021867 B1 021867 B1 (11) 021867

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
021867
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2015.09.30
(21)
(51) Int. Cl. A61K 38/20 (2006.01)
C07K 14/55 (2006.01)
Номер заявки
201290395
(22)
Дата подачи заявки
2010.11.26
(54)
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ПОЛИПЕПТИДЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ IL-2, И ИХ
ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА И ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ
Изобретатель:
(74)
Представитель:
021867
B1
(56)
Леон Монсон Калет, Карменате
Портилла Таня, Гарсия Мартинес
Карина, Лахе Давила Агустин
Бьенвенидо, Перес Родригес Саумель,
Гонсалес Роче Диамиле, Маркес
Перера Габриель (CU)
Медведев В.Н. (RU)
LIU DAVID V. ET AL.: "Engineered
Interleukin-2 Antagonists for the Inhibition of Regulatory
T Cells", JOURNAL OF IMMUNOTHERAPY, vol. 32,
no. 9, 1 November 2009 (2009-11-01), pages 887-894,
XP009145853, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS,
HAGERSTOWN, MD, US ISSN: 1524-9557, DOI:
10.1097/CJI.0B013E3181E1604B, the whole document in
particular, abstract, introduction, discussion and Table 1.
ZURAWSKI S. M. AND ZURAWSKI G.: "Receptor
antagonist and selective agonist derivatives of mouse
(57)
Данное изобретение в целом относится к полипептидам, первичная последовательность
которых имеет высокую гомологию последовательностей с человеческим интерлейкином
2 (IL-2) с некоторыми точечными мутациями в последовательности природного IL-2.
Полипептиды согласно изобретению обладают иммуномодулирующим действием на иммунную
систему, которое является избирательным/преимущественным на регуляторных Т-клетках.
Также данное изобретение относится к конкретным полипептидам, последовательность
аминокислот которых раскрыта в данном описании. В еще одном аспекте представленное
изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного
ингредиента раскрытые полипептиды. В заключение, представленное изобретение относится
к терапевтическому применению раскрытых полипептидов и фармацевтических композиций
благодаря их иммуномодулирующему действию на такие заболевания, как рак и хронические
инфекционные заболевания.
B1
(72)
interleukin-2", EMBO JOURNAL, vol. 11, no. 11, 1 January
1992 (1992-01-01), pages 3905-3910, XP002113939,
OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB ISSN:
0261-4189, table 1
US-A1-2004175357
WO-A2-2009061853
SHANAFELT А. В. ЕТ AL.: "A T-cell-selective
interleukin 2 mutein exhibits potent antitumor activity and
is well tolerated in vivo", NATURE BIOTECHNOLOGY,
vol. 18, no. 11, 1 November 2000 (2000-11-01),
pages 1197-1202, XP002307306, NATURE PUBLISHING
GROUP, NEW YORK, NY, US ISSN: 1087-0156, DOI:
10.1038/81199, abstract, page 1198, left-hand column,
paragraph 1, page 1200, right-hand column, last paragraph page 1201, left-hand column, paragraph first
LITZINGER MARY T. ET AL.: "IL-2 immunotoxin
denileukin diftitox reduces regulatory T cells and enhances
vaccine-mediated T-cell immunity", BLOOD, vol. 110,
no. 9, November 2007 (2007-11), pages 3192-3201,
XP002628064, ISSN: 0006-4971, cited in the application,
abstract
WANG XINQUAN ET AL.: "Structure of the
quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta,
and gamma(c) receptors", SCIENCE (WASHINGTON D
C), vol. 310, no. 5751, November 2005 (2005-11), pages
1159-1163, XP002628065, ISSN: 0036-8075, cited in the
application, the whole document
FERNANDO BAZAN J. ET AL.: "UNRAVELING
THE STRUCTURE OF IL-2", SCIENCE (WASHINGTON
D C), vol. 257, no. 5068, 1992, pages 410-415,
XP002628066, ISSN: 0036-8075, figure 2
RAO BALAJI M. ET AL.: "High-affinity CD25binding IL-2 mutants potently stimulate persistent T
cell growth", BIOCHEMISTRY, vol. 44, no. 31, August
2005 (2005-08), pages 10696-10701, XP002628067, ISSN:
0006-2960, table 1
021867
(31) 2009-0203
(32) 2009.11.27
(33) CU
(43) 2012.10.30
(86) PCT/CU2010/000005
(87) WO 2011/063770 2011.06.03
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
СЕНТРО ДЕ ИНМУНОЛОГИА
МОЛЕКУЛАР (СИМ) (CU)
021867
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к области биотехнологии, в частности к иммунологии. Изобретение
относится к техническим решениям с терапевтическими вариантами применения для здоровья человека.
В частности, оно относится к терапевтической модуляции иммунной системы с использованием аналогов
природных молекул.
Предшествующий уровень техники
Интерлейкин-2 (IL-2) был первым фактором роста, описанным для Т-клеток. Со времени его открытия, он продемонстрировал большую способность способствовать пролиферации и жизнеспособности Тклеток in vitro (Smith, KA (1988) Science. 240, 1169-76) и усиливать иммунный ответ Т-клеток in vivo, в
контексте вирусных инфекций (Blattman, JN, et al. (2003) Nat Med 9, 540-7) или вакцин (Fishman, M., et al.
(2008) J Immunother. 31, 72-80, Kudo-Saito C., et al. (2007) Cancer Immunol Immunother. 56, 1897-910; Lin,
CT, et al. (2007) Immunol Lett. 114, 86-93). Однако, данная классическая роль IL-2 в качестве стимулятора
Т-иммунного ответа в последнее время была подвергнута сомнению за счет множества экспериментальных данных (Almeida A.R., et al. (2002) J Immunol. 169, 4859-60; de la Rosa, M. et al. (2004) Eur J Immunol.
34, 2480-8; Malek T.R. et al. (2004) Nat Rev Immunol. 4, 665-74), показывающих, что данный цитокин
представляет собой гомеостатический фактор роста для природных регуляторных Т-клеток Т
CD4+CD25+FoxP3+ (Treg).
Интерлейкин-2 является основным фактором в механизме, с помощью которого регуляторные Тклетки подавляют активность и размножение других эффекторных клеток, таких как CD4 Т-клеткихелперы, CD8 цитотоксические Т-клетки и NK-клетки. Конкретно, в последнее время было предположено, что регуляторные Т-клетки подавляют другие Т-клетки, индуцируя локальное снижение уровня IL-2
(Pandiyan P. et al. (2007) Nat Immunol. 8, 1353-62). Ингибирующее действие основано на: а) их способности непосредственно ингибировать продуцирование IL-2 эффекторными Т-клетками, которое они подавляют: (Almeida A.R. et al. (2002) J Immunol. 169, 485060; Takahashi Т. et al. (1998) Int Immunol. 10, 196980; Thornton A.M. et al. (1998) J Exp Med. 188, 287-96: Wolf M. et al. (2001) Eur J Immunol. 31, 1637-45); b)
способности потреблять быстро и эффективно IL-2 в их микроокружении (Pandiyan, P., et al. (2007) Nat
immunol. 8, 1353-62); и с) их способности сверхэкспрессировать альфа-цепь рецептора IL-2 (Kuniyasu Y.,
et al. (2000) Int Immunol. 12, 1145-55), что позволяет им использовать IL-2 более эффективно, когда его
концентрация является низкой.
Подводя итог, IL-2 является сильно плейотропным цитокином, который имеет большое значение
для биологической активности различных клеточных популяций. Данное свойство делает IL-2 важным
узлом в регуляции иммунного ответа, делая его привлекательной и сложной мишенью для иммуномодуляторных видов лечения. В частности, плейотропная природа действия данного цитокина делает его
очень важным для разработки стратегий лечения, которые модулируют избирательным/предпочтительным образом активность данного цитокина в различных клеточных популяциях.
На протяжении нескольких лет IL-2 используют в противораковой терапии. В частности, его использование в высоких дозах является апробированной терапией в нескольких странах для лечения меланомы и карциномы клеток почечного эпителия. Однако, прямое применение IL-2 у пациентов сильно
ограничено за счет токсического действия. Настолько сильного, что только 20% пациентов, подходящих
для участия в исследовании, получали дополнительную терапию и только 17% пациентов показывают
релевантный объективный ответ. Одно возможное объяснение данного существенного недостатка на
клинической стадии состоит в том, что лечение природным IL-2 также стимулирует популяции регуляторных Т-клеток (Ahmadzadeh M. et al. (2006) Blood. 107, 2409-14), которые препятствуют осуществляемой им иммуностимуляции.
Разработано несколько стратегий для ослабления токсического действия лечения IL-2. Некоторые
из данных стратегий основаны на использовании мутантных вариантов IL-2, сконструированных для
повышения способности передачи сигнала данной молекулы в основном посредством рецептора с высокой аффинностью (альфа-, бета- и гамма-цепи), а не посредством рецептора с промежуточной аффинностью (бета- и гамма-цепи). Основная идея состоит в том, чтобы содействовать предпочтительной передаче сигнала на Т-клетке вместо передачи сигнала в NK-клетках, которые, как полагают, являются клетками, ответственными за наблюдаемое токсическое действие. Данное направление работы отражено в следующих изобретениях: патент США 7186804, патент США 7105653, патент США 6955807, патент США
5229109, патентная заявка США 20050142106. Во всяком случае необходимо заметить, что ни одно из
данных изобретений не связано с мутантами IL-2 со способностью дифференцированно модулировать
активность регуляторных Т-клеток. Более того, мутанты в данных изобретениях являются агонистами IL2, а не антагонистами/ингибиторами, такими как мутанты, описанные в данной заявке.
Другие мутантные варианты IL-2 были созданы с целью повышения их фармакологической активности. Например, улучшения их фолдинга или увеличения времени их присутствия в крови. Среди прочего, к данному направлению работы относятся следующие изобретения: патент США № 4959314, патент США № 5116943, патент США № 4853332. И снова ни один из данных мутантов не продемонстрировал способность дифференцированно модулировать активность регуляторных Т-клеток.
Другие существующие изобретения относятся к ингибиторам активности IL-2, в первую очередь
-1-
021867
для лечения аутоиммунных заболеваний или для предотвращения отторжения при трансплантации органов. Среди данных изобретений патент США 5876717, патент США 5635597, патент США 6906170, патент США 6168785.
В заключение необходимо упомянуть, что в литературе имеется множество предложений терапевтических средств (Kreitman R.J. (2009) Curr Pharm Des. 15, 2652-64; Litzinger M.T., Fernando R., Curiel
T.J., Grosenbach D.W., Scholm, J. And Palena С. (2007) Blood. 110, 3192-201; Morse M.A., Hobeika, A.C.,
Osada Т., Serra D., Niedzwiecki, D., Lyerly, H.K. and Clay T.M. (2008) Blood. 112, 610-8; Onizuka S., Tawara,
I., Shimizu, J., Sakaguchi S., Fujita T. and Nakayama E. (1999) Cancer Ress. 59,312833; Quezada, S.A., Peggs
K.S., Curran, M.A. and Allison J.P. (2006) J Clin Invest. 116, 1935-45), которые предлагают модулирование
или понижение активности регуляторных Т-клеток in vivo. Данные терапевтические средства были протестированы на животных моделях и даже на пациентах для непосредственного лечения рака или для
усиления действия вакцин. Имеются также некоторые сообщения, которые предлагают модулирование
активности IL-2, в частности моноклональными антителами (Boyman О., Kovar, M., Rubinstein, M.P.,
Surh, C.D. and Sprent, J. (2006) Science. 311, 1924-1927; Boyman O. et al. (2006) Expert Opin Biol Ther. 6,
1323-31; Kamimura, D., et al. (2006) J Immunol. 177, 306-14; Murakami M., Sakamoto A., Bender J., Kappler
J. And Marrak P. (2002) Proc Natl Acad Sci USA. 99, 8832-7; Tomala J., Chmelova H., Mrkvan Т., Rihova B.
And Kovar, M. (2009) J Immunol. 183, 4904-4912), с целью содействовать более хорошему и более эффективному иммунному ответу. Однако насколько известно авторам изобретения, в литературе нет сообщений по мутантным вариантам IL-2, которые поддерживают возможность их использования для модулирования, избирательно или преимущественно, активности регуляторных Т-клеток. В частности, по мутеинам IL-2, способным избирательно/преимущественно противодействовать активности IL-2 на регуляторных Т-клетках, таким образом воздействуя на их функцию и, следовательно, содействуя терапевтическому потенцированию иммунного ответа.
Краткое описание изобретения
Представленное изобретение основано на научном открытии, которое доказывает, что мутантные
варианты IL-2 могут оказывать преимущественное ингибирование регуляторных Т-клеток. Авторы изобретения впервые обнаружили в экспериментах in vivo, что мутантные варианты IL-2 могут, по существу, ингибировать активность регуляторных Т-клеток (Т CD4+CD25+FoxP3+), в то же время почти не
воздействуя на активацию и/или пролиферацию других лимфоцитов с эффекторными функциями. Данное открытие обеспечивает основу для новой стратегии иммуномодуляции регуляторных Т-клеток в таких заболеваниях, как рак или хронические инфекции, где данные клетки являются релевантными.
Представленное изобретение относится к полипептидам, которые имеют общую первичную последовательность с IL-2 человека, за исключением фактически того, что некоторые аминокислоты были видоизменены за счет устранения или, по существу, уменьшения их способности передачи сигнала через
различные формы рецептора IL-2.
Данные мутантные варианты IL-2 сохраняют их способность связываться с одним или более компонентами рецептора IL-2 и обладают ингибирующей активностью, преимущественно наблюдаемой на
регуляторных Т-клеточных популяциях, где они отрицательно модулируют свою функцию. Некоторые
специфичные варианты мутантов IL-2 с предпочтительным свойством ингибирования регуляторных Тклеток защищены. Изобретение также содержит терапевтическое применение данных мутантных вариантов, используемых отдельно или в сочетании с вакцинами для лечения таких заболеваний, как рак или
хронические инфекции, когда активность регуляторных Т-клеток (Treg) является значимой.
Представленное изобретение предлагает новую стратегию модулирования активности регуляторных Т-клеток для заболеваний, в которых подавление посредством данных клеток уменьшает защитный
иммунный ответ, вызванный естественным образом или за счет вакцинации. Имеется множество преимуществ данной новой терапевтической стратегии модулирования активности Treg над другими предложениями. Например, мутант IL-2 представляет собой на самом деле собственные белки (за исключением нескольких мутаций). Этот факт снижает риск неожиданной токсичности (который является обычным
в стратегиях, основанных на ингибиторах небольших размеров) или риск возникновения иммунного ответа против инъецируемых лекарственных препаратов (как должно происходить в таких стратегиях, как
Ontak, в которых IL-2 соединяется с инородной и токсичной молекулой, такой как дифтерийный токсин).
Данные мутантные варианты IL-2 должны сохранять связывающую способность рецептора IL-2, по
меньшей мере, на уровне аффинности природного IL-2 (10 пМ для высокоаффинного рецептора). Данная
аффинность трудно достижима со стратегиями ингибирования рецептора или лиганда моноклональными
антителами или другими лекарственными препаратами.
Малый размер данных мутантов (15 кД) может позволить им иметь высокую мобильность и легко
проникать в микроокружение опухоли. То есть то, что, как известно, является сложным для больших
молекул, таких как антитела и другие.
Подробное описание изобретения
Получение аналогов полипептидов IL-2
Представленное изобретение относится к полипептидам от 100 до 500 аминокислот, предпочтительно к полипептидам, размер которых составляет 140 аминокислот и кажущаяся молекулярная масса
-2-
021867
которых составляет по меньшей мере 15 кД. Данные полипептиды сохраняют высокий уровень идентичности последовательности с природным IL-2, более чем 90% идентичности, в области их последовательности, они содержат от 2 до 6 мутаций относительно природного IL-2.
В данных положениях эти полипептиды видоизменены за счет введения аминокислотных остатков,
отличающихся от тех аминокислот, которые находятся в том же положении в природном IL-2. Остатки,
которые заменяют исходные остатки, выбирают по причине того, что они имеют физико-химические
свойства, значительно отличающиеся от свойств исходной аминокислоты, среди прочего остатки изменяли с полярных на неполярные, с заряженных на незаряженные, с больших на малые, с кислоты на основание.
Полипептиды представленного изобретения среди прочего также могут называться неотличимо
иммуномодулирующие полипептиды, аналоги IL-2 или мутеины IL-2. Данные полипептиды сконструированы из 3D структуры IL-2 (помещенной в базу данных белковых структур), с введением мутаций
только в положения IL-2, которые соответствуют аминокислотам, подвергшимся значительному воздействию растворителя, которые идентифицируют, используя программы биоинформатики публичного домена, такого как RASMOL, SwissPDBviewer и другие. Полипептиды данного изобретения могут быть
получены несколькими путями, среди прочего посредством синтеза белков. Их можно получать также с
помощью технологий генной инженерии, например, экспрессируя их во внутриклеточных тельцах в бактериях, таких как E.coli. Точечные мутации в конкретных позициях также могут быть получены посредством технологии направленного мутагенеза за счет использования полимеразной цепной реакции.
Селекция аналогов полипептидов IL-2 посредством их биологической активности
Полипептиды представленного изобретения выбирают посредством проведения экспериментов in
vivo или in vitro, чтобы одновременно иметь следующие свойства:
1) Данные мутантные варианты IL-2 теряют или существенно уменьшают свою способность передачи сигнала различным формам рецептора IL-2. Данное свойство может быть оценено непосредственно
в испытаниях пролиферации in vitro с клеточными линиями, которые являются IL-2-зависимыми, типа
CTLL2 или Kitt225, или с Т-лимфоцитами или NK-клетками мышиного и/или человеческого происхождения. Данные мутанты должны иметь стимулирующую активность в данных испытаниях по меньшей
мере в 100 раз ниже, чем активность природного IL-2.
2) Данные мутантные варианты IL-2 (мутеины) сохраняют свою способность связываться с одним
или более молекулярными компонентами рецептора IL-2. Данная способность к связыванию может быть
оценена непосредственно с помощью ELISA на уровне коммерчески доступных цепей рецептора, таких
как альфа- и бета-цепи рецептора, или опосредованно на клеточных популяциях, положительных к рецептору. Нормы опознания мутеинов IL-2 должны быть сравнимы с нормами природного IL-2 в данных
испытаниях.
3) Мутантные варианты IL-2 имеют ингибирующую активность природного IL-2 на лимфоцитах,
которая является предпочтительной на регуляторных Т-клеточных популяциях (по меньше мере в клетках Т CD4+CD25+FoxP3+). Мутеины IL-2, включенные в данное изобретение, способны в определенном
диапазоне концентраций преимущественно или избирательно ингибировать активность или размножение
регуляторных Т-клеток, не влияя или только минимально влияя на активность и/или размножение других
лимфоцитов с эффекторными функциями, таких как клетки Т-хелперы, цитотоксические Т-клетки или
NK-клетки. Преимущественная или избирательная ингибирующая активность данных мутеинов может
быть видна в нескольких тестах in vitro, которые исследуют ответ на стимулы смесей эффекторных и
регуляторных популяций в присутствии повышенных количеств мутеинов. В соответствующем диапазоне концентраций мутеины должны быть способны по меньшей мере в три раза сильнее ингибировать
рост и активность регуляторных Т-клеток, чем они ингибируют активность или размножение эффекторных популяций, используемых в эксперименте, например клеток Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток
или NK-клеток.
Данное изобретение также включает несколько конкретных вариантов мутеинов IL-2 (конкретных
мутаций, раскрытых в табл. 1), которые были выбраны из-за наличия свойств, упомянутых выше. Данные мутеины содержат множество аминокислот-заменителей, которые существенно снижают их способность стимулировать мышиные и человеческие лимфоциты. Однако их способность связываться с альфаи бета-цепями рецептора остается незатронутой, и они получают ингибирующие (антагонистические)
способности природной активности IL-2. Наиболее значительный аспект данных мутеинов состоит в
том, что они демонстрируют выраженную способность, в определенном диапазоне концентраций, ингибировать преимущественно регуляторные Т-клетки (CD4+CD25+FoxP3+), в культуре лимфоцитов, содержащих данные клетки и другие эффекторные Т-клетки.
-3-
021867
Таблица 1. Сконструированные мутанты, относящиеся к мутации согласно номенклатуре
человеческого IL-2
Представленное изобретение также содержит дополнительные модификации типа мутантов IL-2,
упоминавшихся выше, и в частности мутантов, раскрытых в табл. 1. Либо с повышением их аффинности
к конкретным компонентам IL-2, но не затрагивая или даже усиливая их преимущественные ингибирующие свойства, либо с улучшением их фармакодинамики in vivo: увеличенный жизненный цикл или
уменьшение их интернализации Т-клетками. Данные дополнительные мутации могут быть получены за
счет рациональной конструкции без биоинформационных инструментов, или за счет использования комбинаторных молекулярных библиотек различной природы (библиотек фаговых дисплеев, библиотек экспрессии генов в дрожжах или бактериях).
Терапевтическое применение аналогов-полипептидов IL-2
Данное изобретение также содержит фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента мутеины IL-2 и их аналоги, раскрытые в представленном изобретении, а также потенциальные варианты их терапевтического применения с целью избирательного модулирования активности IL-2 на регуляторных Т-клетках. В частности, данное изобретение защищает применение данных
мутеинов для содействия иммунному ответу, вызванному природным образом или с помощью вакцин
при таких заболеваниях, как рак или хронические инфекции, когда регуляторные Т-клетки являются особенно релевантными.
Для терапевтического применения полипептид согласно изобретению должен быть введен в переносчик заболевания пациента независимо или в сочетании с другими полипептидами или другими веществами, которые облегчают или усиливают его терапевтическое действие. Путем введения может быть
любой из путей введения, описанных в предшествующем уровне техники для парентерального введения
лекарственных препаратов.
Предпочтительно его можно вводить посредством внутривенного, внутримышечного, подкожного
или внутриопухолевого путей.
Полипептиды или слитые белки, описанные в представленном изобретении, также можно вводить в
виде части фармацевтической композиции, используемой для лечения рака или хронических инфекционных заболеваний.
Для получения необходимого терапевтического эффекта полипептид представленного изобретения
необходимо вводить в достаточно высоких дозах для обеспечения адекватной концентрации в лимфатическом узле или в периферическом участке, релевантном для рассматриваемого заболевания, при этом он
должен находиться в адекватном диапазоне концентраций для мутеина для демонстрации преимущественного ингибирующего эффекта на регуляторных Т-клетках. Вследствие этого, вышеупомянутую дозу
следует отрегулировать в соответствии с типом заболевания и путем введения при изучении. Например,
в случае лечения опухоли, дозу следует регулировать до тех пор, пока концентрации мутанта внутри
опухоли и/или локорегионального лимфатического узла не будут адекватными для обеспечения преимущественного ингибирующего эффекта на регуляторных Т-клетках. Диапазоны доз, подлежащие изучению, могут варьировать от десятков микрограмм до нескольких миллиграмм на дозу.
Число применяемых введений также необходимо отрегулировать в соответствии с биораспределением изучаемого мутеина. В общем, упомянутые выше эффективные концентрации следует поддерживать в течение периода, варьирующего от 2 до 30 последующих дней. Необходимо заметить, например,
что если мутеин соединяется с белком-носителем, частоту введения следует регулировать соответствующим образом. Терапевтическое действие подразумевает общую или частичную ремиссию симптомов
заболевания. Для рака уменьшение объема опухоли или увеличенное время возврата болезни будет считаться, среди прочего, критерием ремиссии. В заключение, необходимо заметить, что имеется множество
преимуществ данной новой терапевтической стратегии модулирования активности Treg по сравнению с
другими предложениями. Например, мутант IL-2 представляет собой на самом деле собственные белки
(за исключением нескольких мутаций). Этот факт снижает риск неожиданной токсичности (который является обычным в стратегиях, основанных на ингибиторах небольших размеров) или риск возникновения
иммунного ответа против инъецируемых лекарственных препаратов (как должно происходить в таких
стратегиях, как Ontak, в которых IL-2 соединяется с инородной и токсичной молекулой, такой как дифтерийный токсин).
Данные мутантные варианты IL-2 должны сохранять связывающую способность рецептора IL-2, по
-4-
021867
меньшей мере, на уровне аффинности природного IL-2 (10 пМ для высокоаффинного рецептора). Данная
аффинность трудно достижима со стратегиями ингибирования рецептора или лиганда моноклональными
антителами или другими лекарственными препаратами.
Малый размер данных мутантов (15 кД) может позволить им иметь высокую мобильность и легко
проникать в микроокружение опухоли. То есть то, что, как известно, является сложным для больших
молекул, таких как антитела и другие.
Примеры
Пример 1.
Мутанты разрабатывали путем вычислений, с помощью методик биоинформатики, используя в качестве основы опубликованную структуру четвертичного комплекса IL-2 человека, соединенного с рецептором в линию, сообщение Wang X., Rickert М. and Garcia K.С. in Structure of the quarternary complex
of interleukin-2 with its alpha, beta, and gamma receptors. Science, 2005. 310(5751): p. 1159-63, и алгоритм
расчета энергии для взаимодействия белок-лиганд в публичном домене. Первоначально были спрогнозированы различные варианты мутеинов, которые не оказывают влияние на способность связывания альфаи бета-цепей рецептора. Данные мутеины экспрессировали в E.coli из генетической конструкции в векторе рЕТ28а, включающем идентифицирующую последовательность из 6 гистидинов в аминном конце.
Мутеины очищали, используя обращенную фазу (фиг. 1), получаемую с высокой чистотой (>95%). Полученные мутеины отбирали в соответствии с их свойствами в экспериментальных испытаниях in vitro.
Среди сконструированных мутеинов в табл. 1 описан набор конкретных мутаций, который обладает
свойством преимущественного ингибирования активности Treg.
Пример 2.
Отобранные мутеины сохраняют способность связываться с различными компонентами рецептора
IL-2, особенно с альфа- и бета-цепями рецептора. Фиг. 2 показывает, что при использовании тестов ELISA, некоторые из мутантов, перечисленных в табл. 1, остаются практически с неизменной способностью
связывать альфа-цепь (фиг. 2) и бета-цепь (фиг. 2b) рецептора IL-2 человека. Фиг. 3 показывает дополнительное подтверждение, что данные мутанты связываются с рецептором на клеточной поверхности (фиг.
3а) и что данное соединение может быть постепенно вытеснено за счет добавления природного IL-2
(фиг. 3b).
Пример 3.
Отобранные мутеины значительно уменьшают их способность подачи сигнала за счет рецептора IL2. Фиг. 3 иллюстрирует данный факт посредством измерения их способности стимулировать рост клеточной линии CTLL2 (фиг. 4а) или стимулировать дифференцировку NK-клеток из общих лимфоцитов
селезенки (фиг. 4b). Данные мутеины в высоких концентрациях ингибируют активность природного IL-2
как на Т-лимфоцитах (фиг. 5а), так и на NK-клетках (фиг. 5b).
Пример 4.
Отобранные мутеины преимущественно ингибируют размножение in vitro регуляторных Т-клеток
(CD4+CD25+FoxP3+). Фиг. 6 иллюстрирует данное свойство для одного из мутантов в табл. 1, в частности показано, что в клеточной культуре лимфоцитов, где имеется смесь эффекторных и регуляторных Тклеток, стимулированных анти-CD3 антителами, добавление промежуточных доз мутеинов существенно
ингибирует пролиферацию CD4+FoxP3+ без значительного влияния на размножение эффекторных популяций CD4+FoxP3+.
Пример 5.
Отобранные мутеины преимущественно секвестрируют посредством регуляторных Т-клеток в
культуре, уменьшая их способность влиять на активность эффекторных Т-клеток. Данные мутеины ингибируют передачу сигнала (стимулирование), опосредованную IL-2, эндогенно продуцированным популяциями клеток Т-хелперов CD4+CD25-FoxP3-, очищенных и стимулированных анти-CD3 антителами. Однако добавление в данные культуры увеличенных количеств регуляторных Т-клеток
CD4+CD25+FoxP3+ парадоксально уменьшает ингибирование, опосредованное мутантом на Тэффекторных популяциях (фиг. 7). Данный эффект объясняется способностью описанных мутеинов преимущественно ингибировать активность IL-2 на Т-регуляторных популяциях. Присутствие регуляторных
Т-клеток даже в малых количествах направляет активность мутантов в данные клетки, снижая таким образом ингибирующую активность мутеина в эффекторной популяции.
Пример 6. Отобранные мутеины показывают противоопухолевую активность на мышиной модели
трансплантируемой опухоли. Фиг. 8 показывает описанное свойство одного из мутеинов из таблицы 1.
Мутеин оценивали на модели первичной опухоли с клеточной линией MB16F10 меланомы, имплантированной подкожно на правом боку. Фиг. 8 показывает уменьшение объема опухоли у мышей, пролеченных мутеином, по сравнению с контрольной группой, пролеченной PBS. Кроме того, была включена
контрольная группа, пролеченная анти-CD25 моноклональным антителом (Mab), показавшая, что экспериментальная система является чувствительной к истощению клеток Treg.
-5-
021867
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Получение и очистка мутантных вариантов человеческого IL-2.
а) вестерн-блоттинг, показывающий экспрессию некоторых мутантных вариантов и контрольного
природного IL-2 в штаммах E.coli, трансфектированных выполненной генной конструкцией;
b) пример типичного профиля очистки, полученного с использованием очистки обращенной фазой.
Фиг. 2. Оценка с помощью ELISA опознания альфа- (а) и бета- (b) цепей рецептора IL-2 некоторыми из мутеинов, приведенных в табл. 1. В качестве положительного контроля использовали природный
IL-2. Как можно видеть, все протестированные мутеины сохраняют нормы опознания, сравнимые с нормами природного IL-2.
Фиг. 3. Оценка с помощью проточной цитометрии способности некоторых из мутеинов, приведенных в табл. 1, связываться с рецептором IL-2 на поверхности клеток. Конкретно с мышиной клеточной
линией CTLL2. Как мутеины, так и контроль природного IL-2 на поверхности клеток определяли с помощью анти-6-His-PE антитела, которое узнает головку гистидина, который содержится в генетической
конструкции данных молекул:
а) гистограммы, показывающие уровни обнаруженного прямого связывания;
b) уменьшение связывания мутеинов с клетками, измеренное за счет уменьшения средней интенсивности обнаруженной флуоресценции, вызванной добавлением увеличенных количеств природного
IL-2 (вариант данной молекулы не имеет гистидиновой головки и не препятствует окрашиванию).
Фиг. 4. Оценка способности передачи сигнала некоторых молекул, приведенных в табл. 1
а) активность мутеинов оценивали в испытании на пролиферацию клеточной линии CTLL2, измеряемую посредством колориметрического анализа с использованием МТТ;
b) мутеины также оценивали в тесте на дифференцировку клеток NK1.1+ из общих мышиных спленоцитов. В обоих случаях, авторы изобретения сравнивали способность стимулировать у мутеинов против контроля природного IL-2, который получают в точно такой же экспериментальной системе (такая
же генетическая конструкция, продуцирующий штамм E.coli, система очистки). Результаты, аналогичные результатам, показанным на фиг. 3а, получены с клеточной линией Kitt225, с человеческой системой
рецепторов.
Фиг. 5. Оценка способности некоторых мутеинов, приведенных в табл. 1, ингибировать in vivo активность природного IL-2.
а) Ингибирование общей пролиферации лимфоцитов ганглиев, стимулированных анти-CD3 моноклональным антителом (клон 2С11 при 10 мкг/мл) посредством увеличения концентраций мутеинов.
b) Ингибирование дифференцировки клеток NK1.1+ из общих мышиных спленоцитов, стимулированных 500 IU/мл природного IL-2, посредством добавления увеличенных количеств мутеинов в культуре.
Фиг. 6. Оценка способности мутеинов преимущественно ингибировать лимфоциты CD4+Foxp3+.
Лимфоциты из лимфатических узлов мышей стимулировали in vitro моноклональным телом анти-CD3
(клон 2С11 при 10 мкг/мл) в присутствии указанных количеств мутеина Ml (как указано в табл. 1). Спустя 72 ч культивирования определили с помощью проточной цитометрии с использованием эталонных
шариков, количество живых регуляторных CD4+Foxp3+ и эффекторных CD4+Foxp3 лимфоцитов. График на а показывает основное окрашивание при проточной цитометрии, использованной для дифференцировки регуляторных и эффекторных клеточных популяций. График на b показывает уровни ингибирования пролиферации, вызванной различными количествами добавленного мутеина. Данное ингибирование рассчитывают на основании количества живых клеток, извлекаемых в отсутствии мутеина. Как показано на b, имеется промежуточный диапазон концентраций мутеина Ml, в котором ингибирование регуляторной популяции CD4+Foxp3+ значительно больше, чем для клеток Т-хелперов CD4+Foxp3- или эффекторных Т-клеток.
Фиг. 7. Оценка способности регуляторных Т-клеток преимущественно секвестрировать сконструированные мутеины IL-2, высвобождая эффекторные Т-клетки с ингибирующим эффектом на них. Эффекторные Т-клетки CD4+CD25-FoxP3- очищали, используя магнитные шарики, меченные CFSE, и помещали в культуру, с добавлением к некоторой части или без добавления к некоторой части мутеинов
(график мутеина M1, две различные концентрации 10 и 5 мкг/мл) и стимулировали антителами анти-CD3
(клон 2С11, 10 мкг/мл) и анти-CD2/ (клон 37,51, 10 мкг/мл). К данным культурам добавляли разные количества очищенных регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+FoxP3+). График 6а показывает высокие уровни чистоты (92% Treg и 97% для эффекторных Т-клеток), достижимые при разделении с помощью магнитных шариков. Фиг. 6b показывает уровни пролиферации эффекторных клеток при измерении посредством разбавления CFSE для различных количеств регуляторных клеток в культуре. Как можно видеть в
отсутствие Treg, наличие мутеинов существенно влияет на пролиферацию эффекторных клеток (ингибирующий эффект), но по мере добавления Treg пролиферация эффекторных клеток восстанавливается,
поскольку Treg преимущественно секвестрируют высвобождающие мутеин эффекторные клетки от их
ингибирующего эффекта.
Фиг. 8. Оценка непосредственного противоопухолевого эффекта мутеинов IL-2 с использованием
модели первичной опухоли с опухолевой клеточной линией MB16F10 меланомы. Использовали 12 мы-6-
021867
шей C57BL6, распределенных на три группы по четыре мыши в каждой. Все обработки проводили подкожно с дня -5 до дня 0. Группа 1 получала 200 мкл PBS, группа 2 получала 100 мкг анти CD25 MAb, а
группа 3 получала 200 мкг мутеина IL-2. На нулевой день все мыши получали 250000 клеток на правом
боку. Объем опухоли измеряли каждые два дня до 30 дня. Данные анализировали, используя дисперсный
анализ и критерий множественных сравнений Бонферрони. Мутеин IL-2 в качестве анти CD25MAb вызывал существенную отсрочку роста опухоли (р<0,001).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Иммуномодулирующий полипептид, полученный из IL-2, который содержит несколько точечных
мутаций относительно последовательности природного IL-2 и обладает свойством ингибирования активности IL-2 in vitro преимущественно на регуляторных Т-клетках, где полипептид выбран из группы, состоящей из (i) указанного полипептида, содержащего мутации Q22V, Q126A и S130G, I129D; (ii) указанного полипептида, содержащего мутации L18N, Q126Y и S130R; (iii) указанного полипептида, содержащего мутации Q13Y, Q126Y, I129D и S130R; (iv) указанного полипептида, содержащего мутации L18N,
Q22V, Т123А и S130R, I129D.
2. Полипептид по п.1, который содержит несколько мутаций в последовательности природного IL2, и которые предоставляют ему возможность преимущественно ингибировать активность IL-2 на природных регуляторных Т-клетках (CD4+CD25+FoxP3+).
3. Полипептид по п.1, характеризующийся своей способностью преимущественно ингибировать регуляторные Т-клетки in vivo.
4. Слитый белок, содержащий иммуномодулирующий полипептид по любому из пп.1-3, соединенный с белком-носителем.
5. Слитый белок по п.4, характеризующийся тем, что белком-носителем является альбумин.
6. Слитый белок по п.5, характеризующийся тем, что белком-носителем является область Fc человеческого иммуноглобулина.
7. Применение полипептида по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, выбранных из группы, включающей инфекционные хронические заболевания, хронические заболевания или рак.
8. Фармацевтическая композиция, пригодная для лечения рака и хронических заболеваний, характеризующаяся содержанием в качестве активного ингредиента полипептида по любому из пп.1-3.
9. Применение слитого белка по любому из пп.4-6 для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, выбранных из группы, включающей инфекционные хронические заболевания, хронические заболевания или рак.
10. Фармацевтическая композиция, пригодная для лечения рака или хронических заболеваний, характеризующаяся содержанием в качестве активного ингредиента слитого белка по любому из пп.4-6.
Фиг. 1
Фиг. 2
-7-
021867
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
-8-
021867
Фиг. 7
Фиг. 8
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-9-