Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский

1
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
профессионального образования «Курский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
На правах рукописи
Азарова Анна Владимировна
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ
ДЕВЯСИЛА ИВОЛИСТНОГО
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Научный руководитель:
доктор фармацевтических наук,
профессор В.Н. Бубенчикова
Курск - 2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………………
7
ГЛАВА 1 БОТАНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, ХИМИЧЕСКИЙ
СОСТАВ И ПРИМЕНЕНИЕ ДЕВЯСИЛА ИВОЛИСТНОГО В НАРОДНОЙ
МЕДИЦИНЕ ……………………………………………………………………… 14
1.1 Краткая ботаническая характеристика девясила иволистного ………… 14
1.2 Химический состав девясила иволистного… …………………………… 16
1.3 Фармакологические свойства и применение девясила иволистного в
народной медицине……………………………………………………………….. 19
Выводы по главе 1 ……………………………………………………………….. 23
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ………………………
25
2.1 Характеристика объектов исследования ………………………………… 25
2.2 Методы фитохимического исследования ………………………………..
25
2.2.1 Приготовление водных экстрактов для проведения качественных
реакций…………………………………………………………………………….
26
2.2.2 Углеводные производные ……………………………………………….. 26
2.2.3 Азотсодержащие соединения ……………………………………………. 27
2.2.4 Дубильные вещества ……………………………………………………... 30
2.2.5 Органические кислоты …………………………………………………... 31
2.2.6 Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование
природных соединений органическими растворителями ………………….. … 32
2.2.7 Кумарины ………………………………………………………………… 32
2.2.8 Фенолкарбоновые кислоты ……………………………………………... 33
2.2.9 Флавоноиды ……………………………………………………………… 33
2.2.10 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ …………………... 34
2.2.11 Тритерпеновые соединения ……………………………………………. 35
2.2.12 Приготовление гекановых извлечений………………………………… 37
3
2.2.13 Каротиноиды …………………………………………………………… 37
2.2.14 Изучение липофильной фракции ………………………………………
38
2.2.15 Эфирное масло…………………………………………………………..
38
2.2.16 Изучение минерального состава ……………………………………….
41
2.3 Методы изучение полисахаридов …………………………………………
41
2.3.1 Выделение полисахаридов ………………………………………………
41
2.3.2 Кислотный гидролиз…………………… ………………………………..
44
2.3.3 Хроматографический анализ………………………. …………………… 44
2.3.4 Количественное определение моносахаридного состава
полисахаридных комплексов ……………………………………………………. 45
2.3.5 Количественное определение функциональных групп пектиновых
веществ…………………………………………………………………………….. 46
2.4 Определение числовых показателей ……………………………………… 47
2.4.1 Определение влажности……………………. ……………………………. 47
2.4.3 Определение экстрактивных веществ… ………………………………... 48
2.5 Морфолого-анатомические исследования ………………………………..
48
2.6 Методы токсико-фармакологических исследований…………………….. 48
2.6.1 Изучение острой токсичности……………………………………………. 49
2.6.2 Изучение отхаркивающего действия….…………………………………. 49
2.6.3 Изучение противовоспалительной активности………………………….. 50
2.6.4 Изучение антимикробной активности…………………………………… 52
2.7 Статистическая обработка результатов эксперимента……………………. 53
ГЛАВА 3 ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
ДЕВЯСИЛА ИВОЛИСТНОГО…………………………………………………..
54
3.1 Углеводные производные …………………………………………………..
54
3.2 Азотсодержащие соединения ……………………………………………… 55
3.2.1 Азотистые основания……………………………………………………… 55
3.2.2 Определение аминокислот………………………………………………... 57
3.3 Дубильные вещества ………………………………………………………... 59
4
3.3.1 Качественное обнаружение ………………………………………………. 59
3.3.2 Количественное определение…………………………………………….. 60
3.4. Органические кислоты …………………………………………………….. 60
3.4.1 Качественное обнаружение ………………………………………………
60
3.4.2 Количественное определение свободных органических кислот ………
61
3.4.3 Количественное определение аскорбиновой кислоты…… ……………. 61
3.5 Кумарины …………………………………………………………………… 61
3.6 Фенолкарбоновые кислоты…………………………………………………. 62
3.7 Флавоноиды ………………………………………………………………… 63
3.7.1 Качественно определение ………………………………………………... 63
3.8 Изучение фенольных соединений травы и корневищ с корнями
девясила ивлоистного методом ВЭЖХ…………………………………………
63
3.9 Тритерпеновые соединения ………………………………………………... 66
3.9.1 Качественное обнаружение ………………………………………………
67
3.9.2 Количественное определение тритерпеновых соединений…………….. 67
3.10 Каротиноиды……………………………………………………………….. 68
3.11 Изучение липофильной фракции методом газовой хроматографиимасс-спектрофотометрии………………………………………………………… 68
3.12 Эфирное масло……………………………………………………………
71
3.13 Сесквитерпеновые лактоны………………………………………………. 71
3.14 Минеральный состав растения…………………………………………… 72
3.15 Изучение углеводов……………………………………………………….. 74
3.15.1 Выделение полисахаридов………………………………………………. 75
3.15.3 Исследование углеводных производных……………………………….. 76
Выводы по главе 3 ……………………………………………………………….. 82
ГЛАВА 4 СТАНДАРТИЗАЦИЯ ТРАВЫ И КОРНЕВИЩ И КОРНЯМИ
ДЕВЯСИЛА ИВОЛИСТНОГО ……………………………………………
86
4.1 Разработка характеристик подлинности сырья «Трава девясила
иволистного»……………………………………………………………………… 86
5
4.1.1 Исследование морфологических признаков травы девясила
иволистного……………………………………………………………………….. 86
4.1.2 Характеристика микродиагностических признаков травы девясила
иволистного ………………………………………………………………………. 87
4.1.3 Исследование морфологических признаков корневищ с корнями
девясила иволистного ……………………………………………………………. 96
4.1.4 Характеристика микродиагностических признаков корневищ с
корнями девясила иволистного………………………………………………….. 97
4.2 Числовые показатели ………………………………………………………. 99
4.2.1 Определение влажности…………… ……………………………………. 99
4.2.2 Определениме золы……………………………….. …………………….. 99
4.2.3 Определение экстрактивных веществ…………………………………… 100
4.3 Разработка методик качественного и количественного опреления
действующих веществ травы и корневищ с корнями девясила иволистного… 101
4.3.1 Разработка методик качественного и количественного определения
суммы фруктозанов в корневищах с корнями девясила иволистного ………... 101
4.3.2 Стандартизация травы девясила иволистного по содержанию суммы
флавоноидов………………………………………………………….…………… 115
4.3.3 Разработка методики количественного определения суммы
фенольных соединений…………………………………………………………
128
4.3.4 Количественное определение сесквитерпеновых лактонов…………… 138
Выводы по главе 4 ………………………………………………………………..
132
ГЛАВА 5 ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ДЕВЯСИЛА ИВОЛИСТНОГО ………………………………………………….. 136
5.1 Изучение острой токсичности …………………………………………….. 136
5.2 Изучение отхаркивающего действия……..……………………………….. 137
5.3 Изучение противовосполительной активности …………………………..
138
5.3.1 Влияние на процессы экссудации…………….. ………………………..
139
5.3.2 Влияние на пролиферацию………………………………………………. 140
6
5.3.3 Влияние на прогицаемость каппиляров у кроликов……………………. 142
5.4 Изучение антимикробной активности…………………………………….. 143
Выводы по главе 5 ……………………………………………………………….. 145
ВЫВОДЫ …………………………………………………………………………
147
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ……………………………………………………….. 150
7
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Из общего арсенала лекарственных
средств,
применяемых в России 1/3 препаратов имеют растительное происхождение. На
фармацевтических рынках США и в странах Европы доля растительных
препаратов
достигает
50%.
Поэтому,
одним
из
приоритетов
развития
отечественной фармацевтической науки и практики является более полное
использование собственных ресурсов дикорастущего растительного сырья и
создание оригинальных фитопрепаратов на его основе, не уступающих по
качеству зарубежным аналогам.
В связи с этим стоит вопрос расширения сырьевой базы лекарственного
растительного сырья за счёт поиска новых источников. Одним из источников
фитопрепаратов является девясил высокий.
высокого
используются
в
Корневища и корни девясила
качестве отхаркивающего, противомикробного,
противовоспалительного средства. Из них получают отвар и препарат «Алантон».
Основными группами действующих веществ корневищ с корнями девясила
высокого являются сесквитерпеновые лактоны – алантолактон, изоалантолактон и
полисахарид инулин. Однако, антропогенное воздействие человека на природу и в
связи с этим значительные экологические изменения приводят к резкому
сокращению запасов растительного сырья, в том числе и девясила высокого.
Решить данную проблему позволит привлечение потенциала других видов
девясила, в частности девясила иволистного, широко распространённого на
территории Центрально-черноземных областей России. Сведения о химическом
составе и фармакологических свойствах как корневищ с корнями так и травы
девясила иволистного, носят фрагментальный характер. В связи с этим
фармакогностическое изучение девясила иволистного с целью внедрения его в
научную медицину наряду с девясилом высоким является актуальным.
Степень разработанности темы. В литературе имеются данные о
выделении эфирного масла из надземной и подземной частей девясила
8
иволистного. Однако, данные о качественном его составе отсутствуют, за
исключением того, что для подземной части указано наличие алантолактона и
изоалантолактона, а для надземной части – геленина. Из подземной части
выделены тритерпен
фриделин и стероид ситостерин, а также полисахарид
инулин. В подземной части установлено присутствие алкалоидов, их количество
достигает 0,06 %. Наличие фенольных соединений установлено в надземной
части, но отсутствуют данные об их характере и структуре. В цветках растения
идентифицированы флавоноиды: апигенин и гиперозид и гидрооксикоричные
кислоты: кофейная и хлорогеновая.
Исследований
по
комплексному
фармакогностическому
изучению
надземной и подземной части девясила иволистного не проводились; не изучен
состав основных групп биологически активных веществ и не разработаны
методики их количественного определения.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось
фармакогностическое изучение корневищ с корнями
и травы девясила
иволистного, как перспективного источника лекарственного растительного сырья,
а также стандартизация и диагностика сырья.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
фитохимическое изучение корневищ с корнями и травы девясила иволистного;
- изучение состава основных групп биологически активных веществ;
-разработка методик количественного определения основных групп биологически
активных соединений;
- установление макро- и микроскопических признаков двух видов сырья: травы и
корневищ с корнями девясила иволистного;
- установление товароведческих показателей сырья;
- проведение фармакологического скрининга.
Научная
новизна.
Проведено
изучение
качественного
состава
и
количественного содержания основных групп биологически активных веществ
корневищ с корнями и травы девясила иволистного: эфирного масла,
9
сесквитерпеновых
лактонов,
углеводов,
азотсодержащих
соединений,
органических кислот, тритерпеновых соединений, каротиноидов, фенольных
соединений.
Впервые исследован минеральный и аминокислотный состав как подземной,
так и надземной части. Установлено наличие 17 макро- и микроэлементов; 17
аминокислот.
Изучен состав липофильной фракции методом газовой хроматографии –
масс-спектрофотометрии (ГХ-МС); при этом идентифицировано 30 соединений,
основными из которых являются в корневищах с корнями производное
дитретбутилдиметоксибензола и диметиловый эфир тимогидрохинона, а в траве
идентифицировано 11 веществ, основные из которых гексадекановая кислота и
производное 1,4-ди-t-бутил-2,5-диметоксибензен.
Исследован состав фенольных соединений с помощью различных методов
хроматографии (бумажной, тонкослойной, ВЭЖХ). В траве девясила иволистного
идентифицировано 18 фенольных соединений, а в корневищах с корнями – 15. Из
фенольных веществ идентифицированы кумарины: умбеллиферон, дикумарин,
дигидрокумарин;
гесперидин,
гиперозид,
фенолкарбоновых
коричная,
флавоноиды:
кислот:
розмариновая,
витексин,
рутин,
изовитексин,
дигидрокверцетин,
лютеолин-7-глюкозид;
производные
галловая, цикориевая, хлорогеновая, кофейная,
производные
дубильных
веществ:
танин,
эпикатехингаллат, катехин, эпикатехин. Новыми для девясила иволистного были
19 фенольных соединений.
Впервые выделены и изучены полисахариды травы девясила иволистного по
фракциям: водорастворимый полисахаридный комплекс, пектиновые вещества,
гемицеллюлозы А и Б. Изучен их качественный и количественный состав;
определены функциональные группы пектиновых веществ.
Впервые
проведены
морфолого-анатомические
исследования
как
надземной, так и подземной частей девясила иволистного. Установлены
морфологические
и
микродиагностические
признаки
для
определения
10
подлинности сырья. Разработаны числовые показатели, регламентирующие
качество сырья.
Проведены исследования по стандартизации травы и корневищ с корнями
девясила иволистного, в результате чего разработаны методики количественного
определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид для травы девясила
иволистного, суммы фруктозанов в пересчете на фруктозу для корневищ с
корнями и суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту
для двух видов сырья. Разработанные методики валидированы по показателям
линейности, правильности, воспроизводимости и повторяемости.
Результаты скрининговых фармакологических исследований показали
наличие у травы и корневищ с корнями девясила иволистного отхаркивающей,
противовоспалительной и антибактериальной активностей.
Практическая значимость.
В результате проведенных исследований получены новые данные о составе
биологически активных веществ, фармакологической активности девясила
иволистного.
Установлена близость качественного состава, количественного содержания
сесквитерпеновых лактонов и фармакологической активности корневищ с
корнями
девясила
иволистного
и
девясила
высокого,
что
позволяет
рекомендовать корневища с корнями девясила иволистного для дальнейшего
изучения с целью внедрения его в научную медицину и использование наряду с
девясилом высоким.
На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
- методика количественного определения суммы фруктозанов в корневищах с
корнями девясила иволистного (Акт внедрения в работу кафедры фармакогнозии
Пятигорского филиала ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский
университет от 14 марта 2013 г.);
- методика количественного определения суммы флавоноидов в траве девясила
иволистного (Акт внедрения в научную и учебно-методическую работу кафедры
11
фармакогнозии
и
ботаники
Курского
государственного
медицинского
университета от 20 декабря 2013 г.);
- методика количественного определения суммы флавоноидов в корневищах с
корнями
девясила
иволистного
(Акт
внедрения
в научную
и
учебно-
методическую работу кафедры фармакогнозии и ботаники и основами
фитотерапии
ГБОУ
ВПО
«Самарский
государственный
медицинский
университет» Минздрава России от 16 декабря 2013 года; Акт внедрения в работу
фармацевтического
факультета
ФГБОУ
ВПО
«Северо-Осетинский
государственный университет им. К.Л. Хетагурова» от 20 ноября 2013 года.
Методология и методы исследования.
Методологической основой выполненной диссертационной работы является
выбор объекта исследования на основе принципа филогенетического родства и
системный
подход,
исследовательский,
анатомический
и
включающий
несколько
фитохимический,
фармакологический.
блоков:
информационно-
стандартизационный,
В
процессе
морфолого-
фармакогностического
исследования использованы химические, физико-химические (УФ-спектроскопия,
ВЭЖХ,
масс-спектроскопия),
макроскопический,
микроскопический,
фармакологический и статистические методы анализа.
Положения выносимые на защиту:
- результаты фитохимического исследования травы и корневищ с корнями
девясила иволистного;
- результаты выделения и исследования полисахаридов;
- разработку методик анализа, показателей качества сырья девясила иволистного;
- результаты морфолого-анатомических исследований девясила иволистного с
целью выявления диагностических признаков для определения подлинности
сырья;
- результаты фармакологического скрининга водных извлечений из травы и
корневищ с корнями девясила иволистного.
12
Степень достоверности и апробация результатов: Научные положения и
выводы диссертации базируются на достаточном объеме экспериментальных
исследований и применении современных физико-химических, химических,
морфолого-анатомических,
фармакологических
методов
исследования,
позволяющих получать достоверные и воспроизводимые результаты. Результаты
исследований обработаны статистически.
Основные положения диссертационной работы доложены на научных
конференциях: Международной научно-практической конференции «Фитодизайн
в
современных
условиях»
(г.
Белгород,
2010
г.);
II
Российский
фитотерапевтический съезд: сборник научных трудов съезда (г.Москва, 2010
г.);Разработка, исследование маркетинг новой фармацевтической продукции
(г.Пятигорск, 2011г.); 77-ой Всероссийской научной конференции студентов и
молодых
ученых
с
международным
участием:
«Молодежная
наука
и
современность» (г. Курск, 2012); III Международной научно-практической
конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки (г.
Владикавказ, 2012); итоговой научной конференции сотрудников КГМУ,
Центрально-Черноземного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 78летию Курского государственного университета и 90-летию со дня рождения
профессора Н.Ф. Крутько (Курск,2012 г.);
VI Международной научно-
практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем
науки» (г. Владикавказ, 2013 г.)
Личный вклад автора. Автор принимал участие в выборе объектов
исследования, постановке целей и задач. Диссертантом проведен научноинформационный поиск литературы по объектам исследования, осуществлен сбор
и анализ литературных данных. Автором выполнен фитохимический анализ,
морфолого-анатомические и фармакологические исследования; разработаны
методики количественного определения основных групп действующих веществ,
проведена статистическая обработка результатов исследования, обобщены
полученные результаты. Лично автором выполнено более 85% исследований.
13
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.
Диссертационная
работа
выполнена
в
соответствии
с
планом
научно-
исследовательских работ Курского государственного медицинского университета
(номер государственной регистрации 01201161124).
Личный вклад. Автором составлен план и разработана структура
исследований, проведен синтез 4 из 6 объектов исследования, пронализированы
источники литературы по теме диссертации, выполнены экспериментальные
исследования, проанализированы с руководителями полученные результаты,
проведены обработка и анализ данных, сделаны выводы и обобщения. В работах,
выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей
участия автора 85-95%.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 5
в журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 49
рисунков, 49 таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав (обзор
литературы, глава «Объекты и методы исследований» и три главы, содержащие
результаты собственных исследований), общих выводов, списка литературы,
приложения.
Список литературы включает 198 источников, из них 22 на иностранных
языках.
14
ГЛАВА 1 БОТАНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, ХИМИЧЕСКИЙ
СОСТАВ И ПРИМЕНЕНИЕ ДЕВЯСИЛA ИВОЛИСТНОГО В НАРОДНОЙ
МЕДИЦИНЕ
1.1
Краткая ботаническая характеристика девясила иволистного
Род Inula L. входит в состав обширного семейства Астровые (Asteraceae),
включающего 24000 видов, объединяющихся в 1200 родов. Представители
семейства обитают во всех климатических зонах и являются наиболее
обширными в мировой флоре. На территории России произрастают только
многолетние и однолетние травы; древовидные и кустарниковые формы присущи
тропической флоре [164].
Род Inula L. впервые выделен и описан Карлом Линнеем. Растения данного
рода представлены преимущественно многолетними, редко двулетними и
однолетними травянистыми растениями.
Стебель
равномерно
листорасположение
олиственный.
очередное.
Листья
Цветочные
простые,
корзинки
цельные:
полушаровидные,
одиночные или большей частью многочисленные, собранные в щитковидные или
иногда головчатые соцветия. Обертка состоит из многочисленных черепитчато
расположенных листочков, большей частью неравных, внутрь постепенно
увеличивающихся, редко равных, острых: наружные листочки травянистые
ланцетные,
линейно-ланцетные,
яйцевидные,
яйцевидно-треугольные
или
продолговатые, иногда с ромбической, или продолговато-яйцевидной, или
округло-лопатчатой верхушкой; средние -
часто кожистые, продолговато-
ланцетные, ланцетные, лопатчатые, ложковидные, линейно-ланцетные, редко
линейные; внутренние – пленчатые, линейные, линейно-ланцетные, шиловидные
или нитевидные, изредка на конце фиолетовые или красноватые; наружные и
средние листочки по всей поверхности, а внутренние в верхней части или только
от середины, большей частью опушенные белыми, бурыми или черноватыми
15
волосками или реснитчатые, иногда покрытые железками; цветоложе плоское или
может быть выпуклое, ямчатое или ячеистое, голое или бахромчатое. Срединные
цветки (цветки диска) ворончато-трубчатые, обоеполые, желтые, (у I. vulgaris
буроватые) многорядные. Краевые цветки (цветки луча) пестичные, язычковые,
желтые (у I. vulgaris красноватые), расположенные в один ряд, в полтора – два
раза превышают обертку, большей частью с длинными язычками, которые редко
немного длиннее обертки или равны ей, или с маленькими язычками, или язычки
не развиваются и краевые цветки тогда нитевидно-трубчатые. Плодоножки в
основании стреловидные с двумя длинными, реже короткими нитевидными
рассечено-реснитчатыми придатками. Язычковые цветки очень редко с тремячетырьмя стаминодиями. Лопасти рыльца на конце расширенные, тупые,
ворсинчатые. Семянки все одинаковые, призматические или цилиндрические,
четырехгранные или ребристые, гладкие или покрытые по всей поверхности или
только в верхней части короткими вверх прижатыми прямыми волосками или
редко в верхней части рассеянными железками. Хохолок из однорядных, большей
частью многочисленных, немного неравных щетинок, мелко вверх зазубренных,
часто сросшихся основаниями [122,164].
Всего в роде насчитывается около 100 видов, распространенных в Европе,
Азии и Африке. В странах СНГ произрастает 32 вида этого рода [122,164].
Девясил иволистный – Inula salicina L. – многолетнее, голое или почти голое
травянистое растение высотой 30-60 см. Стебель прямостоячий, равномерно
облиственный, преимущественно в нижней части с рассеянными, длинными при
основании, неутолщенными волосками. Листья ланцетные, 8-12 см длиной и 2-3
см шириной, плотные (почти кожистые), отстоят от стебля почти под прямым
углом. Цветочные корзинки довольно крупные, диаметром до 2,5 см. Обертка
многорядная с кожистыми голыми листочками, реснитчатыми по краю, в верхней
части
красновато-фиолетовыми,
кнаружи
постепенно
уменьшающимися.
Наружные листочки яйцевидные, яйцевидно-ланцетные или ланцетные с
ромбической, треугольно-яйцевидной или продолговато-яйцевидной зеленой
16
верхушкой, длинно-заостренной и часто отогнутой. Внутренние листочки
линейные, 1 см длиной и 0,8-1,0 см шириной, на 1/3 длиннее наружных, в верхней
части коротко прижатоволосистые. Цветки желтые: краевые – ложноязычковые,
женские; срединные – трубчатые, обоеполые. Плоды – цилиндрические
ребристые семянки, как и завязи, голые, тонкоребристые, с хохолком из
многочисленных щетинок. Цветет в июне – сентябре, семянки созревают в июле –
октябре [84].
Широко распространенный в Евразии вид в том числе произрастает во
многих районах России: Европейской части, Западной и Восточной Сибири, а
также на Дальнем Востоке [174]. В Средней России встречается во всех областях,
чаще в долинах рек [84].
Произрастает в светлых лесах, на опушках, полянах, среди зарослей
кустарников [84].
1.2
Химический состав девясила иволистного
Девясил иволистный, наряду с другими видами данного рода, известен
прежде всего как растение, содержащее терпеноиды, фенольные соединения и
инулин.
Эфирное масло выделено как из подземной, так и из надземной частей
девясила иволистного. Содержание эфирного масла в нем колеблется от 0,06%
(надземная часть) до 2,6% (подземная часть) [70].
Особенностью эфирного масла растений рода девясил, в том числе и
девясила
иволистного,
является
наличие
в
их
составе
специфических
сесквитерпеновых лактонов – алантона, изоалантолактона, которые обнаружены в
его подземной части [194]. В.П. Махлаюк указывает на наличие в надземной
части девясила иволистного эфирного масла, содержащего геленин [125].
Химический состав девясила иволистного представлен в таблице 1.
17
Таблица 1 - Химический состав девясила иволистного
Часть растения
Надземная часть
Подземная часть
Цветки
Выделенные соединения
Литература
Эфирное масло – 0,06%:
[70]
геленин;
[124]
[132]
Сесквитерпеноиды: -лактоны;
[98,144]
Дубильные вещества;
[66]
Флавоноиды – 6,4 мг/кг;
[67]
Кумарины – 0,16%;
[68]
Алкалоиды – следы;
Эфирное масло -2,6%;
[70,125]
Сесквитерпеноиды:
алантолактон;
[98]
изоалантолактон;
[98]
Тритерпеноиды:
[194]
фриделин;
Стероиды:
[179]
-ситостерин;
[180]
Полисахариды:
инулин – до 52%;
[138]
Алкалоиды – 0,06%;
Полиацетиленовые соединения:
[138]
винилпентаацетилен;
Ароматические соединения:
метиловый эфир - 7-изобутирилокситимола – [179]
0,18%;
диметиловый эфир – 7-изобутирилокситимола - [179]
0,11%.
Тритерпеноиды;
[144]
Флавоноиды – 5,10-11,00 мг/кг:
[193]
апигенин;
[191]
гиперозид;
Оксикоричные кислоты:
[193]
кофейная;
хлорогеновая.
При исследовании флоры Средней Азии на наличие лактонов У.
Рахманкуловым с соавторами были получены результаты, которые показали, что
в одном и том же растении синтезируется только одна группа лактонов ( или лактоны), в частности, в надземной части девясила иволистного в период
цветения обнаружены -лактоны [132].
При исследовании этилацетатной фракции, полученной из корней девясила
иволистного в аппарате Сокслета с последующей колоночной хроматографией на
18
силикагеле норвежскими учеными были получены две монотерпеновые фракции
при использовании в качестве элюэнта: петролейный эфир-диэтиловый эфир
(4:1).
Очистку и
разделение
полученных
фракций
проводили
методом
тонкослойной хроматографии на силикагеле. В результате ими были выделены
ароматические соединения: метиловый эфир 7-изобутирилокситимола (0,18%) и
диметиловый эфир 7-изобутирилокситимола (0,11%) [179]. В 1971 году из
этилацетатной фракции корней выделены тритерпеноиды (фриделин) и стероиды
(-ситостерин) [179].
В цветках девясила иволистного установлено наличие тритерпенов [144].
Для подземных органов растения рода Девясил характерно наличие
полисахаридов, производных фруктозанов, в том числе и инулина. В девясиле
иволистном
инулин обнаружен в корневищах с корнями и его содержание
достигает до 52% [138].
Наряду с тритерпеноидами и инулином у девясила иволистного
обнаружено значительное количество фенольных соединений. Фенольные
соединения
представлены
дубильными
веществами,
оксикоричными
кумаринами
кислотами,
(таблица
1).
флавоноидами,
Было
распространение флавоноидов в некоторых видах растений родов
изучено
Девясил и
Василек, семейства Астровых [192]. Объектами исследований были выбраны
цветки как краевые, так и серединные, из которых получали метанольные
извлечения. Эти извлечения исследовали методом хроматографии в тонких слоях
сорбента на пластинках с силикагелем в различных системах растворителей. В
результате было установлено, что характерной отличительной чертой рода Inula
является наличие флавонового гидроксилирования по -кольцу. Так, в цветках
девясила иволистного был найден апигенин. Из гликозидов флавоноидов
идентифицирован гиперозид. При определении количественного содержания
гиперозида установлено, что в цветках девясила иволистного он накапливается в
минимальных количествах [192].
Среди оксикоричных кислот цветков венгерские ученые идентифицировали
19
кофейную и хлорогеновую кислоты [192]. При количественном определении
оксикоричных кислот ими установлено, что в цветках девясила иволистного
содержится максимальное количество хлорогеновой кислоты [192].
Присутствие дубильных веществ установлено только качественно и только
в надземной части растения, но отсутствуют какие-либо данные об их природе и
структуре [174].
В литературе также имеются данные о наличии кумаринов в надземной
части растения, их содержание в ней составляет 0,16% [189].
В корнях девясила иволистного обнаружены ацетиленовые соединения:
винилпентаацетилен [179].
Среди других классов соединений в девясиле иволистном содержатся
алкалоиды. Они обнаружены как в надземной части, так и в подземной части, их
содержание в подземной части растения составляет 0,06% [144,190].
1.3 Фармакологические свойства и применение девясила иволистного в
народной медицине
В народной медицине России используются корневища, надземная часть,
листья девясила иволистного (таблица 2).
Таблица 2 - Применение девясила иволистного в народной медицине
Часть растения
1
Надземная и подземные
части растения
Применение в народной медицине
2
Опухолевые заболевания;
заболевания печени;
венерические болезни;
стенокардия;
спазмофилия;
эпилепсия;
выведение бородавок;
гонорея
Литература
3
[144]
[144]
[144]
[144]
[144]
[144]
[144]
[144]
20
1
Корневища,
корни
Надземная часть
Листья
Продолжение таблицы 2
2
3
Заболевания желудочно-кишечного тракта; [144,174]
рак желудка;
[174]
желтуха;
[174]
золотуха;
[174]
стенокардия;
[144]
гиперацидный гастрит;
[144]
послеродовый период;
[144]
фурункулез;
[144]
скрофулез;
[144]
укусы змей;
[174]
сифилис
[174]
Диарея;
[144,174]
гнойный отит;
[124]
ангина;
[68,144]
зубная боль;
[67,144]
укусы насекомых;
[68,144]
женские болезни;
[124]
язва;
[158,174]
свищи;
[144]
золотуха;
[144]
фурункулез;
[157]
гонорея
[144]
эпилепсия;
[174]
седативное;
[125,174]
кровеостанавливающее;
[125,174]
отхаркивающее;
[125,174]
диуретическое;
[144,174]
потогонное;
[174]
противоцинготное
[174]
Ангина;
[144,174]
нарывы;
[125,174]
кожные сыпи;
[124,174]
бородавки;
[174]
ранозаживляющее
[144,174]
Настой надземной части растения применяется как противопоносное
средство для лечения диареи [144,174].
Девясил иволистный находит применение для лечения заболеваний кожи.
Свежие листья прикладывают к гнойным ранам, язвам, нарывам в качестве
ранозаживляющего средства, а также к бородавкам для их удаления. В качестве
припарок трава используется для лечения сыпи, язв, свищей и фурункулов
[144,174]. Для лечения фурункулеза, золотухи применяется настой из корневищ и
21
травы растения [144].
Имеются данные об использовании девясила иволистного в народной
медицине при заболеваниях печени. Отвар из корневищ с корнями применяют
для лечения желтухи, а также в качестве желчегонного средства [174].
Девясил
иволистный
респираторных
заболеваний.
находит
применение
Настой
травы
для
лечения
используется
в
острых
качестве
отхаркивающего и потогонного средства, а также как противовоспалительное
средство в виде полосканий при ангине [138,174]. Траву применяют как
седативное и противоэпилептическое средство в виде настоя для ванн [174].
В народной медицине трава девясила иволистного рекомендуется в качестве
кровоостанавливающего,
противоцинготного
и
мочегонного
средства
[88,125,165].
Наряду с этим девясил иволистный находит применение при лечении
зубной боли, гнойного отита, стенокардии, спазмофилии [66,174].
Корни девясила иволистного в виде отвара с определенным успехом
применяются для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта при
повышенной кислотности желудочного сока, при слизистом перерождении
желудка, раке желудка [174].
Имеются данные о применении девясила иволистного для лечения
венерических болезней: настой травы используют для лечения сифилиса,
припарки травы - для лечения гонореи [144,174].
Настой, отвар из надземной части и корней растения применяют в качестве
детоксикационного и болеутоляющего средства при укусах ядовитых змей
[138,144].
В народной медицине Туркмении девясил иволистный используется для
лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта [144].
Фармакологическая активность была изучена в основном для соединений,
входящих в состав эфирного масла девясила иволистного. Так, геленин,
кристаллическая
часть
эфирного
масла
девясила
иволистного,
обладает
22
выраженным гемостатическим
действием. Результаты экспериментов на
животных показали, что геленин в дозе 3 мг/кг сокращает продолжительность
кровотечения на 79%. Геленин обладает также противокашлевой активностью,
которая в два раза меньше, чем у кодеина. Выявлена цитотоксическая активность
геленина, которую в основном связывают с присутствием изоалантолактона.
Сумма аланто- и изоалантолактонов проявляет высокую противоопухолевую
активность при саркоме S-180, раке молочной железы Ca-755, саркоме S-100,
саркоме-45, асцитной опухоли АО 9 и умеренное противоопухолевое действие
при лейкозе Р-388.
В эксперименте на мышах показано, что в дозах 100-200 мг/кг аланто- и
изоалантолактоны увеличивают антиоксидантную активность липидов [98].
Изучались и антибактериальные свойства аланто- и изоалантолактона
против
ряда
грамположительных
(Staphylococcus
albus,
Bacillus
subtilis,
Streptococcus faecalis) и грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Proteus
vulgaris). Полное ингибирование наблюдалось лишь при действии алантолактона
на B. subtilis. Геленин обладал выраженным ингибирующим эффектом против
Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis.
Аланто- и изоалантолактонам присуща также антигельминтная активность,
причем действие их более эффективно, чем у сантонина [98].
Было проведено изучение влияния водного извлечения (настоя) из цветков
девясила иволистного на показатели фармакодинамики и фармакокинетики
этанола у экспериментальных животных. Алкогольный наркоз у мышей вызывали
внутрибрюшинным
введением
20%
раствора
этанола
в
дозе
3,5
г/кг.
Наркотический эффект этанола у крыс моделировали внутрижелудочным
введением 25% раствора этанола в дозе 3 г/кг (12 мл/кг). Настой вводили
животным в объеме 15 мл/кг за 30 минут и через 2 часа после введения этанола.
Контрольные животные получали в те же сроки эквиобъемное количество воды.
Выраженность наркотического эффекта этанола на протяжении 7 часов
оценивали ежечасно в баллах. В результате было установлено, что настой цветков
23
девясила иволистного достоверно снижает выраженность наркотического
действия этанола. Обращает на себя внимание тот факт, что действие настоя
приводит к ускорению скорости элиминации этанола (на шестой час
наблюдений). В целом выраженность антиалкогольного действия настоя
проявляется
в
виде
достоверного
снижения
суммарного
показателя
наркотического эффекта за 7 часов наблюдения. Таким образом, показано, что
настой цветков девясила иволистного подавляет наркотическое действие этанола
у крыс при острой алкогольной интоксикации средней тяжести. Это действие
сопровождается снижением концентрации этанола в крови животных [54].
Выводы по главе 1
1.
Анализ литературных данных показывает, что девясил иволистный
широко распространен в областях Центральной России,
имеет достаточную
сырьевую базу.
2.
Сведения о химическом составе девясила иволистного позволили
сделать вывод, что он изучен недостаточно. В литературе имеются данные о
выделении эфирного масла из надземной и подземной частей девясила
иволистного. Однако данные о качественном его составе отсутствуют. В
надземной части установлено наличие фенольных соединений, но отсутствуют
данные об их характере и структуре. В подземной части определен инулин.
Исследований по комплексному фитохимическому изучению надземной и
подземной частей девясила иволистного не проводилось, не изучен состав
основных биологических групп биологически активных веществ.
3.
Отсутствуют методики количественного определения действующих
веществ, не предусмотрена стандартизация сырья основных групп биологически
активных веществ.
4.
Установлено,
что
не
изучены
морфологические
и
микродиагностические признаки сырья девясила иволистного, что обуславливает
24
необходимость проведения морфолого-анатомических исследований.
5.
Из анализа данных по применению в народной медицине следует, что
он широко применяется в народной медицине в качестве отхаркивающего,
противовоспалительного, потогонного и других средств. Однако изучение
фармакологической активности его весьма ограничено. Фармакологическая
активность была изучена в основном для соединений, входящих в состав
эфирного масла.
6.
Таким образом, фармакогностическое изучение девясила иволистного
является актуальным, что позволит расширить отечественную сырьевую базу
лекарственного растительного сырья, в том числе девясила высокого, для
получения лекарственных препаратов.
25
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Характеристика объектов исследования
Объектами наших исследований явились трава и корневища с корнями
девясила иволистного. Сырье заготавливали в течение 2010 – 2012 годов в
областях Центрального Черноземья: траву в период цветения растений,
корневища с корнями после плодоношения - осенью.
Сырье сушили при комнатной температуре с умеренной вентиляцией,
разложив на подстилках в один слой и периодически переворачивая.
Сырье упаковывали и хранили в соответствии с требованиями нормативной
документации при комнатной температуре в сухом, хорошо вентилируемом
помещении, не зараженном амбарными вредителями, без прямого попадания
солнечных лучей [64].
Объектами фармакологических исследований служили настои из травы и
отвар из корневищ с корнями девясила иволистного, которые готовили по ГФ XI
издания в соотношении 1:10 [64], полисахаридные комплексы, полученные из
травы и корневищ с корнями девясила иволистного.
2.2 Методы фитохимического исследования
Трава и корневища с корнями девясила иволистного были обследованы на
следующие группы веществ: углеводные производные, фенольные соединения,
азотсодержащие соединения, органические кислоты, тритерпеновые соединения,
каротиноиды,
минеральные
элементы,
эфирное
масло,
сесквитерпеновые
лактоны.
Для проведения фитохимического анализа готовили водные, водноспиртовые, гексановые извлечения из воздушно-сухого измельченного сырья.
26
2.2.1 Приготовление водных экстрактов для проведения качественных
реакций
5,0 г измельченного сырья заливали 50 мл воды очищенной и нагревали с
обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Извлечения
фильтровали, сырье заливали снова 50 мл воды очищенной, и операцию
повторяли
дважды.
Водные
извлечения,
полученные после
трехкратной
экстракции, объединяли, упаривали под вакуумом до 25 мл и использовали для
определения углеводных производных, дубильных веществ, азотсодержащих
соединений, сапонинов, органических кислот, тритерпеновых соединений.
2.2.2 Углеводные производные
Свободные сахара
Наличие свободных сахаров определяли реакцией Бертрана по образованию
кирпично-красных осадков меди закиси при нагревании смеси равных объемов
водных извлечений из травы и корневищ с корнями исследуемого растения и
реактива Фелинга [64,156], а также хроматографией на бумаге в системах
растворителей н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) и н-бутанол-кислота уксусная-вода
(2:7:1),
параллельно
с
достоверными
образцами
сахаров
[167].
После
хроматографирования хроматограммы обрабатывали раствором анилин-фталата.
Связанные сахара
а) качественное определение гликозидов проводили реакциями с реактивом
Фелинга и 20%-м раствором a-нафтола [168].
б) полисахариды определяли по образованию рыхлых осадков при
прибавлении к концентрированным водным извлечениям трехкратных объемов
27
спирта этилового 96% [64,155].
2.2.3 Азотсодержащие соединения
Качественное обнаружение азотистых оснований
Для определения азотистых оснований в траве и корневищах с корнями
исследуемого растения с водными извлечениями проводили качественные
реакции с раствором кислоты хлористоводородной и бриллиантовым зеленым; с
3% раствором кислоты фосфорновольфрамовой; с реактивом Манделина [23,132].
Для подтверждения наличия азотистых оснований водные извлечения
хроматографировали
на бумаге в системе растворителей: н-бутанол-кислота
уксусная-вода (4:1:2) [52].
Количественное определение азотистых оснований
Азотистые основания определяли модифицированной методикой Г.А.
Луковниковой и А.И. Есютиной. В основу методики положено определение
оптической плотности окрашенных комплексов азотистых оснований с солью
Рейнеке [26,48,131].
3,0 г измельченного сырья (точные навески) помещали в круглодонные
колбы вместимостью 200 мл, заливали 30 мл воды очищенной, взвешивали и
нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2
часов. Доводили объем до первоначальной массы водой очищенной, горячие
извлечения фильтровали через бумажные фильтры. В полученных извлечениях
определяли холин и сумму азотистых оснований.
Для определения холина 10 мл фильтратов помещали в колбы
вместимостью
50
мл,
прибавляли
по
каплям
раствор
кислоты
хлористоводородной 15 % до рН 3 (по универсальному индикатору). Полученные
28
растворы охлаждали до 0◦ С, прибавляли 15 мл раствора соли Рейнеке и оставляли
в холодильнике на 18 часов. Образовавшиеся осадки отфильтровывали через
стеклянные фильтры № 4 и промывали н-бутанолом порциями по 3-5 мл. Затем
осадки на фильтрах растворяли в ацетоне, и полученные фильтраты доводили в
пикнометрах
ацетоном
до
10
мл.
Растворы
не
позднее
5
минут
колориметрировали на фотоэлектроколориметре КФК-2 УХЛ 4.2 при синем
светофильтре (длина волны 40010 нм), в кювете с толщиной слоя 10 мм. В
качестве контрольного раствора использовали ацетон.
Для определения суммы азотистых оснований помещали 10 мл
фильтратов исследуемых растений в колбы вместимостью 50 мл, прибавляли 15
мл 0,1 н раствора калия перманганата и нагревали на кипящей водяной бане в
течение 10 мин для окисления других оснований до холина. После охлаждения
растворов до 0 С по каплям прибавляли раствор кислоты хлористоводородной
15% до рН 1 (по универсальному индикатору), далее анализ проводили как при
определении холина.
Параллельно в тех же условиях измеряли оптическую плотность
раствора стандартного образца холина хлорида с солью Рейнеке.
Качественное обнаружение аминокислот
Для качественного обнаружения аминокислот проводили с водными
извлечениями нингидриновую реакцию, а также анализировали их состав
хроматографией в тонком слое сорбента [28,29,42,64,100,134].
0,03-0,05 мл полученных извлечений наносили на пластинки "Силуфол" и
хроматографировали
в
системе
растворителей
спирт
этиловый
96%
–
концентрированный аммиак (16:4,5) с достоверными образцами аминокислот.
Хроматограммы высушивали на воздухе, обрабатывали спиртовым раствором
нингидрина 0,2% и нагревали в сушильном шкафу при 100-105 С в течение 3-5
минут. Аминокислоты проявлялись в виде красно-фиолетовых пятен [7,100].
29
Количественное определение аминокислот
Для подтверждения хроматографического анализа проведено качественное
и количественное определение аминокислот на аминокислотном анализаторе
марки LKB 4151 «Альфа плюс». Анализ проводился на базе испытательного
центра института животноводства НААН Украины. Для анализа аминокислот
траву и корни девясила иволистного исчерпывающе экстрагировали горячей
водой очищенной. Извлечения фильтровали, упаривали досуха в вакууме. Для
определения свободных аминокислот сухие остатки (точные навески) растворяли
в натриево-цитратном буфере (pH 2,2), объемы растворов доводили до 10 мл и
проводили анализ на аминокислотном анализаторе. Анализ аминокислот
проводили в стандартных условиях, обычно используемых для разделения
белковых гидролизатов [7,134,181].
Для количественной оценки определяли (автоматически) площади пиков
идентифицированных аминокислот. Количество каждой идентифицированной
аминокислоты
определяли
непосредственно
в
наномолях
использованной
для
и
нанограммах
анализа.
Затем
в
было
аликвоте,
рассчитано
количественное содержание обнаруженных свободных аминокислот в мг на 100
мг сырья.
Определение
связанных
аминокислот
проводили
после
кислотного
гидролиза. Для этого сухие остатки водного извлечения (точные навески)
помещали в ампулы и заливали раствором кислоты хлористоводородной (6
моль/л). Ампулы запаивали и выдерживали в сушильном шкафу в течение 24
часов при температуре 105-110С, после этого гидролизаты отфильтровывали.
Остатки на фильтрах промывали горячей водой очищенной до нейтральной
реакции (по универсальному индикатору). Фильтраты упаривали на водяной бане
до густой консистенции. К остаткам прибавляли воду очищенную (20 мл) и
продолжали
упаривать
до
прекращения
выделения
паров
кислоты
хлористоводородной. После окончания упаривания остатки заливали 10 мл
30
буферного раствора (pH 2,2), фильтровали в пробирки и проводили анализ на
аминокислотном анализаторе [73].
2.2.4 Дубильные вещества
Качественное обнаружение
Дубильные вещества определяли в водных
извлечениях с помощью
следующих качественных реакций:
-
к
5
мл
извлечений
по
каплям
прибавляли
равные
количества
свежеприготовленного 1%-го раствора желатины и кислоты хлористоводородной
10% [63];
- к 5 мл извлечений прибавляли 2-3 мл формальдегида и кислоты
хлористоводородной [63];
- к 5 мл извлечений прибавляли 1-2 мл раствора воды бромной 0,5% [63];
- к 5 мл извлечений прибавляли раствор железо - аммонийных квасцов 1% [63].
Количественное определение
Количественное
определение
дубильных
веществ
проводили
перманганатометрическим методом согласно методики ГФ XI издания [63].
Навески измельченного сырья (около 2 г – точная навеска) помещали в
конические колбы вместимостью 500 мл, заливали по 250 мл кипящей воды
очищенной и кипятили с обратными холодильниками в течение 30 минут. Затем
по 100 мл охлажденных извлечений процеживали в конические колбы
вместимостью 250 мл через вату. Далее отбирали по 25 мл полученных
извлечений в конические колбы вместимостью 750 мл, прибавляли 500 мл воды
очищенной, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титровали раствором калия
перманганата (0,02 моль/л) до золотисто-желтого окрашивания. Параллельно
31
проводили контрольный опыт.
2.2.5 Органические кислоты
Качественное обнаружение
Качественное обнаружение органических кислот проводили методом
тонкослойной хроматографии водного извлечения на пластинках "Силуфол" в
системе
растворителей:
спирт
этиловый
96%
-
раствор
аммиака
концентрированный (16:4,5), проявитель-раствор бромкрезолового зеленого
[61,86,100].
Количественное определение свободных органических кислот
Содержание свободных органических кислот проводили согласно методики
ГФ-XI издания титриметрическим методом [64].
Количественное определение аскорбиновой кислоты
Аскорбиновую кислоту определяли титриметрическим методом согласно
методике ГФ-XI издания [64]. Навески измельченного сырья 20 г (точные
навески) помещали в фарфоровые ступки, где растирали со стеклянным
порошком (около 5 г), постепенно добавляя 300 мл воды очищенной и настаивали
10 мин. Смесь хорошо размешивали и извлечения фильтровали. В конические
колбы вместимостью 100 мл вносили по 1 мл полученных фильтратов, 1 мл
раствора
кислоты
хлористоводородной
2
%, 13
мл
воды
очищенной,
перемешивали и титровали из микробюретки раствором 0,001 моль/л 2,6дихлорфенолиндофенолята натрия до появления устойчивой розовой окраски.
Содержание рассчитывали в % в пересчете на абсолютно сухое сырье.
32
2.2.6 Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование
природных соединений органическими растворителями
5,0 г измельченного до 1-2 мм сухих травы и корневищ с корнями девясила
иволистного экстрагировали спиртом этиловым 70%
до полного истощения
сырья (3-4 раза). Объединенные извлечения упаривали под вакуумом до водного
остатка,
охлаждали,
фильтровали
(отделяли
хлорофилл)
и
фильтраты
использовали для жидкостной экстракции органическими растворителями:
хлороформом, этилацетатом, бутанолом. Водные растворы спирто-водных
извлечений переносили в делительную воронку и взбалтывали с равными
объемами хлороформа. После разделения слоев органический растворитель
отделяли. Указанную процедуру проводили 7-8 раз. Хлороформные извлечения
объединяли. Далее водные растворы после экстракции хлороформом нагревали на
водяной
бане
для
удаления
хлороформа,
охлаждали
и
обрабатывали
этилацетатом. Затем водные растворы после экстракции этилацетатом нагревали
на водяной бане для удаления этилацетата, охлаждали и обрабатывали бутанолом.
Полученные с помощью органических растворителей извлечения упаривали в
вакууме до смолообразного остатка и использовали для проведения качественных
реакций и хроматографического анализа.
2.2.7 Кумарины
Определение кумаринов проводили в хлороформной фракции спиртоводных извлечений хроматографированием в тонком слое сорбента на пластинках
"Силуфол" в системе растворителей: бензол-этилацетат (2:1) с последующей
обработкой хроматограмм специфическими реактивами (пары аммиака, раствор
спиртовой
натрия
гидроксида
10%,
раствор
диазотированной
сульфаниловой) и просматривали в УФ-свете [64,103].
кислоты
33
2.2.8 Фенолкарбоновые кислоты
Фенолкарбоновые кислоты изучали в сырье исследуемого растения в
этилацетатной
фракции.
Определение
проводили
методом
бумажной
хроматографии этилацетатной фракции в системе растворителей: кислота
уксусная 2% и 5% с последующей обработкой специфическими реактивами:
парами аммиака, раствором железа хлорида (III) спиртовым 1% [9,51,123].
2.2.9 Флавоноиды
Качественное определение
Флавоноиды качественно определяли в этилацетатных фракциях и водных
остатках извлечений из травы и корневищ с корнями девясила иволистного с
помощью характерных качественных реакций:
- цианидиновой (к исследуемым извлечениям прибавляли концентрированную
кислоту хлористоводородную и магниевую стружку) [166,186,188,192];
- цианидиновой по Брианту:
(восстановление
исследуемого
после проведения цианидиновой реакции
вещества
водородом)
реакционную
смесь
разбавляли равным количеством воды очищенной, прибавляли 1 мл октанола и
взбалтывали [186];
- с раствором алюминия хлорида 2% [186,188];
- с раствором натрия гидроксида 10% [186,188];
- со свинца ацетатом [151,188,188];
- с борно-цитратным реактивом [166];
- с жидкостью Фелинга [53,153,185].
Для анализа флавоноидного состава нами также была использована
хроматография на бумаге, в системах растворителей: кислота уксусная 15 %;
бензол-этилацетат-кислота уксусная (50:50:1) [10,12,36,93,118,192], н-бутанол-
34
кислота
уксусная-вода
(40:12:28),
с
использованием
для
проявления
специфических реактивов (пары аммиака, спиртовый раствор натрия гидроксида,
метанольный раствор циркония хлорокиси 2 %) [8,38,47,57]. Хроматограммы
рассматривали в УФ-свете до и после обработки хромогенными реактивами.
Количественное определение
Для
количественного
определения
флавоноидов
использовали
спектрофотометрический метод. В основе метода анализа выбрана реакция
флавоноидов с алюминия хлоридом в среде спирта этилового 70% [13,15,16,21].
2.2.10 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ
Для исследования воздушно-сухие корневища с корнями и траву девясила
иволистного измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром
отверстия 2 мм по ГОСТ 214-83.
Около 8,0 г растительного сырья помещали в колбу объемом 250 мл,
прибавляли 60 мл спирта этилового 70%, присоединяли к обратному
холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента
закипания спирто-водной смеси в колбе. После охлаждения извлечения
фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и
доводили объем спиртом
этиловым 70% до метки (исследуемый раствор).
Параллельно готовили серию 0,05%
растворов стандартных образцов (РСО)
фенольных соединений в спирте этиловом 70%.
Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе
фирмы «GILSON» (Франция) (модель 305) с ручным инжектором RHEODYNE7125 (USA) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования,
используя программу Мультихром для «Windows» [106,146]. Детектирование
проводилось с помощью УФ-детектора GILSON UV-VIS (модель 151).
35
Хроматографическая колонка 4,6 х 250 мм Kromasil C 18 с размером частиц 5
мкм. Подвижная фаза
- смесь метанол-вода-концентрированная кислота
фосфорная в соотношении 400:600:5. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин,
рабочая длина волны 254 нм, объем пробы – 20,0 мкл, температура колонки
комнатная, время анализа 81,03 минуты для травы и 71,83 минуты для корневищ с
корнями.
Идентификацию разделенных веществ проводили путем сопоставления
времен удерживания пиков, полученных на хроматограмме пробы, с временами
удерживания стандартных растворов (РСО).
Методом внутренней нормализации определено относительное содержание
отдельных идентифицированных фенольных веществ в исследуемом образце
[21,32,36,146].
2.2.11 Тритерпеновые соединения
Качественное обнаружение
Наличие тритерпеновых соединений в сырье определяли в бутанольных
фракциях спирто-водных извлечений и водных извлечениях с помощью
качественных реакций [63,69].
Кроме того, для подтверждения наличия тритерпеновых соединений
бутанольные фракции хроматографировали в тонком слое сорбента в системе
растворителей: хлороформ-этилацетат (9:1), с последующим проявлением
раствором кислоты серной 20% [63,69].
36
Количественное определение
Содержание
тритерпеновых
фотоэлектроколориметрическим
методом,
соединений
основанным
определяли
на
реакции
с
концентрированной кислотой серной, с последующим измерением оптической
плотности [95,97].
5,0 измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбы вместимостью
100 мл и прибавляли 50 мл воды очищенной. Экстрагировали на кипящей
водяной бане с обратными холодильниками в течение 2 часов. Полученные
извлечения фильтровали в мерные колбы на 50 мл и доводили водой очищенной
до метки.
5 мл полученных извлечений помещали в колбы, прибавляли 3 мл смеси
концентрированной кислоты хлористоводородной и воды в соотношении 1:1,
нагревали на кипящей водяной бане с обратными холодильниками в течение 30
минут. Полученные растворы охлаждали под струей холодной воды и сливали в
делительные воронки; колбы, в которых проводили гидролиз, ополаскивали 5 мл
воды очищенной и добавляли смыв в делительные воронки, сюда же вносили 20
мл смеси хлороформ-спирт этиловый 96 % (5:1) и взбалтывали в течение 10
минут. Хлороформные извлечения фильтровали через фильтры с 5 г безводного
натрия сульфата в стеклянные колонки с 2 г алюминия оксида. Операцию
повторяли 3 раза, используя каждый раз по 20 мл смеси хлороформ-этанол.
Хлороформные элюаты упаривали на кипящей водяной бане досуха. Сухие
остатки переносили в мерные колбы на 25 мл спиртом этиловым 70 % и доводили
тем же растворителем до метки. К 5 мл полученных растворов прибавляли 5 мл
концентрированной кислоты серной, перемешивали. Через 30 минут измеряли
оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 490 нм,
используя в качестве раствора сравнения спирт этиловый 70 %.
37
2.2.12 Приготовление гексановых извлечений
Для
приготовления
гексановых
извлечений
1,0
г
воздушно-сухих
измельченных травы и корневищ с корнями девясила иволистного исчерпывающе
экстрагировали 150 мл гексана (при комнатной температуре) в течение 1 часа.
Гексановые извлечения концентрировали и использовали для определения
каротиноидов [113].
2.2.13 Каротиноиды
Качественное обнаружение
Полученные
извлечения
анализировали
методом
тонкослойной
хроматографии на пластинках "Силуфол" восходящим способом в системе
растворителей: гексан-ацетон (8:2) [37,64,113].
Количественное определение
Для количественного определения каротиноидов в сырье девясила
иволистного использовали спектрофотометрический метод [113]. Для этого 1,0 г
(точная
навеска)
измельченного
сырья
помещали
в
конические
колбы
вместимостью 100 мл с притертыми пробками, заливали 20 мл гексана и
экстрагировали при периодическом помешивании при комнатной температуре 15
мин. Затем гексановые извлечения сливали в мерные колбы вместимостью 100
мл, сырье заливали новыми порциями гексана (20 мл) и повторяли экстракцию
указанным выше способом. Экстрагирование растительного сырья проводили
трижды. Гексановые извлечения объединяли, доводили гексаном до 100 мл.
Оптическую плотность полученных извлечений измеряли на спектрофотометре
СФ-2000 при длине волны 453 нм.
38
2.2.14 Изучение липофильной фракции
Липофильные соединения из травы и корневищ с корнями девясила
иволистного исчерпывающе экстрагировали гексаном в аппарате Сокслета.
Исследование
ее
качественного
состава
проводили
методом
газовой
хроматографии – масс-спектрометрии (ГХ-МС) АТ-5975 SMART фирмы Agillent
Technologies (США). Хроматографическая колонка НР-5ms-30m (кварцевый
капилляр, длина 30м, внутренний диаметр 0,25мм, толщина фазы 25 мкм). Режим
хроматографирования 80-220 град., программирование 5 град./мин.
Идентификацию липофильных веществ проводили по масс-спектрам с
использованием штатной базы данных и программ Nist
ГХ-МС системы.
Количественные измерения проводили по площади хроматографического пика
веществ, а состав определяли в процентном выражении доли каждого пика по
отношению к сумме площадей целевых веществ [7].
2.2.15 Эфирное масло
Плотность эфирного масла корневищ с корнями девясила высокого при 300
С составляет 1,015-1,038 (тяжелее воды). Компоненты масла (в первую очередь
сесквитерпеновые лактоны
легкорастворимы в спирте этиловом 96%
и
хлороформе, но труднорастворимы в декалине. В связи с этим фармакопейные
методы для выделения эфирного масла из девясила иволистного так же, как из
девясила высокого, перегонкой с водой непригодны (масло не накапливается в
приемнике) [18].
В связи с чем нами был использован метод Клевенджера для получения
эфирного масла.
При экстракции сесквитерпеновых лактонов
из сырья хлороформом
соэкстрагируется большое количество примесей, что усложняет очистку. В связи
с
этим
использовали
специальный
прибор
для
выделения
из
сырья
39
сесквитерпеновых лактонов
методом перегонки водой и их улавливания
хлороформом. Прибор в основных узлах (кроме приемника) соответствует
фармакопейному прибору для определения
эфирного
масла по методу
Клевенджера. Прибор состоит из круглодонной колбы вместимостью 1000 мл с
насадкой Вюрца, соединенной с паропроводниковой изогнутой трубкой
холодильника, а также воронки для сбора дистиллята и приемника, который
охлаждают в сосуде [18].
С целью установления оптимальных условий перегонки изучали факторы,
влияющие на выход сесквитерпеновых лактонов из сырья девясила иволистного
[18].
Сесквитерпеновые лактоны
Качественное определение
Для качественного определения 2 г корневищ с корнями и травы девясила
иволистного, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с
диаметром отверстий 2 мм, помещали в круглодонные или конические колбы со
шлифом, добавляли 20 мл хлороформа, нагревали на водяной бане с обратным
холодильником и кипятили 10 минут. После охлаждения извлечения сливали,
сырье отжимали. Упаривали полученные извлечения в фарфоровых чашках на
водяной бане до 1-2 мл. Аликвоту полученных извлечений (0,01 мл) наносили на
линию старта хроматографической пластинки «Силуфол» размером 15х15 см.
Хроматографировали
в
системе
растворителей
бензол-этилацетат-спирт
метиловый 94:3:0,5. Время насыщения камеры парами растворителей 15 минут.
Фронт растворителя около 12 см. Хроматограмму сушили на воздухе в течение 5
минут,
опрыскивали
1%
раствором
ванилина
в
кислоте
серной
концентрированной и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105 0 С
в течение 5 минут [2,18].
40
Количественное определение
Для определения суммы сесквитерпеновых лактонов в корневищах с
корнями, а также в траве девясила иволистного использовали прибор, описанный
для получения эфирного масла. Аналитическую пробу сырья измельчали до
размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. Около 10 г
(точные навески) измельченного сырья помещали в круглодонные колбы, которые
затем присоединяли к прибору. При помощи трехходового крана соединяли
воронки с круглодонными колбами и приливали по 300 мл воды. Соединяли при
помощи трехходового крана круглодонные колбы с приемниками. Помещали в
приемники 10 мл хлороформа, а затем 50 мл воды. Опускали в приемники
воронки для сбора дистиллятов и укрепляли их таким образом, чтобы нижний
конец холодильника был направлен внутрь воронки, но не касался ее. Колбы с
содержимым в течение 3 часов нагревали и кипятили (скорость стекания
дистиллятов составляет 60-65 капель в 1 минуту). Через 5 минут после окончания
перегонки воронки для сбора дистиллята вынимали из сборника, а его
содержимое выливали в делительную воронку.
Приемники, воронки для сбора дистиллята промывали хлороформом,
используя каждый раз по 5-7 мл. Промывные фракции помещали в те же
делительные воронки, встряхивали их в течение 5 минут, давали отстояться 5
минут и сливали хлороформный (нижний) слой. Добавляли к водным остаткам по
10 мл хлороформа и далее поступали как указано выше.
Объединенные хлороформные извлечения выпаривали на кипящей водяной
бане до полного удаления хлороформа (контроль по запаху). Маслянистые
остатки растворяли в 10 мл 96% спирта этилового и количественно переносили в
мерные колбы вместимостью 25 мл. Объемы растворов доводили в колбах тем же
растворителем до метки, перемешивали. 10 мл полученных спиртовых растворов
помещали в круглодонные колбы со шлифом, прибавляли по 10 мл 0,1 М раствора
натрия гидроксида и кипятили с обратными холодильниками в течение 5 минут.
41
После охлаждения избыток натрия гидроксида оттитровывали 0,1 М раствором
кислоты
хлористоводородной
(индикатор
-
фенолфталеин).
Параллельно
проводили контрольный опыт. 1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида
соответствует 0,02323 г сесквитерпеновых лактонов в пересчете на алантолактон.
Содержание суммы сесквитерпеновых лактонов вычисляли в процентах в
пересчете на алантолактон и абсолютно сухое сырье [2,18].
2.2.16 Изучение минерального состава
Определение минерального состава проводили методом элементного
спектрального анализа с использованием полуколичественного элементного
спектрального анализа на приборе ДФС-8-1.
Анализируемые пробы тщательно высушивали, измельчали и подвергали
озолению в муфельной печи при t=450-500º С в течение 2 ч. Полученную золу
после охлаждения в эксикаторе взвешивали на аналитических весах и
анализировали. Содержание отдельных элементов определяли на спектрограммах
с погрешностью не более 2% в пересчете на сухое сырье [5,6,35,82,83].
2.3 Методы изучения полисахаридов
2.3.1 Выделение полисахаридов
Полисахариды из лекарственного растительного сырья выделяли по методу
Н.К. Кочеткова фракциями: водорастворимые полисахаридные комплексы, пектиновые вещества и гемицеллюлоза А и Б [19,56,107,110,155].
Выделение водорастворимых полисахаридных комплексов
Для получения полисахаридных фракций по 0,5 кг воздушно-сухого сырья
42
травы и корневищ с корнями девясила иволистного экстрагировали спиртом
этиловым 70% для извлечения фенольных соединений (рисунок 1) [25,61,63,73].
Далее полученный шрот экстрагировали горячей водой 1:20 при нагревании
до 95оС в течение 2 часов при постоянном перемешивании. Повторное извлечение
полисахаридов проводили дважды в соотношении 1:10 в течение часа.
Растительный материал отделяли центрифугированием, а объединенные водные
извлечения упаривали до 1/5 первоначального объема.
С целью дополнительной очистки от фенольных соединений водные
извлечения пропускали через слой полиамидного сорбента высотой 50 мм на
воронке Бюхнера диаметром 300 мм. Сорбент промывали небольшими порциями
воды, которые присоединяли к основной массе элюатов. После этого
полисахариды осаждали трехкратным объемом спирта этилового 96 % при
комнатной
температуре.
Выпавшие
плотные
осадки
полисахаридов
отфильтровывали, промывали спиртом этиловым, ацетоном и высушивали
[61,63].
Выделение пектиновых веществ
Для получения пектиновых веществ (ПВ) использовали шрот сырья,
оставшийся после выделения полисахаридов. Шрот сырья экстрагировали смесью
растворов кислоты щавелевой и аммония оксалата 0,5% (1:1) в соотношении 1:20
при 80-850С в течение 2,5 часов. Повторное извлечение проводили дважды в
соотношении 1:10. Экстракты концентрировали, диализовали и осаждали спиртом
этиловым 95% (1:5).
Выпавшие осадки пектиновых веществ отфильтровывали, промывали
спиртом этиловым и высушивали [1,33,34]
43
Выделение гемицеллюлозы А и Б
Шрот сырья, оставшийся после выделения пектиновых веществ,
использовали для получения гемицеллюлозы А и Б (ГЦ А и ГЦ Б). Для это его
заливали пятикратным объемом 10 % водного раствора натрия гидроксида и
оставляли при комнатной температуре на 12 часов. Затем процеживали через
четыре слоя марли. К полученному фильтрату прибавляли два объема кислоты
уксусной. Образовавшийся осадок отфильтровывали через фильтр. На фильтре
получался осадок гемицеллюлозы А в виде зеленовато-коричневой массы. К
фильтрату добавляли двукратный объем спирта этилового 96 % для осаждения
гемицеллюлозы
Б.
Полученный
осадок
отфильтровывали
через
фильтр,
промывали спиртом этиловым, высушивали [73,108].
Рисунок 1 - Схема выделения полисахаридных фракций из травы и
корневищ с корнями девясила иволистного
44
2.3.2 Кислотный гидролиз
Для определения мономерного состава водорастворимых полисахаридов,
пектиновых веществ и гемицеллюлозы А и Б проводили гидролиз кислотой
серной [35,41,153,154,168]. Эта минеральная кислота вызывает наименьшую
деструкцию полисахаридов и легко удаляется из реакционной смеси, что
обуславливает его использование.
Навески полисахаридных комплексов (0,05 г – точные навески) помещали в
ампулы емкостью 5-10 мл, прибавляли 2,5 мл 2 н раствора кислоты серной,
запаивали ампулы и проводили гидролиз при температуре 100-105 С в течение 6
часов для водорастворимых полисахаридов, 20-24 часов для пектиновых веществ
и 48 часов для гемицеллюлозы А и Б. Содержимое ампул переносили в
стаканчики, промывали ампулы 5 мл воды очищенной, нейтрализовали бария
карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной реакции. Растворы
фильтровали, фильтры промывали водой очищенной до объема фильтратов 10 мл.
К полученным растворам прибавляли 3 объема спирта этилового 96% при
исследовании водорастворимых полисахаридов, гемицеллюлозы А и Б и 5
объемов для пектиновых веществ, тщательно перемешивали и образовавшиеся
осадки отфильтровывали через 1-2 часа. Фильтраты упаривали на кипящей
водяной бане до получения объема около 0,5 мл (раствор А). Осадки бариевых
солей уроновых кислот снимали с фильтров, растворяли в 2,5 мл воды,
прибавляли катионит KУ-2 (Н+) до рН 3-4 по универсальному индикатору.
Растворы фильтровали, упаривали до получения около 0,5 мл раствора (раствор
Б) [41, 110,153,154,171].
2.3.3 Хроматографический анализ
Хроматографический анализ углеводов проводили на бумаге Filtraк–1.
Хроматографирование нейтральных моносахаридов (раствор А) осуществляли
45
методом нисходящей хроматографии в системе н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) в
течение 17-18 часов с образцами нейтральных моносахаридов [153,154,171], а для
изучения кислых моносахаридов (раствор Б) восходящую хроматографию в
системе: этилацетат – кислота уксусная – кислота муравьиная – вода (18:3:1:4) в
течение 5-6 часов с образцами кислот галактуроновых [4,110, 153,154,171].
2.3.4 Количественное определение моносахаридного состава
полисахаридных комплексов
Определение
количественного
содержания
сахаров
в
гидролизатах
водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ, гемицеллюлоз А и Б
проводили денситометрически после хроматографии в тонком слое сорбента
[41,72,163].
Точные навески (0,05 г) полисахаридных комплексов растворяли в 5 мл
раствора
кислоты
серной
(1
моль/л)
и
гидролизовали
6
часов
для
водорастворимых полисахаридов, 24 часа для пектиновых веществ и 48 часов для
гемицеллюлозы А и Б на кипящей водяной бане. Гидролизаты нейтрализовали
бария карбонатом и осадки отфильтровывали. Фильтраты упаривали до 1 мл и
осаждали 10 мл спирта этилового 96 %. Образовавшиеся осадки бариевых солей
уроновых кислот отделяли, промывали спиртом этиловым 80 %. Спирто-водные
фильтраты объединяли, упаривали в вакууме досуха. Сухие остатки, содержащие
сумму
нейтральных
моносахаридов,
растворяли
в
воде,
количественно
переносили в пикнометры и доводили водой до метки. Осадки бариевых солей
уроновых кислот снимали с фильтров, диспергировали в 2,5 мл воды, прибавляли
катионит KУ-2 (Н+) до рН среды 3-4 по универсальному индикатору. Растворы
фильтровали, упаривали в вакууме досуха. Сухие остатки, содержащие сумму
кислых моносахаридов, растворяли в воде, количественно переносили в
пикнометры и доводили водой до метки.
46
На пластинку с тонким слоем сорбента наносили микропипеткой по 0,025
мл полученных растворов параллельно с растворами образцов нейтральных и
кислых моносахаридов. В качестве образцов использовали моносахариды ЧДА,
которые дополнительно 3 раза перекристаллизовывали из водно-спиртовых
растворов и высушивали. Растворы сахаров наносили микропипеткой и пятна
высушивали в токе теплого воздуха. Хроматографирование вели в системе
растворителей: н.бутанол - кислота уксусная - вода (3:1:1). После разделения
сахаров хроматограммы высушивали на воздухе 2 часа, затем равномерно
обрабатывали анилиндифениламинофосфатным реактивом (5 объемов раствора
дифениламина 4% и 1 объем концентрированной кислоты ортофосфорной). После
выдержки на воздухе в течение 20 минут хроматограммы помещали в термостат
на 10 минут. Сахара проявлялись в виде голубовато-зеленых, синих и коричневых
пятен на бесцветном фоне. Концентрацию моносахаридов определяли на денситометре ERi фирмы "Карл Цейес Йена" (Германия). Количество сахаров
вычисляли в процентах.
2.3.5 Количественное определение функциональных групп
пектиновых веществ
Количественное определение функциональных групп пектиновых веществ –
свободных
карбоксильных,
метоксилированных
карбоксильных,
общее
количество карбоксильных, а также содержание метоксильных групп проводили
титрометрическим методом [58,77].
Для определения свободных карбоксильных групп (Кс) в исследуемых
образцах около 1,0 г (точные навески) пектиновых веществ помещали в
конические колбы емкостью 300 мл, смачивали 96%-м спиртом этиловым (во
избежание комкования), добавляли 100 мл воды очищенной, перемешивали и
оставляли на ночь для полного растворения пектинов. Затем смеси титровали
раствором натрия гидроксида (0,1моль/л) до появления не исчезающего в течение
47
минуты красного окрашивания при добавлении 6 капель индикатора Хинтона
(водные
растворы фенолового красного 0,4 %, бромтимолового синего,
крезолового красного и дистиллированной воды в соотношении 3:1:1:1) и
вычисляли процентное содержание свободных карбоксильных групп (Кс%).
Для определения метоксилированных карбоксильных групп (Км) к пробам
после определения содержания свободных карбоксильных групп добавляли точно
отмеренные 10 мл раствора натрия гидроксида (0,5 моль/л), закрывали колбы и
оставляли
на
2
часа
при
комнатной
температуре
для
омыления
метоксилированных карбоксильных групп. Затем в колбы вносили точно
отмеренные 10 мл раствора кислоты хлористоводородной (0,5 моль/л) и избыток
кислоты оттитровывали раствором натрия гидроксида (0,1 моль/л), далее
рассчитывали процентное содержание метоксилированных карбоксильных групп
(Км%).
Общее количество карбоксильных групп (Ко) равно сумме свободных и
метоксилированных карбоксильных групп (в процентах).
Степень метоксилированности (этерификации) пектинов () находили как
отношение содержания метоксилированных карбоксильных групп к общему
количеству карбоксильных групп (в процентах).
Процентное содержание метоксильных групп (ОСН3) вычисляли по
титрометрическим данным [34,77].
2.4 Определение числовых показателей сырья
2.4.1 Определение влажности
Влажность сырья девясила иволистного определяли согласно методике ГФ
XI издания, при высушивании сырья до постоянной массы, когда разница между
двумя следующими взвешиваниями после 30 минут высушивания и 30 минут
охлаждения в эксикаторе не превышает 0,01 г [64].
48
2.4.3 Определение экстрактивных веществ
Экстрактивные вещества в сырье девясила иволистного определяли
количественно в виде сухого остатка согласно методике ГФ XI издания. В
качестве растворителей использовали воду очищенную, спирт этиловый
различных концентраций (96%, 70%, 50%, 30%) [64].
2.5 Морфолого-анатомические исследования
Исследование проводили на свежем и гербарном материале, собранном в
Курской области в период массового цветения растения в течение 2010-2012
годов. Изучение анатомических признаков травы и корневищ с корнями девясила
иволистного проводили общепринятыми методами ГФ XI издания [64].
Для получения микрофотографий использовался лабораторный микроскоп
«Биолам С-11» с цифровой насадкой. Фотографии были обработаны на
компьютере с помощью программ Adobe Photoshop 7.0.
2.6 Методы токсико-фармакологических исследований
Экспериментальная работа выполнена на животных четырех видов:
беспородных белых крысах (180,0-220,0 г), беспородных белых мышах (18,020,0г), кроликах породы Шиншилла (массой 3,0-3,5 кг), лягушках.
Эксперименты проводили в соответствии с установленными документами
"Об утверждении правил лабораторной практики" (МЗ РФ, приказ № 267 от 19
июня 2003 г.), Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies (FDA, 21
CFR Part 58, 22.12.1978), OECD Principles on Good Laboratory Practice (OECD,
ENV/ MC/ CHEM (98) 17, 1977).
49
2.6.1 Изучение острой токсичности
Для определения острой токсичности использовали методику Штабского
Б.М. [89].
Исследования проводили на беспородных белых мышах обоего пола,
массой 18,0-20,0 г. Настои травы и отвар корневищ с корнями девясила
иволистного готовили в соотношении 1:10, вводили однократно внутрибрюшинно
в дозах от 1 г/кг до 5 г/кг (в пересчете на сухое сырье) в объемах от 0,2 до 1 мл.
Водорастворимые полисахаридные комплексы, полученные из травы и корневищ
с корнями исследуемого растения, вводили в дозах от 100 мг/кг до 300 мг/кг,
растворенные в воде очищенной. После введения изучаемых веществ каждую
группу животных (не менее 6 животных) помещали в изолированную клетку при
стандартном температурном и пищевом режиме и вели наблюдение в течение 24
часов [129,145].
2.6.2 Изучение отхаркивающего действия
Для исследования отхаркивающего действия использовали модель изучения
моторной функции мерцательного эпителия пищевода лягушки [58].
Лягушку фиксировали на корковой пластинке брюшком вверх. На кончик
языка наносили исследуемый раствор в количестве 0,1 мл. Для регистрации
движения ресничек использовали шелковую нить размером 15 мм, которую по
истечении 30 секунд после нанесения исследуемых препаратов помещали у
основания языка. По секундомеру замечали время, в течение которого
заглатывалась нить. Регистрировали время, затраченное на перемещение нитки на
10 мм без фитокомплекса (контроль) и после нанесения исследуемого
фитокомплекса.
Учитывая
значительный
разброс
исходных
скоростей
движения
мерцательного эпителия от одного животного к другому, нами предложен расчет
50
коэффициента ускорения (КУ), как отношения скорости, полученной после
аппликации исследуемого фитокомплекса к исходной. Уменьшение данного
коэффициента говорит о повышении двигательной активности мерцательного
эпителия [22,65].
Эффективность отхаркивающего действия сравнивали с фитокомплексами,
полученными из корневищ с корнями девясила высокого.
Настои из травы и отвар из корневищ с корнями девясила иволистного и
девясила высокого готовили в соотношении 1:10. Из полисахаридных комплексов
готовили водные растворы 1 %.
Эксперименты проведены на осенних лягушках Rana Temporarea.
2.6.3 Изучение противовоспалительной активности
Оценку противовоспалительного действия изучаемых водных извлечений и
водорастворимых полисахаридных комплексов проводили в соответствии с
методическими рекомендациями по исследованию противовоспалительных
препаратов,
влияющих
на
разные
стадии
процесса
воспаления
[22,129,139,145,147] .
Влияние на процессы экссудации
Антиэкссудативные свойства оценивали на модели острого воспалительного
отека, вызванного субплантарным введением в заднюю лапу мыши 0,1 мл 2,5%
водного раствора формалина [145].
В опыт брали две группы мышей массой 18-20 г. Одной из них за 2 часа до
введения формалина,
а затем через 5 часов и 18 часов после него вводили
внутрижелудочно различные фитокомплексы изучаемого растения. Настой и
отвар готовили в соотношении 1:10 и вводили в дозе 1 г/кг (в пересчете на сухое
сырье) массы тела (в объеме 0,2 мл на 20 г массы животного), водорастворимые
51
полисахаридные комплексы вводили в дозе 100 мг/кг (в объеме раствора 0,2 мл на
20 г массы животного). Мышам второй группы в те же сроки применяли воду
очищенную. Воспаление вызывали путем впрыскивания в мышцу бедра одной из
задних лапок 0,05 мл раствора формалина 2,5%. Через 24 часа после введения
формалина мышей забивали и у них отрезали воспаленные и невоспаленные
задние
лапки
на
уровне
тазобедренного
сустава.
О
выраженности
воспалительного отека судили по приросту веса воспаленных лапок, который
определяли по разнице в весе между воспаленными и невоспаленными лапками; о
противовоспалительном действии изучаемых фитокомплексов – по разнице
между величиной отека лапы, вызванного формалином у контрольных животных
и мышей, получавших изучаемые фитокомплексы. Препаратом сравнения служил
отвар корневищ с корнями девясила высокого в дозе 1 г/кг [145].
Влияние на пролиферацию
Антипролиферативные свойства исследуемых фитопрепаратов изучали на
модели "ватной гранулемы" у беспородных белых крыс массой 180-220 г [145].
У крыс, находящихся под легким эфирным наркозом, в области спины
тщательно выстригали шерсть и в асептических условиях делали разрез кожи и
подкожной клетчатки длиной 1-2 см. Затем пинцетом через образовавшийся
разрез кожи в подкожной клетчатке формировали полость, куда помещали
предварительно простерилизованный ватный шарик массой 25 мг, после чего
накладывали 1-2 шва. Через 7 дней, на протяжении которых внутрижелудочно
вводили исследуемые водные извлечения (настой и отвар) в соотношении 1:10 в
дозе 1 г/кг массы тела в пересчете на сухое сырье (1 мл), сумму полисахаридов в
дозе 100 мг/кг массы животного, имплантированный шарик с образовавшейся
вокруг него грануляционной тканью извлекали и высушивали до постоянной
массы при t 55-60С. Массу образовавшейся грануляционно-фиброзной ткани
определяли
по
разнице
между
массами
высушенной
гранулы
и
52
имплантированного ватного шарика. Препарат сравнения отвар корневищ с
корнями девясила высокого и воду очищенную (контроль) вводили в
аналогичных условиях.
Изучение капилляроукрепляющего действия
Антифлогистическую активность указанных фитокомплексов (настоя и
отвара в дозе 1 г/кг (в пересчете на сухое сырье), водорастворимых
полисахаридных комплексов в дозе 100 мг/кг) определяли при моделировании
локальной воспалительной реакции с помощью ксилола на кроликах-альбиносах
массой 3,0-3,5 кг [22,133].
У
кроликов предварительно выстригали шерсть на коже
живота.
Фитокомплексы вводили внутримышечно за час до введения индикатора
проницаемости, роль которого выполнял раствор трипановой сини. Трипановую
синь вводили в краевую вену уха в виде раствора 1 % на растворе натрия хлорида
0,9 % из расчета 2 мл на 1 кг массы животного. Длительная циркуляция краски в
кровеносном русле позволяет изучить нарушение проницаемости капилляров в
течение нескольких часов после ее введения. Показателем проницаемости
капилляров служило время появления на коже сине-окрашенных пятен и их
диаметр. По разнице во времени появления пятен и их диаметру до и после
введения фитокомплекса судили о его действии на проницаемость капилляров.
2.6.4 Изучение антимикробной активности
Изучение антимикробной активности водных извлечений из изучаемого
растения проводили на кафедре микробиологии КГМУ под руководством
кандидата медицинских наук, доцента О.Д. Печенина. Исследованы настои из
травы и отвар из корневищ с корнями в соотношении 1:10, на антибактериальную
активность
в
отношении
стандартного
набора
индикаторных
штаммов
53
микроорганизмов.
Антибактериальное
действие
водных
извлечений
из
исследуемых видов сырья девясила определяли методом внесения их на
питательную среду с последующим посевом
микробов на поверхность агара
[30,53,77,87,160].
Для этого из исследуемых водных извлечений готовили различные
разведения в стерильном расплавленном и остуженном до 50 С питательном
агаре. Содержимое после перемешивания заливали в стерильные чашки Петри и
оставляли при комнатной температуре. После застывания агара чашки делили на
сектора. Каждый сектор засевали штриховым методом взвесью суточных культур,
содержащей
100
млн.
микробных
тел
в
1
мл,
в
количестве
одной
бактериологической петли. Контролем являлись посевы тех же бактерий на
питательные среды, не содержащие испытуемых фитокомплексов. Посевы
инкубировали в термостате при температуре +37С. Результаты эксперимента
учитывали через 24 часа для исследуемых микроорганизмов и 48 часов (для
грибов рода Candida). При этом регистрировали интенсивность роста колоний
микроорганизмов
(сильный
рост,
слабый
рост)
или
его
отсутствие.
Антимикробную активность выражали в мкг/мл, в пересчете на действующие
вещества и воздушно-сухое сырье, из которого приготовлено водное извлечение
[109,136].
2.7. Статистическая обработка результатов эксперимента
Статистическую
обработку
результатов
по
химическому
и
фармакологическому экспериментам проводили согласно ГФ XI издания и
руководства по изучению новых фармакологических веществ, расчетные
формулы преобразовали в компьютерную программу Microsoft Excel [65,145].
1
ГЛАВА 3 ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
ДЕВЯСИЛА ИВОЛИСТНОГО
Из приведенного обзора литературы видно, что химический состав девясила
иволистного изучен недостаточно.
Первым
этапом
наших
исследований
явилось
предварительное
фитохимическое изучение надземной и подземной частей девясила иволистного
на наличие различных групп биологически активных соединений [глава 2,
разделы 2.2, 2.3]. В результате проведенных исследований установлено наличие
углеводов, азотсодержащих соединений, органических кислот, тритерпеноидов,
каротиноидов,
фенольных
соединений
(дубильных
веществ,
кумаринов,
фенолкарбоновых кислот, флавоноидов), эфирного масла, сесквитерпеновых
лактонов, минеральных элементов.
3.1 Углеводные производные
Свободные сахара
Наличие свободных сахаров определяли реакцией Бертрана, а также
хроматографией на бумаге [глава 2, раздел 2.2.2]. Сахара проявлялись в виде
пятен красно-коричневого цвета. В результате в траве девясила иволистного
обнаружили глюкозу и галактозу, в корневищах с корнями - фруктозу.
Связанные сахара
Связанные сахара определяли:
а) качественное определение гликозидов проводили реакциями с жидкостью
Фелинга и раствором -нафтола 20% [глава 2, раздел 2.2.2]. Появление осадков с
реактивом Фелинга, больших по объему, после гидролиза кислотой серной 5%,
2
свидетельствует о наличии сахаров в связанном виде. Положительные реакции с
-нафтолом (вишнево-красное кольцо) подтверждают наличие сахаров в траве и
корневищах с корнями девясила иволистного.
б) полисахариды определяли прибавлением к концентрированным водным
извлечениям
спирта этилового 96% [глава 2, раздел 2.2.2], что приводит к
выпадению рыхлых осадков. Полученные осадки отделяли, промывали спиртом,
ацетоном и высушивали. Осадки растворяли в воде и использовали для
проведения реакций с реактивом Фелинга и раствором меди сульфата.
Положительные реакции с реактивом Фелинга и раствором меди сульфата
свидетельствуют о наличии полисахаридов в траве и корневищах с корнями
девясила иволистного.
3.2 Азотсодержащие соединения
3.2.1 Азотистые основания
Азотистые основания играют важную роль в иммунных реакциях организма
[143].
Холин
входит
в
состав
фосфолипидов,
участвует
в
процессах
трансметилирования в качестве донора метильных групп, оказывает липотропное
действие [126]. Фосфолипиды необходимы для нормальной работы головного
мозга, печени и сердца – органов, где наиболее интенсивно протекают обменные
процессы [137]. Холин и бетаин оказывают влияние на условно рефлекторную
деятельность, на процессы возбуждения и торможения [60]. Все это говорит о
том, что определение азотистых оснований в траве и корневищах с корнями
девясила иволистного может определить их ценность.
3
Качественное обнаружение
Наличие азотистых оснований в траве и корневищах с корнями девясила
иволистного определяли с помощью качественных реакций и методом
хроматографии на бумаге [глава, 2 раздел 2.2.3] [79].
Хроматограммы проявляли парами йода в йодной камере. В результате в
извлечениях из травы девясила иволистного обнаружили 7 пятен с Rf 0,11, Rf 0,26,
Rf 0,34, Rf 0,44, Rf 0,57, Rf 0,71, Rf 0,87, а в корневищах с корнями 6 веществ с Rf
0,26, Rf 0,34, Rf 0,44, Rf 0,51, Rf 0,71, Rf 0,87, имеющих темно-оранжевую окраску,
отнесенные к азотистым основаниям (рисунок 2).
Рисунок 2 - Схема хроматограммы
водных извлечений из
травы и
корневищ
с
корнями
девясила
иволистного
А – трава девясила иволистного
Б – корневище с корнями девясила
иволистного
Система растворителей: н-бутанолкислота уксусная-вода (4:1:2)
А
Б
Количественное определение азотистых оснований
Результаты
количественного
определения,
проведенного
фотоэлектроколориметрическим методом [глава 2, раздел 2.2.3] показывают, что
содержание азотистых оснований в траве девясила иволистного составляет
0,83±0,04%, в том числе холина 0,29±0,01 %; а в корневищах с корнями 0,91±0,04
%, в том числе холина 0,14±0,004 %.
4
3.2.2 Определение аминокислот
Аминокислоты как составные части белков участвуют во всех жизненных
процессах наряду с нуклеиновыми кислотами, углеводами и липидами. Кроме
аминокислот, входящих в состав белков, живые организмы обладают постоянным
резервом свободных аминокислот, содержащихся в тканях и клеточном соке. Они
находятся в динамичном равновесии при многочисленных обменных реакциях.
Аминокислоты используются в биосинтезе фосфатидов, порфинов, нуклеотидов.
Тирозин и фенилаланин участвуют в биосинтезе флавоноидных соединений в
растениях [72,76,94,140].
Свободные аминокислоты нужны в живом организме и для выполнения
специфических задач. Так, глутаминовая кислота принимает участие в
углеводном обмене, метионин - в синтезе холина [139].
Аспарагиновая кислота, являющаяся предшественником оротовой кислоты
и далее пиримидинов, обладает иммуноактивными свойствами [121].
Многие аминокислоты выполняют важную роль в патогенезе сахарного
диабета, некоторые из них стимулируют инкрецию инсулина клетками
поджелудочной
железы.
Метионин
способен
выраженно
стимулировать
ослабленную сердечную деятельность через активацию обменных процессов;
аналогичный инотропный эффект обнаружен также у лейцина. Глицин и его
производные оказывают гиполипидемическое действие [121].
Однако, до сих пор лекарственные растения не рассматриваются в качестве
источников легкоусвояемой формы аминокислот в комплексе с микроэлементами
и другими фармакологически активными веществами с целью их использования
при лечении ряда патологий.
В связи с этим нами проведены исследования по изучению компонентного
состава свободных и связанных аминокислот и их количественного определения в
траве и корневищах с корнями девясила иволистного.
При качественном анализе смешивали равные объемы исследуемых водных
5
извлечений из травы и корневищ с корнями девясила иволистного и
свежеприготовленного раствора нингидрина 0,1% и осторожно нагревали [глава
2, раздел 2.2.3]. При охлаждении развивалось красно-фиолетовое окрашивание,
свидетельствующее о наличии аминокислот.
Результаты хроматографического анализа [глава 2, раздел 2.2.3] показали,
что аминокислотный состав травы и корневищ с корнями девясила иволистного
представлен аспарагиновой кислотой, треонином, серином, пролином, глицином,
аланином, лизином, цистеином, валином, метионином, изолейцином, лейцином,
тирозином, фенилаланином, гистидином, аргинином, глутаминовой кислотой.
Для подтверждения хроматографического анализа проведено качественное
и количественное определение аминокислот на аминокислотном анализаторе
марки
LKB
4151
«Альфа
плюс»
[глава
2
раздел
2.2.3].
Результаты
количественного анализа приведены в таблице 3. Определение связанных
аминокислот проводили после кислотного гидролиза [глава 2, раздел 2.2.3].
Таблица 3 - Содержание свободных и связанных аминокислот в траве и
корневищах с корнями девясила иволистного, мг/100 мг
Наименование
аминокислоты
1
Аспарагиновая
кислота
Треонин*
Серин
Глутаминовая
кислота
Пролин
Глицин
Аланин
Цистеин
Валин*
Метионин*
Трава
Содержание
Содержание
свободных
связанных
аминокислот
аминокислот
2
3
Корневища с корнями
Содержание
Содержание
свободных
связанных
аминокислот
аминокислот
4
5
0,03
0,30
0,07
0,32
0,03
0,02
-
0,25
0,25
0,05
0,05
0,15
0,15
0,42
-
0,30
0,05
0,09
0,11
0,04
0,01
0,32
0,25
0,26
Следы
0,65
0,15
0,07
0,22
0,21
0,07
0,02
0,35
0,16
0,16
Следы
0,47
0,10
6
1
Изолейцин*
Лейцин*
Тирозин
Фенилаланин*
Гистидин
Лизин*
Аргинин
Сумма
аминокислот
Сумма
незаменимых
аминокислот
Продолжение таблицы 3
5
0,18
0,23
0,13
0,25
0,10
0,30
0,35
2
0,01
0,06
0,06
0,03
0,03
0,04
0,06
3
0,23
0,36
0,22
0,33
0,10
0,15
0,20
4
0,02
0,11
0,07
0,05
0,04
0,07
0,11
0,67
4,44
1,23
3,70
0,22
2,12
0,39
1,68
Примечание: * - незаменимые аминокислоты.
Из данных таблицы 3 видно, что в траве и корневищах с корнями девясила
иволистного содержание суммы свободных аминокислот колеблется от 0,67
мг/100 мг до 1,23 мг/100 мг, среди них сумма незаменимых аминокислот
колеблется от 0,22 мг/100 мг до 0,39 мг/100 мг. Наибольшее суммарное
содержание свободных аминокислот обнаружено в корневищах с корнями – 1,23
мг/100 мг.
Содержание суммы связанных аминокислот колеблется от 3,70 мг/100 мг до
4,44 мг/100 мг, среди них сумма незаменимых аминокислот колеблется от 1,68
мг/100 мг до 2,12 мг/100 мг. Наибольшее суммарное содержание связанных
аминокислот обнаружено в траве – 4,44мг/100мг.
3.3 Дубильные вещества
3.3.1 Качественное обнаружение
Проведенные качественные реакции [глава 2, раздел 2.2.4] показали наличие
в траве и корневищах с корнями девясила иволистного дубильных веществ,
преимущественно конденсированной группы.
7
3.3.2 Количественное определение
Количественный
анализ
дубильных
веществ,
проведенный
методом
перманганатометрии [глава 2, раздел 2.2.4] показал, что их содержание в траве
девясила иволистного составляет 17,19±0,44 %, а в корневищах с корнями
7,20±0,20 % [3,4].
3.4 Органические кислоты
3.4.1 Качественное обнаружение
Качественное
обнаружение
органических
кислот
проводили
хроматографированием водного извлечения в тонком слое сорбента [глава 2,
раздел 2.2.5]. Идентификацию органических кислот проводили с достоверными
образцами, которые проявлялись в виде желтых пятен на синем фоне. В
извлечениях из травы девясила иволистного идентифицировали аскорбиновую,
щавелевую и винную кислоты, а в корневищах с корнями - аскорбиновую,
лимонную и винную кислоты (рисунок 3).
А
Б
В
Рисунок 3 - Схема хроматограммы
водных извлечений из травы и
корневищ с корнями девясила
иволистного
аскорбиновая кислота А – трава девясила иволистного
Б – корневища с корнями девясила
щавелевая кислота
иволистного
лимонная кислота
В – органические кислоты
винная кислота
Система растворителей:
спирт этиловый 96% – конц. раствор
аммиака (16:4,5)
8
3.4.2 Количественное определение свободных органических кислот
Определение содержания свободных органических кислот, проведенное
титриметрическим методом [глава 2, раздел 2.2.5], показало, что наибольшее
содержание суммы органических кислот отмечено в траве девясила иволистного
5,91±0,17 % (таблица 4).
Таблица 4 - Содержание органических кислот в траве и корневищах с корнями
девясила иволистного
Девясил иволистный
Трава
Корневище с корнями
Содержание аскорбиновой
кислоты, %
0,47±0,02
0,51±0,01
Содержание суммы
органических кислот, %
5,91±0,17
3,74±0,09
3.4.3 Количественное определение аскорбиновой кислоты
При количественном анализе аскорбиновой кислоты [глава 2, раздел 2.2.5],
установили (таблица 4), что ее содержание в траве девясила иволистного
составляет 0,47±0,02 %, в корневищах с корнями 0,51±0,01 %.
3.5 Кумарины
Присутствие кумаринов определяли методом тонкослойной хроматографии
[глава 2, раздел 2.2.7].
В траве и корневищах с корнями девясила иволистного обнаружено 1
соединение, отнесенное к производным кумарина (рисунок 4). С достоверным
образцом в них идентифицирован умбеллиферон.
9
А
Б
Рисунок 4 - Схема тонкослойной
хроматограммы
спирто-водных извлечений из травы и корневищ с
корнями девясила иволистного
А – трава девясила иволистного
Б – корневища с корнями девясила иволистного
В – умбеллиферон
Система растворителей:
Бензол-этилацетат (2:1)
В
3.6 Фенолкарбоновые кислоты
Для исследования фенолкарбоновых кислот использовали хроматографию
на бумаге спирто-водных извлечений из травы и корневищ с корнями девясила
иволистного [глава 2, раздел 2.2.8]. В результате проведенных исследований в
траве девясила иволистного обнаружили 3 соединения, а в корневищах с корнями
– 4, имеющих голубую и темную флюоресценции, отнесенные к производным
фенолкарбоновых кислот (рисунок 5). С достоверными образцами в траве и
корневищах с корнями девясила иволистного идентифицировали галловую,
хлорогеновую, кофейную кислоты.
А
Б
В
Г
Д
Рисунок 5 - Схема бумажной
хроматограммы спирто-водных извлечений
из травы и корневищ с корнями девясила
иволистного
А – трава девясила иволистного
Б – корневища с корнями девясила
иволистного
В – галловая кислота
Г – хлорогеновая кислота
Д – кофейная кислота
Система растворителей:
кислота уксусная 2%
10
3.7 Флавоноиды
3.7.1 Качественное определение
Наличие флавоноидов в спирто-водных извлечениях из травы и корневищ с
корнями девясила иволистного устанавливали известными качественными
реакциями [глава 2, раздел 2.2.9].
Результаты
качественных
реакций
флавоноидных гликозидов и агликонов как
свидетельствуют
в траве, так
о
наличии
и в корневищах с
корнями девясила иволистного.
Рисунок 6 - Схема бумажной хроматограммы
спирто-водных извлечений из травы и корневищ с
корнями девясила иволистного
А – трава девясила иволистного
Б – корневища с корнями девясила иволистного
В – витексин
Г – гиперозид
Д - рутин
Система растворителей: кислота уксусная 15 %
А
Б
В
Г
Результаты
Д
хроматографического исследования [глава 2, раздел 2.2.9]
позволили установить в траве девясила иволистного три вещества,
а в
корневищах с корнями двух соединений, в виде пятен с темной и желтой
флуоресценцией, отнесенные к флавоноидным соединениям (рисунок 6). С
достоверными образцами в траве идентифицировали витексин и гиперозид, а в
корневищах с корнями – рутин.
3.8 Изучение фенольных соединений травы и корневищ с корнями
девясила иволистного методом ВЭЖХ
11
Анализ фенольных соединений травы и корневищ с корнями девясила
иволистного проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе
фирмы «GILSON» (Франция) (модель 305) с ручным инжектором RHEODYNE7125 (USA) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования,
используя программу Мультихром для «Windows» [глава 2, раздел 2.2.10].
Методом ВЭЖХ в траве и корневищах с корнями девясила иволистного
обнаружено 22 вещества фенольной природы, которые в основном представлены
флавоноидами,
кумаринами,
фенолкарбоновыми
кислотами,
дубильными
веществами; из них 18 веществ были идентифицированы в траве, 15 - в
корневищах с корнями (таблица 5).
Таблица 5 – Результаты исследования фенольных соединений травы и корневищ с
корнями девясила иволистного методом ВЭЖХ
Трава девясила иволистного
Корневища с корнями девясила иволистного
Время
КоличестКоличестНаименоваВремя
Наименование
удерживенное
венное
ние
удерживаРСО
вания,
соотношение,
соотношение,
РСО
ния, мин
мин
%
%
1
2
3
4
5
6
Умбеллиферон*
3,055
1,060
Умбеллиферон*
3,070
1,800
Танин*
3,356
2,430
Танин*
3,363
5,040
Галловая кислота*
3,487
4,370
Галловая
4,126
12,090
кислота*
Эпикатехингаллат*
4,139
16,610
Дикумарин*
4,688
10,310
Дикумарин*
4,688
5,810
Цикориевая
5,064
27,750
кислота*
Цикориевая
5,110
10,160
Хлорогеновая
5,890
4,490
кислота*
кислота
Хлорогеновая
5,382
15,870
Эпикатехин*
6,501
3,100
кислота
Кофейная кислота
7,354
1,940
Неидентифици7,111
4,170
рованное
вещество
Неидентифицированное вещество
Дигидрокумарин*
7,779
4,860
9,627
0,810
Дигидрокверцетин*
13,330
3,950
Кофейная
кислота
Феруловая
кислота*
Гесперидин*
7,717
4,620
8,588
3,210
14,040
4,600
12
2
3
Гесперидин*
1
14,710
5,420
Гиперозид
Неидентифицированное вещество
16,370
19,810
2,740
6,400
Коричная кислота*
24,460
6,590
Скополетин (7-окси-6метоксикумарин)*
Розмариновая
кислота*
29,100
0,720
33,630
2,640
Катехин*
42,990
0,410
4
Неидентифицированное
вещество
Рутин*
Неидентифицированное
вещество
Лютеолин-7глюкозид*
Коричная
кислота*
Неидентифицированное
вещество
Неидентифицированное
вещество
Продолжение таблицы 5
5
6
15,580
3,270
17,570
18,590
0,610
1,010
20,900
0,420
23,120
1,340
40,230
0,560
43,450
1,280
*- обозначенные вещества, выделены из исследуемого растения впервые
Было установлено, что из веществ кумариновой природы в траве девясила
иволистного содержится 4 соединения, в корневищах с корнями – 3; флавоноиды
представлены 5 соединениями в траве и 4 в корневищах с корнями, производные
фенолкарбоновых кислот 6 соединениями в траве и 4 в корневищах с корнями;
производные дубильных веществ в траве представлены 3 соединениями, а в
корневищах с корнями – 2 соединениями.
Из таблицы 5 видно, что преобладающим кумарином в траве и корневищах
с корнями девясила иволистного является дикумарин; среди флавоноидов
преобладает гесперидин в траве, изовитексин и витексин в корневищах с
корнями; среди фенолкарбоновых кислот – хлорогеновая кислота в траве и
цикоревая кислота – в корневищах с корнями; среди производных дубильных
веществ - эпикатехингаллат в траве и танин в корневищах с корнями.
Количественное определение флавоноидов и фенолкарбоновых кислот
в траве и корневищах с корнями девясила иволистного
Поскольку фенольные соединения являются одной из основных групп
13
биологически активных веществ девясила иволистного, было интересным
проведение
количественного определения основных из них. Определение
проводили методом ВЭЖХ [120].
Для этого около 8,0 г (точная навеска) исследуемого сырья помещали в
колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 70 мл спирта этилового 70%,
присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в
течение 1 часа с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. После
охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу на 100
мл и доводили спиртом этиловым 70% до метки (испытуемый раствор).
Количественное
проводили
методом
содержание
абсолютной
преобладающих
калибровки
флавоноидных
с
помощью
веществ
программы
«Мультихром» для «Windows» [120].
В результате установлено содержание преобладающих веществ в траве и
корневищах с корнями девясила иволистного (таблица 6).
Таблица 6
- Содержание флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в траве и
корневищах с корнями девясила иволистного, %
Исследуемые соединения
Изовитексин
Витексин
Геспередин
Хлорогеновая кислота
Розмариновая кислота
Галловая кислота
Цикориевая кислота
Трава
0,21
0,30
Корневища с корнями
0,08
0,14
1,48
0,65
0,20
0,71
Таким образом, достаточно высокое содержание витексина, изовитексина,
хлорогеновой кислоты в траве и галловой и цикоревой кислот в корневищах с
корнями девясила иволистного свидетельствуют о том, что данное растение
может быть источником этих соединений.
3.9 Тритерпеновые соединения
14
3.9.1 Качественное обнаружение
В результате проведенных качественных реакций установлено наличие
сапонинов в исследуемом растении [глава 2, раздел 2.2.11] и определено, что они
являются тритерпеновыми соединениями.
Хроматографический
анализ
бутанольных
фракций
спирто-водных
извлечений из травы и корневищ с корнями девясила иволистного в системе
растворителей - хлороформ-этилацетат (9:1) [глава 2, раздел 2.2.11] показал
наличие в извлечениях из травы 4 зон малинового цвета, а в корневищах с
корнями 3 зон, отнесены к тритерпеновым соединениям (рисунок 7). С
достоверными образцами в извлечении из травы девясила иволистного
идентифицирована урсоловая кислота.
Rf 0,87
Rf 0,65
Rf 0,62
Rf 0,48
Урсоловая
кислота
Rf 0,13
А
Б
В
Рисунок 7 - Схема тонкослойной
хроматограммы бутанольных фракций
спирто-водных извлечений из травы и
корневищ
с
корнями
девясила
иволистного
А – трава девясила иволистного
Б – корневища с корнями девясила
иволистного
В – урсоловая кислота
Система растворителей:
хлороформ – этилацетат (9:1)
3.9.2 Количественное определение тритерпеновых соединений
В результате фотоэлектроколориметрического определения тритерпеновых
сапонинов [глава 2 раздел 2.2.11] установлено, что их содержание в траве
девясила иволистного составляет 0,045±0,001%, в корневищах с корнями
0,090±0,001%.
15
3.10 Каротиноиды
Качественное обнаружение
Наличие каротиноидов установили методом тонкослойной хроматографии
гексановых извлечений из травы и корневищ с корнями девясила иволистного в
системе растворителей: гексан-ацетон (8:2) [глава 2, раздел 2.2.13]. В результате в
извлечениях из травы и корневищ с корнями содержится по 3 зоны желтой
окраски каротиноидной природы с (Rf 0,08, Rf 0,17, Rf 0,56) в траве и (Rf 0,08, Rf
0,17, Rf 0,43) в корневищах с корнями (рисунок 8).
Rf 0,56
Rf 0,43
Rf 0,17
Rf 0,08
А
Рисунок 8 - Схема тонкослойной
хроматограммы гексановых извлечений из
травы и корневищ с корнями девясила
иволистного
А – трава девясила иволистного
Б – корневища с корнями девясила иволистного
Система растворителей:
гексан – ацетон (8:2)
Б
Количественное определение каротиноидов
Количественное
определение
каротиноидов
спектрофотометрическим
методом [глава 2, раздел 2.2.13] показало, что содержание их в траве девясила
иволистного составляет 7,01±0,27 мг%, в корневищах с корнями 1,31±0,06 мг%.
3.11 Изучение липофильной фракции методом газовой хроматографиимасс-спектрометрии (ГХ-МС)
16
Методом ГХ-МС (глава 2, раздел 2.2.14 ) в составе липофильной фракции
корневищ с корнями
девясила иволистного идентифицировали 30 веществ, а
травы – 11 веществ (таблица 7, рисунки 9,10).
Таблица 7 - Состав гексановых извлечений из травы и корневищ с корнями
девясила иволистного
№ п/п
Соединения
1
1
2
3
4
2
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Борнилацетат
Пачулен
Лонгипинен
Лонгициклен
Цис-(-)-2,4a,5,6,9a-гексагидро-3,5,5,9тетраметил(1H)
безоциклогептен
Маалиен
Элемен
Неизвестное
Циперен
Тимогидрохинон, диметиловый эфир
Пропофол (диизопропилфенол)
a-Бергамотен
Эпи-δ-Сантален
δ -Эудисмен
δ -Сантален
Кариофиллен
Циперен
Диметоксиацетофенон
Изокариофиллен
Эликсен
Шамигрен
δ -Бисаболен
Валенцен
Лонгифолен-альдегид
Калеминен
Карифилен-оксид
Ледол
Неизвестное
Дитретбутил-диметокси-бензол, производное
Неизвестное
Неизвестное
Неизвестное
Неизвестное
Неизвестное
Неизвестное
Корневища
с корнями
3
0,11
0,04
0,12
0,19
Трава
4
0,07
0,33
0,19
0,88
0,69
16,82
2,74
0,43
1,93
0,28
0,8
1,24
0.49
0,69
2,22
0,35
0,71
0,95
0,17
0,98
0,53
0,37
0,9
2,18
31,37
3,37
1,7
11,98
0,67
1,52
2,42
1,8
2,5
17
1
36
37
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
Продолжение таблицы 7
3
4
0,59
1,53
2,13
1,21
0,58
1,37
1,24
1,1
38,4
4,7
2,9
10
3,2
23,7
3,4
3,4
2
Неизвестное
Неизвестное
Неизвестное
Октакозан
Неизвестное
Нанокозан
Триакозан
Эудесмол
1,4-ди-t-Бутил-2,5-диметоксибензен (производное)
Тетрадекановая кислота
1б4-ди- t -Бутил-2,5-диметоксибензен(производное)
Гексагидрофарнезил - ацетон
Гексадеценовая кислота
Гексадекановая кислота
Гентриаконтан (н-С31 углеводород)
Дотриаконтен (н-С32:1)
A b u n d a n c e
T IC : IN U L A G R A S .D
1 5 0 0 0 0 0
1 4 0 0 0 0 0
1 3 0 0 0 0 0
1 2 0 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
0
4 .0 0
6 .0 0
8 .0 0
1 0 .0 0
1 2 .0 0
1 4 .0 0
1 6 .0 0
1 8 .0 0
2 0 .0 0
2 2 .0 0
2 4 .0 0
2 6 .0 0
T im e - - >
Рисунок 9 - Схемы хроматограммы хромато-масс-спектрального анализа
гексановых фракций травы девясила иволистного
Из
липофильных
веществ
в
корневищах
с
корнями
преобладае
тимогидрохинон деметиловый эфир и дитретбутил-диметоксибензол, а в траве
производное 1,4-ди-t-Бутил-2,5-диметоксибензен и гексадекановая кислота.
18
A b u n d a n c e
T IC : IN U L A R U T .D
1 7 .6 5
1 2 .5 3
1 9 .9 1
4 0 0 0 0 0 0
3 5 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0 0
1 8 .8 5
1 2 .7 4
1 3 .8 2
1 3 .0 7
1 6 .9 7
1 8 .9 6
1 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0
1 0 .0 3
0
1 0 .0 0
2 4 .4 4
2 1 .0 4
2 0 .5 5
2 2 .1 4
1 3 .5 7
1 41 . 40 .74 0
1 2 . 2 5 1 3 1. 23 9. 7 4
1 3 .9 8
1 6 .6 9
1 2 . 3 4 1 3 . 6 21 4 . 6 3
1 2 .8 3 1 3 .9 1
1 5 .5 7
1 1 .9 6 1 3 .2 2
1 4 .2 4
1 11 .27 . 70 4
11 11 .1.331 08. 8 0
1 2 .0 0
1 4 .0 0
1 6 .0 0
2 6 .2 8
2 5 .1 3
2 7 .0 2
2 3 .0 5
2 0 .0 9
2 5 .2 4
2 1 .1 5
1 8 .0 0
2 0 .0 0
2 2 .0 0
2 4 .0 0
2 6 .0 0
T im e - - >
Рисунок 10 - Схемы хроматограммы хромато-масс-спектрального анализа
гексановых фракций корневищ с корнями девясила иволистного
3.12 Эфирное масло
Содержание эфирного масла определяли в приборе, который соответствует
фармакопейному прибору для
определения
эфирного
масла по
методу
Клевенджера [64] в течение 3 часов при соотношении сырья и воды 1:30 [глава 2,
раздел 2.2.15]. Экспериментально установлено, что содержание эфирного масла в
корневищах с корнями колеблется от 0,88 % до 1,12%, в траве - от 0,33% до
0,47%.
При этом наибольшее количество эфирного масла накапливается в
корневищах с корнями.
3.13 Сесквитерпеновые лактоны
Хроматографический анализ хлороформных фракций из корневищ с
19
корнями и травы девясила иволистного [Глава 2, раздел 2.2.15] показал наличие
в извлечениях по 5 пятен, отнесенных к сесквитерпеновым лактонам. В траве и
корневищах с корнями наличие двух пятен с Rf 0,30-0,32 (красно-фиолетового
цвета), соответствующее стандартному образцу алантолактона и Rf 0,40-0,44
(красно-фиолетового
цвета),
соответствующее
стандартному
образцу
изоалантолактона, а также с Rf 0,20 (коричневого цвета у корневищ с корнями,
и сине-зеленого у травы) и Rf 0,96 (красно-фиолетового цвета). В траве может
быть дополнительное пятно с Rf 0,88 (фиолетового цвета), а в корневищах с
корнями с Rf 0,80 (грязно-розового цвета), (рисунок 11).
Рисунок 11 Схема тонкослойной
хроматограммы хлороформных извлечений из
травы и корневищ с корнями девясила
иволистного
А – трава девясила иволистного
Б –корневища с корнями девясила иволистного
В – смесь алантолактона и изоалантолактона
Система растворителей:
Бензол-этилацетат-спирт метиловый 94:3:0,5
Rf 0.96
Rf 0.88
Rf 0.80
Rf 0.44
Rf 0.32
Rf 0.20
А
Б
В
Преобладающим в траве и корневищах с корнями является изоалантолактон
(Rf 0,44). Алантолактон в траве содержится в незначительных количествах.
3.14 Минеральный состав растений
Биологическая роль минеральных веществ в организме человека велика;
вступая в соединения с химическими регуляторами обмена веществ, они
участвуют в различных биохимических процессах, стимулируют и нормализуют
обмен веществ [114,121,173].
Известно,
что
микроэлементы
обладают
высокой
биологической
20
активностью, оказывают многостороннее влияние на организм, находятся в
тесной
взаимосвязи
с
другими
биологически
активными
веществами
[148,157,198].
Макро-
и
микроэлементы
способны
повысить
неспецифическую
резистентность организма к различным воздействиям. Так, железо играет важную
роль в процессах выделения энергии, в ферментативных реакциях, в обеспечении
иммунных функций, в метаболизме холестерина [148]; цинк является кофактором
большой группы ферментов, участвующих в белковом и других видах обмена,
поэтому необходим для нормального протекания многих биохимических
процессов [148]. Серебро, медь и магний оказывают стабилизирующее действие
на клеточные мембраны, участвуют в восстановлении осмотического давления в
клетке [7,20].
В последнее время накопились сведения о микроэлементозах как у человека,
так и у животных, вызванных дисбалансом микроэлементов в организме [142].
Ценным источником минеральных элементов могут стать лекарственные
растения и препараты, полученные из них[135].
Для более полной характеристики химического состава травы и корневищ с
корнями девясила иволистного было проведено определение минерального
комплекса с использованием рентгенофлюресцентного анализа [глава 2, раздел
2.2.16] (таблица 8).
Таблица 8 - Содержание макро- и микроэлементов в траве и корневищах с
корнями девясила иволистного
Химический
элемент
1
Медь
Цинк
Свинец
Серебро
Содержание минеральных элементов в
пересчете на золу, мг/кг
Корневища
Трава
с корнями
2
3
300
50
60
50
25
10
0,3
0,1
21
1
2
2
500
150
2500
500
100
1000
100
80
30
30
8
15
Молибден
Барий
Стронций
Фосфор
Марганец
Никель
Титан
Ванадий
Хром
Цирконий
Литий
Кобальт
Иттрий
Продолжение таблицы 8
3
1
200
200
5000
500
<10
<30
<10
20
<30
<20
<3
<10
Проведенные исследования показали, что наряду с макроэлементами,
содержащимися в большинстве растений, трава и корневища с корнями девясила
иволистного накапливают значительные количества микроэлементов, таких, как
медь, цинк, стронций, марганец, титан, ванадий, хром, цирконий, литий, кобальт.
Высоким содержанием меди, марганца, никеля, титана, ванадия, хрома, циркония,
лития отличаются надземные органы (трава) девясила иволистного, а подземные
органы – стронция, фосфора, марганца.
Концентрации токсичного элемента свинца в исследуемом растении
варьирует от 10 мг/кг до 25 мг/кг, при этом в надземных органах его содержится в
2,5 раза больше, чем в подземных. Установлено, что содержание свинца в
подземных органах девясила иволистного не превышает ПДК для чая (сан. ПиН
2.3.2.1078-01); в траве же наблюдается превышение ПДК по содержанию свинца,
что, видимо, было связано с техногенным загрязнением участка заготовки.
3.15 Изучение углеводов
Анализ литературных данных показал, что растения рода девясил богаты
полисахаридами [145]. Предварительными качественными исследованиями в траве
и корневищах с корнями девясила иволистного нами обнаружены значительные
22
количества полисахаридов, поэтому представляло интерес их выделить и изучить.
3.15.1 Выделение полисахаридов
Располагая данными о наличии в изучаемом растении полисахаридов, нами
на первом этапе проведено их выделение и далее изучен их качественный и
количественный состав. Полисахариды из лекарственного растительного сырья
выделяли
по
методу
Н.К.
Кочеткова
фракциями:
водорастворимые
полисахаридные комплексы, пектиновые вещества и гемицеллюлоза А и Б [глава
2 раздел 2.3.1].
Выделение водорастворимых полисахаридных комплексов
Выход водорастворимых полисахаридных комплексов из травы девясила
иволистного составил 6,87%, из корневищ с корнями – 8,86% (таблица 9).
Таблица 9 - Выход фракций полисахаридных комплексов из травы и корневищ с
корнями девясила иволистного
Фракции полисахаридов, %
Девясил
иволистный
Трава
Корневища с
корнями
водорастворимый
полисахаридный
комплекс
6,87
пектиновый
комплекс
8,86
гемицеллюлоза гемицеллюлоза
А
Б
3,23
3,34
5,97
15,10
3,07
2,86
Водорастворимые полисахаридные комплексы, выделенные из травы и
корневищ с корнями девясила иволистного, представляют собой аморфные
порошки от светло-серого до светло-коричневого цвета; при растворении в воде
образуют опалесцирующие
растворы
(рН
1% водных растворов 5-6);
растворяются также в водных растворах кислот и щелочей и не растворяются в
23
органических растворителях. Полисахаридные комплексы давали положительные
реакции осаждения со спиртом, ацетоном, реакцию с реактивом Фелинга после
кислотного расщепления полисахаридов [153,154,178,195].
Выделение пектиновых веществ
Выход пектиновых веществ из травы девясила иволистного составил 3,23%,
из корневищ с корнями – 15,10% (таблица 9).
Выделенные пектиновые вещества представляли собой аморфные порошки
светло-кремового цвета; они хорошо растворимы в воде с образованием вязких
растворов (рН 1% водных растворов находится в пределах 3-4). Водные растворы
пектиновых
веществ
осаждаются
1%
раствором
алюминия
сульфата
с
образованием пектатов [117].
Выделение гемицеллюлозы А и Б
Выход гемицеллюлозы А из травы девясила иволистного составил 3,34%, из
корневищ с корнями - 3,07%, гемицеллюлозы Б – 5,97% и 2,86% соответственно
(таблица 9).
3.15.2 Исследование углеводных производных
Исследование продуктов кислотного гидролиза полисахаридных
комплексов методом хроматографии на бумаге
Для определения мономерного состава полученных полисахаридных
комплексов проводили их гидролиз кислотой серной [глава 2, раздел 2.3.2] и
исследовали моносахариды методом хроматографии на бумаге [глава 2, раздел
2.3.3] [81,150,154,168].
24
Хроматограммы высушивали на воздухе 1 час, обрабатывали раствором
анилингидрофталата и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105оС.
Через 10-15 минут наблюдали наличие пятен. Хроматографически в гидролизатах
исследуемых ВРПС, полученных из травы обнаружено 7 веществ, а в корневищах
с корнями девясила иволистного обнаружили 6 веществ (рисунки 12,13).
А
Б
В
галактоза
глюкоза
арабиноза
фруктоза
ксилоза
рамноза
галактуроновая
кислота
глюкуроновая
кислота
А
Б
В
Рисунок
12
Схема
хроматограммы
продуктов
кислотного
гидролиза
водорастворимых полисахаридов
из травы и корневищ с корнями
девясила иволистного
А – трава девясила иволистного
Б – корневища с корнями
девясила иволистного
В – смесь моносахаров
Система
растворителей:
нбутанол–пиридин – вода (6:4:3)
Рисунок 13 - Схема хроматограммы
продуктов кислотного
гидролиза
водорастворимых полисахаридов из
травы и корневищ с корнями
девясила иволистного
А – трава девясила иволистного
Б – корневища с корнями девясила
иволистного
В – смесь уроновых кислот
Система растворителей:
Этилацетат-кислота уксусная–
кислота муравьиная–вода (18:3:1:4)
С достоверными образцами в ВРПС травы идентифицировали: галактозу,
арабинозу, ксилозу, рамнозу, галактуроновую и глюкуроновую кислоты, а в
ВРПС из корневищ с корнями – галактозу, глюкозу, фруктозу, ксилозу, рамнозу,
глюкуроновую кислоту.
25
В гидролизатах исследуемых пектиновых веществ (ПВ), полученных из
травы девясила иволистного обнаружили 5 веществ, а из корневищ с корнями 4
соединения (рисунки 14,15).
А
Б
Рисунок 14 – Схема хроматограммы
продуктов кислотного гидролиза
пектиновых веществ из травы и
корневищ с корнями девясила
иволистного
А – трава девясила иволистного
Б – корневища с корнями девясила
иволистного
В – смесь моносахаров
Система растворителей: н-бутанолпиридин-вода (6:4:3)
В
галактоза
глюкоза
арабиноза
ксилоза
рамноза
галактуроновая
кислота
А
Б
В
Рисунок 15 – Схема хроматограммы
продуктов кислотного гидролиза
пектиновых веществ из травы и
корневищ с корнями девясила
иволистного
А – трава девясила иволистного
Б – корневища с корнями девясила
иволистного
В – галактуроновая кислота
Система растворителей: этилацетатуксусная
кислота-муравьиная
кислот-вода (18:3:1:4)
С достоверными образцами в исследуемых пектино¬вых веществах
идентифицировали:
галактозу,
глюкозу,
арабинозу,
ксилозу,
рамнозу,
галактуроновую кислоту.
В гидролизатах, исследуемых гемицеллюлоз А и Б (Гц А, Гц Б), полученных
из травы девясила иволистного, обнаружили 3 вещества, а
из корневищ с
26
корнями - 4 вещества (рисунок 16).
А
Б
В
галактоза
глюкоза
арабиноза
ксилоза
С
достоверными
Рисунок 16 - Схема хроматограммы
продуктов
кислотного
гидролиза
гемицеллюлозы А и гемицеллюлозы Б
из травы и корневищ с корнями
девясила иволистного
А – трава девясила иволистного
Б - корневища с корнями девясила
иволистного
В – смесь моносахаров
Система растворителей: н-бутанол –
пиридин – вода (6:4:3)
образцами
в
исследуемых
гемицеллюлозах
идентифицировали галактозу, глюкозу, ксилозу, арабинозу.
По величине и интенсивности окраски, по предварительной качественной
оценке в ВРПС травы девясила иволистного основными по содержанию были
галактоза и арабиноза, а корневищ с корнями – галактоза и фруктоза, в ПВ –
основу составляет галактуроновая кислота, а в Гц А и Гц Б основной по
содержанию была ксилоза.
Количественное определение моносахаридного состава полисахаридных
комплексов
Определение количественного состава моносахаридов в гидролизатах
полисахаридных комплексов проводили денсиометрически после кислотного
гидролиза [глава 2, раздел 2.3.4]. Результаты исследований представлены в
таблице 10.
27
Таблица 10 - Содержание моносахаридов в полисахаридных комплексах из травы
и корневищ с корнями девясила иволистного
Моносахаридный состав, %
Водороастворимые
полисахариды
Пектиновые
вещества
Гемицеллюлоза А
Гемицеллюлоза Б
Трава
арабиноза
галактоза
глюкоза
ксилоза
рамноза
фруктоза
галактуроновая кислота
глюкуроновая кислота
арабиноза
галактоза
глюкоза
ксилоза
рамноза
галактуроновая кислота
глюкуроновая кислота
арабиноза
11,6
9,3
0,9
1,4
3,2
1,2
3,1
2,9
0,3
0,6
87,5
-
Корневища с
корнями
4,8
1,7
0,3
0,3
8,3
0,9
1,7
1,3
1,9
86,4
1,1
галактоза
глюкоза
ксилоза
рамноза
арабиноза
галактоза
глюкоза
ксилоза
рамноза
галактуроновая
кислота
глюкуроновая
1,9
0,1
4,3
2,1
0,1
3,7
87,5
0,9
1,2
4,9
1,5
1,3
1,4
5,6
86,4
-
-
Количественное определение функциональных групп
пектиновых веществ
Согласно
природными
литературным
биополимерами
данным,
пектиновые
полиуронидной
природы
вещества
и
являются
характеризуются
наличием определенных функциональных групп, влияющих на их свойства,
прежде всего на желирующую и комплексообразующую способность [96,102].
28
Пектиновые вещества связывают катионы поливалентных металлов за счет
водорода карбоксильных групп [86,162], что дает возможность использования их в
качестве
детоксикантов
при
отравлении
солями
тяжелых
металлов
и
радиоактивными изотопами.
Важным свойством пектиновых веществ является способность их растворов
к образованию студней [108,135] что может использоваться в фармацевтической
практике при производстве лекарственных препаратов в качестве желирующих
агентов. При этом значительное влияние на способность к гелеобразованию
оказывает степень метилирования карбоксильных групп пектина [96,156].
Таким образом, изучение качественных характеристик пектиновых веществ
и определения их функциональных групп представляло интерес для обоснования
возможности их использования в медицинских целях.
Количественное определение функциональных групп пектиновых веществ
(свободных
карбоксильных,
метоксилированных
карбоксильных,
общее
количество карбоксильных, а также содержание метоксильных групп) проводили
титриметрическим методом [глава 2, раздел 2.3.5]. Результаты исследований
представлены в таблице 11.
Таблица 11 - Содержание функциональных групп в пектиновых веществах
девясила иволистного
Функциональные группы, %
Вид сырья
Трава
Корневища
корнями
с
Степень
метоксилированности
(), %
Кс
Км
Ко
ОСН3
1,61
7,55
9,22
5,25
82,70
10,88
0,99
11,69
0,62
6,93
Из данных таблицы 11 следует, что содержание свободных карбоксильных
групп в исследуемых пектиновых веществах колеблется от 1,61 % до 10,88%,
29
метоксилированных карбоксильных групп – от 0,99 % до 7,55%, метоксильных
групп – от 0,62 % до
5,25%. Пектиновые вещества травы характеризуются
высокой (=82,70%) степенью этерификации, а пектиновые вещества корневищ с
корнями низкой (=6,93%) степенью этерификации.
Выводы по главе 3
1. Проведено изучение качественного состава биологически активных
соединений травы и корневищ с корнями девясила иволистного. Установлено
наличие
углеводов,
азотсодержащих
соединений,
дубильных
веществ,
органических кислот, тритерпенов, каротиноидов, кумаринов, фенолкарбоновых
кислот, флавоноидов, эфирного масла, сесквитерпеноых лактонов, минеральных
элементов.
2. С достоверными образцами идентифицированы органические кислоты аскорбиновая, лимонная, винная, щавелевая; кумарины - умбеллиферон;
фенолкарбоновые кислоты - кофейная, хлорогеновая, галловая; флавоноиды витексин, гиперозид, рутин; тритерпеновые соединения - урсоловая кислота;
сесквитерпеновые лактоны – алантолактон, изоалантолактон.
3.
Установлено содержание в траве и корневищах с корнями девясила
иволистного: азотсодержащих соединений - 0,83%, 0,91%, в том числе холина –
0,29%, 0,14%; дубильных веществ 17,19%, 7,20%; органических кислот – 5,91%,
3,74%; аскорбиновой кислоты – 0,47 %, 0,51 %; тритерпеновых соединений –
0,045 %, 0,090 %; каротиноидов – 7,01мг%, 1,31мг%; эфирного масла 0,33-0,47% и
0,88-1,12 %, соответственно.
4.
Изучен состав липофильной фракции корневищ с корнями и травы
девясила иволистного.
Идентифицировано в траве 11 веществ, в корневищах с
корнями - 30 веществ.
5.
Исследован аминокислотный состав травы и корневищ с корнями
девясила иволистного. Аминокислоты представлены аспарагиновой кислотой,
30
треонином, серином, глутаминовой кислотой, лизином, гистидином, аргинином,
пролином, глицином, аланином, цистеином, валином, метионином, изолейцином,
лейцином, тирозином, фенилаланином. Суммарное содержание свободных
аминокислот колеблется от 0,67мг/100 мг до 1,23мг/100 мг, связанных – от
3,70мг/100 мг до 4,44 мг/100 мг.
Аминокислотный состав исследуемых растений исследован впервые.
6. Впервые проведено изучение минерального состава травы и корневищ с
корнями
девясила
иволистного.
Установлено
наличие
17
макро-
и
микроэлементов. Показано, что высоким содержанием меди, марганца, никеля,
титана, ванадия, хрома, циркония, лития отличаются надземные органы девясила
иволистного, а подземные органы – фосфора, марганца.
7.
Впервые проведено изучение фенольных соединений девясила
иволистного методом ВЭЖХ. Идентифицировано 22 вещества фенольной
природы: кумарины - умбеллиферон, дикумарин, скополетин, дигидрокумарин;
флавоноиды - витексин, изовитексин, дигидрокверцетин, геспередин, гиперозид,
лютеолин-7-гликозид, рутин; производные фенолкарбоновых кислот: галловая,
цикориевая,
феруловая,
розмариновая,
коричная,
кофейная,
хлорогеновая
кислоты; среди производных дубильных веществ - танин, эпикатехин, катехин,
эпикатехингаллат.
Впервые для девясила иволистного идентифицировано 19 флавоноидных
соединений.
Установлено количественное содержание флавоноидов: витексина (0,30 %) и
изовитексина(0,21 %) в траве и изовитексина (0,08 %) и геспередина (0,14 %) в
корневищах с корнями девясила иволистного, а также фенолкарбоновых кислот:
хлорогеновой (1,48 %) и розмариновой (0,65 %) кислот в траве, а галловой (0,20
%) и цикориевой (0,71 %) кислот - в корневищах с корнями.
8. Впервые из травы и корневищ с корнями девясила иволистного выделены
и изучены полисахариды по фракциям:
водорастворимые полисахаридные
комплексы, пектиновые вещества, гемицеллюлоза А и гемицеллюлоза Б.
31
Изучен
качественный
и
количественный
моносахаридный
состав
полисахаридных комплексов травы и корневищ с корнями девясила иволистного.
В водорастворимых полисахаридах преобладающими являются арабиноза 11,6 %
(трава), галактоза от 4,8 % (корневища с корнями) до 9,3 % (трава), фруктоза 8,3
%
(корневища
с
корнями).
Основу
пектиновых
веществ
составляет
галактуроновая кислота – от 86,4 % (корневища с корнями) до 87,5 % (трава). В
гемицеллюлозе А и Б преобладающими моносахарами являются ксилоза от 4,3 %
(трава) до 4,9 % (корневища с корнями) и от 3,7 % (трава) до 5,6 % (корневища с
корнями) соответственно, что указывает на наличие полисахаридов типа ксилана.
9. Проведено определение функциональных групп пектиновых веществ.
Содержание свободных карбоксильных групп в исследуемых пектиновых
веществах колеблется от 1,61 % до 10,88 %, метоксилированных карбоксильных
групп - от 0,99 % до 7,55 %, метоксильных групп - от 0,62 % до 5,25 %.
Пектиновые вещества травы характеризуются высокой (>50 %) степенью
этерификации,
этерификации.
а
корневищ
с
корнями
невысокой
(<50
%)
степенью
32
ГЛАВА 4 СТАНДАРТИЗАЦИЯ ТРАВЫ И КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ
ДЕВЯСИЛА ИВОЛИСТНОГО
Проведенные
фитохимические
исследования
показали
возможность
применения в медицинской практике девясила иволистного, что является
основанием для разработки показателей качества и характеристик подлинности
для двух видов сырья девясила иволистного – травы и корневищ с корнями.
4.1 Разработка характеристик подлинности сырья
«Трава девясила иволистного»
4.1.1 Исследование морфологических признаков травы девясила
иволистного
Исследование морфологических признаков травы девясила иволистного
проводили
по
гербарным
образцам
и
по
свежесобранным
растениям.
Исследование проводили в соответствии со статьей ГФ XI «Herba» [глава 2,
раздел 2.5] [40,64,116,130].
В результате установлены морфологические признаки травы:
Сырье представляет собой верхние части стеблей длиной до 30 см с
цветками и листьями, продольно-бороздчатые, голые или иногда опушенные
рассеянными волосками. Листья очередные, кожистые, блестящие, голые,
отклоненные от стеблей почти под прямым углом, с выдающимися на нижней
стороне жилками, покрытые короткими рассеянными щетинками, цельнокрайние
или по краям с редкими зубчиками и маленькими густыми шипиками. Нижние
листья яйцевидные или продолговато-яйцевидные длиной до 10 см, шириной 3
см, наверху округлые, в основании суженные, средние и верхние – продолговатые
или продолговато-ланцетные, длиной до 5 см и шириной 1,5 см или
узколанцетные длиной до 5 см длиной и шириной 0,8 см, заостренные, сидячие, в
33
основании полустеблеобъемлющие с усиками. Цветочные корзинки диаметром
2,5 – 4 мм, одиночные или по 2-5 в щитке. Снаружи корзинки покрыты оберткой,
листочки обертки голые, по краю реснитчатые, в верхней части красноватофиолетовые. Наружные листочки ланцетные или яйцевидно-ланцетные, в верхней
части с ромбической или продолговато-яйцевидной, в основании суженной
зеленой верхушкой, длинно заостренной и отогнутой; внутренние листочки
линейные, немного длиннее наружных, острые, вверху иногда коротко прижатоволосистые. Цветки язычковые и трубчатые; язычковые в полтора раза
превышают листочки обертки, немного короче хохолка с 3-5 жилками,
трехзубчатые; трубчатые цветки пятизубчатые, равны хохолкам. Цвет стеблей
зеленоватый, листьев - серовато-зеленый, цветков – желтый, листочков обертки зеленый; запах слабый, вкус водного извлечения сладковато-горький.
4.1.2 Характеристика микродиагностических признаков травы
девясила иволистного
Изучение микродиагностических признаков проводили на временных
микропрепаратах, приготовленных по методике ГФ XI издания с последующей
микрофотосъемкой [глава 2, раздел 2.5].
В результате проведенных исследований были установлены следующие
анатомические признаки: стебель на поперечном сечении округло-ребристый и
имеет пучковое строение (рисунок 17).
Клетки эпидермиса стебля с поверхности толстостенные со складчатой
кутикулой, имеют прозенхимную форму, прямостенные, со скошенными или
прямыми концами, оболочки клеток имеют четковидное утолщение. Устьица
анамоцитного типа (рисунок 18).
Отмечено наличие клеток идиобластов (рисунок 19). Стебель опушен
простыми 5-7 клеточными толстостенными волосками, клетки которых часто
заполнены бурым содержимым (рисунок 19).
34
1
2
3
4
10 11
5
6
7
8
9
А
1
Б
Рисунок 17 - Фрагмент поперечного среза стебля; А - увел. 200х, Б - увел. 35х.
1 – эпидермис; 2 – колленхима; 3 – основная паренхима; 4 – эндодерма; 5- перециклическая
склеренхима; 6 – каменистые клетки; 7 - закрытый коллатеральный пучок; 8 – флоэма; 9 –
ксилема; 10 – паренхима сердцевинных лучей; 11 – сердцевина.
1
2
3
Рисунок 18 - Фрагмент эпидермиса стебля; увел. 200х.
1 – устьица; 2 – клетки эпидермиса со складчатой кутикулой; 3 – двурядная эфиромасличная
железка.
35
Первичная кора хорошо выражена и состоит из 1-2 слоев пластинчатой
колленхимы, основной паренхимы, эндодермы. Клетки
основной паренхимы
тонкостенные овальные или продолговатые, вытянуты вдоль поверхности стебля
в тангентальном направлении. Эндодерма хорошо выражена, залегает в один
слой, представлена крахмалоносным влагалищем. В первичной коре встречаются
группы каменистых клеток, расположенные чаще всего участками
напротив
межпучковой зоны (рисунок 17).
Центральный цилиндр начинается перециклической склеренхимой, которая
залегает крупными участками над пучками, образуя склеренхимную обкладку.
Многочисленные закрытые коллатеральные проводящие пучки округло-овальной
формы, удлиненные в радиальном направлении. Пучки располагаются близко
друг к другу, между ними проходят сердцевинные лучи, образованные 2-4 рядами
основной паренхимы. Флоэма проводящих пучков мелкоклеточная, занимает
небольшой объем. Ксилема образована крупными сосудами, расположенными
радиальными рядами, между которыми залегает склерефицированная паренхима.
Сердцевина
стебля заполнена рыхло расположенными клетками основной
запасающей паренхимы (рисунок 17).
При изучении листовой пластинки установлено, что клетки верхнего
эпидермиса листа прямостенные или со слегка извилистыми стенками (рисунок
21).
Клетки нижнего эпидермиса сильно извилистостенные (рисунок 20).
Устьица в основном приурочены к нижнему эпидермису, устьичный аппарат
аномоцитного типа. Вдоль жилки листа клетки эпидермиса прямостенные,
вытянуты в тангентальном направлении со скошенными или прямыми концами, с
продольной складчатостью кутикулы (рисунок 22). Эпидермис листа опушен
многочисленными волосками. Так, на нижнем эпидермисе листа встречаются
простые многоклеточные толстостенные волоски с кольцевыми утолщениями в
местах соединения клеток с заостренной конечной клеткой и укороченными 3-4
клетками у основания (рисунок 23). Вдоль жилок расположены двух-
36
пятиклеточные толстостенные волоски (рисунок 22).
1
3
2
А
Б
Рисунок 19 - Фрагмент эпидермиса стебля; А - увел. 200х, Б - увел. 80х
1 – устьица; 2 – клетки идиобласты; 3 –простой толстостеный пятиклеточный волосок.
1
Рисунок 20 - Фрагмент нижнего
эпидермиса листа; увел 200х.
1 - устьица
Рисунок 21 - Фрагмент верхнего
эпидермиса листа; увел. 200х.
37
2
1
Рисунок 22 - Фрагмент эпидермиса листа вдоль жилки; А - увел. 400х. Б - увел. 80х.
1- клетки эпидермиса со складчатой кутикулой; 2 – многоклеточные толстостенные волоски.
1
1
1
2
Рисунок 23 - Фрагмент нижнего
эпидермиса листа; увел. 140х. 1 –
устьице;
2
многоклеточный
толстостенный волосок с кольцевыми
утолщениями в местах соединения
клеток с заостренной конечной клеткой и
укороченными 4 клетками у основания.
Рисунок - 24 Фрагмент эпидермиса
листа;
увел.
200х.
1
–
эфиромасличная железка.
38
Край листа опушен многоклеточными толстостенными волосками, часто
прижатыми к эпидермису, пьедестал которых состоит из 2-5 укороченных
прямоугольных клеток, конечные клетки, удлиненные в числе 1-4. Также по краю
листа можно встретить гидатоды (рисунок 25).
Встречаются эфиромасличные железки, состоящие из 6-10 выделительных
клеток, расположенных в 2 ряда и в 3-4 яруса на одноклеточной ножке (рисунок
24).
При
рассмотрении
соцветия
(трубчатых,
ложноязычковых
цветков,
листочков обертки) установлено, что завязь трубчатого цветка голая. Клетки
эпидермиса завязи прямостенные, узкие, вытянуты вдоль оси завязи. Чашечка
трубчатого цветка в виде длинных хохолков, густо покрытых одноклеточными
остроконечными, тонкостенными, прижатыми к поверхности волосками (рисунок
26).
В трубке венчика клетки эпидермиса прямостенные, прямоугольные,
вытянуты вдоль оси трубки, с утолщенными поперечными перегородками между
клетками (рисунок 27).
В центре и по краю отгиба венчика трубчатого цветка клетки эпидермиса
извилистостенные, вдоль жилок – узкие, прямостенные (рисунок 28). Клетки
зубцов ложноязычкового цветка прямостенные 5-6 угольные, в отгибе венчика
ближе к зеву они вытянутые, прямостенные с прямыми или со скошенными
концами, часто заполнены бурым содержимым (рисунок 29). В трубке
ложноязычкового цветка клетки эпидермиса прямостенные (рисунок 30).
По
поверхности
трубчатого,
ложноязычкового
цветка
встречаются
двурядные эфиромасличные железки, характерные для представителей семейства
сложноцветные (рисунки 28, 31).
Клетки эпидермиса листочков обертки прямостенные, изодиаметрические,
многоугольные (рисунок 32).
По краю листочки обертки встречаются волоски простые одноклеточные,
реже 2-х
клеточные, толстостенные с вытянутой заостренной верхушкой.
39
Волоски очень густо расположены и часто срастаются по 2-3 своими основаниями
(рисунки 33, 34)
2
1
2
Рисунок 25 - Фрагмент края листа; увел. 80х.
1 – гидатода; 2 – многоклеточные толстостенные волоски с 2-5 укороченными
прямоугольными клетками пьедестала и 1-4 конечными удлиненными клетками.
1
1
Рисунок 26 - Фрагмент чашечки
трубчатого цветка; увел. 200х.
1 – одноклеточные остроконечные
тонкостенные волоски
Рисунок 27 - Фрагмент трубки
венчика трубчатого цветка; увел
200х.
1
–
клетки
эпидермиса
с
утолщенными
поперечными
перегородками между клетками
40
1
2
1
Рисунок 29 - Фрагмент зубцов
ложноязычкового цветка;
увел.200х.
1 – клетки эпидермиса с бурым
содержимым
Рисунок 28 - Фрагмент отгиба
венчика трубчатого цветка;
увел. 200х.
1 – эфиромасличная железка; 2 –
извилистостенные
клетки
эпидермиса
1
Рисунок 30 - Фрагмент
эпидермиса в трубке
ложноязычкового цветка; увел
200х
Рисунок 31 - Фрагмент
эпидермиса ложноязычкового
цветка с двурядной
эфиромасличной железкой; увел
200х
1 - эфиромасличная железка
41
1
1
1
Рисунок 32 - Фрагмент эпидермиса
листочка обертки; увел. 200х
1– прямостенные
изодиометрические,
многоугольные клетки эпидермиса.
Рисунок 33 - Фрагмент края
листочка обертки; увел.200х
1 – простые одноклеточные
волоски.
2
1
Рисунок 34 - Фрагмент края листочка
обертки; увел. 200х
1 – простые 2-х клеточные волоски;
2 - эфиромасличная железка
2
1
Рисунок 35 - Фрагмент
верхушки листочка обертки;
увел. 200х
1 – простой толстостенный
многоклеточный волосок;
2 – эфиромасличная железка
42
1
Рисунок 36 - Фрагмент верхушки листочка обертки; увел. 200х
1 - многоклеточные толстостенные волоски, пьедестал которых состоит из 3-4
укороченных прямоугольных клеток и одной конечной удлиненной клетки.
Многоклеточные толстостенные волоски, пьедестал которых состоит из 3-4
укороченных прямоугольных клеток и одной конечной удлиненной клетки,
встречаются ближе к верхушке листочков обертки (рисунок 36).
По эпидермису листочков обертки встречаются двурядные эфиромасличные
железки, характерные для представителей семейства сложноцветные (рисунок
35).
4.1.3 Исследование морфологических признаков корневищ с корнями
девясила иволистного
Исследование морфологических признаков корневищ с корнями девясила
иволистного проводили на высушенном и свежесобранном сырье в соответствии
со
статьей
ГФ
клубнелуковицы»
XI
издания
(глава
2,
«Корни,
раздел
корневища,
2.5).
В
луковицы,
результате
клубни,
установлены
морфологические признаки:
Сырье представляет собой цилиндрические цельные (длиной до 15 см,
диаметром 0,2-0,3см) или разрезанные корневища и корни, снаружи продольно -
43
морщинистые, в изломе зернистые. Цвет корневищ и корней снаружи от светлокоричневого до коричневого, на изломе - желтовато-белый. Запах слабый. Вкус
водного извлечения сладковатый, слегка вяжущий.
4.1.4 Характеристика микродиагностических признаков корневищ с
корнями девясила иволистного
Исследование микродиагностических признаков проводили на временных
микропрепаратах, приготовленных по методике ГФ XI издания с последующей
микрофотосъемкой
[глава
2,
раздел
2.5].
Установлены
характерные
микродиагностические признаки корневищ с корнями.
Корневище на поперечном срезе округлой формы. В центре сердцевина
заполнена основной запасающей паренхимой (рисунки 37, 38). Центральный
цилиндр имеет непучковое строение. Ксилема занимает большую часть
центрального цилиндра. Флоэма мелкоклеточная занимает небольшой объем.
Между флоэмой и ксилемой хорошо выражена зона камбия. Над флоэмой
расположены группы перециклических лубяных волокон. Первичная кора
довольно объемная, заполнена основной паренхимой, в которой по кругу
располагаются схизогенные вместилища с эфирным маслом, чередуясь с
группами лубяных волокон. В паренхиме первичной коры, сердцевины, в
древесине встречаются клетки с глыбками инулина (препарат смотреть без
нагревания, при окрашивании спиртовым раствором тимола 20 %).
С
поверхности корневище покрыто слоем пробки.
Корень первичного строения (рисунок 38). Первичная кора занимает
большой объем и состоит из экзодермы, мезодермы, эндодермы. Экзодерма
представлена многоугольными плотно прилегающими клетками, наружный слой
которых опробковевает. Мезодерма представлена запасающей паренхимой,
клетки ее округлой формы с небольшими межклетниками. Эндодерма залегает в
один слой клеток. В паренхиме первичной коры встречаются клетки с глыбками
44
инулина (препарат смотреть без нагревания, при окрашивании спиртовым
раствором тимола 20 %). Центральный цилиндр начинается перициклом. Всю
толщу центрального цилиндра занимает радиальный пучок.
1
8
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
3
8
24
5
6
5
67
78
2
3
8
9
Рисунок
37 Фрагмент
поперечного среза корневища;
увел. 80х.
4.2 Числовые показатели
1 – пробка;
2 – паренхима первичной коры;
3 – перециклические лубяные
волокна;
4 – вместилища с эфирным маслом;
5 – флоэма;
6 – камбий;
7 – ксилема;
8 – клетки с глыбками инулина;
9 – сердцевина.
Рисунок 38 - Фрагмент поперечного
среза корня; увел. 80х.
1 – опробковевшая паренхима;
2 – экзодерма;
3 – мезодерма;
4 – эндодерма;
5 – перецикл;
6 – флоэма;
7 – ксилема;
8 – клетки с глыбками инулина.
4.2 Числовые показатели
4.2.1 Определение влажности
Влажность травы и корневищ с корнями девясила иволистного определяли
согласно методике ГФ IX издания [46]. Результаты определения влажности
представлены в таблице 12.
45
Таблица 12 - Числовые показатели травы и корневищ с корнями девясила
иволистного
Наименования сырья
Влажность,%
Зола общая, %
Трава
Корневища с корнями
8,17- 11,12
9,21 - 11,09
1,61 - 3,95
2,13 - 7,13
Зола нерастворимая в 10%
растворе кислоты
хлористоводородной,%
0,55 - 1,29
0,49 - 3,28
Потеря в массе при высушивании травы девясила иволистного колеблется
от 8,17% до 11,12%, корневищ с корнями от 9,21% до 11,09 %. Таким образом,
влажность травы и корневищ с корнями девясила иволистного не превышает 12%,
поэтому рекомендуем установить показатель влажности не более 13%.
4.2.2 Определение золы
Определение золы общей и золы, не растворимой в растворе кислоты
хлористоводородной 10%, для травы и корневищ с корнями девясила иволистного
проводили согласно методике ГФ XI издания [глава 2, раздел 2.4.2]. В результате
исследования установили, что содержание золы общей травы колеблется от 1,61%
до 3,95%, а корневищ с корнями золы от 2,13% до 7,13%, не растворимой в 10%
растворе кислоты хлористоводородной – от 0,55% до 1,29% в траве и от 0,49% до
3,28% в корневищах с корнями (таблица 11). Поэтому нами предложено
установить следующие показатели: для травы золы общей – не более 5%; золы, не
растворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10 %, не более 2%, для
корневищ с корнями золы общей не более 8%, золы, не растворимой в растворе
кислоты хлористоводородной 10%, не более 4%.
4.2.3 Определение экстрактивных веществ
Экстрактивные вещества травы и корневищ с корнями девясила иволистного
46
определяли количественно в виде сухого остатка согласно методики ГФ XI
издания [глава 2, раздел 2.4.3]. Данный показатель важен для оценки качества
сырья, используемого для получения различных экстракционных лекарственных
форм (настоев, настоек и других). Поэтому нами были проведены исследования
по определению экстрагента, максимально извлекающего комплекс биологически
активных веществ из травы и корневищ с корнями девясила иволистного. Для
этого использовали спирт этиловый различной концентрации (96 %,70 %,50 %,30
%) и воду очищенную.
Таблица 13 - Содержание экстрактивных веществ в траве и корневищах с корнями
девясила иволистного
Экстрагент
Содержание экстрактивных веществ в сырье девясила
иволистного,%
Трава
Корневища с корнями
32,08±1,94
23,25±0,87
16,36±0,59
9,12±0,25
25,35±1,01
28,32±0,67
28,74±1,00
30,64±1,11
16,91±0,01
26,45±0,02
Вода очищенная
Спирт этиловый 96%
Спирт этиловый 70%
Спирт этиловый 50%
Спирт этиловый 30%
Как следует из таблицы 13, максимальное извлечение экстрактивных
веществ
наблюдается
у
травы
девясила
иволистного
(32,08%)
при
экстрагировании водой очищенной и спиртом 50 % (28,74 %), а у корневищ с
корнями – при экстрагировании спиртом этиловым 50% (30,64 %), поэтому
предлагаем установить нормы для травы и корневищ с корнями экстрактивных
веществ, извлекаемых спиртом этиловым 50 %, не менее 25 %.
4.4 Разработка методик качественного и количественного определения
действующих веществ травы и корневищ с корнями девясила иволистного
Согласно литературным данным [глава 1 раздел 1.2] и нашим исследованиям
[глава 3], основными группами действующих веществ девясила иволистного
47
являются эфирное масло, в частности, сесквитерпеновые лактоны, полисахариды
и фенольные соединения, в частности, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты
[24,99].
В связи с этим для стандартизации корневищ с корнями девясила
иволистного
разработаны
методики
качественного
и
количественного
определения фруктозанов, для стандартизации травы – суммы флавоноидов, для
надземных и подземных органов суммы фенольных соединений, а также проведен
анализ корневищ с корнями и травы на содержание сесквитерпеновых лактон
4.4.1 Разработка методик качественного и количественного
определения суммы фруктозанов в корневищах с корнями девясила
иволистного
Качественное обнаружение фруктозанов
Для качественного определения фруктозы в корневищах с корнями девясила
иволистного использовали методику качественного обнаружения сахаров в
корневищах и корнях девясила высокого, в основе которой лежит метод
тонкослойной хроматографии [17].
Для хроматографического разделения использовали водное извлечение,
полученное для количественного определения.
Водное извлечение корневищ с корнями девясила иволистного наносили на
пластинку «Sorbfil» (ПТСХ-П-А) в количестве 0,01 мл в виде полосы длиной 1 см,
рядом наносили в виде точки 0,005 мл 0,1% раствора стандартного образца
фруктозы. Пластинку с нанесенными пробами высушивали на воздухе в течение 5
минут, помещали в хроматографическую камеру с системой растворителей нбутанол-кислота уксусная-диэтиловый эфир-вода в соотношении 9:6:3:1 и
хроматографировали восходящим способом. (Смесь растворителей заливали в
камеру за 15-20 минут до хроматографирования). Когда фронт растворителей
48
проходил 10 см, пластинку вынимали из камеры и высушивали на воздухе.
Хроматограмму последовательно обрабатывали
спиртовым раствором
тимола 20% и раствором кислоты серной разведенной, подсушивали на воздухе и
помещали на 2 минуты в сушильный шкаф при температуре 100-105º С.
На хроматограмме должна быть видна одна зона на уровне стандартного
образца фруктозы (рисунок 39).
Рисунок 39 Схема хроматограммы
водного извлечения из корневищ с
корнями девясила иволистного
А – извлечение из корневищ с корнями
Б – стандартный образец фруктозы
Система
растворителей:
н-бутанолкислота уксусная-диэтиловый эфир-вода
(9:6:3:1)
А
Б
Количественное определение суммы фруктозанов
В корневищах с корнями девясила иволистного содержатся углеводы как в
свободном виде (фруктоза), так и в виде полисахаридов [глава 3, раздел 3.15].
Для стандартизации корневищ с корнями девясила иволистного нами
использован прямой спектрофотометрический метод определения фруктозанов
после
их
кислотной
спектрофотометрическое
трансформации.
определение
продукта
В
основе
кислотной
метода
лежит
трансформации
фруктозы [187]. Этот метод основан на способности сахаров (фруктозы, сахарозы)
при нагревании с концентрированными кислотами образовывать продукты,
имеющие поглощение в области 200-380 нм. Разработанная методика основана на
обработке сахаров 0,1N раствором кислоты хлористоводородной при температуре
80º С. Продукт трансформации имеет максимум поглощения в области 283 нм,
49
представляет собой 5-гидроксиметилфурфурол, он стабилен в течение 2-х часов
[187]. Это позволяет проводить непосредственное спектрофотометрирование 5гидроксиметилфурфурола в извлечениях из сырья девясила иволистного после
кислотной трансформации без дополнительных стадий очистки.
Изучение условий спектрофотометрического определения суммы
фруктозанов в сырье
Процесс экстракции биологически активных веществ из растительного
сырья зависит от измельченности сырья, времени экстракции, температуры
экстракции, соотношения сырье-растворитель.
Определение оптимальных условий экстракции углеводов из корневищ с
корнями девясила иволистного проводили на одном образце сырья. Оптимальные
значения измельченности растительного сырья, найденные различными авторами,
совпадают и равны 0,5-2 мм [141].
Оптимальные условия измельченности сырья представлены в таблице 14.
Таблица 14 - Влияние степени измельчения сырья на полноту экстракции суммы
фруктозанов из корневищ с корнями девясила иволистного
Степень измельчения сырья, мм
0,5
1,0
2,0
3,0
Содержание суммы фруктозанов
(на абсолютно сухое сырье), %
5,00
6,61
6,91
5,24
Как видно из таблицы 14, максимальное извлечение углеводов наблюдается
при степени измельчения 2 мм.
При разработке методики анализа в качестве экстрагента фруктозанов
использована вода очищенная [150].
Для извлечения сахаров нами использована экстракция до наступления
50
равновесия [142].
Исследования динамики экстракции углеводов из
измельченного материала кипящей водой при соотношении сырье-растворитель
1:100 показали максимальный выход углеводов из корневищ с корнями девясила
иволистного через 60 минут (таблица 15).
В связи с тем, что углеводы гидролизуются с различной скоростью, нами
изучена продолжительность их гидролиза. Для гидролиза использовали раствор
кислоты хлористоводородной 5%.
Таблица 15 - Выбор времени экстрагирования суммы углеводов из корневищ с
корнями девясила иволистного
Время экстракции, мин.
30
45
60
90
Содержание суммы фруктозанов, %
5,73
6,42
6,91
6,62
При изучении кинетики образования продукта трансформации фруктозы (5гидроксиметилфурфурола)
аликвотное
количество
исходного
извлечения
подвергали гидролизу раствором кислоты хлористоводородной 5% на кипящей
водяной бане в течение различного времени. Контроль за полнотой образования
5-гидроксиметилфурфурола проводили спектрофотометрически при максимуме
поглощения 285 нм (таблица 16, рисунок 40).
Таблица 16 - Влияние времени на полноту гидролиза фруктозанов из корневищ с
корнями девясила иволистного
Время гидролиза, мин
60
120
180
240
Как
видно
из
таблицы
Содержание суммы фруктозанов, %
4,60
6,40
7,12
5,12
16
максимальное
количество
5-
51
гидроксиметилфурфурола образуется через 3 часа.
0,5
1,0
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
время гидролиза, час
Рисунок 40 - Влияние времени гидролиза извлечений из корневищ с
корнями девясила
иволистного на полноту образования
5-гидроксиметилфурфурола
Расчет содержания суммы фруктозанов проводили с использованием удельного
показателя
поглощения
продукта
трансформации
фруктозы
(5-
гидроксиметилфурфурола), который равен 298 (таблица 17).
Таблица 17 - Результаты определения удельного показателя поглощения
5-гидроксиметилфурфурола в водном растворе кислоты хлористоводородной 5%
(n=5, λmax=285, Ρ=0,95)
Концентрация фруктозы,
мкг/мл
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
EI%/I см
310,0
300,0
295,0
296,0
288,3
Метрологическая
характеристика
Sx=7,98
∆Х
Eотн.= 7,98%
= 297,86 ± 1,98%
Удельный показатель поглощения определен нами экспериментально и
согласуется с литературными данными.
Определение содержания суммы фруктозанов в корневищах с корнями
52
девясила иволистного проводили при длине волны 285 нм. При этой длине волны
находится
максимум
поглощения
5-гидроксиметилфурфурола
и
продукта
гидролиза извлечений из корневищ с корнями девясила иволистного (рисунок 41).
В качестве раствора сравнения использовали извлечение из корневищ с корнями
девясила с кислотой хлористоводородной без проведения гидролиза.
λ, нм
Рисунок 41 - Спектры поглощения 5-гидроксиметилфурфурола (1) и продукта
гидролиза извлечения из корневищ с корнями девясила иволистного (2).
Нами
также
было
проведено
изучение
устойчивости
во
времени
полученного продукта (5-гидроксиметилфурфурола) (таблица 18).
Таблица 18 - Устойчивость во времени извлечений из корневищ с корнями
девясила иволистного после проведения гидролиза
Время, мин
30
60
90
120
150
Оптическая плотность,нм
0,62
0,59
0,59
0,58
0,59
Растворы устойчивы в течение 2,5 часов, что достаточно для
проведения анализа.
53
Методика количественного определения суммы фруктозанов в корневищах с
корнями девясила иволистного
Описанные
выше
исследования
позволили
разработать
методику
количественного определения суммы фруктозанов в корневищах с корнями
девясила иволистного [43].
Методика количественного определения суммы фруктозанов в корневищах
с корнями девясила иволистного
1,0 г (точная навеска) сырья, измельченного и просеянного сквозь сито с
диаметром отверстий 2 мм помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл,
прибавляют 100 мл воды очищенной и взвешивают (погрешность ±0,01 г). Колбу
присоединяют к обратному холодильнику и экстрагируют на кипящей водяной
бане в течение 60 минут. Затем содержимое колбы искусственно охлаждают до
комнатной температуры, взвешивают и доводят водой до первоначальной массы.
Извлечение фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 10 мл
фильтрата.
2,0 мл полученного извлечения помещают в круглодонную колбу
вместимостью 50 мл, прибавляют 48,0 мл раствора кислоты хлористоводородной
5%, присоединяют обратный холодильник и нагревают на кипящей водяной бане
в течение 3 часов. После охлаждения содержимое колбы переносят в мерную
колбу
вместимостью
50
мл
и
объем
раствора
доводят
кислотой
хлористоводородной 5% до метки.
Раствор спектрофотометрируют при длине волны 285 нм в кювете с
толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор,
состоящий из 2,0 извлечения, доведенный в мерной колбе вместимостью 50 мл
раствором кислоты хлористоводородной 5% до метки.
Содержание суммы фруктозанов (Х) в пересчете на фруктозу в процентах
вычисляют по формуле:
54
(1)
Х - содержание суммы фруктозанов, %;
D - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 285 нм;
- удельный показатель поглощения продукта трансформации
фруктозы после кислотного гидролиза, равный 298;
m- масса навески сырья;
W- влажность, %.
Валидация методики количественного определения фруктозанов
При проведении валидации методики количественного определения суммы
фруктозанов изучены следующие валидированные характеристики методики:
линейность,
диапазон
использования,
повторяемость,
воспроизводимость,
правильность.
Для проверки линейности готовили 5 уровней концентраций фруктозы. Для
чего первоначально готовили исходный раствор фруктозы (0,1% раствор), а затем
из него готовили разбавленные растворы. Для этого в круглодонные колбы
вместимостью 50 мл помещали по 0,5 мл, 1,0 мл, 1,5 мл, 2,0 мл, 2,5 мл исходного
раствора фруктозы, прибавляли 45,0 мл раствора кислоты хлористоводородной
5%, присоединяли обратные холодильники и нагревали на кипящей водяной бане
в течение 3 часов. После охлаждения содержимое колб переносили в мерные
колбы вместимостью 50 мл и объём раствора в колбах доводили раствором
кислотой хлористоводородной 5% до метки.
Полученные растворы спектрофотометрировали при длине волны 285 нм в
кювете с толщиной слоя 10 мм; в качестве раствора сравнения использовали
раствор, состоящий из такого же количества мл извлечения в 50 мл кислоты
хлористоводородной 5%.
55
Далее строили график зависимости оптической плотности от концентрации
фруктозы:
оптическая плотность, нм
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,5
Рисунок 42 -
1
1,5
2
2,5
количество стандартного образца фруктозы, мл
Зависимость оптической плотности раствора от концентрации
фруктозы
Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции.
Если его величина близка к единице, то совокупность данных можно описать
прямой линией.
По полученным экспериментальным данным рассчитывали коэффициент
корреляции, угловой коэффициент линейной регрессии, свободный член графика
(таблица 19).
Коэффициент корреляции R =0,99951066, следовательно, данная методика
может быть использована для анализа суммы фруктозанов в указанном диапазоне
концентраций.
Таблица 19. Результаты статистической обработки данных, полученных при
изучении линейной зависимости вида y=bх+а
F
3
x
2
y
0,73246
b
0,4147
a
-0,09694
R
0,99951066
56
Для проверки диапазона использования методики: получали водные
извлечения различной концентрации, для чего брали навески сырья массой: 0,5 г,
0,75 г, 1,0 г, 1,25 г, 1,5 г. Далее из полученных извлечений брали по 2 мл,
помещали их в круглодонные колбы вместимостью 50 мл, прибавляли 48 мл
кислоты хлористоводородной 5%, подсоединяли к обратным холодильникам и
нагревали на кипящей водяной бане в течение трёх часов. После охлаждения
содержимое колб переносили в мерные колбы на 50 мл, при необходимости
доводили объём 5% кислотой хлористоводородной до метки, далее раствор
спектрофотометрировали.
оптическая плотность, нм
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,5
0,75
1
1,25
1,5
навеска корней с корнвищами, гр
Рисунок 43 - Зависимость оптической плотности исследуемых извлечений
от
концентрации фруктозанов.
Зависимость оптической плотности растворов (у) от концентрации сырья (Х)
приведена на рисунке 43 и выражается уравнением
Y=A+BX,
где А – 0,09672,
В – 0,18184,
коэффициент корреляции R=0,9896692.
57
Таблица 20. Результаты статистической обработки данных, полученных при
изучении линейной зависимости вида y= а+bх
F
3
x
y
2
0,4604
b
0,18184
a
0,09672
R
0,9896692
На основании полученных данных установлено, что в пределах измеряемых
концентраций зависимость оптической плотности от концентрации носит
линейный характер (рисунок 43, таблица 20).
Повторяемость методики определяли на одном образце сырья в 6
повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительности
стандартного отклонения, которое не должно превышать 10 %. Эта величина
составила 7,09 % (таблица 21).
Таблица
21
-
Результаты
количественного
определения
фруктозанов
в
корневищах с корнями девясила иволистного методом дифференциальной
спектрофотометрии
№п/п
1
2
3
4
5
6
Содержание суммы фруктозанов
6,84
6,95
6,86
7,00
6,90
7,36
Метрологическая характеристика
Хср.=6,99
Sx2=0,04
Sxср=0,19
ΔX=0,50
Eотн=7,09
Хср±ΔХср=6,99±0,50
Воспроизводимость методики выполняли аспирант и сотрудник кафедры.
Изучение проводили на 3 образцах в 3-х повторностях (таблица 22). Критерий
приемлемости выражается величиной относительного стандартного отклонения,
которое не должно превышать 15%.
В результате наших исследований относительное стандартное отклонение
составило 10,61%, что указывает на прецизионность методики в условиях
воспроизводимости.
Правильность методики проверяли методом добавок фруктозы к аликвоте
испытуемого извлечения из корневищ с корнями девясила иволистного, затем
58
проводили гидролиз и измеряли оптическую плотность. Критерий приемлемости
– средний процент восстановления при использовании растворов заданных
концентраций, скорректированный на 100 %, и его средняя величина должна
находиться в пределах 100±5 % [74].
Таблица 22 - Определение воспроизводимости методики
Содержание суммы фруктозанов в пересчете на фруктозу в корневищах
с корнями девясила иволистного,%
Повторность
Образец 1
Образец 2
Образец 3
1
6,84
7,03
6,32
Аналитик 1
2
6,95
7,16
6,38
3
6,86
7,06
6,24
4
7,23
7,58
6,49
5
Аналитик 2
7,02
7,66
6,51
6
7,18
7,65
6,58
Среднее значение
7,01
7,36
6,42
Относительное стандартное
5,97
10,61
5,15
отклонение, (RSD%)
В разработанной методике процент восстановления колеблется от 98,28 % до
102,01%, его средняя величина составила 100,6 % (таблица 23).
Таблица 23 - Определение правильности методики (результаты опытов с
добавками)
1
Содержание
количества
фруктозанов в
пересчете на
фруктозу, мг
7,0
2
7,0
1,15
8,27
101,47
3
7,0
1,15
8,01
98,28
4
7,0
3,0
10,20
102,00
5
6
7
7,0
7,0
7,0
3,0
3,0
4,5
10,13
10,0
11,48
101,30
100,00
100,78
8
9
7,0
7,0
№п/п
Добавлено
ГСО
фруктозы, мг
Полученное
содержание,
мг
Найдено
относительно
введенного,%
1,15
8,20
100,61
4,5
11,59
101,13
4,5
11,63
102,01
Среднее значение выхода 100,84%
Статистическая
характеристика
Хсреднее= 100,84
S2=1,34034
S=1,15773
ΔX=2,67
ɛ=2,65
59
В методике отсутствует систематическая ошибка, неопределенность при
достоверной вероятности 0,95 не превышает 2,65 %.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что
разработанная методика линейна легко воспроизводима, доступна, занимает
минимум рабочего времени, не требует дорогостоящих реактивов. Она позволяет
объективно оценивать качество корневищ с корнями по содержанию фруктозанов.
Разработанной методикой проанализировано 3 образца корневищ с корнями
девясила иволистного, собранных в Курской и Воронежской областях.
Таблица 24 - Результаты спектрофотометрического определения количества
фруктозанов в корневищах с корнями девясила иволистного
Место и год
заготовки сырья
Курская обл.,
2011 г.
Курская обл.,
2012 г.
Воронежская обл.,
2012 г.
,%
Метрологическая характеристика методики
Δx
Eотн.
6,91
0,00425
0,06519
0,18
2,61
7,11
0,00413
0,06427
0,28
2,53
6,32
0,00472
0,0867
0,29
3,01
Содержание суммы фруктозанов колеблется от 6,32% до 7,11%. Как видно из
приведенных в таблице данных, в методике отсутствует систематическая ошибка,
относительная определяемость при доверительной
вероятности 0,95% не
превышает 3,01%.
4.4.2 Стандартизация травы девясила иволистного по содержанию
суммы флавоноидов
Для количественного определения флавоноидов в лекарственных растениях
используются различные методы: весовые, объемные, фотоколориметрические,
спектрофотометрические, флюорометрические и полярографические методы
[13,14,94,186].
Наиболее
распространенным
методом
является
60
спектрофотометрическое определение флавоноидов в УФ-области спектра в
сочетании с хроматографией на бумаге [12,119,170,173,183] или в тонких слоях
сорбента [12]. Имеются также данные об использовании для этих целей хроматоИК-спектроскопии и флюороденситометрии [92]. Спектрофотометрические и
фотоколориметрические методы в видимой области применяют после проведения
реакций с хромогенными реактивами [15,119,186]. В настоящее время широко
распространенной и фармакопейной является реакция комплексообразования с
алюминия хлоридом [14,36,57,65].
Разработка методики количественного определения суммы
флавоноидов в траве девясила иволистного
Для
анализа
спектрофотометрическая
травы
девясила
методика
иволистного
определения
нами
суммы
разработана
флавоноидов
непосредственно в извлечениях из сырья. В основу данной методики положена
реакция
комплексообразования
с
алюминия
хлоридом
в
сочетании
со
спектрофотометрическим дифференциальным способом определения оптической
плотности
комплексов.
Это
позволяет
проводить
спектрофотометрирование комплекса флавоноидов с
непосредственное
алюминия хлоридом в
извлечениях из сырья без дополнительных трудоемких стадий очистки
[14,57,149,178,183].
Основными этапами разработки методики количественного анализа
являются:
- Изучение процесса экстрагирования;
- Разработка оптимальных условий проведения реакции комплексообразования в
спектрофотометрируемом растворе.
Процесс экстракции флавоноидов из лекарственного растительного сырья
зависит от измельченности сырья, времени экстракции, температуры экстракции,
типа растворителя, соотношения сырье-растворитель.
61
Оптимальные значения степени измельченности, найденные различными
авторами в среднем совпадают и равны 0,5-2 мм [112,141]. Проведенные нами
исследования по изучению влияния степени измельченности растительного сырья
на экстракцию флавоноидов приведены в таблице 25.
Таблица 25 - Выбор степени измельченности травы девясила иволистного для
экстрагирования суммы флавоноидов
Степень измельченности сырья,мм
Содержание суммы флавоноидов в траве
девясила иволистного, %
1,0
2,0
3,0
1,01
1,28
0,87
Из таблицы 25 видно, что максимальное извлечение флавоноидов из травы
девясила иволистного достигается при степени измельченности 2 мм.
Для экстрагирования суммы флавоноидов из растительного сырья в
литературе описано применение спиртов и спирто-водных растворов. Нами
проведены исследования по изучению оптимальной концентрации спирта
этилового. Данные о полноте экстракции приводятся в таблице 26.
Таблица 26 - Выбор оптимальной концентрации спирта этилового для
экстрагирования суммы флавоноидов из растительного сырья
Концентрация спирта этилового , %
30
50
70
95
Содержание суммы флавоноидов в траве
девясила иволистного,%
0,99
1,21
1,28
0,79
Из таблицы 26 следует, что оптимальным растворителем, обеспечивающим
максимальный выход суммы флавоноидов из травы девясила иволистного,
являются спирт этиловый 50-70%. Свой выбор мы остановили на экстрагировании
62
спиртом этиловым 70%, так как он наиболее часто используется для
экстрагирования флавоноидов и
извлекает наибольший качественный состав
данных соединений.
Для извлечения флавоноидов в литературе описаны экстракция в аппарате
Сокслета, многократная экстракция кипящим спиртом этиловым 50-95%. Нами
использована экстракция до наступления равновесия [141,196]. Проведенные
исследования динамики экстракции флавоноидов из измельченного материала
кипящим спиртом при соотношении сырье-растворитель 1:100 показали
максимальный выход флавоноидов через 45 минут для травы девясила с
последующим наступлением равновесия (таблица 27)
Таблица 27 - Влияние времени экстракции на полноту извлечения флавоноидов из
травы девясила иволистного
Время экстракции, мин
30
45
60
Содержание флавоноидов
(на абсолютно сухое сырье), %
1,12
1,32
1,29
При спектрофотометрическом определении флавоноидов в растительном
сырье используют различные реакции, из которых наибольший интерес
представляют реакции комплексообразования с алюминия хлоридом и циркония
хлорокисью.
Нами
была
использована
реакция
комплексообразования
с
алюминия хлоридом в среде спирта этилового 70%. Алюминия хлорид является
доступным, дешевым реактивом, хорошо растворимым в воде, спиртах.
При
разработке
оптимальных
условий
проведения
реакции
комплексообразования установлено, что наилучшие результаты достигаются при
использовании 2 мл спиртового раствора алюминия хлорида 2% (таблица 28, 29).
Поэтому для проведения реакции достаточно брать 2 мл раствора алюминия
хлорида.
63
Таблица 28 - Влияние концентрации алюминия хлорида на полноту протекания
реакции комплексообразования
Концентрация алюминия хлорида, %
1
2
3
4
5
Содержание суммы флавоноидов
(в пересчете на абсолютно сухое сырье),%
1,20±0,05
1,25±0,04
1,28±0,06
1,32±0,05
1,28±0,05
Таблица 29 - Влияние количества раствора алюминия хлорида 2 % на полноту
протекания реакции комплексообразования
Количество алюминия хлорида, мл
1
2
3
4
5
Содержание суммы флавоноидов
(в пересчете на абсолютно сухое сырье), %
1,26±0,04
1,28±0,05
1,28±0,04
1,31±0,05
1,28±0,05
Нами исследованы спектры поглощения извлечения из травы девясила
иволистного с алюминия хлоридом. В результате установлено, что максимум
поглощения спиртового извлечения находятся в области 395 нм. Эта область
спектра достаточно удалена от спектров поглощения сопутствующих фенольных
и других органических веществ, содержащихся в экстракте из сырья (рисунок 44).
Как видно из предыдущих исследований, в траве девясила иволистного
содержатся гликозиды апигенина, кверцетина, и преобладающим среди них
являются моногликозиды флавоноидов. Спектры поглощения извлечений из
сырья с алюминия хлоридом и цинарозида с алюминия хлоридом совпадают,
поэтому в качестве стандартного образца нами выбран цинарозид.
В качестве
раствора сравнения мы использовали исходный раствор извлечения без алюминия
хлорида, то есть применили дифференциальный вариант спектрофотометрии, что
позволяет исключить влияние на результаты анализа сопутствующих веществ,
64
D
0,6
2
0,5
0,4
1
0,3
0,2
0,1
37370
39390
410
41
◦
430
43
◦
450
45
◦, нм
Рисунок 44. Дифференциальные спектры поглощения спиртового
извлечения из травы девясила иволистного с алюминия хлоридом
(1) и цинарозида с алюминия хлоридом (2) в видимой области
спектра
имеющих оптическую плотность в области максимума поглощения извлечений из
сырья [57,101,176].
При проведении анализа пробы подкисляли уксусной кислотой для
переведения флавоноидов и сопутствующих им веществ в недиссоциированную
форму с целью улучшения воспроизводимости результатов.
Таблица 30 - Устойчивость окраски извлечений из растительного сырья девясила
иволистного с алюминия хлоридом
Время, мин
20
30
45
60
90
120
Оптическая плотность
λmax=395 нм
0,468
0,477
0,482
0,480
0,480
0,478
Устойчивое окрашивание извлечений из растительного сырья с алюминия
хлоридом наступает через 30 минут и сохраняется в течение 2-х часов, что
65
достаточно для проведения анализа (таблица 30)
Проведенные
исследования
позволили
разработать
методику
количественного определения флавоноидов.
Методика количественного определения суммы флавоноидов
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих
сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1,0 г (точная навеска)
измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл,
прибавляют 100 мл спирта этилового 70 % и взвешивают с погрешностью 0,01 г.
Колбу присоединяют к обратному водяному холодильнику, нагревают на
кипящей водяной бане в течение 45 минут, периодически встряхивая для
смывания частиц сырья со стенок. Колбу с содержимым искусственно охлаждают,
взвешивают и при необходимости доводят до первоначальной массы спиртом
этиловым 70 %. Извлечение фильтруют через бумажный складчатый фильтр,
отбрасывая первые 10 мл фильтрата. 5,0 мл фильтрата помещают в мерную колбу
вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл раствора алюминия хлорида 2 % в спирте
этиловом 70 % и через 10 минут 2 капли разведенной кислоты уксусной. Объем
раствора доводят спиртом этиловым 70 % до метки. Через 30 минут измеряют
оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 395 нм в
кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 5,0 мл
извлечения, 2 капель разведенной кислоты уксусной и доведенный спиртом
этиловым 70% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Содержание суммы флавоноидов в процентах (Х) в пересчете на цинарозид
вычисляют по формуле:
,
(2)
66
D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 395 нм;
345 – удельный показатель поглощения цинарозида с алюминия хлоридом в
спирте этиловом 70%;
V – количество извлечения в мл;
m – масса навески сырья в граммах;
W – влажность сырья, %
Валидация методики количественного определения суммы
флавоноидов
Изучены
следующие
валидационные
характеристики
методики:
линейность, диапазон использования, повторяемость, воспроизводимость и
правильность.
Определение
линейности
проводили
на
6
уровнях
концентраций.
Первоначально был приготовлен исходный раствор ГСО цинарозида (0,05%), а
затем из него готовили разбавленные растворы, для этого в мерные колбы
вместимостью 25 мл помещали по 0,25; 0,5; 0,75; 1,00; 1,25; 1,50 полученного
ГСО цинарозида, прибавляли по 2 мл раствора алюминия хлорида 2 % в спирте
этиловом 70 %, перемешивали и доводили объем раствора спиртом этиловым 70
% до метки и снова перемешивали. Через 30 минут измеряли оптическую
1,2
1
D
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
0,0005
0,003
Рисунок 45 -
2
0,001
0,0015
4
3
0,002
5
0,0025
6
С
Зависимость оптической плотности полученных растворов
цинарозида (лютеолин-7-гликозида) от концентрации
67
плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 395 нм, в кювете с
толщиной слоя 10 мм в сравнении с контрольным опытом. Градуированный
график цинарозида представлен на рисунке 45.
Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции.
Если его величина близка к единице, то совокупность данных можно описать
прямой линией.
Как видно из рисунка 45, зависимость оптической плотности (у) от
концентрации цинарозида (х) выражается уравнением у= bх + а (таблица 31).
Таблица 31 - Результаты статистической обработки данных, полученных при
изучении линейной зависимости вида y=bx+a
F
4
0,00175
0,603017
b
378,7029
a
-0,05971
R
0,999614
Коэффициент корреляции 0,999614 (таблица 31), поэтому данная методика
имеет линейный характер в указанном диапазоне концентраций.
Проверку диапазона использования методики проводили следующим
образом: получали извлечения из травы девясила иволистного спиртом этиловым
70% различной концентрации, для чего брали навески сырья 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 и
из них готовили извлечения по разработанной методике.
Далее из полученных извлечений брали по 3 мл, помещали их в мерные
колбы вместимостью 25 мл, прибавляли по 2 мл раствора алюминия хлорида 2%
в спирте этиловом 70%, перемешивали, доводили объем раствора спиртом
этиловым 70% до метки и снова перемешивали. Через 30 минут измеряли
оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 395 нм, в кювете с
толщиной слоя 10 мм в сравнении с исходным раствором без алюминия хлорида.
Зависимость оптической плотности извлечений(Y) от навески сырья (X)
приведена на рисунке 46 и выражается уравнением Y=A+BX, где А – -0,03375, В
– 0,44125, коэффициент корреляции R=0,998868.
На основании полученных данных установлено, что в пределах измеряемых
68
концентраций зависимость оптической плотности извлечений от навески сырья
носит линейный характер (рисунок 46).
0,7
0,6
0,5
D
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1
2
3
4
5
6
С
Рисунок 46 - График зависимости оптической плотности извлечении из травы
девясила иволистного от навески сырья
Кроме того, найденное значение коэффициента А (-0,03375) свидетельствует
о
статистически
незначимом
вкладе
остальных
фенольных
соединений,
содержащихся в сырье и полученном извлечении, в содержание флавоноидов, что
позволяет сделать вывод о достаточной специфичности методики.
Повторяемость методики определяли на одном образце сырья в 6
повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительности
стандартного отклонения, которое не должно превышать 10%. Эта величина
составила 2,18% (таблица 32).
Таблица 32 - Результаты количественного определения флавоноидов в траве
девясила иволистного методов дифференциальной спектрофотометрии
№п/п
1
2
3
4
5
6
Содержание суммы флавоноидов
1,28
1,29
1,31
1,29
1,29
1,28
Метрологическая характеристика
Хср.=1,29
Sx2=0,00012
Sxср=0,01
ΔX=0,0281
Eотн=2,18
Хср±ΔХср=1,29±0,03
69
Воспроизводимость методики определяли 2 аспиранта кафедры. Изучение
проводили на 3 образцах в 3-х повторностях (таблица 33). Критерий
приемлемости выражается величиной относительного стандартного отклонения,
которое не должно превышать 15%.
Таблица 33 - Определение воспроизводимости методики
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в траве
девясила иволистного
Образец 1
Образец 2
Образец 3
1
0,71
1,34
1,17
Аналитик 1
2
0,80
1,57
1,20
3
0,88
1,41
1,32
4
0,87
1,47
1,25
5
Аналитик 2
0,81
1,5
1,26
6
0,83
1,52
1,33
Среднее значение
0,83
1,52
1,26
Относительное стандартное
12,31
13,01
13,00
отклонение, (RSD%)
Повторность
В результате проведенных исследований относительное стандартное
отклонение составило 13,01%, что указывает на прецизионность методики в
условиях воспроизводимости.
Правильность методики устанавливали путем измерения содержания
флавоноидов в пересчете на цинарозид в извлечениях, к которым добавлены
определенные количества стандартного раствора цинарозида: 0,25 мл, 0,50 мл,
0,75 мл.
Затем получали по методике окрашенные растворы и измеряли оптическую
плотность при длине волны 395 нм.
Критерий приемлемости – средний процент восстановления при использовании
растворов заданных концентраций, скорректированный на 100 %, и его средняя
величина должна находиться в пределах 100±5 % [74,197]. В разработанной
методике процент восстановления колеблется от 99,01 % до 103,55 %, его средняя
величина составила 101,52 % (таблица 34).
70
Таблица 34 - Определение правильности методики (результаты опытов с
добавками)
1
Содержание
суммы
флавоноидов
в пересчете на
цинарозид, мг
0,381
2
0,381
0,125
0,513
101,38
3
4
0,381
0,381
0,125
0,250
0,524
0,636
103,55
100,79
5
0,381
0,250
0,642
101,74
6
7
0,381
0,381
0,250
0,375
0,649
0,774
102,85
102,38
8
9
0,381
0,381
0,375
0,759
100,39
0,375
0,768
101,58
Среднее значение выхода 100,52%
№
п/п
Добавлено
ГСО
цинарозид,
мг
Полученное
содержание,
мг
0,125
0,501
99,01
Найдено
относительно
введенного, %
Статистические
характеристики
Хсреднее= 100,52
S2=1,85136
S=1,36065
ΔX=3,14
ɛ=3,09
Как видно из таблицы 34 в методике отсутствует систематическая ошибка,
относительная неопределенность при доверительной вероятности 0,95 не
превышает ± 3,09 %.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что
разработанная методика легко воспроизводима, доступна, занимает минимум
рабочего времени, не требует дорогостоящих реактивов.
Разработанной методикой проанализировано по 3 образца травы и по 3
образца корневищ с корнями девясила иволистного (таблица 35).
Таблица
35
-
Результаты
спектрофотометрического
определения
суммы
флавоноидов в траве и корневищах с корнями девясила иволистного
Место и год заготовки
сырья
1
Курская обл., 2011
Курская обл., 2012
Метрологическая характеристика методики
Sx2
S
Δx
3
4
5
Корневища с корнями
0,30
0,00007
0,00837
0,02
0,49
0,00023
0,01517
0,04
,%
2
Eотн.
6
2,67
4,86
71
1
Воронежская обл., 2012
2
0,18
Курская обл., 2011
Курская обл., 2012
Воронежская обл., 2012
1,26
1,52
0,83
На
основании
Продолжение таблицы 35
4
5
6
0,01817
0,05
4,64
3
0,00033
Трава
0,00027
0,00027
0,00001
разработанных
данных
0,01643
0,01643
0,01
анализа
0,05
0,05
0,03
установлены
4,46
3,88
2,91
нормы
содержания флавоноидов в траве девясила иволистного, не менее 0,8%.
4.4.3 Разработка методики количественного определения суммы
фенольных соединений
В проявлении противовоспалительного и антимикробного действия
девясила иволистного значительную роль играют фенольные соединения.
Фенольные соединения в достаточных количествах содержатся как в траве,
так и в корневищах с корнями девясила иволистного. В связи с этим нами
проведена
стандартизация данных видов сырья по содержанию фенольных
соединений.
Фенольные соединения девясила иволистного в основном представлены
флавоноидами и оксикоричными кислотами.
Для
различные
определения
методы:
содержания
прямое
фенольных
соединений
спекторофотометрирование
используются
спирто-водных
извлечений, хроматоспектрофотометрическое определение [115,167]. В последнее
время для этих целей нашли применение метод высокоэффективной жидкостной
хроматографии [127,161,184] и метод газо-жидкостной хроматографии с
использованием пламенно-ионизационного детектора [128].
Для количественного определения суммы фенольных соединений в сырье
девясила нами использован спектрофотометрический метод, основанный на
измерении собственного поглощения веществ в УФ-области. Изучение УФспектров спирто-водного извлечения из травы девясила показало, что оно имеет
72
максимум поглощения при длине волны 325 нм (рисунок 47).
Рисунок 47 -
УФ-спектры спирто-водного извлечения из травы девясила
иволистного (1) и спиртового раствора СО хлорогеновой кислоты (2)
В этой области УФ-спектра находится один из максимумов поглощения
оксикоричных кислот, в частности, хлорогеновой и кофейной кислот, которые
присутствуют в траве исследуемого вида девясила, что позволяет сделать вывод о
том, что характер кривой поглощения спирто-водных извлечений из травы
девясила определяется в основном оксикоричными кислотами.
При разработке методики количественного определения суммы фенольных
соединений были изучены измельченность сырья, время экстракции, температура
экстракции, тип растворителя, соотношения сырье-растворитель.
Результаты изучения влияния степени измельчения на выход фенольных
соединений из травы девясила иволистного приведены в таблице 36.
Таблица 36 - Влияние степени измельченности травы девясила иволистного на
полноту экстракции фенольных соединений (n=5)
Степень измельченности, мм
1
2
3
Результаты
проведенных
Содержание суммы фенольных соединений, %
6,03±0,27
5,74±0,17
5,12±0,14
исследований
показали,
что
максимальное
73
количество фенольных соединений из травы девясила иволистного извлекается
при степени измельченности 1 мм.
При разработке методики анализа для экстракции фенольных соединений
нами использованы спирт этиловый 96%, водно-спиртовые растворы
и вода
очищенная (таблица 37).
Таблица 37 - Выбор оптимальной концентрации спирта этилового для
экстрагирования суммы фенольных соединений из травы девясила иволистного
Экстрагент
Содержание суммы фенольных соединений,%
Вода очищенная
Спирт этиловый 30%
Спирт этиловый 50%
Спирт этиловый 70%
Спирт этиловый 96%
6,18±0,08
7,36±0,15
6,29±0,09
6,13±0,26
4,87±0,18
Из приведенных в таблице 37 данных следует, что полнота экстракции суммы
фенольных соединений из травы девясила иволистного достигается спиртом
этиловым 30%.
Для извлечения фенольных соединений из растительного сырья нами
использована экстракция до наступления равновесия [141]. Исследование
динамики экстракции фенольных соединений из сырья кипящим спиртом
этиловым 30% при соотношении сырье-растворитель 1:50 показали, что
максимальный выход фенольных соединений из травы девясила достигается через
45 минут (таблица 38).
Таблица 38 - Выбор времени экстрагирования суммы фенольных соединений из
травы девясила иволистного
Время экстракции, мин
30
45
60
75
Содержание суммы фенольных
соединений,%
7,21±0,26
7,36±0,15
6,35±0,62
6,35±0,13
74
Для расчета содержания суммы фенольных соединений в траве девясила
нами предложено использовать в качестве стандартного образца кислоту
хлорогеновую. Расчет содержания суммы фенольных соединений в сырье вели с
применением удельного показателя поглощения кислоты хлорогеновой в спирте
этиловом 30%
содержания
при длине волны 325 нм, который равен 504. Определение
суммы
фенольных
соединений
вели
в
области
максимума
поглощения при длине волны 325нм.
Для удаления хлорофилла и липофильных веществ сырье предварительно
обрабатывали хлороформом.
Описанные
выше
исследования
позволили
разработать
методику
количественного определения суммы фенольных соединений в траве девясила
иволистного, а также использовать ее для определения суммы фенольных
соединений и в корневищах с корнями.
Методика количественного определения суммы фенольных соединений
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих
сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм. Около 0,5 г (точная навеска)
измельченного сырья (1 мм) помещают в пакет из фильтровальной бумаги и
обрабатывают хлороформом порциями по 50 мл 3 раза на кипящей водяной бане в
течение 30 минут. Хлороформные извлечения отбрасывают. Обработанное сырье
высушивают, помещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл спирта
этилового 30%. Колбу с содержимым присоединяют к обратному холодильнику и
экстрагируют на кипящей водяной бане в течение 45 минут. После охлаждения
извлечение фильтруют в мерную колбу на 50 мл, при необходимости доводят
объем спиртом этиловым 30%
до метки. 0,5 мл полученного извлечения
переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят объем спиртом этиловым 30% до
метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны
325 нм. В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 30%.
75
Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на кислоту
хлорогеновую вычисляют по формуле с использованием удельного показателя
поглощения кислоты хлорогеновой:
,
(3)
D – оптическая плотность исследуемого раствора;
A – объем мерной колбы, используемой для сбора извлечения, мл;
B – объем мерной колбы, используемой для разведения и анализа, мл;
b – объем извлечения, взятый для разведения и анализа, мл;
– удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты при =325
нм, равный 504;
a – навеска сырья, г.
Валидация методики количественного определения суммы фенольных
соединений
Валидация разработанной методики количественного определения суммы
фенольных соединений проведена по следующим показателям: линейность,
диапазон использования, повторяемость, воспроизводимость и правильность [5,
45].
Для определения линейности строили градуировочный график хлорогеновой
кислоты [Sigma Aldrich]. Растворы стандартного образца кислоты хлорогеновой
готовили
путем разбавления или увеличения аликвоты для измерения
количественного содержания суммы фенольных соединений в растворах,
имеющих концентрацию 50, 75, 100, 125 и 150 %. Критерием приемлемости
является коэффициент корреляции. Если его величина близка к единице, то
совокупность данных можно описать прямой линией (рисунок 48, таблица 39)
76
1
0,9
0,8
0,7
D
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1
0,006
2
0,009 3
0,012 4
0,015
5
Концентрация хлорогеновой кислоты, мг/мл
С
0,018
6
Рисунок 48 - Зависимость оптической плотности растворов от
концентрации кислоты хлорогеновой.
Таблица 39 - Результаты статистической обработки данных, полученных при
изучении линейной зависимости вида y=bx+a
F
3
0,0325
0,012
b
51,967
a
-0,0028
R
0,99953
В наших исследованиях величина коэффициента корреляции составила
0,99953, что удовлетворяет требованиям и свидетельствует о возможности
применения разработанной методики для анализа фенольных соединений в траве
девясила иволистного.
Для установления диапазона использования разработанной методики
получали извлечения различной концентрации из навесок массой 0,2; 0,4; 0,6; 0,8
и 1,0 г (точные навески). Навески заливали 50 мл спирта этилового 30% и
экстрагировали на кипящей водяной бане в течение 45 минут. После охлаждения
извлечения фильтровали в мерные колбы на 50 мл, при необходимости доводили
объем спиртом этиловым 30% до метки. 0,5 мл полученного извлечения
переносили в мерную колбу на 50 мл и доводили объем спиртом этиловым 30%
77
до метки. Измеряли оптическую плотность приготовленного раствора при длине
волны 325 нм. В качестве раствора
сравнения использовали спирт этиловый
30%.
На основании полученных результатов (рисунок 49) установлено что в
0,7
0,6
0,5
D
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1
2
3
4
5
6
С
Рисунок 49 - Зависимость оптической плотности исследуемых извлечений
от концентрации.
пределах измеряемых концентраций зависимость содержания суммы фенольных
соединений от массы навески носит линейный характер, то есть разработанная
методика линейна в указанном диапазоне концентраций.
Проверку повторяемости методики определяли на одном образце сырья в 6
независимых повторностях.
Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного
отклонения, которое составило 3,64 % с 95% доверительной вероятностью, что
говорит о прецизионности методики в условиях повторяемости (таблица 40).
Определение воспроизводимости методики выполняли 2 аспиранта кафедры.
Исследование проводили на 3 образцах в 3 повторностях (таблица 41). Критерий
приемлемости выражается величиной относительного стандартного отклонения
(RSD), которое не должно превышать 15%.
78
Таблица 40 - Содержание суммы фенольных соединений в траве девясила
иволистного
№п/п
1
2
3
4
5
6
Содержание суммы фенольных
соединений, %
7,56
7,73
7,93
8,40
8,29
7,54
Метрологические характеристики
xcр=7,98
Sx2=0,12847
S xcр=0,35843 Р(%) 95
Δx=1,30
Eотн=3,64
xcр±Δ xcр=7,98±1,30
Таблица 41 - Определение воспроизводимости методики
Повторность
Содержание суммы фенольных соединений в траве
девясила иволистного,%
Образец №1
Образец №2
Образец №3
7,85
9,58
5,63
7,42
9,58
5,74
7,10
9,49
6,02
7,11
9,44
5,86
7,85
9,08
6,12
7,54
9,05
6,06
7,98
9,37
5,91
Аналитик
1
1
2
1
3
1
1
2
2
2
3
2
Среднее значение
Относительное стандартное
отклонение, ( RSD%)
В
результате
5,64
проведенных
6,65
исследований
8,44
было
установлено,
что
относительное стандартное отклонение с 95% доверительной вероятностью не
превышает 8,44%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях
воспроизводимости.
Правильность
хлорогеновой
методики
кислоты
к
проверяли
аликвоте
методом
исследуемого
известных
извлечения.
добавок
Критерий
приемлемости – средний процент восстановления при использовании растворов
заданных концентраций, скорректированный на 100%, и его средняя величина
должна находиться в пределах 100±5%.
В разработанной методике процент восстановления колеблется от 99,12%
до 105,14% (таблица 42), его средняя величина составила 102,05%.
79
Таким образом, установлено, что разработанная методика количественного
определения суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту
может быть использована для определения данной группы биологически
активных веществ в сырье девясила иволистного, так как она легко
воспроизводима, линейна, правильна, доступна, занимает минимум рабочего
времени, не требует дорогостоящих реактивов.
Как видно из таблицы 42 в методике отсутствует систематическая ошибка,
относительная ошибка единичного определения с 95% вероятностью не
превышает ±4,69%.
Таблица 42 - Определение правильности методики (результаты опытов с
добавками)
№
п/п
Содержание
суммы
фенольных
соединений в
пересчете на
кислоту
хлорогеновую
Добавлено СО
кислоты
хлорогеновой, мг
Полученное
содержание, мг
Найдено
относительно
введенного, %
1
30,30
1,84
32,99
102,64
2
3
30,30
30,30
1,84
1,84
33,29
31,86
103,57
99,12
4
30,30
3,69
35,74
105,14
5
30,30
3,69
35,44
104,26
6
30,30
3,69
34,78
102,32
7
30,30
5,53
35,76
99,80
8
9
30,30
30,30
5,53
36,31
101,33
5,53
35,94
100,30
Среднее значение выхода 102,05%
Статистическая
характеристика
Хсреднее= 102,05
S2=4,29898
S=2,0734
ΔX=4,79
ɛ=4,69
Содержание суммы фенольных соединений в сырье девясила
иволистного
Для установления нормы содержания суммы фенольных соединений в траве
80
девясила иволистного по разработанной методике проанализировано по 3 образца
травы и корневищ с корнями, заготовленных в Курской и Воронежской областях
в различные годы (таблица 43).
Таблица 43 - Содержание суммы фенольных соединений в сырье девясила
иволистного
Метрологическая характеристика методики
Место и год заготовки
сырья
Sx2
,%
S
Δx
Eотн.
Корневища с корнями
Курская обл., 2011
Курская обл., 2012
Воронежская обл.,
2012
12,89
18,12
0,8548
0,02428
0,46228
0,15582
1,29
0,43
3,01
4,06
16,03
0,01183
0,10872
0,30
2,97
Трава
Курская обл., 2011
Курская обл., 2012
Воронежская обл.,
2012
7,36
9,37
0,00823
0,02937
0,09072
0,4200
0,25
1,17
3,40
3,45
5,91
0,9006
0,06
0,16
2,71
Из данных таблицы 43 видно, что содержание суммы фенольных соединений
в траве девясила иволистного колеблется от 5,91% до 9,37%, в корневищах с
корнями от 12,89% до 18,12%. В результате проведенных исследований
установлена норма содержания фенольных соединений в траве не менее 5%, а в
корневищах с корнями – не менее 12%. Ошибка метода количественного
определения суммы фенольных соединений с 95% вероятностью не превышает
4,06%.
4.4.5 Количественное определение сесквитерпеновых лактонов
Количественное определение сесквитерпеновых лактонов, проведенное
методом обратной алкалиметрии [глава 2, раздел 2.2.14], показало, что их
содержание в корневищах с корнями составляет от 1,35±0,06% до 1,53±0,07%, а в
траве от 0,87±0,03% до 1,22±0,21%.
81
Выводы по главе 4
1.
Проведено
изучение
морфологических
и
микродиагностических
признаков травы и корневищ с корнями девясила иволистного. Установлены
микродиагностические признаки, позволяющие проводить диагностику травы и
корневищ с корнями. Для травы это 1) простые 5-7 клеточные толстостенные
волоски, клетки которых заполнены бурым содержимым;
2) простые
многоклеточные толстостенные волоски с кольцевыми утолщениями в местах
соединения клеток с заостренной конечной клеткой и укороченными 3-4 клетками
у основания; 3) 2-5 клеточные волоски;
4) многоклеточные толстостенные
волоски, прижатые к эпидермису листа, пьедестал которых состоит из 2-5
укороченных прямоугольных клеток и 1-4 удлиненных конечных клеток и
расположенных по краю листа; 5) одноклеточные остроконечные, тонкостенные,
прижатые к поверхности чашечки волоски; 6) простые одноклеточные, реже 2-х
клеточные толстостенные
волоски, расположенные по краю обертки и часто
сросшиеся по 2-3 основаниями; 7) многоклеточные толстостенные волоски,
состоящие из 3-4 укороченных прямоугольных клеток и одной конечной
удлиненной клетки, расположенные ближе к верхушке листочка обертки; 8)
клетки-идеобласты; 9) гидатоды по краю листа; 10) эфиромасличные железки,
состоящие из 6-10 выделительных клеток, расположенные в 2 ряда и 3-4 яруса.
Для корневищ с корнями 1) корневище на поперечном срезе округлой
формы, в центре сердцевина заполнена запасающей паренхимой; 2) центральный
цилиндр непучкового типа строения; 3)
перециклические лубяные волокна,
располагающиеся под флоэмой; 4) схизогенные вместилища с эфирным маслом в
первичной коре; 5) глыбки инулина в паренхиме первичной коры, сердцевине и
древесине; 6) корень первичного строения.
2. Установлены числовые показатели качества травы и корневищ с корнями:
содержание влаги не более 13 %; содержание золы общей не более 8% для травы
82
и не более 4% для корневищ с корнями; содержание золы, не растворимой в
растворе кислоты хлористоводородной 10 % не более 5 % для травы и не более
8% для корневищ с корнями. Максимальное извлечение экстрактивных веществ
из травы девясила иволистного наблюдается при экстрагировании водой (32,08%)
и спиртом этиловым 50% (28,74 %), а из корневищ с корнями спиртом этиловым
50 % (30,64 %). Поэтому нами установлен показатель «Экстрактивных веществ,
извлекаемых спиртом этиловым 50%» не менее 25 %.
3. Впервые разработана методика спектрофотометрического определения
суммы фруктозанов для корневищ с корнями девясила иволистного, основанная
на способности фруктозанов при нагревании с концентрированными кислотами
образовывать 5-гидроксиметилфурфурол, имеющий
максимум поглощения в
области 285 нм. Содержание суммы фруктозанов колеблется от 6,32 % до 7,11 %.
Методика
валидирована
по
показателям
линейности,
правильности,
воспроизводимости и повторяемости.
4. Впервые разработана методика спектрофотометрического определения
суммы флавоноидов в траве девясила иволистного. Содержание суммы
флавоноидов в траве девясила колеблется от 1,03 % до 1,29 %.
Проведена валидации методики по показателям линейности, правильности,
воспроизводимости и повторяемости, в результате чего методика признана
прецензионной в данных условиях.
5. Впервые разработана методика количественного определения фенольных
соединений в траве и корневищах с корнями девясила иволистного. Содержание
суммы фенольных соединений в траве колеблется от 5,91 % до 9,37 %, а в
корневищах с корнями от 12,89 % до 18,12 %. Методика валидирована по
показателям линейности, правильности, воспроизводимости и повторяемости.
6. Проведено количественное определение сесквитерпеновых лактонов
методом обратной алкалиметрии. Установлено, что их содержание в корневищах
с корнями колеблется от 1,35% до 1,53%, а в траве от 0,87% до 1,25%.
Относительная ошибка метода с доверительной вероятностью 0,95 не превышает
83
5%.
ГЛАВА 5 ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ДЕВЯСИЛА ИВОЛИСТНОГО
Сведения о применении в научной медицине девясила высокого, а
также применение девясила иволистного в народной медицине и результаты
фитохимического исследования травы и корневищ с корнями девясила
иволистного
позволили
определить
следующие
основные
направления
фармакологических исследований:
- изучение острой токсичности;
- изучение отхаркивающего действия;
- изучение противовоспалительного действия;
- изучение антибактериальной активности.
5.1 Изучение острой токсичности
Исследование острой токсичности изучаемых лекарственных форм и
биологически
активных
веществ
(настоя,
отвара,
водорастворимых
полисахаридных комплексов) [глава 2, раздел 2.6.1] показало, что в процессе
эксперимента наблюдали угнетение двигательной активности животных, вялость,
заторможенность, причем эти явления усиливались с увеличением дозировки
вводимых препаратов. Однако к концу суток поведение животных не отличалось
от интактных.
Результаты экспериментов представлены в таблице 44.
Из таблицы 44 видно, что внутрибрюшинное введение мышам настоя из
травы и отвара из корневищ с корнями в дозах от 2000 мг/кг до 5000 мг/кг, а
также полисахаридных комплексов от 100 мг/кг до 300 мг/кг не приводило к
гибели животных, что позволяет считать исследуемые водные извлечения и
полисахаридные комплексы нетоксичными в испытанном диапазоне доз. LD50 в
84
опытах не установлена, поскольку при введении максимально допустимой по
объему вводимого извлечения дозы гибели животных не наблюдали.
Таблица 44 -
Результаты изучения острой токсичности настоя, отвара и
полисахаридных комплексов из травы и корневищ с корнями девясила
иволистного
Количество животных
живых
погибших
Корневища с корнями девясила иволистного
отвар
2000
6
0
3000
6
0
4000
6
0
5000
6
0
полисахаридный комплекс
100
6
0
200
6
0
300
6
0
Трава девясила иволистного
настой
2000
6
0
3000
6
0
4000
6
0
5000
6
0
полисахаридный комплекс
100
6
0
200
6
0
300
6
0
Растение, фитокомплекс




Доза, мг/кг
Исходя из имеющихся данных, можно говорить, что исследуемые водные
извлечения и полисахаридные комплексы по классификации К.К. Сидорова
относятся к классу практически нетоксичных.
5.2 Изучение отхаркивающего действия
О наличии отхаркивающих свойств у исследуемых настоя, отвара и
водорастворимых полисахаридных комплексов судили по величине коэффициента
ускорения движения ресничек мерцательного эпителия пищевода лягушки [глава
2, раздел 2.6.2].
Результаты исследований представлены в таблице 45.
Из данных, представленных в таблице 45, видно, что настой травы и отвар
85
корневищ с корнями, а также водорастворимые полисахаридные комплексы
повышают двигательную активность мерцательного эпителия, следовательно,
обладают отхаркивающими свойствами.
Таблица 45 - Влияние исследуемых настоя, отвара и полисахаридных комплексов
из сырья девясила иволистного на двигательную активность мерцательного
эпителия лягушки
Растение, фитопрепарат
Коэффициент ускорения
Корневища
с
корнями
девясила иволистного
 отвар
0,67±0,01
 ВРПС
0,77±0,10
Трава девясила иволистного
 настой
 ВПРС
Увеличение двигательной
активности, %
32,33±1,27*
21,70±4,67*
0,81±0,02
0,89±0,04
18,75±1,73*
10,08±1,86*
Корневища
с
корнями
девясила высокого
 отвар
0,67±0,01
32,06±0,53*
Примечание: * - различия по сравнению с контролем статистически достоверны при Р  0,05, n
= 6 – количество лягушек в группе
Наиболее активными по силе отхаркивающего действия были корневища с
корнями
девясила
иволистного.
Отвар,
полученный
из
них,
по
силе
отхаркивающего действия (увеличение двигательной активности - 32,33%) был
сопоставим с отваром, полученным из корневищ с корнями девясила высокого
(увеличение двигательной активности – 32,06%) [44].
5.3 Изучение противовоспалительной активности
Фармакологическая регуляция процессов воспаления является одной из
важнейших проблем медицины.
Частота
заболеваний,
протекающих
с
выраженной
воспалительной
86
реакцией, их хроническое течение и длительная потеря работоспособности
обусловливают поиск лекарственных средств для воздействия на процессы
воспаления.
В
настоящее
время
недостаточно
широко
используются
противовоспалительные свойства лекарственных растений и препаратов из них,
отличающиеся, может быть, несколько менее выраженным эффектом, но лучшей
переносимостью, меньшей токсичностью, полифункциональностью.
Воспаление – сложный многоступенчатый процесс, представляющий собой
динамический
каскад
биологических
причинно-следственных
явлений,
проходящих в своем развитии через ряд стадий и фаз [159,175]. Поэтому
противовоспалительную активность изучаемых препаратов оценивали по
общепринятой
схеме
с
учетом
влияния
препарата
на
разные
фазы
воспалительного процесса.
5.3.1 Влияние на процессы экссудации
Изучение антиэкссудативной активности исследуемых фитокомплексов
проводили на модели острого воспаления, вызванного субплантарным введением
в заднюю лапу мыши водного раствора формалина [глава 2, раздел 2.6.3][31].
Из результатов, представленных в таблице 46, видно, что величина отека
лапы в контроле составляет 58,272,65% (100%). У мышей, получавших настой из
травы и отвар из корневищ с корнями девясила иволистного, а также
полисахаридные комплексы из исследуемых видов сырья, отеки значительно
меньше по сравнению с контролем. При этом наибольшей антиэкссудативной
активностью
обладают
водорастворимые
полисахаридные
комплексы;
противовоспалительный эффект у полисахаридного комплекса из травы составил
27,90%, а из корневищ с корнями 29,50%.
Из водных извлечений наибольшей антиэкссудативной активностью
обладает настой травы (противовоспалительный эффект 26,26%).
87
Таблица
46
-
Влияние
изучаемых
настоя,
отвара,
водорастворимых
полисахаридов девясила иволистного на отек лапы, вызванный у мышей
формалином
Вес лапок, мг
Растение,
фитокомплекс
Доза
Величина отека
Противовоспалительный
эффект, %
левой
правой
(Мm), мг
%
Контроль
184,78
126,51
58,272,65
100
-
Корневища
с
корнями девясила
высокого
1 г/кг
▪отвар
203,03
157,93
45,102,97*
77,39
22,61
Трава
девясила
иволистного
 настой
1 г/кг
172,83
129,86
73,74
26,26
42,973,53*
*
 ВРПС
100 мг/кг
171,88
129,91
72,02
27,90
41,97±3,99
Корневища
с
корнями девясила
иволистного
1 г/кг
211,78
164,97
46,372,36*
79,58
20,42
 отвар
*
100 мг/кг
166,03
124,78
70,49
29,50
41,080,53
 ВРПС
Примечание: * - различия по сравнению с контролем статистически достоверны при Р  0,05; n
= 6 – количество мышей в групп
Противовоспалительный эффект отвара корневищ с корнями девясила
иволистного
(20,42%)
сопоставим
с
таковым
корневищ
с
корнями
официнального вида - девясила высокого (22,61%), а настой травы превосходит
по силе действия отвар корневищ с корнями девясила высокого (22,61%).
5.3.2 Влияние на пролиферацию
Изучение влияния исследуемых фитокомплексов на пролиферативный
компонент воспаления проводили в опытах на модели "ватной гранулемы" [глава
88
2, раздел 2.6.3]. Результаты представлены в таблице 47. Как видно из таблицы 47,
в контрольной группе животных вес грануляционной ткани составил 140,558,07
мг.
Таблица 47 - Влияние изучаемых настоя, отвара и полисахаридных комплексов,
полученных из травы и корневищ с корнями девясила иволистного на
образование грануляционно-фиброзной ткани у крыс
Растение,
фитокомплекс
Доза
Число
животных
Масса сухих
гранулем (Мm),
мг
140,558,07
Угнетение
образования
гранулемы, %
-
Контроль
6
Корневища с корнями
девясила высокого
 отвар
1 г/кг
6
26,27
103,63 10,47*
Корневища с корнями
девясила иволистного
 отвар
1 г/кг
6
77,162,22*
45,11
 полисахаридный
*
100мг/кг
6
28,73
100,178,03
комплекс
Трава
девясила
иволистного
 настой
1 г/кг
6
53,953,04*
61,62
 полисахаридный
*
100мг/кг
6
65,10
49,057,07
комплекс
Примечание: * - различия по сравнению с контролем статистически достоверны при Р  0,0
Эта величина нами принята за 100 %. В остальных сериях опытов под
влиянием исследуемых настоя, отвара, полисахаридных комплексов величина
грануляционной ткани была меньше с 49,057,07 мг до 100,178,03 мг, что
приводило к достоверному снижению воспалительного процесса от 28,73% до
65,10 %. Таким образом, установлено, что исследуемые настой, отвар,
полисахаридные комплексы
оказывали
влияние на пролиферативную фазу
воспаления, замедляя развитие гранулемы. Пролиферативный эффект настоя из
травы и отвара корневищ с корнями девясила иволистного превышал таковой у
отвара девясила высокого (таблица 47).
При
этом
наиболее
выраженная
антипролиферативная
активность
установлена при введении настоя и полисахаридного комплекса из травы
89
девясила иволистного. В этих случаях процесс развития гранулемы угнетается на
61,62% и 65,10%.
5.3.3 Влияние на проницаемость капилляров у кроликов
В возникновении и течении ряда патологических процессов, в том числе и
воспаления, проявляющихся в виде геморрагических синдромов, большое
значение имеет фактор сосудистой проницаемости.
Изучение
влияния
исследуемых
настоя,
отвара
и
полисахаридных
комплексов на проницаемость капилляров проводили по методу Ойвина [глава 2,
раздел 2.6.3]. Полученные данные представлены в таблице
48. Из данных
таблицы 48 видно, что в случаях введения изучаемых водных извлечений и
полисахаридных
комплексов
пятна
окрашивания,
свидетельствующие
о
проникновении трипановой сини через гисто-гематический барьер, появлялись
значительно позже по сравнению с контролем.
Таблица 48 - Влияние изучаемых настоя, отвара, полисахаридных комплексов,
полученных из травы и корневищ с корнями девясила иволистного, на
проницаемость капилляров у кроликов
Растение,
фитокомплекс
1
Доза
2
3
3,96018
1 г/кг
5,020,10*
Контроль
Корневища
с
корнями девясила
высокого
 отвар
Латентный
период
появления
пятен
окрашивания,
мин
Увеличение
латентного
периода
появления
пятен
окрашивания
мин
4
1,06
Уменьшение
Диаметр пятен
диаметра
окрашивания,
пятен
см
окрашивания,
%
%
5
6
1,740,03
7
26,77
1,180,06*
32,18
90
Продолжение таблицы 48
1
2
Корневища
с
корнями девясила
иволистного
 отвар
1 г/кг
 полисахаридный 100
комплекс
мг/кг
Трава
девясила
иволистного
1 г/кг
 настой
100
 полисахаридный
мг/кг
комплекс
3
4
5
6
7
4,540,18*
4,950,08*
0,58
0,99
14,65
25,00
1,260,08*
0,76,006*
27,59
56,32
6,700,16*
7,820,17*
2,74
3,86
69,19
97,47
0,960,03*
0,650,07*
44,83
62,64
Примечание: * - различия по сравнению с контролем статистически достоверны при Р  0,05.
Число животных в контроле и в каждом варианте опыта 10.
Анализ полученных данных говорит об уменьшении сосудистой проницаемости
для трипановой сини при введении настоя, отвара и полисахаридных комплексов
девясила
иволистного,
капилляроукрепляющего
что
является
действия
как
свидетельством
одного
из
наличия
механизмов
противовоспалительной активности исследуемых фитокомплексов.
Наиболее выраженное капилляроукрепляющее действие выявлено у настоя
и полисахаридных комплексов, полученных из травы девясила иволистного.
5.4 Изучение антимикробной активности
Большинство инфекционных заболеваний имеют хронический, вялотекущий
характер, что предполагает длительное применение антимикробных средств (как
правило,
синтетических
препаратов
или
антибиотиков).
При
высокой
эффективности этих средств они вызывают ряд нежелательных или побочных
действий: резистентность возбудителей инфекции, изменение иммунологической
реактивности организма, аллергические реакции, токсичность и др.
Лекарственные средства растительного происхождения по сравнению с
91
синтетическими
более
безопасны,
полифункциональны,
возможность длительного применения [75,87].
предполагают
Поэтому представляло интерес
изучить антимикробную активность настоя из травы и отвара из корневищ с
корнями девясила иволистного с целью выявления спектра их действия.
Антибактериальное действие исследуемых водных извлечений определяли
методом культивирования микробов на питательной среде с добавлением
исследуемого извлечения в сравнении с контролем [глава 2, раздел 2.6.4].
Результаты исследования антимикробного действия представлены в таблице
49.
Таблица 49 - Антимикробная активность водных извлечений из травы и корневищ
с корнями девясила иволистного
Bacillus
cereus
Pseudomonas
aeruginosa
Proteus vulgaris
Настой травы
девясила
иволистного
+



-



+
+
+
-
Staphylococcus
aureus
Отвар из
корневищ с
корнями
девясила
высокого
Candida
Фитопрепарат
Escherichia coli
Тест - культура
1:2
1:4
1:10
-
+
+
+



1:2
1:4
1:10
-




+
+
+
Разведение
Отвар из

+
корневищ с
1:2

корнями
1:4
+

девясила
1:10
+
иволистного
Примечание: "-" – отсутствие роста, "" – слабый рост,
+
+
+
"+" – сильный рост.
Антибактериальные свойства исследуемых препаратов изучали in vitro в
отношении
Staphylococcus
aureus, Escherichia
coli, Candida, Pseudomonas
92
aeruginosa, Proteus vulgaris, Bacillus cereus. Проведенные исследования показали,
что настой травы девясила иволистного, отвар корневища и корней девясила
иволистного проявляет выраженную антимикробную активность в отношении
грибка рода Candida, в концентрации 1:2, 1:4, 1:10 (таблица 49).
Отсутствие роста культуры Escherichia Colli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa наблюдалось на питательной среде, составной частью которой являлся
настой травы девясила иволистного в концентрации 1:2 и 1:4 (Pseudomonas
aeruginosa).
Что касается официнального вида сырья – девясила высоко корневища и
корни, то выраженная антибактериальная активность проявлялась в отношении
культур Candida, Proteus vulgaris, в концентрации 1:2, 1:4, 1:10 и Bacillus cereus – в
концентрации 1:2, 1:4. В отношении других культур наблюдался слабый или
сильный их рост [44].
Выводы по главе 5
1.
В результате проведенных исследований установлено, что отвар из
корневищ с корнями, настой из травы и полисахаридные комплексы, полученные
из них по классификации К.К. Сидорова, относятся к классу практически
нетоксичных.
2.
Установлена отхаркивающая активность корневищ с корнями и травы
девясила иволистного. Наиболее выраженной отхаркивающей активностью
обладает отвар из корневищ с корнями девясила иволистного (увеличение
двигательной активности 32,33%). Отвар корневищ с корнями девясила
иволистного по силе отхаркивающего действия не уступает официнальному виду
– отвару, полученному из корневищ с корнями девясила высокого (увеличение
двигательной активности 32,06%).
3.
Отвар из корневищ с корнями, настой из травы и полисахаридные
комплексы, полученные из них, обладают противовоспалительной активностью,
93
влияя на воспалительную реакцию за счет угнетения процессов экссудации и
пролиферации, а также оказывают влияние на проницаемость капилляров.
4.
Исследована антимикробная активность отвара из корневищ с
корнями и настоя из травы девясила иволистного. Наибольшую активность
изученные водные извлечения показали в отношении тест-культур «Candida» во
всех исследованных разведениях, отвар из корневищ с корнями девясила
иволистного также был активен в отношении культуры Proteus vulgaris.
94
ВЫВОДЫ
1.
Проведено фитохимическое изучение травы и корневищ с корнями
девясила иволистного. Установлено наличие углеводов, азотистых оснований
(0,83±0,04% в траве и 0,91±0,04% в корневищах с корнями), органических кислот
(5,91±0,17% в траве и 3,74±0,09% в корневищах с корнями), тритерпеновых
соединений (0,05±0,001% в траве и 0,09±0,001% в корневищах с корнями),
каротиноидов (7,01±0,27 мг% в траве и 1,31±0,06 мг% в корневищах с корнями),
фенольных соединений, эфирного масла (в корневищах с корнями от 0,88 % до
1,12%, в траве - от 0,33% до 0,47%.
сесквитерпеновых лактонов, аминокислот, макро- и микроэлементов;
изучен состав липофильной фракции.
2.
Различными методами хроматографии (бумажной, тонкослойной,
ВЭЖХ) в траве и корневищах с корнями идентифицировано 22 вещества
фенольной природы кумарины: умбеллиферон, дикумарин, дигидрокумарин,
скополетин; флавоноиды: витексин, изовитексин, дигидрокверцетин, гесперидин,
рутин, лютеолин-7-гликозид, гиперозид; производные дубильных веществ: танин,
эпикатехингаллат, эпикатехин, катехин; производные фенолкарбоновых кислот:
галловая,
цикориевая,
хлорогеновая,
кофейная,
феруловая,
коричная,
розмариновая кислоты. Впервые для девясила иволистного идентифицировано 19
фенольных соединений.
3.
Впервые, методом ВЭЖХ установлено количественное содержание
основных флавоноидных соединений: витексина (0,3%) и изовитексина (0,21%) в
траве и изовитексина (0,08%) и гесперидина (0,14%) в корневищах с корнями, а
также фенолкарбоновых кислот: хлорогеновой (1,48%) и розмариновой (0,65%) в
траве и галловой (0,20%) и цикориевой (0,71%) в корневищах с корнями.
4.
Впервые из травы и корневищ с корнями девясила иволистного
выделены полисахариды по фракциям: водорастворимые полисахаридные
комплексы, выход которых составил 6,87% для травы и 8,86% для корневищ с
95
корнями; пектиновые вещества – 3,23% и 15,10%; гемицеллюлоза А – 3,34% и
3,07%; гемицеллюлоза Б – 5,97% и 2,86% соответственно. Изучен их
качественный
и
количественный
моносахаридный
состав.
Определено
содержание функциональных групп пектиновых веществ.
5.
Впервые для корневищ с корнями девясила иволистного разработаны
методики количественного определения основных групп действующих веществ:
для корневищ с корнями методика спектрофотометрического определения суммы
фруктозанов,
по
5
гидроксиметилфурфуролу
как
продукту
кислотной
трансформации фруктозы. Содержание суммы фруктозанов колеблется от 6,32%
до 7,11%; для травы методика дифференциального спектрофотометрического
определения суммы флавоноидов, в пересчете на цинарозид, содержание которых
колеблется от 1,03%, до 1,29%; для травы и корневищ с корнями методика
спектрофотометрического
определения
суммы
фенольных
соединений,
содержание суммы фенольных соединений колеблется от 5,91% до 9,37% в траве
и от 12,89% до 18,12% в корневищах с корнями. Разработанные методики
валидированы
по
показателям
линейности,
диапозону
использования,
повторяемости, воспроизводимости и правильности.
6.
Проведено количественное определение сесквитерпеновых лактонов
методом обратной алкалиметрии. Установлено, что их содержание в корневищах
с корнями колеблется от 1,35±0,06% до 1,53±0,07%, а в траве от 0,87±0,03% до
1,22±0,21%. Относительная ошибка метода с доверительной вероятностью 0,95 не
превышает 5%.
7.
Проведено изучение морфологических и микродиагностических
признаков травы и корневищ с корнями девясила иволистного. Установлены
микродиагностические признаки стеблей, листьев, цветков, листочков обертки,
корневищ, корней девясила иволистного. Диагностическое значение имеют
наличие различного типа волосков, эфирномасличных железок, состоящих из 610 выделительных клеток, расположенных в 2 ряда и 3-4 яруса на эпидермисе
стебля, листа, листочков обертки, цветка.
96
Микродиагностические признаки корневищ заключаются
в наличие
схизогенных вместилищ с эфирным маслом в первичной коре; глыбок с
инулином в паренхиме первичной коры, сердцевины и древесины.
8.
Установлены числовые показатели, характеризующие качество сырья:
влажность не более 13%, золы общей не более 5% для травы и не более 8% для
корневищ с корнями, золы, нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте,
не более 2% для травы и не более 4% для корневищ с корнями; экстрактивных
веществ, извлекаемых спиртом этиловым 50% не менее 25%.
9.
Результаты
скрининговых
фармакологических
показали, наличие у корневищ с корнями и травы
исследований
отхаркивающей,
противовоспалительной и антимикробной активности. Отвар корневищ с корнями
девясила иволистного (увеличение двигательной активности на 32,33%) по силе
отхаркивающего действия не уступает отвару, полученному из корневищ с
корнями официнального вида – девясила высокого (увеличение двигательной
активности на 32,06%).
97
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Азарова, А.В. Изучение пектиновых веществ девясила иволистного /
А.В. Азарова, К.А. Александрова // III международная научно-практич.конф.
«Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» : сборник работ,
Владикавказ. – 2012. – С. 146-147.
2.
Азарова, А.В.
Сесквитерпеновые лактоны девясила иволистного
(Inula salicina L.) / А.В. Азарова, Д.Н. Пожидаева // IV международная научнопрактич.конф. «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» :
сборник работ. Часть I. Владикавказ. – 2013. – С. 197-198.
3.
Азарова,
А.В.
Исследование
дубильных
веществ
прозанника
крапчатого и девясила иволистного / А.В. Азарова, А.Ю. Малютина // XVIII
Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» , сборник материалов
конгресса : Москва. 2011. – С.584.
4.
Азарова, А.В. Содержание дубильных веществ в девясиле иволистном
(Inula salicina) / А.В. Азарова // Молодежная наука и современность : материалы
конф. Курск. 2011. Часть II. С.222.
5.
Алкилани, А. Элементный состав надземных и подземных органов
Verbascum densiflorum Bertol / А. Алкилани, О.И. Попова, Т.В. Живчикова //
Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : науч.
тр. / Пятигорск. гос. фармацевт. акад. – 2005. – Вып. 60. – С. 5-6.
6.
Аль-Гифри, С.К. Фармакогностическое изучение растений рода
Дурнишник : дис. … канд. фармацевт. наук : 14.04.02 / С.К. Аль-Гифри. – Курск,
2010. – 174 с.
7.
Аминокислотный
жирнокислотный
и
углеводный
состав
сока
некоторых видов рода Betula / Т.А. Шуляковская, Л.В. Ветчинникова, М.К.
Ильинова [и др.] // Раст. ресурсы. – 2006. – Т. 42, вып.2. – С. 69-77.
8.
Бандюкова, В.А. Методы исследования природных флавоноидов /
В.А. Бандюкова, А.Л. Шинкаренко, А.Л. Казаков. – Пятигорск, 1977. – 72 с.
98
9.
Бандюкова, В.А. Применение цветных реакций для обнаружения
флавоноидов путем хроматографии на бумаге / В.А. Бандюкова // Раст. ресурсы. –
1965. – Т. 1, вып. 4. – С. 391.
10.
Бандюкова, В.А. Тонкослойная хроматография флавоноидов / В.А.
Бандюкова, А.А. Шинкаренко // Химия природных соединений. – 1983. – № 1. –
С. 20
11.
Бандюкова, В.А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды /
В.А. Бандюкова // Химия природных соединений. – 1983. – № 3. – С. 263-273.
12.
Беккер, Ю. Инструментальная аналитика: методы хроматографии
капиллярного электрофореза / Ю. Беккер. – М. : Техносфера, 2009. – 427 с.
13.
Беликов,
В.В.
Избирательный
метод
анализа
флавоноидов
в
фитохимических препаратах / В.В. Беликов, Т.В. Точкова, Л.Г. Колесник //
Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств :
материалы докл. Всесоюз. конф. – М., 1991. – Т. 2, ч. 2. – С. 13, 142.
14.
Беликов, В.В. Методы анализа флавоноидных соединений / В.В.
Беликов, М.С. Шрайбер // Фармация. – 1970. – № 1. – С. 68-72.
15.
Беликов, В.В. Реакции комплексообразования в анализе флавоноидов /
В.В. Беликов, Т.В. Точкова // Фенольные соединения и их физиологические
свойства. – Алма-Ата, 1973. – С. 168-172.
16.
Беликов,
В.В.
Спектрофотометрия
комплексных
соединений
флавоноловых смесей / В.В. Беликов, Т.В. Точкова // Современные проблемы
фармацевтической науки и практики : тез. докл. II Съезда фармацевтов УССР. –
Киев,1972. – С. 572-575.
17.
Беляков, К.В. Определение инулина в корневищах и корнях девясила
высокого (Inula helenium) / К.В. Беляков, Д.М. Попов // Фармация. – 1998. –№ 1. –
С. 34-36.
18.
Беляков, К.В. Определение сесквитерпеновых лактонов в корневище и
корнях девясила высокого (Inula helenium L.) / К.В. Беляков, Д.М. Попов //
Фармация. – 1999. – № 2. – С. 30-32.
99
Блинова, М.П. Углеводный состав подземной части Adenophora
19.
pereskiifolia (Campanulaceae) / М.П. Блинова, В.Г. Дударев, Н.И. Котова // Раст.
ресурсы. – 2007. – Т. 43, вып. 4. – С. 95-101.
Бубенчиков,
20.
Р.А.
Аминокислотный
состав
травы
кульбабы
шершавоволосистой (Leontodon hispidus L.) / Р.А. Бубенчиков, Н.Н. Гончаров //
Современная фармация: образование, наука, бизнес. Материалы конф. – Тюмень.
– 2014. – С.148-149.
Бубенчиков, Р.А. Изучение фенольных соединений фиалки полевой
21.
методом ВЭЖХ / Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров // Хим.-фармацевт. журн. –
2005. – № 3. – С. 18-21.
Бубенчиков, Р.А. Оценка противовоспалительной и отхаркивающей
22.
активности фиалки опушенной / Р.А. Бубенчиков, М.В. Покровский, Т.Г.
Покровская // Кубан. науч. мед. вестн. – 2010. – № 8 (122). – С. 28-31.
Бубенчиков, Р.А. Фитохимическое и фармакологическое изучение
23.
растений рода фиалки : автореф. дис. ... канд. мед. наук (14.00.25; 15.00.02) / Р.А.
Бубенчиков. – Купавна, 2002. – 23 с.
Бубенчикова, В.Н.
24.
Изучение
фенолкарбоновых кислот травы
бородавника обыкновенного, девясила иволистного и прозанника крапчатого /
В.Н. Бубенчикова, С.В. Логутев, А.В. Азарова, А.Ю. Малютина // XIX Российский
национальный конгресс «Человек и лекарство» : сборник материалов конгресса. –
М.: 2012. – С.358-359.
Бубенчикова, В.Н. Изучение полисахаридного комплекса травы Inula
25.
salicina
L./
В.Н.Бубенчикова,
А.В.
Азарова
//
Кластерные
подходы
фармацевтического союза : материалы научн.-практ.конф., Белгород. – 2012. –
С.197-198.
26.
Бубенчикова, В.Н. Азотистые основания девясила иволистного / В.Н.
Бубенчикова, А.В.Азарова // Фитодизайн в современных условиях. Материалы
конф. Белгород 14-17 июня 2010. – под ред. В.К.Тохтарь, В.Н.Сорокопудова,
Белгород. – изд:БелГУ, 2010. – С. 354.
100
27.
Бубенчикова, В.Н. Аминокислотный
и минеральный состав травы
шалфея поникающего (Salvia nutans L.) // Башкирский химический журнал. – 2012
г. – Т.19, №4 – С.154-155.
28.
Бубенчикова, В.Н. Аминокислотный и минеральный состав травы
тимьяна блошиного (Thymus pulegioides L.) / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Старчак //
Науч. ведомости БГУ. Сер. «Медицина. Фармация». – 2012. – № 10 (129), вып.
18/3. – С. 40-42.
29.
Бубенчикова, В.Н. Аминокислотный состав медуницы неясной / В.Н.
Бубенчикова, В.С. Казакова // Сб. тр. II Междунар. науч. конф. молодых ученыхмедиков: в 3 т. – Курск, 2008. – Т. 3. – С. 287-289.
30.
Бубенчикова, В.Н. Антимикробная и антиэкссудативная активность
настоя шалфея горминового (Salvia horminum
L.) / В.Н. Бубенчикова, Ю.А.
Кондратова // Современные проблемы отечественной медико-биологической и
фармацевтической промышленности. Материалы конф. – Пенза, 9-10 ноября 2012
г. – С.201-204.
31.
Бубенчикова, В.Н. Антиэкссудативная активность водорастворимого
полисахаридного комплекса вероники седой / В.Н. Бубенчикова, Ю.А.
Кондратова // Научный журнал Ученые записки Орловского государственного
университета – Орел, 2012 г. - № 6(50) – С.211-213.
32.
Бубенчикова, В.Н. Изучение качественного и количественного состава
флавоноидных соединений медуницы неясной / В.Н. Бубенчикова, В.С. Казакова
// Краеведение в Курском крае: прошлое и современность. Межрегиональные
связи : тр. 2-ой Междунар. науч. краевед. конф. ( Курск, 2 нояб. 2007 г.). – Курск,
2007 – С. 44-46.
33.
Бубенчикова, В.Н. Изучение пектиновых веществ травы вероники
седой и корневищ с корнями девясила иволистного / В.Н. Бубенчикова, Ю.А.
Кондратова, А.В. Азарова // XIX Российский национальный конгресс «Человек и
лекарство» : сборник материалов конгресса. – М.: 2012. – С. 359.
34.
Бубенчикова, В.Н. Изучение пектиновых веществ травы шалфея
101
поникающего (Salvia nutans L.) / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Кондратова //
Университетская наука: теория, практика, инновации : сб. тр. 74-й науч. конф.
КГМУ, сес. Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН и отд-ния РАЕН : в 3 т. –
Курск, 2009. – Т. 2. – С. 204-206.
35.
Бубенчикова, В.Н. Изучение полисахаридного и минерального состава
герани луговой (Geranium pratense L.) / В.Н. Бубенчикова, Ж.А. Булатникова //
Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации : сб. науч. тр. Междунар.
конгр. – М., 2011. – С. 166-168.
36.
Бубенчикова, В.Н. Изучение флавоноидов травы девясила иволистно /
В.Н. Бубенчикова, А.В. Азарова // Традиционная медицина / научнопрактич.журнал № 5. – 2012. – С.183-185.
37.
Бубенчикова, В.Н. Исследование каротиноидов девясила иврлистно /
В.Н. Бубенчикова, А.В. Азарова // Современные аспекты разработки и
совершенствования состава и технологии лекарственных форм / Курск. 2011. –
С.297-298.
38.
Бубенчикова, В.Н. Качественное определение флавоноидов в сырье
«Шалфея листья» / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Кондратова // Научные ведомости
Белгородского государственного университета. Серия медицина. Фармация. –
Белгород, 2012 г. – Выпуск 20/1 С.165-166.
39.
Бубенчикова,
В.Н.
Медуница
неясная
–
новый
источник
полисахаридов / В.Н. Бубенчикова, В.С. Казакова // Фармация. – 2008. – № 2. – С.
19-21.
40.
Бубенчикова, В.Н. Морфолого-анатомическое исследование травы
девясила иволистного [Электронный ресурс] / В.Н. Бубенчикова, Ю.А.
Кондратова, А.В. Азарова // Фундаментальный исследования №5. Часть 3. 2014.
С.519-522. Режим доступа: http://search.rae.ru/
41.
Бубенчикова, В.Н. Пектиновые вещества Fragaria vesca L. / В.Н.
Бубенчикова,
лекарственных
И.Л.
Дроздова
препаратов
//
Актуальные
природного
проблемы
происхождения
создания
:
новых
материалы
VII
102
Междунар. съезда «Фитофарм-2003» ( Санкт-Петербург – Пушкин, 3-5 июля 2003
г.). – СПб., 2003. – С. 24-27.
42.
Бубенчикова, В.Н. Полисахаридный и аминокислотный состав
растений рода медуница и подмаренник / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Понарьина,
В.С. Казакова // Человек и лекарство : тез. докл. XV Рос. нац. конгр. (Москва, 1418 апр. 2008 г.). – М., 2008. –596 с.
43.
Бубенчикова, В.Н. Разработка методики стандартизации корней
девясила иволистного / В.Н. Бубенчикова, А.В. Азарова
// Традиционная
медицина научно-практический журнал №5. 2011. – С. 163-165.
44.
Бубенчикова,
В.Н.
Состав
и
отхаркивающая
активность
водорастворимых полисахаридных комплексов девясила иволистного / В.Н.
Бубенчикова,
А.В.
Азарова
//
Научные
ведомости
Белгородского
государственного университета Естественные науки № 9 (104). Выпуск 15/2.
2011. – С.188-190.
45.
Бубенчикова, В.Н. Стандартизация сырья девясила иволистного (Inula
salicina L.) по содержанию гидроксикоричных кислот [Электронный ресурс] /
В.Н. Бубенчикова, А.В. Азарова // Современные проблемы науки и образования
№ 2. 2014. Режим доступа: http://www.science-education.ru/116-1243
46.
В.Н.
Бубенчикова, В.Н. Тритерпеновые соединения девясила иволистного /
Бубенчикова,
А.В.
Азарова,
О.И.
Пугачева
//
II
Российский
фитотерапевтический съезд: сборник научных трудов съезда / Приложение к
журналу
«Традиционная
медицина»
№3
(22)
2010.
–
М.:
Изд-во
Профессиональной ассоциации натуропевтов, 2010. – С.103.
47.
Бубенчикова, В.Н. Фенольные соединения шалфея лугового (Salvia
pratensis L.) / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Кондратова // Физическое и духовное
здоровье: традиции и инновации : сб. науч. тр. Междунар. конгр. – М, 2011. – С.
168-170.
48.
Бубенчикова, В.Н. Фитохимическое изучение медуницы неясной /
В.Н. Бубенчикова, В.С. Казакова // Университетская наука: теория, практика,
103
инновации : сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сес. Центр.-Чернозем. науч. центра
РАМН : в 3 т. – Курск, 2008. – Т. 3. – С. 41-44.
49.
Буданцев, А.Л. Розмариновая кислота: источники и биологическая
активность / А.Л. Буданцев, Е.Е. Лесиовская // Растительные ресурсы. – 2012. –
Т.48, вып.3. – С.453-468.
50.
Бузина, Г.В. Титрометрический метод количественной и качественной
характеристики пектиновых веществ / Г.В. Бузина, О.Ф. Иванова, Л.Б.
Сосновский // Хлебопекарная и кондитерская промышленость. – 1965. – № 4. –
С.15-18.
51.
Валов,
Р.И.
Фармакогностический
анализ
травы
хамериона
узколистного (Chamerion angustifolium (L.) Holub) / Р.И. Валов, М.А. Ханина //
Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб.
науч. тр. / Пятигор. фармацевт. акад. – Пятигорск, 2007. – С. 23-24.
52.
Василенко, В.Е. Определение хлорхолинхлорида в объектах внешней
среды методом тонкослойной хроматографии / В.Е. Василенко // Гигиена и
санитария. – 1980. – № 10. – С. 54-56.
53.
Ващенко,
Т.Н.
Антимикробное
действие
пектинов
и
пектинсодержащих препаратов / Т.Н. Ващенко, В.П. Степанян, В.П. Анисимова //
Науч. тр. / Курский мед. ун-т. – Курск, 1997. – С. 185.
54.
Виноградова, Р.П. Физико-химические методы в биохимии / Р.П.
Виноградова, В.А. Цудзевич, С.Н. Храпунов. – Киев : Выща школа, 1983. – 387 с.
55.
Влияние экстрактов девясила на показатели фармакодинамики и
фармакокинетики этанола у экспериментальных животных / В.П. Нужный, А.П.
Ефремов, И.Г. Забирова [и др.] // Наркология. – 2004. – № 8. – С. 21-27.
56.
Вылку, С.В. Исследование полисахаридов окопника лекарственного
Symphytum officinale L. / С.В. Вылку // Актуальные проблемы создания новых
лекарственных препаратов растительного происхождения : материалы VII
Междунар. съезда «Фитофарм-2003» (Санкт-Петербург-Пушкин, 3-5 июля 2003
г.). – СПб., 2003. – С. 27-29.
104
57.
Галишевская, Е.Е. Фенольные соединения двух видов растений рода
Марьянник / Е.Е. Галишевская, В.М. Петриченко // Хим.-фармацевт. журн. – 2010.
– Т. 44, № 9. – С. 30-33.
58.
Гацура, В.В. Методы первичного фармакогностического исследования
биологически активных веществ / В.В. Гацура. – М. : Медицина, 1974. – 143 с.
59.
Гейссман, Т. Цветные реакции на флавоноидные соединения / Т.
Гейссман // Химические методы анализа растений : сб. ст. – М., 1960. – С. 469.
59.
Гиниатулин, Р.А. Механизм действия холина на тионевральную
передачу : автореф. дис. ... д-ра мед. наук / Р.А. Гиниатулин. – М., 1981. – 37 с.
60.
Гончаров,
А.Г.
Исследования
растительного
полисахаридного
комплекса / А.Г. Гончаров, Т.И. Исакова, Л.Д. Халеева // Актуальные вопросы
поиска и технологии лекарств : тез. докл. Респ.. науч. конф. – Харьков, 1981. – С.
139.
61.
Горбунова, Т.А. Стандартизация сухого сока каланхое / Т.А.
Горбунова, Т.Д. Даргаева // Ресурсоведческое и фитохимическое изучение лекарственной флоры СССР. – 1991. – Т. 29. – С. 190-195.
62.
Горин,
А.Г.
Получение
и
фитохимическое
исследование
полисахаридов из лекарственных растений / А.Г. Горин // 3 Всерос. съезд
фармацевтов РСФСР : тез. докл. – Свердловск, 1975. – С. 313-314.
63.
Государственная фармакопея СССР. Вып. 1: Общие методы анализа /
МЗ СССР. – 11-е изд., доп. – М. : Медицина, 1987. – 336 с.
64.
Государственная фармакопея СССР. Вып.2: Общие методы анализа.
Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. – 11-е изд., доп. – М. : Медицина,
1989. – 400 с.
65.
Гребнева, Н.Ю. Некоторые фармакологические свойства водных
извлечений растительного сбора "Полестелл" для лечения легочных заболеваний
/ Н.Ю. Гребнева, Е.Е. Лесиовская, Н.П. Харитонова // Раст. ресурсы. – 1999. – Т.
35, вып. 3. – С. 25-34.
66.
Девясил высокий - Inula helenium L. [Электронный ресурс]. – Режим
105
доступа: http://demarj.narod.ru/BAZA/Consp2/SETUP/57.htm, свободный.
67.
Девясил иволистный — Inula salicina L. // Пчелы, цветы и здоровье
[Электронный ресурс] : сайт. – Режим доступа: http://www.lesis.ru/herbbook/vidy/tinula-salicina.htm, свободный.
68.
растений
Девясил иволистный - Inula salicina subsp. Salicina // Энциклопедия
Сибири
[Электронный
ресурс].
–
Режим
доступа:
http://
skazka.nsk.ru/atlas/id.3753, свободный.
69.
Деканосидзе, Г.Е. Биологическая роль, распространение и химическое
строение тритерпеновых гликозидов / Г.Е. Деканосидзе, В.Я. Чирва, Т.В.
Сергиенко. – Тбилиси, 1984. – 348 с.
70.
Дерябина, Ф.И. Предварительное фитохимическое исследование
некоторых растений семейства сложноцветных / Ф.И. Дерябина, З.Ф. Сюзеева //
Науч. тр. Перм. фармацевт. ин-та. – Пермь, 1967. – Вып. 2. – С. 207-213.
71.
Джисман, Т. Биогенез фенолов растительного происхождения / Т.
Джисман // Биогенез природ. соединений. – М. : Мир, 1965. – С. 482-527.
72.
Дроздова, И.Л. Анализ полисахаридного состава травы короставника
полевого флоры Центрального Черноземья / И.Л. Дроздова, Н.Н. Денисова //
Науч. ведомости БелГУ. Сер. «Медицина. Фармация». – 2011. – № 4 (99), вып.
13/2. – С. 161-164.
73.
Дроздова, И.Л. Выделение и химическое изучение полисахаридов
травы донника рослого (Melilotus altissimus Thuill.) // Вестник ВГУ. Сер. «Химия.
Биология. Фармация». – 2004. – № 1. – С. 173-175.
74.
Евдокимова, О.В. Валидация методики количественного определения
суммы флавоноидов в столбиках с рыльцами кукурузы / О.В. Евдокимова //
Фармация. – 2008. – № 7. – С. 14-17.
75.
Егоров, В.А. Характеристика номенклатуры антимикробных и
противовоспалительных средств для лечения заболеваний органов дыхания на
Российском фармацевтическом рынке / В.А. Егоров, Л.В. Мошкова, В.А. Куркин
// Фармация. – 2003. – № 1. – С. 16-20.
106
76.
Запрометов, М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования /
М.Н. Запрометов // Биохим. методы в физиологии растений. – М. : Наука, 1971. –
С. 185-207.
77.
Зяблицева, Н.С. Изучение полисахаридов клубней топинамбура и
создание на их основе лечебно-профилактических средств :
дис. ... канд.
фармацевт. наук : 15.00.02 / Н.С. Зяблицева. – Пятигорск, 1998. – 158 с.
78.
Иванова,
С.Д.
Сравнительная
антигипоксическая,
противовосполительная и иммуномоделирующая активность ряда лекарственных
растений / Д.А. Иванова, С.Д. Марченко, Е.Е. Лесиовская, Д.М. Андреева //
Растительные ресурсы.- 2013. Т.49, вып.2. – С.261-269.
79.
Изучение
азотсодержащих
соединений
медуницы
неясной
и
подмаренника настоящего / В.Н. Бубенчикова, В.С. Казакова, И.Л. Осетрова,
Ю.А. Старчак // Интегративная медицина 2008 : материалы Междунар. форума
(Москва, 6-8 июня 2008 г.) : в 3 ч. Ч. 3. Лекарственные растительные средства.
Фитотерапия. – М., 2008. – С. 93-98.
80.
Изучение пектинов диких яблок / М.Х Маликова, Д.А. Рахимов, Э.Л.
Кристаллович [и др.] // Химия природных соединений. – 1993. – № 3. – С. 355357.
81.
Изучение химического состава и фармакологической активности
полисахаридов листьев липы сердцевидной / Н.А. Криштанова, Е.Д. Павлова, В.Ц.
Болотова [и др.] // Актуальные проблемы создания новых лекарственных
препаратов растительного происхождения : материалы VII Междунар. съезда
«Фитофарм 2003» (Санкт-Петербург-Пушкин, 3-5 июля 2003 г.) – СПб., 2003. – С.
59-61.
82.
Изучение элементного состава плодов и листьев сливы колючей
(Prunus spinosa L.) / И.А. Сафонова, В.Я. Яцук, А.А. Фатьянов, А.А. Сафонов //
Науч. ведомости БелГУ. Сер. «Медицина. Фармация». – 2012. – № 10 (129), вып.
18/3. – С. 46-48.
83.
Изучение элементного состава сырья отдельных лекарственных
107
растений, произрастающих в естественных условиях Ярославской области и
выращиваемых в питомнике / Т.А. Горохова, М.С. Коротаева, Н.Г. Марков [и др.]
// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб.
науч. тр. / Пятигорск. фармацевт. акад. – Пятигорск, 2007. – Вып. 62. – С. 38-39.
84.
Иллюстрированный определитель растений Средней России. Т. 3.
Покрытосеменные (двудольные: раздельнолепестные) / И.А. Губанов, К.В.
Киселева, В.С. Новиков, В.Н. Тихомиров. – М., 2004. – 520 с.
85.
Исследование взаимодействия пектиновых веществ с солями меди,
ртути, цинка и кадмия / Г.Н. Коцева, Е.П. Кухта, Э.П. Панова, В.Я. Чирва //
Химия природных соединений. – 1988. – № 2. – С. 171-179.
86.
Исследование органических кислот в некоторых представителях рода
боярышник / Н.Ф. Гончаров, М.А. Карнафель, А.В. Пшеничных, О.Г. Мельникова
// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб.
науч. тр. / Пятигорск. фармацевт. акад. – Пятигорск, 2007. – С. 36-39.
87.
Исследования антимикробной активности посконника конопляного
травы / А.И. Прозоровская, М.Р. Хочава, С.А. Бабичев [и др.] // Разработка,
исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб. науч. тр. /
Пятигорск. фармацевт. акад. – Пятигорск, 2005. – Вып. 60. – С. 418-421.
88.
К
изучению
свертывающих
и
противосвертывающих
свойств
некоторых растений флоры Сибири / Е.С. Шишкина, Ю.П. Никитин, К.А.
Соболевская [и др.] // Исследование лекарственных препаратов природного и
синтетического происхождения : материалы межвуз. науч. конф. – Томск, 1975. –
С. 90-92.
89.
К методике определения среднесмертельных доз и концентраций
химических веществ / Б.М. Штабский, М.И. Гжегоцкий, М.Р. Гжегоцкий [и др.] //
Гигиена и санитария. – 1980. – № 10. – С. 49-61.
90.
Кайшева, Н.Ш. Исследование природных полиуронидов и получение
лекарственных средств на их основе : автореф. дис. … д-ра фармацевт. наук :
15.00.02 / Н.Ш. Кайшева. – Пятигорск, 2004. – 46 с.
108
91.
Кашин, В.К. Микроэлементный состав некоторых лекарственных
растений Забайкалья / В.К. Кашин // Раст.ресурсы. – 2010. – Т.46, вып.3. – С.7385.
92.
Кемертелидзе, Э.П. Физико-химические методы анализа некоторых
биологически
активных
веществ
растительного
происхождения
/
Э.П.
Кемертелидзе, В.П. Георгиевский. – Тбилиси, 1976. – 224 с.
93.
Клышев, Л.К. Флавоноиды растений / Л.К. Клышев, В.А. Бандюкова,
Л.С. Алюкина. – Алма-Ата : Наука, 1978. – 220 с.
94.
Ковалев, В.Г. Нейроактивные аминокислоты и регуляция кро-
вообращения / В.Г. Ковалев // Тр. ин-та / Волгоград. мед. ин-та. – Волгоград, 1977.
– Т. 30, вып. 3. – С. 13-16.
95.
Количественное
определение
тритерпеновых
сапонинов
в
пя-
тикомпонентной растительной композиции / Т.Г. Заркуа, Д.М. Попов, А.Д.
Бакуридзе, Р.В. Махарадзе // Современные аспекты изучения лекарственных
растений : науч. тр. – М., 1995. – Т. 34. – С. 177.
96.
Комиссаренко, С.Н. Пектины - их свойства и применение / С.Н.
Комиссаренко, В.Н. Спиридонов // Раст. ресурсы. – 1998. – Т. 34, вып. 1. – С. 111119.
97.
Кондратова, Ю.А. Тритерпеновые соединения вероники австрийской /
Ю.А. Кондратова, О.С. Самофалова, Е.Артюшенко // Молодежная наука и
современность : материалы 74-й межвуз. итог. науч. конф. студентов и молодых
ученых, посвящ. Году молодежи в России (Курск, 21-22 апр. 2009 г.) : в 3 ч. –
Курск, 2009. – Ч. 2. – С. 182-183.
98.
Коновалова, Д.А. Биологически активные вещества рода Inula L. /
Д.А. Коновалова, Ш.И. Хубиев // Раст. Ресурсы. – 1997. – Т. 33, вып. 3. – С. 87108.
99.
Копытько, Я.Ф. Использование метода хроматографии в тонком слое
сорбента для качественного определения аскорбиновой и фенолкарбоновых
кислот в настойках гомеопатических матричных мяты перечной, мелиссы
109
лекарственной, душицы обыкновенной и шалфея лекарственного / Я.Ф.
Копытько, З.П. Костенникова // Фармацевтическая наука и практика в новых
социально-экономических условиях : сб. науч. тр. НИИФ. – М., 1997. – Т. 36, ч. 2.
– С. 151-153.
100. Копытько, Я.Ф. Исследование аминокислотного состава настоек
гомеопатических матричных мяты перечной, мелиссы лекарственной, душицы
обыкновенной и шалфея лекарственного / Я.Ф. Копытько, З.П. Костенникова,
Е.А. Тимохина // Фармация. – 1997. – № 6. – С. 31-34.
101. Корепанова, Н.С. Исследования по стандартизации и содержанию
флавоноидов в траве пастушьей сумки / Н.С. Корепанова, Г.И. Олешко //
Современные проблемы фармацевтической науки и практики : сб. науч. тр. /
НИИФ. – М., 1999. – Т. 38, ч. 2. – С. 229-233.
102. Корж, А.П. Водорастворимые полисахариды подземной части Inula
helenium (Asteraceae) / А.П. Корж, А.М. Гуриянов, М.В. Белоусов [и др.] //
Раст.ресурсы. – 2011. – Т.47, вып.3. – С.88-92.
103. Королев, В.А. Фармакогностическое изучение представителей рода
Донник : автореф. дис. ... канд. фармацет. наук : 15.00.02 / В.А. Королев. – Пермь,
1996. – 26 с.
104. Коротаев, М.С. Содержание флавоноидов и гидроксикоричных кислот
в надземной части Ledum palustre (Ericaceae) / М.С. Коротаева, М.В. Белоусов,
Н.С. Фурса // Раст. ресурсы. – 2008. – Т. 44, вып. 1. – С. 66-75.
105. Косман, В.М. Информационное обеспечение для идентификации
фенольных соединений в обращеннофазовой ВЭЖХ. Флавоны, флавонолы и их
гликозиды / В.М. Косман, И.Г. Зинкевич // Раст. ресурсы. – 1997. – Т. 33, вып. 2. –
С. 14-16.
106. Косман, В.М. Информационное обеспечение для идентификации
фенольных
соединений
растительного
происхождения.
Кумарины
и
фурокумарины / В.М. Косман, И. Г. Зинкевич, Н.Ф. Комисаренко // Раст. ресурсы.
– 1997. – Т. 33, вып. 3. – С. 32-36.
110
107. Кочетков, Н.К. Химия биологически активных природных соединений
/ Н.И. Кочетков. – М. : Химия, 1970. – 378 с.
108. Кочеткова, А.А. Классификация и применение пектинов / А.А.
Кочеткова, А.Ю. Колесов // Пищевая промышленность. – 1995. – № 9. – С. 28-29.
109. Краснов, Е.А. Антимикробная активность экстрактов из надземной
части Centaurea scabiosa (Asteraceae) / Е.А. Краснов,
И.П. Каминский,
Т.В.
Кадырова [и др.] // Раст.ресурсы. – 2012. – Т.48, вып.2. – С.262-266.
110. Круглая, А.А. Полисахаридный состав растений рода зопник / А.А.
Круглая, Д.А. Муравьева, И.А. Борисенко // Фармация. – 2007. – № 6. – С. 10-11.
111. Круглов, Д.С. Изменчивость микроэлементного состава медуницы
мягчайшей / Д.С. Круглов, М.А. Ханина // Актуальные проблемы создания новых
лекарственных препаратов природного происхождения : материалы Х Междунар.
съезда «Фитофарм 2006». – СПб., 2006. – С. 190-193.
112. Кувачева, Н.В. Содержание и состав флавоноидов и фенолкарбоновых
кислот ALFREDIA CERNUA (Asteraceae) / Н.В. Кувачева, И.В. Шилова, А.И. Пяк,
В.П. Амельченко // Раст.ресурсы. – 2011. – Т.47, вып.4. – С.105-113.
113. Кудрицкая, О.Е. Каротиноиды плодов и ягод / О.Е. Кудрицкая. – Киев
: Вища шк., 1990. – 212 с.
114. Кузьмин, Э.В. Макро- и микроэлементный состав некоторых видов
Aconitum (Ranunculaceae) юго-восточного Казахстана / Э.В. Кузьмин, О.В.
Чанкина, В.П. Гранкина // Раст. ресурсы. – 2006. – Т. 42, вып. 2. – С. 78-81.
115. Ларькина, М.С. Изучение динамики накопления фенолкарбоновых
кислот в надземной части василька шероховатого / М.С. Ларькина, Т.В. Кадырова,
Е.В. Ермилова // Химия растительного сырья. – 2008. – № 3. – С. 71-74.
116. Латыпова, Г.М. Разработка показателей качества листьев хмеля
обыкновенного / Г.М. Латыпова, К.А. Пупыкина, С.В. Закиева // Вестн. ОГУ. –
2009. – № 6. – С. 198-200.
117. Лигай, Л.В. Изучение углеводов Malva neglecta / Л.В. Лигай, Д.А.
Рахимов, В.А. Бандюкова // Химия природных соединений. – 1989. – № 2. – С.
111
280-281.
118. Литвиненко, В.И. Химия природных флавоноидов и создание
препаратов при комплексной переработке растительного сырья : автореф. дис. ...
д-ра хим. наук : 02.00.10 ; 15.00.02 / В.И. Литвиненко. – Харьков, 1990. – 80 с.
119. Литвиненко, В.И. Хроматографическое определение количественного
и качественного состава флавоноидов бессмертника и препарата фламин / В.И.
Литвиненко, В.П. Георгиевский // Современные проблемы фармацевт. науки и
практики : тез. докл. II съезда фармацевтов УССР. – Киев, 1972. – С. 646-648.
120. Логутев, С.В. Фармакогностическое изучение Lapsana communis
L.:автореф.дис. … канд.фарм.наук:14.04.02 /Логутев Сергей Викторович.Курск,2013.-15 с.
121. Лукманова,
К.А.
Аминокислотный
и
минеральный
состав
фитопрепарата люцерон / К.А. Лукманова, В.А. Рябчук, Н.Х. Салихова //
Фармация. – 2000. – № 1. – С. 25-27.
122. Маевский, П.Ф. Флора средней полосы Европейской части России /
П.Ф. Маевский. – 10-е изд., испр. и доп. – М., 2006. – 600 с.
123. Мартынов, А.М. Полифенольные соединения и аминокислоты
надземной части Viola uniflora (Violaceae) / А.М. Мартынов, А.М. Собенин //
Растит. ресурсы. – 2011. – Т. 47, вып. 2. – С. 118-122.
124. Махлаюк, В.П. Девясил иволистный / В.П. Махлаюк // Кустарь
[Электронный ресурс]: http://www.sdelaysam.info/medherbs/inula.shtml – Режим
доступа: свободный
125. Махлаюк, В.П. Лекарственные растения в народной медицине / В.П.
Махлаюк// Саратов : Приволж. кн. изд-во, 1993. – 542 с.
126. Машковский, М.Д. Лекарственные средства : пособие для врачей /
М.Д. Машковский. – 16-е изд., перераб., испр. и доп. – М. : Новая Волна, 2011. –
1216 с.
127. Медведев, Ю.В. Изучение состава гидроксикоричных кислот в
лекарственном растительном сырье методом ВЭЖХ-МС // Человек и лекарство :
112
материалы XVII Рос. нац. конгр. – М., 2010. – С. 677.
128. Медведев, Ю.В. Разработка методики определения качественного и
количественного
состава
гидроксикоричных
кислот
в
лекарственном
растительном сырье / Ю.В. Медведев, О.И. Передеряев, В.И. Прокофьев // Пути и
формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых
физиологически активных веществ : материалы 4-й Всерос. с междунар. участием
науч.-метод. конф. «Фармобразование 2010». Часть 2: Научные основы создания
новых лекарственных средств. – Воронеж , 2010. – С. 251-253.
129. Методические
(доклиническому)
рекомендации
изучению
нестероидных
по
экспериментальному
противовоспалительных
фармакологических веществ / Ф.П. Тринус, Б.М. Клебанов, С.М. Дроговоз [и др.].
– М., 1983. – 20 с.
130. Морфолого-анатомическая диагностика и некоторые результаты
исследования химического состава медуницы мягчайшей (Pulmonaria mollissima) /
Д.С. Круглов, М.А. Ханина, О.В. Чанкина, Т.И. Савченко // Разработка,
исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : науч. тр. /
Пятигорск. гос. фармацевт. акад. – Пятигорск, 2005. – Вып. 60. – С. 29-32.
131. Муравьева, Д.А. Азотистые основания омелы белой и формианы
простой / Д.А. Муравьева, О.И. Попова, К.О. Гаспарян // Фармация. – 1991. – № 1.
– С. 16-17.
132. Наличие γ-лактонов у семейства Asteraceae флоры Средней Азии / У.
Рахманкулов, Ш.З. Касымов, К. Тойжанов [и др.] // Раст. ресурсы. – 1979. – Т. 15,
вып. 1. – С. 79-89.
133. Ойвин, И.А. О роли фибрина в механизме сосудистой проницаемости
/ И.А. Ойвин, В.И. Ойвин, В.П. Балуда // Бюл. эксперим. биологии и медицины. –
1962. – Т. 54, № 10. - С. 45-47.
134. Парфенов, А.А. Аминокислоты травы пустырника пятилопастного /
А.А. Парфенов, Н.С. Фурса // Фармация. – 2007. – № 7. – С. 6-7.
135. Пектин. Производство и применение / Н.С. Карпович, Л.В. Донченко,
113
В.В. Нелина [и др.]. – Киев : Урожай, 1989. – 125 с.
136. Печенин, О.Д Исследование антибактериальной активности растений
рода девясил / О.Д. Печенин, В.Н. Бубенчикова, А.В. Азарова // Разработка,
исследование маркетинг новой фармацевтической продукции : науч.тр. /
Пятигорск. гос. фармацевт. акад. – 2011. – Вып. 66. – С.563-564.
137. Пилат, Т.Л. Биологически активные добавки к пище (теория,
производство, применение) / Т.Л. Пилат, А.А. Иванов. – М. : Авваллон, 2002. –
710 с.
138. Плеханова, Н.В. Девясилы Киргизии, их состав и лекарственные
свойства / Н.В. Плеханова, С.А. Луговская. – Фрунзе, 1981. – 43 с.
139. Повыдыш,
М.Н.
Анальгезирующая
и
противовоспалительная
активность извлечений из надземной части Galeobdolon Luteum (Lamiaceae) / М.Н.
Повыдыш, А.А. Кашина, Л.С. Теслов // Раст. ресурсы. – 2006. – Т. 42, вып. 4. – С.
56-61.
140. Погорелый, В.Е. Препараты аминокислот как нейропротекторы / В.Е.
Погорелый, Н.Е. Слюнькова, Л.М. Макарова // Актуальные проблемы создания
новых лекарственных препаратов природного происхождения : материалы VII
Междунар. съезда «Фитофарм 2003» (г. Санкт-Петербург – Пушкин, 3-5 июля
2003 г.). – СПб., 2003. – С. 244-250.
141. Пономарев, В.Д. Экстрагирование лекарственного растительного
сырья / В.Д. Пономарев. – М. : Медицина, 1976. – 204 с.
142. Почему растения лечат / М.Я. Ловкова, А.М. Рабинович, С.М.
Пономарева [и др.]. – М. : Наука, 1989. - 256 с.
143. Прокопенко, А.Г. Влияние холина на синтез антител печенью / А.Г.
Прокопенко // Тр. ин-та / Курский мед. ин-т. - 1983. - Вып. 28. - С. 167-190.
144. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический
состав, использование. Семейство Asteraceae / отв. ред. П.Д. Соколов. – Спб. :
Наука, 1993. – 351 с.
145. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению
114
новых фармакологических веществ. – 2-е изд., перераб. и доп. – М. : Медицина,
2005. – 832 с.
146. Свободные фенолкарбоновые кислоты видов семейства Ericaceae
флоры Сибири и Дальнего Востока России / М.В. Белоусов, В.П. Грахов, Т.П.
Березовская [и др.] // Раст. ресурсы. – 1999. – Вып. 3. – С. 74-81.
147. Сернов, Л.Н., Элементы экспериментальной фармакологии / Л.Н.
Сернов, В.В. Гацура. – М., 2000. – 352 с.
148. Скальный, А.В. Химические элементы в физиологии и экологии
человека / А.В. Скальный. – М. : ОНИКС 21 век, 2004. – 216 с.
149. Смирнова, Л.П. Количественное определение суммы флавоноидов в
цветках бессмертника песчаного / Л.П. Смирнова, Л.Н. Первых // Хим.фармацевт. журн. – 1998. – № 6. – С. 35-38.
150. Смирнова, Н.И. Галактоманнаны некоторых видов семейства Fabaceae
/ Н.И. Смирнова, И.Е. Лобанова, О.В. Анулов // Раст. ресурсы. – 1998. – Т. 34,
вып. 4. – С.68-71.
151. Сравнительное
исследование
антибактериальных
свойств
полифенолов из сухих экстрактов растений семейства Geraniaceae и семейства
Rosaceae / В.С. Никитина, Л.Ю. Кузьмина, Г.В. Шендель [и др.] // Актуальные
проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения
: материалы VIII Междунар. съезда «Фитофарм 2004» (Миккели, Финляндия, 2123 июля 2004 г.). – СПб., 2004. – С. 492-495.
152. Сравнительное исследование содержания флавоноидов в препаратах
седативного сбора № 3 / М.Н. Быстрова, Г.А. Панина, М.А. Демидова, Е.В.
Харитонова // Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации : сб. науч.
тр. междунар. конгр. – М., 2011. – С. 174-177.
153. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (моносахариды). Часть
1 : учеб. пособие / Б.Н. Степаненко. – М. : Высш. шк., 1977. – 222 с.
154. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды). Часть
2 : учеб. пособие / Б.Н. Степаненко – М. : Высш. шк., 1978. – 256 с.
115
155. Тулайкин, А.И. Углеводы из надземной части Ononis arvensis
(Fabaceae): выделение и анализ / А.И. Тулайкин, В.С. Березина, М.Ю. Гончаров //
Раст. ресурсы. – 2004. – Т. 40, вып. 4. – С. 73-79.
156. Туроходжаев, М.Т. Растительные пектиновые вещества. Способ
выделения пектиновых веществ / М.Т. Туроходжаев, М.А. Ходжаев // Химия
природных соединений. – 1993. – № 5. – С. 635-643.
157. Удельнова, Т.Н. Микроэлементы, экология и здоровье человека / Т.Н.
Удельнова, С.Г. Торгин, В.А. Ягодин // Успехи современной биологии. – 1990. –
Вып. 2. – С. 279.
158. Уткин, Л.Л. Народные лекарственные растения Сибири / Л.Л. Уткин //
Тр. науч.-исслед.. хим. – фармацевт. ин-та. – 1931. – Вып. 24. – С. 1-133.
159. Фармакологическая регуляция воспаления / Ф.П. Тринус, В.К.
Клебанов, И.М. Ганжа, Р.Д. Сейфулла. – Киев : Здоров’я, 1987. – 144 с.
160. Федосеева, Л.М. Антимикробная активность сухого экстракта из
листьев Bergenia crassifolia (L.) Fritsch. в отношении возбудителей некоторых
гнойно-воспалительных заболеваний / Л.М. Федосеева, С.И. Керашева, Е.Б.
Карабасова // Раст. ресурсы. – 2000. – Т. 36, вып. 1. – С. 53-57.
161. Фенолкарбоновые кислоты отдельных представителей рода Полынь /
Т.Л. Киселева, Ж.А. Союнова, Ю.В. Медведев, А.В. Чаузова // Фармация. – 2012.
– № 2. – С. 16-18.
162. Физико-химические свойства пектинов / Е.Н. Губенкова, В.К. Сомов,
В.А. Шеенсон, А.И. Сомова // Пищевая промышленность. – 1988. – №5. – С. 1316.
163. Филиппов, М.П. Колориметрическое определение уронидной части в
пектиновых веществах / М.П. Филиппов // Изв. АН МССР. Сер. «Биолог. и хим.
науки». – 1973. – № 3. – С. 76-79.
164. Флора СССР / под ред. Е.Г. Боброва, Н.Н. Цвелева. – М.-Л., 1969. – Т.
29. – 798 с.
165. Халматова,
Х.Х.
Растения
флоры
Узбекистана,
обладающие
116
диуретическим действием / Х.Х. Халматова // Раст. Ресурсы. – 1973. – Т. 9, вып. 2.
– С. 161-167.
166. Харборн, Д. Биохимия фенольных соединений : пер. с англ. / Д.
Харборн. – М. : Мир, 1969. – 572 с.
167. Химический анализ лекарственных растений / Е.Я. Ладыгина, Л.Н.
Свфронич, В.Э. Отряшенкова [и др.] ; под ред. Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронич. –
М. : Высш. шк., 1984. – 176 с.
168. Химия и биохимия бобовых растений / пер. с англ. К.С. Спектрова ;
под ред. Н.М. Запрометова. – М. : Агропромиздат, 1986. – 336 с.
169. Хроматография на бумаге / под ред. И.М. Хайца, К. Мацека. – М. :
Изд-во иностр. лит-ры, 1962. – 851 с.
170. Хроматография. Практическое приложение метода : в 2 ч. / ред. Э.
Хейфтман – М. : Мир, 1986.
171. Чушенко, В.Н. Исследование в области полисахаридных препаратов :
автореф. дис. … канд. фармацевт. наук : 15.00.02 / В.Н. Чушенко. – Харьков, 1980.
– 24 с.
172. Шестакова, Т.С. Элементный состав травы и экстракционных
препаратов очанки / Т.С. Шестакова, В.М. Петриченко, Т.В. Сухинина // Хим.фармацевт. журн. – 2008. – Т. 42, № 8. – С. 20-22.
173. Шилова, И.В., Элементный состав надземной части растений рода
ALFREDIA (ASTERACEAE) / И.В.Шилова, Н.В.Барановская, Н.И.Суслов //
Растительные ресурсы. – 2012. – Т.48, вып.3. – С.414-419.
174. Шретер, А.И. Лекарственная флора советского Дальнего Востока /
А.И. Шретер. – М. : Медицина,1975. – 328 с.
175. Щепин, О.П. Современное состояние и тенденции заболеваемости
населения Российской Федерации / О.П. Щепин, Е.А. Тишук // Здравоохранение
РФ. – 2001. – № 6. – С. 3-7.
176. Щербакова,
О.В.
Спектрофотометрический
метод
определения
суммарного содержания флавоноидов в надземной части LINARIA VULGARIS /
117
О.В. Щербакова, В.М. Петреченко, Л.А. Чекрышкина // Раст.ресуры. – 2011. –
Т.47, вып.4. – С.141-147.
177. A review of phytochemistry and pharmacology of flavonoids / H.K.
Sandhar, B. Kumar, S. Prasher [et al.] // Int. Pharm. Sci. – 2011. – Vol. 1, Is. 1. – P. 2541
178. Acidic polysaccharides from Psidium cattleianum / L.C. Vriesmann, C.L.
de O. Petkowicz, P.I.B. Carneiro [et al.] // Int. J. Biol. Technol. – 2009. – Vol. 52, N. 2.
– P. 259-264
179. Anthonsen, T. New thimol derivatives from Inula salicina L. / T.
Anthonsen // Acta Chem. Scand. – 1971. – Vol. 25, N 2. – P. 390-392.
180. Bauer, S. Mass spectrometry for characterizing plant cell wall
polysaccharides / S. Bauer // Front. Plant. Sci. – 2012. – P. 45-56.
181. Benson, J.R. Some recend advances in amino acid analisis / J.R. Benson //
Instrumentation in amino acid seguence analisis / ed. R.N. Perham. – London, N. Y.,
San-Francisco : Academic Press, 1975. – P. 1-40.
182. Bravo, L. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and
nutritional significance / L. Bravo // Nutr. Rev. – 1998. – Vol. 56. – P. 317-333.riant,
E.Т. A note of the differentiation between flavonoid glicosides and their aglicones / E.Т.
Briant // J. Amer. Pharm. Assoc. – 1950. – Vol. 39, N 8. – Р. 480-488.
183. Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary
colorimetric methods / C. Chang, M. Yang, H. Wen, J. Chern // J. Food. Drug. Anal. –
2002. – N 10. – P. 178-182.
184. Farah, A. Phenolic compounds in coffee / A. Farah, C. M. Donangelo //
Braz. J. Plant Physiol. – 2006. – Vol. 18. – P. 2900-2911.
185. Flavonoids as anti-inflammatory agents: implications in cancer and
cardiovascular disease / A. Garcia-Lafuente, E. Guillamon, A. Villares [et al.] //
Inflamm. Res. – 2009. – Vol. 58. – P. 537-552.
186. Flavonoids. Chemistry, biochemistry and application / ed. M. Andersen, K.
R. Markham. – Boca Raton, London, N.Y. : CRC Press Taylor & Francis Group, 2006.
118
– 1198 p.
187. Garrett, E.R. Sensitive direct spectrophotometric determination of fructose
and sucrose after acid degradation / E.R. Garrett, J. Blanch // J. Analyt Chem. – 1967. –
Vol. 39, N 10. – P. 1109-1113.
188. Geissman, Т.А. The chemistry of flavonoid compounds / Т.А. Geissman.Oxford, N.Y. : Pergamon Press, 1962. – 666 p.
189. http:// sibvican.ucoz.ru/load/1-1-0-137
190. http://ru.wikipedia.org/wiki/
191. Kovaleva, A.M. GC/MS STADY OF ESSENTIAL OIL COMPONENTS
FROM FLOWERS OF Grataegus jackii, C.robesoniana, AND C.flabellata / A.M.
Kovaleva,
N.F. Goncharov, A.N. Komissarenko [et al.] // Chemistry of Natural
Compounds. – 2009. – Vol.45, N 4. – P.582-584.
192. Mabry, T.J. The systematic identification of flavonoids / T.J. Mabry, M. R.
Markham, M.B. Thomas – Berlin: Springer 2012 N.Y (Springer-Verlag 1970). – 354 p.
193. Peter, A. Detection of phenoloids in some hungrian inula and centaurea
species / A. Peter, G. Dosa // Acta Bot. Hung.. – 2002. – Vol. 44. – P. 129-135.
194. Seaman, F.C. Sequiterpene lactones as taxonomic characters in the
Asteracaea / F.C. Seaman // Bot. Rew. – 1982. – Vol. 48. – P. 121-595.
195. Shi, L. Isolation, purification, and immunomodulatory activity in vitro of
three polysaccharides from roots of Cudrania tricuspidata / L. Shi, Y. Fu // Acta
Biochim. Biophys. Sin. – 2011. – Vol. 43, Is. 5. – P. 418-424.
196. The flavonoids / ed. J.B. Harborne, T.J. Mabry, H. Mabry. – N.Y. :
Charman and Hall, 1975. – 1200 p.
197. Validation assay for total flavonoids, as rutin equivalents, from trichilia
catigua adr. juss (meliaceae) and ptychopetalum olacoides bentham (olacaceae)
commercial extract / A. Rolim, C.P.M. Maciel, T.M. Kaneko [et al.] // J. AOAC
International. – 2005. – Vol. 88, N 4. – P. 1015-1019.
198. Wood, R.J. Mineral requirements of elderly people / R.J. Wood, P.M.
Suter, R.M. Russell // Am. J. Clin. Nutr. – 1995. – Vol. 62. – P. 493-505.