих секретирующих плазматических клеток.
Однако с течением времени это может смениться истощением пула отвечающих на
антиген лимфоцитов. Гиперглобулинемия сменяется агаммаглобулинемией, развивается состояние иммунодефицита.
Рис. 5. Схема организации и функционирования иммунной системы,
концептуальная модель (по Н.Г. Титовой, 1996) (начало рис. см. на с. 20)
Таблица 4
Цитокины, участвующие в регуляции синтеза антител
Цитокины
IL-2
IL-4
IL-6
IL-7
IL-10
IL-11
IL-13
IL-14
IFN-γ
TGFβ
Эффекты
Усиливает пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов
Стимулирует продукцию и секрецию IgE иIgG4
Способствует формированию плазматических клеток из В-лимфоцитов
Стимулирует пролиферацию и дифференцировку пре-В-клеток
Усиливает пролиферацию В-лимфоцитов и синтез антител
Стимулятор функций плазматических клеток
Способствует продукции IgM, IgE, и IgG4
Усиливает пролиферацию В-лимфоцитов, но тормозит синтез иммуноглобулинов
Усиливает продукцию IgG2α
Усиливает секрецию IgA, но ингибирует пролиферацию клеток
21
В цитокиновой регуляторной цепи ключевую позицию занимают мононуклеарные фагоциты, которые продуцируют и секретируют важнейшие цитокины
и одновременно экспрессируют на клеточной мембране широкий спектр
рецепторов для тех же или других цитокинов. Благодаря этому цитокины
модулируют свойства и активность макрофагов, а макрофаги контролируют
свойства и активность цитокиновой регуляторной сети.
Продукция и секреция противовоспалительных цитокинов (IL-1, TNF, IL-6,
IL-8, IFNα/β) относится к самым ранним событиям, сопутствующим взаимодействию микроорганизмов с макрофагами. Например, грамотрицательные бактерии индуцируют экспрессию цитокиновых генов макрофага через те же рецепторы, которые служат для их адгезии и фагоцитоза, а именно - через рецепторы
для липополисахарида (ЛПС).
Этот ранний неспецифический ответ на инфекцию или иммунизацию чрезвычайно важен по нескольким причинам. Он развивается очень быстро, поскольку не связан с необходимостью предварительного накопления клона
клеток, отвечающих на конкретный антиген. Вместе с тем ранний цитокиновый
ответ влияет на последующий специфический иммунный ответ.
В самые ранние сроки после иммунизации детей коревой вакциной у части
из них существенно повышается уровень спонтанной продукции TNFα мононуклеарами крови. Именно у этих детей результатом вакцинации были наиболее
высокие титры специфических антител в сыворотке крови (Миронова З.Г. и др.).
10. Представление о цитокинах
В последнее десятилетие среди различных эндогенных механизмов иммунорегуляции особое внимание привлекает цитокиновая сеть, которая обеспечивает
взаимосвязи иммунокомпетентных и других клеток, опосредованные секретируемыми ими же молекулами. Каждый из многочисленных цитокинов связывается со своим специфическим рецептором на поверхности клетки-мишени. От
рецептора по путям внутриклеточной трансдукции цитокиновый сигнал активации передается к ядру клетки и реализуется, как правило, индукцией экспрессии
какого-то гена или группы генов.
По химической природе цитокины - это белки, полипептиды или гликопротеиды. Они являются биологически активными молекулами, способными влиять
на процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и функциональную
активность клеток. В ответ на введение отдельного цитокина в организм животного или человека наблюдается, как правило, целая гамма эффектов: изменение
количества циркулирующих лейкоцитов, лихорадка, продукция острофазных
реактантов, метаболические и другие сдвиги. Было бы неправильно приписывать
все эти эффекты введенному цитокину. Каждый цитокин служит индуктором
экспрессии каскада других цитокинов и/или их рецепторов. Поэтому в условиях
in vivo почти не встречается случаев изолированной продукции индивидуальных
22
цитокинов. Любой индуктор синтеза цитокинов, например - бактериальный эндотоксин, вызывает продукцию серии разных, но взаимосвязанных молекул. На
этих фактах базируется концепция цитокиновой регуляторной сети, которая объединяет позитивные и негативные эффекты самих цитокинов, их индукторов или
ингибиторов в рамках определенного биологического ответа (табл. 5).
Таблица 5
Цитокины, их продуценты и мишени
Обозначения
IL-1α
IL-1β
IL-2
IL-3
IL-4
IL-5
IL-6
IL-7
IL-8
IL-9
IL-10
IL-11
IL-12
IL-13
IL-14
IL-15
MCP-1
G-CSF
M-CSF
GM-CSF
TNFα
TNFβ(LN)
IFN-α
IFN-β
IFN-γ
TGFα,β
MIF
Название
Клетки-продуценты
Мф,Фб,ТЛ,ВЛ,ЭК
Интерлейкин-1α
Мф,Фб,ТЛ,ВЛ,ЭК
Интерлейкин-1β
Интерлейкин-2
ТЛ
Интерлейкин-3
ТЛ,ТК
Интерлейкин-4
ТЛ
Интерлейкин-5
ТЛ,ТК
Интерлейкин-6
Мф,Фб,ТЛ
Интерлейкин-7
СК,Фб,СтрК,пТЛ
Интерлейкин-8
Мн,Фб,ЭК
Интерлейкин-9
ТЛ
Интерлейкин-10
ТЛ,ВЛ,МФ
Интерлейкин-11
Фб,СК
Интерлейкин-12
Мн,Мф,ВЛ
Интерлейкин-13
ТЛ
Интерлейкин-14
ТЛ,ВЛ
Интерлейкин-15
ТЛ,ВЛ,Мн,СК,ЭК
Макрофагальный хемоТЛ,Мн,Фб,ЭК,Мф
аттрактант протеин-1
Гранулоцитарный
колониестимулирующий
Мн,ЭК
фактор
Моноцитарный
ТЛ,Фб,ЭК
колониестимулирующий
фактор
ГранулоцитарноМф,ТЛ,ВЛ
моноцитарный колониестимулирующий фактор
Туморнекротизирующий
Мф,НК
фактор
Туморнекротизирующий
ТЛ
фактор-в (Лимфотоксин)
ТЛ,ВЛ,Мн,Мф
Интерферон-α
Фб,ЭК
Интерферон-β
ТЛ,НК
Интерферон-γ
Трансформирующий
Мн,Мф, опух.кл.
ростовой фактор-а,в
Миграцию
ТЛ,Мн,ЭК
Клетки-мишени
ТЛ,ВЛ,Гр,ЭК,Фб и др.
ТЛ,ВЛ,Гр,ЭК,Фб и др.
ТЛ,ВЛ,Мф
СК,Эз
ТК,ВК
ТЛ,ВЛ
ТЛ,ВЛ,СК,Гр
ТЛ,пВЛ,пТЛ
Гр,ТЛ
Мф
Мф,ТК,НК
СК,Мн
НК,ТЛ
ВЛ,Мн,Мф
ВЛ
ТЛ
Мн,Гр,СК
СК,Мф
СК,Гр,Эз,Мф
Гр,Эз,ТЛ,ВЛ
Мф,ЭК,ТЛ, опух.кл.
и др.
вир.инф. и опух.кл.
вир.инф.кл.
вир.инф.кл.
ТЛ,ВЛ,НК,Мф,Гр
ТЛ,ВЛ,Мн,Мф,
опух.кл.
Мф,Гр
23
MIP-1 α,β
LIF
ингибирующий фактор
Макрофагальный воспалительный протеин-1 а,в
Лейкимию
ингибирующий фактор
ТЛ,ВЛ,Гр,Мф,
Лангерганса
ТЛ,Мн,Гр,Фб
СК,Эз
Мн,Мф,СК,Гр
Окончание табл. 5
Обозначения
EGF
FGF
SCF
Название
Эпидермальный ростовой почек и др. Фактор
Фактор роста
фибробластов
Стволовой клетки
фактор
Клетки-продуценты
Мн, эктодермал.
Клетки-мишени
опух.кл.,ЭпК
Мф,ЭК,ЭпК
Фб и др.
СтрК,Фб, и др.
СК,пМн,пТЛ,пВЛ
Примечание. Мн - моноцит, Мф - макрофаг, ТЛ - Т-лимфоцит, ВЛ - В-лимфоцит,
ЭК - эндотелиальная клетка, Гр - гранулоцит, Фб - фибробласт, СК - стволовая клетка,
НК - натуральный киллер, ЭпК - эпителиальная клетка, СтрК - стромальная клетка, Эз эозинофил, опух. кл. - опухолевые клетки, вир. инф. кл. - вирус-инфицированные клетки, ТК - тучная клетка, эктодермал. - эктодермальные клетки, п - предшественники.
Основная роль вышеперечисленных монокинов в этом раннем ответе состоит в рекрутировании защитных клеток и молекул в очаг инфекции или воспаления. Например, местный эффект TNFα проявляется расширением сосудов, усилением местного кровотока, повышением проницаемости сосудов с накоплением
выпота, содержащего иммуноглобулины, компоненты комплимента и другие
белки сыворотки. Другой не менее важный местный эффект TNFα - это индукция экспрессии на эндотелиальных клетках адгезионных молекул, связывающих
циркулирующие в крови гранулоциты, моноциты и лимфоциты. В результате
усиливается миграция этих клеток из капиляров в ткани, в очаг инфекции или
воспаления. Уже через несколько минут экспозиции эндотелиальных клеток с
TNFα на них появляются первые адгезионные молекулы, обеспечивающие
“скользящую” адгезию лейкоцитов. Позднее достигается более прочное прикрепление лейкоцитов к эндотелию за счет индуцированной TNFα экспрессии на
эндотелиальных клетках адгезионных молекул ICAM-1. На этой стадии в качестве синергиста TNFα выступает еще один монокин - IL-8, повышающий прочность адгезии клеток. Адгезивные взаимодействия заставляют лейкоциты преодолевать барьер сосудистой стенки: путем диапедеза проходить через эндотелий. Под влиянием провоспалительных монокинов эндотелиальные клетки сами
начинают продуцировать IL-1, IL-6, TNFα, другие цитокины и хемоатрактанты
для фагоцитов. Например, хемоатрактантом для моноцитов служит молекула
MCP-1 (MCAF), которую продуцируют эндотелиальные и гладкомышечные
клетки или сами моноциты (табл. 6).
Параллельно монокины индуцируют на эндотелии экспрессию молекул, запускающих процессы свертывания крови в капиллярах. Сравнительный анализ
литературных данных показывает, что начало атерогенеза имеет многие черты
24
сходства с вышеописанным ранним периодом воспаления. Все вовлекаемые в
атерогенез клетки являются мишенями для цитокинов и сами способны вырабатывать цитокины. Например, TNFα продуцируют и моноциты, и эндотелиальные и гладкомышечные клетки. На тех же клетках экспрессированы рецепторы
для TNFα.
Таблица 6
Цитокины и местное воспаление
Цитокины
IL-α и β
TNFα и β
Клетки-мишени
Эндотелиальные клетки
Нейтрофилы
Моноциты/макрофаги
Фибробласты
TNFα и β
Хондроциты
Остеокласты
Эндотелиальные клетки
IL-3
Нейтрофилы
Эозинофилы
IL-5
IL-8
MCP-1
G-CSF
Моноциты/макрофаги
Эозинофилы
Нейтрофилы Т-клетки
Моноциты
Гранулоциты
M-CSF
GM-CSF
Моноциты/макрофаги
Эозинофилы/нейтрофилы
Моноциты/макрофаги
IFN-γ
Моноциты/макрофаги
Эффекты
Индукция прокоагулянтной активности
Синтез простациклина
Экспрессия адгезионных молекул
Синтез цитокинов (IL-1,IL-6,GM-CSF)
Экспрессия адгезионных молекул
Активация (стимуляция фагоцитоза и АЗКЦ)
Экспрессия адгезионных молекул
Синтез цитокинов
Митоз
Синтез цитокинов
Синтез и экспрессия антигенов гистосовместимости I класса
Синтез коллагеназы
Активация резорбции костной ткани
Экспрессия антигенов гистосовместимости I
класса
Синтез кислородных радикалов
Активация (продукция супероксидных анионов и АЗКЦ)
Фагоцитоз
Активация
Активация
Хемотаксис
Хемотаксис
Активация (АЗКЦ, фагоцитоз, продукция
супероксидного аниона)
Активация, синтез цитокинов
Активация (АЗКЦ)
Активация (кислородный взрыв)
Экспрессия адгезионных молекул
Хемотаксис
Активация
Синтез цитокинов
Экспрессия антигенов гистосовместимости I
класса
Экспрессия антигенов гистосовместимости II
класса
Экспрессия IgG-FcR
25
Натуральные киллеры
Секреция цитокинов
Активация
Увеличение цитотоксичности
Присутствие TNFα в атероматозных тканях в отличие от тканей нормальных
сосудов, убедительно показано. TNFα способен активировать все клетки, участвующие в атерогенезе, резко изменяя фенотип каждой из них. Эндотелиальные
клетки, участвующие в атерогенезе, резко изменяют фенотип каждой из них.
Эндотелиальные клетки при этом утрачивают свои антиадгезионные и антикоагулянтные свойства. Гладкомышечные клетки превращаются в пролиферирующие и синтезирующие. Моноциты в результате индуцированной TNFα адгезии к
эндотелию переходят в интиму, где усиленно захватывают холестерин, способствуя элиминации его избытка. Перегрузка макрофагов эфирами холестерина
ведет к их трансформации в пенистые клетки. На основе этих данных была
обоснована гипотеза о роли туморнекротизирующего фактора альфа в атерогенезе, которая проходит экспериментальную проверку (Никитина Е.Ю. и др.).
Наряду с местными эффектами провоспалительные монокины вызывают ряд
системных реакций. В качестве эндогенных пирогенов IL-1 и IL-6 индуцируют
лихорадку. Те же цитокины являются индукторами острофазного ответа, при
котором в печени резко возрастает синтез белков острой фазы, поступающих в
плазму. IL-1 индуцирует продукцию IL-6 клетками Купфера (макрофагами), а
IL-6 индуцирует в гепатоцитах синтез белков острой фазы. Среди них С-реактивный белок. У него обнаружено новое свойство - способность взаимодействовать с бактериальными токсинами стрептококков и клостридий и нейтрализовать
их гемолитическую активность. Установлено, что сходным антитоксическим
действием обладают и некоторые цитотоксины, в частности TNFα и IFN-γ. Изучаются механизмы этого нового вида взаимодействий с целью выяснения их значения для антибактериальной резистентности и иммунорегуляции (Назаров П.Г.
и др.).
Другой системный эффект монокинов - индукция лейкоцитоза - увеличения
количества циркулирующих лейкоцитов за счет усиления их продукции в костном мозге и ускорения рекрутирования клеток в циркуляцию. Лейкоцитоз сопутствует любой инфекции, травме, воспалению. Провоспалительные цитокины
IL-1, IL-6, TNFα, продуцируемые активированными макрофагами, стимулируют
продукцию факторов роста: GM-CSF, M-CSF и G-CSF стромальными клетками
костного мозга (фибробластами), эндотелиальными клетками и самими макрофагами. Кроме того, TNFα может выступать в качестве синергиста GM-CSF, MCSF, IL-3, усиливая пролиферацию предшественников моноцитов, что приводит
к повышению количества циркулирующих моноцитов. При любой инфекции
или воспалении возникает необходимость в гиперпродукции фагоцитирующих
клеток, которые усиленно рекрутируются из кровяного русла в очаг. Такую
компенсаторную гиперфункцию обеспечивают провоспалительные цитокины.
Специализированным индуктором активации макрофагов является интерферон-гамма (IFN-γ), который способен индуцировать экспрессию более 100 раз26
ных генов в геноме макрофага. Продуцентами этой молекулы являются активированные Т-лимфоциты (THI) и естественные киллеры (NK-клетки). IFN-γ индуцирует и стимулирует продукцию провоспалительных монокинов: TNFα, IL-1,
IL-6, экспрессию на мембранах макрофагов антигенов гистосовместимости второго класса (MHC II). IFN-γ резко усиливает эффекторные функции макрофагов:
их антимикробную и противоопухолевую активность за счет повышения продукции клетками супероксидных и нитроксидных радикалов. Кроме того, усиление иммунного фагоцитоза и антител-опосредованной цитотоксичности макрофагов под влиянием IFN-γ связаны с усилением экспрессии Fcу-рецепторов для
IgG (табл. 7).
Таблица 7
Объективные критерии активации фагоцитов
Направление
сдвигов
П
О
В
Ы
Ш
Е
Н
И
Е
С
Н
И
Ж
Е
Н
И
Е
Поверхностные
Метаболические
маркеры
показатели
Окислительный взрыв
FcR (для IgG2α)
Продукция и секреция:
С3-, С5а-R
супероксидных и нитроРецепторы цитокиксидных радикалов
нов: IFN-γ, TNFα
ферментов
и др.
монокинов (IL-1, IL-6,
Поверхностные анTNFα)
тигены: HLA 2-го
компонентов комплимента
класса, LFA-1 и др.
факторов коагуляции
фибронектина
простагландинов, лейкотриенов
катионных белков (дефенизинов)
Содержание лизосом и их способность к слиянию с фагосомами
Маннозно-фукозПродукция и секреция:
ные рецепторы
простагландина Е2
Трансферриновые
α-2-макроглобулина
рецепторы IL-4R
монокинов (TNFα, TGFβ)
Мембранная 5-нукингибиторов IL-1, TNFα
леаза
Функциональные
тесты
Адгезия, распластывание
Хемотаксис
Фагоцитоз
Микробицидность
Цитотоксичность
Переработка и презентация антигенов
Миграция
Активирующее действие IFN-γ на макрофаги опосредованно индукцией секреции этими клетками туморнекротизирующего фактора (TNFα). Рекомбинантный препарат TNFα, как и IFN-γ, вызывал усиление бактерицидности макрофагов, повышение продукции супероксидных радикалов. Показано также доза27
зависимое стимулирующее действие TNFα на экспрессию макрофагальных рецепторов для IgG (FcR) и для третьей фракции комплемента (C3R). Под влиянием тех же концентраций TNFα экспрессия маннозо-фруктозных рецепторов
(MFR) на макрофагах снижалась. Совокупность экспериментальных данных свидетельствует об активирующем действии TNFα на макрофаги (Коняев И.Г. и
др.).
Само понятие “активация макрофагов” нуждается в уточнении. Приобретение клеткой “воспалительного” фенотипа, охарактеризованного выше, в связи с
влиянием IFN-γ, TNFα, является не единственным исходом активации макрофагов. Под влиянием других цитокинов (IL-4, IL-13) макрофаг может приобрести
“ассимметричный фенотип с избирательной активацией “scavenger”-рецепторов
типа MFR. Третий вариант активированного макрофага характеризуется селективным усилением продукции IL-6 на фоне пониженной секреции других провоспалительных цитокинов (IL-1, TNFα, MCP-1) и пониженной цитотоксичности. Такой фенотип приобретают макрофаги под влиянием катехоламинов. IL-6
отличается от других воспалительных монокинов противоречивостью биологических эффектов, среди которых преобладают ингибирующие эффекты в отношении макрофагов. В частности, IL-6 ингибирует секрецию макрофагами IL-1 и
TNFα. Возможно, что IL-6 играет роль негативного (down-регулирующего) звена цитокиновой регуляции активности макрофагов и формирует фенотип макрофага, функционирующего в затухающем очаге воспаления.
11. Общие представления об иммуномодулирующих
препаратах
Активное вмешательство в работу иммунной системы, изыскание путей ее
стимуляции или супрессии не только в целом, но и отдельных клеточных популяций, лечение патологически измененной иммунной системы, исправление дефектов ее функционирования входит в задачи иммунокоррекции. Иммунокоррекция рассматривается как первый этап развития иммунофармакологии - создания лекарств и способов лечения патологии иммунной системы.
Иммуномодулирующими средствами являются препараты химической и
биологической природы, способные модулировать (угнетать или стимулировать)
реакции иммунитета. Эти препараты воздействуют на иммунокомпетентные
клетки: на процессы их созревания, миграции, кооперации и функции или взаимодействие этих клеток и их продуктов (антител, лимфокинов, монокинов) с соответствующими мишенями. В качестве мишеней могут выступать различные
экзогенные и эндогенные корпускулярные и растворимые антигены, патогенные
микроорганизмы, клетки опухолей, трансплантанта или собственные аутоантигены.
Иммунотропные препараты принято подразделять на иммунодепрессанты
(иммуносупрессивные препараты) и иммуностимулирующие препараты. Не28
смотря на то, что это подразделение достаточно условно, оно остается общепринятым.
С нашей точки зрения, правильнее говорить об иммуномодуляторах, которые в зависимости от дозы, сроков, кратности применения, а также от иммунологического фона могут либо ингибировать, либо усиливать иммунный ответ. В
отношении самых разных иммунотропных препаратов показано, что одно и то
же вещество может, в зависимости от доз, схемы введения, от количественных и
качественных особенностей антигена, от места и времени иммунизации, вызывать либо иммуносупрессивные, либо иммуностимулирующие эффекты.
Иммуносупрессивные препараты
К числу иммуносупрессоров относятся различные классы химических соединений (гликокортикоиды, антиметаболиты, алкилирующие соединения и
т.д.). Они оказывают влияние на различные звенья иммуногенеза, в силу чего
проявляют различную эффективность при лечении иммунных состояний и
заболеваний и имеют свои определенные показания к применению.
Таблица 8
Классификация иммуносупрессивных препаратов*
Группа препаратов
Глюкокортикоиды
Антиметаболиты
Алкилирующие соединения
Антибиотики
Алкалоиды
Производные препаратов
Кортизон, гидрокортизон, преднизон, преднизолон,
дексаметазон, триамцинолон
Метотрексат, 6-меркаптопурин, азатиоприн, батриден
Циклофосфан, хлорбутин
Дактиномицин, циклоспорин А, Д-пеницилламин
Винкристин, винбластин
* Основные характеристики препаратов, обладающих иммуносупрессивным действием, см.: Фрейдлин И.С. Иммунотропные препараты: Учебн. пособие. Л., 1989.
Аллергические реакции I типа - анафилактические - связаны с гиперпродукцией IgE в ответ на определенный антиген-аллерген, что обусловлено недостаточной функцией соответствующих Т-супрессоров. Патологические последствия
определяются способностью IgE прочно связываться с соответствующими Fcрецепторами тучных клеток и базофилов, на мембране которых происходит реакция антиген-антитело, следствием которой является выброс биологически активных веществ из клеток - гистамина, серотонина, гепарина и др. Эти вещества
действуют на клетки-мишени гладкой мускулатуры, сосудов и других органов, в
которых расположены рецепторы для каждого биологически активного вещества.
29
Поэтому фармакологическая коррекция иммунопатогенеза при аллергических реакциях I типа достигается применением любых средств, угнетающих иммунный ответ, пролиферацию и дифференцировку антитело-образующих клеток, средств, тормозящих синтез антител, и особенно IgE. В более поздних стадиях развития анафилактических реакций решающим становится применение
антигистаминных препаратов.
Аллергические реакции II типа - цитотоксические - связаны с выработкой
антител против антигенов, входящих в состав мембраны клеток организма. Патологические последствия обусловлены тем, что происходящая на клеточной
мембране реакция антиген-антитело активирует систему комплемента, что ведет
к лизису клетки.
Возможности вмешательства в иммунопатогенез при аллергических реакциях II типа также включают антипролиферативные препараты и другие средства
угнетения гуморального иммунного ответа. Кроме того, эффективны препараты,
ингибирующие процессы активации системы комплемента, ингибиторы ферментов этой системы.
Аллергические реакции III типа - иммунокомплексные - связаны с накоплением в кровяном русле и тканях комплексов антиген-антитело, которые не выводятся из организма из-за их физико-химических особенностей или из-за
недостаточности фагоцитирующих клеток. Длительно персистирующие
иммунные комплексы могут вызывать ряд патологических последствий, в том
числе связанных с активацией системы комплемента.
Предупреждение накопления иммунных комплексов при такого рода патологиях достигается применением иммуносупрессирующих препаратов, угнетающих синтез антител. Кроме того, целесообразно назначение противовоспалительных препаратов и ингибиторов ферментов для купирования воспалительных
реакций, индуцированных иммунными комплексами.
Аллергические реакции IV типа - клеточные реакции гиперчувствительности
замедленного типа (ГЗТ) - отличаются от аллергических реакций первых трех
типов основными механизмами иммунопатогенеза. При этом связана сенсибилизация с преимущественной пролиферацией клона Т-лимфоцитов, несущих специфические для данного антигена распознающие рецепторы. Иммунопатологические последствия имеет активизация этих Т-лимфоцитов-эффекторов при повторном контакте с антигеном. Активация сопровождается синтезом и секрецией
клеточных медиаторов-лимфокинов, мобилизующих в очаг иммунного воспаления и активирующих макрофаги. В очаге иммунного воспаления происходит
повреждение клеток и тканей организма за счет активности Т-эффекторов,
Т-киллеров и макрофагов, секретирующих лизосомные ферменты.
Аллергические реакции IV типа уменьшаются антипролиферативными препаратами, способными преимущественно подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов, а также препаратами, ингибирующими функции Т-лимфоцитов и макрофагов.
Аутоиммунные процессы - это такие состояния, при которых происходит
выработка аутоантител или накопление клона сенсибилизированных лимфоци30
тов к антигенам собственных тканей организма. Когда аутоиммунные механизмы вызывают нарушения структуры и функций органов и тканей, говорят об
аутоиммунной агрессии и аутоиммунных заболеваниях. Возникновение аутоиммунных процессов связано, как правило, с утратой естественной иммунологической толерантности. Отсутствие естественной иммунологической толерантности
может быть следствием нарушения функций или соотношений недостаточности
Тс или избыточной активности Тх. В иммунопатогенезе аутоиммунных заболеваний основными являются механизмы аллергии II, III и IV типов и их различные сочетания. Поэтому фармакологическая регуляция иммунопатогенеза при
аутоиммунных заболеваниях определяется преобладанием типов иммунопатологических механизмов гуморального или клеточного и основной направленностью действия иммуносупрессивных средств.
В любом случае целесообразно применение препаратов с иммуносупрессивным действием, которое обусловлено угнетением пролиферации и дифференцировки аутоагрессивного клона лимфоцитов или возникает в результате ингибиции функций зрелых иммунокомпетентных клеток. При выявлении нарушений
функций или соотношений иммунорегуляторных Т-лимфоцитов возникает необходимость избирательной супрессии Т-хелперов или избирательной
активации Т-супрессоров. Кроме того, необходимо использовать весь арсенал
препаратов, обладающих противовоспалительным действием, ингибиторов
ферментов и других средств, направленных на снижение интенсивности
эффекторных реакций иммунного воспаления.
Выбор средств иммуносупрессивной терапии и их сочетаний проводится на
основе данных клинико-иммунологического обследования больных, с обязательным учетом периода, стадии процесса, степени тяжести и преобладающих
иммунопатологических механизмов.
При выборе цитостатика для иммуносупрессии следует учитывать токсичность препарата, так как почти все препараты в дозе, превышающей индивидуальную толерантность, тяжело повреждают костный мозг. Вначале целесообразно назначать средство, действующее на определенную фазу клеточного цикла
для подавления деления клеток (синхронизация), а затем в оптимальный период
времени независимо от фазы деления применяется активный лимфотропный
препарат. При этом можно использовать меньшие дозы выбранных средств и
добиться лучшего эффекта. Выбор цитостатического препарата проводится с
учетом того, что различные средства обладают разным механизмом действия.
По сравнению с лечением глюкокортикостероидами иммуносупрессивная
терапия с помощью цитостатиков имеет некоторые особенности: при подобранной дозе чаще и внезапнее могут возникать более опасные побочные действия и
осложнения. Кроме того, это лечение требует большего времени для достижения
клинического эффекта. Эта форма лечения относительно нова. Пока не совсем
известны ее возможности, опасности и границы применения. Поэтому в настоящее время ее использование должно быть ограничено следующими показаниями:
1 - подтвержденный диагноз аутоиммунного заболевания;
31
2 - прогрессирующее течение;
3 - неблагоприятный прогноз;
4 - ситуация, когда прочие терапевтические возможности исчерпаны;
5 - резистентность к глюкокортикостероидам. Для проведения иммуносупрессивной терапии необходимы следующие условия:
- тщательная оценка показаний у каждого больного;
- обратимый характер изменений;
- отсутствие инфекционных процессов;
- тщательный гематологический контроль;
- длительное наблюдение;
- постепенное снижение дозы.
Длительность иммуносупрессивной терапии зависит от многих факторов:
характера заболевания, переносимости применяемых препаратов и их побочного
действия, успешности лечения и др. Поддерживающая доза должна быть минимальной, хотя и такая тактика нередко ведет к рецидивам заболевания, усилению
симптомов или ухудшению общего состояния.
Учитывая характер действия иммуносупрессивных средств, особую осторожность необходимо соблюдать в следующих ситуациях:
- наличие инфекции, так как при проведении иммуносупрессивной терапии
течение инфекций утяжеляется;
- предстоящие оперативные вмешательства (включая трансплантацию почек), риск которых при проведении иммуносупрессивной терапии возрастает;
- недостаточная функция костного мозга (опасен цитостатический эффект
иммуносупрессоров);
- иммунодефициты.
Следует принимать во внимание и возраст больных. У детей и подростков к
показаниям подходят более строго из-за возможного мутагенного, тератогенного
и канцерогенного действия.
Нужно помнить, что при иммуносупрессивной терапии возрастает опасность
развития инфекционных осложнений. Опасность представляют вирусные и грибковые инфекции, а также септические процессы. Они развиваются при наличии
дефектов в системах клеточного и гуморального ответа при нарушениях лейкопоэза.
Иммуностимулирующие препараты
Под иммуностимулирующими препаратами понимаются лекарственные
средства, способные усиливать функцию иммунокомпетентных клеток, обеспечивать повышенную иммунную защиту при различных заболеваниях, сопровождающихся снижением иммунологической реактивности организма: при хронических воспалительных процессах в послеоперационном периоде, при
длительном лечении антибиотиками, при вяло заживающих ранах, лучевой
терапии
К иммуностимулирующим
и т.д.
препаратам относятся как продукты естественного происхождения (продигиозан, пирогенал, зимозан, вакцины и др.), так и ве32
щества синтетического происхождения (метилурацил, пентоксил, дибазол). Особую группу иммуностимуляторов составляют гормональные средства (соматотропин, тиреоидин, тималин). В определенных клинических ситуациях неспецифической, но достаточно отчетливой активностью обладают витаминные препараты (препараты витаминов С, А, Е) и продукты животного происхождения.
Таблица 9
Основные характеристики некоторых иммуностимулирующих препаратов
Характеристика и механизм иммуностимулирующего действия
I. Бактериальные полисахариды
Пирогенал
Увеличивает количество палочкоядерных и сегментоядерных
нейтрофилов. Повышает фагоцитарное число, показатель завершенности фагоцитоза и фагоцитарную активность макрофагов.
Неспецифически активирует пролиферацию лимфоидных клеток, стимулирует антителообразование и гуморальные неспецифические факторы защиты. Индуцирует синтез интерферона.
Продигиозан
Активирует мононуклеарную фагоцитирующую систему: усиливает функциональную активность и миграцию макрофагов за
счет интенсификации в них обменных процессов. Увеличивает
число нейтрофилов и повышает их поглотительную и переварительную способность. Стимулирует синтез и эмиссию кортикостероидных гормонов. Усиливает антителообразования, индуцирует синтез интерферона.
II. Дрожжевые полисахариды
Зимозан
Активирует мононуклеарную фагоцитирующую систему, стимулирует Т- и (в меньшей степени) В-системы. Усиливает
антителообразование. Стимулирует лейкопоэз и активность
лейкоцитов. Усиливает канцеролитическую и комплементарную
активность сыворотки крови.
III. Вакцины - БЦЖ
Неспецифически стимулирует фагоцитарную функцию макрофагальной системы за счет миграции из костного мозга усиленно продуцируемых прекурсоров макрофагов. Гиперплазирует
макрофагальные элементы в печени и селезенке, усиливает катаболическую функцию макрофагов. Повышает активность маркерных ферментов, резко увеличивает неспецифическую защиту
против бактериальных инфекций, за счет вовлечения
Т-лимфоцитов в активацию мак рофагов.
IV. Препараты нуклеиновых кислот
Нуклеинат натрия
Повышает фагоцитарную активность лейкоцитов. Стимулирует
образование интерферона. Устраняет иммунодефицит Т- и Влимфоцитов. Стимулирует образование РНК и белка в макрофа-
Побочные эффекты
Озноб, повышение
температуры, головная боль, рвота.
Повышение температуры, головная
боль, ломота в суставах, лейкопения,
сменяющаяся лейкоцитозом. Нейротоксичность.
Малотоксичен, не
вызывает гипертермических реакций.
Развитие диссеминированной инфекции БЦЖ.
Повышение температуры, тошнота,
рвота, нарушение
33
гах. Активирует синтез ДНК, усиливает пролиферативные и митотические процессы в селезенке. Нормализует соотношение
Тх/Тс.
функции печени,
снижение АД.
Продолжение табл. 9
Характеристика и механизм иммуностимулирующего действия
Побочные эффекты
V. Производные пиримидина, имидазола и пурина
Левамизол
Стимулирует клеточный иммунитет. Модулирует регуляторные Головная боль, наТ-клетки. Восстанавливает эффекторные функции Т-лимфоцирушения сна, дистов и фагоцитов. Стимулирует созревание зрелых Т-лимфоцитов пепсия, аллергиче(имитация действия тимусных гормонов), вызывает дифференские реакции.
цировку Т-лимфоцитов. Повышает фагоцитарную активность
мононуклеарных фагоцитов. Нормализует соотношение Тх/Тс.
Снижает уровень IgE и количество В лимфоцитов. В малых дозах избирательно стимулирует Т-супрессоры.
Метилурацил, пентоксил
Повышает фагоцитарную активность лейкоцитов и поглотиДиспептические
тельную способность макрофагов. Усиливает синтез нуклеиноявления, головная
вых кислот в клетках иммунной системы. Повышает бактериболь, аллергические
цидную активность сыворотки крови. Индуцирует синтез инреакции. Нельзя
терферона. Повышает уровень иммунизации и количество анти- применять при осттел. Усиливает процесс регенерации за счет повышения синтеза рых лейкозах и злобелка РНК, ДНК.
качественных заболеваниях костного
мозга.
Дибазол
Усиливает фагоцитарную активность макрофагов, стимулирует
Хорошо переноситпродукцию антител. Стимулирует образование интерферона
ся, но может быть
(интерфероноген).
умеренное снижение
артериального давления.
Теофиллин
Избирательно увеличивает количество Тс, нормализует соотно- Изжога, тошнота,
шение Тх/Тс, снижает количество В-лимфоцитов.
рвота, понос, головная боль. При передозировке - эпилептоидные припадки.
Диуцифон
Повышает активность клеток через индукцию ИЛ2, индуцирует
продукцию фактора роста Т-клеток, стимулирует Т- и В-лимфоциты (больше - Т-клетки).
VI. Препараты вилочковой железы
Тималин (тимарин)
Индуцирует созревание Т-лимфоцитов: увеличивает число, восстанавливает их функцию. Нормализует супрессорную активность Т-лимфоцитов. Увеличивает уровень цАМФ в лимфоци34
Обострение латентных вирусных инфекций.
тах-предшественниках и повышает уровень цГМФ в эффекторных клетках.
Окончание табл. 9
Характеристика и механизм иммуностимулирующего действия
Т-активин
Увеличивает содержание Т-клеток, нормализует сниженный
индекс Тх/Тс.
VII. Интерферон
Увеличивает резистентность клеток к вирусным инфекциям.
Стимулирует фагоцитоз, повышает активность естественных Ткиллеров. Увеличивает продукцию интерферона. Поддерживает
равновесие между иммуностимуляцией и иммуносупрессией.
VIII. Витаминные препараты
Аскорбиновая кислота
Нормализует проницаемость мембран лимфоцитов и других
клеток, осуществляющих защитную функцию, нормализует
процессы тканевого дыхания и фосфорилирования. Стимулирует функции лейкоцитов и стабилизирует их количество (особенно при лучевой терапии).
Токоферола ацетат
Тормозит процессы пероксидации липидов в митохондриях (антиокислительный эффект) и обеспечивает нормальный синтез
мембран иммунокомпетентных клеток. Усиливает активность Тхелперов, усиливает синтез.
Ретинола ацетат
Стабилизирует мембраны иммунокомпетентных клеток и регулирует их проницаемость за счет связывания липидной и белковой частей мембраны. Ускоряет синтез антител и ослабляет действие иммунодепрессантов.
Побочные эффекты
Обострение латентных вирусных инфекций.
В больших дозах
возможна лейкопения и тромбоцитопения, алопеция,
лихорадка.
Малотоксичен в малых дозах. В больших - повреждение
гломерул почек гипертония, угнетение инсулинообразования.
При внутримышечном введении - болезненность и инфильтраты.
При передозировке сонливость, вялость,
головная боль, гиперемия лица, тошнота, расстройство
походки.
Иммунопатогенетические основы действия и применения
иммуностимулирующих препаратов
Увеличение инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, полирезистентными к большинству антибиотиков, против которых не существует
методов эффективной вакцинации, обусловливает необходимость неспецифической стимуляции иммунной защиты организма. Широкое распространение респираторных бактериальных и вирусных инфекций, хронических рецидивирую35
щих воспалительных заболеваний дыхательных путей, бактериальных и вирусных кишечных инфекций, смешанных инфекций полиэтиологичной природы,
внутрибольничных инфекций, вызванных условнопатогенными микроорганизмами, заставляет искать пути их профилактики и лечения, основанные на повышении неспецифической резистентности организма.
Трудности лечения инфекционного процесса значительно возрастают при
недостаточности иммунной защиты организма, связанной с первичными (генетически-обусловленными) и вторичными (приобретенными) иммунодефицитами.
Вторичные иммунодефициты развиваются как следствие:
- многих вирусных, бактериальных, грибковых и протозойных инфекций;
- патологических процессов, связанных с нарушением питания, с потерей
белка, заболеваний печени, почек, сахарного диабета;
- тяжелых травм (ожогов) и послеоперационных осложнений;
- злокачественных новообразований;
- некоторых лечебных воздействий, оказывающих иммуносупрессивное действие.
Иммуносупрессивные средства, которые широко используются при аллотрансплантации и лечении аутоиммунных заболеваний для подавления специфического иммунного ответа, в большинстве случаев попутно ингибируют и
противоинфекционный иммунитет, создавая благоприятный фон для развития
инфекций, вызванных условнопатогенной аутофлорой.
Кроме классических иммуносупрессивных препаратов способностью угнетать механизмы противоинфекционной защиты организма обладают противовоспалительные, антигистаминные препараты, антикоагулянты, алкоголь, пестициды и большинство антибиотиков.
В связи с этим круг показаний к применению иммуностимулирующих препаратов достаточно широк:
- хронические, рецидивирующие, бактериальные, грибковые и вирусные инфекции;
- хронические рецидивирующие воспалительные процессы;
- злокачественные новообразования (в комплексной терапии);
- острая и хроническая лучевая болезнь;
- аутоиммунные процессы (в комбинациях с иммунодепрессантами);
- первичные и вторичные иммунодефициты.
Иммуностимулирующие препараты применяются не только при лечении
инфекций, но и для их профилактики: для усиления эффектов специфической
иммунопрофилактики (вакцинации), для экстренного повышения неспецифической резистентности в эпидемически опасной ситуации.
Некоторая избирательность механизмов действия иммуностимулирующих и
иммуносупрессирующих препаратов является основой для создания наиболее
эффективных их комбинаций, с помощью которых можно добиться восстановления сбалансированности иммунной системы организма.
36
В связи с тем, что один и тот же препарат в зависимости от дозы и способа
применения может стимулировать или угнетать иммунитет, необходимо строго
индивидуальное обоснование показаний и противопоказаний к его применению.
Противопоказаниями к применению иммуностимулирующих препаратов являются:
- острые инфекции с выраженной лихорадкой;
- обострение хронических воспалительных процессов;
- выраженная сенсибилизация организма, полиаллергия;
- атопии;
- беременность.
Для некоторых иммуностимуляторов особенно важно тщательно анализировать показания и противопоказания. Так, учитывая способность левамизола в
сравнительно низких дозах избирательно стимулировать Т-супрессоры, его применяют при некоторых аутоиммунных заболеваниях с целью подавления специфического иммунного ответа. Однако эта же его способность заставляет с большей осторожностью использовать этот препарат в онкологии или при синдроме
приобретенного иммунодефицита (СПИД), когда имеется выраженный дисбаланс в Т-системе иммунитета с преобладанием Т-супрессоров.
Показания к назначению иммуностимулирующих препаратов
специфического действия
1. Клинические признаки, характерные для иммунного дефицита (сниженная
защита против вирусной или бактериальной инфекции, затяжное и хроническое
течение инфекционно-воспалительных заболеваний и др.).
2. Снижение количества Т-, В-лимфоцитов, Ттч (теофиллинчувствительных
Т-лимфоцитов): реверсия соотношения Ттр/Ттч (индекс более 4,0).
3. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов к Т-активину или к другому
иммунокорригирующему препарату.
Таблица 10
Иммуномодулирующие препараты, используемые в педиатрии
Наименование препарата, форма выпуска
Т-активин (тимотропин), амп. 100 мкг
Тималин (тимарин), амп. 10 мг
Вилозен, амп. 20 мг
Димефосфон, фл. по 100 мл 15%
Декарис (левамизол), табл. 0,05, 0,15
Продигиозан, амп. 1,0 мл, 0,005%
Пирогенал, амп.
Нуклеинат натрия
Дибазол, пор.
Метилурацил, табл. 0,5, упаковка 50 табл.
Точка приложения
Т-, В-звено иммунитета
-//Стимулирует пролиферацию и дифференциацию Т-лимфоцитов
КОС, Т-, В-звено иммунитета
Т-, В-звено иммунитета
ФАЛ, Т-, В-звено иммунитета
Стимулятор образования эндогенных нук37
Лизоцим, амп. фл., 50, 100 мг, 150 мг
леиновых кислот
ФАЛ, повышает уровень сывороточного
лизоцима
Окончание табл. 10
Наименование препарата, форма выпуска
Точка приложения
Интерферон, амп., лейкоцитарный амп. 0,2 Иммуномодулятор противоинфекционной,
противовирусной активности стимулирует
продукцию эндогенного интерферона
Бифидумбактерин
Бификол, амп. 3; 5 доз, таб. 1 доза, фл. 30,
50 доз
Лактобактерин
Колибактерин
-
12. Методологические подходы к оценке иммунного статуса
Для правильного понимания принципов работы иммунной системы необходимо подчеркнуть несколько важнейших положений. Во-первых, любой организм является с точки зрения иммунолога уникальным, т.е. генетически индивидуальным и несет в себе свой,только ему присущий набор антигенов. Во-вторых,
любой организм в процессе своей жизни постоянно заботится о своей генетической “чистоте”, т.е. сохраняет свою индивидуальность, поскольку ее утрата (например, бурный опухолевый рост) приводит к смерти. И наконец, в -третьих,
надо иметь в виду, что любой организм находится в окружении постоянно меняющегося потенциально враждебного мира, наполненого самыми различными
веществами, бактериями, вирусами; Кроме того, на него оказывают влияние самые различные средовые факторы. И именно на иммунную систему в первую
очередь ложится защита внутренней среды организма от всего многообразия
внешнего мира.
Следовательно, иммунная система должна быть также многообразна в выборе оружия защиты и достаточно подвижна для оперативного реагирования на
внешние факторы. Таким образом, для адекватного функционирования иммунологических механизмов, отдельные компоненты этой системы должны обладать
большой лабильностью. Более того, большая подвижность (изменчивость) системы свидетельствует о ее значительной функциональной активности. Эта точка
зрения наиболее полно получила отражение в концепции иммунологических мобилей (Петров Р.В., 1981), говорящей о том,что нормальное функционирование
иммунной системы является результатом сложного взаимозависимого процесса,
включающего взаимодействие ее отдельных системообразующих компонентов.
При этом позитивный эффект работы системы, заключающийся в максимальной
адаптации, может быть достигнут различными путями.
38
Понятием “имунный статус человека” в настоящее время принято называть
совокупность лабораторных показателей, характеризующих количественную и
функциональную активность клеток имунной системы.
Под нормальным состоянием иммунного статуса подразумеваются параметры иммунной системы, определяемые у практически здоровых лиц различных
возрастных групп.
Определение параметров иммунной системы при различных патолог- ических состояниях дает возможность разделить последние на три главные группы:
- первая - без существенных изменений иммунной системы;
- вторая - с недостаточностью иммунной системы;
- третья - с гиперактивацией иммунокомпетентных клеток.
В настоящее время оценка иммунного статуса человека приобрела четкую
методологическую основу. Она позволяет выявить изменения в иммунной системе обследованной популяции, в том числе и в возрастном аспекте, еще до клинических проявлений патологии, а также сформировать группы риска и повышенного риска по иммунопатологическим состояниям на основе клинических
признаков и лабораторных показателей иммунного статуса. На этой основе возможна разработка адекватных средств и методов иммунокоррекции и иммунопрофилактики.
Целью иммунологической диагностики является выявление направлен- ности иммунопатологического процесса. Многократное исследование иммунного
статуса одного и того же контингента людей позволяет с высокой долей вероятности установить значимые нарушения в иммунной системе и прогнозировать
вероятные последствия различных воздействий на конкретного человека, а также на популяцию в целом.
В настоящее время предложена и разработана к внедрению трехэтапная схема исследования иммунного статуса:
I этап включает анкетный опрос, где выделяются группа лиц, нужда- ющихся в иммунологическом обследовании;
II этап - проведение первичного иммунологического обследования;
III этап - углубленное иммунологическое обследование (табл. 11).
Таблица 11
Трехэтапная схема иммунологического мониторинга
Этап
оценки
1
Вид
исследования
Анкетный
опрос
2
Первичное
лабораторное
Цель исследования
Выявление первичной
группы риска развития
патологии
Выявление грубых изменений в иммунной сис-
Изучаемые признаки
Наследственность, вид и интенсивность воздействия факторов
внешнего окружения; наличие
аутоимунной, аллергической,
инфекционной и др. видов патологии
Абсолютное количество лейкоцитов; содержание Р-белка, по39
обследование
теме и повышенного
риска развития патологии
казателя РТМЛ
Окончание табл. 11
Этап
оценки
3
Вид
исследования
Углубленное
иммунологическое обследование
Цель исследования
Изучаемые признаки
Выявление поврежденного звена иммунитета,
подбор иммунокоррегирующих средств
Количество Т- В-лимфоцитов, их
субпопуляций, НК-киллеров,
РБТ-лейкоцитов, содержание
ЦИК, иммуноглобулинов, показателей фагоцитоза, цитохимические тесты, структура НIАсистемы, определение интерферонового статуса и чувствительности Т- В- лимфоцитов к иммуномодуляторам
Предлагаемая схема иммунологического мониторинга позволяет получить
объективные данные о состоянии иммунной системы человека и влиянии различных факторов внешней среды.
В принципе при оценке иммунного статуса человека ставятся следующие задачи:
1. Определение нарушенного звена иммунитета у больных с различными
расстройствами иммунной системы для подтверждения диагноза и проведения
соответствующей иммунотерапии.
2. Выявление дефектов в работе иммунной системе до клинического проявления иммунодефицитного состояния (донозологическая диагностика) (Петров
Р.В. и соавт., 1995). Для практического здравоохранения Институтом иммунологии МЗ РФ был разработан и рекомендован к использованию комплекс методов
позволяющих оценить функционирование основных звеньев иммунной системы:
фагоцитоза, клеточного и гуморального иммунитета (Петров Р.В. и соавт., 1992).
В этот комплекс включены следующие методы:
1. Изучение абсолютного и относительного содержания лейкоцитов и лимфоцитов.
2. Реакция фагоцитоза.
3. Определение содержания иммуноглобулинов классов А, М, G, Е и содержания В-лимфоцитов.
4. Определение субпопуляций Т-клеток.
5. Определение уровня антител к тиреоглобулину, тринитрофенилу и ревматоидного фактора. Как видно из перечисленного, подобный набор методов позволяет не только определить функция гуморального и клеточного иммунитета,
фагоцитирующих клеток, но и оценить уровень активации иммунной системы,
что позволит с достаточной точностью выявить дефектные звенья иммунной за40
щиты. Ниже мы приводим описание наиболее широко распространенных методов оценки иммунного статуса.
Рис. 5. Схема основных этапов диагностики иммунологической
недостаточности и формирования групп риска по иммунодефицитным
и иммунопатологическим состояниям: ИДС - иммунодефицитный синдром;
ИПС - иммунопатологическое состояние
ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
ПУТЕМ АНКЕТНОГО ОПРОСА
41
Оценка состояния иммунной системы путем анкетного опроса является первым и важным этапом иммунологического обследования. С одной стороны, она
абсолютно доступна и может быть проведена врачом практически любой специальности, с другой - позволяет выявить группу лиц, входящих в группу риска
наличия иммунозависимой патологии. В настоящее время общепринятой в странах СНГ является карта диагностики иммунологической недостаточности, разработанная институтом иммунологии МЗ РФ (см. приложение 1). Она включает
в себя следующие разделы: 1. Эпидемиологическая и санитарно-гигиеническая
характеристика условий труда и быта пациента. 2. Перенесенные инфекции, интоксикации, хирургические вмешательства и травмы. 3. Генеалогический анамнез. 4. Клинические признаки иммунологической недостаточности, в том числе
а) инфекционный синдром; б) аллергический синдром; в) аутоиммунный синдром; г) иммунопролиферативный синдром. 5. Хронические сопутствующие заболевания.
При составлении заключения по результатам анкетирования мы опираемся
на рекомендации В.С. Смирнова и соавт. (1993), который считает, что особое
внимание следует уделять положительным ответам в разделе 4 (пункты а, б, в и
г, включающие вопросы с 46 по 67), а также п.20, определяющий наличие профессиональных вредностей. На наш взгляд, этот перечень необходимо дополнить вопросами номер 31 (наличие туберкулеза) и 37 (длительное применение
терапии). Если имеются несколько положительных ответов (более двух) в п. а)
или б) (4 раздел), либо указание на заболевания, обозначенные в п. в) и г), то это
дает право трактовать состояние иммунной системы как иммунодефицитное, что
служит основанием для отнесения пациента в группу риска и направления его на
первичное лабораторное обследование.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ
Основные методы оценки Т- и В-систем иммунитета связаны с определением количества и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов. В связи с этим
важной процедурой подготовительного этапа является выделение чистой суспензии лимфоцитов периферической крови.
К числу наиболее употребительных относится метод выделения клеток на
градиенте плотности фиколл-пака. Смешивая фиколл и пак в определенной пропорции, получают раствор, имеющий плотность 1.077 г/см. Центрифугируя периферическую кровь после наслаивания на градиент, удается разделить клетки,
имеющие плотность ниже (лимфоциты, моноциты) и выше (эритроциты. гранулоциты), чем 1.077 г/см.
Материалы и оборудование
1. Фиколл-400 - полисахарид.
42
2. Пак - рентгеноконтрастное вещество (аналоги: верографин, изопак, урографин, уротраст, урополониум, уромиро, низотраст-370, триозил, ронпакон,
омнипак и др.).
3. Среда 199.
4. Стерильная дистиллированная вода.
5. 3% раствор уксусной кислоты.
6. Центрифуга с бакет-ротором.
7. Ареометр с пределами измерений от 1.060 г/см до 1.090 г/см.
8. Камера Горяева.
9. Микроскоп.
10. Лабораторная посуда, конические центрифужные пробирки,весы для
уравновешивания центрифужных пробирок и др.
Описание метода
1. Приготовление фиколла: 4.32 (8.64) г порошка фиколла-400 растворяют в
48 (96) мл дистиллированной воды.
2. Приготовление раствора рентгеноконтрастного вещества (например, уротраста): 10.14 (20.28) мл 75% раствора уротраста доводят дистиллированной водой до 21 (42) мл.
3. Приготовление градиента плотности: растворы фиколла и уротраста смешивают. С помощью ареометра измеряют плотность полученного раствора, которая должна составлять 1.077 г/см. Если плотность выше, чем необходимо, то
добавляют раствор фиколла, если ниже - раствор уротраста. Градиент плотности
можно хранить в течение 30 суток при температуре + 4 в склянке из оранжевого
стекла. При отсутствии фиколла градиент плотности можно приготовить только
из одного рентгеноконтрастного вещества. С этой целью 10 (20) мл 76% раствора уротраста смешать с 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и добавить 0.45
(0.9) мл 0.1% раствора хлористого натрия. Полученный при этом 14.3% раствор
уротраста имеет плотность 1.077 г/см и может быть использован в качестве градиента плотности.
4. Выделение лимфоцитов: периферическую кровь из локтевой вены в объеме 10 мл берут в пробирку, содержащую гепарин, в конечной концентрации 25
ед в 1 мл крови. Кровь должна отстояться в течение 40-60 мин при комнатной
температуре до четкого разделения эритроцитов и плазмы.
4а. В центрифужную пробирку наливают 2-3 мл градиента плотности, на него наслаивают 4-6 мл отстоявшейся плазмы и верхний слой эритроцитов. Соотношение объемов градиент: плазму выдерживают в пределах 1:2 - 1:4.
4б. Пробирки центрифугируют в течение 40 мин в бакет-роторе с ускорением 200 g (1500-1800 об/мин) при температуре 20°С. В процессе центрифугирования эритроциты и гранулоциты “проваливаются” в градиент и оседают на дно
пробирки. На верхней границе градиента при правильном разделении образуется
рыхлое кольцо беловатого цвета, состоящее в основном из лимфоцитов с примесью моноцитов. Над слоем лимфоцитов находится плазма. Плазму собирают в
43
отдельную пробирку для последующего анализа на иммуноглобулины; лимфоциты отсасывают в сухую коническую центрифужную пробирку.
4в. К суспензии лимфоцитов добавляют 3-4 мл среды 199 и содержимое пробирки тщательно перемешивают. После этого пробирки центрифугируют с ускорением 200-300 g при температуре 20°С, затем надосадочную жидкость
удаляют, а процедуру отмывки повторяют еще один раз.
4г. После отмывания готовят рабочую концентрацию лимфоцитов, содержащую 2×10 клеток в 1 мл. Перед приготовлением рабочей концентрации
сосчитывают исходное количество лимфоцитов:
- к 0,1 мл осадка отмытых клеток добавляют 0,9 мл среды 199, суспензию
тщательно перемешивают;
- в чистую пробирку вносят 0,38 мл 3% раствора уксусной кислоты и 0,02 мл
взвеси лимфоцитов;
- в камере Горяева подсчитывают лимфоциты в 100 больших квадратах и полученное число умножают на 50000. Результат соответствует количеству лимфоцитов в 1 мл суспензии. Для приготовления рабочей концентрации лимфоцитов полученное число делят на 2×10, из результата вычитают 1, остаток представляет собой количество питательной среды 199 в мл, которое необходимо
добавить в пробирку с лимфоцитами.
Приготовленную по данной методике суспензию лимфоцитов можно хранить при температуре + 4°С в течение 2 часов.
ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫХ АНТИГЕНОВ ТЛИМФОЦИТОВ
Установлено, что на клеточной поверхности Т-лимфоцитов имеются специфические антигенные детерминанты (дифференцировочные антигены), позволяющие выявлять субпопуляции этих клеток. В настоящее время одним из наиболее точных методов определения Т-лимфоцитов и их субпопуляций является
непрямая иммунофлюоресцентная реакция с моноклональными антителами, полученными к дифференцировочным антигенам, локализованным на поверхности
лимфоцитов. Широкое диагностическое применение получили мышиные моноклональные антитела ОКТ. СD3+ выявляют более 95% периферических Т-лимфоцитов, CD4+ - 55-65% периферических Т-хелперов/Т-амплификаторов, CD8+ 34-35% периферических Т-супрессоров/цитотоксических Т-лимфоцитов. Имеются также и другие моноклональные антитела (OKТ5, OKТ6, OKТ11 и т.д.).
Применение данных реагентов основано на способности моноклональных антител фиксироваться на поверхности жизнеспособных клеток, выявляя специфические антигенные детерминанты после дополнительной обработки лимфоцитов
антимышиными иммуноглобулинами, меченными флюоресцеинизотиоцианатом
(ФИТЦ).
44
Материалы и оборудование
1. Исследуемая суспензия лимфоцитов.
2. Забуференный изотонический раствор хлорида натрия.
3. 0,01% раствор поли-L-лизина (мол.масса 40000-80000) в забуференном
изотоническом растворе хлорида натрия.
4. 0.0004% раствор этидиума бромида
5. Моноклональные антитела OKТ3+, OKТ4+, OKТ8+ или их аналоги, выпускаемые Институтом иммунологии Минздрава РФ, Нижегородским НИИВС
Минздрава РФ и другими организациями.
6. Свиные антимышиные антитела, меченные ФИТЦ.
7. Глицерин.
8. Люминесцентный микроскоп.
9. Предметные и покровные стекла.
10. Бытовой холодильник.
11. Лабораторная посуда.
12. Центрифуга с бакет-ротором.
Описание метода
1. Приготовление забуференного изотонического раствора хлорида натрия
(ЗФР): 15,6 г NaН2РО растворить в дистиллированной воде, доведя объем до 1
литра (раствор № 1); 35,8 г Nа2НРО растворить в дистиллированной воде, доведя
объем до 1 литра (раствор № 2). Смешать 13 частей раствора № 1 и 37 частей
раствора № 2, в полученной смеси растворить 8,5 г NаС1; рН раствора должен
составить 7,2-7,4.
2. Проведение реакции. Выделенные на градиенте плотности лимфоциты
дважды отмывают охлажденным до 4°С ЗФР в течение 10 мин при 1000-1500
об/мин; суспензию лимфоцитов разводят ЗФР до концентрации 2×10 клеток в 1
мл.
Тщательно отмытые и обезжиренные предметные стекла покрывают 0.01%
раствором поли-L-лизина в ЗФР путем нанесения его на стекло с последующей
инкубацией в течение 1 часа при 37°С (при отсутствии поли-L-лизина можно
воспользоваться также 0,4% раствором формвара в дихлорэтане, при этом стекло однократно опускают в раствор на 5-10 с; следует помнить, что раствор токсичен и работа с ним требует определенных мер предосторожности - все манипуляции необходимо проводить в вытяжном шкафу). На стекло, покрытое слоем
поли-L-лизина или формвара, наносят 0,05 мл суспензии лимфоцитов (для определения Т-лимфоцитов и их субпопуляций делают три мазка для подсчета
Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+) и Т-супрессоров (CD8+), мазки можно
сделать на трех стеклах или на участках одного стекла, в последнем случае мазки следует пометить с помощью воскового карандаша на обратной стороне стекла. Клетки осаждают на стекле во влажной камере при температуре 37°С (в качестве влажной камеры используют чашку Петри с вложенной в нее влажной
фильтровальной бумагой). После осаждения клеток препарат осторожно промы45
вают круговыми движениями последовательно в трех сосудах с охлажденным
ЗФР. Мазок подсушивают фильтровальной бумагой (не касаясь монослоя клеток). На мазок лимфоцитов наносят один из растворов моноклональных антител,
содержащий 3 мкг/мл OKТ3, OKТ4 или OKT8 в ЗФР и инкубируют во влажной
камере в течение 40 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации
препарат осторожно промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. На мазок наносят 10-15 мкл кроличьего антимышиного иммуноглобулина, меченного
ФИТЦ, разведенного 1:50 в ЗФР, и инкубируют во влажной камере в течение 30
мин при комнатной температуре. Препарат промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. На мазок наносят 10-15 мкл 0,0004% (1 мг в 250 мл дистиллированной
воды) этидиума бромида; стекло слегка подогревают, проводя несколько раз над
пламенем горелки. Препарат промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. Удаляют фильтровальной бумагой избыток жидкости и на мазок наносят 50% раствор глицерина в ЗФР; препарат накрывают покровным стеклом и с помощью
фильтровальной бумаги удаляют избыток глицерина.С целью сохранения препарата от высыхания края покровного стекла окантовывают расплавленным парафином.
Учет результатов
Препарат анализируют с помощью люминесцентного микроскопа (последовательность фильтров, начиная от ртутной лампы: ЗСС, ЗСС 24, ФС-1, БС-8). В
поле зрения микроскопа видны лимфоциты, ядро которых светится кирпичнокрасным цветом, а антительный комплекс, связавшийся с поверхностными рецепторами клеток, имеет точечное свечение изумрудно-зеленого цвета. Клетки,
имеющие диффузное изумрудно-зеленое или чисто зеленое свечение, являются
мертвыми и при анализе не учитываются.
В нескольких полях зрения сосчитывают общее число лимфоцитов и среди
них количество клеток, имеющих точечное изумрудно-зеленое свечение.
Процент лимфоцитов, имеющих на своей поверхности дифференцировочные
антигены CD3+, CD4+,CD 8+ определяют после подсчета 200 клеток.
По результатам подсчета количества CD4+ и CD 8+ лимфоцитов, т. е. Тхелперов и Т-супрессоров, рассчитывают индекс дифференцировки лимфоцитов
(ИД): CD4+/CD8+.
РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ
Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) в присутствии митогена
- конканавалина А (Кон А) является одним из методов определения функционального состояния Т-системы иммунитета. Реакция основана на способности
Т-лимфоцитов в присутствии митогена выделять биологически активные вещества - лимфокины, в том числе факторы, ингибирующие миграцию лейкоцитов.
Материалы и реактивы
46
1. Гепаринизированная исследуемая кровь.
2. Конканавалин А.
3. Изотонический раствор хлорида натрия.
4. Воск или пластилин.
5. Капилляры из набора для определения С-реактивного белка.
6. Центрифужные пробирки.
7. Микроскоп с окуляр-микрометром.
Описание метода
Перед работой необходимо подготовить капилляры. С этой целью отбирают
капилляры с одинаковым внутренним диаметром. На капилляры наносят метку
на расстоянии 1/3 длины от любого края.
На два часовых стекла или в две лунки планшета для иммунологических исследований наливают по 0.2 мл исследуемой крови. В первую порцию вносят
0.05 мл раствора Кон А в концентрации 10 мкг/мл (препарат растворяют в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия. Полученными смесями заполняют капилляры на 2 /3 длины (до метки). На каждую пробу берут не менее 6
капилляров (3 опытных и 3 контрольных). Заполненные капилляры запаивают
воском или пластилином и помещают в маркированные центрифужные пробирки (контрольные и опытные капилляры помещают в разные пробирки). Капилляры в пробирке необходимо зафиксировать комочком ваты или пластилином в
строго вертикальном положении. После этого капилляры центрифугируют в течение 5 мин при 800 об/мин, а затем помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 часов.
Учет результатов
После инкубации производят учет результатов. С этой целью под микроскопом с помощью окуляр-микрометра определяют величину миграции основной
массы лейкоцитов от границы эритроцитарного осадка в контроле и опыте. Результаты выражают в виде процента миграции в опыте относительно контроля.
В норме процент миграции составляет 40-70%; повышение до 90 % или снижение до 30% является умеренным; выше 90% и ниже 30% - значительным.
Увеличение показателя миграции свидетельствует о снижении функциональной
активности лимфоцитов: их способности продуцировать лимфокины, в частности, фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов (ФУМ). При радиационном
иммунодефиците наиболее ранним и типичным признаком является увеличение
показателя миграции до 90% и выше.
ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА (В-СИСТЕМЫ).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА В-ЛИМФОЦИТОВ, ИМЕЮЩИХ
ПОВЕРХНОСТНЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
47
На поверхности В-лимфоцитов имеются иммуноглобулиновые рецепторы,
которые могут быть выявлены с помощью специфических антисывороток, меченных ФИТЦ, причем методика позволяет определять как общее количество Влимфоцитов, несущих на своей поверхности иммуноглобулиновые рецепторы,
так и дифференциально количество клеток с рецепторами отдельных классов:
IgA, Ig G, Ig M.
Материалы и оборудование
1. Исследуемая проба лимфоцитов в концентрации 2×10 кл/мл.
2. Моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам человека, меченные ФИТЦ.
3. Забуференный изотонический раствор хлорида натрия.
4. 50% раствор глицерина на забуференном изотоническом растворе хлорида
натрия.
5. Люминесцентный микроскоп.
6. Термостат.
7. Поли-L-лизин (молекулярная масса 40000-80000).
Описание метода
На мазок лимфоцитов наносят 10-15 мкл моноспецифической сыворотки к
иммуноглобулинам М, G, A, меченной ФИТЦ, и разведенной 1:50 в ЗФР и инкубируют во влажной камере в течение 40 мин при температуре 20 С.
Последующие этапы приготовления мазка, учета и анализа результатов описаны выше.
В норме в периферической крови циркулируют от 8 до 19% клеток, несущих
иммуноглобулиновые рецепторы (ВIg+), 3-10% клеток, несущих IgM (BIgM+),
2-6% клеток, несущих IgG (BIg+), 1-3% клеток, несущих IgA (BIgA+).
При исследовании пробы следует определять как общее количество иммуноглобулиновых клеток, так и их распределение по классам. Снижение количества клеток всех или некоторых классов, а также нарушение их соотношения
(BIgM+ : BIgG+ : BIgA+), равного 6:4:2, свидетельствует о наличии повреждений в В-системе иммунитета.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
МЕТОДОМ РАДИАЛЬНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ
Метод радиальной иммунодиффузии в геле агарозы является в настоящее
время основным при определении содержания иммуноглобулинов различных
классов в сыворотке крови.
Материалы и оборудование
1. Стекла 9×12 см.
48
2. П-образная рамка 120×90×8 мм для облегчения заливки стекла агаром.
3. Водяная баня на 50-60°С.
4. Пастеровские пипетки с оттянутым концом.
5. Влажная камера.
6. Измеритель.
7. Калибровочная линейка.
8. Коммерческие наборы для определения концентрации иммуноглобулинов
производства “СЕВАК”, ЧССР.
9. 0,2 М вероналовый буфер.
10. Реактив для окраски преципитатов.
11. Пробойник круглый диаметром 1.5-2.0 мм для вырезания лунок в геле
агарозы.
Описание метода
Приготовление вероналового буфера: 1,84 г веронала и 0,34 г едкого натра
растворяют в 200 мл дистиллированной воды.
Приготовление геля агарозы: агарозу из набора для определения иммуноглобулинов в сыворотке крови “СЕВАК” в количестве 3,6 г высыпают в 200 мл вероналового буфера, подогретого до температуры 50-60°С, после чего кипятят в
течение 10-15 мин на водяной бане до полного расплавления агара и получения
прозрачного геля. Расплавленный агар фильтруют через вату и разливают по
21 мл в подогретые стеклянные цилиндры, которые закрывают пробками и помещают на водяную баню с температурой 56-58°С. Ампулу моноспецифической
сыворотки с рабочим титром 1:20-1:30 разводят в 1 мл вероналового буфера,
выливают в соответствующий цилиндр, перемешивают и 10-15 мин выдерживают в водяной бане.
Стеклянные пластины размером 9×12 см протирают эфиром, на стекле помещают ограничительную рамку (при отсутствии рамки края можно обработать
парафином). Подготовленные таким образом пластины подогревают и помещают на строго горизонтальную поверхность. На середину пластины из цилиндра
быстро выливают расплавленный агар, содержащий моноспецифическую сыворотку. Гель с помощью стеклянной палочки быстро и равномерно распределяют
по всей поверхности стекла, пузырьки воздуха тщательно удаляют. Пластину с
гелем оставляют на горизонтальной поверхности до полного затвердения агара.
С помощью круглого штампа по трафарету в геле вырезают лунки. Расстояние от края стекла до лунок и между лунками должно быть не менее 10 мм. На
одном стекле размером 9×12 см можно разместить до 48 лунок. Агар из лунок
удаляют пастеровской пипеткой, соединенной с вакуумным или водоструйным
насосом. Подготовленные пластины при необходимости можно хранить во
влажной камере при температуре 4°С.
Исследуемую сыворотку с помощью пастеровской пипетки с тонко оттянутым концом вносят в лунки до исчезновения вогнутого мениска. Каждую сыворотку вносят в лунки агаровых пластин, содержащих ту или иную моноспеци49
фическую сыворотку. В 4 лунки агаровой пластины вносят цельную и разведенную в 2, 4, 8 раз стандартную (эталонную) сыворотку с известным содержанием
иммуноглобулинов всех классов. Ампула со стандартной сывороткой входит в
каждый набор моноспецифических сывороток. После внесения исследуемых сывороток пластины помещают во влажную камеру, в качестве которой можно использовать эксикатор с налитой на дно водой или другую подходящую посуду с
крышкой и инкубируют в течение 24 часов (для определения IgA и IgG) или 48
часов (для определения IgM и IgD).
После инкубации пластины извлекают из влажной камеры и окрашивают
подходящим красителем: бромфеноловым синим (состав краски: бромфеноловый синий 0.5 г, свинец уксуснокислый 4% водной раствор - 10 мл, уксусная кислота ледяная 20 мл, вода дистиллированная до 1 л), амидо черным 10 В (состав
краски: 1% амидо черного в 7% водном растворе уксусной кислоты).
Учет результатов
Для оценки результатов реакции измеряют диаметр образовавшихся вокруг
лунок колец преципитации. Затем на полулогарифмической бумаге наносят на
оси абсцисс диаметры колец стандартной сыворотки, а по оси ординат - известную концентрацию каждого класса иммуноглобулинов в г/л и строят калибровочный график, с помощью которого вычисляют содержание иммуноглобулинов
в каждой исследуемой сыворотке.
В норме в сыворотке содержится 0,65-1,65 г/л IgM; 7,50-15,45 г/л IgG; 1,252,5 г/л IgA.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ
КОМПЛЕКСОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Процессы аутосенсибилизации, происходящие в организме чело века под
воздействием ионизирующей радиации, сопровождаются накоплением циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), в связи с чем определение их содержания является важным этапом оценки вторичного иммунодефицита.
Материалы и оборудование
1. Сыворотка крови (исследуемая).
2. Буфер боратный.
3. Полиэтиленгликоль (мол. М. 6000).
4. Пробирки.
5. Центрифуга высокоскоростная типа Т-24.
6. Спектрофотометр.
Описание метода
50
Приготовление 0,1 М боратного буфера: 3,410 г борной кислоты и 4,275 г
тетрабората натрия смешивают, переносят в мерную колбу и доводят до 1 л дистиллированной водой, рН 8,4.
Сыворотку крови в объеме 200 мкл смешивают с 5 мл 0,1 М боратного буфера. 4 мл смеси приливают к 4 мл 7% раствора полиэтиленгликоля, приготовленного на 0,1 М боратном буферном растворе. Пробу инкубируют 18-20 часов при
температуре 4°С. После инкубации смесь центрифугируют при 2000 об/мин в
течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, препарат дважды отмывают
7% раствором полиэтиленгликоля на 0,1 М боратном буфере и растворяют в 5
мл 0,1 N раствора едкого натра.
Учет результатов
Уровень циркулирующих иммунных комплексов определяют с помощью
спектрофотометра при длине волны - 280 нм и выражают в единицах оптической
плотности.
Поскольку в настоящее время многие лаборатории оснащены вертикальными фотометрами, возможна постановка данной реакции в модификации микрометодом.
Для этого исследуемую сыворотку разводят боратным буфером в 3 раза. Разведение сыворотки выполняют следующим образом.
В лунку планшета для иммунологических реакций вносят 0,05 мл сыворотки
крови и 0,1 мл буфера.
В параллельные лунки второго планшета вносят в первую - 0,25 мл буфера,
во вторую - 0,25 мл раствора полиэтиленгликоля. Затем в обе лунки этого планшета вносят по 0,05 мл разведенной сыворотки из первого планшета. Планшет
выдерживают 1 час при комнатной температуре. На вертикальном фотометре с
использованием светофильтра 450 нм определяют экстинцию. Вычисляют разность показателей сыворотки крови с полиэтиленгликолем и сыворотки с буфером и умножают на 100, что и является величиной ЦИК, выраженной в единицах
оптической плотности.
ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
ФАГОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК
Выделение лейковзвеси
Лейковзвесь для постановки реакции фагоцитоза и нитросинего тетразолиевого теста выделяют по стандартной методике из гепаринизированной крови.
Материалы и оборудование
1. 10 % раствор медицинского желатина.
2. Гепарин.
3. Среда 199 или раствор Хенкса.
51
4. 0,83 % раствор хлористого аммония.
5. Центрифуга с бакет-ротором.
6. Термостат.
7. Микроскоп.
8. Камера Горяева
9. Силиконированные пробирки.
Описание метода
Венозную кровь в объеме 2-3 мл набирают в пробирку с гепарином в соотношении 10-20 ЕД гепарина на 1 мл крови. В кровь добавляет 10 % раствор желатины в пропорции - на 1 мл крови 0,1 мл желатина и помещают в термостат на
30-40 минут при 37°С. После отстаивания надосадок, состоящий из лейковзвеси
отсасывают в отдельную пробирку и добавляют 0,83 % раствор хлористого аммония для лизирования примеси эритроцитов. Далее лейковзвесь трижды отмывают средой 199 или раствором Хенкса в центрифуге по 5-10 минут при ускорении 100-200 g (500-1500 об/мин). Осадок лейкоцитов ресуспендируют в среде
199 и доводят концентрацию до 5×10 в мл. Все манипуляции с клетками с целью
сокращения потерь производят в силиконированной посуде.
ИССЛЕДОВАНИЕ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ
ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ
Материалы и оборудование
1. Монодисперсные частицы латекса.
2. Метанол.
3. Краска по Романовскому-Гимза.
4. Предметные стекла.
5. Пластиковые планшеты для иммунологических реакций.
Описание метода
В силиконированные пробирки или планшеты помещают 0,1 мл лейковзвеси
и добавляют 0,2 мл монодисперсных частиц латекса в концентрации 5×10 /мл.
Оптимальное соотношение количества клеток и частиц латекса составляет 1:100.
Смесь перемешивают и помещают в термостат на 30 минут при температуре
37°С. После инкубации трижды отмывают средой 199 и готовят препарат. Высушенный препарат фиксируют метанолом и окрашивают по РомановскомуГимза.
Учет результатов
В препаратах подсчитывают удельное и абсолютное содержание фагоцитирующих клеток (возможен вариант для специальных исследований: подсчет для
моноцитов и нейтрофилов отдельно) - фагоцитарный показатель (ФП), среднее
52
количество частиц латекса, поглощеных фагоцитировавшей клеткой, - фагоцитарное число (ФЧ). Рассчитывается интегральный фагоцитарный индекс по
формуле:
ФП × ФЧ
ИФИ =
,
100
где ИФИ - интегральный фагоцитарный индекс;
ФП - фагоцитарный показатель, %;
ФЧ - фагоцитарное число.
ПОСТАНОВКА НИТРОСИНЕГО ТЕТРАЗОЛИЕВОГО ТЕСТА
Принцип нитросинего тетразолиевого теста заключается в поглощении из
среды фагоцитирующими клетками бесцветного нитросинего тетразолия (НСТ)
и восстановлении его в темно-синий диформазан. Активность восстановления
НСТ отражает состояние бактерицидных пероксидазных систем клетки и коррелирует с образованием супероксидных радикалов.
Материалы и оборудование
1. 0,2 % раствор нитросинего тетразолия.
2. 2 % водный раствор метилового зеленого.
3. Водяная баня.
4. Метанол.
5. Предметные стекла.
6. Силиконированные пробирки.
Описание метода
Для постановки НСТ-теста к 0,1 мл лейковзвеси добавляют 0,1 мл 0,2 % нитросинего тетразолия. Смесь инкубируют в водяной бане при температуре 37°С в
течение 25 мин и при комнатной температуре в течение 15 мин. Далее клетки
трижды отмывают средой 199 и готовят препараты. Высушенные препараты
фиксируют метанолом и окрашивают 2 % водным раствором метилового зеленого от 30 с до 5 мин.
Учет реакции
Учет реакции включает в себя подсчет относительного и абсолютного количества диформазан-положительных лейкоцитов (возможно для специальных исследований расчет производить отдельно для нейтрофилов и моноцитов), вычисление среднего цитохимического коэффициента реакции (СЦК). Для определения СЦК при учете реакции отмечают диформазан-отрицательные клетки
(0 степень активности), клетки с единичными гранулами диформазана или с
площадью, окрашенной диформазаном, до 25-30 % (1 степень активности); клетки, цитоплазма которых на 30-70 % занята глыбками диформазана (2 степень
53
активности) и клетки, у которых более 70 % цитоплазмы содержит гранулы диформазана (3 степень активности). В каждом препарате подсчитывают 300 лейкоцитов. Средний цитохимический коэффициент рассчитывают по формуле:
( 0xa ) + (1xб ) + ( 2xв ) + (3xг )
,
100
где 0, 1, 2, 3 - степень активности восстановления диформазана;
а, б, в, г - количество клеток каждой степени активности соответственно.
СЦК =
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНОВОГО СТАТУСА ЧЕЛОВЕКА
Материалы и оборудование
1.Лабораторное оборудование:
1) стерильное рабочее место;
2) холодильник на +4°С;
3) морозильник на -20°С;
4) набор автоматических 1и 8-канальных микропипеток на различные
рабочие объемы;
5) лабораторная центрифуга;
6) ридер для иммуноферментного анализа;
7) инвертированный микроскоп.
2. Растворы и питательные среды:
1) среда Игла (может заменяться на среду ДМЕМ, 199 или аналогичные);
2) среда 4 RPMI-1640;
3) сыворотка крови крупного рогатого скота или сыворотка крови плодов
коровы;
4) 0,1 н. раствор 0 HCL;
5) 0,1 н. раствор 0 NaOH;
6) Раствор энтеротоксина 0 St.aureus (СЭА).
3. Культура клеток:
L-41 (культура клеток карциномы легкого человека)
4. Вирусы:
1) вирус болезни Ньюкасла (NDV);
2) вирус везикулярного стоматита (BBC), штамм Индиана.
5. Расходные материалы:
1) микропланшеты для культуральных работ;
2) наконечники для микропипеток, эппендорфы;
3) стерильные салфетки.
6. Другие реактивы:
1) антибиотики (пенициллин, стрептомицин);
2) референс-препараты человеческого ИФН.
7. Прочее:
54
1) лабораторная посуда, дезинфектанты, стерилизаторы и др.
Описание метода
Основные принципы предлагаемой методики заключаются в том, что ИФН
обладает антивирусной активностью, проявляющейся в торможении репродукции вируса и, следовательно, в ингибировании его цитопатического действия
(ЦПД), проявляющегося в деструкции монослоя клеток после их инкубации с
вирусом. Торможение развития ЦПД можно охарактеризовать количественно,
окрашивая клеточный монослой после инкубации с ИФН-содержащими пробами, и индикаторным вирусом. Количество абсорбированного клетками красителя обратно пропорциональны степени развития ЦПД и прямо пропорциональны
содержания ИФН в исследуемых пробах.
Основные стадии анализа: 1) получение монослойной клеточной культуры;
2) преинкубация клеточного монослоя с ИФН-содержащими пробами; 3) инкубация клеточного монослоя с раствором индикаторного вируса; 4) учет результатов анализа (окраска лунок с клетками и определение степени деструкции монослоя).
Забор крови и подготовка анализируемых проб
В стерильные пробирки, в которые предварительно внесено необходимое
количество стерильного антикоагулянта (гепарин, трилон В и др. нетоксичные
антикоагулянты) в виде концентрированного (для исключения разбавления исходного образца) раствора на среде RPMI-1640 или на физиологическом растворе, так, чтобы конечная концентрация антикоагулянта, например для гепарина,
составила 15-20 ед., отбирается венозная кровь объемом от 0,5 до 2 мл. Отобранная таким образом кровь может храниться 5-6 часов при +4°С без потери
всех необходимых свойств.
Подготовка анализируемых проб
В соответствии с литературными данными, универсальными показателями,
наиболее полно отражающими состояние системы интерферона, являются:
1) содержание общего сывороточного интерферона (sИФН);
2) количественное определение способности лейкоцитов крови продуцировать α-интерферон (ИФН-α) и у-интерферон (ИФН-γ) в ответ на специфическое
индуцирующее воздействие (индукция ИФН-α, ИФН-γ). Для анализа вышеперечисленных параметров цельную кровь необходимо обработать следующим образом:
а) в стерильные эппендорфы вносится Среда RPMI-1640 с добавлением глутамина, антибиотиков (пенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл), 2% сыворотки крупного рогатого скота (КРС); растворы индукторов интерферона (вирус NDV для ИФН-α и СЭА для ИФН-γ) и цельная кровь в соотношении 8/1/1 (например, 200 мкл RPMI-1640, 25 мкл раствора индуктора,
55
25 мкл цельной крови). Полученная индукционная смесь инкубируется
при 37°С в течение 24 часов, затем в эппендорфы, в которых производится
индукция ИФН-α, добавляется 0,1 н. раствор HCL до рН 2,0, и проба инкубируется в течение 1 часа при 37°С, после чего в нее вносится 0,1 н.
раствор NаОН до рН 7,4. Обработанные таким образом пробы с индуцированным ИФН-α и ИФН-γ замораживаются и хранятся при -25°С.
б) цельная кровь центрифугируется при 1000 g, после чего в стерильный эппендорф отбирается 50-200 мкл сыворотки для анализа содержания общего сывороточного интерферона (sИФН). Отобранная сыворотка замораживается и хранится при -25°С.
Постановка анализа
Получение монослоя клеток. В стерильные микропланшеты для культур
клеток, предварительно обработанные УФО в течение 1,5-2 часов, вносится суспензия клеток L-41 в ростовой питательной среде (РС) концентрацией 500000
клеток/мл из расчета 100 мкл суспензии в лунку. Ростовая среда представляет
собой среду Игла, содержащую 10% сыворотки КРС, глутамин (300 мг/л), антибиотики (пенициллин, стрептомицин по 100 ед/мл). Засеянные микропланшеты
помещаются в CO-термостат при 37°С до образования полного монослоя клеток
(при соблюдении указанных условий монослой образуется через 24 часа).
Подготовка проб индуцированных ИФН-α и ИФН-γ к анализу
После образования полного монослоя в микропланшеты вносятся интерферонсодержащие пробы. Непосредственно перед анализом пробы, содержащие
индуцированный ИФН-γ центрифугируют при 1500 g в течение 10-15 мин для
осаждения клеточных элементов; пробы, содержащие индуцированный ИФН-α
центрифугируют при 3000-4000 g в течение 20-30 мин для осаждения выпавших
в осадок белков и клеточных элементов.
Титрование ИФН-содержащих проб
Титрование интерферонсодержащих проб производится во вспомогательных
96-луночных микропланшетах (можно использовать планшеты для иммунологических реакций, иммуноферментного анализа и др., объем лунок которых не менее 300 мкл), предварительно обработанных УФО в течение 1,5-2 часов.
Титрование ИФН-содержащих проб осуществляется следующим образом: в
лунки вспомогательного микропланшета 8-канальной микропипеткой вносится
по 150 мкл поддерживающей питательной среды (ПС), являющейся полным аналогом РС, но содержащей только 2% сыворотки КРС, вместо 10%. После этого в
лунки ряда “А” последовательно вносятся анализируемые пробы в количестве
150 мкл и раститровываются по лункам рядов “В”-”Н” соответствующих столб-
56
цов перенесением в каждую последующую лунку 150 мкл пробы, так, что коэффициент разведения от лунки к лунке равен 2.
При этом далеко не всегда целесообразно начинать титрование проб с разведения “2” (вносить в лунки ряда “А” по 150 мкл анализируемой пробы), так как
обычно анализируемые пробы обычно содержат не менее 8-10 МЕ/мл ИФН. Поэтому в целях уменьшения количества материала, отбираемого для анализа (венозной или капилярной крови), возможно внесение в лунки ряда “А” 30 или 60
мкл пробы (с предварительным внесением в лунки ряда “А” 270 или 240 мкл ПС
соотв.), так, чтобы общий объем смеси в лунках ряда “А” равнялся 300 мкл, как
и в случае титрования начиная с разведения 1:2, но при выполнении данных условий внесения проб первоначальное разведение составит 1:5 (или 1:10 соотв.).
Раститровка проб осуществляется также перенесением 150 мкл в каждую последующую лунку с падением концентрации ИФН в 2 раза (от лунок ряда “А” к
лункам ряда “Д” концентрация изменяется соответственно как: 1:5; 1:10; 1:20;
1:40 или 1:10; 1:20; 1:40; 1:80).Такая схема титрования позволяет снизить количество лунок на один анализ (4 лунки на одну параллельную аналитическую
точку) при использовании при учете результатов анализа с применением методики получения кривой количественной зависимости поглощения специфического красителя клетками от содержания ИФН в инкубационной среде (см. ниже).
Таким образом, в каждой лунке вспомогательного микропланшета содержится по 150 мкл пробы необходимого разведения.
Для удобства и унифицирования анализа пробы рекомендуется располагать в
микропланшетах следующим образом:
1) столбцы 1 и 2 рядов “А” - “G”: референс препарат ИФН с рядом вертикального падения концентрации: 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,76 МЕ/мл;
2) столбцы 1 и 2 ряда “Н”: не содержащие ИФН контрольные пробы (ПС)
для контроля протекания процесса развития цитопатического действия (ЦПД)
индикаторного вируса;
3) столбцы 3 - 12 рядов “А” - “Н”: раститрованные в 4-х или 8-ми лунках
анализируемые пробы.
После проведения титрования исследуемых ИФН-содержащих проб во
вспомогательном микропланшете анализируемый материал переносится в микропланшеты с выращенным монослоем клеток (опытные микропланшеты). Для
этого непосредственно перед перенесением из опытных микропланшетов с клетками вытряхивается ростовая среда (или же отсасывается специальным вакуумным устройством), остатки РС вытряхиваются на стерильную бумажную или
тканевую салфетку, и в лунки опытных микропланшетов 8-канальной микропипеткой переносится по 100 мкл опытных образцов в строгом соответствии с расположением их во вспомогательных микропланшетах.
Затем опытные микропланшеты, содержащие клеточный монослой с нанесенными анализируемыми пробами помещаются в СО-термостат при 37°С на 24
часа.
57
Инкубация клеток с индикаторным вирусом
После 24 часов инкубации из микропланшетов вытряхивают ПС с раститрованными пробами и в каждую лунку вносится по 100 мкл ПС, содержащей 100
цитопатических доз (ЦПД) индикаторного вируса - вируса везикулярного стоматита (ВВС) штамм Индиана. Необходимый для проведения анализа ВВС накапливается заражением монослойной культуры L-41, отбором и лиофилизацией
культуральной жидкости после достижения 70-80% полной деструкции монослоя клеток; инфекционность вируса определяется предварительным титрованием вирусосодержащей жидкости в условиях, аналогичных проведению анализа
определения ИФН статуса.
После внесения ВВС в опытные микропланшеты последние помещаются в
СО-термостат при 37°С на 18-24 часа.
Остановка инкубации производится при достижении 100% деструкции монослоя клеток в лунках с контролем ВВС и при значительной деструкции монослоя в лунках, содержавших наибольшие разведения референса ИФН и исследуемых проб. Оптимальным считается момент остановки инкубации в то время,
когда достигнута 90-100%-ная деструкция монослоя в лунках, содержавших 0,78
МЕ/мл референса ИФН и соотв. 20-30%-ная деструкция монослоя в лунках, содержавших 1,56 МЕ/мл референса ИФН. При соблюдении этих условий достигается максимальная чувствительность методики, позволяющая определять содержание ИФН в пробах с точностью до +1 МЕ/мл.
Учет результатов анализа
После остановки инкубации клеточного монослоя с ВВС из планшетов вытряхивается вирусосодержащая жидкость и в каждую лунку 8-канальной микропипеткой вносится 50 мкл раствора красителя кристаллического фиолетового
(0,5% раствор на 30% этаноле). Окрашивание производится в течение 10 мин
при комнатной температуре. После этого из микропланшетов вытряхивается
раствор красителя и микропланшеты промываются в проточной водопроводной
воде комнатной температуры погружением 5-10 раз. Затем микропланшеты высушиваются на воздухе.
Учет результатов можно производить визуально, определяя степень деструкции монослоя клеток в каждой лунке по степени окрашивания дна лунок.
При этом в качестве калибровочной кривой используются столбцы микропланшета, в которых был раститрован референс-препарат ИФН. Сравнивая плотность
клеточного монослоя в лунках с референсом ИФН и в опытных лунках находится какая-либо лунка в столбцах с референсом ИФН, которая соответствовала бы
по плотности монослоя рассматриваемой опытной лунке. Таким образом, зная
концентрации референса ИФН в каждой из лунок и разведение опытной пробы,
определяется истинная концентрация ИФН в анализируемой пробе.
Более точный учет результатов производится с помощью точного определения абсорбированного клетками монослоя красителя. Это достигается путем до58
бавления в каждую лунку микропланшета 100 мкл 30% этанола и 1-часовой экстракцией красителя при 37°С. После этого из каждой лунки 75 мкл экстракта
переносится 8-канальной микропипеткой в микропланшет для иммуноферментного анализа (ИФА) и последующим сканированием микропланшета на ридере
для ИФА. Измерения проводятся при длине волны, как можно более близкой к
590 нм (максимум поглощения раствора кристаллического фиолетового в 30%
этаноле). После получения значений величин оптической плотности экстракта
строится калибровочная кривая зависимости степени деструкции клеточного
монослоя от концентрации интерферона, используя данные по референсу ИФН.
Затем по полученной калибровочной кривой определяется содержание ИФН в
анализируемых пробах, выраженное в международных единицах (МЕ) на мл.
При этом необходимо учитывать все коэффициенты разведения для каждого исследуемого образца.
Для исключения возможных аберраций, присущих каждой биологической
системе, иногда приводящих к появлению несистематических ошибок, рекомендуется на каждом микропланшете проставлять дополнительные контрольные
точки (например, анализ sИФН и индукции ИФН-α, ИФН-γ доноров), дублирующиеся на каждом очередном микропланшете. Для этого необходимо отобрать несколько мл сыворотки крови и провести индукцию ИФН-α, ИФН-γ в
большом объеме.
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 (ИЛ-2)
Материалы и оборудование
1. Среда 199 (Московский институт полиомиелита и вирусных препаратов).
2. Среда RPMI 1640 (Московский институт полиомиелита и вирусных препаратов).
3. Эмбриональная телячья сыворотка (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).
4. L-глютамин.
5. HEPES (Серова, ФРГ).
6. Гентамицин.
7. 2-меркаптоэтанол (Серова, ФРГ).
8. Конканавалин А (Алаинский завод химреактивов).
9. Форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА).
10. Метил-а-D-маннопиранозид (Серова, ФРГ).
11. Н-тимидин.
12. 0.05 М “трис”-НСL-буфер (25 мл 0,2 М раствора триоксиметиламинометана, 45 мл 0,1 н раствора НСL, 30 мл дистиллированной воды).
13. Планшеты для иммунологических реакций Ленинградского завода медицинских полимеров.
14. Пластиковые матрасы для культивирования клеток (Нунклон, Дания).
Можно использовать стеклянные матрасы.
59
15. Фильтры “Владипор” с диаметром пор 0,22 и 0,45 мкм.
16. Микропипетки с регулируемым объемом.
17. СО2-инкубатор.
18. Ламинарный бокс.
19. Харвестер для переноса клеток на фильтры (Дайнатек, Швейцария или
собственного изготовления).
20. Стекловолокнистые фильтры (Ватман, США).
21. Центрифуга с охлаждением.
22. Сцинтилляционный счетчик.
23. Трихлоруксусная кислота, толуол, РРО, РОРОР, этанол.
Описание метода
Приготовление сред. При получении ИЛ-2 используют две основные среды:
Среда №1 (для отмывки клеток) - среда 199, обогащенная 10% (по объему)
эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 10 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентамицина.
Среда №2 (для культивирования клеток) - среда RPMI 1640, с 2 мМ L-глютамина, 25 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентамицина, 6×10 М 2-меркаптоэтанола, 1-5%
ЭТС, инактивированной при 56°С в течение 30 мин.
Для длительного хранения клеток в жидком азоте используют следующие
среды:
Среда №3 (для замораживания клеток) - среда RPMI 1640, 20% ЭТС, 10%
диметилсульфоксида (ДМСО).
Среда №4 (для размораживания клеток) - среда 199, 50 мкг/мл гентамицина,
10 мМ HEPES.
Приготовление клеточных суспензий
В качестве стандартного препарата ИЛ-2 используют супернатант мышиных
или крысиных селезеночных клеток, стимулированных КонА. Суспензию клеток
селезенки получают в стеклянном гомогенизаторе или любым другим доступным способом, фильтруют через стальную или капроновую сеточку с отверстиями диаметром около 100 мкм, затем 3 раза отмывают в среде N1 8-10 мин
при 400 g.
Следует отметить, что ИЛ-2, полученный от крысы или мыши, не действует
на лимфоциты человека, в то время как человеческий ИЛ-2 активирует не только
Т-клетки человека, но и лимфоциты лабораторных животных. Для получения
человеческого ИЛ-2 используют лейкоциты периферической крови, полученные
путем градиентного центрифугирования в растворе фикол-пак или любым другим способом. Источником человеческого ИЛ-2 могут служить также некоторые
перевиваемые клеточные линии (например: Jurkat-FHCRC).
60
Для получения мышиного ИЛ-2 в безмитогенной системе служит одна из
сублиний лимфомы EI-4. Клетки EI-4 пассируют на мышах С57ВI/6, вводя им
внутрибрюшинно по 10 клеток в 1 мл среды 199. Через 8-10 суток у животных
забирают асцитную жидкость и 3 раза промывают клетки, содержащиеся в ней, в
среде №1.
Культуру EI-4 можно поддерживать in vitro в пластиковых матрасах. Клеточную суспензию (0,3-0,5 млн в мл) инкубируют в среде №2 с 5% ЭТС при
37°С и 5% СО в течение 48-72 часов. Затем клетки снимают со дна матраса палочкой с наконечником из силиконовой резины, сделанным, например, из пробки от пенициллинового флакона.
Часть клеток EI-4 идет на получение ИЛ-2, а избыток можно хранить в жидком азоте. С этой целью клетки разводят в среде №3 до концентрации 40-50
млн/мл и помещают на 2-4 часа в морозильник с температурой -20°С. Затем
клетки переносят в морозильник с температурой -70°С и только после этого - в
жидкий азот.
Размораживают клеточную суспензию в водяной бане при 37°С. После размораживания клетки разводят средой №4 так, чтобы конечная концентрация
ДМСО в среде не превышала 1%, и промывают 3 раза в среде №4.
В суспензии, приготовленной любым из перечисленных способов, определяют с помощью окраски трипановым синим процент жизнеспособных клеток и
приступают к их культивированию для получения ИЛ-2.
Продукция ИЛ-2
Клетки EI-4 в концентрации 1 млн/мл ресуспендируют в среде №2 и культивируют в пластиковых матрасах в присутствии 10 мг/мл РМА. (Концентрация
ЭТС в среде не должна превышать 1%). Спленоциты в концентрации 10 млн/мл
культивируют в среде №2 с 5% ЭТС в присутствии 2,0 мкг/мл КонА.
После 40-часового культивирования при 37°С в атмосфере с 5% СО из матрасов собирают культуральную жидкость, центрифугируют ее 8-10 мин при
400g и диализуют против 0.05М “трис”-HCL буфера для удаления ингибирующих субстанций и низкомолекулярных веществ. Диализ проводят в течение 48
часов на магнитной мешалке при 4-10°С с однократной сменой буфера. После
диализа супернатанты обогащают пятикратной средой RPMI 1640 для восстановления изотоничности (1 объем среды к 4 объемам супернатанта) и фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Супернатанты хранят при -20°С до
использования.
Очистка супернатанта, содержащего ИЛ-2, проводится в несколько этапов.
Вначале препарат подвергают высаливанию сульфатом аммония при 80% насыщении на холоду, после чего преципитат диализируют против 0,05М “трис”HCL буфера. Полученный материал фракционируют на колонках с сефадексом
С-100, уравновешенным 0,22-0,24% бикарбонатом натрия. Мышиный ИЛ-2
61
элюируется во фракции с молекулярной массой 30 кД. После колонки каждую
пробу обогащают 10-кратной средой RPMI-1640 (1 объем среды добавляют к 9
объемам фракции) и эмбриональной телячьей сыворотки (до 1%, так как в бессывороточной среде ИЛ-2 плохо сохраняется). Каждую пробу фильтруют через
фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и тестируют на биологическую активность.
Концентрирование белка после колонки проводят с применением фильтров
Amikon UM-2 или UM-10.
Дальнейшую очистку ИЛ-2 можно производить с помощью ионообменной
хроматографии на ДЕАЕ-сефацеле, изоэлектрофокусированием и электрофорезом в SOS-полиакриламидном геле.
Тестирование биологической активности ИЛ-2
Тестирование биологической активности ИЛ-2 и супернатантов, содержащих
его, основано на использовании ИЛ-2-зависимых Т-клеточных линий и клонов.
Однако такие клоны довольно трудно получить и поддерживать. Другой способ
тестирования основан на способности ИЛ-2 поддерживать рост Т-кл., активированных митогеном.
Для получения активированных клеток (КонА-бластов) спленоциты мышей в
концентрации 5 млн/мл (в среде №2 с 5% ЭТС) стимулируют 2,0 мкг/мл КонА в
течение 72 часов при 37°С и 5% СО2. Стимуляцию можно осуществлять в пластиковых матрасах. После окончания культивирования клетки промывают 3 раза
средой №1 и разводят в среде №2 с 5% ЭТС до концентрации 8×10 /мл. Следует
помнить, что вместе с клетками может остаться небольшое количество КонА,
способного вызывать такое же действие, как ИЛ-2. Блокирование активности
КонА достигается добавлением в среду 0,1М метил-а-D-маннопиранозида.
Тестирование активности ИЛ-2 производят в планшетах для иммунологических реакций. Вначале получают несколько серийных двукратных разведений
ИЛ-2 в среде №2 (обычно берут по 4 лунки на каждое разведение). Например,при разведении ИЛ-2 от 1:2 до 1:1024 в 1 и 2 лунки одного ряда планшета
вносят по 100 мкл супернатанта, а в 3-10 - по 50 мкл среды №2. Затем из второй
лунки забирают 50 мкл, переносят в следующую, 3-ю лунку, перемешивают и
т.д. Аналогичные разведения получают еще в 3 рядах планшета.
После разведения ИЛ-2 в каждую лунку добавляют по 50 мкл 0.4М раствора
метил-а-D-маннопиранозида в среде №2, 50 мкл отмытых КонА-бластов, разведенных до концентрации 8×10 /мл. Общий объем в лунке доводят до 0,2 мл средой №2. В качестве контроля вместо супернатанта также вносят среду №2.
Клетки культивируют в течение 24 часов при 37°С в атмосфере с 5% СО. Пролиферацию в культуре оценивают по включению “Н-тимидина: за 4-5 часов до
окончания культивирования в каждую лунку вносят по 2 мкКи изотопа с молярной активностью 1 Ки/мМ в общем объеме 10 мкл.
После окончания культивирования клетки переносят с помощью харвестера
или пипетки на фильтры (стекловолокнистые СГ/с для харвестера или фильтры
“Владипор” при использовании установки для вакуумного фильтрования). Осажденные клетки промывают средой 199 (примерно 10 мл на каждую лунку),
62
преципитируют метку 5% трихлоруксусной кислотой (5 мл/лунку), промывают
фильтр этанолом (5 мл/лунку) и высушивают. Подсчет радиоактивности осуществляют на У-счетчике, помещая фильтр в сцинтилляционную жидкость следующего состава: 3 г 2,5-дифенилоксазола (РРО), 0,1 г 1,4-ди-/5-фенил-2-оксазолил/-бензола /РОРОР/, 1 л толуола.
В отсутствие ИЛ-2 КонА-бласты превращаются в малые лимфоциты и после
24-часового культивирования уровень включения “Н-тимидина составляет 200500 имп/мин на 1 лунку. В присутствии ИЛ-2 наблюдается, зависимое от дозы
фактора, увеличение включения метки до 10-25 тыс. имп/мин. Данные по включению “Н-тимидина используют для определения активности ИЛ-2 в условных
единицах. За 1 единицу принимается такое количество ИЛ-2, которое индуцирует 50% максимальной пролиферации КонА-бластов, наблюдаемой после добавления стандартного образца (супернатанта мышиных спленоцитов, стимулированных КонА, как описано выше). Например: стандартный образец вызывает
максимальную пролиферацию клеток, равную 20000 имп/мин. 50% максимальной пролиферации (т.е. 10000 имп/мин) наблюдается при разведении контрольного, стандартного образца в 16 раз. Тестируемый образец ИЛ-2 вызывает пролиферацию, равную 10000 имп/мин, при разведении в 128 раз. Следовательно,
так как 1 единица равна разведению 1/16, то в тестируемом образце содержится
128:16=8 единиц ИЛ-2 в 1 мл.
Оценка результатов
ИЛ-2 является одним из важнейших факторов, обеспечивающих нормальное
развитие иммунного ответа, поэтому нарушение его продукции свидетельствует
о серьезных изменениях в иммунологическом статусе организма. Поскольку
синтез ИЛ-2 осуществляется Т-клетками, имеющими хелперный фенотип
(Lyt-1+, L3T4+ клетками у мышей и OКТ4+ клетками у человека), ингибиция его
продукции указывает в первую очередь на нарушение в этой субпопуляции
лимфоцитов. Однако следует учитывать тот факт, что активация Т-хелперов зависит от вспомогательных клеток (макрофагов, дендритических клеток), обеспечивающих процессинг антигена и продукцию интерлейкина-1. Синтез ИЛ-2 в
норме осуществляется только после воздействия на продуцирующие клетки ИЛ1 и антигена. Следовательно, нарушение продукции ИЛ-1 также может вызвать
падение продукции ИЛ-2. Напротив, индукция рецепторов к ИЛ-2 на поверхности Т-клеток является процессом, зависящим, по-видимому, только от антигена
и поэтому в ряде ситуаций является более удобным параметром при оценке активности иммунной системы.
Реально в зависимости от целей исследования тестирование можно проводить двумя способами.
1. Изучение способности неизвестного фактора стимулировать продукцию
ИЛ-2 или оценка продукции ИЛ-2 в условиях заболевания.
В первом случае лимфоциты стимулируют исследуемым фактором и проверяют супернатант от стимулированных культур на способность поддерживать
пролиферацию КонА-бластов. В качестве контроля используют стандартный
63
препарат ИЛ-2 (см. выше). Важно при этом удалить исследуемый фактор из супернатанта или блокировать его активность.
Во втором случае лимфоциты инфицированных или здоровых доноров стимулируют лектином (КонА, ФГА), как было описано выше, и сравнивают активность ИЛ-2 в полученных супернатантах.
2. Определение чувствительности лимфоцитов к ИЛ-2 (наличие рецепторов к
ИЛ-2 на лимфоцитах).
Лимфоциты активируют КонА или фактором, действие которого нужно исследовать, затем определяют способность полученных в результате бластов пролиферировать в присутствии стандартного препарата ИЛ-2.
В совокупности предложенная методика дает возможность оценить воздействие различных агентов на ИЛ-2-продуцирующие или ИЛ-2-чувствительные
клетки, а также выявить изменения в этих клеточных популяциях в результате
воздействия патологических факторов. Существенные изменения в продукции
ИЛ-2 или в индукции рецепторов к ИЛ-2 указывают на активацию (или, наоборот, подавление) главным образом клеточных иммунных реакций.
Трактовка полученных результатов лабораторных
исследований иммунной системы
Полученные результаты лабораторного тестирования иммунной системы
достаточно сложно трактовать в клинической практике. Это связано с рядом
факторов. Во-первых, как было ранее отмечено, иммунная система является в
значительной степени подвижной для адекватного реагирования на постоянно
меняющиеся “атаки” внешнего мира. Поэтому многие иммунологические показатели в норме имеют значительный разброс. Во-вторых, в обязательном порядке необходимо учитывать, что природно-климатические факторы оказывают
прямое или опосредованное влияние на функциональные системы организма, в
том числе и на иммунную систему, которая при длительном воздействии перестраивается на новый уровень функционирования, адекватный конкретным средовым условиям (Лозовой В.П., 1988). Поэтому необходимо в клинической работе опираться на “свои” региональные значения нормативных показателей иммунной системы. Более того, идеально под рукой иметь нормы для самых различных групп населения, разбитых по возрасту и полу.
При нахождении полученного результата в границах доверительного интервала M+m (где M - средняя арифметическая генеральной совокупности, а m средняя квадратическая ошибка выборочных показателей) он считается не выходящим за границы нормы. В случае если отклонение выражается в снижении
уровня показателя на величину от 1G до 2G от М (где G - среднее квадратическое отклонение), то данный результат трактуется как подавление или глубокое
подавление показателя.
Необходимо подчеркнуть, заключение обязательно должно учитывать данные анкетного опроса и клинические проявление иммунодефицитного состояния.
64
Изложенный подход к оценке иммунного статуса хорошо зарекомендовал
себя в повседневной клинической и научной практике и далеко не исчерпал своих возможностей и будет широко использоваться в видимой перспективе.
Необходимо отметить, что в настоящее время начата активная разработка
нового, патогенетического принципа оценки иммунной системы человека (Ковальчук Л.В.,Чередеев А.Н., 1990, 1995), основанного на оценке основных этапов функционирования компонентов иммунной системы, а именно, способности
к активации, пролиферации, дифференциации и регуляции. Авторами предлагается иной перечень тестов оценки иммунного статуса включающий как приведенные нами методы, так и ряд совершенно новых методик. Это:
1. Распознавание - оценка Т-клеточного рецептора (ТКР), предоставления
антигена, адгезивных молекул (интегрины и др.),смешанная культура лимфоцитов, генный анализ аллотипов HLA, ТКР.
2. Активация - фенотипирование маркеров активации (CD25, CD71, HLADRb и др.) при стимуляции фитогемагглютинином, атнтителами к ТКР, CD2 и
т.д., выявление вторичных месенжеров (цАМФ, цАТФ, протеинкиназы и др.),
отвечаемость на цитокины.
3. Пролиферация - бласттрансформация на митогены, специфические антигены, ответы на факторы роста клеток.
4. Дифференциация (эффекторная функция) - продукция иммуноглобулинов,
цитотоксическая функция Т-клеток (CD8+), нормальных киллеров, продукция
цитокинов.
5. Регуляция - оценка хелперных и супрессорных функций лимфоидных клеток, анализ функциональных свойств Т-хелперов 1-го и 2-го типов и продуцируемых ими цитокинов, регуляторных свойств моноцитов.
Данный набор методов позволит подойти к более точному пониманию роли
отдельных клеточных элементов иммунной системы человека при иммунопатологии. Однако из-за высокой стоимости и сложности выполнения этот комплекс
пока не вышел за пределы стен специализированных институтов и соответственно не апробирован в широкой клинической практике. Только накопление
фактических данных позволит подтвердить эффектвность этого подхода.
13. Иммунный статус - биологический критерий
адаптационной компоненты здоровья
Весьма важным источником информации о состоянии адаптационных резервов организма является исследование иммунной системы. Она обладает структурно-функциональными атрибутивными признаками и значением для организма, как и все остальные системы. Ее функция сводится к охране генетически детерминированной внутренней среды организма. В связи с этим начальные признаки нарушения структуры и функции этой системы могут служить хорошим
индикатором развития преморбитных состояний и инструментом донозологической диагностики.
65
Выявление ранних нарушений в организме человека, обусловленных действием неблагоприятных факторов внешней среды, имеет особое значение с точки
зрения проведения комплексных мероприятий профилактического характера.
Полноценность защиты организма от вредных факторов окружающей среды
во многом зависит от состояния неспецифической резистентности организма.
Сравнение отдельных факторов неспецифической резистентности демонстрирует их разную чувствительность к действию неблагоприятных факторов окружающей среды (наиболее чувствительны фагоцитоз, лизоцим). Изменения состояния неспецифической резистентности не исчерпывает всех возможностей
организма, важная роль в реализации этих функций принадлежит иммунной системе. Развитие иммунопатологии в организме обусловлено нарушением механизмов защиты (при повреждении тканей включаются иммунные механизмы,
элиминирующие чужеродный организму материал и контролирующие процессы
восстановления клеточного гомеостаза). От степени повреждения иммунитета, в
результате воздействия вредных факторов окружающей среды, может зависеть
здоровье последующих поколений. Исследования последних лет убедительно
показали, что иммунная система обладает высокой чувствительностью ко многим химическим соединениям, радиоактивным веществам, а также экстремальным факторам физической природы.
Характерной особенностью иммунной системы является неодинаковая чувствительность отдельных ее звеньев к одному и тому же фактору. Эти различия
обусловлены высокой структурно-метаболической гетерогенностью иммунной
системы, а также значительной сложностью сетевых взаимодействий отдельных
ее компонентов. В целом иммунная система является критической мишенью для
большого числа экстремальных факторов, причем ее чувствительность в ряде
случаев позволяет констатировать наличие определенных патологических реакций организма, тогда как другими методами эти реакции выявить не удается.
Данное обстоятельство позволяет использовать иммунологические методы для
донозологической диагностики, прогнозирования отдаленных последствий воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды.
Целью донозологического мониторинга иммунной системы является определение направленности иммунопатологического процесса, что предполагает
определенный алгоритм и логику исследований, связанных с высокой
вариабельностью показателей, зависящих от циркадных ритмов, возрастных,
физиологических и других факторов. В процессе мониторинга предполагается
создание иммунограмм, позволяющих выявить у обследуемых формирование
иммунопатологического состояния на ранней стадии патологического процесса.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время раннее распознавание симптомов болезни с целью дальнейшей ее профилактики и иммунокоррекции является чрезвычайно актуальной
проблемой.
66
Развитие иммунологических исследований целесообразно осуществлять на
базе специализированной иммунологической службы. Диагноз должен основываться на конкретных данных показателях иммунологического обследования
человека. В этом случае большую значимость имеет изучение иммунологических параметров в динамике наблюдения: проведение иммунологического мониторинга, ибо в каждом конкретном случае могут быть получены индивидуальные отклонения от общепринятых норм для данной возрастной группы лиц определенной национальности, при этом необходимо помнить об едином общем
требовании: полноценной оценки состояния всех звеньев иммунной системы Ти
В-звена, показателей неспецифической резистентности.
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТРАТУРЫ
1. Петров Р.В. Я или не я: иммунологические мобили. М., 1983.
2. Петров Р.В. Иммунология. М., 1986.
3. Ройт А. Основы иммунологии. М., 1991.
4. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фришера. М., 1987.
5. Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Л. Йегера: В 3 т. М., 1986.
6. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред.
В.В. Меньшикова. М., 1987.
7. Лебедев К.А. Иммунограмма в клинической практике. М., 1990.
8. Федосеева В.Н. и др. Руководство по иммунологическим и аллергическим методам. М., 1993.
9. Фрейдлин И.С. Иммунотропные препараты: Учеб. пособие. Л., 1989.
10. Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е. Иммунология и иммунопатология детского возраста. М., 1996.
11. Пол У. Иммунология инфекционного процесса. М., 1994.
12. Краснов М.В., Ботвиньева В.В. Иммунологическая реактивность детей. Чебоксары, 1993.
13. Пухлик Б.М. Руководство по практической иммунодиагностике и иммунотерапии. Винница, 1992.
14. Дранник Г.М. Иммунотропные препараты. Киев, 1994.
15. Дреслер К. Иммунология: Словарь. Киев, 1988.
16. Петров Р.В., Лозовой В.П. Проблемы и перспективы современной иммунологии.
Новосибирск, 1988.
17. Петров Р.В., Орадовская И.В. Эпидемиология иммунодефицитов. М., 1988.
18. Фрейдлин И.С., Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии. М., 1993.
19. Фрейдлин И.С. От иммунорегуляции к иммунокоррекции. СПб., 1995.
20. Титова Н.Г. Иммунный ответ лимфоцитов // Вестн. РАМН. 1996. № 5.
67
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1
Нормативные значения содержания основных субпопуляций лимфоцитов
в переферической крови для жителей Калининградской области
(по данным кафедры охраны здоровья КГУ)
Маркеры Т-лимфоцитов
1. CD3+
2. CD4+
3. CD8+
4. CD16+
5. CD4+/CD8+
6. CD72+
68
Содержание в % (M+m)
45,3 + 1,6
20,2 + 1,2
14,7 + 0,9
9,1 + 0,8
1,4 + 0,13
6,1 + 0,52
Приложение 2
Средние величины иммунологических показателей у здоровых людей
(по данным НИЛ иммунологии ВМеДА)
Показатели
Т-лимфоциты (Е-РОК)
Т-лимфоциты (ОКТ3)
Активные Т-лимфоциты (Еа-РОК)
Т-хелперы (ОКТ4)
Т-супрессоры (ОКТ8)
ОКТ4/ОКТ8
РБТЛ на ФГА
РБТЛ на Кон А
РТМЛ на ФГА
РТМЛ на Кон А
В-лимфоциты (ЕАС-РОК)
В-лимфоциты (ЕМ-РОК)
В-лимфоциты (Ig+)
В-лимфоциты (IgM+)
В-лимфоциты (IgG+)
В-лимфоциты (IgA+)
Ig M
Ig G
Ig A
НСТ-тест (базальный)
НСТ-тест (стимулированный)
ЛКТ-тест
Активность сукцинатдегидрогеназы
лимфоцитов
Активность альфаглицерофосфатдегидрогеназы в лимфоцитах
С3-компонент комплемента
Циркулирующие иммунные комплексы
Единицы
измерения
%
млрд/л
%
млрд/л
%
млрд/л
%
млрд/л
%
млрд/л
%
%
%
%
%
млрд/л
%
млрд/л
%
млрд/л
%
млрд/л
%
млрд/л
%
млрд/л
г/л
г/л
г/л
у.е.
у.е.
у.е.
гранул
Значения величин
(X + m)
пределы колебаний
56.5 + 1.7
40 - 67
1.05 + 0.05
0.7 - 1.4
55.6 + 1.7
41 - 70
1.07 + 0.08
0.7 - 1.4
30.8 + 1.1
22 - 39
0.59 + 0.04
0.4 - 0.8
35.3 + 2.7
23 - 48
0.65 + 0.05
0.4 - 0.8
21.3 + 0.9
17 - 25
0.41 + 0.03
0.3 - 0.5
1.64 + 0.12
1.1 - 2.2
58.3 + 1.9
44 - 72
59.1 + 1.7
40 - 75
40.5 + 1.8
20 - 60
59.1 + 1.7
40 - 75
25.0 + 1.2
15 - 35
0.53 + 0.04
0.3 - 0.7
10.6 + 1.2
5 - 16
0.21 + 0.03
0.16 - 1.26
13.8 + 1.2
8 - 19
0.28 + 0.02
0.19 - 0.38
6.4 + 0.70.12
3 - 10
+ 0.01
0.07 - 0.017
4.1 + 0.5
2-6
0.08 + 0.008
0.04 - 0.11
2.2 + 0.2
1-3
0.04 + 0.004
0.02 - 0.06
1.15 + 0.06
0.65 - 1.65
11.5 + 0.5
7.5 - 15.5
1.9 + 0.08
1.25 - 2.5
0.10 + 0.001
0.05 - 0.15
1.15 + 0.09
0.5 - 1.5
1.57 + 0.11
1.3 - 1.8
12.91 + 0.74
8 - 20
гранул
10.10 + 0.57
7 - 18
гранул
у.е.
0.84 + 0.02
94 + 0.9
0.6 - 1.10
90 - 95
69
Приложение 3
Возможные причины изменения некоторых показателей иммунограммы
ФАЛ,
НСТ-тест
Лейкоциты,
Нейтрофилы
Лимфоциты
БАС
Титр г/га
Титр комплемента
ИГА
ИГМ
ИГG
Т-лимфоциты
В-лимфоциты
+ острые бактериальные инфекции
- первичные ИД, хронические, аутоиммунные процессы
+ инфекции, воспалительные заболевания, миэлолейкозы, хирургические вмешательства, отторжение трансплантанта, кровопотери, ожоги, роды, острая лучевая болезнь, кома
- сепсис, авитаминозы, голодание, аутоиммунные лейкопении,
лейкопенический лейкоз
+ инволюция инфекций, эпид. паротит, коклюш, лимфобластоз,
хроническая лучевая болезнь
- острая лучевая болезнь, СПИД, лейкопенический лимфолейкоз, хронические инфекции
- аллергии, инфекции, аутоиммунные, иммунодефициты
- иммунодефициты, онкопатология
+ острые пневмонии, аутоиммунные, саркоидоз
- хронические заболевания, нагноения, бронхиальная астма, туберкулез, опухоли
+ инфекции, воспаление, саркоидоз, АБА, аутоиммунные ХНЗЛ,
первичные ИД
+ БА, инфекции, воспалительные, острые аутоиммунные
- ИД
+ аллергии, аутоиммунные, ИД при несост. Тх ИД
+ лимфопролиферативные
- гнойные, хронические инфекции, ИД, АЗ, опухоли, туберкулез,
начало инфекций, стресс, травма, ожоги, кровоизлияния, инфаркт, некоторые ИД
+ вирусные инфекции, затяжные воспаления, первичные ИД,
(синдром Незелофа, швейцарский тип)
- ИД, опухоли
Примечание: + означает увеличение, - снижение показателя.
70
Приложение 4
Синдромы нарушения иммунитета
Синдромы
Вариант нормы
Снижение естественной
резистентности
Снижение показателей
В-звенв лимфоцитов
Снижение показателей
Т-звена лимфоцитов
Иммунорегуляторные
нарушения
Признаки аллергии
Признаки аутоаллергии
Нарушения функции
лимфоцитов
Комбинированные нарушения
Показатели иммунограммы
Колебания показателей иммунограммы в пределах 10-15%
Понижение уровня лейкоцитов, БАС, ФАЛ, НСТ, титра
комплемента
Понижение уровня Вл, иммуноглобулинов основных классов, титра гетерофильных агглютининов
Понижение уровня Тл, Т-хелперов и Т-супрессоров (Е-РОК,
теофиллин-резистентных и чувствительных лимфоцитов)
Диссоциация показателей Тл:Вл (<3>4) и Тх:Тс (<1>3)
Снижение Тл, повышение Вл, Тх:Тс >3, уровень ИГЕ >175
МЕ, положительные тесты ГНТ или ГЧЗТ
Снижение Тл, ФАЛ, рост ЦИК, Тх:Тс >3, положительные
тесты ГНТ или ГЧЗТ с тканевыми антигенами
Снижение РБТЛ, ИМЛ с ФГА, другими антигенами
Сочетанные изменения с примерно равноценными дефектами
71
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение ................................................................................................................... 3
1. Главные принципы функционирования иммунной системы ............................. 3
2. Структура иммунной системы (центральные и периферические органы) ........ 5
3. Основные положения концепции об иммунологическом надзоре .................... 7
4. Механизмы, обеспечивающие надежность иммунной системы ........................ 8
5. Иммунитет ............................................................................................................ 9
6. Гуморальные факторы иммунной системы ...................................................... 10
7. Клеточные факторы иммунной реакции ........................................................... 13
8. Факторы неспецифической резистентности ..................................................... 18
9. Концептуальная модель организации и функционирования иммунной
системы ............................................................................................................... 19
10. Представление о цитокинах ............................................................................. 22
11. Общие представления об иммуномодулирующих препаратах ...................... 28
12. Методологические подходы к оценке иммунного статуса ............................ 38
Оценка состояния иммунной системы путем анкетного опроса ................... 41
Методы изучения иммунной системы ............................................................ 42
Выделение лимфоцитов ................................................................................... 42
Исследование клеточного иммунитета.
Определение дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов ................... 44
Реакция торможения миграции лейкоцитов ................................................... 46
Исследование гуморального иммунитета. Определение количества
В-лимфоцитов, имеющих поверхностные иммуноглобулиновые
рецепторы ......................................................................................................... 47
Количественное определение иммуноглобулинов методом
радиальной иммунодиффузии ......................................................................... 48
Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов
в сыворотке крови ............................................................................................ 50
Исследование функциональной активности фагоцитирующих клеток.
Выделение лейковзвеси ................................................................................... 51
Исследование фагоцитарной активности лейкоцитов крови ........................ 52
Постановка нитросинего тетразолиевого теста ............................................. 53
Методика определения интерферонового статуса человека ......................... 54
Методика определения интерлейкина-2 (ИЛ-2) ............................................. 59
Трактовка полученных результатов лабораторных исследований
иммунной системы .......................................................................................... 64
13. Иммунный статус - биологический критерий адаптационной
компоненты здоровья ...................................................................................... 65
Заключение ............................................................................................................. 66
Список рекомендуемой литературы ...................................................................... 67
Приложения ............................................................................................................ 68
72