процесс катионообменной хроматографии колонки для вэжх

ПРОЦЕСС КАТИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
КОЛОНКИ ДЛЯ ВЭЖХ AGILENT BIO IEX
КОЛОНКИ ДЛЯ ВЭЖХ AGILENT BIO MAB
В данном документе специалисты компании Agilent по прикладной химии делятся
рекомендациями по выбору оптимальной системы ЖХ и ее настройке для выполнения
характеризации биомолекул. Также они описывают общий метод подготовки к началу
работы и дальнейшую оптимизацию для конкретных целей разделения.
Дополнительные сведения см. на сайте www.agilent.com/chem/advancebio
Система ЖХ Bio-Inert
Agilent 1260 Infinity Bio-Inert
Рекомендации
• Основные белки: SCX или WCX
• При выборе pH подвижной фазы учитывайте
изоэлектрическую точку (pl) исследуемого
белка. Если pH<pI, исследуемый белок будет
иметь суммарный положительный заряд.
• pH начального буферного раствора должен
на 0,5–1 единицу pH отличаться от pl
(быть меньше pl для катионного обмена).
• Если pl неизвестна, для катионного обмена
начните с pH 6.
• Начинайте с колонок SCX — они имеют
наиболее широкий рабочий диапазон.
Колонки WCX обладают немного другой
селективностью.
• Буферные растворы для катионного обмена
(pH 4–7) включают формиатный, уксусный,
метилэтилсульфатный, фосфатный,
HEPS (N-2-гидрокси-этилпиперазин-N-2этансульфоновая кислота).
Привитая фаза
SCX (сильный катионный обмен) — SO3H
WCX (слабый катионный обмен) — COOH
Пробы
Колонка
Моноклональное антитело
Bio MAb
Пептиды и белки
Bio SCX и WCX
Глобулярные белки и пептиды
PL-SCX 1000Å
Очень крупные
PL-SCX 4000Å
биомолекулы / высокая скорость
Белки, антитела
Bio-Monolith SO3
Примечание. Для получения каталожного номера колонок для
ВЭЖХ Bio IEX и Bio MAb из нержавеющей стали см. Руководство
по выбору колонок для ВЭЖХ Agilent Bio, 5990-9384EN.
Подвижные фазы
Для сохранения требуемого рабочего pH подвижная
фаза должна содержать буферный раствор, обычно
20 мМ. Обычно используется 400–500 мМ соль для
элюции.
Для создания требуемого профиля градиента путем
смешивания четырех базовых растворов в различных
пропорциях используется ПО Agilent Buffer Advisor.
Ввод пробы
Ввод от 1 до 10 мкл позволяет получить максимальное
разрешение. Проба должна быть растворима в
подвижной фазе.
Скорость потока
Стандартная скорость потока для колонок с внутренним
диаметром 4,6 мм составляет от 0,5 до 1,0 мл/мин.
Температура колонки
Максимальный предел 80 °C. Срок службы колонки
оптимален при температурах от 10 до 50 °C.
Обнаружение
УФ, G1315D со стандартной биоинертной проточной
кюветой 10 мм.
Выбор колонки
Описание
4,6 x 250 мм, 10 мкм
4,6 x 50 мм, 10 мкм
4,6 x 250 мм, 5 мкм
4,6 x 50 мм, 5 мкм
2.1 x 250 мм, 10 мкм
2.1 x 50 мм, 10 мкм
2.1 x 250 мм, 5 мкм
2.1 x 50 мм, 5 мкм
Колонки для ВЭЖХ Bio IEX, ПЭЭК
Bio SCX
Bio WCX
Каталожный номер
Каталожный номер
5190-2435
5190-2455
5190-2436
5190-2456
5190-2427
5190-2447
5190-2428
5190-2448
5190-2439
5190-2459
5190-2440
5190-2460
5190-2431
5190-2451
5190-2432
5190-2452
Колонки для ВЭЖХ Bio MAb,
ПЭЭК
Каталожный номер
5190-2415
5190-2416
5190-2407
5190-2408
5190-2419
5190-2420
5190-2411
5190-2412
Рекомендованные начальные условия
Моноклональные антитела,
Белки и пептиды
Моноклональные антитела
Солевой градиент
Градиент pH
Солевой градиент
Колонки
Bio WCX, 4,6 x 250 мм, 10 мкм
Bio WCX, 4,6 x 250 мм, 5 мкм
Bio MAb, 4,6 x 250 мм, 5 мкм
Bio SCX, 4,6 x 50 мм, 3 мкм
WCX, 4,6 x 50 мм, 3 мкм
Bio MAb, 4,6 x 50 мм, 3 мкм
Подвижная фаза
A: Вода
B: 1,6 M NaCl
C: 40,0 мМ NaH2PO4
D: 40,0 мМ Na2HPO4
A: Вода
B: 1,6 M NaCl
C: 40,0 мМ NaH2PO4
D: 40,0 мМ Na2HPO4
A: 2 0 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 5,0
для WCX или pH 6,0 для SCX
B: Буфер A + 1 мМ NaCl
Градиент
от 0 до 50 % B, от 0 до 20 мин
(постоянный pH, например, pH 6,0)
50 % B, от 20 до 25 мин 0 % B, от 25 до 35 мин
pH от 6,0 до 8,0, от 0 до 20 мин
от 0 до 800 мМ NaCl, от 20 до 25 мин 800 мМ NaCl, от
25 до 30 мин
от 1 до 100 % B через 30 мин для колонок 50 мм,
60 мин для колонок 250 мм
Скорость
потока
1 мл/мин
1 мл/мин
0,5 мл/мин
Буферные растворы 20 мМ в требуемом диапазоне pH
получаются путем сочетания предварительно заданных
пропорций C и D.
Буферные растворы в требуемом диапазоне силы буфера
получаются путем сочетания предварительно заданных
пропорций C и D.
Температура
Комнатная
Комнатная
Комнатная
Введение
10 мкл
10 мкл
10 мкл
Проба
2 мг/мл
(в 20 мМ натрий-фосфатного буферного раствора, pH 6,0)
2 мг/мл
(в 20 мМ натрий-фосфатного буферного раствора, pH 6,0)
Обнаружение
УФ, 220 нм
УФ, 220 нм
Разделение стандартов белков при pH 7,0 с помощью
Agilent Bio WCX, 4,6 × 250 мм, 10 мкм.
Анализ моноклонального антитела IgG с использованием
градиента pH от 6,5 до 7,5 (0–20 мин),
50 мМ, Agilent Bio MAb, 4,6 x 50 мм, 5 мкм
Овальбумин (pI 4,5)
УФ, 220 нм
Разделение стандартов белков на 3 мкм ионообменных
колонках Agilent с помощью катионообменной
хроматографии
Рибонуклеаза (pI 9,4)
Рибонуклеаза (pI 9,4)
Цитохром C (pI 9,8)
Цитохром C (pI 9,8)
Лизоцим (pI 11)
Лизоцим (pI 11)
SCX
WCX
MAb 1
3
3
2
3
1
2
2
1
5
10
15
min
20
25
6
8
10
12
min
14
16
6
8
12
10
14
min
Компания Agilent не несет ответственности за возможные ошибки в
настоящем документе, а также за убытки, связанные или являющиеся
следствием получения настоящего документа, ознакомления с ним и
его использования.
Информация, описанияи спецификации в настоящем документе
могут быть изменены без предупреждения.
компания Agilent Technologies, Inc., 2015
Напечатано в США 1 августа 2015 г.
Номер публикации 5991-6104RU