006965 - 1 - Область техники Выделение специфических
реклама
006965 Область техники Выделение специфических молекул связывания (например, органических молекул) представляет собой центральную проблему в химии, биологии и фармацевтике. Для того, чтобы найти подходящего кандидата обычно приходится проводить скрининг миллионов соединений. Получение очень больших библиотек органических соединений обычно является трудоёмким. Кроме того, сложности, связанные с идентификацией специфических молекул связывания в пуле соединений-кандидатов, возрастают с увеличением размера химической библиотеки, подлежащей скринингу. Согласно данному изобретению предлагается использовать самособирающиеся библиотеки органических молекул (обычно образующие димеры, тримеры или тетрамеры), в которых органические молекулы связаны с олигонуклеотидом, который вызывает самосборку библиотеки и/или обеспечивает код, ассоциированный с каждым фрагментом связывания. Полученная библиотека может быть очень большой (так как она возникает путём комбинаторной сборки подбиблиотек меньшего размера). После захвата желательных соединений специфического связывания целевой мишенью «код связывания» может быть декодирован с применением ряда экспериментальных методик (например, гибридизацией на чипах ДНК или цепной реакцией модифицированной полимеразы (PCR) с последующим секвенированием). Уровень техники Выделение молекул специфического связывания (например, органических молекул) является основной проблемой в химии, биологии и фармацевтике. Например, огромное количество лекарственных веществ, одобренных U.S. Food and Drug Administration, являются молекулами для специфического связывания с биологическими мишенями, которые относятся к одной из следующих категорий: ферменты, рецепторы или ионные каналы. Специфическое связывание с биологической мишенью само по себе не является достаточным для превращения молекулы связывания в лекарство, так как широко известно, что поведение лекарства зависит и от других свойств соединений (таких как фармакокинетические свойства и стабильность). Однако, отделение специфических молекул связывания от релевантной биологической мишени обычно представляет собой исходную точку в процессе, который приводит к созданию нового лекарства (Drews J. Drag discovery: a historical perspective. Science (2000) 287: 1960-1964). Способность быстро генерировать молекулы для специфического связывания целевых биологических мишеней была бы очень ценной в различных химических и биологических областях. Например, специфическая нейтрализация конкретного эпитопа внутриклеточного белка может обеспечивать информацию о функциональной роли этого эпитопа (и, соответственно, этого белка). В принципе, применение моноклональных антител, специфических для данного эпитопа, может обеспечить информацию того же типа (Winter G., Griffiths A. D., Hawkins R. E., Hoogenboom H. R. Making antibodies by phase display technology. Annu. Rev. Irnmunol. (1994) 12: 433-455). Однако большинство антител нелегко проникает через клеточную мембрану и должно быть искусственно введено в целевую клетку. В принципе, внутриклеточные антитела могут также экспрессироваться в клетки мишени путём доставки генов в клеткимишени (например, путём трансфекции клеток при помощи ДНК, управляющей экспрессией антитела). В этом случае часто в молекуле антитела нет складок, так как восстанавливающая внутриклеточная среда не позволяет образоваться дисульфидным связям, которые часто вносят существенный вклад в стабильность антитела (Desiderio A., Franconi R., Lopez M., Villani М. Е., Viti F., Chiaraluce R., Consalvi V., Neri D., Benvenuto E. A semi-synthetic repertoire of intrinsically stable antibody fragments derived from a singleframework scaffold. J. Mol. Biol. (2001) 310: 603-615). Молекулы с высоким сродством к связыванию, склонные к химическим превращениям, могут являться ценной альтернативой антителам. В области химии и химических материалов не требующее усилий выделение специфических молекул связывания может быть полезным для различных целей, таких как генерирование биосенсоров, ускорение химических реакций, получение материалов с новыми свойствами, селективный захват/разделение/ иммобилизация молекул мишени. Генерирование больших наборов молекул (например, путём комбинаторного синтеза: Otto S., Furlan R. L., Sanders J. K. Dynamic combinatorial chemistry. Drug Discov. Today. (2002) 7: 117-125), используемых в оригинальных методах скрининга, считается основным путём выделения нужных связывающих молекул. Например, большинство крупных фармацевтических компаний имеет собственные химические библиотеки, которые изучаются на предмет идентификации ведущих соединений. Эти библиотеки могут содержать более одного миллиона членов и всё-таки в некоторых случаях не содержат связывающих соединений, представляющих интерес (Bohm H. J., Stahl M. Structure-based library design: molecular modeling merges with combinatorial chemistry. Current Option in Chemical Biology (2000) 4: 283-286). Скрининг библиотек, включающих миллионы соединений, может потребовать не только очень сложных методов, но также и сложной робототехники и инфраструктуры для хранения, скрининга и оценки членов библиотеки. Генерирование большого набора высокомолекулярных соединений (например, библиотек пептидов или белков) вместе с эффективными биологическими и/или биохимическими методами идентификации специфичности связывания (такими как фаговый дисплей (Winter, 1994) пептидов на плазмидах [Cull M. G., Miller J. F., Schatz P.] Screening for receptor ligands using large libraries of peptides linked to the С terminus of the lac repressor. Proc. Natl Acad. Sci. USA. (1992) 89: 1865-1869, дисплей рибосом: in vitro метод -1- 006965 селекции и оценки антител из библиотек J Immunol Methods (1999) 231: 119-135] yeast display [Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. (1997) 15: 553-557], периплазматическая экспрессия цитометрическим скринингом (PECS). Nat Biotechnol. (2001) 19: 537-542] ineractive colony filter screening [Giovannoni L., Viti F., Zardi L., Neri D. Isolation of antiangiogenesis antibodies from a large combinatorial repertoire by colony filter screening. Nucleic Acids Res. (2001) 29: E27] etc.) могут позволить выделить ценные полипептидные связывающие молекулы, такие как специфические моноклональные антитела, гормоны с улучшенными свойствами и новые ДНКсвязывающие белки. В противоположность обычным химическим библиотекам библиотеки белков, упомянутые выше, могут обеспечить эффективный скрининг 1-10 биллионов индивидуальных членов в процессе поиска специфичностей связывания. С одной стороны, генерирование библиотек генов (например, комбинаторным мутагенезисом генов антител; Winter, 1994; Viti F., Nilsson F., Demartis S., Huber A., Neri D. Design and use of phage display libraries for the selection of antibodies and enzymes. Methods Enzymol. (2000) 326: 480-505) может непрерывно трансформироваться в библиотеку белков с использованием подходящих систем экспрессии (например, бактерий, дрожжей, человеческих клеток). Далее, такие методы, как фаговый дисплей, приводят к образованию частиц, в которых фенотип (обычно связывающие свойства белка, проявленные на поверхности нитей фага) физически сочетается с соответствующим генотипом (то есть геном, кодирующим белок, проявленный на фаге) [Winter, 1994], что приводит к амплификации и идентификации связывающих членов библиотеки с нужной специфичностью связывания. Однако, в то время как биологические/биохимические методы выделения специфических связывающих биомакромолекул могут обеспечить очень полезные специфичности связывания, их пределы существенно ограничены наборами полипептидов или нуклеиновых кислот [Brody E. N., Gold L. Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J. Biotechnol. (2000) 74: 5-13]. Для некоторых областей применения большие биомакромолекулы (такие как белки или ДНК) не являются идеальными. Например, они часто не способны эффективно проникать в клеточную мембрану и могут подвергаться гидролитическому расщеплению in vivo. Пытаясь имитировать биологические/биохимические методы идентификации органических молекул с желаемыми связывающими свойствами вне химической библиотеки, Brenner и Lerner (Brenner S., Lerner R. A. Encoded combinatorial chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 5381-5383) предложили использовать закодированные химические библиотеки (ECL). Эти авторы предложили способ альтернативного параллельного комбинаторного синтеза для того, чтобы закодировать отдельные члены большой библиотеки химических веществ с уникальными нуклеотидными последовательностями. В частности, эти авторы обусловили условия комбинаторного синтеза полимерных химических соединений на твёрдом носителе (например, шариках), когда стадия комбинаторного синтеза сопровождается синтезом (на тех же шариках) последовательности ДНК, которая должна использоваться как «метка памяти» для химических реакций, осуществляемых на шариках. В обычных областях применения шарики с закодированной ДНК инкубируют с молекулой мишени (например, белка соответствующего назначения). После того, как шарики, меченные ДНК, содержащие полимерное химическое соединение, связываются с мишенью, можно амплифицировать генетическую метку методом репликации и использовать её для обогащения связанных молекул путём гибридизации с получением подраздела библиотеки. Природа полимерной химической структуры, связанной с рецептором, может быть декодирована путём секвенирования нуклеотидной метки. Метод ECL имеет преимущество, заключающееся во введении концепции «кодирования» конкретного полимерного химического соединения, синтезированного на шариках, с соответствующей олигонуклеотидной последовательностью, которая может быть «прочитана» и амплифицирована путём PCR. Однако метод ECL имеет ряд недостатков. Во-первых, необходимо знание общей химии, которое позволяет осуществить альтернативный синтез полимерных органических молекул (часто с различной реакционной способностью) и синтез ДНК на шарике. Во-вторых, синтез, поддержание и контроль качества больших библиотек (например, более одного миллиона индивидуальных членов) является сложной задачей. В действительности, полезность метода ECL ещё должна быть продемонстрирована на примерах. Из патента США 5573905 известна закодированная комбинаторная химическая библиотека, которая содержит множество бифункциональных молекул формулы А-В-С, где А - полимерный химический фрагмент, В - молекула линкера, соединяющего А и С, содержащая в цепи от 1 до примерно 20 атомов, и предпочтительно, представляющая собой средство для прикрепления к твёрдой подложке. «С» представляет собой идентификатор олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеотидов, которая идентифицирует структуру химического фрагмента. Прикрепление к твёрдой подложке особенно предпочтительно в случае постадийного синтеза химического соединения (полимер из звеньев X1-n) и олигонуклеотида (образованного из нуклеотидов Z1-n, которые кодируют и идентифицируют структуру химических звеньев полимера). Описаны также бифункциональные молекулы библиотеки и методы применения библиотеки для идентификации химических структур в составе библиотеки, которые связаны с биологически активными молекулами путём заданных реакций связывания. Применение кода «С» для идентификации полимера А и прикрепление кода «С» к полимеру А при помощи молекулы линкера В позволяет точно идентифицировать полимер, однако решение задачи, предложенное в патенте США 5573905 -2- 006965 (который в основном повторяет публикацию Brenner и Lerner, 1992) ограничено особым типом химического фрагмента. Тот факт, что для каждого члена химической библиотеки должен быть осуществлён индивидуальный синтез, считается другим недостатком. Сущность изобретения Целью данного изобретения является создание химического соединения, содержащего химический фрагмент любого вида, способный участвовать в реакции связывания с молекулой мишени (например, биологической мишени), и кроме того, содержащего олигонуклеотид или его функциональный аналог, причём нет необходимости индивидуально синтезировать химическое соединение, чтобы организовать химическую библиотеку. Эта цель согласно первому аспекту изобретения достигается комбинацией признаков (указанных в независимом пункте 1 формулы), определяющих химическое соединение, включающее химический фрагмент (р), способный к реакции связывания с молекулой-мишенью (например, биологической мишенью) и кроме того, включающее олигонуклеотид (b) или его функциональный аналог, которое характеризуется тем, что олигонуклеотид (b) или его функциональный аналог содержит, по меньшей мере, одну самособирающуюся последовательностью (b1), способную к реакции комбинации по меньшей мере с одной самособирающейся последовательностью (b1'), комплиментарного олигонуклеотида или его функционального аналога, связанного с другим химическим соединением, содержащим химический фрагмент (q). Согласно другому аспекту изобретения указанная цель достигается комбинацией признаков (указанных в независимом пункте 3 формулы), определяющих химическое соединение, включающее химический фрагмент (р), способный к реакции связывания с молекулой мишени (например, биологической мишени) и кроме того, включающее олигонуклеотид (b) или его функциональный аналог, который содержит кодирующую последовательность (b1) для идентификации химического фрагмента (р), и которое характеризуется тем, что химическое соединение дополнительно содержит по меньшей мере одну самособирающуюся часть (m), способную участвовать в реакции комбинации по меньшей мере с одной самособирающейся частью (m') молекулы другого химического соединения, включающего химический фрагмент (q). Другие аспекты и признаки настоящего изобретения будут понятны из дальнейшего описания. Данное изобретение основано на том, что по мнению его авторов ключевое значение для генерирования (и скрининга) очень больших химических библиотек может иметь «самосборка» закодированных молекул. В частности, показано, что самосборка (например, путём гомодимеризации, гетеродимеризации или мультимеризации) меченных при помощи ДНК химических соединений представляет простой способ генерирования очень больших меченных при помощи ДНК химических библиотек меньшего объёма. Например, самосборка (гетеродимеризация) двух библиотек, содержащих 1000 членов, обеспечивает образование 1 000 000 различных комбинаций, то есть 1 000 000 различных химических соединений. Соответственно, гомо- или гетеротримеризация закодированных библиотек, содержащих 1000 меченных при помощи ДНК членов, приведёт к получению библиотеки, содержащей 1 000 000 000 различных меченных ДНК комбинаций, то есть химических соединений. Таким образом, данное изобретение предусматривает химическое соединение, включающее химический фрагмент любого вида, способный к реакции связывания с молекулой мишени (например, биологической мишени), и кроме того, включающее олигонуклеотид или его функциональный аналог, которое может быть получено отдельно и затем участвует в реакции сочетания. Полученное химическое производное(-ые) олигонуклеотида может затем «собираться» с другими подобными соединениями с получением структур высшего порядка и закодированных библиотек соединений. Для целей иллюстрации один конкретный пример осуществления изобретения отражён на фиг. 1. Две химические библиотеки синтезируют путём химической модификации конца 3' и конца 5', соответственно, олигонуклеотидов, способных к образованию дуплексов и несущих отличительные «метки последовательностей» (ассоциированные с химическими фрагментами и, следовательно, кодирующие химический фрагмент, присоединённый к их концу). Полученная закодированная самособирающаяся химическая библиотека (ESACHEL) может быть очень большой (так как она образуется при комбинаторной самосборке двух библиотек меньшего размера) и может быть подвергнута скринингу для связывания с биологической мишенью (например, белком, представляющим интерес в фармацевтике). Члены библиотеки, которые обладают подходящей специфичностью связывания, могут быть захвачены мишенью, представляющей интерес (например, при использовании мишени иммобилизованной на твёрдой подложке). Их генетический код, кодирующий химическую часть молекулы, отвечающую за желаемую специфичность связывания, затем может быть извлечён с применением ряда подходящих методов, которые описаны в разделе «Описание изобретения» ниже. Термин «Специфический», употребляемый в описании, может использоваться в ситуации, когда один член специфической пары связывания не проявляет сколько-нибудь заметной тенденции к связыванию с молекулами, отличными от партнёра (-ов) по специфическому связыванию. В общем, специфичность связана со значительной разницей величин сродства к связыванию по отношению к «неспецифическим» мишеням. Этот термин применяется также там, где, например, член пары связывания является -3- 006965 специфическим для конкретной поверхности на молекуле мишени (называемой далее «эпитопом»), когда член пары специфического связывания с этой специфичностью будет способен к связыванию с различными молекулами-мишенями, несущими эпитоп. Описание фигур Фиг. 1: Пример осуществления метода ESACHEL: В случае простого метода получения ESACHEEL синтезируют две химические библиотеки путём индивидуальной химической модификации конца 3' и конца 5', соответственно, олигонуклеотидов, способных к частичному образованию гетеродуплексов, которые имеют отличительные «метки последовательностей» (ассоциированные с химическими фрагментами р и q, присоединёнными к их концам и, следовательно, кодирующие их). Полученная самосборкой закодированная химическая библиотека (ESACHEL) может быть очень большой (поскольку она образуется путём комбинаторной самосборки двух небольших библиотек) и может быть подвергнута скринингу для связывания с биологической мишенью (например, белком, представляющим интерес для фармацевтики). Эти члены библиотеки, проявляющие подходящие специфичности связывания, могут быть захвачены мишенью, представляющей интерес (например, при использовании мишени, иммобилизованной на твёрдой подложке). Их генетический код, кодирующий химический фрагмент, ответственный за нужную специфичность связывания, затем может быть извлечён при помощи простых методов. Фиг.2: Генерализация ESACHEL. Основными компонентами технологии ESACHEL являются химические соединения, содержащие олигонуклеотидный фрагмент (обычно ДНК-последовательность), связанный с олигомеризационным доменом (способным вызвать (гомо- или гетеро) димеризацию, тримеризацию или тетрамеризацию химических соединений), связанных с химической структурной единицей, которая может участвовать в реакции специфического связывания с молекулой мишени. Часть последовательности олигонуклеотидного фрагмента соединена исключительно с химической структурной единицей (действуя как «код»). Олигомеризационный домен и код могут быть различными частями одной и той же молекулы (обычно олигонуклеотида). Фиг. 3: Самосборка индивидуальных химических соединений ESACHEL может приводить к образованию комбинаторных библиотек большого размера. При практическом осуществлении метода ESACHEL количество n различных химических соединений, содержащих реакционноспособную по отношению к тиолу группу (например, малеимидо- или иодацетамидогруппу), реагируют (по раздельным реакциям) с n различными ДНК-олигонуклеотидов, содержащих тиольную группу на конце 3'. Соответствующий пул n конъюгатов показан на фигуре как «пул А». Подобным образом количество m различных химических соединений, содержащих реакционноспособную по отношению к тиолу группу (например, малеимидо- или иодацетамидогруппу), реагируют (по раздельным реакциям) с m различных ДНК-олигонуклеотидов, содержащих тиольную группу на конце 5'. Соответствующий пул m конъюгатов показан на этой фигуре как «пул В». Полученная самосборкой библиотека будет содержать m x n комбинаций. Фиг. 4: Библиотеки большого размера могут быть получены по методу ESACHEL, когда тримеризационные домены или тетрамеризационные домены представляют собой ДНК-последовательности, образующие триплексы или квадруплексы. Известно, что некоторые ДНК-последовательности способны образовывать стабильные гримерные комплексы или стабильные тетрамерные комплексы. Например, конъюгация по Hoogsten ДНКтриплексов приведёт к самосборке пулов А х В х С, содержащих n, m и I членов, соответственно. Тетрамерная сборка ДНК-(химический фрагмент) конъюгатов позволяет получить библиотеки ещё большего размера, исходя из подбиблиотек А, В, С и D меньшего размера. Фиг. 5: Один метод декодирования ESACHEL. Олигонуклеотиды подбиблиотеки А содержат химические структурные единицы на конце 3'. ДНКпоследовательность в направлении 3' предназначена для гибридизации с последовательностями ДНК на конце 5' олигонуклеотидов подбиблиотеки В. Участок гибридизации прерывается небольшим сегментом. В подбиблиотеке А этот небольшой сегмент обычно состоит из цепи фосфодиэфира без оснований (на конце d-спейсер на фигуре); в подбиблиотеке В соответствующий короткий сегмент имеет уникальную последовательность для каждого члена подбиблиотеки (действует как «код» для подбиблиотеки В). В противоположность этому, олигонуклеотиды подбиблиотеки А имеют отличительный код в направлении 5'. После биопэннинга олигонуклеотиды подбиблиотеки В остаются стабильно гибридизованными с олигонуклеотидами подбиблиотеки А и могут действовать как праймеры для полимеразной реакции ДНК на темплате А. Полученный сегмент ДНК, несущий и код А, и код В, может быть амплифицирован (обычно по PCR) с использованием праймеров, которые гибридизуются на постоянных концах сегмента ДНК. -4- 006965 Фиг. 6: Общий метод декодирования ESACHEL. Идентичность специфических связывающих веществ, выделенных из подбиблиотек А и В, содержащих химические фрагменты на концах частично гибридизованных олигонуклеотидов, устанавливается гибридизацией с олигонуклеотидами-мишенями, иммобилизованными на одном или нескольких чипах. Такие чипы изготавливают предпочтительно из силиконовых дисков с прикреплёнными олигонуклеотидными фрагментами. Например, чип А позволяет определить идентичность (и частоту) членов подбиблиотеки А, полученных после биопэннинга. Подобным образом чип В позволяет установить идентичность (и частоту) членов подбиблиотеки В. На первой стадии метод декодирования, отображённый на этой фигуре, не даёт информации о конъюгации кода А и кода В в членах специфического связывания. Однако декодирование на чипе А и В позволяет выявить возможные кандидаты из подбиблиотек А и В для повторной гибридизации и скрининга в последовательном цикле биопэнинга. Всё увеличивающееся связывание в строгих условиях с мишенью отражается в уменьшении числа членов А и В, идентифицированных на чипе. Наконец, возможные комбинации кандидатов А и кандидатов В собираются индивидуально (или в маленьких пулах) и анализируются на связывание с мишенью. Фиг. 7: Метод деконволюции ESACHEL на основе PCR. Подбиблиотеки А и В образуют гетеродуплекс, фланкированный уникальными последовательностями, кодирующими члены различных библиотек, и постоянными сегментами ДНК на концах. После биопэнинга подходящие пары праймеров позволяют осуществить PCR-амплификацию двух нитей, что приводит к образованию продуктов PCR, последовательность в которых может быть идентифицирована с применением стандартных методов (например, соединением в виде цепочки продуктов PCR с последующим субклонированием и секвенированием). Может быть применена процедура деконволюции (состоящая из одного или более циклов пэннинга с последующим секвенированием и выбором ограниченного набора компонентов подбиблиотек для скрининга следующей ESACHEL), что ограничивает число кандидатов - членов ESACHEL, способных выявить вещества для специфического связывания после самосборки. Фиг. 8: Превращение лигандов ESACHEL в ковалентно связанные химические фрагменты. В случае многих ESACHEL химические производные самособирающихся олигонуклеотидов выделяют в конце одного или нескольких циклов пэннинга. Для многих областей применения желательно осуществить ковалентное связывание химических фрагментов, отвечающих за взаимодействие с молекулой мишени, представляющей интерес. Длина, жёсткость, стереоэлектронные химические свойства и растворимость линкера влияют на сродство к связыванию и характеристики полученной молекулы. Фиг. 9: Химическое равновесие, способствующее хелитному эффекту. Диаграмма показывает возможные состояния взаимодействий между бидентатным лигандом (А-В), связывающимся с молекулой мишени. В состоянии nI оба фрагмента А и В связаны с соответствующими карманами связывания. В состоянии nII и nIII только фрагмент А или В, соответственно, связаны. В состоянии nIV соединение А-В отсоединено от мишени. Была написана компьютерная программа для приблизительной оценки вклада хелатного эффекта на время пребывания А-В на мишени в необратимых условиях диссоциации как функции констант кинетической ассоциации и диссоциации фрагментов А и В в направлении их соответствующих пакетов связывания и длины линкера между А и В. Возможность связывания одного фрагмента с мишенью в единицу времени обозначена как «pon». Фиг. 10: Сборка молекулы «р» с молекулярным набором «Q». Диаграмма показывает образование гетеродуплекса между олигонуклеотидом, соединённым со связывающим веществом р с низким сродством, и вторым классом олигонуклеотидов, которые содержат химические фрагменты q и отличительные коды, способные к идентификации молекул q, которые действуют совместно с р при связывании с молекулой мишени (например, белковой мишени). Раскрытие изобретения Основными компонентами метода создания ESACHEL являются химические соединения, содержащие олигонуклеотидный фрагмент (обычно ДНК-последовательность), связанный с олигомеризационным доменом (способным вызвать (гомо- или гетеро-) димеризацию, тримеризацию или тетрамеризацию химических соединений), связанным с химическим фрагментом, который может быть вовлечён в реакцию специфического взаимодействия с молекулой мишени (фиг. 2). Часть последовательности олигонуклеотидного фрагмента связана только с химическим фрагментом (действую как «код»). Во многих случаях части одного и того же олигонуклеотида будут служить как олигомеризационный домен и код. Олигонуклеотидный фрагмент Природу и строение олигонуклеотидных фрагментов при получении ESACHEL легче понять при описании «кодирующей системы», описанной ниже и в примерах. Для начала достаточно сказать, что путём стабильной ассоциации химических структур с уникальной олигонуклеотидной последовательностью (например, ДНК-последовательностью или аналогами ДНК) обеспечивается эта химическая структура с уникальным кодом, который может быть «прочитан» различными способами (секвенированием, гибридизацией с чипами ДНК и т.д.) и которая может быть подвергнута амплификации (например, при применении полимеразной цепной реакции [PCR]). Далее, используя методы, описанные ниже, код одно-5- 006965 го конкретного химического соединения может стать физически связанным с кодом другого химического соединения (соединений), когда эти химические соединения связаны посредством олигомеризационного домена. Олигомеризационные домены Подходящие ДНК-последовательности (способные к образованию гетеродуплекса, триплекса [Strobel S. A., Dervan P. В. Single-site enzymatic cleavage of yeast genomic DNA mediated by triple helix formation. Nature (1991) 350: 172-174] или квадруплекса [Various authors. Issue of Biopolymers (2000-2001), volume 56(3)] могут рассматриваться как возможные олигомеризационные домены. Кроме того, можно рассмотреть применение других самособирающихся полипептидов (например, амфипатические пептидные спирали, такие как «застёжки-молнии» лейцина). Многие химические фрагменты можно рассматривать как медиаторы химических олигомерных фрагментов. Например, могут быть предусмотрены комплексы атомов металла с подходящими лигандами (такими как производные с дипиридильными или трипиридильными группами). Далее, можно представить, что нековалентное взаимодействие может объединить различные химические соединения, которые затем могут реагировать друг с другом и становиться ковалентно связанными. Некоторые практические аспекты метода ESACHEL Для того, чтобы проиллюстрировать один возможный аспект метода ESACHEL, рассмотрим следующий пример (отражённый на фиг. 3). n различных химических соединений, содержащих реакционноспособную группу (например, реакционноспособную по отношению к тиолу малеимидо- или иодацетамидо-группу) реагируют (по отдельным реакциям) с n различных ДНК-олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособный фрагмент (например, тиольную группу в положении 3'). Соответствующий пул n конъюгатов обозначен на фиг. 3 как «пул А». Олигонуклеотиды пула А построены так, чтобы они имели одну часть ДНК-последовательности, которая может гибридизоваться с соединениями пула В (см. фиг. 3 и надписи внизу), отличительную ДНК-последовательность для каждого из n членов пула А, дополнительные части ДНК-последовательности, предназначенные для «декодирования» комбинаций связывания (возможного; см. ниже в разделе «Декодирование» и в примерах). Подобно, количество m различных химических соединений, содержащих реакционноспособные по отношению к тиолу группы (например, малеимидо- или иодацетамидогруппы) реагируют (по отдельным реакциям) с m различных ДНК-олигонуклеотидов, содержащих тиольную группу в положении 5'. Соответствующий пул m конъюгатов обозначен на рассматриваемой фигуре как «пул В». Олигонуклеотиды пула В должны иметь одну часть последовательности ДНК, которая может гибридизоваться с соединениями пула А (см. фиг. 3), отличительную ДНК-последовательность для каждого из m членов пула В, дополнительные части ДНК-последовательности, предназначенные для «декодирования» комбинаций связывания (возможно). Частично комплиментарные нити ДНК-конъюгатов пула А и пула В могут легко подвергаться гетеродимеризации в растворе со сравнительной эффективностью для различных n членов пула А и m членов пула В. Если применяют подходящие стехиометрические отношения соединений пула А и пула В, n различных типов соединений пула А будут вступать в реакцию гетеродимеризации с m различных типов соединений пула В, что приводит к получению комбинаторной полученной самосборкой химической библиотеки размером m x n. Например, две библиотеки тысяч соединений приведут к получению миллионов различных комбинаций. Далее, полученные самосборкой комбинации m x n, будут нести уникальные ДНК-коды, соответствующие нековалентной, но стабильной ассоциации (гетеродимеризации) ДНК-кода члена пула А с ДНК-кодом члена пула В. В качестве альтернативы спаривания химических структурных единиц с олигонуклеотидами, содержащими тиольные группы, может быть рассмотрен ряд стандартных химических альтернатив (например, олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфирную связь на одном конце, образующие химические структуры, такие как -OP(O)2-O-(CH2)n-NH-CO-R, где R может соответствовать числу различных химических структур и n находится в интервале от 1 до 10). Предположим, что один конкретный член библиотеки способен к специфическому связыванию с мишенью, представляющей интерес (например, белком, иммобилизованным на шарике). Предположим также, что обе нити А и В способствовали реакции специфического связывания (обсуждение хелатного эффекта, который может способствовать этому специфическому связыванию, см. ниже). Можно предпочтительно обогатить эту конкретную комбинацию А и В, превысив m x n комбинацией (например, подвергая библиотеку действию белка-мишени на шарике с последующим удалением шарика из библиотеки с последующей промывкой шарика для уменьшения количества неспецифических связывающих веществ на шарике). Специалистам в данной области будет очевидной аналогия этой процедуры методам биопэннинга, используемым в фаговых библиотеках антител (Viti, 2000). Получение конкретной комбинации А и В, проявляющей желательную специфичность связывания, может сопровождаться идентификацией химических структурных единиц, ответственных за связывание, -6- 006965 идентификацией ДНК-кодов двух нитей А и В (см. ниже раздел «Декодирование для обсуждения возможной стратегии при идентификации ДНК-кодов»). Для ряда областей применения в конце процедуры получения ESACHEL может быть желательным связать две химические структурные единицы А и В, ответственные за специфическое связывание с мишенью (фиг. 3). Может быть желательно попробовать ряд различных химических линкеров и оценить, проявляют ли полученные химические соединения, полученные из химических структур А и В, нужные молекулярные свойства (например, высокое сродство к мишени, высокую специфичность к мишени, подходящую химическую стабильность, подходящую растворимость, подходящие фармакологические свойства и т.д.). Например, длина химического линкера между А и В сильно влияет на связывающие свойства конъюгата (обсуждение см. ниже раздел о хелатном эффекте). На фиг. 3 часть ДНК используется как домен гетеродимеризации, и образование тиоэфирной связи используется для спаривания ДНК-олигонуклеотидов с химическими компонентами библиотеки. Однако можно иметь в виду другие олигомеризационные домены, а также другие химические структуры для спаривания с ДНК. Известно, что некоторые ДНК-последовательности способны к образованию стабильных тримерных комплексов [Strobel, 1991] или стабильных тетрамерных комплексов [различные авторы, 2000-2001]. Например, спаривание ДНК-триплексов по Hoogsten приведёт к самосборке пулов А х В х С, содержащих n, m и I членов, соответственно (фиг. 4). Тетрамерная сборка ДНК-(химический фрагмент) конъюгатов позволит получить библиотеки даже большего размера, исходя из подбиблиотек А, В, С и D меньшего размера. Однако декодирование реакций связывания в некоторых случаях может быть более трудным для тримерных и/или тетрамерных полученных самосборкой закодированных библиотек по сравнению с димерными библиотеками. Далее, длина и гибкость линкеров между нитями ДНК и химическими фрагментами, расположенными на их концах, может или облегчить, или воспрепятствовать идентификации членов специфического связывания полученной самосборкой химической библиотеки (ESACHEL). Некоторая степень гибкости может позволить подходящим химическим фрагментам найти комплиментарные карманы на молекуле мишени (фиг. 4). С другой стороны, ожидается, что влияние сродства на хелатный эффект уменьшит длину линкера. Заслуживает упоминания то, что при использовании подбиблиотек из 100 членов тримерные библиотеки ESACHEL будут содержать 106 членов, а тетрамерные библиотеки ESACHEL будут содержать 108 членов. Легко вычислить размер получающейся библиотеки, исходя из подбиблиотек различных размеров. Большая комбинаторная сложность закодированных полученных самосборкой химических соединений позволяет идентифицировать члены специфического связывания, которые до сих пор не могли идентифицировать, используя обычные комбинаторные химические методы. Можно провести аналогию с фаговой технологией антител, где было показано, что размер библиотеки играет ключевую роль при выделении антител с высоким сродством. Коды ESACHEL и методы декодирования При создании ESACHEL уникальные олигонуклеидные последовательности (обычно ДНКпоследовательности) позволяют получить химические структуры с уникальным кодом. Сколько различных последовательностей нужно для идентификации членов библиотеки? Как упомянуто выше, ключевыми компонентами методики ESACHEL являются химические соединения, содержащие олигонуклеидный фрагмент (обычно ДНК-последовательность), связанный с олигомеризационным доменом, в свою очередь связанным с химической структурой. В большинстве случаев олигонуклеидный фрагмент также обеспечивает образование олигомеризационных доменов. Как следствие, в большинстве случаев компоненты ESACHEL представляют собой химические структуры, спаренные с предварительно выбранными ДНК-олигонуклеотидами. Обычно такие олигонуклеотиды содержат постоянную часть и изменяющуюся часть (уникальная характеристика каждого члена библиотеки). Рассмотрим как пример случай, отражённый на фиг. 3 и обсуждённый в разделе «Некоторые практические аспекты методики ESACHEL» (см. выше). В этом примере подбиблиотека «А» (содержащая n соединений, присоединённых в положении 3' ДНК-олигонуклеотидов) собирается с подбиблиотекой «В» (содержащей m соединений, присоединённых в положении 5' олигонуклеотидов). Подбиблиотека А может быть представлена ДНК-последовательностью х оснований, где 4х больше или равно n. Подбиблиотека В может быть представлена ДНК-последовательностью у оснований, где 4y больше или равно m. В большинстве случаев (см. ниже) идентификация кода членов подбиблиотеки даёт также информацию о том, к какой подбиблиотеке относится конкретный код (и следовательно, к какому конкретному соединению). Существуют многие методы «декодирования» кодов ESACHEL. Ниже мы рассмотрим три метода, которые соответствуют различным условиям эксперимента и демонстрируют гибкость методики ESACHEL. Для простоты рассмотрим вариант ESACHEL, показанный на фиг. 3. Подходящий дизайн олигонуклеотидов, на котором основываются подбиблиотеки А и В, отражены на фиг. 5. Олигонуклеотиды подбиблиотеки А содержат химические фрагменты в положении 3'. ДНК-последовательность в направлении 3' предназначена для гибридизации в ДНК-последовательностями в положении 5' олигонуклеоти-7- 006965 дов подбиблиотеки В. Участок гибридизации прерывается сегментом небольшого размера. В подбиблиотеке А этот небольшой сегмент обычно содержит фосфодиэфирную цепь без оснований (d-спейсер на фигуре); в подбиблиотеке В соответствующий короткий сегмент содержит уникальную последовательность для каждого члена подбиблиотеки (действующий, следовательно, как «код» для подбиблиотеки В). В противоположность этому, олигонуклеотиды подбиблиотеки А содержат их отличительный код в направлении 5'. Если в конце биопэннинга выделяют несколько членов специфического связывания, получается несколько продуктов PCR (полимеразный цепной реакции) по способу, показанному на фиг. 5. Эти продукты будут иметь сходные последовательности за исключением участков, кодирующих члены подбиблиотек А и В. Для того, чтобы узнать больше об относительном множестве различных членов специфического связывания, можно создать конкатемеры на основе различных продуктов PCR в реакционной смеси. Такие конкатемерные последовательности можно «прочитать» путём секвенирования, выявляя и идентичность, и частоту пар кода А и кода В (что отвечает только конкретным членам библиотеки). Альтернативная стратегия декодирования отражена на фиг. 6. Подбиблиотеки А и В содержат химические фрагменты на концах частично гибридизованных олигонуклеотидов. В большинстве случаев часть ДНК, образующая гетеродуплекс, в библиотеке будет постоянной. В противоположность этому можно сконструировать другие концы, которые затрудняют образование гетеродуплекса. Такие не спаренные нити ДНК становятся доступными для гибридизации с олигонуклеотидами-мишенями (например, ДНК-олигонуклеотидами, иммобилизованными на одном или нескольких чипах). Например, чип А позволяет читать идентичность (и частоту) членов подбиблиотеки А, полученных после биопэннинга. Подобным образом, чип В позволяет проводить чтение идентичности (и частоты) членов подбиблиотеки В. Можно применить различные стратегии (например, радиометку ДНК, биотинилирование ДНК с последующим детектированием при помощи реагентов на основе стрептавидина и т.д.) для визуализации реакции связывания на чипе. На первой стадии метод декодирования, отражённый на фиг. 6, не даёт информации о спаривании кода А и кода В среди членов специфического связывания. Однако, декодирование на чипах А и В даёт возможность определить кандидаты-компоненты подбиблиотек А и В для повторной гибридизации и скрининга в последовательных циклах биопэннинга. Связывание во всё более строгих условиях с мишенью отражается в непрерывном уменьшении числа членов А и В, идентифицированных на чипе. Наконец, возможные комбинации кандидатов - членов в А и В, собираются в отдельности (или маленькими пулами) и анализируются на связывание с мишенью. Этот метод мы называет деконволюцией. Очевидно, что метод декодирования, отражённый на фиг. 6, применим также для ESACHEL, когда библиотеки самосбираются с образованием тримерных или тетрамерных комплексов (например, используя ДНК-триплексы или квадруплексы для олигомеризации соединений). В этих случаях можно использовать три или четыре чипа, соответственно, которые содержат отличительные олигонуклеотиды мишени для декодирования. Если это желательно, ДНК выбранных фрагментов связывания на фиг. 6 может быть амплифицирована при помощи PCR до гибридизации на чипе. В этом случае дизайн олигонуклеотида будет напоминать дизайн, описанный в следующем параграфе (см. также фиг. 7). Ещё один возможный метод декодирования показан на фиг. 7. Подбиблиотеки А и В образуют гетеродуплекс, фланкированный уникальными последовательностями, кодирующими различные члены библиотек, и постоянными сегментами ДНК на концах. После биопэннинга подходящие пары праймеров позволяют осуществить амплификацию двух нитей при помощи PCR с получением продуктов PCR, последовательность которых может быть идентифицирована стандартными методами (например, конкатенированием продуктов PCR с последующим субклонированием и секвенированием). Подобно методу, основанному на применении чипов и показанному на фиг. 6, метод на фиг. 7 в общем не даёт непосредственной информации о спаривании кода А и кода В в членах пары специфического связывания. Однако (подобно описанному на фиг. 6) может быть применён метод деконволюции (состоит из одного или нескольких циклов пэннинга с последующим секвенированием и выбором ограниченного набора компонентов подбиблиотек для скрининга следующей ESACHEL), ограничивающий число членов ESACHELкандидатов, способных после самосборки образовывать соединения для специфического связывания. Конструирование библиотек Конструирование библиотеки ESACHEL облегчается не только за счёт большого размера, который может быть достигнут самосборкой подбиблиотек, но также за счёт более лёгкого генерирования и простой очистки химических производных ДНК-олигонуклеотидов. Как упомянуто выше, ДНК-олигонуклеотиды, содержащие тиольную группу в положениях 3' и 5', могут быть приобретены у ряда производителей. Химия модификации тиольных групп реагентами, содержащими реакционноспособные группы, такие как иодацетамидная группа или малеимидная группа, хорошо разработана (см., например, каталог Probes на сайте www.probes.com). Далее из литературы известны несколько методов химической модификации 3'- и 5'-групп в ДНК-олигонуклеотидах, например, в процессе синтеза в твёрдой фазе. -8- 006965 Химические производные ДНК (или некоторые аналоги ДНК) имеют свойство быть отрицательно заряженными при нейтральном рН. Это облегчает развитие общей стратегии очистки ДНК-производных. Например, анионообменная хроматография позволяет осуществлять нековалентную (но стабильную) иммобилизацию ДНК-олигонуклеотидов (и их производных) на смоле, в то время как другие компоненты реакционных смесей могут быть удалены промывкой. ДНК-производные затем можно элюировать путём буферного обмена. Можно применять другие методы очистки (например, хроматографию в обращенной фазе, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, хроматографию на гидроксиапатите и т.д.). Доступность общепринятых методов очистки производных ДНК делает синтез компонентов ESACHEL легко поддающимся роботизации (например, с применением станции TECAN Genesys 200-based (TECAN, Mannedorf, Switzerland), снабжённый жидкостной системой и манипулятором-роботом). Роботизация может быть необходимой для создания подбиблиотек ESACHEL, содержащих несколько сотен различных соединений. Методики, описанные в данной заявке, применимы не только для маленьких органических молекул, но также для пептидов и олигомерных белков (например, фрагментов Fv антител, состоящих из доменов VH и VL; см. пример 1). Действительно, прикрепление ДНК-гетеродуплекса на С-конце меченных цистеином доменов VH и VL обеспечивает экстрастабилизацию гетеродимера Fv. Биопэннинг Применение ESACHEL для идентификации соединений для специфического связывания основано на инкубации компонентов ESACHEL вместе с молекулой мишени (например, белка, представляющего интерес для фармакологии), с последующим физическим отделением полученного комплекса от компонентов ESACHEL, которые не связаны с мишенью. В этом отношении этот биопэннинг аналогичен биопэннингу, который может быть осуществлён с фаговыми библиотеками и/или библиотеками рибосом, о которых имеется много сведений и протоколов в литературе [Winter, 1994; Viti, 2000; Schaffitzel, 1999]. Например, физическое отделение комплекса, образованного членами ESACHEL и молекулой мишени, от пула несвязанных членов ESACHEL может быть достигнуто путём иммобилизации молекулы мишени на твёрдой подложке (например, трубке из пластмассы, смоле, магнитных шариках и т.д.). Хелатный эффект Некоторые преимущества технологии ESACHEL при идентификации специфического связывания имеют отношение к химическому процессу, называемому «хелатным эффектом». Термин «хелат» впервые был применён в 1920 г сэром Гилбертом Т. Морганом и Н.Д. Дрю [J. Chem. Soc, 1920, 117, 1456], которые заявили: «Прилагательное «хелатный», образованное от слова «большая клешня» или «chela» (chely-греч.) лобстера или других ракообразных, предлагается для обозначения похожих на кронциркуль групп, которые функционируют как две связанные единицы и присоединены к центральному атому с образованием гетероциклических колец». Хелатный эффект может быть виден при сравнении реакции хелатного лиганда и иона металла с соответствующей реакцией с участием сравнимых монодентатных лигандов. Например, сравнение реакции связывания 2,2'-дипиридина с пиридином или 1,2-диаминоэтана (этилендиамина) с аммиаком. Уже много лет известно, что сравнение этого типа всегда показывает, что комплекс, полученный в результате координации с хелатирующим лигандом, является гораздо более стабильным с точки зрения термодинамики. Рассмотрим стадии диссоциации монодентатного лиганда по сравнению с мультидентатом (например, бидентатными лигандами). Когда монодентатная группа вытесняется, она теряется в массе раствора. С другой стороны, если один конец бидентатной группы вытесняется, другое «плечо» остаётся всё ещё присоединённым, и всё дело заключается во вращающемся плече и оно может быть снова присоединено (фиг. 8). В общем образование комплекса с бидентатными группами является более благоприятным, чем образование комплекса с соответствующими монодентатными группами. Было показано, что хелатный эффект способствует связыванию с высоким сродством не только в случае мультидентатных лигандов металлов, но и во многих других ситуациях в химии, включая реакции связывания с макромолекулами (например, мультидентатное ДНК-связывание, хелатирующие рекомбинантные антитела) [Neri D., Momo M., Prospero Т., Winter G., High-affinity antigen binding by chelating recombinant antibodies (CRAbs) J. Mol. Biol, (1995)246:367-73]. При проверке некоторых вариантов ESACHEL, например, тех, когда два химических соединения олигомеризуются посредством образования ДНК-гетеродуплекса, полезно проиллюстрировать хелатный эффект в контексте стабильности ДНК-гетеродуплекса, который связывает два химических соединения, участвующих в реакции специфического связывания с мишенью. В большинстве случаев будет удобно иметь гетеродуплексы (или триплексы, или квадруплексы), которые de facto не диссоциируют в условиях опыта, выбранных для биопэнинга ESACHEL. Полезную информацию и дискуссию об энергетике кооперативного связывания с короткими фрагментами ДНК-гетеродуплекса (8bp) можно найти в работе Distefano и Dervan, 1993 [Distefano M. D., Dervan P. В. Energetics of cooperative binding of oligonucleotides with discrete dimerization domains to DNA by triple helix formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993), 90: 1179-1183]. -9- 006965 Рассмотрение процедур, следующих за биопэнингом ESACHEL Что следует за опытами по созданию ESACHEL, когда члены пары специфического связывания определены? Для некоторых целей (например, некоторых биохимических экспериментов) можно использовать члены ESACHEL без дальнейших химических превращений. Например, может быть желательным измерить сродство к связыванию и кинетические константы связывания членов ESACHEL с молекулой мишени. Для многих областей применения, однако, может быть желательным превращение полученных самосборкой молекул ESACHEL в аналоги, в которых химические фрагменты, ответственные за связывание, соединены ковалентно. Длина, жесткость, стереоэлектронные химические свойства и растворимость линкера будут влиять на сродство к связыванию и характеристики полученной молекулы [Shuker S. В, Hajduk P. J., Meadows R.P, Fesik S. W. Discovering High-Affinity Ligands for Proteins - Sar by Nmr. Science (1996) 274: 1531-1534] (см. также пример 4). Примеры Пример 1. Как упоминается в предыдущих разделах, одним из преимуществ ESACHEL является совместимость с различными химическими фрагментами, включая пептиды и глобулярные белки (например, домены антител). В этом примере показано, как простой вариант ESACHEL (фиг. 1), характеризующийся вариабельными доменами меченых цистеином антител, связанными ковалентно с ДНК-олигонуклеотидами, способными к образованию частичных гетеродуплексов, приводит к идентификации пары вариабельного тяжёлого домена (VH) и вариабельного лёгкого домена (VL), которые после гетеродимеризации обеспечивают специфическое связывание антигена. Гены доменов VH и VL антитела L19 (специфического для ED-B-домена фибронектина [Pini A, Viti F., Santucci A., Carnemolla В., Zardi L., Neri P., Neri D. Design and use of phage display library. Human antibodies with subnanomolar affinity against a marker of angiogenesis eluted from a two-dimension gel. J. Biol. Chem. (1998) 273: 21769-21776]) антитела HyHEL-10 (специфического для лизозима куриного яйца [Neri, 1995]; имеется в виду, что внутренний сайт EcoRI предварительно подвергнут мутагенезу без изменения белковой последовательности) и других антител, выделенных из библиотеки ЕТН-2 [Viti, 2000], подвергнуты амплификации с помощью PCR с использованием следующих пар праймеров, которые кодируют остаток цистеина, подвешенный на С-конце каждого V-домена: - 10 - 006965 Полученные продукты PCR подвергают субклонированию с помощью стандартных методов молекулярной биологии в сайты EcoRI/HindIII плазмиды pQE12 (Qiagen, Germany). Полученные плазмиды кодируют V-домены, содержащие следующую последовательность на С-конце: -Gly-Gly-Cys-His-HisHis-His-His-His. Плазмиды, кодирующие меченые цистеином V-домены, вводят методом электропорации в клетки E.coli (предпочтительно, в штамме Origani Novagen, который имеет слегка окисляющий цитоплазмический потенциал), подвергают экспрессии и очистке с помощью металлхелатной хроматографии на смоле NiNTA (Qiagen, Germany). Меченые цистеином V-домены восстанавливают с помощью 1 мМ раствора дитиотреола в PBS (50 мМ фосфатного буфера + 100 мМ NaCl, pH = 7,4) с последующим обессоливанием на колонке PD-10 (Amersham-Pharmacia, Dubendorf, Switzerland). Параллельно получают от поставщика (например, Microsynth, Balgach, Switzerland) различные олигонуклеотиды, содержащие тиольную группу в положении 3' или 5'. Индивидуальные ДНКолигонуклеотиды с тиольной группой в положении 3' используются для спаривания с индивидуальными VH-доменами. Индивидуальные ДНК-олигонуклеотиды с тиольной группой в положении 5' используют для спаривания с индивидуальными VL-доменами. Репрезентативные типы последовательностей показаны ниже. Олигонуклеотиды этих семейств способны к частичному образованию гетеродуплекса: В параллельных реакциях очищенные тиолсодержащие ДНК-олигонуклеотиды реагируют с мольным избытком бисмалеимидо-гексана (Pierce, Belgium) в PBS + DMSO согласно инструкции изготовителя. Полученные производные очищают от не прореагировавшего бисмалеимидо-гексана с помощью анионообменной хроматографии, затем подвергают реакции с небольшим мольным избытком очищенно- 11 - 006965 го VH-cys или VL-cys, соответственно, с концентрацией домена > 0,1 мг/мл. Полученные продукты реакции (V-домен)-ДНК отделяют от не прореагировавшего V-домена с помощью анионообменной хроматографии. Эквимолярную смесь производных (V-домен)-ДНК смешивают в среде PBS, нагревают при 70°С в течение 1 мин, затем выдерживают до достижения комнатной температуры. Затем полученную смесь соединений ESACHEL инкубируют вместе с 0,1 мкМ раствором биотина-ED-B в среде PBS при комнатной температуре в течение 10 мин (Pini, 1998), затем связывают с магнитными шариками, покрытыми стрептавидином, и тщательно промывают согласно стандартным методам. Полученный препарат используют затем в качестве темплата для двух раздельных PCR-реакций, когда происходит амплификация (L19_5SH, HyHel10_5SH, GST_5SH) и (L19_3SH, HyHel10_3SH, GST_3SH) олигонуклеотидов (см. выше), используя олигомеры: Полученные PCR-продукты обрабатывают EcoR1, лигируют для получения конткатенамеров, субклонируют в подходящую плазмиду с последующей электропорацией в E.coli и секвенированием. Анализ полученной последовательности показывает сильное смещение в сторону кодов L19 (CAT AAT и ATA TAT) по сравнению с кодами HyYEL10 и GST, что показывает предпочтительное наличие комбинации VH(L19)-VL(L19) по сравнению с другими возможными продуктами сборки. Пример 2. В этом примере описывается, как вариант ESACHEL, отражённый на фиг. 1, может быть осуществлён практически. Стратегия, описанная в данном примере, применима также для вариантов, изображённых на фиг. 4, когда для выявления химических фрагментов на концах получающихся самосборкой олигонуклеотидов используют ДНК-триплексы или ДНК-квадруплексы. Конструирование двух библиотек осуществляют следующим образом. Создают подбиблиотеку «А» путём получения конъюгатов n соединений, присоединённых к 3'-концу n различных ДНКолигонуклеотидов. Среди многих возможных различных вариантов подходящим является присоединение иодацетамидных или малеимидных производных n химических соединений к индивидуальным ДНКолигонуклеотидам, которые содержат тиольную группу в положении 3'. Присоединение можно легко осуществить при комнатной температуре в среде PBS (50 мМ фосфатного буфера + 100 мМ NaCl, pH = 7,4), путём простого смешения олигонуклеотида, содержащего тиольные группы (типичная концентрация: 10-100 мкМ), с мольным избытком производного, содержащего иодацетамидную группу или малеимидную группу (типичная концентрация: 50-500 мкМ) с последующей хроматографической очисткой аддукта ДНК-химическое соединение. Олигонуклеотиды, содержащие тиольные группы, можно приобрести у производителей. Каждый из них содержит постоянную часть последовательности (например, 5'XXXXXCAGCACACAGAATTCAGAAGCTCC-3'), способную к образованию гетеродуплекса с членами подбиблиотеки В (см. ниже). Часть ДНК-последовательности ХХХХХ в положении 5' (по меньшей мере, частично) в каждом члене подбиблиотеки А разная и действует как код. Подобным образом создают подбиблиотеку «В» путём присоединения m соединений в положении 5' m разных ДНК-олигонуклеотидов. Присоединение иодацетамидных или малеимидных производных m химических соединений к индивидуальным ДНК-олигонуклеотидам, которые содержат тиольную группу в положении 5', осуществляют, как описано для подбиблиотеки «А». Такие олигонуклеотиды можно купить у производителей. Каждый из них содержит постоянную часть последовательности (например, 5'GGAGCTTCTGAATTCTGTGTGCTGYYYYY-3'), способную к образованию гетеродуплекса с членами подбиблиотеки А (см. выше). Часть ДНК-последовательности YYYYY в положении 3' в каждом члене подбиблиотеки В является разной (по меньшей мере, частично) и действует как код. Сборка членов подбиблиотеки А с членами подбиблиотеки В осуществляется путём смешения подбиблиотек в среде PBS, нагревания смеси при 70°С в течение 1 мин (если это согласуется со стабильностью химических соединений, использованных при конструировании подбиблиотек) с последующей выдержкой при комнатной температуре. Полученная подбиблиотека ESACHEL содержит n x m членов и может быть использована при проведении биопэннинга с последующим декодированием членов пары связывания. Пример 3. Этот пример иллюстрирует один из многих возможных методов декодирования для вариантов ESACHEL, отражённых на фиг. 1 и в примере 2. Стратегия декодирования, показанная схематически на - 12 - 006965 фиг. 5, основана на том принципе, что после биопэннинга требующихся специфичностей связывания ESACHEL получаются продукты PCR, каждый из которых содержит код пар членов подбиблиотеки, комбинация которых была получена при биопэннинге, что позволяет идентифицировать соответствующие гетеродимеризованные химические структуры. Химические структуры подбиблиотек А и В (см. также фиг. 1 и пример 2) соединяются по отдельности с членами двух пулов ДНК-олигонуклеотидов со следующими свойствами: Один пул олигонуклеотидов содержит химические фрагменты в положении 3' (пул А), а другой пул содержит химические фрагменты в положении 5' (пул В). Достаточное количество оснований в положении 5' олигонуклеотидов пула В позволяет осуществить специфическую димеризацию любого отдельного члена пула В с любым отдельным членом пула А. В этом димеризационном домене олигонуклеотиды из пула В содержат участок «кода», который кодирует химический фрагмент в положении 5'. Олигонуклеотиды пула А содержат достаточное число звеньев дезоксирибозы без оснований (d-спейсер) для предотвращения любого нежелательного присоединения к основаниям кода В. Олигонуклеотиды подбиблиотеки В остаются стабильно гибридизованными с олигонуклеотидами подбиблиотеки А и могут работать как праймеры для реакции ДНК-полимеразы на темплате А. Полученный сегмент ДНК, содержащий и код А, и код В, можно подвергнуть амплификации (обычно с помощью PCR), используя праймеры, которые подвергаются гибридизации на постоянных кодах сегмента ДНК (фиг. 5). Пример модели олигонуклеотидов А и В, которые могут быть использованы для получения продукта PCR, который содержит оба кода А и В, приведён ниже: тип В_олиго Химический фрагмент В - 5'-GCA TCA CGG ААТ ТСС CAG CAT AAT GAT CGC ТАТ CGC TGC-3' тип А_олиго (d = d - элемент спейсера) 5'-CGT CAG CTC GAA ТТС ТСС ATA TAT GCA GCG ATA GCG АТС DDD DDD CTG GGA ATT CCG GTA TGC-3'-химический фрагмент А CodeABfo 5'-GCA TAC CGG AAT ТСС CAG-3' CodeABba 5'-CGT CAG CTC GAA ТТС ТСС-3' Тип А_олиго и тип_В олиго смешивают в примерно эквимолярных количествах. Полученную смесь нагревают при 70°С и охлаждают до комнатной температуры для осуществления гетеродимеризации типа А олиго и типа В олиго. Полученную смесь смешивают с подходящим буфером для PCR, dNTP3 (250 мкМ на нуклеотид, Pharmacia). Затем добавляют Taq-полимеразу (1 ед., Appligen) и осуществляют инкубацию смеси при 40°С в течение 5 мин. Затем после добавления праймеров CodeABfo и CodeABba (400 мкМ) запускают программу PCR с 30 циклами (90°/1 мин) - (50°С/1 мин) - (72°/15 с). После завершения программы длину фрагмента PCR проверяют стандартным методом с использованием полиакрилимидного геля Novex. Идентичность последовательности может быть установлена обработкой продукта EcoRI с последующим клонированием в подходящую плазмиду и секвенированием. Пример 4. Как и в случае рекомбинантных антител (CRAbs) [Neri, 1995] и маленьких органических лигандов, идентифицированных с использованием SAR с помощью ЯМР [Shuku, 1996], связывание с высоким сродством членов ESACHEL с молекулами мишени может основываться на хелатном эффекте. Считают, что положительный вклад величины сродства в хелатный эффект зависит от длины, жёсткости, стереоэлектронных химических свойств и стабильности связи между двумя (или несколькими) химическими структурами в контакте с антигеном-мишенью. Далее, влияние сродства непосредственно зависит от величины констант скорости ассоциации и диссоциации (kon и koff) индивидуальных химических соединений, присоединяющихся к мишени. В этом примере описана компьютерная модель, которая даёт информацию о вкладе хелатного эффекта по отношению к вышеупомянутым параметрам (длина линкера, kon и koff). Как показано на фиг. 9, два различных химических соединения А и В присоединяются к разным сайтам связывания одной и той же молекулы мишени и связаны линкером определённой длины. Удобно обозначить четыре различные состояния (nI, nII, nIII и nIV), которые могут взаимопревращаться путём химического связывания: nI: и «А», и «В» связаны со своим карманом связывания; nII: «А» связано со своим карманом связывания, а «В» не связано с карманом связывания; nIII:«В» связано со своим карманом связывания, а «А» не связано с карманом связывания; nIV: и «А», и «В» не связаны со своими карманами связывания. Кинетические параметры konA, koffA, konB и koffB, описывающие связывание индивидуальных химических соединений А и В с соответствующими карманами связывания, известны. На основе этих констант можно определить вероятность отсоединения связанной молекулы от кармана связывания (poff) и связывания несвязанной молекулы со своим карманом связывания (pon) в определённый отрезок времени. poff = koff ·Δt [1] - 13 - 006965 Согласно кинетике первого порядка полупериод связывания может быть выражен следующим образом: τon = ln2 /(κon ⋅ [В]) [2] Если в момент времени t = 0 все молекулы В не связаны с соответствующим карманом связывания (и если пренебречь процессами диссоциации в первом приближении), фракция связанных молекул через промежуток времени Δt может быть выражена следующим образом: N(Δt)/N(t=0) = e-Δt kon·[B] [3] Если выбрать достаточно большое количество молекул, уравнение [3] можно аппроксимировать для возможности связывания молекулы В с карманом в промежуток времени Δt. Эти уравнения соответствуют химическим соединениям А и В, которые связываются с соответствующими карманами независимо друг от друга. Предположим, однако, что А и В соединены линкером и что соединение А присоединено к своей мишени. Удобно выразить концентрацию В вблизи кармана связывания как эффективную концентрацию «ec». pon = e-Δtkon⋅·ec [4] В случае модели согласно изобретению вклад хелатного эффекта в процесс связывания бидентатной молекулы А-В с мишенью обусловлен увеличением эффективной концентрации одной из двух молекул присоединения, когда другая связана со своим карманом связывания (фиг. 9). Предположим для простой модели, что если молекула А связана, молекула В может быть расположена с равной вероятностью в каждом положении в полусферическом пространстве вокруг молекулы А, причём радиус «rad» (измеренный в м) равен длине линкера. Стерические препятствия линкера, эффекты отталкивания и т.д. в простой модели не учитываются. То же предположение используется и в случае, когда молекула В связана, а молекула А остаётся несвязанной. В результате мольная эффективная концентрация «ec» может быть вычислена как: еc = 1 / [1/2⋅(4/3⋅π⋅rad3)⋅6,01⋅1026] [5] Основываясь на этих предположениях, авторы изобретения создали компьютерную программу для оценки вклада хелатного эффекта в остаточный полупериод связывания бидентатной молекулы А-В, где два индивидуальных соединения А и В, связанные с двумя разными карманами связывания той же самой молекулы мишени, связаны линкером длиной «rad». Возможностью связывания А и В с двумя разными молекулами мишени пренебрегают. В популяции n молекул А-В четыре состояния, отражённые на фиг. 9, могут включать отдельные молекулы, и понятно, что отдельные молекулы находятся в разных состояниях в разные моменты наблюдения. Для нашей модели мы определили возможность pon и poff индивидуальных молекул А и В менять состояние в промежуток времени Δt. Как практический пример рассмотрим случай, когда в момент времени t = 0 все молекулы А-В находятся в состоянии nI (и А, и В связаны). В каждый промежуток времени Δt (равный 1 с в программе) возможности молекул А и В изменить свой статус связывания дают толчок новому распределению молекул А-В в четырёх разных состояниях. При моделировании учитываются условия необратимой диссоциации (а именно, диссоциированные молекулы А-В в состоянии nIV не имеют возможности снова связываться с мишенью). Программа повторяет эти расчёты в каждый промежуток времени, до тех пор, пока популяция молекул А-В, связанных с мишенью (сумма nI, nII и nIII) не уменьшится наполовину от первоначального количества. Сумма промежутков времени представляет собой величину полупериода связывания молекулы А-В с мишенью. Варьируя или начальную конфигурацию семейства молекул, или параметры koffA, koffB, konA, konB и «rad», можно оценить вклад в хелатный эффект различных связанных химических молекул в терминах кинетической стабилизации комплекса. Код соответствующей программы CHELATE (написана на языке PASCSL) приведён ниже. - 14 - 006965 - 15 - 006965 - 16 - 006965 Пример 5. Во многих случаях желательно повысить сродство существующего соединения к связыванию с молекулой мишени (например, фармацевтической мишени). Для достижения этой цели технологию ESACHEL можно использовать следующим образом, а именно, исключить «код» олигонуклеотидной последовательности из оптимизируемого соединения, участвующего в связывании. Предположим, что химическое соединение р связывается с молекулой мишени (например, белка) с недостаточным сродством. Можно связать р с одним концом (например, 5') подходящего олигонуклеотида, способного к самосборке с другими производными олигонуклеотидов (обычно путём образования гетеродуплекса, как отражено на фиг. 10). Например, химический фрагмент р спаривается в положении 5' с олигонуклеотидом 5' - 5' - 17 - 006965 GGA GCT TCT GAA TTC TGT GTG CTG -3'. Можно по отдельным реакциям химически присоединять многие различные соединения q к 3'-концу олигонуклеотидов с общей последовательностью 5'-XX....XXY-CAG САС АСА GAA TTC AGA AGC ТСС-3', где часть XX....XX будет разной для разных соединений; Y представляет собой биотинилированный аналог основания; последовательность 5'-CAG САС АСА GAA TTC AGA AGC ТСС-3' одинакова во всех случаях, что позволяет образоваться гетеродуплексу с последовательностью 5'-GGA GCT TCT GAA TTC TGT GTG CTG-3', химически соединённой с р, для всех членов семейства молекул q. Полученная библиотека содержит пары р с молекулами q, каждая из которых содержит отличительный олигонуклеотидный код. Полученная самосборкой библиотека подвергается биопэннингу в строгих условиях. Связывающие соединения, полученные в конце биопэннинга, идентифицируются с помощью кода. Например, коды молекул q, которые вместе с р образуют соединения с высоким сродством к связыванию с молекулой мишени, могут быть прочитаны с помощью гибридизации с олигонуклеотидным чипом, в котором разные положения заняты олигонуклеотидами, которые являются комплиментарными последовательностям XX.....XX членов подбиблиотеки Q. Биотиновый фрагмент в молекулах членов подбиблиотеки Q позволяет обнаружить моменты связывания на чипе. Химические соединения-кандидаты q затем химически соединяются с p и полученные конъюгаты используются для специфического связывания с молекулами мишени, представляющей интерес. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Продукт реакции сочетания по меньшей мере двух химических соединений, каждое из которых содержит химический фрагмент (p,q,r,s), потенциально способный вступать в реакцию связывания с единственной молекулой мишени, и олигонуклеотид (b,b',b",b'") или его функциональный аналог, который включает по меньшей мере один самособирающийся фрагмент (m,m',m",m'"), причем химические соединения связаны друг с другом при помощи самособирающихся фрагментов (m,m',m",m'"), отличающийся тем, что представляет собой стабильный продукт в отсутствие молекулы мишени, и олигонуклеотиды (b,b',b",b"') или их функциональные аналоги, по меньшей мере, одного соединения включают вариабельную, уникальную кодирующую последовательность (b2,b2',b2",b2'") для идентификации отдельного химического фрагмента (p,q,r,s). 2. Продукт реакции по п.1, отличающийся тем, что самособирающиеся фрагменты (m,m',m",m'") представляют собой самособирающиеся последовательности (b1,b1',b1",b1'") олигонуклеотидов (b,b',b",b'"), их функциональные аналоги, лиганды (I), способные вступать в реакцию комплексообразования со специфическим ионом (i), или пептиды, способные к ассоциации с другими молекулами. 3. Продукт реакции по п.1 или 2, отличающийся тем, что по меньшей мере два химических соединения каждый содержат химическую группу, при помощи которой они ковалентно связываются после образования стабильного продукта реакции сочетания. 4. Продукт реакции по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что олигонуклеотиды (b,b',b",b'") или их функциональные аналоги ковалентно и непосредственно связаны с химическими фрагментами (p,q,r,s). 5. Продукт реакции по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что олигонуклеотиды (b,b',b",b'") или их функциональные аналоги дополнительно содержат линкеры (b3,b3',b3",b3'"), которые расположены между самособирающейся последовательностью (b1,b1',b1",b1'") и химическим фрагментом (p,q,r,s). 6. Продукт реакции по одному из пп.1-5, отличающийся тем, что кодирующая последовательность (b2,b2',b2",b2"') олигонуклеотида (b,b',b",b'") или его функциональный аналог расположены между химическим фрагментом (p,q,r,s) и самособирающейся последовательностью (b1,b1',b1",b1'"). 7. Продукт реакции по одному из пп.1-6, отличающийся тем, что он представляет собой димер, тример или тетрамер, проявляющий химический фрагмент (p,q,r,s). 8. Библиотека химических соединений, содержащая продукт реакции сочетания по меньшей мере двух химических соединений, каждое из которых содержит химический фрагмент (p,q,r,s), потенциально способный вступать в реакцию связывания с единственной молекулой мишени, и олигонуклеотид (b,b',b",b'") или его функциональный аналог, который включает по меньшей мере один самособирающийся фрагмент (m,m',m",m'"), причем химические соединения связаны друг с другом при помощи самособирающихся фрагментов (m,m',m",m'"), отличающаяся тем, что продукт реакции представляет собой стабильный продукт в отсутствие молекулы мишени, и олигонуклеотиды (b,b',b",b'") или их функциональные аналоги по меньшей мере одного соединения включают вариабельную, уникальную кодирующую последовательность (b2,b2',b2",b2'") для идентификации отдельного химического фрагмента (p,q,r,s). 9. Библиотека по п.8, отличающаяся тем, что самособирающиеся фрагменты (m,m',m",m'") представляют собой самособирающиеся последовательности (b1,b1',b1",b1'") олигонуклеотидов (b,b',b",b'"), их функциональные аналоги, лиганды (I), способные вступать в реакцию комплексообразования со специфическим ионом (i), или пептиды, способные к ассоциации с другими молекулами. - 18 - 006965 10. Библиотека по одному из пп.8 или 9, отличающаяся тем, что по меньшей мере два химических соединения, каждый, содержат химическую группу, при помощи которой они ковалентно связываются после образования стабильного продукта реакции сочетания. 11. Библиотека по одному из пп.8-10, отличающаяся тем, что она включает продукт реакции по любому из пп.4-7. 12. Библиотека по одному из пп.8-11, отличающаяся тем, что индивидуальные комбинации фрагментов (p,q,r,s) получены путём образования гетеродуплексов, гетеротриплексов или гетероквадруплексов самособирающихся последовательностей (b1,b1',b1",b1'") олигонуклеотидов (b,b',b",b'"). 13. Библиотека по одному из пп.8-11, отличающаяся тем, что индивидуальные комбинации фрагментов (p,q,r,s) получены хелатированием самособирающихся фрагментов (m,m',m",m'") при помощи специфических ионов (i). 14. Библиотека по п.12, отличающаяся тем, что она содержит индивидуально закодированные подбиблиотеки (А) и (В), причём подбиблиотека (А) содержит (n) соединений, присоединённых к 3'-концам (n) различных ДНК-олигонуклеотидов (b), и подбиблиотека (В) содержит (m) соединений, связанных с 5'-концом (m) различных ДНК-олигонуклеотидов (b'). 15. Библиотека по п.14, отличающаяся тем, что в подбиблиотеке (А) или подбиблиотеке (В), соответственно, иодацетамидные или малеимидо-производные (n) или (m) химических соединений соединены с индивидуальными ДНК-олигонуклеотидами, которые содержат тиольную группу на концах 3' или 5'. 16. Библиотека по п.14, отличающаяся тем, что в подбиблиотеке (А) или в подбиблиотеке (В), соответственно, амидные производные, образующие химические структуры, такие как -ОР(O)2-O-(СН2)n— NH-CO-R, где R может соответствовать числу различных химических соединений и (n) находится в интервале между 1 и 10, соединены с олигонуклеотидами, содержащими фосфодиэфирную группу на одном конце. 17. Библиотека по одному из пп.14-16, отличающаяся тем, что в подбиблиотеке (А) самособирающаяся последовательность (b1) прервана d-спейсером в направлении, противоположном коду (В), причём d-спейсер предотвращает нежелательное спаривание с основаниями кода (В), который кодирует подбиблиотеку (В), и олигонуклеотид (b) подбиблиотеки (А) имеет различительный код (А) в направлении 5'конца. 18. Способ биопэннинга лигандов, специфических по отношению к молекулам мишени, при котором продукт реакции сочетания инкубируют с молекулой мишени, причем продукт реакции состоит из по меньшей мере двух химических соединений, каждое из которых содержит химический фрагмент (p,q,r,s), потенциально способный вступать в реакцию связывания с единственной молекулой мишени, и олигонуклеотид (b,b',b",b'") или его функциональный аналог, который включает по меньшей мере один самособирающийся фрагмент (m,m',m",m"'), причем химические соединения связаны друг с другом при помощи самособирающихся фрагментов (m,m',m",m"'), отличающийся тем, что продукт реакции представляет собой стабильный продукт в отсутствие молекулы мишени, и олигонуклеотиды (b,b',b",b'") или их функциональные аналоги по меньшей мере одного соединения включают вариабельную, уникальную кодирующую последовательность (b2,b2',b2",b2'") для идентификации отдельного химического фрагмента (p,q,r,s). 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что для биопэннинга применяют продукт реакции по одному из пп.1-7. 20. Способ по п.18, отличающийся тем, что для биопэннинга применяют библиотеку продуктов реакции по одному из пп.8-17. 21. Способ идентификации молекулы мишени при помощи продукта реакции сочетания, содержащего химический фрагмент (p,q,r,s), способный вступать в реакцию связывания с этой молекулой мишени, и содержащего также олигонуклеотид (b,b',b",b'") или его функциональный аналог, отличающийся тем, что продукт реакции связан с мишенью методом биопэннинга по одному из пп.18-20. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что PCR-фрагменты, образующиеся в процессе полимеразной цепной реакции (PCR), несут код пар членов подбиблиотек (А) и (В), причём подбиблиотека (А) содержит n соединений, присоединённых к 3'-концам n различных ДНК-олигонуклеотидов (b), и подбиблиотека (В) содержит m соединений, присоединённых к 5'-концам m различных ДНК-олигонуклеотидов (b'). 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что в подбиблиотеке (А) или в подбиблиотеке (В), соответственно, иодацетамидопроизводные или малеимидопроизводные n или m химических фрагментов присоединены к индивидуальным ДНК-олигонуклеотидам, которые содержат тиольную группу в положении 3' или 5'. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что в подбиблиотеке (А) самособирающаяся последовательность (b1) прервана d-спейсером в направлении, противоположном коду (В), при этом d-спейсер предотвращает любое нежелательное присоединение к основаниям кода (В), который кодирует подбиблиотеку (В), а олигонуклеотид (b) подбиблиотеки (А) содержит отличительный код (А) в направлении 5'конца. - 19 - 006965 25. Способ по одному из пп.22-24, отличающийся тем, что длина PCR-фрагментов определяется и идентичность их последовательности устанавливается путём расщепления PCR-фрагментов сайтом рестрикции для специфической эндопептидазы (например, EcoRI) с последующим клонированием с подходящей плазмидой и секвенированием. 26. Способ по одному из пп.22-25, при котором несколько членов специфического связывания выделены в конце биопэннинга, отличающийся тем, что на основе различных PCR-фрагментов, содержащихся в реакционной смеси, создаются конкатенамеры, причём конкатенированные последовательности «прочитываются» путём секвенирования, что позволяет выявить и идентичность, и частоту пар кода (А) и кода (В). 27. Способ по п.22, при котором члены специфического связывания выделяются в конце биопэннинга и подбиблиотеки (А) и/или (В) содержат химические фрагменты на концах частично гибридизованных олигонуклеотидов, отличающийся тем, что раздельные нити ДНК подвергаются гибридизации с олигонуклеотидными мишенями (например, ДНК-олигонуклеотидами), иммобилизованными на одном или нескольких чипах. 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что путём использования чипа (А) или чипа (В), соответственно, осуществляют считывание идентичности и/или частоты членов подбиблиотеки (А) и подбиблиотеки (В), соответственно, которые получены после биопэннинга, и путём декодирования на чипах (А) и (В) выявляются кандидаты - соединения в подбиблиотеках (А) и (В), для повторной гибридизации и скрининга. 29. Способ по п.28, отличающийся тем, что всё увеличивающееся связывание с мишенью в строгих условиях отражается в уменьшении членов (А) и/или (В), идентифицированных на соответствующем чипе, и возможные комбинации членов кандидатов (А) и (В) собираются в отдельности или в маленькие пулы и анализируются для связывания с мишенью. 30. Способ по одному из пп.27-29, отличающийся тем, что библиотеки самособираются для образования тримерных или тетрамерных комплексов с помощью трёх или четырёх чипов, соответственно, содержащих отличительные олигонуклеотидные мишени для декодирования. 31. Способ по одному из пп.27-30, отличающийся тем, что ДНК выбранных молекул связывания амплифицируют с помощью PCR до гибридизации чипа. Фиг. 1 - 20 - 006965 Фиг. 2 Фиг. 3 Фиг. 4 - 21 - 006965 Фиг. 5 Фиг. 6 Фиг. 7 - 22 - 006965 Фиг. 8 Фиг. 9 Фиг. 10 Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6 - 23 -
