1 003862 2 Настоящее изобретение относится к ком-

1
Настоящее изобретение относится к композиции и к терапевтическому использованию
ингибиторов каскада реакций лимфотоксина для
лечения фолликулярных лимфом.
Предпосылки создания изобретения
Цитокины, родственные фактору некроза
опухоли (TNF), являются медиаторами защиты
хозяина и регуляции иммунного ответа. Члены
этого семейства существуют в мембранноассоциированных формах, действуя локально
посредством межклеточного контакта, или в
формах секретированных белков, способных
диффундировать в более удаленные тканимишени. Параллельное семейство рецепторов
сигнализирует о присутствии этих молекул, что
приводит к инициации гибели клеток или к клеточной пролиферации и дифференцировке в
тканях-мишенях. В настоящее время известно,
что члены семейства лигандов TNF и рецепторов
составляют, по крайней мере, 11 пар "рецепторлиганд", включая TNF:TNF-R; LT-α:TNF-R; LTα/β:LT-β-R; FasL:Fas; CD40L:CD40; CD30L:CD30;
CD27L:CD27; 0X40L:0X40 и 4-1BBL:4-1BB.
Члены семейства TNF могут быть наилучшим образом описаны как главные "переключатели" в иммунной системе, контролирующие
выживание и дифференцировку клеток. В настоящее время известно, что секретируемыми
цитокинами являются лишь TNF и LTα (лимфотоксин-α) в отличие от других многочисленных
мембранно-ассоциированных членов семейства
TNF. Мембранная форма TNF была хорошо
охарактеризована и, вероятно, она играет уникальную биологическую роль, тогда как секретированный TNF действует, в основном, как
сигнал "тревоги", сообщаемый клеткам, более
удаленным от участка возникновения события.
Таким образом, секреция TNF может усиливать
событие, приводящее к хорошо описанным изменениям в выстилке кровеносных сосудов и к
воспалительному состоянию клеток. В противоположность этому, мембранно-ассоциированные члены этого семейства посылают сигналы
через рецепторы типа TNF только тем клеткам,
которые находятся в непосредственном контакте с ними. Так, например, Т-клетки обеспечивают CD40-опосредованную "помощь" только для
тех В-клеток, которые вступают в прямой контакт
посредством
когнатных
TCRвзаимодействий (TCR определен как Тклеточный рецептор). Аналогичный межклеточный контакт ограничивает способность индуцировать гибель клеток, опосредованную хорошо изученной Fas-системой.
Большинство
мембранно-ассоциированных комплексов LTα/β ("поверхностный LT")
имеет стехиометрию LTα1/β2 (Browning et al.,
Cell. 72, pp.847-56 (1993); Browning et al., J. Immune-1., 154, pp. 33-46 (1995)). Поверхностные
лиганды LT не связываются с TNF-R с высокой
аффинностью и не активируют TNF-R-опо-
003862
2
средованную передачу сигнала. Однако, рецептор для LTβ (LTβ-R) связывается с комплексами
этого поверхностного лимфотоксина с высокой
аффинностью (Crowe et al., Science, 264, pp. 70710 (1994)).
Передача сигнала посредством LTβ-R, подобно TNF-R-oпocредованной передаче сигнала,
имеет антипролиферативный эффект и может
оказывать цитотоксическое действие на опухолевые клетки. В одновременно рассматриваемой
заявке США рег.№ 08/378968, поданной авторами настоящего изобретения, описаны композиции и методы для селективной стимуляции
LTβ-R с использованием LTβ-R-активирующих
агентов. LTβ-R-активирующие агенты могут
быть использованы для ингибирования роста
опухолевых клеток без коактивации TNF-Rиндуцированного каскада провоспалительных
или иммунорегуляторных реакций.
Недавние исследования, относящиеся к
доставке генов, позволяют сделать предположение об определенной роли LTα/β в развитии
вторичных лимфоидных органов (Banks et al., J.
Immunol., 155, pp. 1685-1693 (1995); De Togni et
al., Science, 264, pp. 703-706 (1994)). Действительно, у LTα-дефицитных мышей отсутствуют
лимфоузлы (ЛУ) и бляшки Пейера (БП). Кроме
того, селезенка этих мышей имеет нарушенную
структуру, и экспрессия функциональных маркеров в клетках маргинальной зоны селезенки
является измененной. (Banks et al., 1995; De
Togni et al., Science, 264, pp. 703-706 (1994),
Matsumoto et al., Science, 271, pp. 1289-1291
(1996)). Причем, ни одна из этих характеристик
не была описана для каких-либо мышей, дефицитных по TNF-рецептору. (Erickson et al., Nature, 372, pp. 560-563 (1994); Pfeffer et al., Cell,
73, pp. 457-467 (1993); Rothe et al., Nature, 364,
pp. 798-802 (1993)). Недавно авторами настоящего изобретения была выявлена роль комплексов мембранных LTα/β в развитии вторичного
лимфоидного органа благодаря установлению
того факта, что у потомства мышей, которому
во время беременности инъецировали растворимую форму мышиного LTβ-R, соединенного с
Fc-фрагментом IgGl человека (LTβ-R-Ig), отсутствовало большинство лимфоузлов, и была обнаружена нарушенная структура селезенки.
(Rennert et al., 1996, "Surface Lymphotoxin alpha/beta complex is required for the development
of peripheral lymphoid organs." J.Exp. Med. 184:
1999-2006). В другом исследовании было показано, что трансгенные мыши, имеющие аналогичную LTβ-R-Ig-конструкцию, которая начинает экспрессироваться через три дня после их
рождения, имеют LN. Однако структура их селезенки была разрушена и некоторые маркеры
клеток маргинальной зоны селезенки не экспрессировались (Ettinger et al., "Disrupted splenic architecture, but normal lymph node development in mice expressing a soluble LTβ-R/IgGl fusion protein".,
3
Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 93: 13102-7). Все эти
данные указывают на то, что имеется лишь временная потребность в функции мембранного LT для
опосредованного действия на развитие вторичных
лимфоидных органов, но не на структуру селезенки.
TNF-система также может участвовать в
развитии селезенки. Клетки маргинальной зоны
селезенки у TNF-дефицитных мышей не экспрессируют макрофагальных маркеров или
MAdCAM-1 (Alexopoulou et al., 60th Int. TNF
Congress, Eur. Cytokine Network, pp. 228 (1996);
Pasparakis et at., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, pp. 239 (1996)). У TNF-R55дефицитных мышей также отсутствует MadCAM-1 (но не МОМА-1), дающий окрашивание
в маргинальной зоне селезенки (Neumann et al.,
J.Exp. Med. 184, pp. 259-264 (1996), Matsumoto et
al., Science, 271, pp. 1289-1291 (1996)). Было
показано, что экспрессия этих маркеров в селезенке у TNF-R75-дефицитных мышей является
нормальной. Matsumoto et al., Science, 271, pp.
1289-1291 (1996)).
Лимфоидоподобные ткани возникают не
только в ходе процессов развития, но также и
при некоторых патологических состояниях, таких как хроническое воспаление, то есть, процесс, который недавно был определен как неолимфоорганогенез (Picker & Butcher, Annu.Rev.
Immunol., 10, pp.561-591 (1992); Kratz et al., J.
Exp. Med., 183, pp.1461-1471 (1996)). Очевидно,
что члены семейства TNF оказывают влияние на
такие процессы. У мышей, трансгенных по гену
LTα, находящемуся по контролем промотора
крысиного инсулина (RIP-LT), развивались индуцированные лимфотоксином хронические
воспалительные поражения со свойствами организованной лимфоидной ткани (Kratz et al., J.
Exp. Med., 1183, pp.1461-1471 (1996); Picarella et
al., Proc.Natl. Acad. Sci., 89, pp. 1003610040(1992)).
Оценка функции LT во время Тклеточнозависимого иммунного ответа, проводимая с использованием LTα-дефицитных мышей, показала необходимость LT для образования GC, вероятно, для поддержания организованной структуры фолликулярных дендритных
клеток (ФДК) и для гуморальных ответов.
(Banks et al., J. Immunol., 155, pp. 1685-1693
(1995), Matsumoto et al., Science, 271, pp. 12891291 (1996); Matsumoto et al., Nature, 382,
pp.462-466 (1996)). У TNF-R55-дефицитных
мышей также отсутствовали ФДК, наблюдалось
недостаточное развитие GC и недостаточное
развитие оптимального гуморального ответа на
овечьи эритроциты (SRBC). Это дает основание
предположить, что TNF-R55 может быть стимулирован сигналами, передаваемыми растворимым LT или TNF для большинства из этих ответов (Le Hir et al., J.Exp.Med. 183, pp.2367-2372
(1996). Alexopoulou et al., 60th Int. TNF Congress,
003862
4
Eur. Cytokine Network, pp. 228 (1996); Pasparakis
et al., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network pp. 239 (1996)).
LTβ-рецептор, член TNF-семейства рецепторов, специфически связывается с поверхностными LT-лигандами. LTβ-R связывается с гетеромерными комплексами LT (преимущественно,
с LTαl/β2 и LTα2/βl), но не связывается с TNF
или LTα (Crowe et al., Science, 264, pp. 707-10
(1994)). мРНК LTβ-R обнаружены в селезенке,
тимусе и в основных органах человека, участвующих в иммунной системе. Хотя исследования экспрессии LTβ-R проводились на ранних
стадиях, однако очевидно, что характер экспрессии LTβ-R является аналогичным характеру
экспрессии, описанному для TNF-R55, за исключением того, что LTβ-R отсутствует у Т- и
В-клеток и Т-клеточных и В-клеточных линий
периферической крови.
Комплексы лимфотоксина (LT) клеточной
поверхности были охарактеризованы в СD4+-Тклеточных гибридомах (11-23.D7), которые экспрессируют высокие уровни LT (Browning et al.,
J. Immunol., 147, pp.1230-37 (1991); Androlewicz
et al. J.Biol.Chem., 267, pp. 2542-47 (1992), обе
эти работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Экспрессия и биологическая
роль LTβ-R, субъединиц LT и комплексов поверхностных LT описаны C.F. Ware и др. "The
ligands and receptors of the lymphotoxin system" в
Pathways for Cytolysis, Current Topics Microbiol.
Immunol., Springer-Verlag, pp.175-218 (1995), эта
работа вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Индуцирование экспрессии LTα и секреция LTα осуществляется, главным образом, активированными Т- и В-лимфоцитами и природными клетками-киллерами (NK). Что касается Т
клеток-хелперов, то, очевидно, что LTα продуцируется Th1-клетками, но не Тh2-клетками.
LTα также был обнаружен в меланоцитах. Микроглиальные клетки и Т-клетки на участках поражения пациентов с рассеянным склерозом
могут быть окрашены антисывороткой против
LTa (Selmaj et al., J. Clin. Invest., 87, pp.949-954
(1991)).
Лимфотоксин β (также называемый р33)
экспрессируется на поверхности человеческих и
мышиных Т-лимфоцитов, Т-клеточных линий,
В-клеточных линий и лимфокин-активированных клеток-киллеров (LAK). LTβ является объектом изобретения в одновременно рассматриваемой международной заявке PCT/US91/04588,
поданной авторами настоящего изобретения и
опубликованной 9 января 1992 г. под номером
WO92/00329; и в PCT/US93/11669, опубликованной 23 июня 1994 г. под номером WO
94/13808, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Поверхностные LT-комплексы экспрессируются, главным образом, активированными Т-
5
клетками(хелперами, Th1 и клетками-киллерами) и
В-лимфоцитами
и
природными
клеткамикиллерами (NK), как было определено с помощью
FACS-анализа или с помощью иммуногистологии с
использованием антител против LT или растворимых гибридных белков LTβ-R-Ig. В одновременно
рассматриваемой заявке США рег.№ 08/505606, поданной 21 июля 1995 г., описаны композиции и методы с использованием растворимых LTβрецепторов и анти-LTβ-рецепторов, а также лигандспецифических антител в качестве терапевтических
агентов для лечения иммунологических заболеваний, опосредованных Th1-клетками. Были также
описаны поверхностные LT на клонах человеческих
цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), активированных периферических мононуклеарных Тлимфоцитах (ПМЛ), IL-2-активированных лимфоцитах периферической крови (клетки LAK), активированных митогенами фитоллаки или анти-СD40активированных периферических В-лимфоцитах
(ПВЛ) и на различных лимфоидных опухолях Т- и
В-клеточных линий дифференцировки. Сцепление
аллоантигеннесущих клеток-мишеней специфически индуцирует экспрессию поверхностных LT клонами CD8+- и СD4+-ЦТЛ.
Авторами настоящей заявки описано несколько иммунологических функций для поверхностного LT, а также показано действие
LTα/β-связывающих реагентов на генерирование и характер иммуноглобулинового ответа,
сохранение клеточной организации вторичных
лимфоидных тканей, включая действие на состояние дифференцировки фолликулярных дендритных клеток и образования зародышевых
центров, а также на уровни экспрессии аддрессина, который влияет на клеточный транспорт.
Таким образом, заявителями было установлено,
что агенты, связывающиеся с LTα/β-и LTαрецептором, могут быть использованы в терапевтических целях.
Исследования показали, что В-клетки активируются в лимфоузлах (ЛУ) и в селезенке
после взаимодействия с различными антигенами. В специфических структурах, называемых
зародышевым центром, которые образуют в ЛУ
и в селезенке области, богатые В-клетками,
формируются зрелые В-клетки и В-клетки памяти1. В-клетки способны трансформироваться
в опухоли в большинстве участков в процессе
их развития2. Трансформация В-клеток приводит к образованию лимфом, и лимфомы, происходящие от В-клеток в зародышевых центрах,
часто называют фолликулярными лимфомами.
Точное определение изменения направления
дифференцировки лимфом с образованием различных подгрупп этих лимфом находится уже
на стадии осуществления, поскольку было обнаружено дополнительное число поверхностных
маркеров, позволяющих более точно установить
происхождение клеток. Фолликулярные лимфомы могут быть разделены на ряд подгрупп, ис-
003862
6
ходя из стадии развития или типа пролифирирующей В-клетки, и этот прогноз зависит от
типа клетки. Стандартный курс химиотерапии
может оказывать благоприятное влияние на лечение многих пациентов с клетками низкой
дифференцировки. Тем не менее, часть этих
пациентов остается невосприимчивой к химиотерапии и имеет неблагоприятный прогноз.
Поэтому, несмотря на прогресс в лечении
опухолевых заболеваний, все еще остается актуальной необходимость в разработке методов
лечения этих опухолей, а особенно тех фолликулярных лимфом, которые обычно не восприимчивы к химиотерапии, а также схем лечения,
которые давали бы меньше побочных эффектов,
чем это наблюдается при существующих методах терапии.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам и к композициям для лечения фолликулярных лимфом, которые позволяют решить
некоторые проблемы, связанные с существующими методами терапии, и предусматривают
проведение альтернативной терапии для пациентов с фолликулярными лимфомами, не восприимчивыми к традиционной химиотерапии .
В некоторых вариантах своего осуществления, настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума с фолликулярной
лимфомой, включающим введение указанному
индивидууму эффективного количества композиции, которое блокирует взаимодействие гетеромера LT-α/β с его рецептором. Предпочтительными композициями в различных вариантах
осуществления изобретения являются, но не
ограничиваются ими, растворимые рецепторы
лимфотоксина-β, антитела, направленные против LTβ-рецептора и антитела, направленные
против поверхностного LT-лиганда. Более
предпочтительными являются растворимые рецепторы лимфотоксина-β, имеющие лигандсвязывающий домен, который может селективно связываться с поверхностным LT-лигандом,
таким как, например, LTβ-R в растворимой
форме, присоединенный к Fc-домену иммуноглобулина человека. Кроме того, предпочтительными композициями являются моноклональные антитела, которые направлены против
LTβ-рецептора, включая гуманизированные
антитела, химерные антитела или антитела, модифицированные каким-либо другим способом.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения заявлены способы лечения индивидуумов с фолликулярными лимфомами, где блокирующие агенты вводят до тех
пор, пока не наступит регрессия или прекращение роста опухоли. В некоторых вариантах
осуществления настоящего изобретения, агенты, блокирующие каскад реакций LT, вводят в
комбинации с другими известными агентами,
которые могут быть использованы для лечения
7
опухолей, такого как, например, курс химиотерапии. Кроме того, в некоторых вариантах, способы настоящего изобретения могут предусматривать дополнительное лечение индивидуума с
применением лучевой терапии или трансплантации костного мозга.
В еще одном варианте настоящего изобретения, заявленные способы включают введение
LTβ-R-блокирующих агентов в сочетании с
агентами, блокирующими каскады реакций других членов семейства TNF. Так, например, TNFблокирующие агенты могут быть введены в
комбинации, одновременно или последовательно, с блокирующими агентами настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к
применению композиции, блокирующей взаимодействие LT-β с его рецептором, для лечения
индивидуума с фолликулярной лимфомой.
Подробное описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к способам и к композициям для лечения фолликулярных лимфом.
Термины "иммуноглобулиновый ответ"
или "гуморальный ответ", используемые в настоящем описании, означают иммунологический ответ животного на чужеродный антиген, в
результате чего у этого животного продуцируются антитела к чужеродному антигену. В эффективном продуцировании высокоаффинных
антител важную роль играют Т-клетки-хелперы
класса Th2.
Термин "зародышевый центр", используемый в нестоящем описании, означает вторичный В-клеточный фолликул, который образуется после иммунизации антигеном. Появление
этого гистологического участка коррелирует с
генерированием оптимальной иммунологической памяти, переключением изотипа, соматической сверхмутацией и, тем самым, с "созреванием аффинности" гуморального ответа.
Термины "маргинальная зона" или "область типа маргинальной зоны", используемые в
настоящем описании, означают гистологически
описанные компартменты вторичных лимфоидных тканей, состоящих, главным образом, из
макрофагов маргинальной зоны (MZM), металлофильных макрофагов (ММ), В-клеток маргинальной зоны и ретикулярных клеток, а также
из Т-клеток и дендритных клеток. Артериальный кровоток поступает в маргинальные синусы, что, тем самым, открывает для антигенов
прямой доступ к этим клеткам и стимулирует
клеточные реакции с антигенами в этой области.
Термин "Т-клетки-хелперы (Th)", используемый в настоящем описании, означает функциональный субкласс Т-клеток, которые способствуют генерированию цитотоксичных Тклеток и которые кооперируются с В-клетками
для стимуляции продуцирования антител. Тклетки-хелперы распознают антиген в ассоциа-
003862
8
ции с молекулами МНС класса II, и передают
контакт-зависимые и контакт-независимые (цитокиновые) сигналы эффекторным клеткам.
Термин "Fc-домен" антитела, используемый в настоящем описании, означает часть молекулы, имеющую шарнирные домены, СН2-и
СН3-домены, но не имеющую антигенсвязывающих сайтов. Этот термин также означает
эквивалентные области IgM или антитела другого изотипа.
Термин "антитело против LTβ-рецептора",
используемый в настоящем описании, означает
любое антитело, которое специфически связывается, по крайней мере, с одним эпитопом LTβрецептора.
Термин "антитело против LT", используемый в настоящем описании, означает любое
антитело, которое специфически связывается,
по крайней мере, с одним эпитопом LTα, LTβ
или LTα/β-комплекса.
Термин "передача сигнала LTβ-R", используемый в настоящем описании, означает молекулярные реакции, ассоциированные с каскадом
реакций LTβ-R, и последующие молекулярные
реакции, протекающие в результате этих реакций.
Термин "LTβ-R-блокирующий агент", используемый в настоящем описании, означает
агент, который может ослаблять связывание
лиганда с LTβ-R, образование LTβ-R-кластера
на поверхности клеток или передачу LTβ-Rопосредованного сигнала, либо агент, который
может влиять на интерпретацию этого LTβ-Rсигнала внутри клетки.
LTβ-R-блокирующий агент, который действует на стадии связывания лиганда с рецептором, может ингибировать связывание LTлиганда с LTβ-R, по крайней мере, на 20%.
Примерами LTβ-R-блокирующих агентов являются растворимые молекулы LTβ-R-Fc и антитела против LTα, LTβ, LTα/β и LTβ-R. Предпочтительными являются антитела, которые не
вступают в перекрестную реакцию с секретируемой формой LTα.
Термин "биологическая активность LTβ-R"
означает: 1) способность молекулы LTβ-R или
его производного конкурировать за связывание
растворимого или поверхностного LT-лиганда с
растворимыми или поверхностными LTβ-Rмолекулами; или 2) активность нативного LT,
такую, как способность стимулировать иммунорегуляторный ответ или цитотоксическую активность.
Термин "LT-лиганд" означает гетеромерный LTα/β-комплекс или его производное, которое может специфически связываться с LTβрецептором.
Термин "лигандсвязывающий домен LTβR" означает фрагмент или фрагменты LTβ-R,
9
которые участвуют в специфическом распознавании LT-лиганда и во взаимодействии с ним.
Термин "поверхностный LT" или "поверхностный LT-комплекс" означает комплекс, содержащий субъединицы LTα и мембранноассоциированные субъединицы LTβ, (включая
мутантные, модифицированные и химерные
формы одной или нескольких субъединиц), которые локализуются на клеточной поверхности.
Термин "поверхностный LT-лиганд" означает
поверхностный комплекс LT или его производное, которое может специфически связываться с
LTβ-рецептором.
Термин "индивидуум" или "объект" относится к животному или к одной или нескольким
клеткам, происходящим от животного. Таким
животным, предпочтительно, является млекопитающее. Клетки могут находиться в любой
форме, включая, но не ограничиваясь ими, клетки, присутствующие в ткани; клеточные кластеры; иммортализованные, трансфицированные
или трансформированные клетки; и клетки,
происходящие от животных, которые могут
быть физически или фенотипически изменены.
Как обсуждалось выше, трансформация Вклеток приводит к образованию лимфом, а
трансформация В-клеток, происходящих от зародышевых центров, то есть, от специфических
структур, обнаруживаемых в богатых Вклетками областях лимфоузлов и селезенки,
приводит к образованию фолликулярных лимфом. Для своего созревания и пролиферации, Вклетки зародышевых центров требуют специфической среды, и фолликулярные дендритные
клетки обеспечивают как присутствие антигена,
так и, по всей вероятности, передачу специфических сигналов для В-клеток зародышевых
центров, что стимулирует созревание, выживание и пролиферацию этих клеток. Исследование
мышей SJL со спонтанной формой ретикулоклеточной саркомы (RCS, ранее принятое обозначение опухолей этого типа) привело к получению трансплантабельных, а также in viroклеточных линий RCS (CRCS), которые служат
моделью для взаимодействий между хозяином и
опухолью3,4. Эти RCS часто продуцируются в
лимфоузлах (ЛУ) у мышей SJL и являются гетерогенными, то есть, содержащими различные
гемопоэтические клетки. Рассматриваемые данные указывают на то, что эти лимфомы происходят из зародышевых центров и, для своего
выживания и пролиферации, требуют передачи
соответствующих сигналов, обеспечиваемой
хозяином5,6. Возможность манипулировать с
этими сигналами позволяет ингибировать рост
указанных опухолей.
Очевидно, что первостепенное значение в
образовании и функции зародышевого центра
имеет один тип клеток, называемых фолликулярными дендритными клетками (ФДК). За выживание и поддержание жизнеспособности В-
003862
10
клеток зародышевого центра ответственны и
многие другие факторы. А именно, такими факторами являются члены семейства цитокинов
TNF, которые представляют собой поверхностные сигнал-передающие лиганды и которые
находятся на поверхности В-клеток, например,
CD40, и на поверхности ФДК, например, TNF и
рецепторы лимфотоксина (LT). Мыши, дефицитные по LT- или TNF-системе, являются дефектными по ФДК, и поэтому у них отсутствуют зародышевые центры7. Очевидно, что TNFсистема имеет решающее значение для развития
ФДК, хотя, вероятно, существует и другая ее
прямая роль. Очевидно, что более важная роль
LT-системы заключается в поддержании ФДК в
функциональном состоянии. LT-система участвует в передаче сигнала от различных лигандположительных лимфоцитов к рецептор-положительным клеткам, которые по всей вероятности, происходят не от костного мозга, то есть,
возможно, они происходят от ФДК, что способствует поддержанию ФДК в их полностью
функциональном зрелом состоянии. Заявителями было также обнаружено, что блокирование
этого каскада реакций, например, антителами
против LT-лигандов или растворимого гибридного белка "рецептор-иммуноглобулин", приводит к потере зрелых ФДК (Mackay & Browning,
1998 Nature, V.395, pp.26-27, "Turning off Follicular Dendritic Cells"). Кроме того, ингибирование каскада реакций LT приводит к предотвращению образования зародышевого центра и
к некоторому нарушению структуры селезенки8.
В настоящей заявке, заявители впервые
указывают на то, что ингибиторы каскада реакций LT могут способствовать нарушению взаимодействий между фолликулярной В-клеточной
лимфомой и ее средой, то есть, ФДК, и способствуют замедлению или прекращению роста
опухолей. Поэтому, такие ингибиторы могут
быть использованы для лечения трудноизлечимых лимфом, либо для первичной терапии, либо
в дополнение к стандартному курсу химиотерапии. Хотя специалистами было, в частности,
высказано предположение, что активация каскада реакций LT может быть полезной для противоопухолевой терапии, однако, авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что кратковременное блокирование
каскада реакций LT может приводить к замедлению или к прекращению роста опухолей,
включая, например, фолликулярные лимфомы.
В более широких вариантах своего осуществления, настоящее изобретение относится к
способам лечения индивидуумов с опухолями
или лимфомами, а в частности, с фолликулярными лимфомами, путем введения эффективного количества композиции, ингибирующей каскад реакций LT. Специфические ингибирующие
омпозиции могут содержать растворимый LTβрецептор; гибридные белки, содержащие LTβ-R;
11
антитела против LTβ-R и антитела против LTлиганда. Такой ингибирующей композицией,
предпочтительно, является фармацевтически
приемлемый носитель. Предпочтительным индивидуумом, подвергаемым лечению, является
млекопитающее, а наиболее предпочтительно,
человек.
Способ настоящего изобретения предусматривает введение композиций настоящего
изобретения индивидууму до тех пор, пока не
будет наблюдаться определенная степень регрессии опухоли или прекращение ее роста. Продолжительность лечения может широко варьироваться, и такое лечение может продолжаться
от нескольких недель до нескольких месяцев, а,
в некоторых случаях, даже больше. Каждый
специалист может определить, когда именно
происходит регрессия опухоли или прекращение ее роста, и для этого может быть использован любой из известных методов. Использование FACS-маркеров для разделения В-лимфом
на подгруппы дает значительные преимущества,
и можно предполагать, что лимфомы определенных подтипов будут наиболее восприимчивыми к терапии этого типа.
Также вероятно, что другие регуляторные
молекулы иммунной системы, такие как другие
члены семейства TNF, могут участвовать в сохранении структуры органов иммунной системы, а поэтому они вносят свой вклад в обеспечение благоприятного окружения для пролиферации лимфом. Следовательно, совместное ингибирование каскадов реакций LT и других реакций может способствовать эффективному лечению некоторых индивидуумов. Так, например, могут быть использованы ингибиторы каскада реакций LT в комбинации с блокаторами
каскада реакций лигандов CD40/CD40. Может
быть использована любая композиция, которая
блокирует нужный каскад реакций, такая как,
например, антитела, растворимые лиганды или
рецепторы. Может оказаться предпочтительным
вводить антитела против лигандов CD40 в комбинации с ингибиторами каскада реакций LT.
При введении более, чем одного блокатора каскада реакций членов TNF, эти композиции могут быть, введены, в основном, одновременно,
или, альтернативно, эти блокаторы могут быть
введены последовательно. Каждый специалист
может легко установить наиболее эффективный
курс лечения для данного пациента, исходя из
конкретной опухоли, подвергаемой лечению, и
состояния пациента.
Для устранения остаточной опухоли после
проведения лечения композициями настоящего
изобретения, может быть назначен курс стандартной химиотерапии, либо, в некоторых случаях, эта терапия может быть использована одновременно с введением композиций настоящего изобретения или до их введения. Ингибиторы
каскада реакций LT могут быть использованы
для прекращения роста лимфомы перед прове-
003862
12
дением стандартного курса химиотерапии. Вероятно, что подавление сигналов, стимулирующих рост/выживание клеток может делать лимфому более восприимчивой к химиотерапевтическим агентам, а поэтому, предпочтительно,
чтобы ингибитор каскада реакций LT был введен перед использованием традиционных химиотерапевтических агентов.
Пример 1. Обработка RCS-опухолей у
мышей SJL ингибитором каскада реакций LT
приводит к уменьшению общего ЛУ/размера
опухоли.
Мышей SJL обрабатывали 0,3-0,4 мг мышиного LTβR-hIgG1-гибридного белка посредством внутрибрюшинной инъекции либо за три
дня до трансплантации опухоли (день 3, Д-3),
либо во время трансплантации (ДО), либо через
3 дня после трансплантации (ДЗ). Трансплантацию опухоли осуществляли, в основном, как
описано в литературе9. Мышам было внутривенно (i.v.) инъецировано 5 х 106 RCS-клеток с
низким содержанием Т-клеток, и этих мышей
оставляли для стимуляции и роста опухолей в
соответствующих органах. Через 5-7 дней мезентриальные, плечевые и подмышечные лимфоузлы (ЛУ) иссекали и определяли их массу
как процентное отношение к общей массе тела.
Из табл. 1 видно, что во всех экспериментах
размер ЛУ был уменьшен. В 1 из 3 экспериментов, размер селезенки был также уменьшен, однако при этом уменьшение массы селезенки
было незначительным. Снижение массы ЛУ
варьировалось от около 50%, при введении одной дозы, и до 80-90%, при введении многократных доз.
Таблица 1. Ингибирующее действие LTβR-Ig на рост RCS у
нормальных мышей SJL
Мыши, инъецированные: ЛУ Wta(n) p
Селезенка Wta(n)
p (День: Доза мг)
Эксперимент 1 huIgG-контроль
(умерщвление на Д5)
2.70+/-0.37 (7)
3.18+/-0.37 (7)
mLTβR-Igc
(ДО, +3:0, 4, 0,3)
1.42+/-0.15(4)<0001
3.29+/-0.18 (4) NSb
Эксперимент 2 huIgG-контроль
(умерщвление на Д7)
3.35+/-0.21 (3)
4.04+/-0.34 (3)
mLTβR-Ig
(ДО, +3:0, 3,0, 2)
2.37+/-0.24 (4) 0.0024 3.04+7-0.19(4) 0.004↓
Эксперимент 3 huIgG-контроль
(умерщвление на Д6)
2.34+7-0.11 (5) 2.93+/-0.57 (5)
mLTβR-Ig (Д-3:0,4)
1.10+7-0.38(3) 0.0024
2.27+/-1.39 (3) NS
mLTβR-Ig (Д-3,0: 0,4,0,3) 0.78+7-0.02(3)<0.0001
3.95+7-0.53(3) 0.046↑
mLTβR-Ig (Д0:0,3)
0.92+7-0.10(3)<0.0001
3.25+/-0.15 (3)NS
а
Масса органа, выраженная в процентах в расчете на
всю массу тела. Масса необработанных ЛУ обычно составляла 0,5% от всей массы тела.
b
NS - незначимые данные
с
mLTβR-Ig представляет собой гибридный белок между внеклеточным доменом mLTβR и СН2- и СН3областями hIgG1.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения, может оказаться жела-
13
тельным вводить ингибиторы каскада реакций
LT одновременно, до или после проведения лучевой терапии. Для каждого специалиста очевидно, что предпочтительная терапия может
быть проведена на основании отдельных показателей, таких как, состояние пациента и тип
опухоли, подвергаемой лечению.
Ингибирующие анти-LTβ-R-Ab и другие
LTβ-R-блокирующие агенты могут быть идентифицированы методами, ранее описанными в
литературе (в одновременно рассматриваемой
заявке США рег.№ 08/378968).
LTβ-R-блокирующие агенты в одном из
вариантов осуществления настоящего изобретения включают растворимые молекулы LTβрецептора. Известно, что последовательность
внеклеточной части человеческого LTβ-R кодирует лигандсвязывающий домен (см. фиг. 1). С
использованием данных об этой последовательности, представленных на фиг. 1 и техники рекомбинантных ДНК, хорошо известных специалистам, функциональные фрагменты, кодирующие LTβ-R-лигандсвязывающий домен, могут
быть клонированы в вектор и экспрессированы
в подходящем хозяине с продуцированном растворимой LTβ-R-молекулы.
Растворимый LTβ-рецептор, содержащий
аминокислотные последовательности, выбранные из последовательностей, представленных на
фиг. 1, может быть присоединен к одному или
нескольким гетерологичным доменам белка
(«гибридным/доменам») в целях увеличения in
vivo-стабильности рецепторного гибридного
белка, либо в целях модуляции его биологической активности или локализации.
Предпочтительно, чтобы для конструирования
рецепторных гибридных белков использовались
стабильные плазматические белки, которые обычно
имеют время полужизни в кровотоке более 20 ч.
Такими плазматическими белками являются, но не
ограничиваются ими, иммуноглобулины, сывороточный альбумин, липопротеины, аполипопротеины
и трансферрин. Последовательности, которые могут
нацеливать растворимую молекулу LTβ-R на клетку
или на ткань конкретного типа, могут быть также
присоединены к LTβ-R-лигандсвязывающему домену с образованием специфически локализованного
растворимого LTβ-R-гибридного белка.
Вся или функциональная часть внеклеточной
области LTβ-R (фиг. 1), содержащая лигандсвязывающий домен LTβ-R, может быть соединена, с константной областью иммуноглобулина,
подобной Fc-домену тяжелой цепи человеческого
IgG1 (Browning et al., J. Immunol., 154, pp.33-46
(1995)). Предпочтительными являются растворимые гибридные белки "рецептор-IgG", которые
представляют собой известные иммунологичные
реагенты, и методы конструирования которых
также известны специалистам (см. например, патент США № 5225538, который вводится в настоящее описание посредством ссылки).
003862
14
Функциональный лигандсвязывающий домен LTβ-R может быть присоединен к Fcдомену иммуноглобулина (Ig), происходящему
от иммуноглобулина, не принадлежащего к
классу или подклассу IgGl. Fc-домены антител,
принадлежащих к другим классам или подклассам Ig, могут активировать различные вторичные эффекторные функции. Эта активация происходит в том случае, когда Fc-домен связан
посредством когнатного Fc-рецептора. Вторичными эффекторными функциями являются способность активировать систему комплемента,
проходить через плаценту и связываться с различными микробными белками.
Если необходимо повредить или убить
клетку-мишень, несущую LT-лиганд, то для
создания LTβ-R-Fc-гибридного белка может
быть выбран особенно активный Fc-домен
(IgG1). Альтернативно, если желательно осуществить нацеливание LTβ-R-Fc-гибридного белка
на клетку без "запуска" системы комплемента,
то может быть выбран неактивный Fc-домен
IgG4.
Мутации в Fc-доменах, которые снижают
или элиминируют связывание с Fc-рецепторами
и активацию комплемента, были описаны в литературе (S. Morrison, Annu.Rev. Immunol., 10,
pp. 239-65 (1992)). Эти и другие мутации могут
быть использованы отдельно или в комбинации
для оптимизации активности Fc-домена, используемого для конструирования LTβ-R-Fcгибридного белка.
Различные аминокислотные остатки, образующие участки стыка гибридного белка "рецептор-Ig", могут изменять структуру, стабильность и конечную биологическую активность
растворимого гибридного белка "LTβ-рецептор". Для модификации области стыка с выбранным гибридным доменом, к С-концу выбранного LTβ-R-фрагмента могут быть добавлены одна или более аминокислот.
N-конец LTβ-R-гибридного белка может
быть также модифицирован путем изменения
положения, в котором выбранный ДНКфрагмент для LTβ-R отщепляют у его 5'-конца,
для его встраивания в рекомбинантный экспрессирующий вектор. Стабильность и активность
каждого LTβ-R-гибридного белка может быть
оценена и оптимизирована с помощью рутинного экспериментирования и анализов для отбора
LTβ-R-блокирующих агентов, описанных в настоящей заявке.
С использованием последовательностей
лигандсвязывающих доменов LTβ-R могут быть
также сконструированы варианты аминокислотной последовательности во внеклеточном домене, показанном на фиг. 1, для модификации аффинности растворимого LTβ-рецептора или
гибридного белка для LT-лиганда. Растворимые
LTβ-R-молекулы настоящего изобретения могут
конкурировать за связывание поверхностного
15
LT-лиганда с эндогенными LTβ-рецепторами
клеточной поверхности. При этом считается,
что любая растворимая молекула, содержащая
лигандсвязывающий домен LTβ-R, которая может конкурировать с LTβ-рецепторами клеточной поверхности за связывание с LT-лигандом,
является LTβ-R-блокирующим агентом, который входит в объем настоящего изобретения.
В другом варианте настоящего изобретения антитела, направленные против человеческого LTβ-рецептора (анти-LTβ-R-Ab), действуют как LTβ-R-блокирующие агенты. АнтиLTβ-R-Ab настоящего изобретения могут быть
поликлональными или моноклональными антителами (mAb) и могут быть модифицированы
для оптимизации их способности блокировать
передачу LTβ-R-сигнала, их биологической доступности in vivo, стабильности или других нужных свойств.
Сыворотку, содержащую поликлональные
антитела, направленные против человеческого
LTβ-рецептора, получают стандартными методами путем подкожной инъекции животным,
таким как козы, кролики, крысы, хомяки или
мыши, человеческого гибридного белка "LTβрецептор-Fс" (пример 1) в полном адъюванте
Фрейнда с последующей внутрибрюшинной или
подкожной инъекцией в неполном адъюванте
Фрейнда. Поликлональную антисыворотку, содержащую нужные антитела, направленные
против LTβ-рецептора, скринируют с использованием стандартных иммунологических процедур.
Мышиные
моноклональные
антитела
(mAb), направленные против человеческого
гибридного белка "LТβ−рецептор-Fс", получают, как описано в примере 5. Гибридомная клеточная линия (BD. А8.АВ9), которая продуцирует мышиные антитела против человеческого
LTβ-R(mAb BDA8) была депонирована 12 января 1995 г. Американской коллекцией типовых
культур (АТСС) (Rockville, MD) в соответствии
с Будапештским договором и имеет номер доступа АТСС НВ11798. Все ограничения на выдачу специалистам вышеуказанного депозита
АТСС будут окончательно сняты после выдачи
патента на данную заявку.
Различные формы анти-LTβ-R антител могут быть также получены с использованием
стандартной техники рекомбинантных ДНК
(Winter & Milstein, Nature, 349, pp.293-99
(1991)). Так, например, могут быть сконструированы "химерные" антитела, в которых антигенсвязывающий домен, взятый от антитела
животного, соединен с константным доменом
антитела человека (напр., Саbilly et al., патент
США 4816567; Morrison et al., Proc.Natl. Acad.
Sci., USA, 81, pp. 6851-55 (1984)). Использование химерных антител приводит к снижению
наблюдаемого иммуногенного ответа, выраба-
003862
16
тываемого антителами животных при их использовании в клинической терапии человека.
Кроме того, могут быть синтезированы рекомбинантные "очеловеченные" антитела, которые распознают LTβ-R. "Очеловеченными" антителами являются химерные конструкции, содержащие, главным образом, последовательности IgG человека, в которые были встроены области, ответственные за специфическое связывание с антигеном (см., например, WO
94/04679). Животные были иммунизированы
нужным антигеном, затем соответствующие
антитела были выделены, и часть последовательностей вариабельной области, ответственных за специфическое связывание с антигеном,
была удалена. Затем, происходящие от животного антигенсвязывающие области клонировали
в соответствующее положение генов антител
человека, в которых были делегированы антигенсвязывающие области. "Очеловеченные"
антитела минимизируют использование гетерологичных (межвидовых) последовательностей в
человеческих антителах и снижают вероятность
вырабатывания иммунного ответа у индивидуума, подвергающегося лечению.
Конструирование различных классов рекомбинантных антител против LTβ-R может
быть также осуществлено путем создания химерных или "очеловеченных" антител, содержащих вариабельные домены антитела против
LTβ-R и константные домены человеческого
антитела (CH1, CH2, СН3), выделенные из иммуноглобулинов различных классов. Так, например, антитела против LTβ-R типа IgM с повышенной валентностью антигенсвязывающего
центра могут быть рекомбинантно продуцированы путем клонирования ангигенсвязывающего сайта в векторы, несущие константные
области цепи Т человека (Arulanandam et al.,
J.Exp.Med., 177, pp. 1439-50 (1993); Lane et al.,
Eur. J. Immunol., 22, pp. 2573-78 (1993);
Traunecker et al., Nature, 339, pp.68-70 (1989)).
Кроме того, стандартная техника рекомбинантных ДНК может быть использована для
изменения аффинности связывания рекомбинантных антител с их антигенами путем модификации аминокислотных остатков вблизи от
антигенсвязывающих центров. Аффинность
связывания с антигеном "очеловеченного" антитела может быть увеличена путем мутагенеза на
основе молекулярного моделирования (Queen et
al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 86, pp. 10029-33
(1989); WO 94/04679).
Может оказаться предпочтительным увеличить или уменьшить аффинность анти-LTβ-RAb по отношению к LTβ-R в зависимости от
типа ткани-мишени или от конкретно рассматриваемой схемы лечения. Так, например, может
оказаться предпочтительным, в качестве полупрофилактических мер, проводить лечение пациента постоянными уровнями анти-LTβ-R-Ab
17
с пониженной способностью к передаче сигнала
посредством каскада реакций LTβ. Аналогичным образом, использование ингибирующих
антител против LTβ-R с повышенной аффинностью по отношению к LTβ-R может оказаться
предпочтительным для кратковременного лечения.
Антитела против LTβ-R в качестве LTβ-Rблокирующих агентов
Антитела против LTβ-R, которые действуют как LTβ-R-блокирующие агенты, могут
быть выбраны путем тестирования на их способность ингибировать LTβ-R-индуцированную
цитотоксичность в опухолевых клетках. При тестировании других антител, направленных против человеческого LTβ-рецептора, предполагается, что другие антитела против LTβ-R, которые функционируют как LTβ-R-блокирующие агенты у человека, могут быть идентифицированы с использованием рутинного экспериментирования и с помощью анализов, описанных в настоящей заявке.
Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает
композиции и способы, в которых используются
антитела, направленные против LT-лиганда и
действующие как LTβ-R-блокирующие агенты.
Как описано выше, антитела против LTβ-R, антитела против LT-лиганда, которые функционируют как LTβ-R-блокирующие агенты, могут
быть поликлональными или моноклональными
и могут быть модифицированы в соответствии с
рутинными процедурами для модуляции их антигенсвязывающих свойств и их иммуногенности.
Анти-LT антитела настоящего изобретения
могут быть продуцированы отдельно против
одной из двух субъединиц LT, включая растворимые, мутантные, модифицированные и химерные формы субъединицы LT. Если субъединицы LT используются в качестве антигена, то
предпочтительно, чтобы они представляли собой субъединицы LTβ. Если используются
субъединицы LTα/β, то предпочтительно, чтобы
полученные антитела против LTα связывались с
поверхностным LT-лигандом и не вступали в
перекрестную реакцию с секретированным LTα,
либо не модулировали активность TNF-R.
Альтернативно, антитела, направленные
против гомомерного (LTβ) или гетеромерного
(LTα/β) комплекса, содержащего одну или несколько субъединиц LT, могут быть продуцированы и скринированы на активность в качестве
LTβ-R-блокирующих агентов. В качестве антигена, предпочтительно использовать комплексы
LTα1/β2. Как обсуждалось выше, предпочтительно, чтобы полученные антитела против
LTα1/β2 связывались с поверхностным LTлигандом и не связывались с секретированным
LTα, а также не влияли на активность TNF-R.
003862
18
Продуцирование поликлональных антител
против LTα человека описано заявителями в
одновременно рассматриваемой заявке (WO
94/13808). Были также описаны и моноклональные антитела против LTα и LTβ (Browning et at.,
J. Immunol., 154, pp.33-46 (1995)).
Соединения
Терапевтическими соединениями, которые
могут быть использованы в способах настоящего изобретения, являются любые соединения,
которые блокируют взаимодействие LTβ с LTβрецептором, и тем самым ингибируют каскад
реакций LT. Конкретно рассматриваемыми соединениями, направленными против LT, являются поликлональные антитела или моноклональные антитела (mAb), а также производные
этих антител, такие как химерные молекулы,
"очеловеченные" молекулы, молекулы с пониженными эффекторными функциями, биспецифические молекулы и конъюгаты антител.
Настоящее изобретение также относится к
молекулам против LTβ и против LТβ−рецептора
другого типа, таким как полные Fab-фрагменты,
(Fab1)2-соединения, Vн-области, Fv-области,
одноцепочечные антитела (см., например, WO
96/23071), полипептиды, гибридные конструкции
полипептидов,
гибриды
LТβ−рецептора, и низкомолекулярные соединения, такие как небольшие полупептидные соединения
или непептидные соединения, каждое из которых способно блокировать каскад реакций LT.
С использованием стандартной техники
рекомбинантных ДНК могут быть также продуцированы различные формы антител (Winter &
Milstein, Nature 349: 293-99, 1991). Например,
могут быть сконструированы "химерные" антитела, в которых антигенсвязывающий домен,
взятый от антитела животного, присоединен к
константному домену антитела человека (антитела, первоначально происходящего от млекопитающего, не относящегося к человеку, в котором, с использованием техники рекомбинантных ДНК, была проведена замена всей или части шарнирной и константной областей тяжелой
цепи и/или константной области легкой цепи на
соответствующие области легкой цепи или тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина)
(см., например, Cabilly и др., патент США
4816567; Morrison et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 81:
6851-55, 1984). Химерные антитела, при их использовании в клинической терапии человека,
вызывают пониженный иммуногенный ответ по
сравнению с ответом, вызываемым антителами
животных.
Кроме того могут быть синтезированы рекомбинантные "очеловеченные" антитела. "Очеловеченные" антитела представляют собой антитела, первоначально происходящие от млекопитающего, не
относящегося к человеку, в которых, с помощью
техники рекомбинантных ДНК, некоторые или все
аминокислоты, не являющиеся необходимыми
19
для связывания с антигеном, были заменены
аминокислотами из соответствующих областей
тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека (химеры, содержащие, главным образом,
последовательности IgG человека, в которые
были встроены области, ответственные за специфическое связывание с антигеном) (см. например, заявку на патент РСТ WO 94/04679).
Животных иммунизируют нужным антигеном,
соответствующие антитела выделяют, а фрагменты последовательностей вариабельных областей, ответственных за специфическое связывание с антигеном, удаляют. Затем, антигенсвязывающие области, происходящие от животного, клонируют в соответствующее положение
генов антитела человека, в которых были делетированы антигенсвязывающие области. "Очеловеченные" антитела позволяют минимизировать использование гетерологичных (межвидовых) последовательностей в антителах человека
и снижают вероятность вырабатывания иммунного ответа у индивидуума, подвергаемого лечению.
В способах и композициях настоящего
изобретения также используются антитела приматов и антитела от других видов, имеющие
последовательности, происходящие от приматов.
В способах и композициях настоящего
изобретения могут быть также использованы
фрагменты антител и одновалентные антитела.
Одновалентные антитела включают димер тяжелой цепи/легкой цепи, связанный с Fcобластью (или со "стволом") второй тяжелой
цепи. Fab-области означают такие фрагменты
цепей, которые почти эквивалентны или аналогичны последовательностям, включающим части ветви "Y" тяжелой цепи и всю легкую цепь, и
которые, как было показано, во всей своей совокупности (в агрегатах) обладают активностью
антитела. Fab-белок включает в себя агрегаты
одной тяжелой и одной легкой цепи (обычно
известные как Fab'), а также тетрамеры, которые
соответствуют двум разветвленным сегментам
антитела Y (обычно известным как F(ab)2), независимо от того, является ли любой из вышеуказанных фрагментов ковалентно или нековалентно агрегированным, при условии, что эти агрегаты обладают способностью селективно реагировать с конкретным антигеном или семейством
антигенов.
Кроме того, стандартная техника рекомбинантных ДНК может быть использована для
изменения аффинности связывания рекомбинантных антител с их антигенами посредством
замены аминокислотных остатков в области,
находящейся в непосредственной близости от
антигенсвязывающих сайтов.
Цели настоящего изобретения
Целью настоящего изобретения, для достижения которой были разработаны способы
003862
20
настоящего изобретения, является лечение фолликулярных лимфом.
Способы введения
Соединения настоящего изобретения могут быть введены любым фармакологически
приемлемым способом. Такими способами являются парентеральные инъекции, такие как
внутривенные, внутрисосудистые, внутриартериальные, подкожные, внутримышечные, внутриопухолевые, внутрибрюшинные, интравентрикулярные, интраэпидуральные инъекции,
или другие способы, такие как пероральное,
интраназальное, офтальмическое и ректальное
введение или местное применение. В настоящем
изобретении также предусматривается введение
препарата пролонгированного действия, такого
как депо-инъекции. Некоторые формы LTблокирующих соединений могут быть использованы для перорального введения и могут изготовлены в виде суспензий или пилюль.
Дозы и схемы лечения
Количество и схема введения доз любого
конкретного соединения пациенту с данной болезнью иммунных комплексов назначается его
лечащим врачом, исходя из ряда факторов. Основная доза устанавливается путем преклинических и клинических испытаний, которые предусматривают проведение широкомасштабных
экспериментов для определения благоприятного
и негативного действия на пациента различных
доз соединения. Даже после рекомендаций, сделанных на основании этих экспериментов, лечащий врач, в большинстве случаев, варьирует
эти дозы для каждого конкретного пациента,
исходя из ряда факторов, таких как возраст, состояние здоровья, вес и пол пациента, а также
сопутствующее лечение другими фармацевтическими препаратами. Определение оптимальной дозы для каждого LT-блокирующего соединения, используемого для лечения фолликулярной лимфомы, осуществляют рутинными методами, обычно применяемыми в фармацевтической и медицинской практике.
В основном, частота введения дозы должна
быть установлена лечащим врачом, и назначенная доза может быть введена один раз или несколько раз в день в интервалы 2-6 дней, раз в
неделю, раз в две недели или раз в месяц.
В соответствии с настоящим изобретением, для лечения фолликулярных лимфом может
быть проведена комбинированная терапия с
использованием других агентов, направленная
против таких лимфом, включая, например, лучевую терапию, химиотерапию или другие виды
терапии, известные специалистам.
LT-блокирующее соединение настоящего
изобретения вводят пациенту в виде фармацевтически приемлемой композиции, которая может включать в себя фармацевтически приемлемый носитель. Такой носитель является относительно нетоксичным и безвредным для пациента в концентрации, обеспечивающей эффек-
21
тивную активность блокирующего соединения
или других активных ингредиентов, так, чтобы
побочные эффекты, приписываемые этому носителю, не ослабляли благоприятного действия
активных ингредиентов композиции. Эта композиция может содержать и другие совместимые вещества, где используемое здесь понятие
"совместимые" означает, что компоненты фармацевтической композиции могут смешиваться
с LT-блокирующим соединением и друг с другом, но так, чтобы при этом не происходило их
взаимодействия, которое могло бы приводить к
снижению терапевтической эффективности
фармацевтической композиции. Фармацевтические композиции настоящего изобретения, подходящие для перорального введения, могут
быть изготовлены в виде отдельных дискретных
форм, таких как капсулы, крахмальные капсулы,
таблетки, драже или пастилки, каждая из которых содержит заранее определенное количество
потенцирующего соединения в виде порошка
или гранул; липосомы, суспензии в водном или
в безводном растворе, такие как сироп, эликсир,
эмульсия или капли.
Композиции настоящего изобретения могут быть упакованы в контейнеры для сохранения стерильности и для защиты активности активных ингредиентов во время соответствующего распределения и хранения, а также для
обеспечения соответствующей и эффективной
доступности этой композиции при введении
пациенту. В случае использования готового
препарата для инъекций, содержащего LTблокирующее соединение, эта композиция может быть помещена в сосуд с плотно закрывающейся крышкой, так, чтобы содержимое
этого сосуда могло быть извлечено из него с
помощью иглы или шприца. Этот сосуд может
быть предназначен либо для одноразового, либо
для многократного использования. Указанная
композиция может быть также изготовлена в
виде уже заполненного шприца. В некоторых
случаях, содержимое может быть изготовлено в
виде жидкого готового препарата, а в других
случаях, эта композиция может присутствовать
в сухой или лиофилизованной форме, которая
для получения жидкой формы требует разведения обычным или специально поставляемым
разбавителем. Если соединение используется в
жидкой форме для внутривенного введения, то
оно может поставляться в стерильном пакете
или в контейнере, к которому может быть подсоединена трубка или катетер для внутривенного введения. В тех случаях, когда блокирующее
соединение предназначено для перорального
введения в виде таблетки или драже, то это соединение может поставляться во флаконах с
открывающейся крышкой. Эти контейнеры могут быть снабжены этикеткой с указанием типа
соединения, имени производителя или дистрибьютора, показаний для данного лекарственного средства, рекомендуемой дозы, и инструк-
003862
22
циями по хранению или по введению лекарственного средства.
Библиография
1. Tsiagbe, V.K., Inghirami, G. & Thorbecke,
G.J. The physiology of germinal centers. Crit Rev
Immunol 16, 381-421 (1996).
2. Freedman, A.S. & Nadler, L.M. in Cancer
Medicine 3rd Ed. (ed. Holland, J.F.e.a.) 2028-2068
(Lea&Febiger, London, 1994).
3. Lasky, J.L., Ponzio, N.M. & Thorbecke,
G.J. Characterization and growth factor requirements of SJL lymphomas. I. Development of a B
cell growth factor-dependent in vitro cell line,
cRCS-X [published erratum appears in J Immunol
1988 Apr 1;140(7):2478]. J Immunol 140, 679-87
(1988).
4. Lasky, J.L. & Thorbecke, G.J. Characterization and growth factor requirements of SJL lymphomas. II. Interleukin 5 dependence of the in vitro
cell line, cRCS-X, and influence of other cytokines.
Eur J Immunol 19, 365-71 (1989).
5. Ponzio, N.M., Brown, P.H. & Thorbecke,
G.J. Hosttumor Interactions in the SJL lymphoma
model. Intern. Rev. Immunol. 1, 273-301 (1986).
6. Tsiagbe, V.K., et al. Syngeneic response to
SJL follicular center I cell lymphoma (reticular cell
sarcoma) cells is primarily in V beta 16+ CD4+ T
cells. J Immunol 150, 5519-28 (1993).
7. Matsumoto, M., et al. Distinct roles of
lymphotoxin alpha and the type I tumor necrosis
factor (TNF) receptor in the establishment of follicular dendritic cells from non-bone marrowderived cells. J Exp Med 186, 1997-2004 (1997).
8. Mackay, F., Majeau, G.R., Lawton, P.,
Hochman, P.S. & Browning, J.L. Lymphotoxin but
not tumor necrosis factor functions to maintain
splenic architecture and humoral responsiveness in
adult mice. Eur J Immunol 27, 2033-42 (1997).
9. Katz, I.R, Chapman-Alexander, J., Jacobson, E.B., Lerman, S.P. & Thorbecke, G.J. Growth
of SJL/J derived trans-plantable reticulum cell sarcoma as related to its ability to induce T-cell proliferation in the host. III. Studies on thymectomized
and congenitally athymic SJL mice. Cellular Immunol. 65, 84-92 (1981).
Список последовательностей
Данные для последовательности SEQ ID No:1:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 197 аминокислот
(B) Тип: аминокислотная последовательность
(C) Цепочечность:
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы: пептид
(xi) Описание последовательности SEQ ID
No:1:
23
003862
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ прекращения или замедления
развития фолликулярной лимфомы, снижения
ее тяжести или последствий, включающий введение индивидууму эффективного количества
композиции, которая ингибирует взаимодействие между LT-β и его рецептором.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную композицию выбирают из группы, состоящей из растворимого LT-β-рецептора, антитела
против LT-β и антитела против LT-β-R.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что
указанная композиция содержит растворимый
LT-β-рецептор.
24
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что
указанным индивидуумом является млекопитающее.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что
указанным индивидуумом является человек.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что
растворимый рецептор лимфотоксина-β содержит лигандсвязывающий домен, который может
селективно связываться с поверхностным LTлигандом.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что
указанный LT-β-рецептор содержит Fc-домен
иммуноглобулина человека.
8. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанная композиция содержит моноклональное антитело, направленное против LT-β-рецептора.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что
указанным моноклональным антителом является гуманизированное или химерное антитело.
10. Способ по п.1, дополнительно включающий введение указанному индивидууму, по
крайней мере, одного химиотерапевтического
агента.
11. Способ по п.1, дополнительно включающий лечение указанного индивидуума с помощью лучевой терапии.
12. Применение композиции, блокирующей взаимодействие LT-β с его рецептором, для
лечения индивидуума с фолликулярной лимфомой.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6