Автореферат () - Институт молекулярной патологии и
реклама
На правах рукописи Сладкова Евгения Анатольевна ЦИТОАРХИТЕКТОНИКА И СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ (ДОНОРОВ) И ПРИ РАЗВИТИИИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ НА ОСНОВЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология А В Т О Р Е Ф Е РАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации. Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Скоркина Марина Юрьевна Официальные оппоненты: Бгатова Наталия Петровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией ультраструктурных исследований ФГБНУ Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии (Новосибирск). Гуляева Людмила Федоровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза ФГБНУ Научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики (Новосибирск). Ведущая организация: ФГБНУ Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины, лаборатория цитологии и клеточных культур (Новосибирск). Защита состоится: «_____» _____________ 2015 г. в ___ час. на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБНУ Институте молекулярной патологии и патоморфологии по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБНУ Института молекулярной патологии и патоморфологии http://pathomorphology.ru Автореферат разослан «_____» ______________ 2015 г. Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Молодых Ольга Павловна ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Действие целого спектра стимулов (вирусов, канцерогенов и т.п.) наряду с трансформацией функционального состояния клетки сопровождается изменением структуры ее поверхности, что в итоге приводит к появлению у нее новых биологических свойств (Wroblewski J.M. et al., 2002; McLead I.X. et al., 2011). В зависимости от природы и интенсивности возмущающего воздействия, адаптивные реакции клеток проявляются неодинаково, однако общими их свойствами являются изменения цитоархитектоники, формы и поверхности (Wolf K. et al., 2003). В связи с этим одной из актуальных проблем клеточной биологии является изучение функциональных свойств и структуры поверхности лимфоцитов в норме и при патологии (например, развитии опухолей в системе крови). Решение данной проблемы позволит установить ранние изменения структурно-функциональных свойств лимфоцитов, характерных для неопластической клетки, а также разработать терапевтические подходы, направленные на уничтожение аномальных клеток. Степень разработанности темы исследования. В настоящее время в литературе представлены данные многочисленных научных исследований, касающихся вопросов опухолевого перерождения клеток (Зуева Е.Е., 2008; Тамкович С.Н. и др., 2008; Чеботкевич В.Н. и др., 2010), метастазирования и образования лейкостазов (Сорокин Ю.Н. и др., 2013). Нарушение пролиферации и дифференцировки лимфоцитов при развитии лимфопролиферативных заболеваний обусловлены изменением их генетической и метаболической систем (Lopez J.I. et al., 2008), что отражается на особенностях их метастатического потенциала, механизмах формирования и функционирования поверхностного аппарата клетки (Шутова М.С., 2010; Dong C. et al., 2005; Kraning-Rush C.M. et al., 2012). Доказано, что процесс развития неопластических лимфоидных клеток сопровождается изменением заряда (Тарасова И.М., 1985) и свойств плазмалеммы (Горло Е.И., 2000). Несмотря на многочисленные экспериментальные данные, представленные в источниках литературы, открытым остаётся вопрос об особенностях цитоархитектоники, механических и электрических свойств клеточной поверхности, изменяющихся в процессе опухолевого перерождения. Решение данной проблемы стало возможным благодаря внедрению в экспериментальные исследования технологий сканирующей зондовой микроскопии, использующей различные модификации атомно-силовых микроскопов. Преимуществами атомно-силовой микроскопии, по сравнению с традиционными способами исследования, являются: трехмерная визуализация топографии (Kamruzzaham A.S.M. et al., 2004); интеграция морфологических изображений клеточной поверхности с ее механическими свойствами (Simone A., Durrieu M.C., 2006); получение информации об упруго-эластических (Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю., 2013) и электрических свойствах клеток (Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю., 2014). 1 Внедрение атомно-силовой микроскопии создает новые направления в изучении морфологических и функциональных особенностей клеточной поверхности. С учетом вышесказанного сформулированы цель и поставлены задачи исследования. Цель работы: охарактеризовать цитоархитектонику и свойства поверхности лимфоцитов в норме (у здоровых людей) и при развитии лимфопролиферативных процессов на основе метода атомно-силовой микроскопии. Задачи исследования: 1. Измерить поверхностный потенциал лимфоцитов в норме и при развитии лимфопролиферативных процессов. 2. Изучить цитоархитектонику поверхности и упруго-эластические свойства лимфоцитов в норме и в условиях пролиферации. 3. Охарактеризовать миграционную активность и организацию элементов цитоскелета лимфоцитов в норме и в условиях пролиферации. 4. Проанализировать цитоархитектонику и функциональные свойства лимфоцитов здоровых людей и больных лейкозом на моделях митогенстимулированной пролиферации. Научная новизна. На основе комплексного подхода с использованием современных методов атомно-силовой микроскопии получены новые данные о структуре и функциональных свойствах нормальных и трансформированных лимфоцитов. Впервые показано, что развитие миелопролиферативного процесса сопровождается изменением морфологии, упруго-эластических свойств и миграционной активности лимфоцитов. Установлены различия архитектоники, жесткости и организации цитоскелета лимфоцитов в условиях острого и хронического типов лимфобластной пролиферации. Показано, что в период ремиссии лимфобластного лейкоза лимфоциты сохраняют свойство, характерное для клеток в стадии обострения болезни – способность распластываться на подложке. Установлено повышение потенциала поверхности лимфоцитов при развитии лимфопролиферативных процессов как миело-, так и лимфобластного ростков кроветворения. Научная новизна работы заключается так же в том, что на модели митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов удалось доказать и подтвердить ранние изменения свойств и структуры поверхности различных субпопуляций лимфоцитов в норме и при развитии лимфопролиферативных заболеваний. Так, установлено, что реакция лимфоцитов на митогенную стимуляцию проявляется в образовании клеток с повышенным потенциалом поверхности и сниженной двигательной активностью. Теоретическая и практическая значимость. В выполненном исследовании представлены новые сведения о структурной организации и функциональных свойствах лимфоцитов в норме и при развитии пролиферативных процессов. Полученные данные имеют важное теоретическое и 2 практическое значение в области клеточной биологии в качестве критерия, позволяющего объективно дифференцировать нормальные лимфоциты от клеток, обладающих злокачественными свойствами. Комплексное исследование цитоархитектоники и функциональных свойств лимфоцитов в условиях пролиферации позволило установить объективные маркеры, которые можно использовать для прогноза степени и тяжести течения острых и хронических типов лимфопролиферативных заболеваний. На основе полученных данных, а также с учетом ранее разработанных способов («Способа исследования нативных клеток крови»; патент РФ № 2398234; «Способа определения упругости клеток крови»; патент РФ № 2466401), создан «Способ прогнозирования течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза» (патент РФ № 2541189). Разработаны рекомендации по оценке локомоторной активности опухолевых лимфоцитов при выполнении исследований в рамках Федеральной целевой программы 1.3.2. «Проведение научных исследований целевыми аспирантами», соглашение № 14.132.21.1320 от 01.10.2013. На модели митогенстимулированной пролиферации клеток показано, что образовавшиеся лимфобласты больных острым лимфобластным лейкозом в ремиссии и хроническим лимфолейкозом после лечения обладают функциональными свойствами, сходными с агрессивными лимфобластами больных острым лимфолейкозом. Подобная реакция клеток на митоген, в отсутствие противоопухолевой терапии, указывает на способность лимфоцитов сохранять злокачественные свойства у больных как острым лимфолейкозом в ремиссии, так и хроническим лимфолейкозом после лечения. Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедре экологии, физиологии и биологической эволюции НИУ «БелГУ» при разработке учебно-методических пособий по дисциплинам «Физиология крови» для магистров по направлению 020400.68 – Физиология человека и животных, «Иммунология» для студентов направления подготовки 020200.62 – Биология; «Цитология и гистология» для студентов направления подготовки 020400.62 – Биология. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Развитие острых и хронических лимфопролиферативных процессов в системе крови сопровождается повышением поверхностного потенциала лимфоцитов. 2. Упруго-эластические свойства и тонкая организация цитоархитектоники поверхности лимфоцитов специфична для каждого типа пролиферации. 3. Пролиферативные процессы сопровождаются изменением миграционной активности лимфоцитов: снижение ее у больных хроническим лимфолейкозом после лечения и острым лимфолейкозом в фазу ремиссии, и увеличение – у больных острым миелобластным и острым лимфобластным лейкозом в фазу обострения. 4. Адаптивный ответ лимфоцитов на моделях митогенной стимуля3 ции, как в группе здоровых людей, так и больных лейкозом проявляется в образовании трех морфологически разнородных субпопуляций клеток с характерными особенностями цитоархитектоники, повышенным потенциалом поверхности и сниженной миграционной активностью, однако в изменении упруго-эластических свойств клеток однозначной зависимости не установлено. Степень достоверности полученных результатов и выводов диссертации обусловлена теоретическим анализом, личным участием автора во всех сериях экспериментального исследования, использованием современных высокоточных методов атомно-силовой микроскопии, соответствующих компьютерных программ обработки и анализа изображений, большим объемом фактического материала, который обработан с использованием традиционных методов статистики, получением патентов на изобретения, публикацией данных диссертации в статьях, докладах на международных конференциях и научных семинарах. Апробация работы. Основные результаты диссертационных исследований представлены на III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2010» (Москва, 2010); 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010); VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012); XVII Российском симпозиуме по растровой и электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ – 2012) (Черноголовка, 2012); 16-ой Международной Пущинской школеконференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2012); X Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии Коми «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2012); 17-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2013); IX Международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 2013); XXII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва-Волгоград, 2013); IV Международной научно-практической конференции «Научные перспективы XXI века. Достижения и перспективы нового столетия» (Новосибирск, 2014), расширенном заседании кафедры экологии, физиологии и биологической эволюции НИУ «БелГУ» (Белгород, 2015). Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов исследования, 3 патента на изобретения. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка сокращений, списка литературы (287 источников, в том числе 192 – иностранных). Работа включает 24 таблицы, иллюстрирована 109 рисунками. 4 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Проведено 3 серии экспериментов, в каждой из которых исследовали кровь больных лейкозом (255 обследованных от 18 до 45 лет) и здоровых людей (160 обследованных от 25 до 45 лет). В работе использовали кровь больных острым миелобластным лейкозом (ОМЛ), острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) в стадии обострения и ремиссии болезни, хроническим лимфобластным В-клеточным лейкозом (ХЛЛ) после лечения. Забор крови, общий клинический анализ крови здоровых и больных людей, а также цитохимический анализ клеток крови больных лейкозом и постановка диагноза выполнены на базе клинико-диагностической лаборатории областной клинической больницы им. Святителя Иоасафа г. Белгорода с участием специализированного медицинского персонала. Первая серия исследований включала изучение свойств и структуры поверхности, культивируемых в питательной среде, лимфоцитов больных лейкозом. Во второй и третьей серии исследований моделировали митоген-стимулированную нагрузку на лимфоциты в культуре и изучали свойства и структуру поверхности субпопуляций клеток. Согласно данным литературы, митогены способны вызывать в здоровых клетках трансформации, сходные с преобразованиями, происходящими при опухолевом перерождении (Шутова М.С., 2009; Ломакин М.Е., 2011). Во второй серии экспериментов к культуральной среде добавляли Кон А, в третьей – ФГА. В каждой серии экспериментов исследовали кровь 50 доноров, 25 пациентов с диагнозом ОЛЛ на стадии обострения болезни и 15 в ремиссии, 25 больных ХЛЛ и 20 пациентов с ОМЛ. Взятие крови, проведение общего и дифференциального анализа крови. Забор периферической крови здоровых людей и больных лейкозом осуществляли из локтевой вены. Общий и дифференциальный анализ крови проводили при непосредственном участии врачей-лаборантов клинической лаборатории на автоматическом гематологическом анализаторе Beckman Coulter LH500 (Франция, 2010). Цитохимическая диагностика лейкозов. С целью диагностики острых типов лейкозов использовали алгоритм цитохимической диагностики, принятый в клинической онкогематологии (Почтарь М.Е. и др., 2003). Диагностику хронического лимфобластного лейкоза осуществляли методом селективного гейтирования на проточном цитометре FACS Cantu II (США, 2010), используя стандартные панели моноклональных антител для Т- и В-лимфоцитов. Культивирование лимфоцитов. Культивирование лимфоцитов осуществляли согласно схеме (патент РФ № 2084523, Фролова И.В. и др., 1987). Для приготовления пробы 1 мл свежевыделенной суспензии лейкоцитов смешивали с 5 мл питательной смеси и инкубировали в течение 48 часов при 37°C в присутствии 5% CO2 (Зайцева Е.М. и др., 2011). При моделировании процессов митогенной стимуляции деления клеток в 5 культуральную среду добавляли Кон А и ФГА, доза составила 0,02 мл на 5 мл культуральной среды (патент РФ № 2084523; Эшмен Р.Ф., 1987). По истечении времени инкубации готовили суспензионные препараты для исследований структуры и функциональных свойств клеток. Методы исследования клеток крови на АСМ. Режим полуконтактного сканирования. Геометрические параметры и микрорельеф поверхности лимфоцитов изучали в полуконтактном режиме на атомно-силовом микроскопе ИНТЕГРА Вита фирмы NT-МDТ (Зеленоград, 2009). Для сканирования использовали кантилеверы серии NSG03 с радиусом закругления 10 нм. Пробоподготовку для АСМ проводили согласно разработанным на кафедре способам при непосредственном участии автора (патент РФ № 98248, патент РФ № 2009125268). Из пробы сканировали по 15 клеток каждой субпопуляции лимфоцитов. На полученных сканах измеряли морфометрические параметры клеток и анализировали неоднородности их клеточной поверхности на участках мембраны площадью 3Х3 мкм. Морфометрию клеток осуществляли, используя программные продукты Nova (NT-MDT, Россия, 2009) и Gwyddion (Czech Metrology Institute, 2004). Режим силовой спектроскопии. Упруго-эластические свойства лимфоцитов изучали в режиме силовой спектроскопии согласно двум методическим подходам. В первом случае измеряли общую жесткость клетки с использованием модифицированного зонда, изготовленного на основе полимерных микросфер, прикрепленных к типлессу серии CSG 11, согласно разработанному автором в коллективе с соавторами способу (патент РФ № 2466401). Во втором случае оценивали механические свойства поверхности в локальных участках. Для этого использовали стандартный зондовый датчик серии NSG 03, при наложении нагрузки на клеточную поверхность в 25 точках. Расчеты глубины погружения зонда в образец, силы прижатия зонда к образцу и модуль Юнга осуществляли по общеизвестным формулам (Israelachvili J., 1992; Capella B., Dieter G., 1999). Режим зонда Кельвина. Суспензию лейкоцитов для измерения потенциала поверхности (ПП) готовили согласно схеме (патент № 2027188; Шереметев Ю.А. и др., 1995). Измерение ПП осуществляли с помощью кантилевера с токопроводящим титановым покрытием серии NSG03/TiN (Nanoworld, USA). Из каждой пробы сканировали по 15 клеток и проводили обработку полученных сканов в программе Nova (NT-MDT, Россия). Изучение функциональной активности лимфоцитов. Функциональную активность лимфоцитов оценивали с помощью реакции торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ) в прямом капиллярном тесте с учетом жизнеспособности клеток не менее 95% (Новиков Д.К. и др., 2006). Двигательную активность клеток анализировали, используя индекс торможения миграции лимфоцитов (ИТМЛ). ИТМЛ вычисляли для митогенстимулированных лимфоцитов в сравнении со спонтанной (без митогена) миграцией. Расчет проводили по известной формуле (Новиков Д.К., 2005). 6 Морфологические методы анализа цитологических фиксированных препаратов лимфоцитов. С целью изучения особенностей организации элементов цитоскелета, измерения их длины (Ченцов Ю.С. и др., 1982), учета числа ядрышек (Howell W.M., 1980) и оценки пролиферативного потенциала лимфоцитов (Маркина Т.Н., 2011) готовили цитологические препараты по общепринятым стандартным методикам. Анализ цитологических препаратов осуществляли с помощью комплекса аппаратно-программной визуализации изображения «ВидеоТестМастерМорфология» (производитель НПФ «ВидеоТест», Санкт-Петербург, 2004). Для визуализации цитоскелетных структур использовали программное обеспечение «Видео-Тест-Размер 5.0». Методы статистической обработки. Результаты исследований представлены в виде среднеарифметических значений с их средними стандартными ошибками. Исследуемые параметры находятся в пределах нормального распределения. Статистический анализ проведен с использованием критерия Стьюдента для 5%-го уровня значимости (Лакин Г.Ф., 1968; Платонов А.Е., 2000). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Структурно-функциональные свойства лимфоцитов доноров и больных лейкозом. По данным исследования гематологического профиля больных лейкозом установлено снижение числа эритроцитов у пациентов с диагнозом острый миелобластный тип. Так, число эритроцитов и концентрация гемоглобина снижены соответственно на 35% и 39% (р<0,05) по сравнению с показателями крови доноров (табл. 1). Число лейкоцитов в крови больных ОЛЛ и ХЛЛ возросло соответственно на 975% и 503% (р<0,05), а в стадии ремиссии острого лейкоза снизилось на 34% (р<0,05) по сравнению с контролем. В группе больных ОМЛ установлено увеличение жесткости поверхности на 64% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (табл. 2). Изменение механических свойств клеточной поверхности лимфоцитов больных ОМЛ происходит одновременно с повышением потенциала поверхности и их миграционной активностью. Так, ПП лимфоцитов больных ОМЛ увеличился на 8% (р<0,05) по сравнению с лимфоцитами доноров. При этом лимфоциты этих больных сохраняли самую высокую способность к миграции по сравнению с другими формами лейкоза. Их миграционная активность возросла на 162% (р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 1). В лимфоцитах больных ОМЛ и доноров выявлена сеть цитоскелетных структур, расходящаяся от ядра радиально. Плотность расположения фибрилл, при наблюдении в световой микроскоп была настолько велика, что идентифицировать отдельные нити было не возможно, в результате, 7 Таблица 1. Гематологический профиль обследованных пациентов Доноры ОЛЛ ХЛЛ после ОМЛ ОЛЛ (контроль) в ремиссии лечения RBC, 1012 л-1 4,3±0,5 2,8±0,2* 4,1±0,3 4,9±0,5 4,5±0,4 Hb, г/л 145,0±25,0 88,6±8,6* 131,7±6,2 148,5±5,7 132,8±10,4 Ht, усл.ед. 0,44±0,2 0,3±0,02 0,38±0,1 0,46±0,3 0,6±0,2 MCV, мкм3 87,5±4,5 93,5±1,5 94,4±1,5 96,2±3,6 88,6±1,7 MCH, пг/кл/ 30,5±4,5 31,7±0,8 32,4±2,4 32,2±1,8 29,6±0,7 MCHC, г/л 335,0±32,5 338,8±9,4 343,1±9,4 340,4±8,4 334,1±3,1 PLT, 109 л-1 275,0±28,5 236,3±15,4 234,6±17,2 228,6±11,2 212,7±31,9 MPV, мкм3 8,5±1,5 7,3±0,4 8,7±1,1 7,4±0,8 9,0±0,9 * * WBC 6,5±1,5 8,86±4,1 69,9±2,1 4,3±0,9 39,2±4,6* Параметр Примечание: * – статистически достоверные различия между значениями лимфоцитов доноров и больных лейкозом по критерию Стьюдента при р<0,05. RBC – число эритроцитов, Hb – концентрация гемоглобина, Ht – гематокрит, MCV – средний объем эритроцита, МСН – средняя концентрация гемоглобина в 1 эритроците, MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, PLT – количество тромбоцитов, MPV – средний объем тромбоцита, WBC – число лейкоцитов. Таблица 2. Свойства поверхности и длина пучков элементов цитоскелета лимфоцитов Группа Модуль Юнга, мПа ПП, мВ Длина, мкм Доноры (контроль) 3,9±0,1 - 37,3±0,6 0,78±0,2 ОМЛ 6,4±0,3* - 34,7±0,3* 0,95±0,2 * * ОЛЛ 1,8±0,2 - 27,8±0,9 1,77±0,2* * * ОЛЛ в ремиссии 2,5±0,1 - 29,0±0,5 0,81±0,1 ХЛЛ после лечения 11,2±0,5* - 6,7±0,2* 0,69±0,1 Примечание: * – статистически достоверные различия между значениями лимфоцитов доноров и больных лейкозом по критерию Стьюдента при р<0,05. 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 Доноры ОМЛ ОЛЛ ОЛЛ в ХЛЛ после ремиссии лечения Рис. 1. Число лимфоцитов после миграции в 1 мкл суспензии. 8 а в б г д Рис. 2. Элементы цитоскелета в лимфоцитах: а – доноров, б – больных ОМЛ, в – больных ОЛЛ, г – больных ОЛЛ в ремиссии, д – больных ХЛЛ (стрелкой показаны пучки структур цитоскелета, располагающиеся вокруг ядра). проводили анализ пучков цитоскелетных структур, состоящих из скопления фибрилл (рис. 2). Визуальных различий в строении и расположении элементов цитоскелета в лимфоцитах больных ОМЛ по сравнению с клетками доноров не выявлено. Длина пучков в группе больных ОМЛ достоверно не отличалась от контроля (см. табл. 2). Изменение механических свойств и локомоторной активности лимфоцитов больных ОМЛ сопровождалось появлением на их поверхности однотипных глобулярные выступов, которые были собраны локально в структуры дугообразной формы, что придавало ей «рифленость» (рис. 3). В группе больных ОЛЛ при микроскопировании мазков обнаружены бластные формы с неправильными контурами цитоплазмы и ядром, занимающим большую часть клетки. Жесткость лимфоцитов больных ОЛЛ снизилась на 54% (р<0,05) по сравнению с группой доноров (см. табл. 2). Потенциал поверхности этих клеток был повышен на 34% (р<0,05) по сравнению с лимфоцитами доноров (см. табл. 2). Количество мигрировавших лимфоцитов в группе больных ОЛЛ возросло на 79% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. рис. 1). Элементы цитоскелета в подвижных лимфоцитах больных ОЛЛ были собраны в тонкие длинные отдельно лежащие пучки, расходящиеся от ядра радиально (см. рис. 2). Длина пучков цитоскелетных структур увеличилась на 126% (р<0,05) по сравнению с группой доноров (см. табл. 2). Рельеф поверхности лимфоцитов был сглажен (см. рис. 3). В суспензии культивированных лимфоцитов больных ОЛЛ в ремиссии не выявлено бластных форм лимфоидного ряда. Модуль Юнга лимфоци9 1 а в б г 4 3 2 д е Рис. 3. Рельеф поверхности лимфоцитов: а – доноров, б – больных ОМЛ, в – больных ОЛЛ, в – больных ОЛЛ в ремиссии (1 тип), д – больных ОЛЛ в ремиссии (2 тип), е – больных ХЛЛ (1 – дугообразные скопления глобулярных выступов; 2 – крупные инвагинации плазмалеммы; 3 – глобулярные выступы сферической формы; 4 – скопления глобулярных выступов). тов был снижен на 36% (р<0,05), а потенциал поверхности – повышен на 29% (р<0,05; см. табл. 2) по сравнению с группой доноров. Количество мигрировавших лимфоцитов в группе больных ОЛЛ в ремиссии снизилось на 28% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. рис. 1). В клетках со сниженной миграционной активностью основная масса элементов цитоскелета располагалась отдельными структурами в области околоядерного пространства (см. рис. 2). Несмотря на общие свойства структура поверхности лимфоцитов больны ОЛЛ в ремиссии была различна. Согласно полученным данным на АСМ выделено два типа клеток в зависимости от конфигурации их поверхности (см. рис. 3). Для лимфоцитов с первым типом клеточной поверхности характерно наличие мелких глобулярных структур, которые чередовались с крупными инвагинациями плазмалеммы. Для лимфоцитов со вторым типом рельефа клеточной поверхности характерно наличие глобулярных образований и редко встречающиеся мелкие инвагинации. В группе больных ХЛЛ после лечения были обнаружены крупные лимфоциты, похожие на бласты. Форма клеток варьировала от округлой до неправильной. Цитоплазма клеток располагалась в виде тонкого ободка, околоядерное пространство было четко выражено. Жесткость лимфоцитов больных ХЛЛ возросла на 187% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров, потенциал поверхности – повышен на 456% (р<0,05; см. табл. 2). Миграционная активность «жестких» лимфоцитов больных ХЛЛ была снижена. Число вышедших из капилляра клеток уменьшилось 10 на 30% (р<0,05) по сравнению с лимфоцитами доноров (см. рис. 1). Для малоподвижных лимфоцитов больных ХЛЛ характерна максимальная локализация цитоскелетных структур в околоядерной зоне. Пучки фибрилл представляли собой два типа структур: прямые и извитые (см. рис. 2). На клеточной поверхности присутствовали глобулярные выступы, которые были сгруппированы в структуры неправильной формы. Таким образом, для лимфоцитов больных как хроническим, так и острым типами лейкоза, вне зависимости от стадии течения болезни, характерно повышение заряда клеточной поверхности. В группе больных ОЛЛ высокая миграционная активность лимфоцитов в сочетании со снижением их жесткости и расположением длинных цитоскелетных пучков в виде отдельных нитей, предопределяет формирование условий для выхода «мягких» лимфоцитов в ткани. В период ремиссии ОЛЛ лимфоциты сохраняют свойство пониженной жесткости, однако способность их к миграции существенно снижена, за счет значительного укорочения длины структур цитоскелета. По данным литературы, наблюдаемые свойства могут быть связаны с воздействием химиотерапевтических препаратов на клетку (Barret A.J., 2009). У пациентов больных ХЛЛ после лечения возрастает жесткость клетки на фоне снижения миграционной активности, элементы цитоскелета клеток расположены в околоядерной зоне в виде коротких пучков. Структурно-функциональные свойства Кон А-стимулированных лимфоцитов. В условиях митогенной стимулированных лимфоцитов в культуре, как доноров, так и больных различными типами лейкоза были обнаружены субпопуляции микроцитов, нормоцитов и бластов. В культуре лимфоцитов больных ОМЛ выявлены субпопуляции микроцитов и нормоцитов, бласты отсутствовали. Форма микроцитов округлая сходная с клетками доноров, ядро занимало большую часть клетки. Под влиянием Кон А жесткость микроцитов больных ОМЛ увеличилась на 64% (р<0,05) по сравнению с контролем (табл. 3). В субпопуляции нормоцитов больных ОМЛ встречались формы с цитоплазмой, расположенной в виде тонкого ободка, либо широкого участка, ядро в таких клетках было смещено к полюсу. Жесткость нормоцитов достоверно не отличалась от клеток доноров (см. табл. 3). Под влиянием Кон А потенциал поверхности лимфоцитов больных различными типами лейкоза увеличился. Так, в группе больных ОМЛ потенциал возрастал на 298% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 3). В результате проведенных исследований установлено снижение двигательной активности лимфоцитов больных разными формами лейкоза под влиянием Кон А. Количество мигрировавших клеток больных ОМЛ уменьшилось на 36% (р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 4). В культуре лимфоцитов больных ОЛЛ микроциты имели правильную округлую форму и ядро, занимающее большую часть клетки. Модуль Юнга 11 Таблица 3. Величины модуля Юнга и ПП лимфоцитов в условиях стимуляции Кон А Модуль Юнга (мПА) Группы ПП, мВ Микроциты Нормоциты Бласты Доноры (контроль) 11,4±0,4 8,2±0,9 7,3±0,2 -21,1±0,5 * ОМЛ 18,7±0,3 8,5±0,5 – -5,3±0,7* ОЛЛ 10,7±0,4 8,3±0,9 6,5±0,2 -14,0±0,3* * * * ОЛЛ в ремиссии 3,4±0,1 1,6±0,1 1,8±0,1 -6,2±0,3* * * * ХЛЛ после лечения 6,5±0,2 2,3±0,3 1,6±0,2 -2,5±0,2* Примечание: * – статистически достоверные различия между значениями лимфоцитов доноров и больных лейкозом по критерию Стьюдента при р<0,05. 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Доноры ОМЛ ОЛЛ ОЛЛ в ХЛЛ после ремиссии лечения Рис. 4. Число лимфоцитов после миграции в 1 мкл суспензии. их был снижен в среднем на 5% (р<0,05) по сравнению с лимфоцитами доноров (см. табл. 3). Нормоциты были округлой формы, с центрально расположенным ядром, форма которого повторяла форму клетки. Среди бластных форм преобладали широкоцитоплазматические клетки, в единичных случаях наблюдали формы с узким ободком цитоплазмы. По данным АСМ достоверных различий между значениями средней жесткости нормоцитов и бластов больных ОЛЛ и клетками доноров не установлено. Потенциал поверхности трансформированных лимфоцитов больных ОЛЛ возрастал на 51% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 3). Исследуя культуру лимфоцитов больных ОЛЛ на стадии ремиссии болезни при митогенной стимуляции, наблюдали присутствие трех субпопуляций клеточных форм, морфология которых не изменялась по сравнению с острым течением заболевания. Однако свойства поверхности этих клеток существенно отличались от контроля и от клеточных форм, характерных для острого течения заболевания. Для всех субпопуляций отмечали снижение жесткости поверхности: микроцитов – на 70% (р<0,05), нормоцитов – на 78% (р<0,05), бластов – на 58% (р<0,05) по сравнению с соответствующими субпопуляциями доноров (см. табл. 3). Потенциал 12 поверхности трансформированных лимфоцитов больных ОЛЛ в ремиссии возрастал на 240% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл. 3). При этом количество мигрировавших клеток уменьшилось на 16% (см. рис. 4). В культуре лимфоцитов больных ХЛЛ все клеточные формы были правильной округлой формы с ядром, занимающим большую часть клетки. Жесткость микроцитов, нормоцитов и бластов больных ХЛЛ уменьшилась соответственно на 43%, 72% и 80% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл. 3). Потенциал поверхности Кон А-трансформированных лимфоцитов больных ХЛЛ увеличился на 744% (р<0,05). Одновременно с увеличением заряда поверхности лимфоцитов больных ХЛЛ происходило снижение их двигательной активности на 25% по сравнению с контролем (см. рис. 4). Таким образом, в условиях митогенной стимуляции деления лимфоцитов больных различными типами лейкоза общая реакция клеток проявляется в увеличении заряда поверхности, снижении двигательной активности и уменьшении жесткости лимфоцитов в ряду микроциты – нормоциты – бласты. Нормоциты больных ОМЛ в отсутствие миелобластов приобретают функциональные характеристики близкие к нормоцитам здоровых людей. Механические и электрические свойства Кон А-трансформированных бластов больных ОЛЛ в ремиссии и ХЛЛ после лечения сопоставимы с аналогичными свойствами лимфобластов, циркулирующих в крови больных ОЛЛ. Следовательно, жесткость и заряд поверхности лимфоцитов могут выступать клеточными маркерами, указывающими на развитие опухолевого процесса в системе крови. Структурно-функциональные свойства ФГА-стимулированных лимфоцитов. В культуре лимфоцитов больных ОМЛ микроциты были округлой формы, со сниженным модулем упругости на 58% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (табл. 4). Форма нормоцитов больных ОМЛ была округлой, жесткость повышена на 29% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл. 4). В субпопуляции бластов больных ОМЛ встречались клетки, как с правильными округлыми контурами, так и овальной формы, цитоплазма и тех и других форм располагалась широким ободком вокруг ядра. Жесткость лимфобластов снижена на 50% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 4). Потенциал поверхности ФГА стимулированных лимфоцитов больных ОМЛ увеличился на 42% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 4). Число мигрировавших лимфоцитов снизилось на 33% по сравнению с группой доноров (рис. 5). В культуре лимфоцитов больных ОЛЛ на стадии острого течения заболевания форма клеток всех субпопуляций была округлой, ядро занимало большую часть клетки. Жесткость нормоцитов увеличилась на 10% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 4). Достоверных изменений модуля Юнга в субпопуляциях микроцитов и бластов не установлено. По13 Таблица 4. Величины модуля Юнга и ПП лимфоцитов в условиях стимуляции ФГА Модуль Юнга, мПА Группы ПП, мВ микроциты нормоциты бласты Контроль (доноры) 8,7±0,8 7,1±0,1 6,8±0,3 -41,3±0,7 ОМЛ 3,7±0,2* 8,3±0,7 3,4±0,4* -23,8±0,5* ОЛЛ 9,7±0,4 7,8±0,3* 6,8±0,1 -34,4±0,9* * ОЛЛ в ремиссии – 7,5±0,5 3,7±0,3 -5,6±0,8* * * * ХЛЛ после лечения 1,6±0,1 3,4±0,4 2,1±0,2 -10,7±0,7* Примечание: * – статистически достоверные различия между значениями лимфоцитов доноров и больных лейкозом по критерию Стьюдента при р<0,05. 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Доноры ОМЛ ОЛЛ ОЛЛ в ХЛЛ после ремиссии лечения Рис. 5. Число лимфоцитов после миграции в 1 мкл суспензии. тенциал поверхности субпопуляций лимфоцитов больных ОЛЛ увеличился на 17% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл. 4). В состоянии ремиссии у больных ОЛЛ под влиянием ФГА микроцитов не обнаружено. Нормоциты больных ОЛЛ в ремиссии имели овальную или вытянутую форму. Для бластов характерна округлая правильная форма ядра и ровные контуры цитоплазмы, которая располагалась тонким ободком. Встречались бластные формы с ядром, смещенным к периферии, и широким участком цитоплазмы. Достоверных различий между значениями жесткости нормоцитов больных ОЛЛ в ремиссии и доноров не выявлено. Жесткость лимфобластов снижена на 45% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 4). Потенциал поверхности субпопуляций лимфоцитов больных ОЛЛ в ремиссии увеличился на 86% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл. 4), миграционная активность лимфоцитов снизилась на 34% (р<0,05; см. рис. 5). В культуре лимфоцитов больных ХЛЛ микроциты были округлой формы, ядро занимало большую часть клетки. Форма нормоцитов овальная, ядро вытянуто по одной из осей, контуры цитоплазмы изрезаны. В лимфобластах ядро состояло из нескольких лопастей, широкий ободок 14 цитоплазмы был с многочисленными выростами по периферии. Модуль Юнга микроцитов, нормоцитов и бластов больных ХЛЛ снизился соответственно на 82%, 52% и 31% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 4). Потенциал поверхности трансформированных лимфоцитов больных ХЛЛ увеличился на 74% (р<0,05; см. табл. 4), число мигрировавших лимфоцитов снизилось на 39% (р<0,05) (см. рис. 5). Таким образом, на модели ФГА-стимулированных лимфоцитов установлено присутствие субпопуляций лимфоцитов с увеличенным потенциалом поверхности и сниженной миграционной активностью. Изменение жесткости в субпопуляциях клеток больных лейкозом происходит неоднозначно. В целом, проанализировав структурно-функциональную организацию лимфоцитов при развитии лимфопролиферативных процессов, выявлено сходство их свойств во время течения хронического лейкоза после лечения и острого лейкоза на стадии ремиссии болезни. В частности, для них характерно снижение миграционной активности клеток, увеличение потенциала поверхности, локализация элементов цитоскелета в околоядерной зоне и образование на плазмалемме глобул различной конфигурации. На моделях митоген-стимулированных лимфоцитов показано, что пролиферация как модельных лимфобластов, так и прошедших опухолевое перерождение в естественных условиях сопровождается снижением жесткости и повышением потенциала поверхности клеток. ВЫВОДЫ 1. Развитие острых и хронических лимфопролиферативных процессов сопровождается появлением в периферическом русле лимфоцитов с повышенным зарядом клеточной поверхности. 2. Жесткость лимфоцитов при развитии острого миелобластного и хронического лимфобластного лейкоза повышена, однако острый лимфобластный тип пролиферации, как в стадии обострения, так и в ремиссии характеризуется появлением лимфоцитов со сниженной жесткостью. 3. В норме (у здоровых людей-доноров) цитоархитектоника мембран лимфоцитов представлена однотипными глобулярными структурами округлой формы. При развитии лимфопролиферативных процессов на поверхности лимфоцитов появляются либо скопления дугообразных структур (острый миелобластный тип) и конгломераты нерегулярной формы (хронический лимфобластный тип), либо поверхность теряет большую часть глобулярных структур (острый лимфобластный тип). 4. Развитие острых форм лимфо-и миелобластного типов пролиферации сопровождается увеличением миграционной активности лимфоцитов, в то же время течение хронического типа после лечения и острого лимфобластного лейкоза на стадии ремиссии болезни – снижением двигательной активности клеток. 15 5. При развитии острого лимфопролиферативного процесса элементы цитоскелета в лимфобластах собраны в тонкие пучки, расходящиеся от ядра радиально, в результате чего клетки приобретают неправильные контуры с вытянутыми краевыми участками цитоплазмы. При развитии хронического типа лимфопролиферативного процесса элементы цитоскелета в лимфоцитах собраны в короткие пучки, сосредоточенные в околоядерном пространстве, при этом форма клеток чаще округлая и реже неправильная. 6. В митогенстимулированных лимфоцитах, как у здоровых людей, так и при лимфопролиферативных процессах установлено повышение потенциала поверхности и снижение миграционной активности клеток. 7. Цитоархитетконика поверхности Кон А-стимулированных лимфоцитов представлена морфологическими образованиями нерегулярной формы. Рельеф поверхности ФГА-стимулированных лимфоцитов был сглажен, однако в единичных случаях идентифицировали морфологические структуры, не изменяющие общую картину цитоархитектоники. 8. На моделях митогенстимулированной пролиферации установлено снижение жесткости лимфоцитов при хроническом типе лимфопролиферативных состояний. В условиях острого типа лимфобластной пролиферации жесткость лимфоцитов изменяется в зависимости от природы митогена и субпопуляции клеток. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. С целью ранней диагностики развития лейкозов, риска метастазирования и выявления индикаторов развития лейкостазов может быть рекомендован «Способ прогнозирования течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза» (патент РФ № 2541189), основанный на комплексном подходе изучения миграционной активности, механических и электрических свойств клеточной поверхности. 2. С целью изучения морфофизиологических параметров клеток крови, при развитии патологий может быть рекомендовано использование инструментария на базе АСМ, в частности измерение поверхностного потенциала и модуля Юнга лимфоцитов, а также анализ архитектоники мембран. ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ АСМ – атомно-силовая микроскопия Кон А – конканавалин А ОЛЛ – острый лимфобластый лейкоз ОМЛ – острый миелобластный лейкоз ПП – потенциал поверхности ФГА – фитогемагглютинин 16 ХЛЛ – хронический лимфобластный лейкоз ХМЛ – хронический миелобластный лейкоз Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. мероприятие 1.3.2. «Проведение научных исследований целевыми аспирантами», соглашение № 14.132.21.1320 от 01.10.2013. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Патент на изобретение РФ № 2398234 «Способ исследования нативных клеток», заявка № 2009125268, дата приоритета 01.07.2009. Авторы: Федорова М.З., Скоркина М.Ю., Чернявских С.Д., Сладкова Е.А., Забиняков Н.А. 2. Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Чернявских С.Д., Сладкова Е.А., Забиняков Н.А. Методика оценки морфометрических параметров нативных клеток крови с использованием АСМ // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 150, № 8. – С. 238-240. 3. Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Сладкова Е.А., Забиняков Н.А. Упругие свойства клеток крови больных лейкозом // Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2010». – Москва. – 2010. – Т. 1. – С. 349-352. 4. Сладкова Е.А., Забиняков Н.А. Использование наномеханического сенсора для изучения морфофункциональных профилей клеток крови // Всероссийский конкурс научно-исследовательских работ студентов вузов в области нанотехнологий и наноматериалов. – Москва. – 2010. – С. 210-214. 5. Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Чернявских С.Д., Забиняков Н.А., Сладкова Е.А. Сравнительная оценка морфофункциональных характеристик нативных и фиксированных эритроцитов // Цитология. – 2011. – Т. 53, № 1. – С. 17-21. 6. Патент на изобретение РФ № 2466401 «Способ определения упругости клеток крови», заявка № 2011109741 от 15.03.2011. Авторы: Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Сладкова Е.А., Забиняков Н.А. 7. Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Муравьев А.В., Сладкова Е.А. Использование наномеханического сенсора для изучения морфофункциональных свойств лимфоцитов здоровых доноров и больных хроническим лимфобластным лейкозом // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2012. – № 3. – С. 172-175. 8. Сладкова Е.А. Мембранный потенциал и упругие свойства лимфоцитов больных острым лимфобластным лейкозом // Материалы VII сибирского съезда физиологов. – Красноярск. – 2012. – С. 483-484. 17 9. Сладкова Е.А. Сравнительная характеристика архитектоники лимфоцитов здоровых доноров и больных острым лимфобластным лейкозом // XVII Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2012). – Черноголовка. – 2012. – С. 488-489. 10. Сладкова Е.А. Морфологические параметры и модуль упругости лимфоцитов, активированных митогенами // Сб. мат. 16-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». – Пущино. – 2012. – C. 444. 11. Сладкова Е.А. Роль длины микротрубочек и морфологии клеточной поверхности в подвижности лимфоцитов, трансформированных митогенами // Сборник материалов X Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии Коми «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике». – Сыктывкар. – 2012. – С.218-220. 12. Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю. Структурно-функциональные особенности лимфоцитов больных лимфобластным лейкозом // Цитология. – 2013. – Т. 55, № 6. – С. 388-393. 13. Патент на изобретение РФ № 2541189 «Способ прогнозирования течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза», заявка № 2013131646 от 09.07.2013. Авторы: Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю., Шамрай Е.А. 14. Сладкова Е.А. Влияние митогенов на структуру и механические свойства плазмалеммы лимфоцитов больных ОЛЛ // Сборник материалов 17-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». – Пущино. – 2013. – C. 453-454. 15. Сладкова Е.А. Сравнительная оценка морфофизиологических параметров лимфоцитов больных ОЛЛ и ОМЛ методом АСМ // XVIII Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2013). – Черноголовка. – 2013. 16. Сладкова Е.А. Сравнительная оценка локомоторного потенциала лимфоцитов больных ОЛЛ, ХЛЛ и ОЛЛ в ремиссии // Сборник материалов IX Международной конференции «Микроциркуляция и гемореология». – Ярославль. – 2013. – С. 43. 17. Сладкова Е.А. Влияние фитогемагглютинина на структурно-механические свойства клеточной поверхности лимфоцитов // Сборник материалов XXII съезда физиологического общества имени И.П. Павлова. – Москва-Волгоград, 2013. – С. 486-489. 18. Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю. Оценка поверхностного потенциала лимфоцитов больных лейкозом методом зонда Кельвина // Биофизика. – 2014. – Т. 59, вып. 2. – С. 310-313. 19. Сладкова Е.А. Использование модифицированного сенсора для определения жесткости клеточной поверхности // Сборник материалов 18 IV Международной научно-практической конференции «Научные перспективы XXI века. Достижения и перспективы нового столетия». – Новосибирск. – 2014. – С. 151-152. 20. Сладкова Е.А. Оценка структурно-функционального статуса митоген-трансформированных лимфоцитов // Научный результат. – 2014. – № 1 (1). – С. 12-20. Соискатель Е.А.Сладкова
